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Verfahren zur Herstellung eines neuen Tetracyclin-Penicillinates mit antibiotischer Wirkung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Tetracyclin-Penicillinates mit be- merkenswerter antibiotischer Wirkung.
Diese neue Verbindung besitzt charakteristische Eigenschaften insofern, als sie einerseits in Wasser beträchtlich löslich ist und anderseits praktisch keine Empfindlichkeit gegenüber Penicillinase zeigt. Dadurch wird die Wirksamkeit des einen Teils dieser Verbindung, die sowohl der Tetracyclinreihe als auch der Penicillinreihe angehört, nämlich des Penicillinteils, gegenüber Staphylokokken gewährleistet, die bisher als gegen die bekannten Penicilline resistent angesehen wurden, insbesondere gegenüber Staphylococcus aureus, dem Erzeuger der Penicillinase.
Es ist bekannt, dass die Tetracycline und die Penicilline jeweils ihre besonderen Vorteile und Nachteile besitzen, wobei letztere ihre Anwendung beträchtlich einschränken. So ist bekannt, dass das Tetracyclin und der grösste Teil seiner Derivate in Wasser praktisch unlöslich sind.
Anderseits sind die bekannten Penicilline bei bestimmten Penicillinase erzeugenden Staphylokokken wirkungslos.
Man hat zwar schon daran gedacht, Tetracyclin mit bestimmten Penicillinen zu verknüpfen, doch ist die einzige Verbindung dieser Art, das Phenoxymethyl-penicillinat des Tetracyclins, das eine gewisse Aktivität gegenüber bestimmten penicillinresistenten Staphylokokken aufweist, gleichfalls praktisch unlöslich in Wasser, wodurch seine medizinische Anwendung erschwert wird.
Das erfindungsgemäss erhältliche Produkt ist von beiden dieser Nachteile frei und stellt die erste Verbindung dar, die gleichzeitig wasserlöslich und daher therapeutisch mit Vorteil verwendbar und in Gegenwart von Penicillinase aktiv, d. h. selbst gegenüber solchen Staphylokokkenstämmen aktiv ist, die Penicillinase erzeugen.
Die erfindungsgemäss erhältliche Verbindung ist das Phenoxymethyl-penicillinat des am CarboxamidStickstoff oder in 9- oder 7-Stellung durch einen 4'- (6-Hydroxyäihyl)-diäthyIendiaminomeihyl-rest substituierten Tetracyclins, für das eine annehmbar erscheinende Formel wie folgt wiedergegeben werden kann :
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EMI2.1
EMI2.2
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wird filtriert, zweimal mit Äther gewaschen und im Vakuum 5 h bei 400C getrocknet. Man erhält so 40 g des Phenoxymethylpenicillinats des 4'-(ss-Hydroxyäthyl)-diäthylendiaminomethyltetracyclins, was einer Ausbeute von etwa 85 bis 90% entspricht. Die Eigenschaften dieses Produkts werden weiter unten wiedergegeben.
Beispiel 2 : Man löst 58, 6 g 4'-(ss-Hydroxyäthyl)-diäthylendiaminomethyltetracyclin und 35 g Phenoxymethylpenicillin unter Rühren in 300 cm3 Methanol, filtriert durch einen Büchner-Trichter, versetzt das Filtrat unter starkem Rühren mit 990 cm3 wasserfreiem Äther, filtriert erneut unter Druck und wäscht den Filterkuchen zweimal mit je 50 cm3 wasserfreiem Äther. Nach dem Trocknen des Produkts im Vakuum erhält man 84 g eines weissgelblichen Pulvers, das gleichfalls die weiter unten wiedergegebenen physikochemischen Eigenschaften aufweist.
Beispiel 3 : Man löst die gleichen Mengen der gleichen Reaktionsteilnehmer, wie sie in Beispiel 2 beschrieben wurden, in 500 cm3 destilliertem Wasser von 50C auf. Man filtriert die Lösung durch einen Büchner-Trichter und unterwirft dann das Filtrat einer Lyophilisierung bei -400C. Das so erhaltene lyophilisierte Produkt zeigt die gleichen Eigenschaften wie die nach den vorhergehenden Beispielen erhaltenen Produkte.
In allen drei Fällen liegt das Endprodukt in Form eines weissgelblichen, geruchlosen, schwach bitteren Pulvers vor, das in Wasser stark löslich ( > 1, 5 g/cm3), in Methanol und Äthanol löslich und in Äther unlöslich ist. Der pH-Wert einer 2'0gen wässerigen Lösung beträgt 5, Ba
EMI3.1
Analyse : CHgNS
EMI3.2
<tb>
<tb> ber. <SEP> C <SEP> 57, <SEP> 67 <SEP> ; <SEP> H <SEP> 6, <SEP> 02 <SEP> ; <SEP> N <SEP> 8, <SEP> 96 <SEP> ; <SEP> S <SEP> 3, <SEP> 42 <SEP>
<tb> gef. <SEP> C <SEP> 56, <SEP> 41 <SEP> ; <SEP> H <SEP> 6. <SEP> 11 <SEP> ; <SEP> N6, <SEP> 11 <SEP> ;
<SEP> S3, <SEP> 36
<tb>
EMI3.3
<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> Tetracyclinderivat <SEP> Penicillinderivat
<tb> (I) <SEP> (II)
<tb> ber. <SEP> 62, <SEP> 60 <SEP> 37, <SEP> 4 <SEP>
<tb> gef. <SEP> 61, <SEP> 70% <SEP> 37, <SEP> 2% <SEP>
<tb>
Die Bestimmung des Anteils (I) erfolgt auf jodometrischem Wege, die Bestimmung des Anteils (II) durch Spektrophotometrie durch Ermittlung der Extinktion bei 356 mu für eine Lösung mit einem Gehalt von 10/lg/ml in n/10 HCI.
Die aussergewöhnliche Löslichkeit der neuen Verbindung und der PH-Wert ihrer Lösung ermöglichen ihre Verabreichung auf intramuskulärem und sogar intravenösem Wege.
Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Phenoxymethylpenicillinat des am Carboxamid-stickstoff oder in 9-oder 7-Stellung durch einen 4-(ss-Hydroxyäthyl)-diäthylendiaminomethyl-Rest substituierten Tetracyclins besitzt aussergewöhnliche antibiotische Eigenschaften, die sich von denen der Antibiotica, aus denen es zusammengesetzt ist, deutlich unterscheiden.
Die stärkste Aktivität wird auf penicillinresistente Staphylokokken ausgeübt. Trotz der nachgewiesenen Resistenz dieser Stämme gegenüber dem Phenoxymethylpenicillin zeigt das erfindungsgemäss erhältliche Produkt eine Wirkung, die beträchtlich über derjenigen des amCarboxamidstickstoff oder in 9- oder 7-Stellung durch einen 4- (8-Hydroxyäthyl)-diäthylendiaminomethyl-Rest substituierten Tetracyclins und selbstverständlich auch über derjenigen aller bekannten Tetracyclinderivate liegt.
Die neue Verbindung ist baktericid, während das N- (oder 9-oder 7-)-4'- (ss-Hydroxyäthyl)-diäthy- lendiaminomethyl-tetracyclin nur bakteriostatisch wirkt. Auch gegenüber nicht penicillinresistenten
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Bakterien ist die Wirkung der neuen Verbindung erheblich grösser als diejenige des basischen Teils allein.
Die an Gruppen von mit penicillinresistenten Staphylokokken infizierten weissen Mäusen bestimmte Mortalität ist bei solchen Gruppen die mit dem Phenoxymethyl-penicillinat des 4'-(ss-Hydroxyäthyl)-di- äthylendiaminomethyl-tetracyclins behandelt wurden, erheblich geringer als bei solchen Gruppen, die mit N- (oder 9-oder 7-) (ss-Hydroxyäthyl)-diäthylendiaminomethyl-tetracyclin behandelt worden waren.
Aus den weiter unten angegebenen antibakteriellen Spektren ergibt sich, dass die minimale inhibierende Dosis (M. I. D.) einen ausserordentlich niedrigen Wert aufweist. Zur Würdigung dieser Dosis muss berücksichtigt werden, dass die erfindungsgemäss erhältliche Verbindung einen Penicillinanteil und einen Tetracyclinanteil enthält und dass das Verhältnis eines jeden dieser Anteile in einer dem Versuch unterworfenen vorgegebenen Menge des Produkts die Hälfte der Menge des entsprechenden Anteils darstellt, der für sich allein dem Vergleichsversuch unterworfen wird.
Bei der Bewertung der Ergebnisse ist ferner zu berücksichtigen, dass die Toxizität der neuen Verbindung ausschliesslich auf ihren Tetracyclin-Teil zurückzuführen ist, d. h. die Toxizität des erfindungsgemäss erhältlichen Produkts ist ungefähr halb so gross wie die Toxizität einer gleich grossen Gewichtsmenge an Tetracyclin.
In der folgenden Tabelle, worin die minimalen inhibierenden Dosen in Mikrogramm je Milliliter angegeben sind, ist das erfindungsgemäss erhältliche Produkt mit P, der löslich gemachte Tetracyclinteil dieses Produkts mit T und der Phenoxymethylpenicillinteil mit pmp bezeichnet.
Antibakterielles Spektrum in vitro
M. I. D. g/ml
EMI4.1
<tb>
<tb> Produkt
<tb> Produkt
<tb> Teststamm <SEP> T <SEP> pmp <SEP> P <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Ox. <SEP> 0, <SEP> 66 <SEP> 0,02 <SEP> 0, <SEP> 03
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 0,40 <SEP> 0,04 <SEP> 0, <SEP> 06
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0,40 <SEP> 0,05 <SEP> 0, <SEP> 08
<tb> Streptococcus <SEP> heem. <SEP> A <SEP> 0. <SEP> 40 <SEP> 0,02 <SEP> 0, <SEP> 03
<tb> Diplococcus <SEP> pneum. <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> 0. <SEP> 03 <SEP> 0,05
<tb> Neisseria <SEP> gonorrh. <SEP> 0,30 <SEP> 0,01 <SEP> 0,01
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 1 <SEP> 0,08 <SEP> 0,13
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 65-1, <SEP> 00
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 12 <SEP> 0, <SEP> 40-0, <SEP> 38
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> N <SEP> 0.
<SEP> 20-0, <SEP> 25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> FDA <SEP> 209 <SEP> P <SEP> 0,20 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 0,05
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> penicillinresistent, <SEP> 62 <SEP> ug/ml <SEP> 0, <SEP> 35 <SEP> 62 <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> penicillinresistent, <SEP> 60 <SEP> Jlg/ml <SEP> 0,48 <SEP> 60 <SEP> 0,48
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Silver <SEP> 2,
<tb> penicillinresistent, <SEP> 6 <SEP> g/ml <SEP> 0, <SEP> 16 <SEP> 6 <SEP> 0. <SEP> 16
<tb> Bacillus <SEP> subtilis, <SEP> penicillinresistent, <SEP> lOOjg/ml <SEP> 0,24 <SEP> 100 <SEP> 0,24
<tb>
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Aktivität in vitro des Produkts P gegenüber verschiedenen Teststämmen.
Es wurden verschiedene Methoden angewendet.
1. Methode der stetigen Verdünnung in flüssigem Milieu. Die verwendeten Bakterien wurden von Kranken isoliert oder der Sammlung von Stämmen des Laboratoriums entnommen.
Untersuchte Verbindung : P.
Vergleichsverbindungen : T und Phenoxymethylpenicillin.
Die Ergebnisse wurden 18 h nach der Beimpfung festgestellt. a) Erste Versuchsreihe :
EMI5.1
<tb>
<tb> M. <SEP> I. <SEP> D.
<tb>
Produkt
<tb> Bakterienstämme <SEP> T <SEP> Phenoxymethylpenicillin <SEP> P <SEP>
<tb> Staph. <SEP> p. <SEP> aureus <SEP> pen. <SEP> res.
<tb>
100 <SEP> I. <SEP> E./ml <SEP> 0, <SEP> 66 <SEP> Ilg/ml <SEP> 100 <SEP> I. <SEP> E./ml <SEP> oder <SEP> 62 <SEP> g/ml <SEP> 0,50 <SEP> g/ml
<tb> Staph. <SEP> p. <SEP> aureus <SEP> pen. <SEP> res.
<tb>
200 <SEP> I. <SEP> E./ml <SEP> 0,80 <SEP> g/ml <SEP> 200 <SEP> I. <SEP> E./ml <SEP> oder <SEP> 124 <SEP> Ilg/ml <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP> Ilg/ml <SEP>
<tb> Staph. <SEP> pen. <SEP> res <SEP> 3 <SEP> I. <SEP> E./ml,
<tb> tetr. <SEP> res. <SEP> 8 <SEP> g/ml <SEP> 8 <SEP> g/ml <SEP> 3 <SEP> I. <SEP> E./ml <SEP> oder <SEP> 4 <SEP> g/ml <SEP> 0,80 <SEP> g/ml
<tb>
b) Zweite Versuchsreihe : (M. I. K. = minimale inhibierende Konzentration)
Mit dieser Methode wurden durch Untersuchung der bakteriostatischen und der baktericiden Wirkung die folgenden Ergebnisse erhalten.
2. Methode der Verdünnungen im Quadrat.
EMI5.2
<tb>
<tb>
Bakteriostatische <SEP> Wirkung <SEP> Baktericide <SEP> Wirkung
<tb> Hscherichia <SEP> Coli <SEP> III
<tb> 1. <SEP> Resistent <SEP> gegen <SEP> Penicillin <SEP> 1. <SEP> Resistent <SEP> gegen <SEP> Penicillin
<tb> 2. <SEP> T <SEP> M. <SEP> I. <SEP> K. <SEP> = <SEP> 0,93 <SEP> g/ml <SEP> entsprechend <SEP> 2. <SEP> T <SEP> 1. <SEP> Grad <SEP> 100%ige <SEP> baktericide <SEP> Wir-
<tb> 0, <SEP> 70 <SEP> g/ml <SEP> Tetracyclinbase <SEP> kung <SEP> = <SEP> 5 <SEP> entsprechend <SEP> 3, <SEP> 78 <SEP> j-tg/ml <SEP>
<tb> Tetracyclinbase
<tb> 3. <SEP> P <SEP> M. <SEP> I. <SEP> K. <SEP> = <SEP> 0,93 <SEP> g/ml <SEP> entsprechend <SEP> 3. <SEP> P <SEP> 1.
<SEP> Grad <SEP> 100lige <SEP> baktericide <SEP> Wir-
<tb> 0, <SEP> 43 <SEP> fJg/ml <SEP> Tetracyclinbase <SEP> kung <SEP> = <SEP> 5 <SEP> entsprechend <SEP> 2,38 <SEP> g/ml
<tb> Tetracyclinbase
<tb> Staphylococcus <SEP> Issoudun
<tb> 1. <SEP> Penicillin <SEP> : <SEP> M. <SEP> I. <SEP> I. <SEP> = <SEP> 0,46 <SEP> g/ml <SEP> 1. <SEP> Penicillin: <SEP> 1. <SEP> Grad <SEP> 100% <SEP> = <SEP> 0,62 <SEP> g/ml
<tb> 2. <SEP> T <SEP> : <SEP> M. <SEP> I. <SEP> K. <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 62 <SEP> g/ml <SEP> entsprechend <SEP> 2. <SEP> T <SEP> : <SEP> 1. <SEP> Grad <SEP> 100% <SEP> = <SEP> 2,5 <SEP> g/ml <SEP> entspre-
<tb> 0, <SEP> 46 <SEP> fJg/ml <SEP> Tetracyclinbase <SEP> chend <SEP> 1,89 <SEP> g/ml <SEP> Tetracyclinbase
<tb> 3. <SEP> P <SEP> : <SEP> M. <SEP> I. <SEP> K. <SEP> = <SEP> 0,23 <SEP> g/ml <SEP> entsprechend <SEP> 3. <SEP> P <SEP> :
<SEP> l. <SEP> Grad <SEP> 100% <SEP> = <SEP> 0,95 <SEP> g/ml <SEP> entspre-
<tb> 0,10 <SEP> g/ml <SEP> Tetracyclinbase <SEP> und <SEP> chend <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> fJg/ml <SEP> Tetracyclinbase
<tb> 0, <SEP> 09 <SEP> g/ml <SEP> Penicillin <SEP> und <SEP> 0, <SEP> 36 <SEP> fJg/ml <SEP> Penicillin
<tb>
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Ergebnisse der bakteriologischen Messungen im Warburg-Apparat.
Durch Versuche im Warburg-Apparat wurden die Kurven des Sauerstoffverbrauchs der Bakterien, die auf der Atmungsaktivität der Bakterien beruhen und gleichzeitig die Vermehrung der Bakterien bestimmt.
Zum Vergleich dienten Phenoxymethylpenicillin, N- (oder 9-oder 7-)-4'- (ss-Hydroxyäthyl)-diäthylendi- aminomethyl-tetracyclin sowie ein Blindversuch, bei dem kein Antibiotikum angewendet wurde. Das er- findungsgemäss erhältliche Produkt zeigt dabei eine völlig andere und unvergleichlich stärkere Wirkung.
Diese Wirkung ist bei den beigefügten Zeichnungen in den Fig. 1 und 2 graphisch dargestellt.
Die Fig. 1 gibt die Veränderung des Sauerstoffverbrauches der Bakterien wieder.
Die Fig. 2 stellt das Wachstum des Staphylococcus aureus dar.
In den beiden in den Fig. 1 und 2 dargestellten Kurvenscharen sind die in den folgenden 4 Fällen be- obachteten Ergebnisse mit 1, 2,3 bzw. 4 bezeichnet :
Kurve 1 : ohne Antibioticum (Blindprobe),
Kurve 2 : Anwendung von Phenoxymethylpenicillin in einer Konzentration von 0,23 fig/ml,
Kurve 3 : Anwendung von N- (oder 9-oder 7-)-4'- (0-Hydroxyäthyl)-diäthylendiaminoäthyltetracyclin in einer Konzentration von 0, 4 Mg/ml,
Kurve 4 : Anwendung des erfindungsgemäss erhältlichen Produktes in einer Konzentration von 0, 63 ug/ml.
Wenn es auch zunächst scheint, als seien die zur Erzielung der Kurven 2,3 und 4 angewendeten Do- sen voneinander verschieden, so trifft dies doch nicht zu, denn die Dosis von 0, 63 lig/ml der Kurve 4 ent- spricht der Summe der 0,23 jg/ml der Kurve 2 und der 0,4 j-tg/ml der Kurve 3.
Die Kurven der Fig. 1 sind im Logarithmus der Menge des von den Bakterien verbrauchten Sauerstoffs in mm3 gegen die Zeit in Stunden aufgetragen.
In den Kurven der Fig. 2 ist der Logarithmus der Zahl der lebenden Mikroorganismen als Funktion der
Zeit in Stunden dargestellt.
Aus der Fig. 1 lassen sich die verbesserten Ergebnisse entnehmen, die mit dem erfindungsgemässen Produkt bei der Inhibition der Atmung von Staphylococcus aureus erzielt werden.
In gleicher Weise wird das Wachstum von Staphylococcus aureus durch das erfindungsgemäss erhältliche Produkt in auffallender Art beeinträchtigt :
Während die Kurven 1 und 2 eine Zunahme der Zahl der Mikroorganismen und die Kurve 3 lediglich eine konstante Zahl, d. h. nur eine Bakteriostase erkennen lassen, zeigt die Kurve 4 eine zunehmende Verringerung dieser Zahl, d. h. eine baktericide Wirkung. Die erfindungsgemäss erhältliche Verbindung wirkt daher, wie bereits oben ausgeführt, nicht nur bakteriostatisch, sondern auch baktericid, was im Hinblick auf die Eigenschaften ihrer einzelnen Bestandteile für sich ausserordentlich überraschend ist.
Unter Berücksichtigung der oben wiedergegebenen angenommenen Formel ist es interessant festzustellen, dass der TetracyclinteiI dieser Formel einer Substanz mit lediglich bakteriostatischer Wirkung, der heterocyclischeDiaminteil lediglich einer löslich machenden Gruppe und der substituierte Penicillinteil allein keiner baktericiden Substanz entspricht. Im Gegensatz hiezu ist das komplexe Molekül des erfindungsgemäss erhältlichen Produkts vollständig löslich und übt eine baktericide Wirkung auf alle grampositiven Bakterien, die Penicillinase erzeugen, einschliesslich der Staphylococcus-aureus-Stämme aus.
Auf dieser wesentlichen Eigenschaft der neuen Verbindung beruht ihre Bedeutung und ihre Sonderstellung.
Es wird angenommen, dass das Verhalten der neuen erfindungsgemässen Substanz im Organismus durch ihre physikalischen Eigenschaften erklärt werden kann, die zeigen, dass die neue Verbindung im Gegensatz zu den andern Salzen des Tetracyclinteils als dem Phenoxymethylpenicillinat nur eine sehr schwache und sehr allmähliche Ionisierung erfährt, so dass jeder Teil des grossen komplexen Moleküls der ererfindungsgemässen Substanz nicht einzeln auftritt, sondern dass vielmehr dieses grosse Molekül in seiner Gesamtheit mit den ihm zugehörigen Eigenschaften wirkt.
Die vorstehenden theoretischen Überlegungen sollen jedoch die vorliegende Erfindung nicht beschränken.
Eine gewisse Bestätigung findet diese Theorie in erster Linie durch einen Vergleich der kryoskopi- schen Punkte und der Werte des spezifischen Widerstands von Lösungen verschiedener Salze des N- (oder 7-oder 9-)-4'- (ss-Hydroxyäthyl)-diäthylendiaminomethyl-tetracycIins :
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EMI7.1
<tb>
<tb> Salz <SEP> der <SEP> Verbindung <SEP> T <SEP> Kryoskopischer <SEP> Punkt <SEP> (OC, <SEP> Widerstand <SEP> (103 <SEP> Ohm/cm,
<tb> wässerige <SEP> 0,05 <SEP> m-Lösung) <SEP> wässerige <SEP> 0,01 <SEP> m-Lösung)
<tb> Citrat <SEP> 0,15 <SEP> 0,35
<tb> Glutamat <SEP> 0,14 <SEP> 0,51
<tb> Succinat <SEP> 0,13 <SEP> 0,39
<tb> Phenoxymethylpenicillat <SEP> 0,09 <SEP> 0,74
<tb>
Die Anwendung der Raoult'schen Gleichung, durch die die Schmelzpunktserniedrigung A mit der Dissoziationskonstante K eines Salzes vom Molekulargewicht M in wässeriger Lösung von der Konzentration c verbunden wird
EMI7.2
auf den vorliegenden Fall liefert folgende Gleichung - 0, 09 = K x 0, 05 und damit K =-18
Dieser Wert für K ist praktisch derjenige, der den Nicht-Elektrolyten entspricht, woraus sich ergibt,
dass in 0,05 molarer Lösung bei OOC die Ionisation praktisch 0 ist.
Diese Ergebnisse werden auch durch Leitfähigkeitsmessungen bestätigt, die bei verschiedenen Temperaturen mit wässerigen Lösungen verschiedener Konzentration der erfindungsgemäss erhältlichen Verbindung durchgeführt wurden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben :
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<tb>
<tb> C <SEP> M/94 <SEP> M/940 <SEP> M/9. <SEP> 400 <SEP> M/94.
<SEP> 000
<tb> c <SEP> 0, <SEP> 103 <SEP> 0, <SEP> 032 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP>
<tb> X <SEP> X <SEP> # <SEP> X <SEP> # <SEP> X <SEP> #
<tb> 00C <SEP> 236 <SEP> 23, <SEP> 3 <SEP> 29,6 <SEP> 28 <SEP> 3, <SEP> 6 <SEP> 34 <SEP> 1,28 <SEP> 121
<tb> 200C <SEP> 396 <SEP> 37,5 <SEP> 51 <SEP> 48 <SEP> 6, <SEP> 83 <SEP> 66 <SEP> 2,80 <SEP> 262
<tb> 37 C <SEP> 563 <SEP> 53,5 <SEP> 74 <SEP> 70 <SEP> 8,80 <SEP> 83 <SEP> 3,20 <SEP> 302
<tb>
EMI7.4
<tb>
<tb> X <SEP> entspricht <SEP> 10- <SEP> #/cm
<tb> 1000X
<tb> c
<tb>
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EMI8.1
EMI8.2
EMI8.3
sich somit wie ein partieller Komplex.
Diese unvollständige und geringe Ionisation des erfindungsgemäss erhältlichen Produkts kann sicherlich zu einer vielleicht noch unvollständigen Erklärung seines besonderen bakteriologischen Verhaltens dienen. Das gleiche gilt für die Nierenausscheidung, die im Vergleich zu derjenigen der Bestandteile der neuen Verbindung deutlich erniedrigt ist. Die Bezeichnung"Ausscheidung"wird hier in ihrer klassischen medizinischen Bedeutung gebraucht :
Man bezeichnet als Ausscheidung einer Substanz, beispielsweise Harnstoff, die Plasmamenge in ml, die die Substanzmenge in g (Harnstoff) enthält, die in 1 min der Nierentätigkeit entfernt wird. (Vgl.
B. A. Houssay-Physiologie Humaine-s. 1061-Flammarion Aufl.- [1950].) PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Tetracyclin-Penicillinates mit antibiotischer Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass man äquimolekulare Mengen von Phenoxymethylpenicillin, Tetracyclin in Form der Base und N-Hydroxyäthyl-N'-hydroxymethyldiäthylendiamin in einem gemeinsamen Lösungsmittel zur Umsetzung bringt.
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Process for the production of a new tetracycline penicillinate with antibiotic effect
The invention relates to a method for producing a new tetracycline penicillinate with a noticeable antibiotic effect.
This new compound has characteristic properties in that, on the one hand, it is considerably soluble in water and, on the other hand, it shows practically no sensitivity to penicillinase. This ensures the effectiveness of one part of this compound, which belongs to both the tetracycline series and the penicillin series, namely the penicillin part, against staphylococci, which were previously considered to be resistant to the known penicillins, in particular to Staphylococcus aureus, the producer of penicillinase.
It is known that the tetracyclines and the penicillins each have their particular advantages and disadvantages, the latter considerably limiting their use. It is known that tetracycline and most of its derivatives are practically insoluble in water.
On the other hand, the known penicillins have no effect on certain penicillinase-producing staphylococci.
Although it has already been thought of linking tetracycline with certain penicillins, the only compound of this kind, the phenoxymethyl penicillinate of tetracycline, which has a certain activity against certain penicillin-resistant staphylococci, is also practically insoluble in water, which makes its medical use difficult becomes.
The product obtainable according to the invention is free from both of these disadvantages and represents the first compound which is at the same time water-soluble and therefore therapeutically useful and active in the presence of penicillinase, i.e. H. is even active against those strains of staphylococci which produce penicillinase.
The compound obtainable according to the invention is the phenoxymethyl penicillinate of the tetracycline substituted on the carboxamide nitrogen or in the 9 or 7 position by a 4'- (6-hydroxyethyl) diethylenediamine methyl radical, for which a formula which appears to be acceptable can be given as follows:
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EMI2.1
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is filtered, washed twice with ether and dried in vacuo at 40 ° C. for 5 h. 40 g of the phenoxymethyl penicillinate of 4 '- (β-hydroxyethyl) diethylenediaminomethyltetracycline are obtained, which corresponds to a yield of about 85 to 90%. The characteristics of this product are given below.
Example 2: Dissolve 58.6 g of 4 '- (ss-hydroxyethyl) diethylenediaminomethyltetracycline and 35 g of phenoxymethylpenicillin in 300 cm3 of methanol with stirring, filter through a Buchner funnel, add 990 cm3 of anhydrous ether to the filtrate while stirring vigorously again under pressure and washes the filter cake twice with 50 cm3 anhydrous ether each time. After drying the product in vacuo, 84 g of a white-yellowish powder are obtained, which likewise has the physicochemical properties given below.
Example 3: The same amounts of the same reactants as described in Example 2 are dissolved in 500 cm3 of distilled water at 50 ° C. The solution is filtered through a Buchner funnel and the filtrate is then subjected to lyophilization at -400C. The lyophilized product obtained in this way shows the same properties as the products obtained according to the preceding examples.
In all three cases the end product is in the form of a yellowish-white, odorless, slightly bitter powder that is highly soluble in water (> 1.5 g / cm3), soluble in methanol and ethanol and insoluble in ether. The pH value of a 20% aqueous solution is 5 Ba
EMI3.1
Analysis: CHgNS
EMI3.2
<tb>
<tb> ber. <SEP> C <SEP> 57, <SEP> 67 <SEP>; <SEP> H <SEP> 6, <SEP> 02 <SEP>; <SEP> N <SEP> 8, <SEP> 96 <SEP>; <SEP> S <SEP> 3, <SEP> 42 <SEP>
<tb> found <SEP> C <SEP> 56, <SEP> 41 <SEP>; <SEP> H <SEP> 6. <SEP> 11 <SEP>; <SEP> N6, <SEP> 11 <SEP>;
<SEP> S3, <SEP> 36
<tb>
EMI3.3
<tb>
<tb> Components <SEP> tetracycline derivative <SEP> penicillin derivative
<tb> (I) <SEP> (II)
<tb> ber. <SEP> 62, <SEP> 60 <SEP> 37, <SEP> 4 <SEP>
<tb> found <SEP> 61, <SEP> 70% <SEP> 37, <SEP> 2% <SEP>
<tb>
The proportion (I) is determined by iodometric means, the proportion (II) is determined by spectrophotometry by determining the extinction at 356 μm for a solution with a content of 10 μg / ml in n / 10 HCl.
The exceptional solubility of the new compound and the pH of its solution enable it to be administered intramuscularly and even intravenously.
The phenoxymethylpenicillinate obtained by the process according to the invention of the tetracycline substituted on the carboxamide nitrogen or in the 9- or 7-position by a 4- (β-hydroxyethyl) diethylenediamine methyl radical has exceptional antibiotic properties which differ from those of the antibiotics from which it is composed, clearly differentiate.
The strongest activity is exerted on penicillin-resistant staphylococci. Despite the proven resistance of these strains to phenoxymethylpenicillin, the product obtainable according to the invention shows an effect which is considerably higher than that of the amCarboxamidnitrogen or in the 9- or 7-position by a 4- (8-hydroxyethyl) diethylenediaminomethyl radical and of course also over that of all known tetracycline derivatives.
The new compound is bactericidal, while the N- (or 9- or 7-) - 4'- (ss-hydroxyethyl) diethylenediaminomethyl-tetracycline only has a bacteriostatic effect. Also against non-penicillin-resistant
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Bacteria, the effect of the new compound is considerably greater than that of the basic part alone.
The mortality determined in groups of white mice infected with penicillin-resistant staphylococci is considerably lower in groups treated with phenoxymethyl penicillinate des 4 '- (ß-hydroxyethyl) -di-ethylenediamine-methyl-tetracycline than in groups treated with N - (or 9- or 7-) (ss-hydroxyethyl) -diethylenediaminomethyl-tetracycline had been treated.
The antibacterial spectra given below show that the minimum inhibiting dose (M.I.D.) has an extremely low value. To assess this dose, it must be taken into account that the compound obtainable according to the invention contains a penicillin component and a tetracycline component and that the ratio of each of these components in a given amount of the product subjected to the experiment represents half of the amount of the corresponding component, which in itself is the Comparative test is subjected.
When evaluating the results, it should also be taken into account that the toxicity of the new compound is exclusively due to its tetracycline part, i.e. H. the toxicity of the product obtainable according to the invention is approximately half as great as the toxicity of an equal amount by weight of tetracycline.
In the following table, in which the minimum inhibitory doses are given in micrograms per milliliter, the product obtainable according to the invention is designated with P, the solubilized tetracycline part of this product with T and the phenoxymethylpenicillin part with pmp.
Antibacterial spectrum in vitro
M.I.D. g / ml
EMI4.1
<tb>
<tb> product
<tb> product
<tb> Test strain <SEP> T <SEP> pmp <SEP> P <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Ox. <SEP> 0, <SEP> 66 <SEP> 0.02 <SEP> 0, <SEP> 03
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 0.40 <SEP> 0.04 <SEP> 0, <SEP> 06
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0.40 <SEP> 0.05 <SEP> 0, <SEP> 08
<tb> Streptococcus <SEP> heem. <SEP> A <SEP> 0. <SEP> 40 <SEP> 0.02 <SEP> 0, <SEP> 03
<tb> Diplococcus <SEP> pneum. <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> 0. <SEP> 03 <SEP> 0.05
<tb> Neisseria <SEP> gonorrh. <SEP> 0.30 <SEP> 0.01 <SEP> 0.01
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 1 <SEP> 0.08 <SEP> 0.13
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 65-1, <SEP> 00
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 12 <SEP> 0, <SEP> 40-0, <SEP> 38
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> N <SEP> 0.
<SEP> 20-0, <SEP> 25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> FDA <SEP> 209 <SEP> P <SEP> 0.20 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 0.05
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> penicillin-resistant, <SEP> 62 <SEP> g / ml <SEP> 0, <SEP> 35 <SEP> 62 <SEP> 0, <SEP> 25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> penicillin-resistant, <SEP> 60 <SEP> Jlg / ml <SEP> 0.48 <SEP> 60 <SEP> 0.48
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Silver <SEP> 2,
<tb> penicillin-resistant, <SEP> 6 <SEP> g / ml <SEP> 0, <SEP> 16 <SEP> 6 <SEP> 0. <SEP> 16
<tb> Bacillus <SEP> subtilis, <SEP> penicillin-resistant, <SEP> 100jg / ml <SEP> 0.24 <SEP> 100 <SEP> 0.24
<tb>
<Desc / Clms Page number 5>
In vitro activity of the product P against various test strains.
Various methods were used.
1. Method of continuous dilution in a liquid medium. The bacteria used were isolated from sick people or taken from the laboratory's collection of strains.
Compound examined: P.
Comparison compounds: T and phenoxymethylpenicillin.
The results were noted 18 hours after inoculation. a) First series of tests:
EMI5.1
<tb>
<tb> M. <SEP> I. <SEP> D.
<tb>
product
<tb> bacterial strains <SEP> T <SEP> phenoxymethylpenicillin <SEP> P <SEP>
<tb> staph. <SEP> p. <SEP> aureus <SEP> pen. <SEP> res.
<tb>
100 <SEP> I. <SEP> E./ml <SEP> 0, <SEP> 66 <SEP> Ilg / ml <SEP> 100 <SEP> I. <SEP> E./ml <SEP> or <SEP > 62 <SEP> g / ml <SEP> 0.50 <SEP> g / ml
<tb> staph. <SEP> p. <SEP> aureus <SEP> pen. <SEP> res.
<tb>
200 <SEP> I. <SEP> E./ml <SEP> 0.80 <SEP> g / ml <SEP> 200 <SEP> I. <SEP> E./ml <SEP> or <SEP> 124 < SEP> Ilg / ml <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP> Ilg / ml <SEP>
<tb> staph. <SEP> pen. <SEP> res <SEP> 3 <SEP> I. <SEP> E./ml,
<tb> tetr. <SEP> res. <SEP> 8 <SEP> g / ml <SEP> 8 <SEP> g / ml <SEP> 3 <SEP> I. <SEP> E./ml <SEP> or <SEP> 4 <SEP> g / ml <SEP> 0.80 <SEP> g / ml
<tb>
b) Second series of experiments: (M.I.K. = minimum inhibiting concentration)
With this method, by studying the bacteriostatic and bactericidal effects, the following results were obtained.
2. Squared dilution method.
EMI5.2
<tb>
<tb>
Bacteriostatic <SEP> effect <SEP> Bactericidal <SEP> effect
<tb> Hscherichia <SEP> Coli <SEP> III
<tb> 1. <SEP> Resistant <SEP> to <SEP> penicillin <SEP> 1. <SEP> Resistant <SEP> to <SEP> penicillin
<tb> 2. <SEP> T <SEP> M. <SEP> I. <SEP> K. <SEP> = <SEP> 0.93 <SEP> g / ml <SEP> corresponding to <SEP> 2. < SEP> T <SEP> 1st <SEP> grade <SEP> 100% <SEP> bactericide <SEP> we-
<tb> 0, <SEP> 70 <SEP> g / ml <SEP> tetracycline base <SEP> kung <SEP> = <SEP> 5 <SEP> corresponding to <SEP> 3, <SEP> 78 <SEP> every day / ml <SEP>
<tb> tetracycline base
<tb> 3. <SEP> P <SEP> M. <SEP> I. <SEP> K. <SEP> = <SEP> 0.93 <SEP> g / ml <SEP> corresponding to <SEP> 3. < SEP> P <SEP> 1.
<SEP> Grade <SEP> 100lige <SEP> bactericide <SEP> We-
<tb> 0, <SEP> 43 <SEP> fJg / ml <SEP> tetracycline base <SEP> kung <SEP> = <SEP> 5 <SEP> corresponding to <SEP> 2.38 <SEP> g / ml
<tb> tetracycline base
<tb> Staphylococcus <SEP> Issoudun
<tb> 1. <SEP> Penicillin <SEP>: <SEP> M. <SEP> I. <SEP> I. <SEP> = <SEP> 0.46 <SEP> g / ml <SEP> 1. < SEP> Penicillin: <SEP> 1st <SEP> grade <SEP> 100% <SEP> = <SEP> 0.62 <SEP> g / ml
<tb> 2. <SEP> T <SEP>: <SEP> M. <SEP> I. <SEP> K. <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 62 <SEP> g / ml <SEP> corresponding to <SEP> 2nd <SEP> T <SEP>: <SEP> 1st <SEP> grade <SEP> 100% <SEP> = <SEP> 2.5 <SEP> g / ml <SEP> corresponds to
<tb> 0, <SEP> 46 <SEP> fJg / ml <SEP> tetracycline base <SEP> corresponding <SEP> 1.89 <SEP> g / ml <SEP> tetracycline base
<tb> 3. <SEP> P <SEP>: <SEP> M. <SEP> I. <SEP> K. <SEP> = <SEP> 0.23 <SEP> g / ml <SEP> according to <SEP > 3. <SEP> P <SEP>:
<SEP> l. <SEP> grade <SEP> 100% <SEP> = <SEP> 0.95 <SEP> g / ml <SEP> corresponds to
<tb> 0.10 <SEP> g / ml <SEP> tetracycline base <SEP> and <SEP> correspondingly <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> fJg / ml <SEP> tetracycline base
<tb> 0, <SEP> 09 <SEP> g / ml <SEP> penicillin <SEP> and <SEP> 0, <SEP> 36 <SEP> fJg / ml <SEP> penicillin
<tb>
<Desc / Clms Page number 6>
Results of the bacteriological measurements in the Warburg apparatus.
Experiments in the Warburg apparatus were used to determine the curves for the oxygen consumption of the bacteria, which are based on the breathability of the bacteria and, at the same time, the reproduction of the bacteria.
Phenoxymethylpenicillin, N- (or 9- or 7-) -4'- (ss-hydroxyethyl) -diethylenediaminomethyl-tetracycline and a blind test in which no antibiotic was used were used for comparison. The product obtainable according to the invention shows a completely different and incomparably stronger effect.
This effect is shown graphically in the accompanying drawings in FIGS.
Fig. 1 shows the change in the oxygen consumption of the bacteria.
Fig. 2 shows the growth of Staphylococcus aureus.
In the two families of curves shown in FIGS. 1 and 2, the results observed in the following 4 cases are denoted by 1, 2, 3 and 4, respectively:
Curve 1: without antibiotic (blank sample),
Curve 2: application of phenoxymethylpenicillin at a concentration of 0.23 fig / ml,
Curve 3: Use of N- (or 9- or 7-) - 4'- (0-hydroxyethyl) -diethylenediaminoethyltetracycline in a concentration of 0.4 mg / ml,
Curve 4: Use of the product obtainable according to the invention in a concentration of 0.63 μg / ml.
Even if it initially appears that the doses used to achieve curves 2, 3 and 4 are different from one another, this is not the case, because the dose of 0.63 μg / ml in curve 4 corresponds to the sum the 0.23 jg / ml of curve 2 and the 0.4 j-tg / ml of curve 3.
The curves in FIG. 1 are plotted in the logarithm of the amount of oxygen consumed by the bacteria in mm 3 versus time in hours.
In the curves of Fig. 2, the logarithm of the number of living microorganisms as a function of
Time shown in hours.
FIG. 1 shows the improved results that are achieved with the product according to the invention in the inhibition of the respiration of Staphylococcus aureus.
In the same way, the growth of Staphylococcus aureus is impaired in a striking way by the product obtainable according to the invention:
While curves 1 and 2 show an increase in the number of microorganisms and curve 3 only a constant number, i.e. H. show only one bacteriostasis, curve 4 shows an increasing decrease in this number, i.e. H. a bactericidal effect. The compound obtainable according to the invention therefore has, as already stated above, not only a bacteriostatic but also a bactericidal effect, which in itself is extremely surprising in view of the properties of its individual components.
Taking into account the assumed formula given above, it is interesting to note that the tetracycline part of this formula corresponds to a substance with only bacteriostatic action, the heterocyclic diamine part only corresponds to a solubilizing group and the substituted penicillin part alone does not correspond to any bactericidal substance. In contrast to this, the complex molecule of the product obtainable according to the invention is completely soluble and has a bactericidal effect on all gram-positive bacteria which produce penicillinase, including the Staphylococcus aureus strains.
Its importance and its special position are based on this essential property of the new connection.
It is assumed that the behavior of the new substance according to the invention in the organism can be explained by its physical properties, which show that the new compound, in contrast to the other salts of the tetracycline part than the phenoxymethylpenicillinate, experiences only a very weak and very gradual ionization that each part of the large complex molecule of the substance according to the invention does not appear individually, but rather that this large molecule acts in its entirety with the properties associated with it.
However, the above theoretical considerations are not intended to limit the present invention.
This theory is confirmed to a certain extent primarily by a comparison of the cryoscopic points and the values of the specific resistance of solutions of various salts of N- (or 7- or 9-) -4'- (ss-hydroxyethyl) diethylenediamine methyl tetracycIins:
<Desc / Clms Page number 7>
EMI7.1
<tb>
<tb> Salt <SEP> of the <SEP> connection <SEP> T <SEP> Cryoscopic <SEP> point <SEP> (OC, <SEP> resistance <SEP> (103 <SEP> Ohm / cm,
<tb> aqueous <SEP> 0.05 <SEP> m-solution) <SEP> aqueous <SEP> 0.01 <SEP> m-solution)
<tb> Citrate <SEP> 0.15 <SEP> 0.35
<tb> Glutamate <SEP> 0.14 <SEP> 0.51
<tb> Succinate <SEP> 0.13 <SEP> 0.39
<tb> Phenoxymethyl penicillate <SEP> 0.09 <SEP> 0.74
<tb>
The application of Raoult's equation, by which the lowering of the melting point A is connected with the dissociation constant K of a salt of molecular weight M in aqueous solution of concentration c
EMI7.2
In the present case, the following equation yields - 0.09 = K x 0.05 and thus K = -18
This value for K is practically the one that corresponds to the non-electrolytes, from which it follows
that in 0.05 molar solution at OOC the ionization is practically 0.
These results are also confirmed by conductivity measurements which were carried out at different temperatures with aqueous solutions of different concentrations of the compound obtainable according to the invention. The results are given in the following table:
EMI7.3
<tb>
<tb> C <SEP> M / 94 <SEP> M / 940 <SEP> M / 9. <SEP> 400 <SEP> M / 94.
<SEP> 000
<tb> c <SEP> 0, <SEP> 103 <SEP> 0, <SEP> 032 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP>
<tb> X <SEP> X <SEP> # <SEP> X <SEP> # <SEP> X <SEP> #
<tb> 00C <SEP> 236 <SEP> 23, <SEP> 3 <SEP> 29.6 <SEP> 28 <SEP> 3, <SEP> 6 <SEP> 34 <SEP> 1.28 <SEP> 121
<tb> 200C <SEP> 396 <SEP> 37.5 <SEP> 51 <SEP> 48 <SEP> 6, <SEP> 83 <SEP> 66 <SEP> 2.80 <SEP> 262
<tb> 37 C <SEP> 563 <SEP> 53.5 <SEP> 74 <SEP> 70 <SEP> 8.80 <SEP> 83 <SEP> 3.20 <SEP> 302
<tb>
EMI7.4
<tb>
<tb> X <SEP> corresponds to <SEP> 10- <SEP> # / cm
<tb> 1000X
<tb> c
<tb>
<Desc / Clms Page number 8>
EMI8.1
EMI8.2
EMI8.3
thus look like a partial complex.
This incomplete and slight ionization of the product obtainable according to the invention can certainly serve to explain its particular bacteriological behavior, which may still be incomplete. The same applies to kidney excretion, which is markedly decreased compared to that of the constituents of the new compound. The term "excretion" is used here in its classic medical meaning:
The excretion of a substance, for example urea, is the amount of plasma in ml that contains the amount of substance in g (urea) that is removed in 1 minute of kidney activity. (See.
B. A. Houssay Physiology Humaine-s. 1061-Flammarion Aufl.- [1950].) PATENT CLAIMS:
1. A process for the preparation of a new tetracycline penicillinate with antibiotic action, characterized in that equimolecular amounts of phenoxymethylpenicillin, tetracycline in the form of the base and N-hydroxyethyl-N'-hydroxymethyl diethylenediamine are reacted in a common solvent.