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Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin und seinen Derivaten
Die Erfindung betrifft die Herstellung und die Isolierung von Tetracycline, wie Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin und Dimethylchlortetracyclin, mittels neuer Erdalkalidibenzyläthylendiiminkomplexe des Tatracyclins bzw. der Tetracyclinderivate.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung werden die neuen Komplexe dadurch gebildet, dass man N, N'-Dibenzylidenäthylendiimin - im folgenden A-DBÄD genannt - der Formel C6Hs. CH = N- - CHg-CH -N=CH. C Hg dem Kulturmedium während der Fermentierung oder der bereits fermentierten Brühe in Gegenwart von Erdalkalimetallionen zusetzt ; die Komplexe werden nach der Abscheidung vom Myzel bei einem PH zwischen 8-9, 5 gefällt. Das betreffende Tetracyclin wird dann aus den auf diese Weise erhaltenen Komplexen durch Einstellung des pH auf seinen isoelektrischen Punkt durch Ansäuern freigesetzt.
Vorliegende Erfindung bietet wesentliche Vorteile für die industrielle Anwendung : die Abscheidung wird in wenigen Arbeitsschritten vollendet ; organische Lösungsmittel sind nicht erforderlich ; es weiden billige Trennmittel angewendet und hohe Ausbeuten erzielt.
Wenn A-DBÄD dem Kulturmedium während der Fermentierung zugesetzt wird, wird die Fermenterungsausbeute, d. h. die durch das Medium während der Fermentierung erzielte antibiotische Aktivität um etwa 5-20% gesteigert, u. zw. je nach den Arbeitsbedingungen und dem verwendeten Stamm im Vergleich zu Fermentierungen, die ohne Zusatz von A-DBÄD durchgeführt werden.
Man hat schon vorgeschlagen, zur Gewinnung von Chlortettacyclin und/oder Tetracyclin auf mikrobiologischem Wege mit Hilfe von Streptomyces-Stämmen als fermentierenden Mikroorganismus Streptomyces lusitanus C. B. S. A 101 oder dessen Varianten oder Mutanten zu verwenden, die Fermentation in Gegenwart von Dibenzyläthylendiamin durchzuführen und das entsprechende Tetracyclinderivat in an sich bekannter Weise aus dem Kulturmedium zu gewinnen. Das Verfahren vorliegender Erfindung ist im Hinblick auf den niedrigeren Preis des A-DBÄD wirtschaftlicher, ausserdem werden etwas höhere Ausbeuten erzielt.
Es wird der Brühe eine Menge A-DBÄD zugesetzt, die mindestens gleich einem halben Mol je Mol Antibiotikum entspricht, wenn es sich um die Herstellung von Tetracyclin, Oxytetracyclin und Chlortetracyclin handelt. Wenn Demethylchlortetracyclin hergestellt wird, verwendet man vorzugsweise 1t Mol A-DBÄD je Mol des Antibiotikums.
Um höchste Ausbeuten zu erzielen, setzt man während der Fermentierung 10-1000 mg A-DBÄD je Liter Brühe in verschiedenen Portionen zu und man setzt der angesäuerten und filtrierten Brühe bei einem pl, von 5 die Menge A-DBÄD zu, die erforderlich ist, um die vorstehend angegebenen Verhältnisse, berechnet auf die Menge des während der Fermentierung erzielten Antibiotikums, zu erreichen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Isolierung der Tetracycline mittels der A-DBÄD-Komplexe, wenn diese ausschliesslich in der Phase der bereits fermentierten Brühe durchgeführt wird.
Für die Zwecke der Erfindung kann jeder Tetracycline erzeugende Mikroorganismus verwendet werden,
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Streptomyces rimosus, Streptomyces viridifaciens, Streptomyces sayamaensis, Streptomyces psammoticus, Streptomyces lusitanus, Streptomyces varsoviensis, einschliesslich deren Mutanten.
Das A-DBÄD wird dem Kulturmedium in mehreren Anteilen unter sterilen Bedingungen zugesetzt.
Befriedigende Ergebnisse werden erzielt, wenn das Zusetzen bei Beginn nach 36,96 und 120 Stunden der Fermentierung erfolgt. Die fermentierte Blühe wird dann mit einer Säure, wie Schwefelsäure oder Oxalsäure-auch andere Säuren können verwendet werden-bei einem pH von 0, 5 bis 1, 8 angesäuert.
Die Brühe wird dann filtiiert und das pH mit Ammoniak auf 5 eingestellt, falls die Brühe zur Bildung des A-DBÄD-Komplexes ausreichende Mengen Erdalkalimetallionen enthält, und falls dies nicht der Fall ist, wird das PH mit einem Erdalkalimetallhydroxyd eingestellt. Man setzt die erforderliche Menge A-DBÄD zu, um eine Gesamtmenge von wenigstens einem halben Mol je Mol vorliegenden Tetracyclins, Oxytetra-
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Komplex wird dann ausgefällt.
Eine Analyse der verschiedenen Ansätze ermöglichte festzustellen, dass die gebildeten Komplexe fol-
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:in denen Me ein Erdalkalimetall ist. Ausser den vorstehend angegebenen Komplexen können andere weniger wichtige Komplexe, die eine andere Zusammensetzung haben, hergestellt und gebildet werden.
Man filtriert dann den gebildeten Komplex, wäscht ihn mit Wasser und suspendiert ihn im noch nassen
Zustand in Wasser. Durch Einstellen des pH der Suspension auf den isoelektrischen Punkt des jeweils vorliegenden Tetracyclins mit einer Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Oxalsäure, kann die entsprechende Tetracyclinbase im reinen Zustand hergestellt werden. Durch Umkristallisation der Komplexe unter Anwendung eines geeigneten Lösungsmittels, wie Dimethylformamid und durch Zusetzen von Wasser können die Komplexe in reinem Zustand erhalten werden.
Im Hinblick auf die Tatsache, dass die Brühen im allgemeinen Calciumsalze in einer grossen Menge enthalten, und die mit verdünnter Schwefelsäure angesäuerte Brühe ebenfalls Calciumionen in einer für die Fällung des Komplexes überschüssigen Menge enthält, ermöglicht das Zusetzen eines ,,sequestring agent", wie Äthylensdiamintetraacetat, vor der Fällung des Komplexes, höhere Ausbeuten zu eizielen. Auch das Zusetzen eines Antioxydants zu der angesäuerten Brühe ermöglicht, ein Produkt mit höherem Reinheitsgrad zu eibalten.
Als Antioxydans kann man Ammoniumfoimaldehydsulfoxylat odei irgendein anderes mild wirkendes Antioxydans verwenden.
Die nach der Fällung bei den pH-Werten des isoelektrischen Punktes erhaltenen Basen entsprechen dem Reinheitsgrad, der von den verschiedenen Pharmakopoen gefordert wird, und sie können für medizinische Zwecke verwendet oder in die entsprechenden Säuresalze durch bekannte Verfahren übergeführt werden.
Die weiteren Fermentierungsbedingungen sind im allgemeinen bekannt, und die folgenden Beispiele geben eine eindeutige Veranschaulichung, wie die Fermentierung durchgeführt wird.
Wenn die #-DBÄD-Komplexe hauptsächlich auch zur Isolierung der verschiedenen Tetlacycline dienen, können die Komplexe auch als solche für pharmazeutische Zwecke verwendet werden, da sie eine antibiotische Wirksamkeit in vitro und in vivo haben, die dem entsprechenden Tetracyclin, das sie enthalten,
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50%....................... <SEP> 28 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 14 <SEP> g <SEP>
<tb> Stärke <SEP> 38 <SEP> g <SEP>
<tb> (NH4)2SO4....................... <SEP> 5,7 <SEP> g
<tb> NH4Cl........................... <SEP> 1,5 <SEP> g
<tb> Mus04. <SEP> 4H2O....................... <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> Coil. <SEP> 6 <SEP> H2O <SEP> ....................................0,002g
<tb>
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<tb>
<tb> ZnSÛ4......................................
<SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> g
<tb> Erdnussmehl.................................. <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Specköl <SEP> 35 <SEP> g <SEP> je <SEP> Liter <SEP> Leitungswassei
<tb>
(PH 6, 7-6, 8 nach der Sterilisation) ; es wurde mit 150 1 einer Vorkultur von Streptomyces viridifaciens geimpft und dem Medium je Liter l g A-DBÄD in vier gleichen Anteilen bei Beginn und nach 36,72 und 98 Stunden der Fermentierung zugesetzt. Die Fermentierung wird bei 28 C unter Belüftung von 2 I/Liter per Minute durchgeführt. Nach 150 Stunden erhält man 8, 6 g Tetracyclin je Liter. Das Medium wird dann mit 25%iger Schwefelsäure auf einen PH von 1, 5 angesäuert, mittels eines Trommelfilters filtriert und der Filterkuchen wird dann zweimal mit Wasser bei einem pH von 1, 5 extrahiert.
Man setzt den vereinigten Filtraten 18 kg "Versene" (Äthylendiamintetraacetat als sequestring agent) und 12 kg A-DBÄD zu ; dann wird der pH-Wert mit 12%igem Ammoniak auf 9, 5 eingestellt. Nach 3 Stunden Rühren filtriert man den Niederschlag, der im wesentlichen aus einem unreinen A-DBÄD-Tetracyclincalciumkomplex der Formel ss-DBÄDs. Ca4' Tetracyclin, besteht. Der feuchte Niederschlag wird dann in Wasser suspendiert, mit einer 10% igen wässerigen Lösung von Oxalsäure unter Rühren auf ein pH von 1, 5 eingestellt.
Die Lösung wird dann
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50%..................,....... <SEP> lOg
<tb> Zucker <SEP> 10g
<tb> CaC03....................................... <SEP> 1 <SEP> g <SEP>
<tb> (NHHPO,.................................. <SEP> 2g <SEP>
<tb> KH2PO4........................ <SEP> 2g
<tb> MgSO4.7H2O <SEP> ................... <SEP> 0,25g
<tb> Wasser <SEP> 1000 <SEP> cm <SEP>
<tb>
wurde mit l ml einei Sporensuspension von Streptomyces alboflavus-Mutante M-108-OX (CBS) geimpft und bei 25 C 36 Stunden in einem rotierenden Schüttelgerät auf Temperatur gehalten.
Dann wurde ein Probefermentierungsgerät, das ein sterilisiertes Medium folgender Zusammensetzung enthielt :
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<tb>
<tb> Leitungswasser <SEP> 1201
<tb> Stärke <SEP> , <SEP> 6 <SEP> kg
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50%.......................... <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> kg
<tb> CaCOg....................................... <SEP> 0, <SEP> 72 <SEP> kg
<tb> (NHJ, <SEP> SO4 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> kg
<tb> NH4Cl....................................... <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> kg
<tb> CoCl2......................... <SEP> 0,180g
<tb> CuSO4. <SEP> 5H2O................... <SEP> 0,6 <SEP> g
<tb> ZnS04. <SEP> 7 <SEP> H20................................ <SEP> 6 <SEP> g <SEP>
<tb> FeSO4........................... <SEP> 0,180g
<tb> Sonnenblumenöl.................. <SEP> 0,2 <SEP> kg
<tb>
mit der vorstehend angegebenen, nach 36 Stunden erhaltenen Vorkultur geimpft.
Man setzt 400 mgA-DBAD je Liter in vier gleichen Teilen bei Beginn nach 36,72 und 96 Stunden der Fermentierung zu.
Die Submers-Fermentierung wurde dann bei 260 C unter Rühren und bei einer sterilen Belüftung durchgeführt.
Die Fermentierung wurde nach 150 Stunden abgebrochen ; es ergab sich eine Endkonzentration von 7, 6 g Oxytetracyclin je Liter.
Man säuert die fermentierte Brühe mit Schwefelsäure (25%) bis zu einem PH von 1, 5 an, filtriert sie und das Myzel wird mit Wasser ausgewaschen. Die vereinigten Filtrate ergaben 240 1. Man setzt dann 2 g Äthylendiamintetraacetat als sequestiing agent je Liter zu. Dann stellt man das pi auf 6 mit Ammoniak (12%) ein und gibt 140 g #-DBÄD zu und steigert das pH auf 9,5 mit Ammoniak (12%). Nach dreistündigem Rühren filtriert man und wäscht den gebildeten Niederschlag, bis das PH des Waschwassers 7 erreicht.
Man suspendiert den feuchten Niederschlag in Wasser und säuert mit Oxalsäure (10%) bis zu einem PH von 1, 5 an. Man filtriert die Lösung und stellt das PH auf 5 ein. Die reine Oxytetracyclinbase kristallisiert.
Nach dem Filtrieren und Waschen trocknet man das Produkt ; tatsächliche Ausbeute 87%.
Beispiel 3 : Man verfährt wie im Beispiel 2 angegeben, aber man impft das Medium mit Streptomyces rimosus. 142 Stunden später enthält die Brühe je Liter 6, 3 g Oxytetracyclin ; endgültige Ausbeute 89 .
Beispiel 4 : Man impft 300 l eines sterilen Kulturmediums folgender Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50%........................,. <SEP> 28 <SEP> g <SEP>
<tb> CaCO3............................... <SEP> 12 <SEP> g <SEP>
<tb> Stärke <SEP> 38 <SEP> g <SEP>
<tb> NH4Cl.............................. <SEP> 1,5 <SEP> g
<tb> MnSO4. <SEP> 4H2O......................... <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb>
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<tb>
<tb> ZnCl2.............................. <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> g <SEP>
<tb> CoC12. <SEP> 6H2O........................ <SEP> 0,005g
<tb> Erdnussmehl <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Specköl............................
<SEP> 25 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> 1000 <SEP> ccm
<tb>
(pH 6, 7 nach der Stetilisation) mit einer Sporensuspension von Streptomyces lusitanus 101-A (CBS) und fügt 1200 mg/Liter A-DBÄD in vier gleichen Anteilen dem Medium bei Beginn nach 36,72 und 96 Stunden der Fermentierung zu, die bei 27 C unter Rühren und bei einer sterilen Belüftung durchgeführt wird, wobei die Luftmenge allmählich von 1, 5 I/Liter je Minute auf 4, 0 I/Liter je Minute gesteigert wird. Nach 150 Stunden beträgt die Aktivität
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schlag filtriert, mit Wasser gewaschen und gut abtropfen gelassen. Mai : gibt den noch feuchten Niederschlag zu 12 1 Dimethylformamid und fällt den Komplex durch Zusetzen von 361 Wasser aus und durch
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mg, ausgedrückt in Chlortetracyclinhydrochlorid. Die tatsächliche Ausbeute beläuft sich auf 88, 1%.
Beispiel 5 : Man impft 300 l des wie in Beispiel 4 angegebenen zusammengesetzten Mediums mit einer Sporensuspension einer Demethylchlortetracyclin bildenden Streptomyces aureofaciens-Art. Man setzt dem Medium zu Beginn 100 mg/Liter und jeweils 200 mg/Liter #-DBÄD nach 56 und 112 Stunden Fermentierung zu. Nach 130stündiger Fermentierung erhält man je Liter 2, 8 g Demethylchlortetracyclin. Man setzt dann dem angesäuerten Filtrat 170 g A-DBÄD zu und verfährt weiter, wie im Beispiel 4 angegeben. Das Endprodukt hat folgende Zusammensetzung: 52,8% Demethylchlortetracyclin als wasserfreie Base, 38, 4% A-DBÄD, 6, 72% Calcium und 2, 43% Wasser entsprechend der Formel : Demethylchortetracyclin2.#-DBÄD3.Ca3 in wasserfreiem Zustand. Ausbeute 79%.
Nach dem Verfahren der Erfindung lassen sich folgende Komplexe des Tetracyclins bzw. seiner Derivate herstellen :
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In den vorstehend angegebenen Formeln bedeutet Me ein Erdalkalimetall-Ion.
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Process for the preparation of tetracycline and its derivatives
The invention relates to the production and isolation of tetracyclines, such as tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline and dimethylchlorotetracycline, by means of new alkaline earth dibenzylethylene diimine complexes of the tatracycline or the tetracycline derivatives.
According to one embodiment of the invention, the new complexes are formed by adding N, N'-dibenzylidene ethylenediimine - hereinafter referred to as A-DBAD - of the formula C6Hs. CH = N- - CHg-CH -N = CH. C Hg is added to the culture medium during fermentation or to the already fermented broth in the presence of alkaline earth metal ions; the complexes are precipitated after separation from the mycelium at a pH between 8-9.5. The tetracycline in question is then released from the complexes obtained in this way by adjusting the pH to its isoelectric point by acidification.
The present invention offers significant advantages for industrial use: the deposition is completed in a few work steps; organic solvents are not required; cheap release agents are used and high yields are achieved.
If A-DBAD is added to the culture medium during fermentation, the fermentation yield, i.e. H. the antibiotic activity achieved by the medium during fermentation is increased by about 5-20%, u. depending on the working conditions and the strain used compared to fermentations carried out without the addition of A-DBÄD.
It has already been proposed to obtain chlorotettacycline and / or tetracycline by microbiological means with the help of Streptomyces strains as the fermenting microorganism Streptomyces lusitanus CBS A 101 or its variants or mutants, to carry out the fermentation in the presence of dibenzylethylenediamine and the corresponding tetracycline derivative in to be obtained from the culture medium in a manner known per se. The process of the present invention is more economical in view of the lower price of the A-DBÄD, and somewhat higher yields are achieved.
An amount of A-DBAD is added to the broth which is at least equal to half a mole per mole of antibiotic when it comes to the manufacture of tetracycline, oxytetracycline and chlortetracycline. When preparing demethylchlorotetracycline, it is preferred to use 1t mole of A-DBAD per mole of antibiotic.
In order to achieve the highest yields, 10-1000 mg of A-DBÄD per liter of broth are added in various portions during the fermentation and the amount of A-DBÄD required is added to the acidified and filtered broth at a p of 5 to achieve the ratios given above, calculated on the amount of antibiotic obtained during fermentation.
The present invention also relates to the isolation of the tetracyclines by means of the A-DBAD complexes when this is carried out exclusively in the phase of the already fermented broth.
For the purposes of the invention, any tetracycline-producing microorganism can be used,
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Streptomyces rimosus, Streptomyces viridifaciens, Streptomyces sayamaensis, Streptomyces psammoticus, Streptomyces lusitanus, Streptomyces varsoviensis, including their mutants.
The A-DBAD is added to the culture medium in several portions under sterile conditions.
Satisfactory results are obtained when the start-up is added after 36, 96 and 120 hours of fermentation. The fermented flower is then acidified with an acid such as sulfuric acid or oxalic acid - other acids can also be used - at a pH of 0.5 to 1.8.
The broth is then filtered and the pH adjusted to 5 with ammonia if the broth contains sufficient amounts of alkaline earth metal ions to form the A-DBAD complex, and if not, the pH is adjusted with an alkaline earth metal hydroxide. The required amount of A-DBÄD is added to produce a total of at least half a mole per mole of tetracycline, oxytetra-
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The complex is then precipitated.
An analysis of the various approaches made it possible to determine that the complexes formed
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: in which Me is an alkaline earth metal. In addition to the complexes indicated above, other less important complexes which have a different composition can be prepared and formed.
The complex formed is then filtered, washed with water and suspended while it is still wet
State in water. By adjusting the pH of the suspension to the isoelectric point of the tetracycline present in each case with an acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or oxalic acid, the corresponding tetracycline base can be produced in the pure state. By recrystallizing the complexes using a suitable solvent such as dimethylformamide and adding water, the complexes can be obtained in a pure state.
In view of the fact that the broths generally contain calcium salts in a large amount and the broth acidified with dilute sulfuric acid also contains calcium ions in an amount in excess for the precipitation of the complex, the addition of a "sequestring agent" such as ethylene diamine tetraacetate enables Aiming at higher yields prior to the precipitation of the complex. The addition of an antioxidant to the acidified broth also enables a product with a higher degree of purity to be obtained.
The antioxidant used can be ammonium foimaldehyde sulfoxylate or any other mild antioxidant.
The bases obtained after the precipitation at the pH values of the isoelectric point correspond to the degree of purity required by the various pharmacopoeias and they can be used for medical purposes or converted into the corresponding acid salts by known methods.
The other fermentation conditions are generally known and the following examples give a clear illustration of how the fermentation is carried out.
If the # -DBÄD complexes are also mainly used to isolate the various tetlacyclines, the complexes can also be used as such for pharmaceutical purposes, since they have an antibiotic activity in vitro and in vivo which is similar to the corresponding tetracycline they contain,
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<tb>
<tb> Corn spring water <SEP> 50% ....................... <SEP> 28 <SEP> g <SEP>
<tb> Calcium carbonate <SEP> 14 <SEP> g <SEP>
<tb> Strength <SEP> 38 <SEP> g <SEP>
<tb> (NH4) 2SO4 ....................... <SEP> 5.7 <SEP> g
<tb> NH4Cl ........................... <SEP> 1.5 <SEP> g
<tb> Mus04. <SEP> 4H2O ....................... <SEP> 0.05 <SEP> g
<tb> coil. <SEP> 6 <SEP> H2O <SEP> .................................... 0.002g
<tb>
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<tb>
<tb> ZnSÛ4 ......................................
<SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> g
<tb> Peanut flour .................................. <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Bacon oil <SEP> 35 <SEP> g <SEP> per <SEP> liter <SEP> tap water egg
<tb>
(PH 6, 7-6, 8 after sterilization); 150 l of a preculture of Streptomyces viridifaciens were inoculated and 1 g of A-DBAD per liter was added to the medium in four equal proportions at the beginning and after 36, 72 and 98 hours of fermentation. The fermentation is carried out at 28 ° C. with aeration of 2 l / liter per minute. After 150 hours, 8.6 g of tetracycline are obtained per liter. The medium is then acidified to a pH of 1.5 with 25% sulfuric acid, filtered using a drum filter and the filter cake is then extracted twice with water at a pH of 1.5.
18 kg of "Versene" (ethylenediaminetetraacetate as sequestring agent) and 12 kg of A-DBÄD are added to the combined filtrates; then the pH is adjusted to 9.5 with 12% ammonia. After stirring for 3 hours, the precipitate, which consists essentially of an impure A-DBÄD-tetracycline calcium complex of the formula SS-DBÄDs, is filtered off. Ca4 'tetracycline. The moist precipitate is then suspended in water and adjusted to a pH of 1.5 with a 10% strength aqueous solution of oxalic acid while stirring.
The solution will then
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<tb>
<tb> Corn spring water <SEP> 50% .................., ....... <SEP> lOg
<tb> Sugar <SEP> 10g
<tb> CaC03 ....................................... <SEP> 1 <SEP> g <SEP>
<tb> (NHHPO, .................................. <SEP> 2g <SEP>
<tb> KH2PO4 ........................ <SEP> 2g
<tb> MgSO4.7H2O <SEP> ................... <SEP> 0.25g
<tb> water <SEP> 1000 <SEP> cm <SEP>
<tb>
was inoculated with 1 ml of a spore suspension of Streptomyces alboflavus mutant M-108-OX (CBS) and kept at 25 ° C. for 36 hours in a rotating shaker.
A sample fermentation device containing a sterilized medium of the following composition was then used:
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<tb>
<tb> tap water <SEP> 1201
<tb> strength <SEP>, <SEP> 6 <SEP> kg
<tb> Corn spring water <SEP> 50% .......................... <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> kg
<tb> CaCOg ....................................... <SEP> 0, <SEP > 72 <SEP> kg
<tb> (NHJ, <SEP> SO4 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> kg
<tb> NH4Cl ....................................... <SEP> 0, <SEP > 2 <SEP> kg
<tb> CoCl2 ......................... <SEP> 0.180g
<tb> CuSO4. <SEP> 5H2O ................... <SEP> 0.6 <SEP> g
<tb> ZnS04. <SEP> 7 <SEP> H20 ................................ <SEP> 6 <SEP> g <SEP >
<tb> FeSO4 ........................... <SEP> 0.180g
<tb> sunflower oil .................. <SEP> 0.2 <SEP> kg
<tb>
inoculated with the above-mentioned preculture obtained after 36 hours.
400 mgA-DBAD per liter is added in four equal parts at the start of the fermentation after 36, 72 and 96 hours.
The submerged fermentation was then carried out at 260 ° C. with stirring and sterile ventilation.
The fermentation was stopped after 150 hours; it resulted in a final concentration of 7.6 g oxytetracycline per liter.
The fermented broth is acidified with sulfuric acid (25%) to a pH of 1.5, filtered and the mycelium is washed out with water. The combined filtrates gave 240 l. 2 g of ethylenediaminetetraacetate as sequestering agent are then added per liter. Then the pi is set to 6 with ammonia (12%) and 140 g # -DBÄD are added and the pH is increased to 9.5 with ammonia (12%). After stirring for three hours, the mixture is filtered and the precipitate formed is washed until the pH of the wash water reaches 7.
The moist precipitate is suspended in water and acidified with oxalic acid (10%) to a pH of 1.5. The solution is filtered and the pH is adjusted to 5. The pure oxytetracycline base crystallizes.
After filtering and washing, the product is dried; actual yield 87%.
Example 3: The procedure is as stated in Example 2, but the medium is inoculated with Streptomyces rimosus. 142 hours later, the broth contains 6.3 g oxytetracycline per liter; final yield 89.
Example 4: 300 l of a sterile culture medium of the following composition are inoculated:
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<tb>
<tb> Corn spring water <SEP> 50% ........................,. <SEP> 28 <SEP> g <SEP>
<tb> CaCO3 ............................... <SEP> 12 <SEP> g <SEP>
<tb> Strength <SEP> 38 <SEP> g <SEP>
<tb> NH4Cl .............................. <SEP> 1.5 <SEP> g
<tb> MnSO4. <SEP> 4H2O ......................... <SEP> 0.05 <SEP> g
<tb>
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<tb>
<tb> ZnCl2 .............................. <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> g <SEP>
<tb> CoC12. <SEP> 6H2O ........................ <SEP> 0.005g
<tb> peanut flour <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Bacon oil ............................
<SEP> 25 <SEP> g
<tb> water <SEP> 1000 <SEP> ccm
<tb>
(pH 6.7 after the stabilization) with a spore suspension of Streptomyces lusitanus 101-A (CBS) and add 1200 mg / liter A-DBÄD in four equal proportions to the medium at the start of the fermentation after 36, 72 and 96 hours is carried out at 27 C with stirring and with sterile ventilation, the amount of air being gradually increased from 1.5 l / liter per minute to 4.0 l / liter per minute. After 150 hours the activity is
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filtered, washed with water and allowed to drain well. May: gives the still moist precipitate to 12 l of dimethylformamide and precipitates the complex by adding 36 l of water and through
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mg expressed in chlorotetracycline hydrochloride. The actual yield is 88.1%.
EXAMPLE 5 300 l of the medium composed as described in Example 4 are inoculated with a spore suspension of a Streptomyces aureofaciens species which produces demethylchlorotetracycline. 100 mg / liter and 200 mg / liter # -DBÄD are added to the medium at the beginning after 56 and 112 hours of fermentation. After 130 hours of fermentation, 2.8 g of demethylchlorotetracycline are obtained per liter. 170 g of A-DBAD are then added to the acidified filtrate and the procedure is continued as indicated in Example 4. The final product has the following composition: 52.8% demethylchlortetracycline as anhydrous base, 38.4% A-DBÄD, 6, 72% calcium and 2, 43% water according to the formula: Demethylchortetracycline2. # - DBÄD3.Ca3 in an anhydrous state. Yield 79%.
The following complexes of tetracycline or its derivatives can be prepared using the method of the invention:
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In the above formulas, Me denotes an alkaline earth metal ion.