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Les technologies de l’ADN recombinant

1- Les outils de la biologie moléculaire :
I- Enzymes de restriction :
1- Définition :
Leur fonction consiste à couper l’ADN au niveau de la liaison phosphodiester, libérant deux fragments
un se terminant, généralement, par un 3’OH et l’autre par un 5’ phosphate. On distingue les
exonucléases qui digèrent l'ADN en retirant les nucléotides à partir de l'extrémité et les
endonucléases qui coupent au milieu de l’ADN.
Les endonucléases de restriction sont des enzymes bactériennes participant à un mécanisme de
défense des bactéries vis-à-vis des virus. Pour détruire l’ADN du parasite, la bactérie exprime des
gènes de restriction. Les gènes de restriction permettent la synthèse d’endonucléases coupant l’ADN
en des sites très spécifiques.
2- Types d’enzymes :
Il y a trois types d’enzymes de restriction :
 Le type I reconnaît une séquence d'ADN, puis se déplace, s'arrête 1000 à 5000 paires de
bases plus loin et libère quelques dizaines de nucléotides.
 Le type II, coupe l'ADN au niveau de la séquence reconnue.
 Le type III coupe une vingtaine de nucléotides plus loin que le site de reconnaissance.

3- Enzymes utilisables en génie génétique :

Seuls les Enzymes de restriction de classe II sont utilisés en génie génétique ; clivant spécifiquement
les deux brins de l'ADN au niveau d'une séquence, en général palindromique, parfaitement définie (de
4 à 8 nucléotides). Le nom de chaque enzyme est dérivé du nom d’espèce ou de variété de la Bactérie
qui la produit.
Les enzymes de restriction sont des hydrolases, agissant sur des liaisons esters, c’est-à-dire des
estérases. Elles catalysent la coupure de l’ADN, non méthylé en des endroits caractérisés par une
séquence spécifique de nucléotides (site de restriction formé de 4 à 8 nucléotides).
Les extrémités des fragments de restriction peuvent être formées de deux brins d’égale longueur
(bouts francs) ou bien présenter un brin plus long que l’autre de quelques nucléotides (bouts
collants).

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II- Vecteurs :
1- Définition :
Un vecteur est une structure biologique capable de complexer une macromolécule et de l’intégrer
spécifiquement dans une cellule vivante. C’est un transporteur capable de conduire une molécule à
pénétrer dans une cellule alors qu’elle n’est pas captée spontanément par cette cellule.
En biologie moléculaire et génie génétique, certains vecteurs sont étudiés pour faire entrer un acide
nucléique dans une cellule et permettre la réplication ou l’expression de cet acide nucléique dans la
cellule qui le reçoit. Les plasmides bactériens, les bactériophages et de nombreux virus sont des
vecteurs naturels permettant la transformation de différents types de cellules hôtes.
A- Plasmide :
1- Définition :
En biologie moléculaire, un plasmide est une molécule d'ADN distincte de l'ADN chromosomique, et non
essentielle à la survie de la cellule. Les plasmides sont bicaténaires (constitués de deux brins
complémentaires) et généralement circulaires, qui possède obligatoirement une origine de réplication,
afin qu'il puisse se répliquer de manière autonome dans la cellule et un gène de sélection pour qu'il ne
soit pas perdu par l'organisme au fil des multiplications cellulaires.
2- Fonction :
Dans la nature, les plasmides sont des morceaux d'ADN qui peuvent se transmettre par transfert
horizontal, de cellule en cellule. S'il porte un gène d'intérêt (résistance à un antibiotique par exemple),
c'est un avantage certain pour les cellules qui le possèdent.
Les plasmides utilisés en recherche biomoléculaire peuvent être bien plus complexes, et
notamment contenir également des cassettes de clonage, qui sont en fait des séquences courtes
reconnues par des enzymes de restriction capables de couper l'ADN au niveau de ces séquences.
3- Les plasmides sont utilisés comme vecteur de clonage :
Par des expériences de recombinaison in vitro, on sait intégrer dans la molécule d'un plasmide un
fragment d'ADN provenant d'une autre source. On obtient ainsi un plasmide recombiné ou plasmide
chimère. On peut faire pénétrer ces molécules recombinées dans des cellules dépourvues de
plasmide (transformation). On peut repérer les cellules qui ont reçu une molécule de plasmide grâce
aux gènes du plasmide qui sont sélectionnables (résistance à un antibiotique par exemple).
Parmi ces cellules, on pourra, dans certains cas, reconnaître (ou sélectionner) celles qui portent un
plasmide ayant intégré un fragment particulier de l'ADN étranger.
L'ensemble des descendants d'une telle cellule constitue un clone. On dit que l'on a cloné un fragment
d'ADN.

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4- Les plasmides sont utilisés comme vecteur d'expression :

Une fois un fragment d'ADN cloné dans un plasmide on peut réussir à faire exprimer les gènes
qu'il porte dans les cellules recevoir. Cette expression nécessite la transcription de ce
fragment et la traduction du messager. On peut ainsi faire fabriquer à ces cellules des
protéines étrangères (par exemple, l'insuline humaine, l'hormone de croissance humaine).

B- Virus :
1- Définition :
Les virus sont des assemblages plus ou moins complexes entre des protéines et un acide nucléique,
qui peut être soit de l'ADN, soit de l'ARN, mais jamais les deux. Les virus se multiplient en utilisant la
machinerie métabolique d'une cellule-hôte (ribosomes, ARN de transfert, enzymes de la transcription
et de la traduction) dont ils sont eux-mêmes dépourvus. C'est pourquoi ce sont des parasites absolus :
ils ne peuvent se multiplier dans un milieu de culture inerte ; il leur faut s'implanter dans une cellule
vivante (bactérie, des animaux et de l'homme).
L'organisation générale d'un virus simple comporte essentiellement un génome constitué par un acide
nucléique (ADN ou ARN), porteur d'une information génétique spécifique. Ce génome est protégé par
un système de sous-unités protéiques dont l'organisation obéit, dans le cas des virus simples.
2- Mode de transmission :
Quelle que soit la structure de protection (appelée capside dans les cas les plus simples), l'infection
d'une cellule résulte toujours de l'introduction (selon des modalités diverses), dans cette dernière, du
génome du virus. L'expression de ce génome dans les cellules infectées conduit à la multiplication des
virus et à la manifestation du pouvoir pathogène. Dans quelques cas (rétrovirus), le génome viral
s'intègre dans l'ADN de la cellule-hôte, dont il transforme les propriétés (conversion dans le cas des
bactéries infectées par certains bactériophages, transformation tumorale dans le cas des virus
oncogènes).
3- Vecteur viral :
Les vecteurs viraux sont des outils couramment utilisés en biologie moléculaire pour délivrer un
gène d’intérêt - ou par extension, une construction génétique d’intérêt - à l'intérieur de cellules. Ce
procédé peut être utilisé sur un organisme vivant (in vivo) ou sur des cellules maintenues en culture
(in vitro). L'évolution a permis aux virus de développer des mécanismes spécifiques et
particulièrement efficaces pour incorporer leur génome à l'intérieur des cellules qu'ils infectent. Ce
mécanisme d'incorporation de matériel génétique (ADN ou ARN) s'appelle la transduction.
Des virus spécifiques ont été sélectionnés en tant que des véhicules de distribution de gène selon leur
capacité de transporter les gènes étrangers, ainsi que leur capacité de livrer commodément les
gènes qui sont liés à l'expression du gène efficace.

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III- Sonde :
1- Définition :
C’est la propriété d’appariement des acides nucléiques, selon les lois de la complémentarité entre
deux séquences de bases qui a permis d’élaborer cette méthode de détection des fragments. Il suffit
de disposer d’une copie fidèle et pure d’un gène pour repérer la séquence complémentaire sur le
génome. Cette copie, appelée sonde, est spécifique, c’est-à-dire qu’elle ne peut s’hybrider qu’avec le
gène dont elle est la copie. Le " marquage " de la sonde par des isotopes radioactifs ; et plus rarement
par des marqueurs non radioactifs, dits froids repérables au moyen d’anticorps ; permet de la suivre
jusqu’à son point de fixation.
A- Sondes Génomiques :
1- Définition :
La technique de Southern blot est une méthode de biologie moléculaire. C'est une étape essentielle
dans l'obtention des empreintes génétiques. Elle intervient après l'électrophorèse. Elle consiste à
détecter spécifiquement des fragments d’ADN transférés sur filtre par leur hybridation à des
séquences complémentaires marquées par un radioisotope.
2- Protocole :
 Extraction de l’ADN génomique : Cette extraction s’effectue à partir des leucocytes
circulants par exemple obtenus à partir de sang total.
 Digestion par des enzymes de restriction différentes du même ADN génomique : L’ADN
génomique est digéré par des enzymes de restriction différentes. On peut bien entendu
réaliser des digestions par deux enzymes dans un même tube. Dans ces conditions, on obtient
un très grand nombre de fragments, mais seuls quelques fragments correspondent à une
partie ou à la totalité du gène étudié.
 Séparation par l’électrophorèse des fragments d’ADN par électrophorèse dans un gel
d’agarose : Après séparation par l’électrophorèse en gel d’agarose des fragments d’ADN
bicaténaires obtenus par digestion enzymatique, on réalise une dénaturation des fragments
par un traitement alcalin du gel d’électrophorèse. Ce traitement transforme les fragments
d’ADN double brin (ou bicaténaires) en fragments d’ADN monobrin (ou monocaténaires).
 Transfert des fragments monocaténaires du gel d’agarose à un support souple (feuille
de nylon par exemple) : Le transfert des fragments monocaténataires du gel d’agarose à un
support type nylon s’effectue par simple capillarité.
 Les fragments monocaténaires d’ADN transférés sur un support solide souple : (nylon)
sont mis en présence d’une sonde qui va s’hybrider dans des conditions physico-chimiques
bien définies. On parle de conditions optimales de stringence. La sonde s’apparie avec les
fragments d’ADN monocaténaire selon les règles de complémentarité. De plus, elle est
marquée avec un radioisotope (soit à son extrémité 5’, soit à l’intérieur de la chaîne
polynucléotidique).

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 Lavages et révélation (dans ce cas par autoradiographie) : Après de nombreux lavages, le

support solide est mis en contact avec un film photographique pendant plusieurs jours. Le film
est ensuite révélé. Les bandes d’ADN monocaténaires hybridées avec la sonde radioactive
sont visibles sous forme de bandes noires sur un fond blanc. La position de ces bandes par
rapport à des témoins de poids moléculaire permet de déterminer la taille de ces fragments.

3- Résultats :
La sonde va révéler la position sur la membrane des fragments d'ADN recherchés.
Plusieurs situations peuvent se présenter : Les fragments d'ADN sont semblables au lieu
d'hybridation de la sonde et à proximité de celui-ci et les fragments sont de même taille
: il n'y a pas de polymorphisme.

Figure 01 : Exemple d’une autoradiographie

B- Sondes oligonucléotidiques :
1- Définition :
Pour pouvoir reconnaître spécifiquement une séquence d'ADN, on utilise au laboratoire un petit
morceau d'ADN synthétisé (sonde) dont la séquence correspond au moins en partie à celle d'un des
brins du DNA. Parce qu'elle est complémentaire de l'autre brin du DNA, la sonde est capable de se fixer
spécifiquement sur l'autre brin à l'endroit où se lit la séquence complémentaire. En marquant cette
sonde par un atome radioactif ou par une molécule fluorescente liés covalentiellement à un des
nucléotides de la sonde, on peut détecter la sonde et le morceau d'ADN complémentaire qui lui est
hybridé.
2- Protocol :
 Un fragment d’ADN double brin affecte normalement une structure secondaire en double
hélice. En élevant la température, on disjoint 50 % environ des liaisons hydrogène qui unissent
les brins d'ADN, ce qui dénature partiellement la double hélice. Lorsque la température atteint
95°C.
 Toutes les liaisons hydrogène sont rompues et la dénaturation de l'ADN est complète : ADN
simple brin, qualifié de « dénaturé ». En refroidissant brutalement (glace) les structures
secondaires ne se reforment pas et l'ADN reste dénaturé. Si on refroidit doucement, la double
hélice se reforme progressivement.
 Un oligonucléotide (sonde) ajouté à ce moment peut s'hybrider avec un fragment
complémentaire de l'ADN, dès que la température descend en-dessous d'un certain seuil.
 L'hybridation d'une sonde marquée (atomes radioactifs, radicaux fluorescents ou ligands
spécifiques) sur un ADN dénaturé permet de marquer spécifiquement tous les fragments de
cet ADN dont la séquence est complémentaire de la sonde.

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C- Sondes radioactives (marqueurs radioactives) :

1- Introduction :
Le marquage est principalement employé dans toutes les techniques qui utilisent une sonde. On
distingue le marquage dit 'chaud' utilisant des isotopes radioactifs, et les marquages 'froids' qui
utilisent des molécules aux propriétés fluorescentes, luminescentes.
2- Définition :
On distingue plusieurs méthodes selon la localisation du marquage (extrémités ou interne à la
molécule) et selon la nature de la séquence marquée (simple ou double brin).
Le Phosphore 32 est le radioisotope le plus utilisé. Incorporé dans la sonde enzymatiquement au
moyen d'un ou plusieurs nucléotides triP radiomarqués. Il existe des sondes mono ou double brins
Soufre 35, H3 utilisés plutôt pour le séquençage et hybridation in situ.
Le soufre n’est normalement pas présent dans les acides nucléiques mais comme il est proche de
l’oxygène on peut faire des analogues soufrés des nucléotides dans lesquels un oxygène est remplacé
par un soufre. Le choix de l’isotope dépendra de l’utilisation de la sonde. On emploiera un rayonnement
fort pour une détection sur un filtre, et un rayonnement moins énergétique pour une détection en
microscopie.
La détection des radioisotopes peut se faire de plusieurs manières : i) en utilisant un compteur à
scintillation, ii) par radioautographie (film sensible ou émulsion) iii) par un scanner spécial, le
phosphoimager.
Les sondes radioactives présentent un avantage de la grande sensibilité mais présentent de nombreux
inconvénients. Elle nécessite de se protéger du rayonnement émis et un maniement des sondes
inconfortable. La décroissance rapide du P 32 ce qui nécessite un besoin de marquer les sondes
fréquemment.
3- Sonde de doubles brins :
Marquage par amorçage au hasard :
Très employé dans les laboratoires pour par exemple les Southern et Northern Blot, il permet
d'obtenir des activités spécifiques plus élevées, nécessaires pour détecter un gène sur quelques mg
d'ADN génomique. Dans cette technique de marquage, les deux brins d'ADN de la sonde sont
préalablement séparés par chauffage suivi d'un refroidissement brutal.
Puis, on ajoute un mélange d'oligonucléotides Ces oligonucléotides vont s'hybrider avec le sonde pour
une partie d'entre eux. Ces oligonucléotides fixés vont servir d'amorces au fragment de Klenow de
l'ADN polymérase I qui va reconstituer l'intégrité des deux fragments en présence de
désoxynucléosides triphosphates (ATP) marqués au 32P.

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D- Sondes froides :
1- Définition :
On peut utiliser des marquages non radioactifs. Dans ce dernier cas, on parle de sonde froide. Les
deux types de marquage froid les plus souvent utilisés sont les marquages à la biotine et à la
digoxigénine. Ces deux composés sont fixés sur un nucléotide, lui-même incorporé à la sonde.
La biotine est la vitamine H. C'est un cofacteur de réactions enzymatiques impliquées dans
l'incorporation ou le transfert de CO2.