Université des Sciences et de la Technologie d’Oran "Mohamed Boudiaf"

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Génétique Moléculaire Appliquée

Unité d’enseignement Fondamentale 2 (UEF 3.1.2) : Biologie Moléculaire

Matière 1 : Biologie Moléculaire et Génie Génétique

Spécialité : Génétique

BCG/LMD 3ème année Licence

Dr. Nadjet BOUSHABA

Année universitaire 2020-2021

 Programme

A. Biologie Moléculaire

Chapitre I. Méthodologie en Biologie Moléculaire

I. Méthodes de caractérisation et analyse de l’ADN
1. Extraction et purification de l’ADN
2. Quantification
3. Séparation analytique et visualisation
4. Fragmentation
5. Restriction et analyse du polymorphisme
6. Amplification (PCR et ses applications)

Chapitre II. Système de restriction-modification

1. Enzymes de restriction
2. Carte de restriction
B. Génie Génétique
Chapitre I. Sources et préparation de l’ADN à cloner

1. ADN génomique
2. ADN complémentaire
3. ADN synthétique

Chapitre II. Vecteurs de clonage

1. Vecteurs bactériens
1.1 Plasmides
1.2 Phages
1.3 Cosmides
1.4 PAC
1.5 BAC
2. Vecteurs de clonage dans la levure
2.1 Vecteurs intégratifs
2.2 Vecteurs autonomes dérivés du chromosome ou du plasmide 2μ
2.3 Chromosomes artificiels

3. Vecteurs eucaryotes (cellules animales)

3.1 Plasmides non réplicatifs
3.2 Plasmides réplicatifs
3.3 Virus

4. Vecteurs eucaryotes (cellules végétales) : Plasmide Ti et ADNT

Chapitre III. Procédés de ligation du vecteur et de l’ADN à cloner

1. Enzymes ligases
2. Procédés de ligation

Chapitre IV. Transfert de l’ADN dans les cellules

1. Transfert direct
1.1 Biolistique

2. Transformation/transfection
2.1 Méthodes chimiques : au chlorure de calcium (bactéries)
2.2 Co-précipitation de l’ADN et du phosphate de calcium
2.3 DAEA-dextran
2.4 Fusion des protoplastes
2.5 Electroporation
2.6 Transduction virale (encapsidation in vitro)
Chapitre V. Notion de banque d’ADN génomique et complémentaire

1. Banque d’ADN génomique

2. Banque d’ADNc

Chapitre VI. Sélection des transformants recombinants

Sélection par complémentation

Chapitre VII. Criblage pour la détection des clones d’intérêt

1. Hybridation des acides nucléiques

2. Détection des produits d’expression

Chapitre VIII. Notions de transgénèse animale et végétale

1. Transgénèse animale
2. Transgénèse végétale
Cours : 01 Chapitre I. Méthodologie en Biologie Moléculaire (1/2)

Chapitre I.
Méthodologie en Biologie Moléculaire (1/2)
A. Biologie Moléculaire
1. Définition

 Science qui étudie le fonctionnement d’une cellule vivante au niveau de ses

molécules (ADN, ARN et protéines). Elle fait appel à la Génétique, la Biochimie et
la Physique
2. Extraction et purification de l’ADN

 L'extraction de l'ADN est une technique permettant d'isoler l'ADN de cellules ou

de tissus. L’ADN extrait peut être utilisé pour des recherches de Biologie
Moléculaire, telles que le séquençage, la PCR (Plymerase Chain Reaction) ou le
clonage.
 L’ADN peut être extrait à partir de :

- Tissus (organes, biopsie)

- Sang
- Muqueuse buccale
- Cellules en culture
- Sperme
- Urine, larmes, bulbe de cheveux ou de poils, ongles, …
- Sécrétions vaginales
- ADN de contact.
 Différentes méthodes d’extraction de l’ADN :

- Au phénol
Toxiques
- Chlorure de guanidinium

- NaCl2 (Salting-Out) Non toxique, non coûteuse

Protocole expérimental (sang total) au NaCl2
Méduse
Conservation de l'ADN

Le stockage des acides nucléiques se fait au froid :

- Pour un stockage à court terme, l'ADN est gardé à + 4°C

- Pour un stockage à long terme, l'ADN est placé à - 20°C
 3. Quantification de l’ADN

 Dosage de l’ADN par spectrophotométrie

 Mesure l’absorbance ou Densité Optique (DO) de l’ADN dans l'ultra-violet à

260 nm

 Mesure l’absorbance des protéines à 280 nm (éventuelle contamination par les

protéines)
Dilution de l’ADN Cuves en Quartz
(1/100)

Spectrophotomètre
Quantification et analyse d’ADN par spectrophotométrie.
1 Unité de densité optique à 260 nm correspond à :

 Une solution d’ ADN double brin à 50 μg/ml,

 Une solution d’ADN simple brin ou ARN à 25μg/ml.

Pureté d'un échantillon ADN

Ratio Valeur Indication de pureté

< 1,8 Présence de protéines

260/280
>2 Contamination ARN

1,8 - 2 ADN pur

Concentration de l’ADN = DO260 nm x 50 x 100 = µg/ml ou ng/µl

1 U DO260 = 50 µg/ml d’ADN

Facteur de dilution de l’ADN = 100

4. Fragmentation

 La fragmentation de l’ADN correspond à des cassures dans le matériel

génétique à des sites spécifiques à l’aide d’enzyme de restriction

 Conditions d’incubation : tampon, température et temps

 1 Unité d’enzyme de restriction peut digérer 1 µg d’ADN dans des conditions

adéquates.
5. Séparation analytique et visualisation

 Electrophorèse en gel d’agarose est une technique qui permet de séparer des
fragments d’ADN en fonction de leur taille en utilisant un champ électrique

 Taille des fragments d’ADN est déterminée en présence d’un marqueur de taille

 Bromure d’éthidium (BET) est un agent intercalant : colorer l’ADN sous les
ultra-violets

 Bleu de bromophénol est un colorant : voir le front de migration

 Sucrose : alourdisseur de l’ADN.

BET dans le gel d’agarose Mise en place du peigne et des joints de coulage

Cathode
(-)
Sens de la
migration
Anode
(+)
Marquer
de taille
Echantillons

Taille du
fragments
d’ADN

Visualisation des fragments d’ADN sous U.V.

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Département de Génétique Moléculaire Appliquée

Unité d’enseignement Fondamentale 2 (UEF 3.1.2) : Biologie Moléculaire

Matière 1 : Biologie Moléculaire et Génie Génétique

Spécialité : Génétique

BCG/LMD 3ème année Licence

Dr. Nadjet BOUSHABA

Année universitaire 2020-2021

Cours : 02 Chapitre I. Méthodologie en Biologie Moléculaire (2/2)

Chapitre I.
Méthodologie en Biologie Moléculaire
(2/2)
5. Restriction et analyse du polymorphisme

 Le polymorphisme de restriction désigne des variations interindividuelles d’une

séquence d’ADN révélée par des modifications de la longueur des fragments de
restriction

 Le profil obtenu avec une enzyme de restriction donnée montre les différences
individuelles
 Technique de Southern-blot

 Technique de biologie moléculaire mise au point par E. M. Southern (1975)

 Elle permet de détecter spécifiquement des fragments d'ADN transférés sur un

filtre par leur hybridation à des séquences complémentaires (sondes) marquées par
un radioisotope
Southern-blot
 Détermination de la taille des
Test de digestion enzymatique
fragments sur une feuille semi-log.
Avantages du Southern-blot
 Outil très puissant car les phénomènes observés sont codominants

Inconvénients

 Longue et laborieuse

 Couteuse (P32)

 Non automatisée

 Toxique (radioactivité)

 Quantité d’ADN utilisée 1 µg = 150 000 cellules.

 6. Amplification (PCR et ses applications)

 Méthode d’amplification d’ADN in vitro a été conçue au début des année 80 par
Kary B. Mullis, publiée pour la première fois en 1985. Il a reçu le prix Nobel de
Chimie en1993

 Elle permet d'obtenir un grand nombre de copies identiques d'une séquence d’ADN
connue

 Séquence initiale est amplifiée 1 million de fois

 Rendement est de 80%.

 Etapes de la réaction de la PCR

Etape 1 : Dénaturation : les deux brins d'ADN sont séparés par chauffage (95 °C, 5
minutes)

Etape 2 : Hybridation de la matrice avec les amorces de 20 à 25 nucléotides situées

de part et d’autre en 3’ de la séquence à amplifier (50 - 64°C, 30 secondes)

Etape 3 : Elongation à partir des amorces par une enzyme Taq polymérase (72°C, 30
secondes) grâce aux oligonucléotides (dNTP) présents dans le milieu de réaction

 Les étapes 1 à 3 qui constituent un cycle d'amplification est reproduit

successivement de 30 à 40 fois

 Un thermocycleur permet d'automatiser la réaction de PCR en programmant des

cycles consécutifs de 20 à 40 fois.
 Exploration de la séquence amplifiée

Hybridation Electrophorèse Séquençage Clonage

Gel d’agarose Gel de polyacrylamide

 Applications de la PCR

 Dépistage génétique : identifier des mutations chez les personnes malades

 Diagnostic anténatal

 Détection de gènes ou OGM (Organisme Génétiquement Modifié)

 Recherche d’une pathologie : parasitologie, bactériologie, virale,…

 Recherche de paternité

 Séquençage

Analyse du polymorphisme

 Caractérisation des animaux : traçabilité, filiation (chevaux)

Avantages de la technique de PCR

 Rapide (1h30)

 Peu coûteuse

 Non toxique

 Grande spécificité

 Quantité d’ADN utilisée 1 pg = 1 cellule

 Automatisée

Limite : ≤ 3kb.
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Cours : 03 Chapitre II. Système de restriction-modification

Chapitre II.
Système de restriction-modification
 1. Enzymes de restriction

 Les enzymes de restriction sont des endonucléases

 Elles reconnaissent des séquences spécifiques de 4 à 8 bases, palindromiques

 Elles sont d’origine bactérienne, capable de cliver un ADN double brin quelque
soit son origine

 La séquence reconnue par l’enzyme de restriction est appelée site de restriction

1.1 Types d’enzymes de restriction

Type I : Elles reconnaissent des séquences sur l’ADN sans aucune symétrie, elles
clivent 1000 à 5000 pb plus loin

Type II : Elles reconnaissent un site spécifique (souvent palindromique),

pratiquement les seules utilisées en génie génétique

Type III : L'enzyme reconnaît une séquence mais clive la molécule d’ADN 20
nucléotides plus loin
1.2 Nomenclature des enzymes de restriction

Exemple : EcoRI

E : 1ère lettre en majuscule : le genre de la bactérie d’où elle a extraite l’enzyme

Escherichia

co : 2ème et 3ème lettres en minuscule : l’espèce bactérienne coli

R : 4ème lettre en majuscule : souche RY317

I : Chiffre romain : ordre de la découverte

1.3 Mécanisme d’action

EcoRI : Escherichia coli

5’-G/A A T T C-3’ Le site de restriction est souvent

3’-C T T A A/G-5’ palindromique

Extrémités cohésives simples brins

Ou Bouts collants
 Exemple : HaeIII : Heamophylus aegyptus

5’-GG/CC-3’
3’-CC/GG-5

Extrémités franches
Bouts francs
’
 1.4 Autres types d’enzymes de restriction
a) Isoschizomères
 Des enzymes de restriction différentes qui reconnaissent la même séquence d’ADN

MspI HpaII

5'...C↓C G G…3' 5'...C↓C G G…3'

3'...G G C↑C...5' 3'...G G C↑C...5'

 La méthylation de la Cytosine (sur le carbone 5’) qui précède la Guanine inactive

l’action de l’enzyme HpaII et non l’enzyme MspI

MspI HpaII
5'...C↓C* G G …3' 5'...C C* G G …3'
3'...G G C*↑C...5' 3'...G G C*C...5'
Coupure Pas de coupure
 b) néoschizomères

 Enzymes de restriction différentes qui reconnaissent la même séquence d’ADN mais

coupent à deux endroits différents

SmaI XmaI

5'...G G G↓C C C…3' 5'...G↓G G C C C…3'

3'...C C C↑G G G...5' 3'...C C C G G ↑G...5'

Extrémités franches Extrémités cohésives

 c) Enzymes compatibles

 Deux enzymes compatibles ont des sites de restriction différents mais donnent
naissance aux mêmes extrémités cohésives

BamHI Sau 3AI

5'... G↓G A T C C…3‘ 5'... ↓G A T C …3‘

3’…C G T A G↑G …5’ 3’ …C T A G↑ …5’

Mêmes extrémités cohésives

2. Système de restriction-modification
3. Enzymes de modification des acides nucléiques
a) Endonucléases

- DNase I : coupe l’ADN double ou simple brin entre les pyrimidines (C, T) sans
reconnaissance d’un site spécifique

- Nucléase S1 : coupe l’ADN simple brin ou l’ARN

- RNase A (ARN simple brin), RNase H (l’ARN dans les hybrides ARN-ADN

b) Exonucléases : 5’ 3’ ou 3’ 5’
4. Intérêts des enzymes de restriction

 Préparer des fragments d’ADN pour le clonage

 Rechercher des mutations

 Rechercher les méthylations de bases au niveau de l’ADN des eucaryotes

 Etablir la carte de restriction de l’ADN.

5. Carte de restriction

 Elle indique le nombre de sites de restriction sur un fragment d’ADN, l’ordre

des sites et la distance génétique qui les sépare

 Unité des cartes de restriction est exprimée en pb ou en kb

 Un ADN linéaire : 1 site 2 fragments

2 sites 3 fragments

n sites n + 1 fragments

 Un ADN circulaire : 1 site 1 fragment

2 sites 2 fragments

n sites n fragments
Exemple : EcoRI : 2,5 kb et 5 kb Digestion simple

HindIII : 2 kb et 5,5 kb Digestion simple

EcoRI + HindIII : 2,5 kb, 2 kb et 3 kb Double digestion

EcoRI

2,5 kb 5 kb

HindIII

2 kb 5,5 kb

HindIII EcoRI
Carte de restriction
finale
2 kb 3 kb 2,5 kb
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B. Génie Génétique
 1. Définition

 Ensemble des techniques faisant partie de la biologie moléculaire

qui permettent d’isoler un gène et de l’introduire dans une cellule hôte
afin de le cloner dans un but de recherche appliquée.
Cours : 04 Chapitre I. Sources de préparation de l’ADN à cloner

Chapitre I.
Sources de préparation de l’ADN à cloner
 2. Historique

• 1822 : Travaux de Mendel

• 1868 : Théorie chromosomique de l’hérédité de Morgan
• 1961 : Code génétique
• 1970 : Découverte des enzymes de restriction
• 1978 : Premier clonage de l’insuline pour traiter le diabète de type I
Cette hormone extraite du pancréas du porc intolérance immunitaire

• 1980 : Insuline du porc a été humanisée en modifiant un seul acide

aminé
• 1997 : Clonage de Dolly.
3. Outils utilisés

1. Outils cellulaires
- Cellules procaryotes E. coli : division toutes les 20 mn
- Cellules animales
- Cellules végétales
- Cellules eucaryotes en culture

2. Outils moléculaires
- Enzymes de restriction (endonucléases), ligases, polymérases,…
- Vecteurs : capables de transférer les gènes d’intérêt dans les
différents types de cellules hôtes.
4. Sources de préparation de l’ADN à cloner

4.1 ADN génomique (ADNg)

1- Cellules 2- Extraction 3- Digestion

eucaryotes de l’ADN enzymatique

Fragments
d’ADN de
petites tailles
4.2 ADN complémentaire (ADNc)
4.3 ADN synthétique

 Synthèse des oligonucléotides de 100 à 200 nucléotides par un

automate
Université des Sciences et de la Technologie d’Oran "Mohamed Boudiaf" (USTO-MB)
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Matière : Biologie Moléculaire et Génie Génétique

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2020-2021
Cours 05 Chapitre II. Vecteurs de clonage (1/3)

Chapitre II.
Vecteurs de clonage
(1/3)
Définition

 Le vecteur de clonage est un outil moléculaire dans lequel un fragment d’ADN à

étudier est inséré

 L'ADN inséré est appelé insert ou ADN étranger ou ADN exogène.

 La cellule hôte qui reçoit le vecteur va se multiplier en même temps que le

vecteur

 Vecteur + insert Vecteur recombinant

 Vecteur sans insert Vecteur non recombinant

1. Vecteurs bactériens
1.1 Plasmides

 Les plasmides sont des petites molécules d'ADN circulaires naturellement présentes
dans les bactéries et indépendants du génome bactérien

 Capacité de clonage : 8 - 9 kb
 Propriétés générales des plasmides

• Taille de 2 à 5 kb

• Origine de réplication (E. coli)

• Marqueur de sélection : gènes de

résistance aux antibiotiques

• Site multiple de clonage (SMC) ou

polylinker, contenant une série de sites
de coupure unique
a) Plasmides pBR

Plasmide

Boliver

Rodriguez

 pBR322 est un petit plasmide de taille de 43,61 kb, dont la séquence

nucléotidique est connue

 Il possède deux gènes de résistances aux antibiotiques : l’un pour l’ampicilline

(AMPR), l’autre pour la tétracycline (TETR)

 Il possède vingt sites uniques pour des enzymes de restriction dont 11 sont
localisés dans les deux gènes de résistance aux antibiotiques
 b) Plasmides pUC

Plasmide

University
California

 Petit plasmide de taille de 2,6 kb

 Il contient le gène de résistance à l’ampicilline de pBR322 (AMPR)

 Il contient une partie du gène bactérien lacZ dans lequel a été introduit un site
multiple de clonage (polylinker)
 Dans le milieu de culture, le lactose est remplacé par un produit chimique X-gal
et un inducteur IPTG

LacZ+ LacZ-

Synthèse de b-galactosidase Pas de synthèse de b-galactosidase

Dégradation de X-gal Pas de dégradation de X-gal

Colonie bleue Colonie blanche

Bactérie a reçu un vecteur Bactérie a reçu un vecteur

non recombinant recombinant
Université des Sciences et de la Technologie d’Oran "Mohamed Boudiaf" (USTO-MB)
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Matière : Biologie Moléculaire et Génie Génétique

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2020-2021
Cours 06 Chapitre II. Vecteurs de clonage (2/3)

Chapitre II.
Vecteurs de clonage
(2/3)
1.2 Phages ou bactériophages

 Un bactériophage ou (phage) est un virus n’infectant que des bactéries

 La multiplication du bactériophage est rapide, le nombre de copies est très élevé

par cellule bactérienne

 Le support génomique des bactériophages peut être un ADN ou un ARN.

a) Structure du bactériophage
b) Cycle du phage
c) Types de phages

1) Phage lambda (l)

 L'ADN du phage l est une molécule linéaire double brin de 48,5 kb

ADN simple brin

(12 nt)

 Les séquences cos sont nécessaires pour l’encapsidation de l’ADN du phage

 2) Phage gt11

 Dérivé du phage l, capacité de clonage : 6 - 8 kb par simple insertion

3) Phage M13

 Petit virus d’E. coli (6.407 kb). L'ADN de ce phage est sous forme simple brin
circulaire

4) Phagemide

 Vecteurs qui combinent des éléments d'origine plasmidique et phagique

c) Méthode d’insertion

Elimination de la partie indispensable (non essentielle) au cycle de vie du

bactériophage λ augmente la capacité d'insertion de grand fragment (22kb)
1.3 Cosmides

Cosmide: site cos du phage λ + plasmide

→ Clonage de fragment de 45 kb

Sites cos λ
→ Encapsidation in vitro
→ Particules virales capables d'infecter E. coli (transformation)

Origine de réplication plasmidique(Ori)

→ Multiplication dans la bactérie de la même façon qu'un plasmide
1.4 PAC ou (P1-derived Artificial Chromosome)

 Chromosome Artificiel dérivé du phage P1

 Taille du génome: 115 kb

 Capacité de clonage : 100-300 kb

 Structure du vecteur PAC

ori : origine de réplication plasmidique

kanR : gène de résistance à la kanamicyne

Pac : ("packaging site"): le clivage de ce site

permet l'assemblage des particules virales

sacB : gène de saccharose synthase (sélection

des bactéries recombinantes

BamH1 : site de clonage

• La dégradation du saccharose produit un composé hautement toxique pour les

bactéries. Sur un milieu contenant du saccharose, seules les bactéries dont le gène sacB
est modifié se développeront.
1.5 BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

 Chromosome Artificiel de Bactérie

 Taille du génome: 7,4 kb

 Capacité de clonage : 300 kb

 Structure du vecteur BAC

oriS : origine de réplication

repE : réplication du plasmide à partir de oriS

CMR : gène de résistance au chloramphénicol

lacZ : Site de clonage dans le gène crible de

sélection blanc/bleu
 Chapitre II. Vecteurs de clonage (3/3)

Chapitre II.
Vecteurs de clonage
(3/3)
2. Vecteurs de clonage dans la levure

2.1 Vecteurs intégratifs

 Vecteur qui s’intègre à un chromosome pour être maintenu et stable

 Ils sont essentiellement des vecteurs bactériens pBR322 contenant :

• Un gène de résistance à l’ampicilline (AMPR),

• Un gène de résistance à la tetracycline (TETR),
• Un gène de levure (URA3),
• Origine de réplication spécifique de E. coli (ori).
 2.2 Vecteurs autonomes dérivés du chromosome ou du plasmide 2μm

 Un vecteur qui existe dans la cellule de

levure à un nombre de copies compris entre 60
et 600

 Il a une taille de 6 kb

 REP1 et REP2 sont impliqués dans

la réplication du plasmide

 Fonction de D n'est pas connue avec

précision
 2.3 Chromosomes artificiels

 Les vecteurs YACs (Yeast Artificial Chromosomes) sont dérivés des

chromosomes de levures Sacharomyces cerviciae
 Capacité de clonage : 200 - 2000kb

ARS1 : origine de réplication

CEN4 : centromère du chromosome

TEL : deux télomères

URA3 et TRP1 : gènes marqueurs

de sélection

Ori et AMP : plasmide pBR322

SUP4 : site de clonage; suppression

d'une mutation qui confère une
couleur blanche aux colonies de
levure.
3. Vecteurs eucaryotes (cellules animales)

3.1 Plasmides non réplicatifs

 Vecteurs qui sont délétés ou mutés dans des gènes essentiels afin
de réduire l’expression des protéines virales

 Ils sont également utilisés pour des stratégies de vaccination

 Capacité de clonage accrue : 150 kb.

3.2 Plasmides réplicatifs

 Vecteurs se répliquant de manière autonome

• Pas d ’utilisation en thérapie génique

• Utilisation en biologie moléculaire, cellulaire, biochimie, biotechnologie à

l ’échelle industrielle et expression des protéines
3.3 Virus

 Méthode des vecteurs viraux a été découverte par Paul Berg en 1970

 Les virus sont des particules microscopiques qui sont composés soit d’ADN soit
d’ARN et sont englobés dans une capside de protéines

 Leur efficacité d’infection est élevée : transduction

 Utilisés pour la thérapie génique

 Exemple :
• Adénovirus : virus à ADN
• Rétrovirus : Virus à ARN
4. Vecteurs eucaryotes (cellules végétales) : Plasmide Ti et ADNT

 Le plasmide Ti (Tumor inducing ) est un ADN double brin circulaire présent chez
une bactérie du sol appelée Agrobacterium tumefaciens

 Cette bactérie provoque chez les plantes qu’elle infecte une maladie du nom de
"gale du collet"

.
 Lors de l’infection, la partie du plasmide, appelée "ADN-T", est transférée dans la
plante et insérée au hasard dans le génome cellulaire. La séquence ADN-T contient:

• Des gènes qui codent pour des hormones de croissance végétales et sont
responsables de la tumorisation des cellules de la plante,

• Des gènes qui codent pour des enzymes qui conduisent les cellules tumorales
à synthétiser des substances appelées opines (nopaline et octopine).
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Matière : Biologie Moléculaire et Génie Génétique

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2020-2021
Cours 07 Chapitre III. Procédés de ligation du vecteur et de l’ADN à cloner

Chapitre III.
Procédés de ligation du
vecteur et de l’ADN à cloner
1. Enzymes ligases

 Les ADN ligases sont des enzymes qui catalysent la formation d'une liaison
entre une extrémité 3'OH et une extrémité 5'P de deux nucléotides voisins sur un
brin d’ADN

• ADN ligase d'E. coli : ligation entre 2 ADN à extrémités cohésives

• ADN ligase T4 : ligation entre 2 ADN à extrémités franches

2. Procédés de ligation
 La jonction entre le vecteur et l’ADN exogène
a) digestion par la même enzyme de restriction EcoRI

2 Digestion
du vecteur ADN 2
Digestion
1 de l’ADN 1
5‘-...G ↓ A A T T C ……………. G ↓A A T T C…-3'
3‘-...C T T A A ↑ G …………….. C T T A A↑G…-5'

5' -A A T T C ……………. G -3'

3' -G …………….. C T T A A-5'
3 Insertion par ADN ligase E.coli

Vecteur recombinant
b) addition de linker

Vecteur Insert
Site EcoRI

5’-G/AATTC G/AATTC-3
3’-CTTAA/G CTTAA/G-5’
+ Linkers EcoRI
+ ADN ligase T4

Digestion
avec EcoRI

5’-AATTC G-3
3’-G CTTAA-5’

Insertion
+ ADN ligase E. coli
3. Transformation bactérienne
[AMPS,TETS]

Intégration de l’ADN plasmidique

Plasmide natif

Plasmide recombinant
 Incubation dans un milieu nutritif sans antibiotique

Bactéries transformées par un vecteur recombinant

Résultats Bactéries transformées par un vecteur non recombinant
Bactéries non transformées
 3. Sélection des transformants recombinants

3. 1 Méthode génétique

1ère sélection 2ème sélection

Colonie bactérienne
ayant reçu le
plasmide
recombinant Milieu + tétracycline
Milieu + ampicilline [AMPR,TETS]
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Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de Génétique Moléculaire Appliquée

Matière : Biologie Moléculaire et Génie Génétique

BCG/LMD 3ème année Licence Génétique

Dr. Nadjet BOUSHABA

2020-2021
Cours 08 Chapitre IV. Transfert de l’ADN dans les cellules

Chapitre IV.
Transfert de l’ADN dans les cellules
2. Transformation/transfection

 La transformation est la modification du patrimoine génétique d'un

organisme par l'ajout externe d'ADN

 La transfection est le processus de transfert de gènes dans des

cellules eucaryotes n’utilisant pas comme vecteur un virus, par
opposition à la transduction
2.1 Méthodes chimiques : au chlorure de calcium (CaCl2) (bactéries)

Co-précipitation de l’ADN et du phosphate de calcium

DAEA-dextran Liposomes artificiels

Transduction virale (encapsidation in vitro)
 Chapitre V. Notion de banque d’ADN génomique et complémentaire

Chapitre V.
Notion de banque d’ADN génomique
et complémentaire
 1. Banque d’ADN génomique

 Une banque d’ADN (Library) : correspond à un ensemble de clones

cellulaires (bactéries, levures,…) où chaque cellule renferme un
exemplaire différent d’ADN recombiné à un vecteur

1. 1 Caractéristiques de la banque d’ADN génomique

 Type de vecteur (plasmide, cosmide, phage, YAC, BAC,…)

 Nature des inserts (ADNg, ADNc) et leur origine

 Taille moyenne des inserts

 Taille de la banque (quantité de clones)

1. 2 Différentes étapes
1. 3 Avantages de la banque d’ADN génomique

 Exons

 Introns

 Séquences transcrites et non traduites (séquences régulatrices)

 ADN intergénique

 Pseudogènes (gènes inactifs)

 Gènes chevauchants

 Gènes domestiques ou gène de ménage ou housekeeping gene

1. Banque d’ADNc

 Une banque d’ADNc représente l’ensemble des ARNm présents

dans les tissus sous forme de clones
a) Isolement et purification des ARNm

b) préparation de l’ADNc double brin par transcriptase inverse

1. 3 Avantages de la banque d’ADNc

 Taille des clones est plus petite que celle de l’ADNg

 Ex. Gène de la dystrophine : 2,5 Mb

ARNm ADNc : 11 kb
 Chapitre VII. Criblage pour la détection des clones d’intérêt

Chapitre VII.
Criblage pour la détection des clones d’intérêt
1. Méthode de préparation d’une sonde radioactive
1.1 Marquage par
Nick-translation
1.2 Marquage par multi-
amorçage au hasard
2. Méthodes de criblage des clones d’intérêt

2. 1 Hybridation moléculaire
2. 2 Détection des produits d’expression
Université des Sciences et de la Technologie d’Oran "Mohamed Boudiaf" (USTO-MB)
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Matière : Biologie Moléculaire et Génie Génétique

BCG/LMD 3ème année Licence Génétique

Dr. Nadjet BOUSHABA

2020-2021
 Chapitre VIII. Notion de transgenèse animale et végétale

Chapitre VIII.
Notion de transgenèse animale et végétale
 Chapitre VIII. Notion de transgénèse animale et végétale

1. Transgenèse animale
1. Définition

 Un animal transgénique, est un animal dont le génome a été modifié suite à une
intervention humaine :

• Soit par l’addition de nouvelles séquences d’ADN dans son génome, avec une
intégration au hasard (transgenèse additive)

• Soit par la modification de séquences déjà présentes dans son génome (transgenèse
ciblée) par recombinaison homologue

 Ces modifications doivent être transmissibles par la lignée germinale d’une

génération à l’autre.
 2. Techniques de transgénèse
a) micro-injection
29/03/2021 21:09
b) transfert dans des cellules souches embryonnaires
c) Infection rétrovirale

 Le gène à introduire est cloné dans un rétrovirus modifié

 Les rétrovirus s’intègre par un mécanisme parfaitement défini dans le génome de

la cellule infectée
d) Transfert de noyau
Avantages de la transgenèse animale

 Production de protéines thérapeutiques ! L’insuline, l’hormone de croissance,

facteur de coagulation exprimé dans le sang, le lait (alicament)

 Etude physiologique d’un gène à l’intérieur d’un organisme donné

 Xénogreffe : animaux donneurs d’organes

 Amélioration des races animales

Inconvénients de la transgénèse animale

 Etat de santé des animaux clonés: certains présentent des mutations graves et
meurent pendant la gestation

 Syndrome de "gros nouveaux nés" : développement fœtal anormal

 Risque d’extinction d’autres races animales rustiques

2. Transgenèse végétale
1. Techniques de transgénèse
1. 1 Transfert direct
1. 2 Transfert indirect
Avantages de la transgenèse végétale

1. Applications thérapeutiques

 Production de molécules d’intérêt pharmaceutiques ; protéines vaccinales,

facteur VIII,…

2. Applications industrielles

 Industrie papetière : papier à partir de cellulose de bois

 Coton pour obtenir des vêtements en fibres naturelles

3. Applications agronomiques

 Résistance aux insectes en utilisant le gène de l’endotoxine de la bactérie

Bacillus thuriengenis (gène Bt) contre la larve (la pyrale) qui détruit le maïs

 Résistance aux herbicides

 Amélioration des qualités nutritionnelles

 Riz doré : introduction de gènes pour la synthèse de la béta-carotène

(précurseur de la vitamine A) contre la cécité

 Tolérance au stress abiotique

Inconvénients de la transgenèse végétale

 Diminution de la biodiversité : le maïs transgénique peut affecter les insectes

non visés :les abeilles et le Monarque (papillon de l’Amérique du Nord)

 Le maïs transgénique contenant un gène de résistance à l’ampicilline peut

s’intégrer dans les bactéries du tube digestif humain et peuvent conférer la
résistance à cet antibiotique

 Risque de contamination d’autres plantes sauvages

 Risque d’allergie

 Riz doré sera privé de la vitamine E (antioxydant)

 Problème d’étiquetage des animaux qui se nourrissent d’OGM

Conclusion

 Réaliser la transgénèse à condition de respecter l’équilibre écologique de la

planète