1º Curso CFGS de Laboratorio Clínico y Biomédico I.E.S.
ALIXAR
Biología Molecular y Citogenética.
PROBLEMAS DE CULTIVOS CELULARES
Nota: en el caso de las placas multipocillo, el volumen de medio indicado en la tabla corresponde al que
puede contener cada pocillo de forma individual. Ej: Si cultivamos células en tres pocillos de una placa P6,
tendremos un volumen total de cultivo de 2 mL x 3 = 6 mL
Igualmente, el nº de células para siembra o confluencia se refiere a las células en cada pocillo, no en el
total de la placa.
1. Se necesita hacer un subcultivo de una línea celular con la que estás trabajando. Antes de realizar el
recuento de viables, se tripsinizan las células, se lavan y se resuspenden en 10mL de medio de cultivo. Para
determinar la viabilidad del cultivo se hará un dilución 1/3 de 20L de suspensión celular con azul tripán.
Tras el recuento en los retículos de la cámara se han obtenido los siguientes resultados:
PRIMER RETÍCULO SEGUNDO RETÍCULO
1º cuadrado: 75 + 15 1º cuadrado: 82 + 8
2º cuadrado: 80 + 10 2º cuadrado: 79 + 11
3º cuadrado: 78 + 14 3º cuadrado: 85 + 9
4º cuadrado: 35 + 3 4º cuadrado: 88 + 10
Responde a las siguientes preguntas:
a) Calcula la densidad celular total y viable de los 10mL de suspensión.
b) Calcula el número total de células que hay en el tubo inicial de células resuspendidas.
c) Calcula la viabilidad celular.
d) Si en el subcultivo se van a usar frascos Roux de T-75, calcula cuantos frascos se necesitan. ¿Qué
volumen de medio y de suspensión celular hay que colocar en cada uno?
e) Si necesitamos congelar células en criotubos de 2mL de suspensión celular, con una concentración de
5x105 células viables/mL, ¿cuántos criotubos necesitaremos? ¿qué volumen de solución de congelación
se necesitará?
f) ¿Por qué crees que existe tanta diferencia entre el cuarto cuadrado del primer retículo y los
otros?¿Crees que esto puede influir en el resultado?
2. En tu laboratorio emplean células de la línea HepaRG para el estudio de cáncer de colon, y te encargan
hacer un pase. Previamente debes determinar la viabilidad del cultivo, diluyendo 5L de suspensión celular
en 10L azul tripán. Partiendo de un tubo con 5mL de suspensión celular, tras intentar hacer el recuento,
observas que resulta imposible realizarlo debido a la gran cantidad de células que aparecen en los retículos.
Para poder resolver el problema, decides hacer una dilución 1/2 en PBS previa a la tinción. Obtienes los
siguientes resultados de recuento:
PRIMER RETÍCULO SEGUNDO RETÍCULO
1º cuadrado: 83 + 4 1º cuadrado: 83 + 10
2º cuadrado: 85 + 8 2º cuadrado: 86 + 6
3º cuadrado: 93 + 9 3º cuadrado: 81 + 1
4º cuadrado: 77 + 20 4º cuadrado: 82 + 4
Responde a las siguientes preguntas:
1º Curso CFGS de Laboratorio Clínico y Biomédico I.E.S. ALIXAR
Biología Molecular y Citogenética.
a) Calcula la densidad celular total y viable de los 5mL de suspensión.
b) Calcula el número total de células que hay en el tubo inicial de suspensión celular.
c) Calcula la viabilidad celular.
d) Si en el pase se van a usar placas de Petri de 10 cm de diámetro, calcula cuantas placas se necesitan.
¿Qué volumen de medio y de suspensión celular hay que colocar en cada uno?
e) Si necesitamos congelar células en criotubos de 2mL de suspensión celular, con una concentración de
1x106 células viables/mL, ¿cuántos criotubos necesitaremos? ¿qué volumen de solución de congelación
se necesitará?
f) Si tras una semana de incubación, al determinar la densidad celular total en una de las placas
obtenemos un resultado de 9,1x106 células/mL, ¿podríamos mantener el cultivo en esas placas o
tendríamos que hacer un subcultivo? Razona la respuesta.
3. Una LCC con la que se trabaja en tu laboratorio está cultivada en una placa multipocillo P6. Se decide
realizar un subcultivo a partir de 3 pocillos, y congelar el contenido de los otros tres. Para realizar el
recuento de mezclan 10L de suspensión celular con 10L de aztul tripán, y se obtiene el siguiente
resultado:
PRIMER RETÍCULO SEGUNDO RETÍCULO
1º cuadrado: 36 + 1 1º cuadrado: 44 + 1
2º cuadrado: 45 + 3 2º cuadrado: 43 + 4
3º cuadrado: 67 + 2 3º cuadrado: 50 + 3
4º cuadrado: 39 + 6 4º cuadrado: 42 + 2
a) ¿Sería necesario realizar un subcultivo? Razona la respuesta.
b) Para congelar las células, usaremos criotubos de 1,5mL, y necesitamos que estén a una concentración
de 4 x 105 células/mL. Determina el número de tubos necesario, el volumen de solución de congelación
para cada tubo y el volumen total de solución de congelación.
4. Partiendo de un cultivo en un frasco Roux T-75, se determina la densidad celular con un resultado de 3,45 x
105 células/mL. Responde a las siguientes preguntas:
a) Si se contaron en total 68’75 células, ¿qué cantidad de suspensión celular se pudo emplear para la
tinción con azul tripan?
b) ¿Será necesario hacer un pase? Razona la respuesta.
c) Si en lugar del frasco mencionado, se tratase de un frasco T-25 ¿sería necesario hacer un pase? Razona
la respuesta.
