DEPARTAMENTO DE SANIDAD

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

CFGS Laboratorio clínico y biomédico

ACTIVIDADES UD10. CULTIVOS CELULARES

1. Realiza un esquema con los distintos tipos de cultivos celulares existentes.

a. Cultivo de órganos
b. Cultivo de explantes
c. Cultivos de células: primarios y secuendarios. En suspensión y en monocapa.
d. Cultivos organotípicos

2. Explica gráficamente las fases de crecimiento de un cultivo celular:

• Fase de latencia (período lag). Fijación al sustrato e inicio del ciclo celular.
• Fase de crecimiento exponencial. El número de células se duplica aproximadamente cada 24
horas.
• Fase de confluencia. Las células del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa:
inhibición por contacto; suspensión: consumo del medio).
• Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las células entran en una fase de
senescencia que termina con la muerte de las células en cultivo.

3. Indica si las siguientes afirmaciones corresponden a cultivos en suspensión o en monocapa.

a. Formarán parte del cultivo aquellas células que sean capaces de superar el proceso de
disgregación, de adherirse al sustrato y de proliferar. MONOCAPA
b. Es propio de las células hematopoyéticas, algunas líneas celulares transformadas y de células
procedentes de tumores. SUSPENSIÓN
c. Se alcanza la confluencia de las células, éstas detienen su crecimiento. MONOCAPA
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d. Las células se multiplican en medio líquido sin adherirse a ningún sustrato. SUSPENSIÓN
e. Puede ser estacionario o rotatorio. SUSPENSIÓN
f. Las células se adherirán al sustrato para iniciar la proliferación. MONOCAPA
g. El crecimiento se detiene cuando la densidad celular es alta en el medio. SUSPENSIÓN
4. Realiza un esquema de los factores a tener en cuenta para la realización de un cultivo.

FACTORES A
TENER EN
CUENTA
SOPORTE FÍSICO:
Vidrio COMPOSICION MEDIO:
Plástico desechable
Microsoportes o microcarries
-Medios base
Sustratos artificiales - aditivos
Superficies tratadas
Feeder layers
Matrices tridimensionales
Sustratos no adherentes CONDICIONES FISICO QUÍMICAS DEL
Interfases liquido-gel o liquido-liquido MEDIO:
Haces microcapilares permeables
pH (7.0-7.7)
Osmolaridad (260-320) mOsm/Kg
Viscosidad = Suero

NATURALEZA Y COMPOSICIÓN FASE TEMPERATURA:

GASEOSA: Tejidos de aves y mamíferos: 36º-38ºC
Tejidos de anfibios, peces, insectos y reptiles:
O2 (95%) 20º-36ºC
CO2 (5%)

5. Diseña un protocolo de prácticas para la realización de la curva de crecimiento de un cultivo,

indicando los materiales y reactivos a utilizar, así como los pasos para su realización. Deberá tener
los mismos pasos que los protocolos que utilizamos en el laboratorio: objetivos, materiales,
procedimiento y análisis de resultados.

OBJETIVOS: determinación de la curva de crecimiento del cultivo en el laboratorio

MATERIALES:
- Muestra Células
- Frasco de cultivo
- Medio líquido
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- Incubador de CO2
- Cámara neubauer
- Azul de tripán
- Pipetas
- Microscopio
- Papel y lápiz
PROCEDIMIENTO:
1. Obtención de las células del cultivo. Si por ejemplo usamos una muestra de sangre, haremos
una centrifugación y cogemos los linfocitos de la capa intermedia con una pipeta y echamos en
el frasco de cultivo con el medio.
2. Incubación del cultivo en el incubador de CO1a 37ºC, 5% CO” y 95%CO2
3. A las 24 horas sacar de la estufa y realizar determinación del recuento y viabilidad:
La manera más habitual de determinar el número de células es contándolas en un hemocitómetro,
como por ejemplo una cámara de Neubauer (Figura 16).

Figura 16. Recuento de células en cámara de Neubauer

La cámara de Neubauer (A) es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al
de contraste de fases (B). Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo del
cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen (C).
Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues
el área redondeada y marcada L (C) corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del
cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un
cubreobjetos éste Cámara de Neubauer Microscopio invertido A B C D Cámara de Neubauer
Microscopio invertido A B C D 61 dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen
comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 l.
Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas,
la concentración en la suspensión celular será:
Concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)
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4. Una vez calculado el número de células, añadimos el medio de cultivo necesario para obtener la
concentración requerida, que suele ser habitualmente de 106 células/ml.
5. Determinación de la viabilidad celular:
Durante todo el procedimiento de recuento celular puede que algunas células se mueran por ello es
conveniente llevar a cabo un estudio de viabilidad celular en el que pueden emplearse varios métodos.
El más común consiste en teñir de alguna manera las células, de forma que se puedan distinguir y
contar las células vivas y muertas, y el total. Para llevar a cabo la distinción entre células vivas y
muertas se utilizan colorantes vitales. El más común es el azul tripán.
El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la
membrana. Así pues las células que aparecen en la imagen (Figura 16D), claramente de color azul, son
consideradas no viables. Asimilar células blancas, por exclusión, a células viables es un error pues por
este método se sobrevalora la viabilidad de las células en la suspensión, determinando como inviables
sólo aquellas con la membrana rota.
Para llevar a cabo esta técnica las células se suspenden en buffer fosfato salino (PBS) y se colocan en
hielo hasta que se realiza el contaje celular. Un pequeño volumen de Trypan Blue preparado al 0.4 %.
Se añade a un volumen igual de suspensión celular y la mezcla se incuba durante 5 minutos. La muerte
celular se determina por la presencia del Trypan Blue citoplasmático.
El número total de células y el porcentaje de células no viables se determina usando un hemocitómetro
bajo microscopia óptica. La viabilidad celular se expresa como el porcentaje del número de células
vivas/ número de células totales.
6. Volvemos a introducir el cultivo en el incubador de CO2 y repetimos la operación cada 24 horas.
7. Registro de los datos en una gráfica, poniendo en el eje Y la concentración de células y en el X el
tiempo.

RESULTADOS: realización de la curva en la gráfica y observar si la curva responde a la morfología

estudiada con las fases de crecimiento habitual, tal y como se indica a continuación:
• Fase de latencia (período lag). Fijación al sustrato e inicio del ciclo celular.
• Fase de crecimiento exponencial. El número de células se duplica aproximadamente cada 24
horas.
• Fase de confluencia. Las células del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa:
inhibición por contacto; suspensión: consumo del medio).
• Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las células entran en una fase de
senescencia que termina con la muerte de las células en cultivo.
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