Crecimiento microbiano

Cinética del Crecimiento Discontinuo

Introducción

Cuando a una pequeña cantidad de células vivas se le agrega una solución líquida de
nutrientes esenciales, a una temperatura y pH adecuados, tiene lugar el crecimiento de las
mismas.

El proceso de desarrollo que aquí interesa, tiene dos diferentes manifestaciones que están
de acuerdo con la morfología de los microorganismos involucrados. Para organismos
unicelulares, que se dividen conforme crecen, el aumento de la biomasa (masa de materia
viviente) va acompañado por el aumento del número de células presentes.

Este caso, que se enfrenta con un problema de población en crecimiento, ocupa la mayor
parte de la atención de este capítulo.

Cuando se considera el desarrollo de hongos filamentosos, sin embargo, la situación es

completamente diferente. Aquí, la longitud y el diámetro del micelio aumentan conforme el
organismo crece. Con el desarrollo, el hongo aumenta de este modo en tamaño y densidad,
pero no necesariamente en número.

Asociados con el crecimiento celular, coexisten dos procesos: la toma de nutrientes desde el
medio, y liberación de los productos finales del metabolismo, al medio que rodea las células.
Como se verá más adelante, la velocidad de estos procesos varía ampliamente conforme
ocurre el desarrollo.

Antes de encarar la consecución de datos experimentales y sus teorías relacionadas, se

harán algunas apreciaciones sobre la medición y control de los procesos de crecimiento
microbiano.

Según se considere el crecimiento de organismos unicelulares o filamentosos, las técnicas

para su evaluación serán diferentes.

Además del crecimiento, en el caso de los organismos filamentosos tienen una gran
importancia los fenómenos de difusión (nutrientes, oxígeno disuelto, y productos del
metabolismo) en el seno mismo de la masa microbiana; la periferia de ésta es bastante más
activa que la parte central, ya que en ella hay mayor transferencia.

Técnicas de evaluación de la población microbiana

Hay muchas técnicas, ninguna conviene a todos los casos y ninguna es completamente
satisfactoria. Sus resultados deben ser interpretados con prudencia en razón de los errores y
las posibles interferencias, así como la posible diferenciación que permiten hacer entre
células vivas y células muertas.

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 Crecimiento microbiano

MÉTODOS DIRECTOS

a) Determinación de la concentración celular

Cuenta al microscopio: Las ventajas de estas técnicas son evidentes: rapidez y simplicidad de
manipulación. Se utilizan portaobjetos especiales para el microscopio (cámaras de Thomas y
Neubauer), del tipo hematímetro. Son celdas calibradas, que tienen una cuadrícula, que
encierra las células por contar en un volumen conocido. Estas celdas son convenientes para
contar levaduras, en razón de su tamaño. El método puede adaptarse también a la
enumeración de bacterias. Para ello se hace un frotis sobre un portaobjetos común,
partiendo de un volumen de suspensión de células conocido (por ejemplo 0,01 ml) sobre una
superficie conocida (1 ó 2 cm 2). La medición de la superficie del campo con ayuda de un
sistema micrométrico permite, a partir del número de bacterias por campo, deducir la
concentración de células. Tales técnicas se pueden mejorar con el empleo de colorantes
vitales que permiten diferenciar las células vivas de las muertas.

Recuento en placa: Consiste en sembrar diluciones realizadas a partir de la muestra a medir,

sobre un medio estéril solidificado en cajas de Petri apropiado para el microorganismo a
evaluar. Después de la incubación se procede a la enumeración de las colonias y se informa
como “cfu/ml” (unidades formadoras de colonias por ml de cultivo). Es una técnica lenta,
consume mucho trabajo y no proporciona ningún resultado sino después de las 24 horas o
más que tarde la incubación que necesiten los microorganismos para producir colonias que
se puedan contar. Es poco conveniente para la evaluación de una población de organismos
filamentosos.

b) Determinación de biomasas microbianas

Determinación de la materia celular seca: la biomasa microbiana se recupera generalmente

por centrifugación, se lava a fin de eliminar el medio de cultivo retenido entre las células y se
seca a 105 ºC hasta peso constante. Esta técnica se aplica a suspensiones muy densas de
células y en las cuales los microorganismos sean las únicas partículas suspendidas.

Turbidimetría: es una técnica muy rápida y se basa en el hecho de que la densidad óptica de
una suspensión es proporcional a la masa de las partículas suspendidas. Se mide la absorción
luminosa (generalmente a 600-700 nm) de la suspensión microbiana, y por comparación con
una escala de referencia se deduce la concentración en biomasa. La existencia de otras
partículas extrañas a las células alteran o invalidan la medición. Las suspensiones de
organismos filamentosos no son apropiadas para esta técnica.

MÉTODOS INDIRECTOS

Cuando no son aplicables los métodos directos, se tiene el recurso de los métodos
indirectos. Se basan en la substitución de la masa microbiana misma, por la determinación
de un parámetro evaluable con mayor facilidad y cuyo valor se pueda correlacionar con
precisión con el de la biomasa.

a) Determinación de los constituyentes celulares

Constituyentes celulares: análisis de nitrógeno por el método de Kjeldhal, determinación de

proteínas por el método específico de la reacción del Biuret o por separación y dosificación
de aminoácidos. La evaluación de la biomasa microbiana por determinación del ATP, tiende
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 Crecimiento microbiano

a generalizarse. Este constituyente es un intermedio importante en el metabolismo celular

ya que es el centro del "mecanismo" energético. Por este hecho, el ATP es un constituyente
constante en las células vivas. El contenido en ATP (en mg/gr s.s.) de las células, varía de un
organismo a otro, y para un mismo organismo, en función de su estado fisiológico. De aquí el
interés de su determinación en las fermentaciones o cuando se trata de procesos en los
cuales trabaja un solo tipo de células. El ATP también se halla libre de componentes del
medio de cultivo. Su determinación por medio de la bioluminiscencia, es relativamente
sencilla, rápida y sensible. También se puede correlacionar la medición de ciertas actividades
enzimáticas con la biomasa microbiana.- Esto es particularmente importante en las
reacciones celulares de oxidorreducción. El NADH, coenzima de oxidorreducción, emite una
fluorescencia a 460 nm cuando se la excita con luz de longitud de onda de 340 nm. Bajo su
forma oxidada, NAD, la coenzima no fluoresce. Durante el crecimiento celular, la cantidad de
NAD-NADH, aumenta en relación con la reproducción celular.

Por último, se puede evaluar la biomasa microbiana en forma indirecta, midiendo el

potencial eléctrico de las células que la constituyen. En efecto, las células están cargadas
negativamente en su superficie, y si en la suspensión se sumerge un electrodo constituido
por un ánodo de platino y un cátodo de peróxido de plata, los microorganismos pierden sus
electrones al contacto con el ánodo. A fin de deducir el potencial de las sustancias
electroactivas de la solución, se dispone otro electrodo provisto de una membrana. Se
supedita así la evaluación de la biomasa, a una medición eléctrica que ya se ha adaptado a
los fermentadores.

b) Determinación de constituyentes del medio de cultivo

El crecimiento celular tiene por efecto modificar considerablemente la composición del

medio en el cual se desarrolla. Paralelamente a la aparición de la biomasa, se asiste a la
desaparición del substrato, al consumo de oxígeno, a la aparición de subproductos del
metabolismo y a un desprendimiento de calor. El estudio de la variación de estos
parámetros permite seguir la aparición de la biomasa. Esto se puede lograr mediante un
dosaje de azúcar (substrato) ya sea por vía química o enzimática, eventualmente con la
ayuda de un autoanalizador acoplado al fermentador.

Curva de crecimiento microbiano

Fases del ciclo de desarrollo para cultivos discontinuos

Muchos procesos bioquímicos involucran el desarrollo discontinuo de microorganismos.

Después de sembrar un medio líquido, de una composición apropiada, con un inóculo de
células vivas, se permite el desarrollo del cultivo sin agregar ni sacar nada del mismo,
excepto una corriente de aire estéril, si ello es procedente.

Típicamente, la variación del número de células vivas con el tiempo, se muestra en la Figura
1 (a). En la Figura 1 (b) se observa la velocidad referida al número de células (velocidad
específica).

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Figura 1 (a):
Etapas del
crecimiento
microbiano

Figura 1 (b): Velocidad específica

en función del tiempo

Después de una fase de latencia, donde no se incrementa en forma evidente el número de

células, sobreviene una etapa de rápido crecimiento, durante el cual el número de células se
incrementa en forma exponencial con el paso del tiempo. Naturalmente, en un recipiente
cerrado, las células no pueden multiplicarse indefinidamente, de modo que al período de
crecimiento exponencial le sigue una fase estacionaria. En este punto, la población alcanza
su máximo tamaño. Posteriormente, ocurre una declinación del número de células en la
denominada fase de muerte. Aquí se observa frecuentemente un decrecimiento exponenci al
en el número de células vivas.

Cada una de estas fases es de una importancia potencial en un proceso microbiológico. Por
ejemplo, el objetivo general de un proceso bien diseñado puede ser minimizar la longitud de
la fase de latencia y hacer máxima la longitud y velocidad de la fase exponencial. Este último
objetivo se alcanzará retardando la acometida de la fase de transición hacia el crecimiento
estacionario.

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Fase de latencia: La longitud de la fase de latencia que se observa cuando se inocula un

medio fresco, depende tanto de los cambios en la composición de los medios (si es que
ocurre alguna) que experimentan las células, como de la edad y el tamaño del inóculo. El
impacto de un cambio brusco a un nuevo ambiente, tiene varios efectos sobre las célula s
vivas. Primero se debe recordar que el modo de control y regulación de toda la actividad
enzimática, incluye una característica de adaptación: cuando se halla presente un nutriente
nuevo, la célula produce enzimas para posibilitar su metabolización. Si s e transfiere un
cultivo en fase de desarrollo exponencial desde un medio con glucosa, como única fuente de
carbono, a uno que contiene lactosa, se producirá un intervalo en el cual se detendrá la
multiplicación celular, mientras se sintetizan las enzimas y cofactores para la vía metabólica
de la lactosa. Similarmente, una variación en la concentración de nutrientes puede provocar
la aparición de una fase se latencia. Si el nuevo medio nutriente es más rico en un substrato
limitante, algo de tiempo y nutriente serán utilizados en desarrollo no multiplicativo,
mientras se crea una mayor concentración de enzimas metabolizantes. Un menor nivel en la
concentración de nutrientes, puede también dar lugar a una fase de latencia; la etapa de
desarrollo exponencial se reasume inmediatamente, pero con más baja velocidad.

Muchas de las enzimas intracelulares requieren ser activadas por pequeñas moléculas
(vitaminas, cofactores) o iones (activadores), los que pueden tener una apreciable
permeabilidad a través de las membranas celulares.

La transferencia de un pequeño volumen de cultivo (o inóculo) a un mayor volumen de

medio, causarán una difusión al exterior de esos factores (vitaminas, cofactores o
activadores) para catalizar en el seno del medio, siempre que el nuevo me dio sea careciente
en esas especies o difiera apreciablemente en fuerza iónica. La velocidad de desarrollo podrá
disminuir correspondientemente a las más bajas concentraciones de estas especies en el
interior de la célula, y entonces aparecerá nuevamente una fase de latencia hasta que se
ponga en marcha el mecanismo de generación de tales activadores. Si los activadores
esenciales que están diluidos, no pueden ser producidos internamente por la célula, el nivel
total de actividad celular disminuirá irrevocablemente. La transferencia de células jóvenes a
un medio de glucosa-fosfato-aminoácidos, da como resultado una fase de latencia muy
corta. Por el contrario, la transferencia de una población más vieja (en una etapa de
desarrollo más lento debido a la disminución de nutrientes y/o acumulación de productos
tóxicos) da como resultado una transición de latencia mucho más larga.

El tamaño del inóculo transferido es una variable que influye, como ya se ha visto, como
consecuencia de la pérdida por difusión de vitaminas y activadores. Así, mientras una
población joven no muestra fase de latencia cuando se la transfiere a un medio rico en
metabolitos intermedios tales como aminoácidos, el mismo inóculo transferido a un medio
con (NH4 ) 2 SO4 como fuente de nitrógeno, pierde estos valiosos intermediarios por difusión
en la solución. Con células jóvenes se presenta una fase de latencia más larga, ya que éstas
sólo han podido acumular una pequeña concentración de aminoácidos en el medio original.

Transfiriendo cultivos en fase de desarrollo exponencial, que ya han podido acumular una
cierta concentración de intermediarios en el medio original, la dilución tiene un efecto
mucho menor.

En base a lo detallado anteriormente, se puede establecer como criterios para el inóculo el

siguiente:
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1) El cultivo inoculante deberá ser tan activo como sea posible y la inoculación hecha
durante la fase de desarrollo exponencial del mismo.

2) El medio de cultivo utilizado para desarrollar el inóculo deberá ser tan parecido como sea
posible, al medio usado en la escala final de fermentación.

3) Se recomienda el uso de un inóculo razonablemente grande, (del orden del 5% del nuevo
volumen del medio) para evitar la indeseada pérdida por difusión de los intermediarios o
activadores necesarios y de este modo asegurarse un número de generaciones inferior a 4,
con lo que se minimiza el riesgo a las mutaciones.

Fase exponencial de desarrollo: al final de la fase de latencia, la población ya está bien

adaptada al nuevo ambiente. Las células pueden entonces multiplicarse rápidamente, y la
masa celular o el número de células vivas se duplica regularmente con el tiempo. La
ecuación 1 describe el crecimiento y se conoce como ley de Malthus (ecuación 1)

dX
 X  rX (1)
dt

con X = X0 al t = t lag

Así, la velocidad de incremento del número de células es proporcional al número de células.

Esta expresión se conoce como la forma diferencial del crecimiento y puede aplicarse en
cualquier etapa del ciclo de crecimiento.

La forma integrada de la ecuación anterior es:

   t  t lag 
X
ln (2)
X0


 t  t lag 
X  X 0e (3)

Esta expresión sólo puede usarse en el período exponencial de crecimiento donde la

velocidad específica (µ) permanece constante.

Se puede deducir rápidamente que el intervalo de tiempo requerido para duplicar la

población está dado por:

ln 2
td  (4)

Durante el desarrollo exponencial, se necesita un solo parámetro (μ o td) para caracterizar la
población. Por esta razón, la velocidad específica de desarrollo μ se usa ampliamente para
describir la influencia del ambiente sobre el comportamiento de las células.

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 Crecimiento microbiano

Factores que afectan la velocidad específica de crecimiento

Los principales factores que afectan la velocidad específica de crecimiento son la

temperatura, concentración de nutrientes y productos, pH, etc.

Efectos de la Temperatura

Al igual que todas las reacciones químicas, el crecimiento microbiano es afectado por la
temperatura. El crecimiento neto observado es un balance entre el desarrollo y la
mortalidad y viene dado por la expresión de la ecuación 5

dX
 (  k d )X
dt (5)

Donde µ es la velocidad específica de crecimiento (h -1) y kd es la velocidad específica de

muerte (h-1). El crecimiento observado es un balance entre el crecimiento y la mortalidad, no
obstante, en general las condiciones son favorables al desarrollo (µ >>k d).

La dependencia de las constantes de velocidad puede expresarse mediante Arrhenius como

se muestra en la ecuación 6:

 Ea  Ed
  Ae RT
k d  A 'e RT (6)

Donde A y A ’ son constantes y Ea y Ed son las energías de activación y R la constante de los

gases (1.98 cal.mol -1 K-1) y T es la temperatura absoluta en º K. Los valores típicos de E a y Ed
son 15-20 (kcal. mol -1 K-1) y 60-70 (kcal. mol -1 K-1) respectivamente.

En la Figura 2 se observa la influencia de la temperatura sobre la velocidad específica de

desarrollo.

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 Crecimiento microbiano

Figura 2: Influencia de la temperatura

El aumento de la rapidez de mortalidad y disminución de µ a altas temperaturas se debe

principalmente a la desnaturalización térmica de las proteínas. A bajas temperaturas, los
mecanismos regulatorios de la célula son afectados por limitaciones difusionales de los
sustratos hacia el interior y el exterior.

Los microorganismos pueden clasificarse de acuerdo al intervalo de temperaturas en el cual

se desarrollan. Como se observa en Tabla 1, cada clase tiene un óptimo de tem peratura
donde su desarrollo es máximo, y límites inferiores y superiores de temperatura, tras los
cuales no pueden sobrevivir.

Tabla 1: Clasificación de los microorganismos según su temperatura de desarrollo.

Denominación Temperatura º C

Mínimo Óptimo Máximo

Termófilos 40 a 45 55 a 75 60 a 80

Mesófilos 10 a 15 30 a 45 35 a 47

Psicrófilos -5 a 5 15 a 18 19 a 22

Efectos de la concentración de sustrato

Monod fue el primero en investigar el efecto de la concentración de sustrato sobre la

velocidad de crecimiento. Encontró que la velocidad de crecimiento µ y la concentración de
sustrato (S) presenta una evolución hiperbólica como se muestra en la Figura 3.

Figura 3: Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de crecimiento

La relación funcional entre la velocidad específica de desarrollo μ y la concentración de un

nutriente esencial propuesta por Monod en 1942 sigue la expresión dada en la ecuación 7:

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 max Si
 (7)
K i  Si
Donde µmax es la máxima velocidad de desarrollo y K i es la constante de Monod. Cuando S i
>> Ki y la concentración de otros nutrientes permanece sin cambios, la velocidad de
crecimiento alcanza la µmax. En general los valores de K i son muy pequeños como puede
observarse en la tabla 2.

Tabla 2: Constante de Monod para microorganismos desarrollados en diferentes sustratos

Microorganismo Sustrato Ki (mg.l-1 )

E. coli glucosa 6.8 x 10-2

lactosa 20.0

A. niger arginina 0.5

Candida utilis glicerol 4.5

Saccharomyces cerevisiae glucosa 25.0

Pseudomonas sp. metanol 0.7

Klebsiella aerogenes SO-2 4 2.7

Klebsiella aerogenes CO2 0.4

Si la concentración inicial de sustrato es aumentada en un valor muy alto con relación al K i,

por ejemplo más de 10 a 20 veces el valor de K i, la velocidad de crecimiento disminuye por
inhibición de sustrato. Para sustratos carbonados, los valores máximos empleados están en
el rango de 100 a 150 g. l -1 de glucosa u otros carbohidratos y muy pocos crecerán a
concentraciones superiores a 300-500 g.l -1. Esta característica es la razón por lo cual durante
muchos siglos los alimentos como frutas han sido conservados en altas concentraci ones de
azúcar.

Limitaciones del Modelo de Monod y Ley de Malthus: para poder aplicar estos modelos es
importante que se cumpla el concepto de desarrollo balanceado: en un intervalo de tiempo,
las propiedades intensivas del sistema en crecimiento deben i ncrementarse conforme un
mismo factor, durante ese intervalo. Como dijo Monod acerca de la fase de desarrollo
exponencial: "es razonable considerarla un estado donde las concentraciones relativas de
todos los metabolitos y las enzimas son constantes". Efectivamente, es la única fase del
desarrollo en la que las propiedades de la célula pueden ser consideradas constantes y
pueden ser descriptas por un valor numérico. En términos de velocidades, se puede probar
que la velocidades específicas de la fracción de todos los componentes i de las células son
nulas:

Ci (8)
(Cif ) 
X
Cif =fracción del componente i X= concentración de biomasa

Ci= concentración del componente i

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 Crecimiento microbiano

Luego:

Ci  (Cif )X (9)

Derivando la expresión anterior, se obtiene

dCi dX d(Cif )
 (Cif ) X (10)
dt dt dt
Dividiendo por (C if )X :

1 dCi 1 dX 1 d(Cif )
  (11)
Ci dt X dt (Cif ) dt

Como puede observarse la expresión anterior puede escribirse en términos de velocidades

específicas:

 Ci   Cif   X (12)

Si  Cif =0, estamos en presencia de un crecimiento balanceado.

Cuantitativamente se puede ver el crecimiento balanceado como la situación alcanzada en

un ambiente constante, después de haberse completado todas las adaptaciones celulares
necesarias.

En un sistema discontinuo, donde el crecimiento es lo suficientemente lento y la población

no es demasiado grande, el crecimiento balanceado es una razonable aproximación a la fase
exponencial. La ecuación de Monod describe los resultados experimentales bajo tales
condiciones.

Es posible que dos (o más) substratos sean limitantes del desarrollo. En tal caso la ecuación
de Monod generalizada se escribe como en la ecuación 13:

S1 S2
   max . ............. (13)
K1  S1 K 2  S2
Efecto del pH

Los microorganismos tienden a crecer en un intervalo limitado de pH. En general las

bacterias crecen en un intervalo de pH de 4 a 8, las levaduras de 3 a 6 y los mohos de 3 a 7.
Estos diferentes intervalos de pH para el crecimiento se pueden usar ve ntajosamente para
reducir la posibilidad de contaminación. Es común que las fermentaciones de levaduras se
operen a pH bajos evitando de este modo el desarrollo de bacterias, reduciéndose los
tiempos de esterilización y por lo tanto los costos del proceso.

En la Figura 4 se observa la influencia del pH en dos situaciones diferentes: con adaptación y

sin adaptación.

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 Crecimiento microbiano

Figura 4: efecto del pH sobre el crecimiento

La fase estacionaria y el máximo de población

Cuando algunas variables significativas, tales como ciertos niveles de concentración de

nutrientes o toxinas, alcanzan valores a los cuales no puede sostenerse la velocidad máxima
de desarrollo, se presentan eventuales desviaciones al crecimiento exponencial.

El agotamiento en particular de algún nutriente crítico, puede a veces aparecer de repente

en un determinado momento, ya que las células en fase de crecimiento exponencial están
incrementando rápidamente la velocidad de consumo de todos los nutrientes.

Si la acumulación de alguna toxina disminuye la velocidad de crecimiento de la población

desde la fase exponencial, es frecuente encontrar el uso de una ecuación de la forma:

dX
 k  X   1  f  conc. de toxina  
dt (14)

En el caso de que la toxina disminuya linealmente la velocidad de desarrollo, se tiene una

ecuación para la velocidad específica de desarrollo del tipo:

1 dX (15)
 k 1  bCT 
X dt

Donde CT es la concentración de la toxina y b una constante.

La fase de muerte

Cuando se produce el agotamiento de nutrientes o la aparición de productos tóxicos, la

población no puede sustentarse a sí misma y comienza la fase de muerte.

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 Crecimiento microbiano

Performance del reactor tanque agitado operado en forma discontinua

A los efectos de derivar la ecuación de performance del reactor discontinuo de mezcla

completa, es necesario en primer lugar integrar la expresión dX de lo que se
 X  rX
dt
obtiene:

XdX X dX t (16)
X0 rX X0 X t0 dt  t  t 0
 

Hay que notar que la ecuación 16 se aplica cuando r X es mayor que cero. Por lo tanto, t 0 no
es el tiempo en que el reactor fue inoculado, sino el momento donde las células comienzan a
desarrollarse. De acuerdo a la ecuación, el tiempo de crecimiento t – t0 es el área bajo la
curva 1/r x versus X, entre X 0 y X. La forma en U bajo estas curvas, son características de las
reacciones autocatalíticas ( S + X X + X). Una característica de estas reacciones es que al
principio la reacción es lenta porque hay poca cantidad de catalizador, pero en la medida
que la concentración celular aumenta, la velocidad alcanza su máximo, luego disminuye
como consecuencia de que el sustrato limitante se agota y se acumulan productos tóxicos. S i
el modelo de Monod puede ser apropiado, la ecuación 16 puede escribirse de la siguiente
manera:

dX (K s  S)dX (17)
  
X X t
  dt  t  t 0
X0 rX X0  máx SX t0

Esta ecuación puede resolverse si se conoce la relación entre S y X. Como hemos vis to
anteriormente, la relación funcional entre ambas variables, puede establecerse bajo la
suposición de que el coeficiente de rendimiento es constante (Y X/S ).

Modelos matemáticos de desarrollo en sistemas discontinuos

Todo proceso para la obtención de producto lleva consigo un inevitable cambio de escala, ya
que la forma de operar, la metodología para contactar las materias primas y recuperación de
productos, no puede ser la misma que en el laboratorio. Para describir el proceso, es
necesario contar con un modelo cinético, que proporcione la velocidad de cambio del
sistema, qué cambios se producen y cómo afectan a la vez la evolución del sistema.

La clasificación más empleada responde a la que aparece en la siguiente Tabla, en la que se

consideran dos conceptos: Estructuración y Segregación. Un Modelo No Estructurado es
aquel que describe al microorganismo como único componente, utilizando una sola variable,
generalmente la concentración de biomasa. Un Modelo Estructurado es aquel que describe
al microorganismo teniendo en cuenta que está formado por múltiples componentes
internos que reaccionan entre sí. Un Modelo Segregado es aquel que considera que una
población está formada por microorganismos diferentes, mientras un Modelo No Segregado
considera que todos los microorganismos de la población son iguales a aquel que se toma
como individuo medio, representativo de la población.

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 Crecimiento microbiano

La ley de Malthus se emplea ampliamente en estudios microbiológicos sobre el crecimiento,

debido a que sólo se necesita el conocimiento de la evolución de la biomasa con el tiempo:

dX
 X (18)
dt
Las desventajas de este modelo es que es incapaz de predecir la concentración de biomasa
en la fase estacionaria, ya que su tendencia es hacia el infinito.

Otra expresión que pertenece al tipo de modelos no estructurados es la ley logística, y que
también depende solamente de la concentración de biomasa.

dX  X  (19)
 X 1  
dt  Xm 
En esta ecuación, X m, corresponde al valor máximo alcanzado por el número de células y que
será función de la concentración de nutriente limitante, y está dada por la siguiente
expresión:

X m  X 0  YX / S X 0 (20)

Cabe mencionar, que el Modelo de Monod antes descrito, corresponde a los Modelos No
estructurados.

Luedekin y Piret propusieron una expresión para la producción de productos:

dP dX (21)
rp    X
dt dt

donde α y β son coeficientes. Si a la expresión anterior la dividimos por la concentración

celular, obtenemos la velocidad específica de producción de productos:

1 dP 1 dX
 
X dt X dt
(22)
q p    

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 Crecimiento microbiano

Caso a: productos asociados al crecimiento ( q p   )

Caso b: productos parcialmente asociados al crecimiento ( q p     )

Caso c: productos no asociados al crecimiento ( q p   )

Productividad de los sistemas operados en forma discontinua

La productividad (gramos de biomasa o productos del metabolismo por litro de medio y por
hora) es con frecuencia el criterio que se mantiene para la evaluación de un procedimiento
de fermentación.

En todo caso, es ella la que servirá para determinar las dimensiones de las instalaciones para
la producción.

En el caso de los procesos discontinuos, se debe tener en cuenta a fin de evaluar la

productividad, el tiempo de vaciado del equipo desde la corrida precedente (tv ), el tiempo de
lavado (tn), el tiempo de llenado del fermentador para la nueva corrida (t r) y el tiempo de
esterilización (tS), además del tiempo necesario para el proceso biológico propiamente dicho
(crecimiento y producción).

1 Xf
tm  ln  t lag (23)
 X0
El tiempo total de proceso puede calcularse de la ecuación:

1 Xf
T ln  t lag  t v  t n  t r  t s (24)
 X0

La productividad total P estará expresada por:

Xf
P (25)
T
De esta ecuación es posible determinar los efectos de los cambios en el proceso sobre la
productividad total.

Un inóculo grande acortará el tiempo de proceso. Disminuyendo el tiempo de reinicio del

proceso (tv + tn), o el tiempo de demora (t r + tS) también se acortará el proceso, así como
también lo hará el uso de un inóculo en activo desarrollo para disminuir el tiempo de
duración de la fase de latencia.

Si un ciclo de fermentación es corto (por ej. 18 - 48 hs.), tales como la producción de

levadura para panadería o ácido glutámico, el tiempo demandado por el reinicio de cada
ciclo tiene mucha influencia sobre la productividad total. Por otro lado, con fermentaciones
largas (150 - 200 hs.), como la producción de antibióticos, algunas horas de diferencia,
tienen poca significación.

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 Crecimiento microbiano

Ventajas Cultivo Discontinuo

- Simple de usar y baja probabilidad de contaminación ya que a excepción del inóculo

que se introduce al principio del proceso, los únicos aditivos que ingresan son ácidos o álcalis
para mantener el pH, anti-espumas y la corriente de aire.

- Permite producir metabolitos no asociados al crecimiento.

- Se puede controlar el número de generaciones en cada corrida.

Desventajas Cultivo Discontinuo

- Producción de metabolitos que pueden ser tóxicos.

- Agotamiento de nutrientes.

- Concentración de nutrientes iniciales que pueden ser tóxicas o generar efectos de

represión.

- Variabilidad de una corrida a otra.

- El uso de los sistemas discontinuos puede conducir a un incremento de períodos no

productivos debido a los ciclos de limpieza, reesterilización, llenado y puesta en
marcha del equipo.

CULTIVOS CONTINUOS

Un biorreactor puede ser operado en forma continua alimentado constantemente medio

fresco y retirando medio agotado con la misma velocidad volumétrica de flujo lo que
garantiza volumen de líquido constante. Se asume mezcla completa lo que garantiza
propiedades uniformes en el seno del líquido. Un cul tivo continuo comienza como batch o
discontinuo y luego de obtenerse una cierta cantidad de biomasa se comienza a alimentar
con medio fresco.

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 Crecimiento microbiano

Balance de masa general

La siguiente figura es un diagrama esquemático de un reactor agitado operado en forma

continua.

Debido a que las velocidades de flujo de ingreso y egreso son iguales, el volumen (V)
permanece constante.

dV (26)
Fo  F  0
dt

V=cte

Un balance de masa general podría escribirse de la siguiente forma:

d(Vy ) (27)
  Vrgeneración   Vrconsumo  Fo y o  Fy
dt
Dividiendo por V la ecuación 27 resulta:

d(y ) (28)
  rgeneración   rconsumo  Dy o  Dy
dt
F
D
V
Siendo D la velocidad de dilución (h -1), parámetro clave ya que corresponde a la inversa del
tiempo medio de residencia del flujo de material a través del sistema.

Balances de masa individuales para cada componente en estado de régimen

Células viables

0  rx  rd  D(X o X ) (29)

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 Crecimiento microbiano

Células no viables

0  rd  D(X do X )d (30)

Sustrato

0  (r Sx r
 Sm r SP) D(S
 S)o  (31)

Producto

0  rP  D(P o P)
 (32)

Modelo cinético para el quimiostato

Asumiendo que las células crecen conforme al Modelo de Monod e ignorando la muerte
celular, energía de mantenimiento y formación de producto e insertando las expresiones de
velocidad en los balances de masa para las células y la fuente carbonada obtenemos las
siguientes expresiones:

0  X  DX (33)

 D (34)

X
0  D(S o S) (35)
Y 'X / S

Teniendo en cuenta la ecuación 34, encontramos la expresión que permite calcular el

rendimiento en un cultivo continuo:

X (36)
Y 'X / S 
(S S)
o 

Para obtener la expresión de la concentración de sustrato en estado estacionario,

emplearemos el modelo de Monod, desde donde se despeja S

K SD (37)
S
( max 
D)

Reemplazando el valor de S encontrado en la ecuación 37, obtenemos una expresión para la

evolución de la biomasa en función de la velocidad de dilución.

K sD (38)
X  Y 'X / S(S o  )
( max 
D)

Lavado o Washout y Velocidad de dilución crítica

En un quimiostato la concentración de sustrato limitante es independiente de la

concentración del nutriente limitante en la alimentación. A una velocidad de dilución fija,
17
 Crecimiento microbiano

llamada velocidad de dilución crítica, la concentración de células cae a cero (X=0) y por lo
tanto la concentración del sustrato en el estado de régimen es el mismo que en la
alimentación So. A esta velocidad de dilución crítica ocurre el lavado de células ya que la
velocidad con la que abandonan las células el reactor es mayor que la de desarrollo.

Con lo anterior se puede deducir

So  S cuando D  Dcrit
 S (39)
Dcrit  max o
K S  So

Productividad

La productividad de un biorreactor continuo se obtiene mediante la siguiente expresión:

P  DX (40)

En la Figura 5 se muestra la evolución de las diferentes variables en un cultivo continuo.

Figura 5: Evolución de variables en función de D

CULTIVO DISCONTINUO ALIMENTADO (BATCH ALIMENTADO)

Otro modo de operar un biorreactor es empleando la técnica de batch alimentado o fed

batch donde un cultivo desarrollado en batch se alimenta continuamente con medio
nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante
del crecimiento, esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento (μ) del
microorganismo. Esta metodología es particularmente útil en procesos en los que el
crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del
sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la productividad de la biomasa o
del metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se emplea cuando se quieren

18
 Crecimiento microbiano

evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentración de
biomasa.

El proceso en forma esquemática sería comenzar a alimentar el reactor cuando la

concentración del sustrato limitante en el reactor está prácticamente agotado. La
alimentación ingresa con una concentración S 0 y el flujo es constante. Se continúa
alimentando hasta llegar al volumen final V w y se comienza a cosechar el producto o células
producidas.

La velocidad de incremento del volumen en el reactor viene dado por

dV
F (41)
dt

Integrando la expresión anterior

V  V0  Ft (42)

La concentración de biomasa en el reactor para un tiempo determinado viene dada por la

siguiente expresión:

X  Xt / V (43)

19
 Crecimiento microbiano

Si derivamos la expresión anterior podemos encontrar una expresión para la variación de la

biomasa con el tiempo en un cultivo semi continuo:

dX V(dX t / dt)  X t (dV / dt) (44)


dt V2

Ya que dX t / dt  X t , dV/dt=F, X=Xt/V, F/V=D la ecuación 44 se resume en:

dX (45)
 (  D)X
dt

Cuando el sustrato es completamente consumido, S≈0 y X=X m la ecuación 45 se reduce a que

dX/dt=0 y por lo tanto µ=D. En esta situación la velocidad de consumo del sustrato es igual a
la velocidad de alimentación del mismo al sistema.

El balance de masa para el nutriente limitante del crecimiento se traduce en la siguiente

expresión:

dSt X t (46)
 FS0 
dt YX/S

Siendo St la cantidad total de sustrato limitante en el cultivo y S 0 la concentración de sustrato

en la alimentación. Cuando se logra un estado cuasi estacionario la ecuación 46 puede
resumirse en:

X t (47)
FS0 
YX / S

De la expresión anterior se deduce que

dX t (48)
 X t  FYX / SS0
dt

La concentración celular en un tiempo determinado t viene dada por la ecuación 43:

Xt=XmV (49)

En el estado estacionario cuando S≈0 y Xm es constante se obtiene:

dX t  dV  (50)
 Xm    X m F  FYX/SS0
dt  dt 

Si integramos la ecuación 50 con relación al tiempo entre t= 0 y un tiempo cualquiera t, para

un biorreactor que inicialmente tenía una concentración de biomasa de X 0t:

X t  X 0t  FYX/SS0 t (51)

Conclusiones remarcables:
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 Crecimiento microbiano

- La cantidad de células en el cultivo incrementa linealmente con el tiempo.

- La velocidad de dilución disminuye con el tiempo.

- Ya que D=µ, en el estado cuasi estacionario, la velocidad de crecimiento es

controlada por este factor.

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