Crecimiento microbiano

Crecimiento microbiano
En microbiología la palabra CRECIMIENTO se define como un incremento en el número de células. Este crecimiento para
la mayoría de los microorganismos pasa por un proceso de FISIÓN BINARIA

Crecimiento: incremento ordenado de todos los componentes del sistema biológico à aumento de la masa celular à
multiplicación celular

 En microorganismos que se dividen por fisión o por gemación à aumento del nº de individuos
 En microorganismos cenocíticos à aumento del tamaño de la colonia cenocítica

Fisión binaria
Se observa en bacterias, una célula se divide en 2, generando individuos idénticos, por lo que no se puede distinguir la
célula original.

La célula duplica el material intracelular, compartiendo el material envolvente, por lo tanto cada célula tiene material
nuevo y viejo.

Los factores que influyen en el crecimiento celular son:

o Factores genéticos: Cada microorganismo tiene un tiempo de generación distinto.

o Ambientales: Como el acceso a los nutrientes, temperatura, concentración de oxígeno…

Otros tipos de reproducción

Gemación
Asexual y característica de levaduras

Se presenta en levaduras, de un individuo se obtienen 2, pero se puede distinguir claramente al original. La célula
original mantiene su identidad, y se puede distinguir por una cicatriz en el lugar de la gemación.

Esporas
Típica de mohos donde intervienen esporas sexuales y asexuales

Crecimiento de Hongos
Los hongos filamentosos crecen por hifas o ramificaciones

Crecimiento en sistemas cerrados líquidos

Crecimiento en sistemas cerrados líquidos: cultivo Batch: El más habitual en laboratorio. Cultivo en frascos, tubos, etc.
No hay aporte nuevo de nutrientes ni es posible eliminar los productos de desecho del cultivo
Se desarrolla a través de una curva característica de crecimiento.
  Fase lag( fase de latencia) - las células se adaptan al nuevo ambiente, aun no se dividen
 Fase exponencial (log) - velocidad máxima de crecimiento bajo condiciones particulares, tiempo de generación
mínimo

 Fase estacionaria - sin crecimiento neto, Vc=0 ó estadísticamente = 0. Cuando Vc=Vm (vel. crecimiento es igual
a la de muerte)
o Nutrientes limitantes, pero suficientes para mantener actividad
o Acumulación de desechos, inhibición del crecimiento
 Fase de muerte - velocidad de muerte celular > velocidad de división celular

 Velocidad específica de crecimiento: cambio del nº de células o de la masa celular por unidad de tiempo

 Tiempo de generación: tiempo necesario para duplicar la población

Cultivo continuo
Quimiostato
Mide la concentración de un metabolito

Turbidostato
Mide la turbidez del cultivo

Métodos de medida del crecimiento

Directos
 Recuento de microorganismos
 Determinación de masa de microorganismos

Indirectos
 Determinación de elementos que tengan una relación con la cantidad de biomasa

Medida del crecimiento por masa celular

Métodos directos:

 Determinación del peso húmedo

 Determinación del peso seco
 Determinación del N total
 Determinación de algún componente característico:
o PG
o ADN, ARN
o Proteínas
o ATP
o Clorofilas (en fotosintéticos)

Peso Seco
Se toma una muestra húmeda previamente pesada, se seca y se vuelve a pesar, para determinar la cantidad de agua y
así obtener la masa seca de microorganismo.

Por medio de este método se pueden cuantificar microorganismos filamentosos, aunque se debe cuidar que la muestra
debe ser representativa

El tiempo depende de la temperatura, generalmente va entre 8 a 15 horas

Métodos indirectos:

 Consumo de nutrientes
o QO2 (consumo de oxígeno)
o QCO2 (consumo de dióxido de carbono)
 Producción de ciertos metabolitos
 Producción de ácidos orgánicos
 Métodos turbidimétricos (ópticos):
o Espectrofotómetro (mide luz transmitida)
o Nefelómetro (mide luz dispersada)

Turbidimetría
Se basa en la relación entre la absorbancia y la concentración de las especies de la muestra

Abs = Ɛ * C * L

La absorbancia, es la cantidad de intensidad de luz que absorbe una muestra. Siendo Ɛ el coeficiente de extinción
molar, C la concentración y L  la longitud atravesada por el haz de luz.

Turbidimetría

La relación es lineal dentro de cierto rango. Lo que va a estar en relación a la concentración de la muestra y la calidad
del equipo (espectrofotómetro)

La muestra debe ser homogénea para evitar errores en la lectura

Cuando la muestra está muy concentrada, comienza un efecto de difracción (dispersión de las ondas) de la luz, por lo
que el equipo recibe más luz de la que realmente debería pasar.

Medida del número de individuos

Métodos directos:

 Cámara de Petroff-Hauser (para bacterias)

 Cámara de Thoma (para levaduras y células mayores que las bacterianas)
 Contadores electrónicos de partículas (contador Coulter)

Recuento en cámara al microscopio

Se realiza en celdas de conteo, que tienen un volumen definido

Es útil solo cuando las células crecen en forma individual

Se puede realizar tinción para determinar las células viables y no viables

Si las células presentan gran movilidad, esto puede interferir en la cuantificación

Recuento en Placa
Se basa en el principio de que una célula da origen a una colonia

Las células deben crecer en forma individual, no en racimos

La placa debe ser incubada entre 24 y 72 horas

Las células quedan separadas y distribuidas en la superficie de la placa.

El recuento se expresa como ufc/g ó ufc/ml

En una placa estándar (9 cm diámetro) entre 30-300 colonias… se
puede incurrir en errores al contar…presencia de VNC (VIABLES NO
CULTIVABLES)

Recuento electrónico:

Contador Coulter
El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando
una partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño orificio

Las células deben estar en forma individual y la suspensión diluida

La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partícula, controlando la cantidad de la suspensión que circula
a través del orificio es posible contar y medir el tamaño de las partículas.

Filtración

Citofluorímetro
Se busca lograr pasar las células de forma individual por un conducto

Se detecta el choque del láser con las células

La limpieza debe ser absoluta, para no tapar los capilares ni inducir errores en la medición

Método del número más probable o De los tubos múltiples

Es un método estadístico. Cuenta viables

Exige la siembra de al menos 3 series, cada una de ellas con 3 ó 5 tubos, con diluciones seriadas de la muestra.

El medio de cultivo y la temperatura y tiempo de incubación deben ser adecuados al grupo de microorganismos que
queramos contar

PCR a tiempo real (Real time PCR)

Amplificación de la secuencia comprendida entre los dos cebadores
Ciclos de amplificación:

 Desnaturalización
 Reasociación
 Polimerización
 Ciclo desnaturalización reasociación
polimerización
1º ciclo 5’/94ºC 2’/50ºC
3’/72ºC
2º-34º ciclo 1’/94ºC 2’/50ºC
3’/72ºC
último ciclo 1’/94ºC 2’/50ºC
10’/72ºC
Componentes del sistema
 Oligonucleótidos: secuencias que flanquean el fragmento a amplificar
o Actúan como cebadores
o Tamaño de 20-24 nucleótidos
o Diseño: 3’-OH bien apareado
o Posibilidad de mutagénesis dirigida

 Tampón: Tris pH 8,4. Importancia de la concentración de MgCl 2. Afecta a incorporación de dNTP, actividad
polimerasa y Tm cebador-molde

 Polimerasas: Dirección de polimerización 5’-3’. Necesita 3’-OH. Copian molde. Usan dNTP

 dNTPs: dATP, dGTP, dGTP, dTTP a 100-200mM

Pueden utilizarse marcados con 32P, quimiolumisiscentes o fluorescentes para que el producto del PCR se use
como sonda.

 Molde: DNA cualquier secuencia. RNA usando polimerasas con actividad de trascriptasa inversa (RT-PCR)

PCR cuantitativa (q-PCR): es un método que mide en tiempo real la amplificación de DNA por la visualización del
producto de PCR. Monitorización de la reacción en tiempo real vs análisis del producto final. La PCR cuantitativa
se diseña de modo que el incremento de la cantidad de producto produce un incremento de fluorescencia.

Factores que influyen en el crecimiento microbiano

Genéticos: cada microorganismo tiempo de generación distinto

Ambientales: acceso a nutrientes, T, concentración de oxígeno, etc…

Factores físicos

 Efecto de la temperatura.
o Efecto letal del calor.
o Efecto de las bajas temperaturas.
 Liofilización
 Desecación
 Efecto de las radiaciones
 Ondas sonoras
 Presión hidrostática
 Presión osmótica
 Efecto del pH
Temperatura
Importante en desarrollo bacteriano. Afecta a la V de crecimiento. Según la temperatura óptima de crecimiento se
clasifican en:

 Termófilas: T óptima de crecimiento sobre los 50ºC. en ambientes como:

 Fuentes termales volcánicas terrestres
 Fuentes termales submarinas
 Acúmulos de compost y ensilados

 Mesófilas: T óptima entre 25 y 40 ºC. Aquí están la mayoría de las bacterias que se relacionan con el hombre.
 Psicrófilas: T óptima entre 10 y 20 ºC. Se encuentran principalmente en el ambiente

Clases de microorganismos según la temperatura

Psicrófilos

 Obligados (óptimos a 15-18ºC)

 Facultativos, psicrotolerantes o psicrotrofos (óptimos a 20-30ºC)

Mesófilos (óptimos 25-40ºC). Aquí están la mayoría de las

Bacterias relacionadas con el hombre.

Termófilos (óptimos >50ºC)

 Hipertermófilos (óptimos >80ºC)

 Termófilos facultativos: pueden crecer a <37ºC

Microorganismos psicrófilos
Hábitats fríos:
 Aguas oceánicas, especialmente los fondos (1-2ºC)
 Bolsas de agua en Ártico, Antártico, glaciares, etc.

Adaptaciones bioquímicas al frío:

 Enzimas crio-resistentes
 Sistemas de transporte adaptados a frío
 Fosfolípidos de membrana poliinsaturados (4-9 dobles enlaces)
Microorganismos termófilos
Hábitats permanentemente calientes:
 Fuentes termales volcánicas terrestres
 Fuentes termales submarinas
 Acúmulos de compost y ensilados

Adaptaciones bioquímicas
 Enzimas y ribosomas termorresistentes
 Membranas ricas en A.G. saturados
 En Archaea: éteres de hidrocarburos con glicerol, e incluso monocapas bioquímicas bifitanil-tetraéteres

Efecto letal del calor

La muerte por calor es una función exponencial de primer orden:

dN/dT = -KT·N

En cada momento muere una fracción constante (K T) de la población. La muerte se debe a la destrucción o inactivación
irreversible de una molécula o estructura esencial: ADN o membrana

Algunos parámetros
 Punto térmico mortal: temperatura mínima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (10 min)
 Tiempo térmico mortal: tiempo para que mueran todas las bacterias a una determinada temperatura
 Tiempo de reducción decimal (valor D): tiempo para reducir al 10% la densidad de una suspensión a una
determinada temperatura
El tiempo (D) varía para cada temperatura (se pone un subíndice t) de forma que a mayores temperaturas el
valor de D es menor, es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones
fisiológicas.

Inactivación total y parcial

Inactivación total (=esterilización) y Inactivación parcial. Se deben a:

 Desnaturalización de proteínas
 Fusión de lípidos de membrana

La inactivación puede ser por:

 Calor húmedo (más rápida y efectiva)

 Calor seco

La inactivación (total o parcial) por calor se debe a la desnaturalización de proteínas y a la fusión de lípidos de
membrana, debido a que se rompen muchos enlaces débiles, sobre todo los puentes de hidrógeno entre grupos -C=O y
H2-N-.

Estos enlaces se rompen más fácilmente por calor húmedo (en atmósfera saturada de vapor de agua), debido a que las
moléculas de agua pueden desplazar a los puentes de hidrógeno.

Calor húmedo
Autoclave:
 Calienta agua a temperaturas >100ºC, en compartimento estanco a P> atmosférica. Aplicaciones:
o Esterilización medios y soluciones en lab.
o Esterilización material quirúrgico
o En industrias alimentarias: conservas, leche, bebidas

Tindalización
 Fases a): calentar material <100ºCx 1-2 h
  Fases b): incubar material a 30-37ºC x 24h

Uperización: esterilización por calor húmedo a 135-150ºC x 1-2 seg

Inactivación parcial por calor húmedo:

 Pasteurización clásica: 63ºC x 30 min
 Pasterización instantánea: 72ºC x 15 seg
o Mata más rápidamente
o Altera menos el sabor

Calor seco
Necesita mayores tiempos y temperaturas que el calor húmedo. Aplicaciones:
 Horno Pasteur: para esterilizar material inerte en el lab: vidrio, metales, aceites...
 Flameado a la llama del asa de siembra
 Incineración de materiales de desecho

Efecto de las bajas temperaturas

No efecto esterilizante, sino microbiostático (detiene crecimiento)

Entre –1 y-10ºC el citoplasma queda en sobrefusión, pero hay pérdida de agua y formación de microcristales de hielo à
[sales y electrolitos]

 Desnaturalización de proteínas
 Daño a membrana

Liofilización
Es la desecación a vacío de una muestra previamente congelada (sublimación)

Mantiene la viabilidad de los cultivos durante decenas de años (en ampollas de vidrio herméticamente cerradas y
mantenidas a temperatura ambiente)

Efecto de las radiaciones

Las radiaciones ultravioleta (UV), Rayos X y radiación γ producen efectos esterilizantes (destrucción de
microorganismos) al alterar las proteínas, membranas, ácidos nucleicos y al generar radicales libres del tipo OH - y H-. El
procedimiento es similar al descrito para el uso de altas temperaturas.
Hay que considerar, sin embargo, los poderes de penetración de los diferentes tipos de radiación. Así, por ejemplo, la
radiación UV tiene un poder de penetración muy bajo y, por consiguiente, se utiliza para esterilizar superficies, mientras
que la radiación X o la γ tiene poderes de penetración mucho mayores.

Efectos de las radiaciones ionizantes

Radiaciones ionizantes:
 Rayos X
 Rayos gamma

Las bacterias son más resistentes que organismos superiores:

 Endosporas: 2000-3000 Gy (grays)

 Deionococcus radiodurans: 2200 Gy
 Bacterias “normales”: 200-600 Gy
 Homo sapiens: su dosis letal es solo 10 Gy

Efecto letal directo

A altas dosis: roturas y entrecruzamientos en el cromosoma que no se pueden reparar
Efecto mutagénico
Daños menores que se reparan por mecanismos propensos a error

Efecto letal indirecto

Por radiolisis del agua, que genera radicales OH- letales
Si además, hay oxígeno à formación de peróxidos y epóxidos que son letales

Aplicaciones de las radiaciones ionizantes

Para la esterilización de:

 Material farmacéutico (antibióticos, hormonas, etc)

 Material médico-quirúrgico (guantes cirujano, suturas, jeringas, agujas, bisturíes, catéteres, prótesis, etc)
 Algunos alimentos envasados (en algunos países). Reconocida su seguridad por la OMS y otras agencias
sanitarias

Efectos de las radiaciones ultravioleta

El espectro de acción de los rayos UV coincide con el espectro de absorción por el ADN: 260 nm
No tienen actividad ionizante, pero originan fotoproductos en el ADN:

 Dímeros de pirimidina (ej.: T-T)

 Fotoproducto de la endospora
 Hidratos de pirimidina

Aplicaciones prácticas de la luz UV

Producida por lámparas de vapor de mercurio (emiten a 254 nm). La luz UV no penetra en sólidos, poco en líquidos y se
apantalla por vidrio. Aplicaciones:

 Lámparas de desinfección de aire en hospitales y laboratorios

 En investigación: mutagénesis

Efectos de la luz visible

Efecto negativo indirecto: Las riboflavinas, citocromos, etc se excitan con luz solar directa, y originan:

 Fotooxidaciones en proteínas y ADN

 Se genera oxígeno singlete (O2-1) à radical muy reactivo, oxidante, destructivo

Efecto del pH
Es un parámetro crítico en el cultivo de microorganismos ya que estos sólo pueden crecer en un rango estrecho de pH
fuera del cual mueren rápidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que,
en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de
protones a ambos lados de la membrana citoplásmica.

A diferencia de la temperatura, el pH óptimo de desarrollo suele estar en un valor muy bien definido para cada
microorganismo.

Acidófilos
Son los microorganismos que viven a valores de pH por debajo de 2.

 Thiobacillus: crecen a pH 2
 Arqueas Sulfolobus, Thermoplasma, Ferroplasma: crecen a pH 2
 La arquea Picrophilus: óptimo a pH 0.7

En general los hongos tienden a tolerar valores de pH más ácidos que las bacterias.
Alcalófilos o basófilos
Son aquellos microorganismos que viven a valores de pH superiores a 10.

 Viven en lagos alcalinos o suelos carbonatados

 Algunos son también halófilos

Neutrófilos
Son aquellos microorganismos que viven a valores de pH cercano a la neutralidad (pH 5,5 a 8,0).

Independiente del pH del ambiente, el interior de la célula debe estar cercano a un valor 7.

Actividad de agua (aw)

Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión de vapor de agua del substrato de cultivo (P)  y la presión
de vapor de agua del agua pura (P0):

P
a w=
Po

Para el crecimiento microbiano es fundamental contar con agua para realizar todas las reacciones bioquímicas y
enzimáticas.

El agua difunde siempre desde una zona de alta concentración (baja concentración de solutos) a una zona de baja
concentración de agua (alta concentración de solutos).

La actividad de agua depende de la disponibilidad de ésta en el medio ambiente y de la concentración de solutos

presentes en ella. Por lo que se relaciona muy bien con las concentraciones de NaCl.

Halófilos
Microorganismos que requieren del ión sodio para desarrollarse.

 Halófilos discretos (1-6 %)

 Halófilos moderados (6-15 %)
 Halófilos extremos (15-30 %)

Osmófilos=Sacarófilos
Microorganismos que viven en presencia de altos valores de azúcares

Xerófilos
Microorganismos que viven en presencia de alta sequedad o ausencia de agua.

Presión osmótica
Es la fuerza o tensión que se ejerce cuando una solución se difunde a través de una membrana semipermeable.

Microorganismos osmófilos
 Sacarófilos=sobre todo levaduras
o Solutos compatibles: polioles
 Halotolerantes
  Halófilos
o Moderados (ej: bacterias marinas): 3,5% de NaCl
o Hiperhalófilos (arqueas Halobacterium): requieren saturación de NaCl
 Soluto compatible: K+: acumulan hasta 7 M de K+
 Requieren gran [Na+] para mantener envueltas

Presión hidrostática
Las altas presiones inhiben el crecimiento de los microorganismos

La razón por la que las altas presiones inhiben el crecimiento no está clara, aunque se ha visto que se detiene la síntesis
de proteínas y los procesos catabólicos.

El efecto de la presión sobre el crecimiento de los microorganismos tiene importancia en el desarrollo de sistemas de
eliminación de microorganismos en alimentos y en la consideración de los microorganismos que participan en procesos
en los que aumenta la presión.

Efecto de la presión
Las bacterias de hábitats continentales no soportan grandes presiones

Bacterias marinas
Barotolerantes: crecen a presión atmosférica, pero aguantan hasta 500 atm

Barófilas

 Moderadas: óptimo a 400 atm, pero aguantan hasta (viven entre 5000 y 7000 metros)
 Extremas: óptimos a > 600 atm, y no crecen a presión atmosférica (viven en fosas marinas a 10.000 m)

Potencial redox: Concentración de oxígeno

Este es otro factor determinante del crecimiento y del metabolismo del cultivo. El potencial redox del medio de cultivo
nos indica su capacidad para aceptar o donar electrones, esto es: sus características oxidantes o reductoras. Uno de los
factores que intervienen en el potencial redox, aunque no el único, es la concentración de oxígeno [O 2].

Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes
reductores.

En general, cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo
(o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un
metabolismo fermentativo.

Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo necesita o bien
cuando muere en presencia de oxígeno (anaerobios estrictos como los clostridios).

Por otra parte, hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabolismo