Vitae

ISSN: 0121-4004
vitae@udea.edu.co
Universidad de Antioquia
Colombia

RAMÍREZ V., Alejandro; MEDINA H., María M.; FRANCO G., Omar O.
DETERMINACIÓN DE CLORHIDRATO DE LIDOCAÍNA Y EPINEFRINA EN SOLUCIONES
ANESTÉSICAS INYECTABLES DE USO DENTAL POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIENCIA CON DETECCIÓN U.V.
Vitae, vol. 10, núm. 2, 2003, pp. 89-96
Universidad de Antioquia
Medellín, Colombia

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=169817981010

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VITAE, REVISTA DE LA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
ISSN 0121-4004 Volumen 10 número 2, año 2003.
Universidad de Antioquia, Medellín - Colombia. págs. 89-96

DETERMINACION DE CLORHIDRATO DE LIDOCAINA Y

EPINEFRINA EN SOLUCIONES ANESTÉSICAS INYECTABLES
DE USO DENTAL POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIENCIA CON DETECCIÓN U.V.

DETERMINATION OF LIDOCAINE HYDROCHLORIDE AND EPINEPHRINE IN

ANESTHETIC INJECTABLE SOLUTIONS OF DENTAL USE BY HIGH PERFORMANCE
LIQUID CROMATOGRAPHY WITH U.V. DETECTION

Alejandro RAMÍREZ V.1*, María M. MEDINA H.1, Omar O. FRANCO G1.

RESUMEN

En este trabajo se presenta el desarrollo de una metodología analítica para la cuantificación de

Epinefrina y clorhidrato de Lidocaína por cromatografía líquida en fase reversa, en soluciones anestésicas
inyectables de uso dental. A diferencia de la metodología propuesta en la monografía de la farmacopea
norteamericana USP 26, la cual requiere del uso de dos detectores acoplados en serie, únicamente
detección UV es empleada. El método es selectivo, exacto y preciso, como lo indican los resultados de
los parámetros estudiados durante la validación.

Palabras clave: Clorhidrato de Lidocaína, Epinefrina, soluciones anestésicas inyectables, HPLC.

ABSTRACT

In this work the development of an analytic methodology for the quantification of Epinephrine
and Lidocaine hydrochloride by reversed phase high performance liquid chromatography, in injectable
solutions of dental use is presented. Contrary to the methodology proposed in the monograph of the
North American pharmacopeia USP 26, which requires the use of two detectors coupled in series,
only UV detection is used. The method is selective, exact and precise, as it is indicated by the results
of the studied parameters during the validation.
Key words: Lidocaine hydrochloride, Epinephrine, anesthetic injectable solutions, HPLC.

1 New Stetic S.A. A.A 1759 Medellín-Colombia. PBX 5500000. Teléfono: 5513122. Fax: 5513134.
* Autor a quien se debe dirigir la correspondencia: ofranco@newstetic.com.
90 V ITAE

INTRODUCCIÓN mientos quirúrgicos. La Epinefrina puede tener

concentraciones de 0.0200 mg/mL (1:50000),
La Lidocaína se sintetiza por primera vez en 0.0125 mg/mL (1:80000) y 0.0100 mg/mL
1943, es introducida en 1948 como el primer anes- (1:100000) (1-3).
tésico local del tipo aminoamida (véase figura 1a), La Lidocaína es una molécula bastante estable
convirtiéndose en uno de los anestésicos locales que no se degrada fácilmente bajo las condiciones
de uso dental más empleado. Comercialmente se normales de almacenamiento. La Epinefrina pue-
encuentra como solución inyectable al 2% (peso/ de degradarse fácilmente en soluciones acuosas
volumen) en cárpules de vidrio o polipropileno mediante mecanismos de oxidación o sustitución
de 1.8 mL. Frecuentemente a esta solución nucleofílica del OH que se encuentra sobre el car-
inyectable se le adiciona Epinefrina (véase figura bono quiral. Este último mecanismo es originado
1b), un vasoconstrictor que prolonga el tiempo por especies sulfito que provienen del
de acción del medicamento y facilita los procedi- metabisulfito o bisulfito de sodio, usados como
antioxidantes (4 - 6).
CH 3
a) HO
b)
OH
NH
HO

NH
CH 3 O N
CH 3
H 3C CH 3

Figura 1. Estructura química de a) Lidocaína base y b) Epinefrina base.

Es posible encontrar en la literatura algunas El propósito de este trabajo es desarrollar un

metodologías que utilizan cromatografía líquida método por RP-HPLC que permita cuantificar
de alta eficiencia para la determinación de Lidocaína de una manera rápida, económica y confiable
y Epinefrina, entre ellas el método analítico pre- Lidocaína y Epinefrina en soluciones anestésicas
sentado en la monografía de la farmacopea norte- inyectables de uso dental, usando detección U.V
americana USP-26 (4,7,8). Sin embargo, la y calibración con estándares externos.
implementación de estas metodologías requiere
el uso de dos detectores, ultravioleta para la de- DESARROLLO EXPERIMENTAL
tección de Lidocaína y electroquímico para la de-
tección de Epinefrina, y dos fases móviles dife- Equipos
rentes, por lo que la cuantificación de los princi- El sistema cromatográfico es controlado a tra-
pios activos es hecha en dos análisis independien- vés de una PC micron con el software Class VP
tes. Además, durante la determinación de 7.2 y lo conforman un inyector manual con capa-
Epinefrina, el hierro (II) (que puede desprender- cidad para 20 mL, una bomba cuaternaria LC-
se de las tuberías de acero inoxidable del sistema 10AT (Shimadzu) con capacidad de gradiente de
cromatográfico) eluye inmediatamente después de elución, un detector UV-VIS SPD-M10A
la Epinefrina como un pico electroquímicamente (Shimadzu) con arreglo de diodos y un horno
activo, haciendo necesario la adición de un agente CTO-10A (Shimadzu) ajustado a 30 ºC. La sepa-
acomplejante en la fase móvil, generalmente ración se realiza usando una columna shimadzu
edetato de sodio, para su eliminación (4,7). C-18 sobre sílica gel (5 µm de diámetro de partí-
cula, 150*4.6 mm d.i.).
DETERMINACION DE CLORHIDRATO DE LIDOCAINA Y EPINEFRINA EN SOLUCIONES ANESTÉSICAS ... 91

Reactivos Condiciones del sistema cromatográfico

Metanol grado HPLC (Mallinckrodt), ácido La fase móvil consta de una solución acuosa de
acético, hidróxido de sodio, ácido clorhídrico y ácido acético, preparada al mezclar 50 mL de áci-
metabisulfito de sodio grado analítico (Merck), do acético glacial en 930 mL de agua y ajustando el
Lidocaína (Rhenochem AG 99.6 % de pureza), pH a 3.20 con una solución de hidróxido de sodio
Epinefrina (Boehringer Ingelheim 99.46% de pu- 0.1N (eluente A), y metanol (eluente B). Para
reza), benzoato de sodio (Noveun Kaloma Inc) y obtener la separación cromatográfica se usa el
cloruro de sodio (Akzo Nobel) todos grado USP, gradiente que se muestra en la tabla 1. La Lidocaína
muestra de Lidocaína 2% E-80 ®. se detecta y cuantifica a 260 nm, la Epinefrina se
detecta y cuantifica a 276 nm.

Tabla 1. Composición del gradiente.

Tiempo Eluente Ba Velocidad de flujo

Actividad
(min) (% de flujo) (mL/min)

0.00 0 0.7 Inyección de la muestra

3.01 45 0.7

4.00 45 1.4

9.00 45 1.4 Fin del análisis

Regreso a la composición del gradiente inicial. Equilibrar la

10.01 0 1.4
columna

15.00 0 0.7 Comienza el siguiente análisis

a) todos los segmentos del gradiente son lineales y reproducibilidad) y exactitud, una alícuota de este
placebo es adicionada a las diferentes soluciones
de los principios activos, de manera que la con-
Preparación de las soluciones stock y los centración de los excipientes en cada análisis es
estándares igual a su concentración en el medicamento.
Antes de ser inyectada, la muestra es diluida Soluciones stock
en un factor de 5 (por ejemplo: 1.0 mL de mues- Lidocaína- Se pesan exactamente 1250 mg de
tra es diluido hasta completar un volumen de 5.0 Lidocaína (estándar de referencia USP), se llevan
mL usando el eluente A). Para construir las cur- a un balón volumétrico de 50 mL, se disuelven y
vas de calibración, en los niveles de concentración diluyen a volumen usando la matriz de la mues-
de los estándares se utiliza esta misma dilución. tra. (CL = concentración de la solución stock de
Matriz de la muestra Lidocaína).
1.9 (±0.01) gramos de cloruro de sodio fue- Epinefrina- Se llevan 50 mg de Epinefrina
ron disueltos en 100 mL de agua y llevados a un (estándar de referencia USP), exactamente pesa-
balón de 1 L, se adiciona 2.2 mL de ácido clorhí- dos, a un balón volumétrico de 100 mL, el sólido
drico y se completa a volumen. se disuelve y se diluye a volumen usando la ma-
triz de la muestra. De esta solución se toman 5
Placebo mL, se llevan a un balón volumétrico de 100 mL
Se prepara un placebo a partir de metabisulfito y se diluye usando nuevamente la matriz de la
de sodio y benzoato de sodio. En los ensayos de muestra. (CE = concentración de la solución stock
especificidad, linealidad, precisión (repetitibilidad de Epinefrina).
92 V ITAE

Soluciones estándar preparada como se indica en placebo, a balo-

nes de 25 mL, se adiciona el placebo y 2 mL de
Se preparan cinco soluciones estándar llevan-
una solución de metabisulfito de sodio al 0.3%
do alícuotas de 1, 2, 3, 4, 5 mL de la solución stock
(peso/volumen), se completa el volumen usan-
de Epinefrina y 3, 4, 5, 6, 7 mL de la solución
do el eluente A. Esta solución se calienta a 45
stock de Lidocaína a balones de 25 mL, se adicio-
°C durante 15 minutos.
na el placebo y se afora con el eluente A. Los ni-
veles de concentración para cada analito son esti- Lidocaína
mados con un exceso de 50% sobre el límite su-
perior y un defecto de 50% por debajo del límite - Oxidación: se pesan por separado 100 y 150
inferior de la concentración de estos principios mg de Lidocaína y se disuelven en 15 mL del
activos en el medicamento Lidocaína 2% E-80 ® eluente A, se adiciona el placebo y 10 gotas de
(véase tabla 2). peróxido de hidrógeno, se procede a calentar
suavemente a 45 °C por 30 minutos. Ambas
Degradación artificial de los principios soluciones son llevadas a balones de 25 mL y
activos se aforaron usando el eluente A.
Para el estudio de especificidad, los principios - Hidrólisis ácida: Se pesan 300 mg de clorhi-
activos son degradados artificialmente en presen- drato de Lidocaína y se disuelven en 30 mL de
cia del placebo como se indica a continuación: HCl 1.0N, se adiciona el placebo y se somete a
Epinefrina reflujo por 30 minutos. Esta solución se lleva
- Oxidación: se llevan alícuotas de 2, 4 y 10 mL cuantitativamente a un balón de 50 mL y se
de una solución stock de Epinefrina, prepara- afora usando el eluente A.
da como se indica en placebo, a balones de 25
mL, se adiciona el placebo y 2 gotas de peróxido RESULTADOS Y DISCUSIÓN
de hidrógeno al 30%, se afora usando el eluente
Debido a que la Epinefrina se degrada fácil-
A y se permite reacción durante 15 minutos.
mente con el oxígeno atmosférico, en la evalua-
ción de los parámetros estadísticos solo se traba-
Tabla 2.
jan tres réplicas.
Concentración para cada analito en las soluciones
estándar. Selectividad
Concentración (mg/mL)a La selectividad se determina de la siguiente
Nivel
CL' CE' forma: a) Inyectando el placebo, b) Inyectando los
principios activos con el placebo, c) Inyectando el
1 3.00 0.0010 placebo con los productos de degradación de la
2 4.00 0.0020 Lidocaína o la Epinefrina, obtenidos artificial-
mente (10)
3 5.00 0.0030
En las figuras 2 y 3 se presentan algunos de los
4 6.00 0.0040 resultados en este estudio. En estas figuras, los
5 7.00 0.0050
picos que corresponden a los principios activos y
los excipientes son enumerados de uno a cuatro y
a) en donde CL' y CE' son las concentraciones de Lidocaína y los picos que corresponden a productos de de-
Epinefrina en los estándares.
gradación son nombrados usando el prefijo pd
- Ataque por sulfito: se llevan alícuotas de 2, 4 y (véase tabla 3).
10 mL de una solución stock de Epinefrina,
DETERMINACION DE CLORHIDRATO DE LIDOCAINA Y EPINEFRINA EN SOLUCIONES ANESTÉSICAS ... 93

3
4 276 nm
276 nm 260 nm
260 nm

1 2 3 4
1 2 3 4
Tiempo
(a) Tiempo (b)
1
1 2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Tiempo Tiempo

2
4
4 260 nm
276 nm 276 nm
260 nm

pd2

1 2 3 4
(c) Tiempo
(d)
pd1
pd2
2
2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tiempo Tiempo

Figura 2. Resultados en el estudio de selectividad del método analítico: (a) placebo, (b) placebo con los principios
activos, (c) y (d) placebo con los productos de degradación de la Epinefrina obtenidos artificialmente mediante
oxidación y ataque por sulfito respectivamente.

pd4
3 4
2 76 nm
2 60 nm 276 nm
260 nm
3

pd3
4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Tiempo Tiempo

Figura 3. Resultados en el estudio de selectividad del método analítico: (a) y (b) placebo con los productos de
degradación de la Lidocaína obtenidos artificialmente mediante hidrólisis ácida y oxidación respectivamente
94 V ITAE

Con la metodología propuesta, es posible se- 15). Para los gráficos de Área vs concentración (mg/
parar los excipientes y los cuatro productos de mL) para la Epinefrina y la Lidocaína se tienen los
degradación de los compuestos de interés (véase siguientes resultados:
tabla 3). - Epinefrina:
Ecuación de la recta: Área = 2.24 x 107 x (con-
Tabla 3. Tiempos de retención para los excipientes, los centración) + 4275, coeficiente de correlación (r)
principios activos y sus productos de degradación. = 0.9998, coeficiente de determinación (r2) =
0.9996. Los límites de confianza para la pendien-
a) b)
Nombre del pico Nombre del compuesto tr te y el intercepto son: 2.24 x 107 ± 2.23 x 106 y
1 Metabisulfito de sodio 2.42 4275 ± 7400. (para P = 0.05 y n-2 grados de li-
bertad).
2 Epinefrina 3.03
- Lidocaína:
3 Lidocaína 7.30
Ecuación de la recta: Área = 1.26 x 106 x (con-
4 Benzoato de sodio 8.50 centración) + 157899, coeficiente de correlación
pd1 Oxidación de la Epinefrina 2.53 (r) = 0.9988, coeficiente de determinación (r2) =
pd2 Ataque de sulfito en la Epinefrina 2.48 0.9976. Los límites de confianza para la pendiente
y el intercepto son: 1.26 x 106 ± 12483 y 1.58 x 105
pd3 Hidrólisis ácida de la Lidocaína 2.55
± 1.77 x 105 (para P = 0.05 y n-2 grados de liber-
pd4 Oxidación de la Lidocaína 2.53 tad).
a) Principios activos, excipientes y productos de degradación obte- Precisión
nidos artificialmente. b) tiempo de retención.
Para evaluar la reproducibilidad y la
repetitibilidad, se utilizan tres niveles de concen-
No se observa interferencia para ninguna de tración. Estos niveles son representados como
las tres concentraciones ensayadas, a los tiempos porcentajes y son obtenidos con base en la con-
de retención de la Lidocaína y la Epinefrina. centración teórica de los principios activos
Linealidad (Epinefrina y Lidocaína) en el producto Lidocaína
2% E-80 ®.
La linealidad de la respuesta del detector para
cada principio activo se determina en el rango que Repetitibilidad
se menciona en la preparación de soluciones La tabla 4 presenta los resultados de
estándar (50-150% de la cantidad teórica reporta- repetitibilidad para la Epinefrina y la Lidocaína.
da para el producto Lidocaína 2% E-80), cada ni- Aquí se muestra el porcentaje medio, la desvia-
vel (5 en total) es inyectado por triplicado (n = ción estándar y el coeficiente de variación.

Tabla 4. Resultados de repetitibilidad para la Epinefrina y la Lidocaína.

Porcentaje medio ± S CV(%)

Porcentaje de los principios
N° de análisis
activos con respecto a Lidocaína Epinefrina Lidocaína Epinefrina Lidocaína

Epinefrina Lidocaína
80 75 3 73.3±2.3 74.6±1.0 3.2 1.3
120 100 3 122.7±2.4 99.9±0.1 1.9 0.1
160 125 3 162.7±2.4 126.1±0.4 1.4 0.3
DETERMINACION DE CLORHIDRATO DE LIDOCAINA Y EPINEFRINA EN SOLUCIONES ANESTÉSICAS ... 95

En esta tabla se observa que el coeficiente de que en la muestra tiene un porcentaje de

variación más alto para la Epinefrina se obtiene 0.00125%, estos CV pueden ser hasta un 7.3%
cuando el nivel de concentración es 80% (20% (9). Los resultados están por debajo de este va-
menos concentrado que en el producto Lidocaína lor.
2% E-80 ®), este coeficiente de variación cae den-
Reproducibilidad
tro del máximo aceptable de un método analítico
cuando el límite de aceptación del resultado esta El análisis de los tres niveles de concentración
entre 95-105 y se tienen tres réplicas (%CV = 3.3). es realizado por triplicado por dos analistas dife-
Los coeficientes de variación para la Lidocaína no rentes en días diferentes.
son mayores de 1.3 %. La tabla 5 presenta los resultados de
Algunas publicaciones presentan reglas que reproducibilidad para la Epinefrina y la Lidocaína.
indican que los coeficientes de variación máxi- Aquí también se muestra el porcentaje medio, la
mos permitidos para un analito son función de desviación estándar y el coeficiente de variación
su porcentaje en la muestra. Para la Epinefrina, como porcentaje.

Tabla 5. Resultados de reproducibilidad para la Epinefrina y la Lidocaína.

En esta tabla se observa que el coeficiente de Exactitud

variación más alto para la Epinefrina es de 6.1%. Para determinar si la exactitud es aceptable se
Este coeficiente cumple con el máximo acepta- expresan los resultados empleados en la evalua-
ble, el cual no debe ser mayor al doble del valor ción de la repetitibilidad como porcentajes de re-
obtenido en el parámetro de repetitibilidad (6.4%). cuperación y se aplica una prueba t (P = 0.05, n =
El coeficiente de variación más alto para la 9 y n-2 grados de libertad, ttabla = 2.31) (véanse
Lidocaína es de 0.5%. Estos datos indican que el tablas 6 y 7). Tanto para la Epinefrina (texp = 0.75)
método cumple con los criterios aceptables de un como para la Lidocaína (texp = 1.20) se encuentra
método analítico para un límite de aceptación en- que texp < ttabla y por lo tanto no existe diferencia
tre 95-105% y tres réplicas (9). significativa entre la recuperación media y 100,
confirmando la exactitud del método.
96 V ITAE

Tabla 6. Porcentajes de recuperación para la Epinefrina artificial realizada (oxidación, hidrólisis ácida y ata-
que por sulfitos) no interfieren con los picos de
% Teórico Resulatado como porcentaje de interés, por lo que el presente método puede ser
recuperación utilizado para estudios de estabilidad de este me-
Muestra 1-80 90.0 95.0 90.0 dicamento.
Muestra 2-120 100.0 103.4 103.4 La detección por UV tiene una sensibilidad
menor comparada con la detección electroquímica
Muestra 3-160 102.6 100.0 102.6
(11) ésta es la sugerida por la USP para la deter-
Recuperación media (n=9) 98.6 minación de Epinefrina, pero el método desarro-
Desviación estándar 5.5 llado presenta una precisión y exactitud (12, 9)
Coeficiente de variación (%CV) 5.6 adecuadas para determinar y cuantificar la
Epinefrina en los inyectables anestésicos dentales
a las concentraciones disponibles en el mercado.
Tabla 7. Porcentajes de recuperación para la Lidocaína
AGRADECIMIENTOS
% Teórico Resulatado como porcentaje de
recuperación Los autores desean expresar sus agradecimien-
Muestra 1-75 98.7 98.4 98.0
tos a New Stetic S.A. por la financiación y respal-
do a este proyecto.
Muestra 2-100 100.0 100.2 100.5
Muestra 3-125 99.8 100.2 100.4 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Recuperación media (n=9) 99.6
1. Haas D.A. (2002) An update on local anesthetics in dentistry. J.
Desviación estándar 0.9 Can. Dent. Assoc. 68(9): 546-541.
2. Stanley F. (2001) Manual de anestesia local. (Ed) Guanabara
Coeficiente de variación (%CV) 1.0 Koogans. 4ª ed pp 49-52.
3. Leon M.E. (2001) Anestésicos locales en odontología. Colom-
bia. Med. 32(3): 137-140.
100 − R × n 4. Waraszkiewicz S.M., Milano E.A., Dirubio R. (1981) Stability-
texp es calculado como: texp = Sien-
CV Indicating High-Performance Liquid Chromatographic analysis
of Lidocaine Hydrochloride and Lidocaine Hydrochloride with
do R la recuperación media y %CV el coeficiente Epinephrine injectable solutions. Journal of Pharmaceutical
de variación. Sciences. 70(11): 1215.
5. Connors K.A., Amidon G.L. and Stella V.I. (1986) Chemical
Stability of Pharmaceuticals. (Ed) John Wiley and Sons. 2ª ed
CONCLUSIONES pp 438-447.
6. Foye O. W. (1986) Principios de Química Farmacéutica. (Ed).
Siguiendo la metodología descrita anterior- Reverté, S.A.. 2da ed. pp 362 - 370
mente, es posible cuantificar en corto tiempo (15 7. Waraszkiewicz S.M., Milano E.A., Dirubio R. A Stability
indicating LCEC method for Epinephrine and its application to
minutos por muestra) y usando pequeñas canti- the analisis of Lidocaine Hydrochloride injectable solutions.
dades de muestra (1 cárpul = 1.8 mL), Epinefrina Astra Pharmaceutical Products. INC. Worcester, Massachusetts.
y Lidocaína en cualquiera de las soluciones 8. The United States Pharmacopeia 26 and the National Formulary
21 (2003). The United States Pharmacopeia Convention.
anestésicas inyectables de uso dental disponibles 9. Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria. Valida-
comercialmente. Además, como se observa en los ción de Métodos Analíticos. Monografía. pp 71 -73
cromatogramas, también es posible la 10. Bergmann G. Von Oepen B. y col. Improvement in the
Definitions of Sensitivity and Selectivity. Anal. Chem. 1987, 59,
cuantificación de benzoato de sodio. 2522-2526
A diferencia de la metodología propuesta en la 11. Snyder R. LL.(1997) y col. Practical HPLC Method
monografía de la farmacopea norteamericana Development. (Ed). Willey- Interscience Publication. 2da. Ed
pp 85.
USP-26, la cuantificación de los principios activos 12. Guidance for industry Q2B validation of analytical procedures:
es realizada en un solo análisis cromatográfico, Methodology. ICH.(1996).
usando un solo detector y con una fase móvil poco
compleja. Fecha de Recibo: Septiembre 10 de 2003
Los productos que se obtienen al someter los Fecha de Aceptación: Octubre 14 de 2003

principios activos y excipientes a la degradación