INFORME DE LABORATORIO BIOQUÍMICA
IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Alvarado Bautista Ana Sofía 1, Díaz Camargo Ana Sofía 1, García Segura Brayan Steven1
1. Proyecto curricular Biología, Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Bogotá, Colombia
1/08/2022
Resumen
Las proteínas son moléculas grandes y complejas compuestas por largas cadenas de
aminoácidos, son una de las moléculas más importantes para el desarrollo de la vida,
desempeñando diversas funciones biológicas específicas como: enzimáticas, mensajeras,
estructurales, transportadoras, de almacenamiento y como anticuerpos. Las propiedades
de las proteínas, tanto estructurales como funcionales se pueden ver afectadas por
modificaciones en el pH, ya que este controla muchos de los procesos que estas llevan a
cabo. Con el fin de determinar la presencia de proteínas en extractos vegetales y extractos
animales, se llevaron a cabo una serie de pruebas para evaluar el comportamiento de las
características de las proteínas frente a diferentes reactivos. La primera de estas pruebas
fue la reaccion de Biuret, basada en la formacon de un compuesto de color violeta oscuro
para identificar la presencia de proteinas, peptidos cortos y otros compuestos con dos o
mas enlaces peptidicos; posteriormente, se realizo la prueba de precipitacion salina, en
donde las altas concentraciones salinas de los solutos, se precipitaron logrando diferenciar
los dos contedidos en capas separadas; y la tercera prueba, fue la formacion de un gel, en
donde se puede evidenciar la capacidad de las proteinas para formar geles al ser
calentadas. Estas pruebas nos permitieron identificar si sustancias desconocidas eran o no
proteínas, partiendo de métodos que nos brindaron las herramientas para reconocer las
características y reacciones de estas, entendiendo la importancia que tienen las proteínas
en los múltiples procesos vitales.
Palabras clave: pH, soluciones, aminoácidos, temperatura, cromatografía.
Abstract
Proteins are large and complex molecules composed of long chains of amino acids, are
one of the most important molecules for the development of life, performing various specific
biological functions such as: enzymatic, messenger, structural, transporter, storage and as
antibodies. The properties of proteins, both structural and functional, can be affected by
changes in pH, since this controls many of the processes that these carry out. In order to
determine the presence of proteins in plant extracts and animal extracts, a series of tests
were carried out to evaluate the behavior of the characteristics of proteins against different
reagents. The first of these tests was the reaction of Biuret, based on the formation of a
dark violet compound to identify the presence of proteins, short peptides and other
compounds with two or more peptidic bonds; later, the salt precipitation test was carried
out, in which the high saline concentrations of the solutes were precipitated, managing to
differentiate the two counts in separate layers; and the third test, was the formation of a gel,
where it can be evidenced the ability of proteins to form gels when heated. These tests
allowed us to identify whether unknown substances were proteins or not, based on
methods that gave us the tools to recognize the characteristics and reactions of these,
understanding the importance of proteins in multiple life processes.
Keywords: pH, solutions, amino acids, temperature, chromatography.
Introducción
La importancia de la identificación de las proteínas ha desarrollado diversas pruebas entre
las cuales se ha tomado el Reactivo de Biuret como base y referencia de lo llevados a cabo,
ya que es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos
con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida. Está hecho
de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio
(KNaC 4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y
vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no
participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.
(Datta, SP. et Al 1959). Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico
que permite determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante
espectroscopía ultravioleta-visible a una longitud de onda de 560 nm (para detectar el ión
Cu2 +). Debido a la insensibilidad y poca interferencia por parte de los aminoácidos libres,
este ensayo es más útil para muestras de tejido completo y otras fuentes con alta
concentración de proteínas.(Ninfa, 2009) sustancias orgánicas muy complejas presentes en
toda la materia viva, están compuestas por carbono, hidrógeno, también nitrógeno y a
menudo azufre y fósforo y a la vez se componen básicamente de 20 unidades estructurales
denominadas aminoácidos unidos por enlaces peptídicos provocando características
específicas en cada una de las clases de proteínas.(Shrestha B, 2002). Además, cuando la
proteína no ha sufrido ningún cambio en su interacción con el disolvente, se dice que
presenta una estructura nativa. Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de
las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena
polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija.
Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente disminuirá su
estabilidad en disolución y provocará la precipitación. Así, la desaparición total o parcial de la
envoltura acuosa, la neutralización de las cargas eléctricas de tipo repulsivo o ruptura de los
puentes de hidrógeno facilitarán intermolecular la agregación y provocará la precipitación. La
precipitación suele ser consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización y se dice
entonces que la proteína se encuentra desnaturalizada.(Mathews.C.K et al.2002). Con esto
llegamos a la importancia de las pruebas y su orden que nos permiten determinar la
presencia de proteínas.
Objetivos
General:
● Determinar la presencia de proteínas en extractos vegetales y productos animales.
Específicos:
● Reconocer las características estructurales y funcionales de las proteínas
● Observar el comportamiento de las proteínas frente a reactivos que logren afectar o
promover sus características.
● Identificar cualitativamente la relación entre proteínas de origen animal y vegetal y el
reactivo de Biuret
● Reconozca a las proteínas mediante sus propiedades fisicoquímicas
Materiales
10 Tubos de ensayo
2 tubos de centrífuga
Agitador
Gasa
1 Gradilla vidrio
Erlenmeyer
Embudo
1 Pinza para tubos de ensayo
1 Espátula
3 Pipetas Pasteur
Tijeras
Termómetro
Colador
Toalla o limpión
Colador
Toalla o limpión
Reactivos
Solución de Caseína
Solución de Albúmina
Solución saturada de sulfato de amonio
Reactivo de Biuret
Extractos quinua y fríjol
Leche de soya
2 clara de huevo
Agua destilada.
10mL de Leche entera de vaca, cabra u oveja
50ml de leche cruda (Traerla)
Tabletas de renina o cuajo
Sal yodada (Traerla)
Gelatina sin sabor (Traerla)
Metodología
A. Reacción de Biuret
1. Tome 10 tubos de ensayo y adicione 1 mL de los siguientes reactivos:
a. Tubo 1 = Agua destilada
b. Tubo 2 = Solución de albúmina
c. Tubo 3= Solución de caseína
d. Tubo 4= Clara de huevo
e. Tubo 5= Leche de vaca, cabra u oveja
f. Tubo 6= Leche de soja
g. Tubo 7= Extracto de quinua
h. Tubo 8= Extracto de frijol
i.Tubo 9= Solución de gelatina sin sabor
A cada uno de los tubos adicionar 1 mL del reactivo de biuret, agitar constantemente y
observar los cambios de cada tubo.
B. Precipitado diferencial de proteínas
1. Separar la clara y la yema del huevo y fíltrarla a través de una gasa.
2. En un tubo de ensayo agregar 1 ml del filtrado de la clara de huevo más 1 mL de la
solución saturada de sulfato de amonio y mezclar suavemente.
3. Dejar en reposo durante 30 minutos agitando la solución ocasionalmente.
4. Permitir que sedimente o se forme el precipitado y decantar el líquido o sobrenadante,
una vez obtenidas estas dos fracciones separarlas en dos tubos de ensayo diferentes,
marcándolos como tubo 1 para el precipitado y tubo 2 para el sobrenadante.
5. Realizar el ensayo de Biuret para determinar la presencia de proteínas en el tubo 1 y
tubo 2 y determinar si existe proteína.
C. Formación de un gel
1. Pulverizar 1⁄2 tableta de renina y disolverla en 5 ml de agua destilada, más una 0,5 mg
de sal.
2. Calentar 50 mL de leche cruda en un beaker hasta alcanzar 35oC (utilizar parrilla de
calentamiento, puede ser mechero pero se debe tener mucho cuidado al utilizarlo
para que la leche no se derrame al hervir).
3. Adicionar a la leche caliente, los 5mL de la solución de renina o cuajo, mezclar muy
bien y dejar en reposo, hasta observar la formación de gel (aproximadamente 30
minutos después de la adición de la renina).
4. Con un cuchillo limpio realizar varios cortes al gel, dejar en reposo 15 minutos y
recolectar el agua sobrante, al cual se le realiza la prueba de Biuret.
5. Pasar el gel suavemente a un colador limpio y deje escurrir para acabar de eliminar
parte del agua.
6. Extraer un trocito del gel y realizar la prueba de Biuret.
Resultados, análisis y discusión
A. Reacción de Biuret
Inicialmente al someter diferentes sustancias y soluciones al reactivo de Biuret se
describen los resultados.
En primer lugar al someter el agua ante 1mL de reactivo de Biuret esta toma una
coloración azul clara, la cual es característica del reactivo en su estado natural, al
transcurrir el tiempo la coloración continua de la misma manera, lo que indica que la
prueba es negativa para proteínas, (fig. 1), esto está relacionado con que el reactivo de
Biuret detecta los enlaces peptídicos en los polipéptidos y proteínas y en el caso del
agua no se presentan biomoléculas de este tipo, (Vázquez et al., 2014).
Figura 1. Reacción del agua al someterse al reactivo de Biuret, coloración azul clara lo que
indica prueba negativa para proteínas y polipéptidos. Fuente: Los autores.
Posteriormente se presentan los compuestos de solución de albúmina y clara de huevo,
estos dos compuestos son expuestos a 1mL de reactivo de Biuret cada uno. Las
reacciones correspondientes son muy similares, (fig. 2), ambos compuestos se tornan
de coloración violeta, esto indica una prueba positiva para proteínas o polipéptidos, el
color violeta es otorgado debido a la formación de un complejo de coordinación entre los
cationes cúpricos del reactivo, en medio alcalino con las uniones peptídicas, (Vázquez
et al., 2014). Además de esto, la reacción es positiva debido a que la albúmina es una
proteína relativamente pequeña que en los humanos se presenta principalmente en el
plasma sanguíneo, (Arbeláez-Ramírez Luis F & Quijano Parra, 2015). En la clara de
huevo se encuentra también una proteína denominada ovoalbúmina la cual es una
fosfoglucoproteína específica de los huevos y se relaciona con el desarrollo y aporte de
nutrientes al embrión, (Instituto de Estudios del Huevo et al., 2001).
Figura 2. A. Solución de clara de huevo con reactivo Biuret. B. Solución de albúmina con
reactivo Biuret. En ambos casos se obtiene prueba positiva para proteínas. Fuente: Los autores
En el caso de la reacción para la solución de caseína y leche, (fig. 3); en ambos casos
se presenta la coloración violeta, por lo que la prueba es positiva para proteínas, la
caseína es una fosfoproteína presente en la leche de la gran mayoría de mamíferos, en
la leche bovina especialmente se encuentra una proteína denominada kappa caseína la
cual está relacionada con la formación del cuajo para la producción de derivados de
lácteos; en la leche se encuentra en forma de sal cálcica como caseinato cálcico,
(Guevara-Garay et al., 2014). Adicionalmente se encuentra que en la leche la coloración
violeta es más tenue, esto debido a que la leche era pasteurizada por lo que la kappa
caseína se encuentra congregada en complejos, (fig. 3).
Figura 3. A. Solución de caseína con reactivo de Biuret. B. Solución de leche de vaca con
reactivo de Biuret. Prueba positiva en ambos casos. Fuente: Los autores.
A continuación se analiza la quínoa, el frijol y la soya se encuentran los siguientes
resultados, (fig. 4). En el caso de la quinoa se tiene que la coloración es violeta
incipiente, esto a pesar de que la quinua es considerada un alimento que provee gran
cantidad de proteínas vegetales, (Rojas et al., 2016); por lo que se relaciona este
resultado con la calidad de la muestra y los procesos de industrialización que la
precedieron y que pudieron reducir su valor nutricional. En el caso del frijol, el resultado
fue diferente, en este se nota una coloración violeta oscura lo cual indica la prueba
positiva para proteínas, en este caso la presencia de globulinas es común en las
legumbres como el frijol, este tipo de proteínas están relacionadas también con los
problemas digestivos causados por ese tipo de alimentos puesto que algunas globulinas
son inhibidoras de las tripsinas, (Rodríguez Castillo & Fernández Rojas, 2009).
Asimismo, en la soya ocurre una condición similar, la mayor concentración de proteínas
en esta legumbre se atribuye a las globulinas de soya las cuales se caracterizan por su
capacidad emulsificante, capacidad de retención de agua, espumante, gelificante,
proporciona a los sistemas alimenticios características de película, adhesividad,
cohesividad, elasticidad y aumento de viscosidad, (Vanegas Pérez et al., 2009).
Figura 4. A. Solución de quinoa con reactivo de Biuret. B. Solución de leche de soya con
reactivo de Biuret. C. Solución de frijol con reactivo de Biuret. Prueba positiva de forma evidente
en B y C, medianamente coloreada en A. Fuente: Los autores.
Por último se evalúa la reacción de la gelatina sin sabor al exponerse al reactivo de
Biuret, en esta reacción se evidencia una prueba positiva de acuerdo a la coloración
violeta intensa que toma la muestra, (fig 5). La presencia de proteínas en la gelatinas se
da debido a que su obtención es mediante la hidrólisis del colágeno que se extrae del
tejido conectivo de pieles de bovinos, cerdos, pescado y huesos de animales, por lo que
la cantidad de proteínas de alto peso molecular y solubles en agua es bastante elevada,
(Serna-Cock et al., 2007).
Figura 5. Solución de gelatina sin sabor disuelta en agua y reactivo de Biuret. Prueba positiva
para proteínas. Fuente: Los autores.
B. Precipitado diferencial de proteínas
En este caso se somete la clara de huevo al sulfato de amonio y se deja en reposo.
Posteriormente con el paso del tiempo se observa una separación de fases dentro de la
mezcla, las fases se separan y se les agrega reactivo de Biuret a cada una de ellas. En
este caso la fase 1 corresponde al precipitado de la mezcla, mientras que la fase 2 hace
referencia a la parte de la mezcla que estaba en superficie, los resultados para prueba
de Biuret muestran prueba positiva para fase 1 y negativa para fase 2, (fig. 6); esto está
relacionado con que las proteínas en presencia de sulfato de amonio se precipitan esto
debido a la neutralización y deshidratación de la molécula, seguida de agregación y
precipitación, (Vázquez et al., 2014).
Figura 6. 1. Solución de la fase 1 o precipitado de la clara de huevo y sulfato de amonio. 2.
Solución de la fase 2 fase de la superficie. Prueba positiva para la fase 1. Fuente: Los autores.
C. Formación de un gel
En esta etapa de la práctica se quiso realizar una gelificación de la leche utilizando
renina o cuajo. Sin embargo en el laboratorio la prueba no arrojó los resultados
esperados puesto que en ningún momento se formó el gel. Esto está relacionado con
las proteínas kappa caseína las cuales al pasar por un proceso de pasteurización a más
de 80 °C se forman en complejos, esto resulta en dificultades para la formación del gel,
(Guevara-Garay et al., 2014). Además de esto, los procesos de pasteurización
disminuyen los niveles de calcio soluble lo que afecta la acción de la renina, la cual
también es encargada de formar un gel, a modo de matriz, que atrapa o retiene grasa,
agua y algunos componentes solubles de la leche, (Dobler-López et al., 2016).
Conclusiones
El reactivo de Biuret reacciona con los enlaces peptídicos de las proteínas o polipéptidos, así
mismo, sus niveles de coloración desde azul a violeta, indican la abundancia de proteínas en
ciertas muestra como lo es la clara de huevo y la gelatina sin sabor las cuales coinciden en
ser proteínas de origen animal, esto podría representar una variación de la prueba de Biuret,
puesto que en compuestos con proteínas de origen vegetal como la quinua, su reacción no
era tan vistosa en comparación con las demás.
Las proteínas más comunes en leguminosas son las globulinas, la cuales se presentan en el
frijol y la soya, es por esto que su reacción fue positiva, además de esto se destaca que este
grupo de proteínas suele estar relacionado con la inhibición de tripsinas, lo que da
explicación a los problemas digestivos que se suelen presentar al consumir legumbres más
comúnmente conocidas como granos.
En el caso de la precipitación de las proteínas por sulfato de amonio, se pueden identificar
separaciones de mezclas como la clara de huevo, en donde la porción de proteínas se
decanta mientras que la que no contiene proteínas se aísla hacia la superficie, esto también
se relaciona con los pesos moleculares y densidades de las proteínas que al ser más altas
se conservan en el fondo del recipiente.
La leche de vaca es una gran fuente de caseínas, especialmente de kappa caseína, esta
proteína está muy relacionada con los productos derivados de la leche como los quesos,
puesto que de ella depende en parte el proceso de coagulación; se demuestra que la
pasteurización es de cierto modo un proceso que inhibe a estas proteínas y por lo tanto
afecta los procesos de coagulación como se evidencia en la prueba de formación de un gel,
donde se atribuye la temperatura de pasteurización (80°C) a la inhibición de las kappa
caseínas.
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