REPUBLICA DE COLOMBIA
UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR
PROGRAMA: MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DEL SUELO
DOCENTE: MANUEL PANTOJA
PRACTICA 4: BACTERIAS FIJADORAS DE NITRÓGENO SIMBIÓTICAS.
REALIZADO POR:
Jeancklin González
Dianys Gutiérrez
Wilfrido López
Lysanis Morales
Yaritza Muñoz
Valledupar- Cesar
2016
PROCEDIMIENTO
En un suelo de buena calidad se identificó y se tomó una planta leguminosa
(Leucaena) se desenterró para extraer su sistema radical completo sin dañar su
raíz principal y raíces secundarias. Se lavó las raíces para identificar los nódulos
radicales formados por la infección de bacterias simbióticas del genero Rhizobium.
Imagen 1 Imagen 2
Tomado de: Tomado de:
http://www.tropicalforages.info/key/Fo http://www.cipav.org.co/pdf/red%20de
rages/Media/Html/Leucaena_pallida.h %20agroforesteria/seminarios%20y
tm %20congresos/Panama2010/Juan.Cu
billos.pdf
Se seleccionaron los nódulos más grandes, brillantes y de color rojo, lavándolos
con abundante agua y se trasfirieron a una caja de Petri limpia y seca. Luego se
sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio 2,5 % por 2 minutos, se
lavaron nuevamente los nódulos tres veces con agua destilada durante 2 minutos
cada lavado para retirar el exceso de hipoclorito de la superficie, los lavados se
realizaron cerca al mechero para evitar la contaminación de los nódulos con
bacterias y hongos ambientales.
Finalmente se colocaron los nódulos lavados sobre una caja de Petri limpia, con
ayuda de un bisturí se cortaron los nódulos por el centro verificando la presencia
de leghemoglobina. Las porciones se colocaron con una pinza estéril sobre la
superficie de agar ELMARC llevando las cajas a incubación a temperatura de 37
°C durante 2 días. Con los nódulos sobrantes se hizo un frotis en láminas porta
objeto posteriormente se realizó una tinción de Gram para la identificación de las
células de Rhizobium al observar la morfología y tamaño de los bacteroides.
Al cabo de los 2 días de la incubación se retiraron los cultivos, se observó el
crecimiento de las colonias alrededor de los nódulos, se tomó muestra de las
colonias más representativas y se realizó un repique de estas en agar YMA
incubando 5 días a 37 °C, luego se pasaron a la nevera por 2 días, posterior a
estos días se observó e identificó el crecimiento de las colonias características.
RESULTADOS
Imagen 3 Imagen 4
Imagen 5 Imagen 6
Medio ELMARC: se evidenció el crecimiento de colonias refrigentes alrededor de
los nodulos despues de 2 dias de incubación
Medio YMA: cultivos de los repiques de las colonias más representativas de
Rhizobium sp en el medio ELMARC, no se evidenció las colonias características
de Rhizobium sp por lo que no fue necesario realizar tinción de Gram.
DISCUSIÓN
Las plantas leguminosas son de gran importancia agronómica, estas tienen una
característica exclusiva que es fijar nitrógeno en sus raíces con la ayuda de
algunos microorganismos, por un proceso denominado simbiosis. Esta
particularidad ha sido estudiada desde hace tres décadas, las raíces de estas
plantas contribuyen a la reconstrucción de suelos degradados por estrés, por lo
tanto hace que las leguminosas puedan ser utilizadas para mejorar las
características físico-químicas y nutricionales de zonas áridas y semiáridas (De
Felipe M., 2009).
Algunos de los microorganismos que realizan asociación benéfica con plantas
leguminosas son Rhizobiaceae, Phyllobacteriaceae, Hyphomicrobiaceae y
Bradyrhizobiaceae (géneros Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium,
Azorhizobium, Bradyrhizobium) en unas estructuras llamadas nódulos. Ello es
posible por la existencia del enzima nitrogenasa en el citoplasma de estas
bacterias. (De Felipe M., 2009).
En el estudio realizado por Valenzuela, J. Borbor, G. y Borbor, V. (2012) se utilizó
el medio de cultivo ELMARC, donde se observó un crecimiento de colonias
planas, mucoides, de color blanco opaco hasta translucido, posible de Rhizobium.
El crecimiento se presentó alrededor de los nódulos previamente cortados que
presentaban una coloración roja-rosada debido a la presencia de leghemoglobina.
Lo anterior coincide con los resultados obtenidos en la práctica.
Al realizar el repique en medio selectivo YMA para Rhizobium se observaron
colonias atípicas de este género. Un estudio realizado por Mendoza, J. y Bonilla,
R. (2014) en la costa caribe colombiana específicamente en los departamentos de
La Guajira y Cesar, concuerda con que este medio (YMA) es muy utilizado y
específico para aislar este tipo de cepas, el tiempo de incubación en la
investigación fue de 7 días obteniendo colonias características del genero
Rhizobium, mientras que en la práctica fue de 5 días presentándose
contaminación de las placas (contaminación por hongos y bacterias). No se
cumplieron a cabalidad los objetivos de la práctica puesto que no se aisló
Rhizobium ni otra cepa capaz de fijar nitrógeno por medio de la formación de
nódulos, esto puede ser atribuido a la presencia de géneros diferentes a
Rhizobium en los nódulos incubados en el medio ELMARC.
CONCLUSIÓN
En la asociación simbiótica de raíz-leguminosa ocurren diferentes interacciones
biológicas benéficas como las que realizan las bacterias PGPR (bacterias
promotoras de crecimiento vegetal) y algunos hongos como los micorrizicos que
ayudan de diferentes maneras a las plantas. No obstante, como se evidencia en
los resultados no se presenció dicha interacción y crecimiento de Rhizobium sp
debiéndose a diferentes factores, entre los cuales la ausencia de este
microorganismo en las raíces de la planta leguminosa (Leucaena), puede ser
ocasionado por algunas condiciones adversas que impiden la infección y la
actividad benéfica de Rhizobium sp en Leucaena, por concentraciones de metales
pesados, pesticidas, etc., de allí que resulta importante tener en cuenta que las
condiciones ambientales y el tipo de planta son un factor indispensable para
lograr el objetivo de aislar las bacterias fijadoras de nitrógeno de manera
simbiótica. También otro factor es que no todos los suelos poseen las condiciones
propicias para la aparición de la bacteria Rhizobium sp u otras simbióticas (Pérez,
Grisales, Fuentes. 2011) siendo necesarias para estimular y favorecer el
crecimiento adecuado de las plantas leguminosas y algunas de estas plantas
requieren una asociación especifica con esta bacteria para la fijación del
nitrógeno. Tanto es así que cada planta requiere su propia cepa especifica de
Rhizobios para de esa manera desarrollar nódulos de manera eficiente y a la vez
que se garantiza la presencia del genero Rhizobium lo cual es importante a la hora
de aislarse de este tipo de muestras para poder observar su crecimiento y
diferenciación en el laboratorio.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
De Felipe Antón M., “Biotecnologías limpias en agricultura: fijación biológica de
nitrógeno. estructura-función de la simbiosis Rhizobium-leguminosa” (2009).
Mendoza Labrador Jonathan Alberto., Bonilla Buitrago Ruth Rebeca., “Infectividad
y efectividad de rizobios aislados de suelos de la costa caribe colombiana en vigna
unguiculata”. colomb. biotecnol. vol. xvi no. 2, (2014).
Valenzuela Javier., Borbor Gabriela., Borbor Verónica,. “Identificación y
caracterización de cepas nativas de Rhizobium en la provincia de Santa Elena”.
UPSE. Volumen 1, (2012).
Pérez Alexander., Grisales Tatiana., Fuentes Julio,. “Determinación de morfotipos
nativos de Rhizobium asociados a la leguminosa teramnus volubilis sw en fincas
ganaderas del municipio de tolú en el departamento de sucre”. Revista
Colombiana cienc. Anim. 3. (2011)
