PEMBUATAN PREPARAT PEJETAN (SQUASH) LAPORAN PRAKTIKUM Disusun untuk memenuhi tugas matakuliah Mikroteknik Tumbuhan yang diampu oleh Drs. Sulisetijono, M.Si dan Dra. Nursasi Handayani, M.Si Oleh NUR AZIZAH 100342400923 UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM STUDI BIOLOGI Mei 2013 PEMBUATAN PREPARAT PEJETAN (SQUASH) A. Tujuan pembuatan preparat Tujuan kegiatan pembuatan preparat pejetan akar ini adalah: 1. Membuat preparat pejetan ujung akar bawang merah 2. Memperoleh preparat pejetan yang cukup tipis guna pemeriksaan dengan mikroskop 3. Memperoleh preparat pejetan yang sel-selnya terpisah antara yang satu dari yang lain tanpa kehilangan bentuk asli sel 4. Mengidentifikasi fase-fase mitosis pada preparat pejetan yang dihasilkan 5. Mempelajari bangun sel meristem akar bawang merah B. Latar belakang Sel-sel meristem mengalami mitosis melalui tahap-tahap profase, metafase, anafase, dan telofase. Fase-fase pembelahan tersebut dapat dielajari antara lain pada meristem apikal akar, misalnya akar Allium cepa (branbang/bawang merah). Mitosis berlangsung di apeks meristem di daerah yang sel-selnya belum mengalami diferensiasi. Fase-fase mitosis yang berurutan belum tentu terdapat pada sel-sel yang saling berdekatan. Daerah yang sel-selnya belum mengalami diferensiasi hanya dalam rentangan dengan satuan mikron dari titik ujung meristem apikal. Dinding sel pada meristem berupa dinding primer, dan salah satu ciri khas sel meristem adalah intinya aktif. Bagian meristem apikal sangat lunak sehingga oleh tekanan yang rigan saja sel-selnya menjadi tercerai berai. Fase-fase mitosis pada meristem apikal bawang merah dapat dipelajari melaui preparat awetan yaang dibuat dengan metode irisan membujur atau dengan metode pejetan (squash). Preparat pejetan mitosis yang baik adalah preparat yang cukup tipis sehingga dapat diamati dengan menggunakan mikroskop. Sel-selnya terpisah tanpa kehilangan bangun aslinya, dan menunjukkan fase-fase mitosis secara lengkap. C. Dasar teori Mitosis terjadi pada sel-sel meristematik. Meristem berdasarkan posisinya pada tubuh tumbuhan dapat dibedakan menjadi a) meristem apikal, b) meristem lateral dan c) meristem interkalar. Meristem interkalar pada sumbu tubuh tumbuhan terdapat di ujung akar. Meristem apikal batang terlindungi oleh daun-daun yang masih belum mekar, dan pada meristem apikal batang terdapat tonjolan-tonjolan yang berupa banir daun, premordia daun, dan bahkan tonjolan yang bakal menjadi tunas ketiak. Sebaliknya pada meristem apikal akar tidak ada tonjolan-tonjolan seperti yang terdapat pada meristem apikal batang. Karena itu meristem apikal akar tidak serumit meristem apikal batang. Bawang merah dalam kondisi lingkungan yang lembab cepat sekali menampakkan akar-akar yang berkembang dari pangkalnya. Perkembangan akar itu diakibatkan oleh aktivitas mitosis. Aktivitas mitosis pada akar tersebut tidak merata sepanjang hari, pada rentang jam-jam tertentu aktivitas mitosis tinggi, sedangkan pada jam-jam lainnya dalam hari yang sama kurang terjadi aktivitas mitosis, dan pada rentang waktu yang terakhir tadi sel-sel meristem dalam kondisi interfase. Meristem apikal mencakup daerah-daerah sel-sel inisial, tunika, korpus, daerah yang sel-selnya aktif mengalami mitosis, dan daerah yang sel-selnya mengalami diferensiasi serta spesialisasi. Akar dari puncak ke pangkal terdiri dari daerah meristematik, daerah pembentangan, daerah berbulu, dan daerah yang menua. Daerah meristematik hanya meliputi beberapa mikron saja dari puncak ujung akar. Sel-sel di daerah meristematik menampilkan inti yang jelas pada tahap interfase, sedangkan pada tahap-tahap mitosis mempunyai ciri khas terkait dengan kondisi inti dan kromosomnya. Selama metafase inti menunjukkan perubahan menuju ke penampilan kromosom, pada metafase kromosom tampil di bidang ekuator pembelahan, pada anafase kromosom sedang menuju ke kutub-kutub pembelahan, dan akhirnya tampilan telofase ialah terbentuknya inti pada kedua kutub pembelahan. Sel-sel meristem tersusun rapat tanpa ruang antar sel, urutan fase-fase mitosis tersebut tidak harus tampil pada sel-sel yang bertetangga secara berurutan. Sebagai contoh, satu sel yang sedang pada tahap telofase dapat tampil di antara sel-sel sekitarnya yang interfase. D. Alat dan Bahan Alat Bahan - Beaker glass - umbi bawang merah - Lidi/tusuk gigi - air - Silet - akar bawang merah - Skalpel - alkohol absolut - Pisau berkarat - alkohol 50% - Kaca benda - alkohol 70% - Kaca penutup - alkohol 85% - Kertas isap - alkohol 95% - Pensil - alk. Absolut:xylol = 3:1 - Labu erlenmeyer - alk. Absolut:xylol = 2:2 - Lampu spiritus - alk. Absolut:xylol = 1:3 - Tripot - aquades - Lap pembersih - asam cuka es - HCl 1 N - acetocarmine - xylol murni - entelan E. Cara Kerja  Persiapan Menyemaikan brambang (bawang merah). Meletakkan brambang bertusuk lidi di mulut beaker glass yang berisis air, usahakan agar brambang tergantung dengan pangkal terletak dekat sekali dengan permukaan air. Menyiapkan larutan fiksasi yang berupa FAA (Formaldehid acetil acetat).  Tahap pemrosesan Memotong ujung akar bawang pada jam 12 malam beberapa senti meter dan memasukan kedalam larutan fiksasi selama 24 jam. Memindahkan spesimen ke dalam alkohol 70% sehingga spesimen dapat disimpan sampai digunakan. Memindahkan spesimen ke dalam alkohol 70% sehingga spesimen dapat disimpan sampai digunakan. Meneteskan satu tetes aceto-carmine sehingga ujung akar menjadi lunak. Memotong bagiaan ujung akar sepanjang 2-3 milimeter dan sisanya dibuang. Mencacah bagian ujung spesimen dengan skalpel atau silet berkarat untuk mempercepat reaksi warna. Menutup spesimen dengan kaca penutup, kelebihan zat warna ditarik dengan kertas hisap. Memejet kaca penutup dengan ibu jari atau dengan menggelindingkan pensil diatas kaca penutup secara hati-hati. Bila warna masih pucat, dapat diintensifkan dengan jalan memanaskannya diatas mulut gelas beker yang berisi air mendidih. Memberikan entelan sebagai perekat pada tepi kaca penutup. F. Data (a) (b) (d) (c) (e) Gambar 1. Fase mitosis pada preparat akar bawang (a. interfase, b. Profase, c. metafase, d. Anafase, e. Telofase) G. Analisis data Hasil pengamatan pembuatan preparat pencetan diperlihatkan pada gambar 1. Ditemukan semua fase saat pembuatan preparat pencetan, hanya saja semua fase tidak langsung terdapat dalam satu bidang pandang melainkan butuh beberapa preparat untuk melihat keseluruhan fase mitosis. Fase interfase pada gambar a telihat bahwa pengikatan warna oleh kromosom kurang, sehingga warna yang dihasilkan pucat, sementara pada fase profase dan metafase pada gambar b dan c terlihat sangat terang dan berwarna merah terang. Pada fase anafase dan telofase pewarnaan masih kurang merah sehingga warna yang didapat sedikit pudar. H. Pembahasan Kromosom memiliki peranan yang sangat penting bagi keberlangsungan suatu makhluk hidup, karena kromosom merupakan alat pengangkutan bagi gengen yang akan dipindahkan dari suatu sel induk ke sel anakannya, dari generasi yang satu ke generasi yang lainnya. Pengamatan terhadap perilaku kromosom sama pentingnya dengan mempelajari struktur kromosom. Perilaku atau aktivitas kromosom dapat terlihat dalam siklus sel, termasuk didalamnya adalah pembelahan sel (mitosis atau meiosis). Analisis kromosom, baik mitosis maupun meiosis merupakan langkah awal yang dapat dilaksanakan untuk mempelajari kromosom Tumbuhan pada masa awal perkembangan mengalami pertumbuhan sangat banyak, tumbuhan mengalami pembelahan sel secara tidak langsung yang disebut juga dengan mitosis. Mitosis adalah pembelahan duplikasi dimana sel memproduksi dirinya sendiri dengan jumlah kromosom sel induk. Mitosis mempertahankan pasangan kromosom yang sama melalui pembelahan inti dari sel somatis secara berturut turut. Peristiwa ini terjadi bersama-sama dengan pembelahan sitoplasma dan bahan-bahan di luar inti sel dan memiliki peran penting dalam pertumbuhan dan perkembangan hampir semua organisme. mitosis memiliki beberapa tahapan meliputi profase metafase, anafase, dan telofase. Tujuan dari pembelahan mitosis adalah mewariskan semua sifat induk kepada kedua sel anaknya karena mitosis menghasilkan sel anak yang identik, regenerasi dan perbaikan sel-sel tubuh yang rusak. Akar bawang digunakan untuk mempelajari mitosis dengan alasan karena bawang merah memiliki jumlah kromosom 16 sehingga mudah dihitung, ukuran kromosom besar sehingga mudah diamati dan telah diketahui rentang waktu mitosisnya (Listiawan, 2009), sehingga lebih memungkinkan untuk mendapatkan hasil percobaan yang lebih baik, mudah didapatkan, dan mudah dilakukan (membuat preparat dan meneliti jaringannya) dan akar bawang merupakan salah satu jaringan yang sel-sel penyusunnya adalah sel-sel somatik, khusus pada ujung akar terdiri dari sel-sel yang bersifat meristematik, yaitu sel-selnya selalu aktif membelah, sehingga diharapkan fase-fase mitosis dapat diamati secara lengkap. Sebelum membuat preparat irisan melintang tudung akar bawang merah dengan beberapa tahapan sesuai prosedur, tudung akar dipisahkan dari bagian akar lainnya dengan cara dipotong ± 1cm. Pemotongan tersebut dilakukan pada pukul 24.00 WIB. Menurut Margono (1973) sel-sel yang ada di ujung akar bawang merah mengalami aktivitas pembelahan pada rentangan waktu 5 menit sebelum dan sesudah pukul 24.00 WIB. Dengan melakukan pemotongan pada sekitar waktu tersebut, diharapkan dapat menemukan dan mengamati fase-fase/ tahapan pembelahan mitosis beserta ciri-ciri selnya. Potongan akar dimasukkan ke dalam tabung vial yang berisi larutan FAA. Larutan FAA merupakan larutan fiksatif yang bisa menahan sel untuk tidak melakukan pembelahan lagi. Akar dikeluarkan dari tabung vial dan dibersihkan dari FAA dengan mencuci menggunakan air kran, kemudian potongan akar diletakkan di gelas arloji direndam dengan alkohol 70% selama 2 menit dengan tujuan untuk membersihkan potongan akar dari mikroba serta mengawetkan potongan tersebut. Setelah itu alkohol dihilangkan dengan cara diserap menggunakan kertas tisu. Selanjutnya potongan akar tersebut ditetesi beberapa tetes larutan HCL 1 N dan biarkan selama 5 menit. Menurut Jureak (1999) Golongan asam kuat seperti asam klorida (HCL) digunakan untuk melunakkan jaringan yang akan diamati.Perendaman ini bertujuan untuk memperjelas dan untuk membedakan antara bagian tudung dengan bagian akar lainnya. Bagian tudung akar akan tampak lebih cerah daripada bagian akar lainnya. Selain itu, perendaman tersebut bertujuan untuk melunakkan dinding sel akar bawang merah. Setelah terlihat jelas batas antara tudung akar dengan bagian akar lainnya, pada bagian tersebut dipotong dengan menggunakan silet. Tudung akar tersebut kemudian dipindahkan ke kaca benda dan ditetesi acetokarmin dengan membiarkan selama 5 menit, supaya sel-sel terlihat lebih jelas ketika diamati. Setelah itu proses pencacahan tudung akar dengan menggunakan silet berkaratpun dilakukan sampai halus dan ada perubahan warna pada pewarna. Alasan mengapa menggunakan silet berkarat adalah kandungan besi (Fe) teroksidasi dapat membantu proses pengikatan warna yang dilakukan oleh kromosom. Korosi besi merupakan elektrokimia. Ion besi (II) yang terbentuk selanjutnya teroksidasi menjadi ion besi (III) yang kemudian membentuk senyawa oksida terhidrasi Fe2O3, yaitu karat besi. Setelah bercampur dengan acetokarmin akan terjadi penyerapan warna. Selanjutnya menutup hasil pencacahan tersebut dengan kaca penutup. Pemberian tekanan pada preparat bertujuan supaya preparat dalam kondisi rata dan lebih tipis. Preparat siap untuk diamati di bawah mikroskop. Jika belum terlihat jelas sel yang diamati, preparat dipanaskan terlebih dahulu. Berdasarkan hasil pengamatan dengan perbesaran mikroskop 40x10 didapatkan hasil bahwa tahapan pembelahan sel yang teramati ialah tahapan interfase, profase, metafase awal, metafase akhir, anafase awal, anafase akhir, dan telofase. Berdasarkan hasil pengamatan, pada tahapan interfase kromosom terlihat lebih memadat dan terlihat lebih jelas daripada ketika tahapan profase. Tahapan interfase menurut Reece (1999: 223) merupakan tahapan dimana sel tumbuh dan menyalin kromosom dalam persiapan untuk pembelahan sel. Berkaitan dengan tahapan profase, Reece (1999: 229) menjelaskan bahwa pada saat tahapan profase, kromatin memadat. Nukleolus masih jelas terlihat tetapi akan segera mulai menghilang. Pada tahapan ini, gelendong miotik mulai terbentuk. Berdasarkan hasil pengamatan, tahapan profase juga ditunjukkan dengan adanya pemadatan kromatin. Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop cahaya, nukleolus tidak terlihat jelas, dan gelendong mitotik juga tidak terlihat. Elrod dan Stansfield (2007: 5) menjelaskan bahwa pada tahapan profase, kromosom-kromosom mengalami penebalan atau berkondensasi, sehingga dapat terlihat di bawah mikroskop cahaya, mula-mula sebagai benang-benang tipis, lalu secara progresif menjadi semakin pendek dan tebal karena mengumpar di sekeliling proteinprotein histon, kemudian mengumpar terpilin (supercoil) pada dirinya sendiri. Tahapan pembelahan mitosis selanjutnya yang didapatkan berdasarkan hasil pengamatan ialah metafase awal. Reece (1999: 229) menjelaskan bahwa pada tahap metafase awal, telah terlihat kromosom yang telah terpisah, masingmasing terdiri atas dua kromatid saudara identik yang saling melekat. Pada tahapan ini, selubuh nukleus akan terfragmentasi dan mikrotubula gelondong akan melekat pada kinetokor kromosom. Selain metafase awal, dalam pengamatan juga ditemukan tahapan metafase akhir. Kromosom pada metafase akhir, nampak terlihat jelas berbaris pada pelat metafase, sedangkan pada metafase awal kromosom tidak terlihat jelas berbaris pada pelat metafase. Reece (1999: 229) menjelaskan bahwa pada tahapan metafase gelendong telah lengkap, dan kromosom yang ditarik sama kuat oleh mikrotubula kinetokor yang datang dari kutub sel yang berlawanan, berbaris pada pelat metafase. Elrod dan Stansfield (2007: 6) juga menjelaskan bahwa saat metafase, serabut-serabut kinetokor dari MTOC (microtubule organizing center) yang berseberangan akan mendorong dan menarik sentromer-sentromer yang menjadi satu pada kromatid-kromatid saudari. Akibatnya, masing-masing kromosom bergerak ke bidang yang biasanya dekat dengan bagian tengah sel, sebuah posisi yang disebut bidang metafase (metaphase plate). Kromosom-kromosom dijaga pada posisi tersebut oleh tekanan dari serabut-serabut MTOC yang berseberangan. Tahapan pembelahan selanjutnya ialah anafase. Berdasarkan hasil pengamatan pada tahapan anafase akhir seluruh kromosom telah tertarik ke utubkutub yang berseberangan, sedangkan pada anafase awal belum semua kromosom tertarik ke kutub yang berseberangan. Reece (1999: 229) menjelaskan bahwa kromatid setiap kromosom telah terpisah dan kromosom anak berpindah ke kutubkutub sel begitu mikrotubula kinetokornya memendek. Elrod dan Stansfield (2007: 6) juga menjelaskan bahwa selama anaphase, kromatid-kromatid saudari memisah di bagian sentromer dan tertarik ke kutub-kutub yang berseberangan. Seiring bergeraknya masing-masing kromatid melalui sitosol yang kental, lengannya bergerak lambat di belakang sentromernya (yang melekat ke serabut gelendong melalui kinetokor), sehingga memberi bentuk khas pada kromatid tersebut, tergantung pada letak sentromernya. Tahapan pembelahan selanjutnya ialah telofase. Berdasarkan hasil pengamatan pada tahapan ini masing-masing set dari kromosom telah mulai terpisah, yang dipisahkan oleh pelat sel dengan membagi sitoplasma menjadi dua. Reece (1999: 229) menjelaskan bahwa pada tahapan ini nukleus anak terbentuk, sementara itu sitokinesis mulai terjadi. Pelat sel yang akan membagi sitoplasma menjadi dua, sedang tumbuh ke arah keliling sel induknya. Elrod dan Stansfield (2007: 6) juga menjelaskan bahwa pada telofase, masing-masing set dari kromatid-kromatid yang memisah, berkumpul pada kedua kutub sel. Kromatidkromatid (yang kini disebut lagi kromosom) mulai membuka kumparannya dan kembali ke keadaan interfase. Gelendong berdegenerasi, membran nukleus terbentuk kembali, dan sitoplasma membelah dalam proses yang disebut sitokinesis. Sitokinesis pada sebagian besar tumbuhan melibatkan pembentukan lempengan sel dari pektin yang berawal dari tengah sel dan menyebar secara lateral ke di dinding sel. Selanjutnya, selulosa dan materi-materi penguat lainnya ditambahkan ke lempengan sel, sehingga mengubah lempengan itu menjadi dinding sel yang baru. I. Diskusi 1. Hubungan jam pemotongan akar dan pemasukan specimen ke dalam larutan fiksatif yang dikaitkan dengan jumlah sel yang menampakkan aktivitas mitosis adalah Jawab: Aktivitas mitosis tidak merata sepanjang hari, namun pada rentang jamjam tertentu. Untuk mengamati tahap-tahap pembelahan mitosis dilakukan pemotongan akar pada saat tengah malam, yaitu pukul 24.00 WIB, Menurut Margono (1973) hal ini dikarenakan pada ujung akar bawang merah banyak sel yang mengalami aktifitas pembelahan dengan rentangan 5 menit sebelum dan sesudah pukul 24 malam sehingga diharapkan tahap-tahap mitosis dapat diamati. 2. Sel-sel meristem tersusun rapat tanpa ruang antar sel, urutan fase-fase mitosis tersebut tidak harus tampil pada sel-sel yang bertetangga secara berurutan. Sebagai contoh, satu sel yang sedang pada tahap telofase dapat tampil di antara sel-sel sekitarnya yang interfase. 3. sel-sel maristem akar berbentuk persegi. Dengan inti sel yang nampak seperti lingkaran 4. hubungan mitosis dan perkembangan tumbuhan adalah Jawab: mitosis terjadi pada sel-sel meristematik dan salah satu cirri khas sel meristem adalah intinya aktif. Sel-sel meristem pada tumbuhan berada di posisi apikal, lateral dan interkalar. Sifat yang mudah membelah tersebut menjadikan tumbuhan menjadi terus berkembang dari hari ke hari. Mitosis adalah fase-fase pembelahan sel yang berlangsung di sel-sel meristem. Mitosis berlangsung di apeks meristem di daerah yang sel-selnya belum mengalami diferensiasi seperti bagian ujung akar yang menjadi objek pengamatan praktikum squash ini. 5. Tipe-tipe pembelahan berdasarkan bidang pembelahan adalah   Profase : fase dimana kromatinnya memadat, nukleolus masih jelas terlihat tetapi akan segera mulai menghilang dan gelendong mitotic mulai terbentuk Prometafase: fase dimana kromosom mulai terpisah, masing-masing terdiri dari dua kromatid saudara identik yang saling melekat, selubung nukleus akan terfragmentasi dan mikrotubula gelendong akan melekat pada  kinetokor kromosom. Metaphase: fase dimana gelendong pembelahan telah lengkap, kromosom yang ditarik sama kuat oleh mikrotubula kinetokor yang datang dari kutub  sel yang berlawanan, berbaris pada pelat metaphase  kromosom anak berpindah ke kutub-kutub sel saat mikrotubula memendek Anaphase: fase dimana kromatid setiap kromosom telah berpisah dan Telofase: fase dimana nukleus anak terbentuk, dan sitokinesis mulai terjadi, pelat sel akan membagi sitoplasma menjadi dua J. Tugas mahasiswa 1. Mengapa pemahaman mitosis sangat penting dalam studi meristem? Jawab: karena perkembangan jaringan-jaringan meristem menuju tahap diferensiasi tidak dapat luput dari pembelahan mitosis sel, terutama terjadi pada ujung akar dan ujung batang. 2. Mengapa untuk memperoleh ujung akar sebagai spesimen dalam pembuatan preparat tidak mengambil dari akar tumbuhan yang tumbuh di lingkungan? Jawab: karena lebih praktis jika menumbuhkan sendiri dengan medium air, selain tidak kotor terkena tanah, akarnya juga masih dalam keadaan utuh tanpa lecet. 3. Megapa pada tahap pemejetan hanya dilakukan daya tekan yang ringan saja? Jawab: karena jika ditekan terlalu kencang akan menyebabkan isi dari sel terutama kromosom rusak dan tidak dapat diamati. Hal tersebut disebabkan selsel bawang sangan tipis dan rapuh. 4. Mengapa bahan ujung akar yang digunakan pada akhirnya hanya diambil sepanjang beberapa milimeter saja? Jawab: karena daerah pembelahan hanya terdapat sedikit pada ujung akar, fase selanjutnya yaitu fase pemanjangan, pada fase tersebut umumnya sudah sulit ditemukan pembelahan mitosis. 5. Mengapa spesimen yang digunakan diambil dari ujung akar dan bukan dari ujung batang? Jawab: karena ujung akar sangat mudah ditumbuhkan, selain itu sel-sel pada ujung batang lebih keras dan terdapat lapisan-lapisan daun pada ujung batang sehingga mempersulit pengamat untuk melakukan pengamatan tentang pembelahan sel. K. Tugas Terstruktur Lakukan studi pustaka tentang hal-hal yang terkait dengan inti sel dalam pembelahan sel. Tipe pembelahan sel berdasar bidang pembelahan, organisasi meristem apikal. Perbandingan meristem apikal pada batang dan pada akar. Jawab: studi ustaka sudah masuk pada pembahasan. Kita hanya membuat preparat meristem akar saja bukan batang. L. Kesimpulan Fase-fase mitosis yang ditemukan pada preparat pencetan adalah keseluruhan fase mitosis mulai dari interfase, profase, metafase, anafase, dan telofase dengan pewarnaan yang sudah cukup bagus. M. Daftar Pustaka Jurèák J. 1999. A Modification To The Acetocarmine Method Of Chromosome Colouring In The School Practice. 14 hlm. Listiawan, Dwi Andi. dkk. 2009. Potensi Ekstrak Etanolik Daun Tapak Dara (Catharanthus roseus (l.) G. Don.) Sebagai Alternatif Pengganti Kolkhisin Dalam Poliploidisasi Tanaman. Litbang News: Departemen Penelitian dan pengembangan. Edisi Januari-Maret 2009. Margono, Hadi. 1973. Pengaruh Colchicine terhadap Pertumbuhan Memanjang Akar Bawang Merah (Allium cepa). Skripsi. Tidak diterbitkan. Malang IKIP. Reece, Campbell; Lawrence G. Mitchel. 1999. Biologi Jilid 1: Edisi 5. Jakarta: Erlangga