BAB IV UJI KUALITATIF PROTEIN TUJUAN : Mengetahui prinsip dasar uji kualitatif protein Mengetahui perbedaan prinsip dari masing-masing metode A. Pre-lab 1. Bagaimana prinsip dan mekanisme analisis protein dengan metode ninhidrin? Pada prinsip uji ninhidrin ini, yaitu menguji ada tidaknya protein dalam suatu senyawa dengan penambahan reagen ninhidrin untuk mengetahui jumlah kadar asam amino bebas yang terkandung didalamnya, dimana asam amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Uji Ninhidrin dilakukan dengan menambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin yang kemudian dipanaskan. Reaksi ini terjadi dengan senyawa amin primer dan ammonia tanpa pembebasan CO. Adanya protein atau asam amino ditunjukkan dengan terbentuknya warna ungu pada bahan uji (Krishna, dkk., 2015). 2. Bagaimana prinsip dan mekanisme analisis protein dengan metode biuret? Uji Biuret didasarkan pada reaksi antara ion Cu2+dan ikatan peptide dalam suasanabasa. Warna kompleks ungu menunjukkan adanya protein. Intensitas warna yang dihasilkan merupakan ukuran jumlah ikatan peptida yang ada dalam protein. Ion Cu2+ dari pereaksi Biuret dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptide yang menyusun protein, dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet. Reaksi ini positif terhadap dua buah ikatan peptide atau lebih, tetapi negative untuk asam amino bebas atau ikatan peptida. Protein melarutkan hidroksida tembaga untuk membentuk kompleks warna. Reaksi pembentukan warna ini dapat terjadi pada senyawa yang mengandung dua gugus karbonil yang berikatan dengan nitrogen atau atom karbon (Kumar, dkk., 2016). 3. Kondisi apa yang sebaiknya diberikan pada saat pengujian protein serta jelaskan alasannya! Sebenarnya protein bersifat amfoter bisa bereaksi dengan asam atau basa. Namun lebih mudah bereaksi dengan suasana basa. Selain itu agar mudah untuk diamati. Dalam uji biuret supaya ion Cu2+ dari pereaksi biuret (dalam suasana basa) akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet (Krishna, dkk., 2015).  B. Tinjauan Pustaka Protein Protein tersusun dari peptida-peptida sehingga membentuk suatu polimer yang disebut polipeptida. Setiap monomernya tersusun atas asam amino. Peranan protein diantaranya sebagai katalisator, pendukung, cadangan, sistem imun, dsb (Wirahadikkusumah, 2008). Protein yang tersusun dari rantai asam amino akan memiliki berbagai macam struktur yang khas pada masing-masing protein. Adapun struktur protein meliputi struktur primer, struktur sekunder, struktur tersier, dan struktur kuartener. Struktur primer merupakan struktur yang urutan asam aminonya tersusun secara linear dan tidak terjadi percabangan rantai. Struktur sekunder merupakan kombinasi antara struktur primer yang linear dan memiliki segmen-segmen dalam polipeptida yang terlilit. Struktur tersier dari suatu protein adalah lapisan yang tumpang tindih di atas pola struktur sekunder yang terdiri atas pemutarbalikan tak beraturan dari ikatan antara rantai samping (gugus R) berbagai asam amino Struktur kuarterner adalah protein membentuk molekul kompleks, beberapa rantai protein bergabung membentuk seperti bola (Wirahadikkusumah, 2008). Uji Ninhidrin Uji ninhidrin adalah metode yang digunakan untuk menganalisa protein secara kualitatif. Uji ninhidrin ini didasarkan pada reaksi yang terjadi antara asam amino dengan ninhidrin. Asam amino akan bereaksi dengan ninhidrin membentuk aldehida dengan 1 atom C yang lebih rendah melepaskan molekul NH3 dan CO2. Selain melepaskan NH3 dan CO2, asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin akan membentuk warna ungu atau biru. Warna yang dihasilkan tersebut disebabkan karena molekul ninhidrin dan hidratin bereaksi dengan NH3 setelah asam amino tersebut dioksidasi (Krishna, dkk., 2015). Uji Biuret Uji biuret adalah metode yang digunakan dalam analisis protein secara kualitatif. Metode biuret ini didasarkan pada reaksi antara ion Cu2+ dengan ikatan peptide dalam suasana basa. Ion Cu2+ yang terdapat pada reagen biuret akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptide penyusun protein dalam keadaan basa. Reaksi antara ion Cu2+ dengan ikatan-ikatan peptide tersebut menghasilkan warna kompleks ungu. Warna ungu yang terbentuk tersebut disebabkan karena ikatan-ikatan peptide protein tersebut melarutkan hidroksida tembaga. Reaksi pembentukan warna ini dapat terjadi pada senyawa yang mengandung 2 gugus karbonil yang berikatan dengan nitrogen atau atom karbon (Kristiani, 2010). Fungsi Reagen Reagen Ninhidrin Ninhidrin adalah suatu reagen yang berguna untuk mendeteksi asam amino dan menetapkan konsentrasinya dalam larutan. Apabila bereaksi dengan asam amino menghasilkan zat berwarna ungu. Reagen ini dapat menyebabkan iritasi saluran pernafasan. Berbahaya jika tertelan dan berbahaya jika diserap melalui kulit atau terhirup (Poedjiadi, 2009). Reagen Biuret Reagen biuret merupakan senyawa dengan rumus kimia H2NC(O)NHC(O)NH2. Reagen biuret ini merupakan hasil kondensasi dari dua molekul urea. Reagen biuret ini dapat menyebabkan iritasi jika terpapar pada daerah sensitive pada jangka waktu lama. Reagen biuret digunakan untuk mengidentifikasi adanya ikatan peptide pada suatu sampel yang diuji (Poedjiadi, 2009). Tinjauan Bahan 5.1 Aspartam (Poedjiadi, 2009). Aspartam adalah pemanis nutritif yang memasok energi tubuh dalam bentuk kalori. Aspartam seratus hingga dua ratus kali lebih manis daripada sukrosa. Bahan ini terdiri atas kombinasi dua protein, asam aspartat dan fenilalanin (Poedjiadi, 2009). 5.2 Gelatin (Poedjiadi, 2009). Gelatin adalah polipeptida dengan berat molekul tinggi dan hidrokoloid penting yang telah terbukti secara umum dan penggunaannya dalam berbagai makanan untuk meningkatkan elastisitas ,konsistensi, dan stabilitas seperti gel. Gelatin berbeda dari hidrokoloid lain karena kebanyakan dari mereka adalah polisakarida, sedangkan gelatin adalah protein yang dapat dicerna dan mengandung semua asam amino esensial kecuali triptofan. Komposisi asam amino khususnya yang berkaitan dengan prolin dan hidroksiprolin dapat bervariasi dari spesies ke spesies, sebagai akibat dari paparan berbagai kondisi lingkungan, khususnya suhu. Gelatin dapat diperoleh tidak hanya dari kulit dan tulang hewan darat, tetapi juga dari ikan dan serangga (Poedjiadi, 2009). 5.3 MSG (Poedjiadi, 2009). Monosodium glutamat (MSG) adalah garam natrium (sodium) dari asam glutamate, suatu asam amino yang terdapat dalam semua  jenis protein. Glutamat diproduksi melalui fermentasi, suatu proses yang digunakan untuk membuat bir, cuka, kecap kedelai dan yogurt. Prosesnya dimulai dengan bahan alami seperti tetes gula (molasses) dari gula tebu atau gula bit dan pati singkong atau biji-bijian. MSG berfungsi sebagai bahan penyedap dan penambah cita rasa dalam makanan (Poedjiadi, 2009). 5.4 Susu skim (Poedjiadi, 2009). Susu skim dibuat ketika semua krim (juga disebut lemak susu) dihapus dari susu. Kadang-kadang hanya setengah krim dihapus, sehingga susu semi-skim gantinya. Susu skim lebih populer di Amerika Serikat daripada Inggris. Ini mengandung lemak kurang dari susu biasa, yang berarti bahwa banyak ahli gizi dan dokter menyarankan untuk orang-orang yang mencoba untuk menurunkan berat badan atau mempertahankan berat badan yang sehat. Susu skim cenderung memiliki rasa sedikit berair, yang beberapa konsumen tidak menikmati. Susu rendah lemak memiliki tingkat lemak antara 0,5-2%. Hal ini juga harus berisi minimal 8,25% padatan-tidak-lemak. Ini harus berisi 2000 IU vitamin A per liter. Susu skim juga disebut susu non fat (Poedjiadi, 2009). C. Diagram Alir Uji Ninhidrin Sampel 2 mL larutan ninhidrin Diambil 2 mL Dimasukan tabung reaksi pada air mendidih selama 20 detik Diamati warna larutannya Dicatat dan ditulis hasil pengamatan Hasil Uji Biuret 3 mL larutan sampel 1 mL NaOH 10% Dimasukkan ke dalam tabung reaksi Dikocok larutan CuSO4 0,1% Ditambahkan 3 tetes ke dalam tabung reaksi Diamati timbulnya warna Hasil  D. Data Hasil Pengamatan dan Pembahasan 1. Uji Ninhidrin No. Sampel Sebelum Pemanasan Sesudah Pemanasan Hasil uji 1 Susu Skim Ada endapan susu skim dan warnanya bening Warnanya bening dengan adanya endapan susu skim - 2 MSG Warnanya ungu bening Warnanya ungu pekat + 3 Aspartam Warnanya bening Warnanya ungu bening + 4 Gelatin Warnanya bening Warnanya bening - Analisa Prosedur Dalam uji ini yang perlu dilakukan pertama yaitu ambil masing-masing sampel (susu skim, MSG, gelatin, dan aspartam) sebanyak 2 ml, lalu tambahkan 2 ml larutan ninhydrin dan masukkan larutan-larutan tersebut ke dalam masing-masing tabung reaksi dan beri label. Kemudian, masukkan masing-masing tabung reaksi pada air mendidih selama 20 detik. Setelah itu, amati perubahan warna yang terjadi dan catat hasil pada data hasil pengamatan yang telah tersedia. Analisa Hasil Dari praktikum yang telah dilakukan dihasilkan pada sampel susu skim sebelum pemanasan terdapat endapan susu skim pada sampel dan berwarna bening dan pada saat setelah pemanasan hasilnya tetap seperti saat sebelum pemanasan. Ini artinya bahwa uji ninhidrin pada sampel susu skim negatif. Hal ini dikarenakan susu skim memiliki gugus asam amino bebas yang sedikit sehingga membutuhkan waktu yang lebih lama dalam pemanasan, sedangkan pada saat praktikum sendiri waktu yang dilakukan untuk pemanasan hanya 20 detik dan dirasa masih kurang lama agar sampel susu skim berubah warna menjadi ungu. Lalu pada sampel MSG sebelum pemanasan memiliki warna ungu bening. Akan tetapi, pada saat setelah pemanasan sampel MSG berubah warna menjadi ungu pekat sehingga sampel ini dikatakan hasilnya positif pada uji ninhydrin. Hal ini dikarenakan pada MSG banyak mengandung asam amino bebas sehingga dengan mudah sampel MSG berubah warna menjadi ungu. Kemudian, pada sampel aspartame pada saat sebelum pemanasan memiliki warna bening. Akan tetapi pada saat setelah pemanasan, warnanya berubah menjadi ungu bening sehingga sampel ini dikatakan hasilnya positif pada uji ninhydrin. Hal ini dikarenakan dalam aspartam tersusun atas asam aspartat dan fenilalanin sehingga terbentuk dipeptide. Lalu, pada sampel gelatin pada saat sebelum dan sesudah pemanasan memiliki warna yang tetap yaitu bening sehingga dikatakan bahwa sampel gelatin negatif pada uji ini. Hal ini dikarenakan pada gelatin memiliki asam amino yang kompleks. Bila dibandingkan dengan literatur (Kartasapoetra, 2008) menyatakan bahwa sampel yang hasilnya positif mengandung asam amino bebas adalah susu skim, MSG, dan aspartame. Sedangkan untuk gelatin negatif mengandung asam amino bebas. Reaksi yang terjadi Reaksi yang terjadi pada uji ninhidrin yaitu: Asam alfa amino + 2 ninhydrin CO2 + aldehid + kompleks warna ungu + 3H2O Atau bisa juga reaksinya seperti ini. Ninhydrin + asam amino diketohirylhalida + diketohidramin 2. Uji Biuret No. Sampel Sebelum ditambah reagen Sesudah ditambah reagen Hasil uji 1 Susu skim Berwarna kuning bening dan terdapat endapan pada sampel Terdapat warna ungu pekat di permukaan sampel + 2 MSG Berwarna bening Terdapat warna biru muda di permukaan sampel - 3 Gelatin Berwarna kuning bening Terdapat warna ungu muda di permukaan sampel + 4 Aspartam Berwarna bening dan ada endapan putih Terdapat warna biru bening/muda di permukaan sampel - Analisa Prosedur Dalam uji ini yang perlu dilakukan pertama yaitu ambil masing-masing sampel (susu skim, MSG, gelatin, dan aspartam) sebanyak 3 ml, lalu tambahkan 1 ml NaOH 10% dan masukkan larutan-larutan tersebut ke dalam masing-masing tabung reaksi. Kemudian, kocok masing-masing tabung reaksi tersebut. Setelah itu, tambahkan 3 tetes larutan CuSO4 0,1% ke dalam masing-masing tabung reaksi, kemudian amati perubahan warna yang terjadi dan catat hasil pada data hasil pengamatan yang telah tersedia. Analisa Hasil Dari praktikum yang telah dilakukan, dihasilkan pada sampel susu skim pada saat sebelum ditambah reagen CuSO4 memiliki warna kuning bening dan terdapat endapat pada sampel. Akan tetapi, saat setelah ditambah reagen CuSO4 terdapat warna ungu pekat di permukaan sampel. Hal ini dikarenakan pada sampel susu skim terdapat protein yang mengandung ikatan peptide dengan ion Cu2+ yang berasal dari CuSO4 dalam suasana basa. Sehingga dapat dikatakan bahwa sampel susu skim positif mengandung ikatan peptida. Kemudian pada sampel MSG pada saat sebelum ditambah reagen CuSO4 berwarna bening. Akan tetapi setelah penambahan CuSO4 terdapat warna biru muda di permukaan sampel. Ini menandakan bahwa sampel MSG tidak mengandung ikatan peptide karena warna yang dihasilkan bukan ungu melainkan biru, sehingga sampel ini negatif mengandung ikatan peptida. Lalu, pada sampel gelatin saat sebelum ditambahkan reagen CuSO4 warnanya kuning bening. Akan tetapi, saat setelah ditambahkan reagen CuSO4 terdapat warna ungu muda di permukaan sampel, hal ini disimpulkan bahwa sampel ini positif mengandung ikatan peptide. Kemudian pada sampel aspartam, saat sebelum ditambah reagen CuSO4 warnanya bening dan ada endapan berwarna putih. Pada saat setelah ditambah reagen CuSO4 terdapat warna biru muda di permukaan sampel. Ini menandakan bahwa sampel aspartam tidak mengandung ikatan peptide karena warna yang dihasilkan bukan ungu melainkan biru, sehingga sampel ini negatif mengandung ikatan peptida. Bila dibandingkan dengan literature (Anyango, 2011) menyatakan bahwa sampel yang hasilnya positif mengandung ikatan peptida adalah susu skim dan gelatin. Sedangkan untuk MSG dan aspartam negatif mengandung ikatan peptida dalam sampelnya. Reaksi yang terjadi Reaksi yang terjadi pada uji biuret yaitu sebagai berikut. Larutan CuSO4 alkalis (reagen biuret) + 2 atau lebih ikatan peptide kompleks warna violet. E. PERTANYAAN Bagaimana reaksi yang terjadi antara sampel dengan reagen pada uji Ninhidrin? Reaksi akan menginisiasi menjadi warna ungu adalah proses reduksi reagen ninhydrin oleh asam amino, kemudian asam alfa amino terpecah karena adanya proses reduksi tadi dan terbentuklah ninhydrin tereduksi, aldehid, NH3, serta terlepasnya CO2. Lalu ninhydrin yang tereduksi akan bereaksi dengan ammonia dan dengan molekul ninhydrin lain sehingga terjadi proses kondensasi melepas 3 molekul H2O dan menghasilkan garam diketohyrilhalida-diketohidramin dan akhirnya membentuk senyawa kompleks berwarna ungu (Patong, 2012). Bagaimana mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada sampel dengan menggunakan uji Biuret? Cara mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada sampel dengan menggunakan uji biuret yaitu dengan ditambahkan NaOH dan CuSO4 berdasarkan ada atau tidaknya ikatan peptida dimana Cu2+ akan bereaksi dengan polipeptida sehingga menghasilkan senyawa kompleks berwarna ungu (Patong, 2012). F. KESIMPULAN Prinsip pada uji ninhydrin yaitu menguji ada atau tidaknya protein dengan menambahkan reagen ninhydrin untuk mengetahui kadar asam amino bebas dimana asam amino bereaksi dengan ninhydrin membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Sedangkan prinsip pada uji biuret yaitu menguji adanya tidaknya protein dengan ditambahkan NaOH dan CuSO4 berdasarkan ada atau tidaknya ikatan peptida dimana ion Cu2+ akan bereaksi dengan polipeptida sehingga menghasilkan senyawa kompleks berwarna ungu. Praktikum uji kualitatif protein memiliki tujuan yaitu mengetahui prinsip dasar uji kualitatif protein dan mengetahui perbedaan prinsip dari masing-masing metode. Pada praktikum uji ninhidrin, sampel yang menunjukkan uji positif adalah MSG dan aspartam. Kedua sampel tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki gugus amino bebas. Sedangkan pada sampel susu skim negatif. Hal ini dikarenakan susu skim memiliki gugus asam amino bebas yang sedikit sehingga membutuhkan waktu yang lebih lama dalam pemanasan, sedangkan pada saat praktikum sendiri waktu yang dilakukan untuk pemanasan hanya 20 detik dan dirasa masih kurang lama agar sampel susu skim berubah warna menjadi ungu. Dan pada sampel gelatin negatif mengandung asam amino bebas. Sedangkan pada uji biuret, sampel yang menunjukkan hasil uji positif adalah susu skim dan gelatin. Susu skim dan gelatin tersebut dapat disimpulkan memiliki dua atau lebih ikatan peptida. Sedangkan pada sampel MSG dan aspartam negatif mengandung ikatan peptida. DAFTAR PUSTAKA Krishna, Gopala., Al-Batrani, Bayanmohsin., and Al-Kalbani, Fatma Saif. 2015. Qualitative Analysis and Quantitative Estimation of Some Physic-Chemical Parameters of Different Brands of Baby Milk Powder. International Journal of Analytical and Bioanalytical Chemistry. Vol 5(3): 58-60 Kristiani, E. B. E. 2010. Petunjuk Praktikum Kimia. Salatiga: UKSW Kumar, B., Sandeep, N., Najminara, S., and Rosemary. 2016. Extraction and Detection of Bovine Lung Surfactants and Their Antibacterial Role. The International Journal of Science and Technoledge. Vol 4 Issue 7 Poedjiadi, A. 2009. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia Press Wirahardikkusumah, Muhammat. 2008. Biokimia. Bandung: ITB DAFTAR PUSTAKA TAMBAHAN Anyango, Joseph E., dkk. 2011. Impact of Cowpea Addition on the Protein Digestibility Corrected Amino Acid Score and Other Protein Quality Parameters of Traditional African Foods Made from Non-Tannin and Tannin Sorghum. International Journal of Food Chemistry. Vol 124, Issue 3, Pages 775-780 Kartasapoetra, G., dkk. 2008. Ilmu Gizi. Jakarta: Rineka Cipta Patong, A.R., dkk. 2012. Biokimia Dasar. Makassar: Lembah Harapan Press LAMPIRAN Uji Ninhydrin Setelah pemanasan Sebelum pemanasan Uji Biuret Sesudah ditambah reagen Sebelum ditambah reagen Nama FARIDA KURNIASARI NIM 175100201111015 Kelas BE Kelompok BE 2