[go: up one dir, main page]

WO2025005470A1 - 카다베린 디카르복실산염 제조 공정 - Google Patents

카다베린 디카르복실산염 제조 공정 Download PDF

Info

Publication number
WO2025005470A1
WO2025005470A1 PCT/KR2024/006742 KR2024006742W WO2025005470A1 WO 2025005470 A1 WO2025005470 A1 WO 2025005470A1 KR 2024006742 W KR2024006742 W KR 2024006742W WO 2025005470 A1 WO2025005470 A1 WO 2025005470A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cadaverine
dicarboxylate
lysine
dicarboxylic acid
molar ratio
Prior art date
Application number
PCT/KR2024/006742
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
노승우
이수진
곽동훈
박정호
신지현
이강훈
이용찬
안성암
박상민
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이제일제당 (주) filed Critical 씨제이제일제당 (주)
Publication of WO2025005470A1 publication Critical patent/WO2025005470A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01018—Lysine decarboxylase (4.1.1.18)

Definitions

  • the present application relates to a technology for producing high purity cadaverine dicarboxylate (cadaverine sebacate, cadaverine undecanedioic acid salt, or cadaverine dodecanedioic acid salt) using a microbial fermentation and purification process.
  • cadaverine dicarboxylate cadaverine sebacate, cadaverine undecanedioic acid salt, or cadaverine dodecanedioic acid salt
  • Cadaverine is a toxic diamine compound that produces a foul odor when animal tissues decompose. Unlike hexanediamine, cadaverine exists in a liquid state at room temperature and absorbs carbon dioxide, an acidic gas in the air, more easily, causing many difficulties in transportation and storage. Therefore, salt formation crystallization not only obtains high-quality monomers, but is also easy to transport and store.
  • cadaverine sebacate, cadaverine undecanedioic acid salt, and cadaverine dodecanedioic acid salt are polymerization precursors of bio-polyamide, which is one of the engineering plastics widely used in automobiles, electrical and electronic parts, etc.
  • the process for preparing cadaverine dicarboxylate generally includes the following steps:
  • Cadaverine synthesis involves the fermentation of suitable microbial strains capable of producing lysine decarboxylase, an enzyme that catalyzes the decarboxylation of lysine to cadaverine.
  • Cadaverine Dicarboxylate involves the reaction between Cadaverine and a dicarboxylic acid in the presence of a suitable catalyst.
  • the reaction typically involves mixing the two monomers at a suitable temperature and stirring for a specified period of time to ensure complete reaction.
  • cadaverine dicarboxylate is purified using various separation and purification techniques such as solvent extraction, chromatography, and crystallization.
  • the dicarboxylate salt had to be removed before crystallization, and there were problems such as the cost burden due to the additional process for removing the dicarboxylate salt, the decrease in process efficiency, and the environmental pollution due to the use of chemical solvents.
  • the problem to be solved by the present application is to provide a method for producing cadaverine dicarboxylic acid salt (cadaverine sebacate salt, cadaverine undecanedioic acid salt, or cadaverine dodecanedioic acid salt).
  • One object of the present application is to provide a method for producing cadaverine dicarboxylate, comprising the first step of culturing an L-lysine producing microorganism in a medium to which dicarboxylic acid is added in the form of diammonium dicarboxylate to obtain lysine dicarboxylate, and the second step of converting the lysine dicarboxylate into cadaverine dicarboxylate.
  • a separate process for removing the dicarboxylate is not required, thereby simplifying the process, and at the same time, since crystals of the dicarboxylic acid are not precipitated together as a by-product, high-purity C10, C11 or C12 cadaverine dicarboxylate can be produced in a high yield.
  • Figure 1 is a flow chart showing a process for manufacturing cadaverine dicarboxylic acid salt according to the present application.
  • Figure 2 is a flow chart showing a process for manufacturing cadaverine dicarboxylic acid salt according to one embodiment of the present application.
  • One aspect of the present application provides a method for producing cadaverine dicarboxylate, comprising the first step of culturing an L-lysine producing microorganism in a medium to which dicarboxylic acid is added in the form of diammonium dicarboxylate to obtain lysine dicarboxylate, and the second step of converting the lysine dicarboxylate into cadaverine dicarboxylate.
  • dicarboxylic acid in this application means a dibasic acid containing two carboxyl groups, and is important as a metabolic intermediate in a living body.
  • the dicarboxylic acid may be an aliphatic dicarboxylic acid having 10, 11, or 12 carbon atoms. That is, the dicarboxylic acid in this application means an aliphatic dicarboxylic acid selected from sebacic acid, undecanedioic acid, and dodecanedioic acid. If the cadaverine dicarboxylic acid salt to be produced in the manufacturing method of the present application is cadaverine sebacate, it should be understood that all of the dicarboxylic acids added or introduced are sebacic acid.
  • the cadaverine dicarboxylic acid salt to be produced in the manufacturing method of the present application is cadaverine undecanedioic acid, it should be understood that all of the dicarboxylic acids added or introduced are undecanedioic acid.
  • the cadaverine dicarboxylic acid salt to be produced in the manufacturing method of the present application is cadaverine dodecanedioic acid, it should be understood that all of the dicarboxylic acids added or introduced are dodecanedioic acid.
  • the dicarboxylic acid in the present application refers to one type of aliphatic dicarboxylic acid, not a mixture of different types of dicarboxylic acids.
  • sebacic acid in this application refers to a dicarboxylic acid having 10 carbon atoms and having a chemical formula of C 10 H 18 O 4 , and generally exists as a white powdery solid.
  • the sebacic acid is also named sebacic acid, sebacic acid, etc., and is utilized as a precursor of various industrial products, including polymers and plasticizers.
  • undecanedioic acid in this application refers to a dicarboxylic acid having 11 carbon atoms and having a chemical formula of C 11 H 20 O 4 .
  • the undecanedioic acid is utilized as a precursor of various industrial products, including polymers and plasticizers.
  • dodecanedioic acid in this application is a carboxylic acid having 12 carbon atoms and having the chemical formula of C 12 H 22 O 4 .
  • the dodecanedioic acid is also named dodecanedioic acid.
  • CAD CAD
  • Cadaverine in this application refers to a foul-smelling toxic diamine compound, which is represented by the chemical formula NH 2 (CH 2 ) 5 NH 2 .
  • Cadaverine may also be named 1,5-pentanediamine or pentamethylenediamine. It should be understood that cadaverine in this application includes the cadaverine dicarboxylate salt form.
  • cadaverine dicarboxylate in the present application refers to a material manufactured by reacting a dicarboxylic acid component with cadaverine in the form of the diamine, and has high industrial utility as a precursor for manufacturing polyamide resins.
  • cadaverine dicarboxylate in the present application refers to one cadaverine dicarboxylate selected from cadaverine sebacate, cadaverine undecanedioic acid salt, and cadaverine dodecanedioic acid salt.
  • FIG. 1 and FIG. 2 are flowcharts showing a process for manufacturing cadaverine dicarboxylate according to one embodiment of the present application.
  • L-lysine producing microorganism includes both wild type microorganisms and microorganisms that have undergone genetic modification naturally or artificially, and may be a microorganism that includes genetic modification for the production of L-lysine, as well as a microorganism whose specific mechanism is weakened or strengthened due to causes such as insertion of an external gene or enhanced or inactivated activity of an endogenous gene.
  • the microorganism producing L-lysine of the present application may be, but is not limited to, a microorganism which naturally has L-lysine production ability, a microorganism in which L-lysine production ability is conferred on a microorganism which does not have L-lysine production ability, or a microorganism in which L-lysine production ability is enhanced in a microorganism with significantly low L-lysine production ability.
  • the microorganism producing L-lysine or the microorganism having L-lysine production ability in the present application may be a microorganism in which some of the genes in the L-lysine biosynthesis pathway are enhanced or weakened, or some of the genes in the L-lysine degradation pathway are enhanced or weakened.
  • "Enhanced” or “increased” L-lysine production ability means that the L-lysine production ability is improved compared to a parent strain or a non-modified microorganism.
  • the microorganism may be a microorganism of the genus Corynebacterium or a microorganism of the genus Escherichia.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium may include all microorganisms belonging to the genus Corynebacterium.
  • the microorganism of the genus Escheria may include any microorganism belonging to the genus Escheria.
  • Escherichia coli Escherichia albertii, Escherichia blattae, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii or Escherichia vulneris
  • the strain of the genus Escherichia may be, but is not limited to, Escherichia coli.
  • the cultivation of the above L-lysine producing microorganism can be carried out according to suitable media and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected microorganism. Specifically, the above culture can be batch, continuous and fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” means a material containing nutrients necessary for culturing the microorganism as a main component, and supplies nutrients and growth factors, including water essential for survival and growth.
  • the medium used for culturing the L-lysine-producing microorganism of the present application may be any medium used for culturing general microorganisms without particular limitation, except that it contains diammonium dicarboxylate as part or all of the nitrogen source.
  • the microorganism of the present application can be cultured under aerobic conditions while controlling temperature, pH, etc. in a general medium containing a nitrogen source including diammonium dicarboxylate, an appropriate carbon source, phosphorus, inorganic compounds, amino acids, and/or vitamins.
  • the first step of the method for producing cadaverine dicarboxylate of the present application is a step of culturing an L-lysine producing microorganism in a medium to which dicarboxylic acid is added in the form of diammonium dicarboxylate to obtain lysine dicarboxylate. This can be accomplished through a fermentation process of the lysine producing microorganism.
  • the dicarboxylic acid can be supplied to the medium in the form of diammonium dicarboxylate, and accordingly, it should be understood that the dicarboxylic acid in the present application includes a diammonium dicarboxylate form.
  • diammonium dicarboxylate in this application refers to a form in which two hydrogen atoms of a dicarboxylic acid are replaced with ammonium, and is used as a major nitrogen source of the medium.
  • the diammonium dicarboxylate can be prepared by gently mixing dicarboxylic acid with ammonia water to have a neutral pH, and then used in the form of crystals through concentration or in the form of a liquid, but is not limited thereto.
  • the manufacturing method of the present application can manufacture cadaverine dicarboxylate having high purity while simplifying the process by adding 81 mol% or more of the dicarboxylic acid supplied throughout the entire process to the medium in the form of diammonium dicarboxylate in the first step, and can reduce the side effect of the dicarboxylate being precipitated together with cadaverine dicarboxylate.
  • the diammonium dicarboxylate of the first step can be included in the medium at a high ratio, specifically 41 mol% or more, with respect to the dicarboxylic acid supplied in the entire process of the manufacturing method of the present application.
  • the diammonium dicarboxylate of the first step may be included in at least 43 mol%, at least 45 mol%, at least 53 mol%, at least 78 mol%, at least 80 mol%, at least 81 mol%, at least 82 mol%, at least 83 mol%, at least 84 mol%, at least 85 mol%, at least 86 mol%, at least 87 mol%, at least 88 mol%, at least 89 mol%, at least 90 mol%, at least 91 mol%, at least 92 mol%, at least 93 mol%, at least 94 mol%, at least 95 mol%, at least 96 mol%, at least 97 mol%, at least 98 mol%, at least 99 mol%, or at least 100 mol% of the dicarboxylic acid supplied in the overall process of the manufacturing method of the present application.
  • the manufacturing method of the present application can provide an advantage in that high-purity cadaverine dicarboxylate can be manufactured without performing a separate dicarboxylate removal step, such as ion resin exchange, decarboxylation process, or distillation process, unlike the conventional process of adding ammonium sulfate, etc., by including a large amount of diammonium dicarboxylate in the medium.
  • diammonium dicarboxylate it is possible to easily adjust the molar ratio of dicarboxylic acid added in the overall process/cadaverine in the process solution after the second step.
  • the diammonium dicarboxylate of the first step may be included in a molar ratio (diammonium dicarboxylate/lysine) with respect to the lysine to be produced of 0.7 to 1.11. More specifically, the diammonium dicarboxylate of the first step may be included in a molar ratio (diammonium dicarboxylate/lysine) with respect to the lysine to be produced of 0.74 to 1.06, 0.76 to 1.04, 0.78 to 1.02, or 0.80 to 1.00, or 0.82 to 0.98, and even more specifically 0.84 to 0.96.
  • the amount of lysine to be produced refers to the total amount including all forms of lysine dicarboxylate.
  • the diammonium dicarboxylate of the first step can be included in a molar ratio with lysine to be produced (diammonium dicarboxylate/lysine) in a range consisting of a lower limit selected from 0.7, 0.72, 0.74, 0.78, 0.79, 0.80, 0.82, 0.84, 0.87, 0.88, 0.89, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, and 0.96 and/or an upper limit selected from 1.11, 1.1, 1.08, 1.07, 1.06, 1.05, 1.04, 1.03, 1.02, 1.01, and 1.0.
  • the dicarboxylic acid and the dicarboxylic acid are sebacic acid and sebacic acid
  • the diammonium dicarboxylic acid of the first step may be included in a molar ratio (diammonium dicarboxylic acid/lysine) with respect to the lysine to be produced of 0.84-0.86.
  • the dicarboxylic acid and the dicarboxylic acid are undecanedioic acid and undecanedioic acid
  • the diammonium dicarboxylic acid of the first step may be included in a molar ratio with the lysine to be produced (diammonium dicarboxylic acid/lysine) of 0.84-0.90.
  • the dicarboxylic acid and the dicarboxylic acid are dodecanedioic acid and dodecanedioic acid
  • the diammonium dicarboxylic acid of the first step may be included in a molar ratio with the lysine to be produced (diammonium dicarboxylic acid/lysine) of 0.86-0.96.
  • the diammonium dicarboxylate of the first step can be included in an amount of 0.3 mol/L to 0.5 mol/L based on the L-lysine-producing microorganism fermentation broth. More specifically, the diammonium dicarboxylate of the first step can be included in an amount of 0.3 mol/L to 0.45 mol/L, 0.35 mol/L to 0.45 mol/L, 0.38 mol/L to 0.45 mol/L, or 0.38 mol/L to 0.4 mol/L based on the L-lysine-producing microorganism fermentation broth.
  • ammonium ions act as a nitrogen source during fermentation, and the dicarboxylic acid and lysine form a salt, which can be included in a dissolved state in the fermentation broth.
  • Lysine dicarboxylate can be produced through fermentation of L-lysine producing microorganisms in a medium containing diammonium dicarboxylate. Lysine dicarboxylate can be input into a subsequent process as a fermentation solution containing the cells, in the form of a fermentation solution with the cells removed, or after concentration or purification.
  • the concentration of lysine in the fermentation solution in which the first-stage lysine-producing microorganism of the present application is cultured is not limited, but may be 50 g/L to 200 g/L, 60 g/L to 150 g/L, 60 g/L to 140 g/L, or 61 g/L to 69 g/L based on the fermentation solution of the L-lysine-producing microorganism.
  • the carbon source of the above medium may include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, maltose, and their isomers; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, and citric acid; and amino acids such as glutamic acid, methionine, and lysine.
  • carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, maltose, and their isomers
  • sugar alcohols such as mannitol and sorbitol
  • organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, and citric acid
  • amino acids such as glutamic acid, methionine, and lysine.
  • natural organic nutrients such as starch hydrolysate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sugarcane residue, and corn steep liquor may be used, and specifically, carbohydrates such as glucose and sterilized pretreated molasses (i.e., molasses converted into reducing sugar
  • the carbon source that may be included in the culture medium of the present application may include glucose, maltose, or maltose isomers. More specifically, it may include at least one selected from glucose, maltose, and maltose isomers (isomaltose), or a combination of two or more, but is not limited thereto.
  • the personnel of the above badge may include potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, or their corresponding sodium-containing salts.
  • the inorganic compounds may include sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc.
  • the culture medium may contain metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins may be used.
  • suitable precursors may be used in the culture medium. The above-mentioned raw materials may be added to the culture in a suitable manner during the culturing process, for example, in a batchwise or continuous manner, but are not limited thereto.
  • the nitrogen source of the above medium may include diammonium dicarboxylate.
  • a typical medium for microbial culture may include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, ammonium nitrate, etc. as a nitrogen source; organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc., peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolysate, fish or its decomposition product, defatted soybean cake or its decomposition product, etc.
  • diammonium dicarboxylate may be included as the sole nitrogen source or as an additional nitrogen source.
  • a second step of converting the lysine dicarboxylate into cadaverine dicarboxylate can be performed.
  • the second step refers to the step of converting lysine dicarboxylate into the target product cadaverine dicarboxylate (cadaverine sebacate, cadaverine undecanedioic acid salt or cadaverine dodecanedioic acid salt).
  • the second step may further comprise adding a dicarboxylic acid to the process liquid.
  • the process liquid may be the fermentation process liquid obtained in the first step.
  • the dicarboxylic acid added in the second step may not be added or may be added in a trace amount of 0.57 mol/L or less, 0.53 mol/L or less, 0.48 mol/L or less, 0.4 mol/L or less, 0.18 mol/L or less, 0.15 mol/L or less, 0.12 mol/L or less, 0.1 mol/L or less, 0.08 mol/L or less, 0.06 mol/L or less, 0.05 mol/L or less, 0.04 mol/L or less, 0.03 mol/L or less, 0.02 mol/L or less, or 0.01 mol/L or less based on the volume of the fermentation process solution obtained in the first step.
  • the dicarboxylic acid added in the second step may be added in a trace amount of 0.01 mol/L or more and 0.06 mol/L or less, for example, 0.04 mol/L to 0.06 mol/L.
  • the dicarboxylic acid added in the second step may be added in a trace amount of 0.01 mol/L or more and 0.06 mol/L or less, for example, 0.02 mol/L to 0.04 mol/L.
  • the dicarboxylic acid added in the second step may be added in a trace amount of 0.02 mol/L or less, for example, 0.005 mol/L to 0.015 mol/L.
  • the dicarboxylic acid may be added before, after, or simultaneously with the conversion reaction, but is not limited thereto.
  • dicarboxylic acid is additionally added in the second step, it is understood that the amount of dicarboxylic acid added throughout the process of the manufacturing method of the present application is the sum of the amount of diammonium dicarboxylate added to the medium in the first step and the amount of dicarboxylic acid added in the second step.
  • dicarboxylic acid is not additionally added to the process solution in the second step, it is understood that the amount of dicarboxylic acid added throughout the process of the manufacturing method of the present application is the same as the amount of diammonium dicarboxylate added to the medium in the first step.
  • the amount of dicarboxylic acid added in the present application's manufacturing method may be added in consideration of the amount of cadaverine in the process liquid to be obtained after the second step.
  • the amount of dicarboxylic acid added in the present application's manufacturing method may be a molar ratio of 0.85 to 1.12 relative to the amount of cadaverine in the process liquid after the second step.
  • the amount of dicarboxylic acid added in the present application manufacturing method may be a molar ratio of 0.86 to 1.11, 0.87 to 1.10, 0.88 to 1.08, 0.89 to 1.06, 0.90 to 1.05, 0.91 to 1.04, 0.92 to 1.03, 0.93 to 1.02, 0.94 to 1.01, or 0.95 to 1.0 relative to the amount of cadaverine in the process solution after the second step.
  • the amount of dicarboxylic acid added in the present application manufacturing method can be included in a molar ratio in a range comprised of a lower limit selected from 0.83, 0.84, 0.85, 0.86, 0.87, 0.88, 0.89, 0.9, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95 and 0.96 and/or an upper limit selected from 1.10, 1.09, 1.08, 1.07, 1.06, 1.05, 1.04, 1.03, 1.02, 1.01 and 1.0 relative to the amount of cadaverine in the process solution after the second step.
  • the amount of the dicarboxylic acid added in the manufacturing method of the present application may be a molar ratio of 0.9 to 1.10, 0.91 to 1.09, 0.92 to 1.08, 0.93 to 1.06, 0.94 to 1.02, 0.95 to 1.01, or 0.96 to 1.00 relative to the amount of cadaverine in the process solution after the second step.
  • One technical significance of the present invention lies in the fact that when sebacic acid is added in a molar ratio within the above range in comparison with the amount of cadaverine calculated to be obtained after the second step in the manufacturing method of the present application, sebacic acid does not precipitate into crystals together with cadaverine sebacate, thereby enabling the production of high-purity and high-yield cadaverine sebacate.
  • cadaverine sebacate can be obtained at a total yield of 40% or higher, 42% or higher, 53% or higher, 56% or higher, 64% or higher, 66% or higher, 72% or higher, 73% or higher, or 74% or higher.
  • the amount of the dicarboxylic acid added in the manufacturing method of the present application may be a molar ratio of 0.9 to 1.10, 0.91 to 1.09, 0.92 to 1.08, 0.93 to 1.06, 0.94 to 1.02, or 0.95 to 1.00 relative to the amount of cadaverine in the process solution after the second step.
  • One technical significance of the present invention lies in the fact that when undecanedioic acid is added in a molar ratio within the above range in comparison with the amount of cadaverine calculated to be obtained after the second step in the manufacturing method of the present application, undecanedioic acid does not precipitate into crystals together with cadaverine undecanedioic acid salt, thereby enabling the production of cadaverine undecanedioic acid salt with high purity and high yield.
  • cadaverine undecanedioic acid salt can be obtained in a total yield of 46% or higher, 48% or higher, 55% or higher, 56% or higher, 61% or higher, 63% or higher, 66% or higher, 68% or higher, 70% or higher, 72% or higher, or 73% or higher.
  • the amount of dodecanedioic acid added in the manufacturing method of the present application may be a molar ratio of 0.9 to 1.10, 0.91 to 1.09, 0.92 to 1.08, 0.93 to 1.06, 0.94 to 1.02, or 0.95 to 1.00 relative to the amount of cadaverine in the process solution after the second step.
  • One technical significance of the present invention lies in the fact that when dodecanedioic acid is added in a molar ratio within the above range in comparison with the amount of cadaverine calculated to be obtained after the second step in the manufacturing method of the present application, dodecanedioic acid does not precipitate into crystals together with cadaverine dodecanedioic acid salt, thereby enabling the production of high-purity and high-yield cadaverine dodecanedioic acid salt.
  • cadaverine sebacate salt can be obtained at a total yield of 40% or higher, 42% or higher, 53% or higher, 56% or higher, 64% or higher, 66% or higher, 72% or higher, 73% or higher, or 74% or higher.
  • the conversion reaction of the lysine dicarboxylate into cadaverine dicarboxylate may be an enzymatic conversion reaction.
  • the lysine dicarboxylate may include both the lysine dicarboxylate obtained in the first step and the lysine dicarboxylate produced in the second step when a dicarboxylic acid is additionally added in the second step.
  • the enzymatic conversion reaction of the second step can be performed using a protein having lysine decarboxylase activity or a microorganism expressing a protein having the activity.
  • a protein having lysine decarboxylase activity may be added to the fermentation process solution of the first stage, or a starter culture solution of a microorganism expressing a protein having the activity may be added, but is not limited thereto.
  • decarboxylase in this application refers to an enzyme that catalyzes the production of carbonic acid by removing a carboxyl group, which is an organic acid, and may also be named decarboxylase, decarboxylase, decarboxylase, decarboxylase, or carbonic acid decarboxylase.
  • the above protein is not particularly limited as long as it exhibits lysine decarboxylase activity, and may be, for example, PtLDC protein from Pseudomonas thermotolerans or CadA protein derived from Escherichia coli.
  • the protein sequence may be obtained using GenBank, a known database, or expressed using the above microorganism, or a commercially available enzyme may be purchased and used, and is not limited thereto.
  • the microorganism expressing the above protein may be a microorganism transformed to express the protein.
  • the transformed microorganism is not limited to a prokaryotic microorganism or a eukaryotic microorganism, as long as it is transformed to express a protein having decarboxylase activity.
  • the microorganism transformed to express the protein having the decarboxylase activity can convert lysine dicarboxylate in the process solution into cadaverine dicarboxylate by secreting the protein having the enzyme activity into the starter culture solution.
  • microorganism may specifically be a microorganism belonging to the genus Escherichia or the genus Corynebacterium, and more specifically, may be, but is not limited to, Escherichia coli or Corynebacterium glutamicum.
  • the conversion reaction of the second step may be performed for 20 minutes to 3 hours, more specifically for 0.5 to 1.5 hours, and for example, for 1 hour, but is not limited thereto.
  • the conversion reaction of the second step can be performed at 30 to 60°C, more specifically at 40 to 55°C, and for example at 45 to 50°C, but is not limited thereto.
  • the conversion reaction of the second step may be performed at a pH of 7.5 to 9, more specifically at 7.8 to 8.7, and even more specifically at 8 to 8.5.
  • the pH may be adjusted to the above range by optionally additionally adding a dicarboxylic acid, and in another embodiment, the pH may be adjusted to the above range by adding CO 2.
  • the pH range of the second step conversion reaction is adjusted to the above range, the conversion rate of lysine dicarboxylate to cadaverine dicarboxylate may be significantly increased.
  • the method for producing cadaverine dicarboxylate of the present application may further include a recovery step of recovering the obtained cadaverine dicarboxylate after performing the second step.
  • the above recovery may be by collecting cadaverine dicarboxylate using a suitable method known in the art.
  • cadaverine dicarboxylate can be collected by various chromatography methods such as centrifugation, filtration, concentration, crystallization, extraction, sonication, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, HPLC, or a combination of these methods.
  • the recovery step may include one or more of a filtration step, a concentration step, and a crystallization step.
  • the above filtration step refers to a step of removing impurities from the conversion solution containing cadaverine dicarboxylate obtained in the second step.
  • the filtration may include removing cells in the cadaverine dicarboxylate process solution by performing membrane separation, etc., or performing activated carbon filtration, etc.
  • the above concentration step refers to a step of concentrating so that the solid content ratio in the conversion solution is increased, and may be performed after the filtration step.
  • the concentration may be a pressure reduction concentration using a rotary evaporator.
  • the concentration step may be to concentrate so that the solid content becomes 45-70% (w/w), and more specifically to concentrate so that it becomes 46-68% (w/w), 48-67% (w/w), 45-65% (w/w), 50-70% (w/w). For example, it may be to concentrate so that it becomes 45-55% (w/w). For example, it may be to concentrate so that it becomes 60-70% (w/w).
  • the above concentration step may be performed at a temperature of 45 to 80°C, for example, but is not limited to, 55 to 70°C.
  • the above crystallization step may be a cooling crystallization step, which means a step of cooling the conversion solution and precipitating it into crystals to obtain the final target product, cadaverine dicarboxylate crystals.
  • the cooling may be cooling the conversion solution to 30°C or lower, and more specifically, cooling to 27°C or lower, 25°C or lower, 23°C or lower, 20°C or lower, for example, 10°C, but is not limited thereto.
  • the cooling rate may be 0.1-20°C/hour, more specifically 0.5-1.5°C/hour, and for example, 1°C/hour, but is not limited thereto.
  • the recovery step may further include a stirring step for stirring the process solution.
  • the stirring step may be performed simultaneously with the cooling crystallization step, during the cooling crystallization step, before the cooling crystallization step, or after the cooling crystallization step. Through this stirring step, the process solution may be sufficiently stirred to facilitate crystal precipitation.
  • the recovery step may further include a mother liquor circulation step of recycling the mother liquor containing non-crystallized cadaverine dicarboxylate after the crystallization step to the feed liquor of the concentration step.
  • the number of times the mother liquor is cycled may be 0 to 3 times, 1 to 3 times, 1 to 4 times, 1 to 5 times, 1 to 10 times, or more.
  • the number of times the mother liquor is cycled being 0 means that the mother liquor circulation step is not performed.
  • the total yield of cadaverine dicarboxylate can be increased by recycling the remaining mother liquor of cadaverine dicarboxylate as a feed liquid of a concentration step 1 to 3 times, 1 to 4 times, 1 to 5 times, 1 to 10 times or more.
  • the recovery step may further include the steps of washing, separating and drying the crystallized process solution.
  • a high-purity cadaverine dicarboxylate can be commercialized.
  • the cadaverine dicarboxylate crystal can be provided in powder form, but the formulation can be changed as needed.
  • the recovery step may further include a decolorization step.
  • the decolorization may be performed using, but is not limited to, activated carbon, anion resin, or the like.
  • the method for producing cadaverine dicarboxylate of the present application may include an additional purification step.
  • the purification may be performed using a suitable method known in the art.
  • the recovery process and the purification process may be performed continuously or discontinuously regardless of the order, or may be performed simultaneously or integrated into one step, but are not limited thereto.
  • the manufacturing method of the present application may be characterized in that it does not include a separate process for removing the dicarboxylate in the recovery step.
  • the dicarboxylate precipitates as crystals together during the crystallization process, thereby lowering the purity. To prevent this, a separate process for removing the dicarboxylate before crystallization was required.
  • the manufacturing method of the present application provides a technical advantage of being able to manufacture high-purity cadaverine dicarboxylate without performing a separate dicarboxylate removal process.
  • the method of the present application may be characterized in that it can obtain cadaverine sebacate having a purity of 99% or higher in the 0th to 4th circulation of the mother liquor.
  • the accumulated total yield of cadaverine sebacate may be 70% or higher based on 4 circulations of the mother liquor, and more specifically, may be more than 70%, 71% or higher, 72% or higher, 73% or higher, or 74% or higher.
  • the method of the present application may be characterized in that cadaverine undecanedioic acid salt having a purity of 99% or higher can be obtained in 0 to 5 cycles of the mother liquor.
  • the accumulated total yield of cadaverine undecanedioic acid salt may be greater than 68%, for example, greater than 70%, and the purity may be greater than 99%, based on 5 cycles of the mother liquor.
  • the method of the present application may be characterized in that cadaverine dodecanedioic acid salt having a purity of 98% or higher can be obtained in the 0th to 4th circulation of the mother liquor.
  • the method may be characterized in that cadaverine dodecanedioic acid salt having a purity of 99% or higher can be obtained in the 2nd to 4th circulation of the mother liquor.
  • the accumulated total yield of cadaverine dodecanedioic acid may be 70% or higher, and more specifically, may be more than 70%, 71% or higher, or 72% or higher, based on the 4th circulation of the mother liquor.
  • the method of the present application may be characterized in that it can obtain cadaverine dicarboxylate having a purity of 98% or higher and a total yield of 22% or higher in the 0th to 4th circulation of the mother liquor.
  • the method of the present application enables production of high-purity cadaverine dicarboxylate without the decarboxylation and distillation processes required in the conventional liquid cadaverine production.
  • cadaverine dicarboxylic acid salt (cadaverine sebacate, cadaverine undecanedioic acid salt or cadaverine dodecanedioic acid salt) according to one embodiment of the present application has been examined.
  • the advantageous effects mentioned in the present application will be examined through experimental results of examples and comparative examples of cadaverine sebacate, cadaverine undecanedioic acid salt or cadaverine dodecanedioic acid salt, respectively.
  • Corynebacterium glutamicum strain (KCCM12154P, Publication No. US 2021-0355514 A1) having lysine production ability was secured through solid-phase culture and flask culture, and the main production fermentation was performed after seed culture in a fermentation tank. Fermentation was performed through fermentation tank culture at 900 rpm for 63 hours at 36°C.
  • ammonium sebacate as a substitute for the existing ammonium sulfate was supplied at a level of 92 to 94 g/L for each example, and the concentration of the carbon source included in the culture medium was lowered to 1.2 mol to maintain the carbon source/nitrogen source balance.
  • lysine sebacate was obtained at a level of 136 to 139 g/L and lysine was obtained at a level of 68 g/L.
  • the sebacic acid/lysine molar ratio in the fermentation process solution in the examples was adjusted to a level of 0.83 to 0.85.
  • E. coli (US Patent Publication No. US 2018-0030430 A1) overexpressing the PtLDC enzyme, a lysine decarboxylase gene derived from Pseudomonas thermotolerans, using the pET-Deut1 vector was used.
  • the enzyme conversion solution in which the enzyme strain was cultured in the fermentation process solution of lysine sebacate prepared from the above Manufacturing Example 1-1, was supplied at a mass percentage of 10% to the process solution to perform the conversion reaction.
  • the conversion reaction temperature was maintained at 45 to 50°C, and the pH was adjusted to 8.0 to 8.5.
  • CO2 was added for neutralization in Examples 1-1 to 1-4.
  • sebacic acid was additionally added at a level of 0.01 to 0.06 mol/L (based on the volume of the fermentation process solution of lysine sebacate) before the conversion reaction.
  • the conversion rate of cadaverine sebacate was at the level of 97 to 98%.
  • cadaverine sebacate was obtained at a level of 119 to 140 g/L (based on the volume of the fermentation process liquid of lysine sebacate), and cadaverine was obtained at a level of 47 g/L (based on the volume of the fermentation process liquid of lysine sebacate).
  • sebacic acid was additionally added at a level of 0.02 to 0.05 mol/L (based on the volume of the fermentation process liquid of lysine sebacate).
  • the cells in the cadaverine sebacate process solution were removed by performing membrane filtration with a size of 0.1 ⁇ m.
  • activated carbon at a level of 10% based on the weight of cadaverine sebacate in the filtrate from which the cells were separated. Heat the process solution with added activated carbon to 60°C and stir for 1 hour to decolorize, and then filter the activated carbon through a filter paper.
  • the filtered liquid above was concentrated under reduced pressure at about 55 to 70°C and 120 Torr in a rotary evaporator until the solid content of the filtrate became 50% by weight.
  • the above concentrate was cooled from 50°C to 25°C at a rate of 1°C/hr.
  • the precipitated crystals were separated from the mother liquor using a centrifuge.
  • the crystals were washed with 10% water based on the weight of cadaverine sebacate.
  • the separated crystals were dried for one day, and then the purity was measured by HPLC.
  • the mother liquor separated above was recycled to the step of concentrating the cadaverine sebacate process solution from which impurities were removed.
  • Example 1-1 When the molar ratio of added sebacic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 0.85
  • a cadaverine sebacate conversion solution having a sebacate/cadaverine molar ratio of 0.85 1,000 ml of a cadaverine sebacate conversion solution having a sebacate/cadaverine molar ratio of 0.85 was supplied and passed through a 0.1 ⁇ m sized membrane to remove microorganisms.
  • the cadaverine sebacate conversion solution having a sebacate/cadaverine molar ratio of 0.85 was manufactured by following the manufacturing methods of Manufacturing Examples 1-1 and 1-2, except that in Manufacturing Example 1-1, the amount of sebacate added among the ammonium sebacate added in the fermentation process for producing lysine and the amount of sebacate added in Manufacturing Example 1-2, the cadaverine sebacate conversion reaction, were controlled so that the sum of the moles of cadaverine converted could be 0.85.
  • the filtrate was decolorized using activated carbon, filtered through a filter paper, and concentrated under reduced pressure to a solid content of 50% by weight.
  • the concentrate was cooled from 50°C to 25°C and crystallized.
  • the crystals and mother liquor were separated by centrifugation, and the separated crystals were dried for one day and their purity was measured by HPLC.
  • the mother liquor containing residual sebacate was recycled to the cadaverine sebacate feed solution having a sebacate/cadaverine molar ratio of 0.85, and then subjected to the crystallization step again. The recycling of the mother liquor was performed sequentially.
  • Example 1-2 When the molar ratio of added sebacic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 0.89
  • a cadaverine sebacate conversion solution having a sebacate/cadaverine molar ratio of 0.89 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 1-1.
  • Example 1-3 When the molar ratio of added sebacic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 0.96
  • a cadaverine sebacate conversion solution having a sebacate/cadaverine molar ratio of 0.96 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 1-1.
  • Example 1-4 When the molar ratio of added sebacic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 1.0
  • a cadaverine sebacate conversion solution having a sebacate/cadaverine molar ratio of 1.0 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 1-1.
  • Example 1-5 When the molar ratio of added sebacic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 1.04
  • a cadaverine sebacate conversion solution having a sebacate/cadaverine molar ratio of 1.04 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 1.
  • Example 1-6 When the molar ratio of added sebacic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 1.11
  • a cadaverine sebacate conversion solution having a sebacate/cadaverine molar ratio of 1.11 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 1-1.
  • Table 1 shows the process solutions that did not circulate the mother liquor.
  • Example 1-1 Example 1-2
  • Example 1-3 Example 1-4
  • Example 1-5 Example 1-6 Sebasic acid/cadaverine mole ratio 0.85 0.89 0.96 1 1.04 1.11 Crystallization supply New supply, ml 1000 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g 166 166 166 166 Amount of cadaverine in the generated crystals, g Decision not made 35 37 40 35 31 Amount of cadaverine in mother liquor, g - 131 129 127 131 135 result Purity, % - 98 99 99 99 86 73 transference number, % - 21 22 24 21 19 Total yield, % - 21 22 24 21 19
  • Table 2 shows the process solution for which the mother liquor has been circulated once.
  • Example 1-1 Example 1-2
  • Example 1-3 Example 1-4
  • Example 1-5 Example 1-6 Sebasic acid/cadaverine mole ratio 0.85 0.89 0.96 1 1.04 1.11 Crystallization supply New supply, ml - 1000 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g - 297 295 293 297 301 Cadaverine, g in the generated crystals - 62 66 70 63 56 Cadaverine in the mother liquor, g - 235 229 223 234 245 result Purity, % - 98 98 99 88 78 transference number, % - 21 22 24 21 19 Total yield, % - 38 40 42 38 34
  • Table 3 shows the process solution for which the mother liquor has been circulated twice.
  • Example 1-1 Example 1-2
  • Example 1-3 Example 1-4
  • Example 1-5 Example 1-6 Sebasic acid/cadaverine mole ratio 0.85 0.89 0.96 1 1.04 1.11 Crystallization supply New supply, ml - 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g - 401 395 389 400 411 Amount of cadaverine in the generated crystals, g - 84 89 93 85 77 Amount of cadaverine in mother liquor, g - 317 306 297 315 334 result Purity, % - 98 99 99 90 81 transference number, % - 21 22 24 21 19 Total yield, % - 51 53 56 51 46
  • Table 4 shows the process solution for which the mother liquor has been circulated three times.
  • Example 1-1 Example 1-2
  • Example 1-3 Example 1-4
  • Example 1-5 Example 1-6 Sebasic acid/cadaverine mole ratio 0.85 0.89 0.96 1 1.04 1.11 Crystallization supply New supply, ml - 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g - 483 472 463 481 500 Amount of cadaverine in the generated crystals, g - 101 106 110 102 94 Amount of cadaverine in mother liquor, g - 382 366 353 379 406 result Purity, % - 98 99 99 99 91 84 transference number, % - 21 22 24 21 19 Total yield, % - 61 64 66 62 56
  • Table 5 shows the process solution for which the mother liquor has been circulated four times.
  • Example 1-1 Example 1-2
  • Example 1-3 Example 1-4
  • Example 1-5 Example 1-6 Sebasic acid/cadaverine mole ratio 0.85 0.89 0.96 1 1.04 1.11 Crystallization supply New supply, ml - 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g - 548 532 519 545 572 Amount of cadaverine in the generated crystals, g - Decision not made 120 123 116 107 Amount of cadaverine in mother liquor, g - - 413 395 429 465 result Purity, % - - 99 99 92 85 transference number, % - - 22 24 21 19 Total yield, % - - 72 74 70 65
  • Example 1-1 even when the crystallization process was performed, no crystals were precipitated. This is because the molar ratio of sebacate was low, and thus not sufficient for crystals of cadaverine sebacate to precipitate.
  • Example 1-2 crystals were precipitated up to the third cycle of mother liquor circulation, but no crystals were formed in the fourth cycle. This is because the sequentially circulated mother liquor lowered the molar ratio of sebacate to the crystallization feed solution, and thus the concentration of sebacate was not sufficient to precipitate crystals of cadaverine sebacate.
  • Example 1-5 the purity of the crystal was somewhat low at 86% when the mother liquor was not circulated, but the purity increased to 92% when the mother liquor was circulated four times.
  • Example 1-6 the purity of the crystal was low at 73% when the mother liquor was not circulated, but the purity increased to 81% when the mother liquor was circulated four times.
  • Example 1-3 was able to obtain 99% high-purity cadaverine sebacate up to the fourth cycle of mother liquor circulation, and achieve a high total yield of approximately 72%.
  • Example 1-4 was able to obtain cadaverine sebacate having a purity of 99% up to the fourth cycle of mother liquor circulation, and achieve a high total yield of approximately 74%.
  • a method for producing high-purity cadaverine sebacate can be provided depending on the molar ratio of sebacic acid and cadaverine in the conversion solution (process solution) supplied after the cadaverine conversion process.
  • the amount of added sebacic acid was adjusted to a molar ratio of about 0.84 to 0.86 with respect to the amount of cadaverine in the process solution after the second step, an excellent total yield of 53% or more can be exhibited while maintaining a purity of 99% of cadaverine sebacate even after two or more rounds of mother liquor circulation.
  • Corynebacterium glutamicum strain (KCCM12154P, US Patent Publication No. US 2021-0355514 A1) having lysine production ability was secured through solid-phase culture and flask culture, and the seed culture was performed in a fermentation tank after the seed culture. Fermentation was performed through fermentation tank culture at 900 rpm for 30 hours at 36°C.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of producing lysine undecanedioic acid salt through microbial fermentation using ammonium undecanedioic acid salt according to the manufacturing example described above.
  • ammonium undecanedioic acid salt as a substitute for the existing ammonium sulfate was supplied at a level of 88 to 100 g/L for each example, and the concentration of the carbon source included in the culture medium was lowered to 1.2 mol to maintain the carbon source/nitrogen source balance.
  • lysine undecanedioic acid salt was obtained at a level of 127 to 145 g/L and lysine was obtained at a level of 66 g/L.
  • the molar ratio of undecanedioic acid/lysine in the fermentation process solution in the examples was adjusted to a level of 0.78 to 0.89.
  • E. coli (US Patent Publication No. US 2018-0030430 A1) overexpressing the PtLDC enzyme, a lysine decarboxylase gene derived from Pseudomonas thermotolerans, using the pET-Deut1 vector was used.
  • the enzyme conversion solution in which the seed culture was performed with the enzyme strain described above, was supplied to the fermentation process solution of lysine undecanedioic acid salt produced from the above Manufacturing Example 2-1 at a mass percentage of 10% to the process solution to perform the conversion reaction.
  • the conversion reaction temperature was maintained at 45 to 50°C, and the pH was adjusted to 8.0 to 8.5.
  • CO2 was added for neutralization in Examples 2-1 to 2-4.
  • undecanedioic acid was additionally added at a level of 0.02 to 0.04 mol/L (based on the volume of the fermentation process solution of lysine undecanedioic acid salt) before the conversion reaction.
  • cadaverine undecanedioic acid salt was at the level of 97 to 98%.
  • cadaverine undecanedioic acid was obtained at a level of 111 to 140 g/L (based on the volume of the fermentation process solution of lysine undecanedioic acid), and cadaverine was obtained at a level of 45 g/L (based on the volume of the fermentation process solution of lysine undecanedioic acid).
  • undecanedioic acid was additionally added at a level of 0.06 to 0.08 mol/L to prepare a process solution.
  • the cells in the cadaverine undecanedioic acid salt process solution were removed by performing membrane filtration with a size of 0.1 ⁇ m.
  • activated carbon at a level of 10% based on the weight of cadaverine undecanedioic acid salt in the filtrate from which the cells were separated. Heat the process solution with activated carbon added to 60°C and stir for 1 hour to decolorize, and then filter the activated carbon through a filter paper.
  • the filtered liquid above was concentrated under reduced pressure at about 55 to 70°C and 120 Torr in a rotary evaporator until the solid content of the filtrate became 65% by weight.
  • the above concentrate was cooled from 50°C to 10°C at a rate of 1°C/hr.
  • the precipitated crystals were separated from the mother liquor using a centrifuge.
  • the crystals were washed with 10% water based on the weight of cadaverine undecanedioic acid salt.
  • the separated crystals were dried for one day, and then the purity was measured by HPLC.
  • the mother liquor separated above was recycled to the step of concentrating the cadaverine undecanedioic acid salt process solution from which impurities were removed.
  • Experimental Example 2-1 the method according to Manufacturing Examples 2-1 to 2-3 was used to confirm how the purity and yield of cadaverine undecanedioic acid salt change depending on the molar ratio of undecanedioic acid salt and cadaverine in the cadaverine undecanedioic acid salt conversion solution.
  • Example 2-1 When the molar ratio of added undecanedioic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 0.79
  • 1,000 ml of a cadaverine undecanedioic acid conversion solution having an undecanedioic acid/cadaverine molar ratio of 0.79 was supplied and passed through a 0.1 ⁇ m sized membrane to remove microorganisms.
  • the cadaverine undecanedioic acid conversion solution having an undecanedioic acid/cadaverine molar ratio of 0.79 was manufactured by following the manufacturing methods of Manufacturing Examples 2-1 and 2-2, except that the sum of the amount of undecanedioic acid among the ammonium undecanedioic acid added in the fermentation process for producing lysine in Manufacturing Example 2-1 and the amount of undecanedioic acid added in the cadaverine undecanedioic acid conversion reaction in Manufacturing Example 2-2 was controlled to be 0.79 of the mole number of cadaverine that was converted.
  • the filtrate was decolorized using activated carbon, filtered through a filter paper, and concentrated under reduced pressure to a solid content of 65%.
  • the concentrate was cooled from 50°C to 10°C and crystallized.
  • the crystals and mother liquor were separated by centrifugation, and the separated crystals were dried for one day and their purity was measured by HPLC.
  • the mother liquor containing residual undecanedioic acid was recycled to the cadaverine undecanedioic acid feed solution having a molar ratio of undecanedioic acid/cadaverine of 0.79, and then subjected to the crystallization step again.
  • the recycling of the mother liquor was performed sequentially.
  • Example 2-2 When the molar ratio of added undecanedioic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 0.91
  • a cadaverine undecanedioic acid conversion solution having an undecanedioic acid/cadaverine molar ratio of 0.91 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 2-1.
  • Example 2-3 When the molar ratio of added undecanedioic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 0.95
  • a cadaverine undecanedioic acid conversion solution having an undecanedioic acid/cadaverine molar ratio of 0.95 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 2-1.
  • Example 2-4 When the molar ratio of added undecanedioic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 1.0
  • a cadaverine undecanedioic acid conversion solution having an undecanedioic acid/cadaverine molar ratio of 1.0 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 2-1.
  • Example 2-5 When the molar ratio of added undecanedioic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 1.04
  • a cadaverine undecanedioic acid conversion solution having an undecanedioic acid/cadaverine molar ratio of 1.04 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 2-1.
  • Example 2-6 When the molar ratio of added undecanedioic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 1.09
  • a cadaverine undecanedioic acid conversion solution having an undecanedioic acid/cadaverine molar ratio of 1.09 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 2-1.
  • Table 6 is for the process solution that did not circulate the mother liquor.
  • Example 2-6 Undecanedioic acid/cadaverine molar ratio 0.79 0.91 0.95 1.0 1.04 1.09 Crystallization supply New supply, ml 1000 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g 113 113 113 113 Amount of decision produced, g 109 119 124 127 132 136 Amount of cadaverine in mother liquor, g 78 75 73 72 75 77 result Purity, % 99 99 99 99 99 91 82 transference number, % 31 34 35 36 34 32 Total yield, % 31 34 35 36 34 32 34 32
  • Table 7 shows the process solution that has been circulated once.
  • Example 2-6 Undecanedioic acid/cadaverine molar ratio 0.79 0.91 0.95 1.0 1.04 1.09 Crystallization supply New supply, ml 1000 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g 191 188 187 185 188 190 Amount of decision produced, g 178 195 203 209 227 245 Amount of cadaverine in mother liquor, g 134 125 122 118 119 119 result Purity, % 99 100 99 99 99 93 87 transference number, % 30 33 35 36 37 37 Total yield, % 41 45 46 48 47 47 47
  • Table 8 shows the process solution that was circulated twice.
  • Example 2 2 rounds of mother circulation
  • Example 2-1 Example 2-2
  • Example 2-3 Example 2-3
  • Example 2-4 Example 2-5
  • Example 2-6 Undecanedioic acid/cadaverine molar ratio 0.79 0.91 0.95 1.0 1.04 1.09 Crystallization supply New supply, ml 1000 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g 247 239 235 232 232 233 Amount of decision produced, g 219 243 253 261 277 293 Amount of cadaverine in mother liquor, g 177 160 154 148 147 146 result Purity, % 99 99 99 99 94 89 transference number, % 28 33 35 36 37 37 Total yield, % 48 53 55 56 57 57
  • Table 9 shows the process solution for which the mother liquor has been circulated three times.
  • Example 2-6 Undecanedioic acid/cadaverine molar ratio 0.79 0.91 0.95 1.0 1.04 1.09 Crystallization supply New supply, ml 1000 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g 290 274 267 261 260 259 Amount of decision produced, g 243 274 385 294 309 323 Amount of cadaverine in mother liquor, g 212 186 176 167 165 163 result Purity, % 99 99 100 100 95 90 transference number, % 27 323 34 36 37 37 Total yield, % 53 59 61 63 64 64
  • Table 10 shows the process solution that was circulated four times.
  • Example 2-1 Example 2-2
  • Example 2-3 Example 2-4
  • Example 2-5 Example 2-6 Undecanedioic acid/cadaverine molar ratio 0.79 0.91 0.95 1.0 1.04 1.09 Crystallization supply New supply, ml 1000 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g 326 299 289 280 278 277 Amount of decision produced, g 256 292 305 315 329 343 Amount of cadaverine in mother liquor, g 243 205 19 179 177 174 result Purity, % 99 99 99 100 95 91 transference number, % 25 31 34 36 37 37 Total yield, % 57 64 66 68 69 69
  • Table 11 shows the process solution that was circulated five times.
  • Example 2-6 Undecanedioic acid/cadaverine molar ratio 0.79 0.91 0.95 1.0 1.04 1.09 Crystallization supply New supply, ml 1000 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g 357 318 304 292 290 288 Amount of decision produced, g 262 304 318 329 342 355 Amount of cadaverine in mother liquor, g 273 221 202 186 184 181 result Purity, % 99 100 99 100 96 92 transference number, % 24 31 34 36 37 37 Total yield, % 60 68 70 73 73 73 73
  • Example 2-1 99% high purity cadaverine undecanedioic acid salt was obtained, but a low yield of 62% was achieved up to the fifth cycle of mother liquor circulation. This is because the molar ratio of undecanedioic acid salt was low, so that the crystals of cadaverine undecanedioic acid salt were not sufficiently precipitated.
  • Example 2-2 obtained cadaverine undecanedioic acid salt with a high purity of 99% through mother liquor circulation, but achieved a low yield of 67% in total yield up to the fifth mother liquor circulation. This is because the molar ratio of undecanedioic acid salt was low, so that the crystals of cadaverine undecanedioic acid salt were not sufficiently precipitated.
  • Example 2-5 the purity of the crystal was somewhat low at 91% when the mother liquor was not circulated, but the purity increased to 96% when the mother liquor was circulated 5 times.
  • Example 2-6 the purity of the crystal was low at 82% when the mother liquor was not circulated, but the purity increased to 92% when the mother liquor was circulated 5 times.
  • Example 2-3 obtained cadaverine undecanedioic acid salt with a purity of 99% up to the fifth cycle of mother liquor circulation, and also achieved a high yield of approximately 70% in total yield.
  • Example 2-4 obtained cadaverine undecanedioic acid salt with a purity of 99% up to the fifth cycle of mother liquor circulation, and also achieved a high yield of approximately 73% in total yield.
  • the purity of the manufactured cadaverine undecanedioic acid salt can vary depending on the molar ratio of undecanedioic acid and cadaverine in the conversion solution (process solution) supplied after the cadaverine conversion process.
  • the amount of added undecanedioic acid was adjusted to a molar ratio of about 0.95 to 1.00 with respect to the amount of cadaverine in the process solution after the second step, it was possible to maintain a purity of 99% of cadaverine undecanedioic acid salt even after two or more rounds of mother liquor circulation while exhibiting an excellent total yield of 55% or more.
  • Corynebacterium glutamicum strain (KCCM12154P, US Patent Publication No. US 2021-0355514 A1) having lysine production ability was secured through solid-phase culture and flask culture, and the seed culture was performed in a fermentation tank after the seed culture. Fermentation was performed through fermentation tank culture at 900 rpm for 30 hours at 36°C.
  • ammonium dodecanedioic acid was supplied as a substitute for the existing ammonium sulfate at a level of 93-106 g/L for each example, and the concentration of the carbon source included in the culture medium was lowered to 1.2 mol to maintain the carbon source/nitrogen source balance.
  • lysine dodecanedioic acid was obtained at a level of 132-151 g/L and lysine was obtained at a level of 61 g/L.
  • the dodecanedioic acid/lysine molar ratio in the fermentation process solution in the examples was adjusted to a level of 0.83 to 0.95.
  • E. coli (US Patent Publication No. US 2018-0030430 A1) overexpressing the PtLDC enzyme, a lysine decarboxylase gene derived from Pseudomonas thermotolerans, using the pET-Deut1 vector was used.
  • the enzyme conversion solution in which the seed culture was performed with the enzyme strain described above, was supplied to the fermentation process solution of lysine dodecanedioic acid salt produced from the above Manufacturing Example 3-1 at a mass percentage of 10% to the process solution to perform the conversion reaction.
  • the conversion reaction temperature was maintained at 45 to 50°C, and the pH was adjusted to 8.0 to 8.5.
  • CO 2 was added for neutralization in Examples 3-1 to 3-4.
  • dodecanedioic acid was additionally added at a level of 0.01 mol/L (based on the volume of the fermentation process solution of lysine dodecanedioic acid salt) before the conversion reaction.
  • cadaverine dodecanedioic acid salt was obtained at a level of 116 to 136 g/L (based on the volume of the fermentation process solution of lysine dodecanedioic acid salt), and cadaverine was obtained at a level of 42 g/L (based on the volume of the fermentation process solution of lysine dodecanedioic acid salt).
  • dodecanedioic acid was additionally added at a level of 0.03 to 0.05 mol/L (based on the volume of the fermentation process solution of lysine dodecanedioic acid salt), thereby preparing a process solution.
  • the cells in the cadaverine dodecanedioic acid solution were removed by performing membrane filtration with a size of 0.1 ⁇ m.
  • activated carbon at a level of 10% based on the weight of cadaverine dodecanedioic acid salt in the filtrate from which the cells were separated. Heat the process solution with activated carbon added to 60°C and stir for 1 hour to decolorize, and then filter the activated carbon through a filter paper.
  • the filtered liquid above was concentrated under reduced pressure at about 55 to 70°C and 120 Torr in a rotary evaporator until the solid content of the filtrate became 50% by weight.
  • the above concentrate was cooled from 50°C to 10°C at a rate of 1°C/hr.
  • the precipitated crystals were separated from the mother liquor using a centrifuge.
  • the crystals were washed with water containing 10% of the weight of cadaverine dodecanedioic acid salt.
  • the separated crystals were dried for one day, and their purity was measured by HPLC.
  • the mother liquor separated above was recycled to the step of concentrating the cadaverine dodecanedioic acid salt process solution from which impurities were removed.
  • Example 3-1 When the molar ratio of added dodecanedioic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 0.85
  • 1,000 ml of a cadaverine dodecanedioic acid salt conversion solution having a dodecanedioic acid salt/cadaverine molar ratio of 0.85 was supplied and passed through a 0.1 ⁇ m sized membrane to remove microorganisms.
  • the cadaverine dodecanedioic acid salt conversion solution having a dodecanedioic acid salt/cadaverine molar ratio of 0.85 was manufactured by following the manufacturing methods of Manufacturing Examples 3-1 and 3-2, except that in Manufacturing Example 3-1, the sum of the dodecanedioic acid salt input amount of ammonium dodecanedioic acid salt input in the fermentation process for producing lysine and the dodecanedioic acid salt input amount in the cadaverine dodecanedioic acid salt conversion reaction of Manufacturing Example 3-2 was controlled to be 0.85 of the mole number of cadaverine that was converted.
  • the filtrate was decolorized using activated carbon, filtered through a filter paper, and concentrated under reduced pressure to a solid content of 50%.
  • the concentrate was cooled from 50°C to 10°C and crystallized.
  • the crystals and mother liquor were separated by centrifugation, and the separated crystals were dried for one day and their purity was measured by HPLC.
  • the mother liquor containing residual dodecanedioic acid salt was recycled to the cadaverine dodecanedioic acid salt feed solution having a dodecanedioic acid salt/cadaverine molar ratio of 0.85, and then subjected to the crystallization step again.
  • the recycling of the mother liquor was performed sequentially.
  • Example 3-2 When the molar ratio of added dodecanedioic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 0.9
  • a cadaverine dodecanedioic acid salt conversion solution having a dodecanedioic acid salt/cadaverine molar ratio of 0.9 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 3-1.
  • Example 3-3 When the molar ratio of added dodecanedioic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 0.95
  • a cadaverine dodecanedioic acid salt conversion solution having a dodecanedioic acid salt/cadaverine molar ratio of 0.95 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 3-1.
  • Example 3-4 When the molar ratio of added dodecanedioic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 1.0
  • a cadaverine dodecanedioic acid salt conversion solution having a dodecanedioic acid salt/cadaverine molar ratio of 1.0 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 3-1.
  • Example 3-5 When the molar ratio of added dodecanedioic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 1.04
  • a cadaverine dodecanedioic acid salt conversion solution having a dodecanedioic acid salt/cadaverine molar ratio of 1.04 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 3-1.
  • Example 3-6 When the molar ratio of added dodecanedioic acid/cadaverine in the process solution after the second step is 1.09
  • a cadaverine dodecanedioic acid salt conversion solution having a dodecanedioic acid salt/cadaverine molar ratio of 1.09 was supplied, and the mother liquor was sequentially recycled and a purification process was performed in the same manner as in Example 3-1.
  • Table 12 is for the process solution that did not circulate the mother liquor.
  • Example 3-1 Example 3-2
  • Example 3-3 Example 3-4
  • Example 3-5 Dodecanedioic acid/cadaverine molar ratio 0.85 0.9 0.95 1 1.04 1.09 Crystallization supply New supply, ml 1000 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g 166 166 166 166 166 166 The generated decision, g Decision not made 35 37 40 35 31 Mother liquid, g - 131 129 127 131 135 result Purity, % - 98 99 99 99 86 73 transference number, % - 21 22 24 21 19 Total yield, % - 21 22 24 21 19
  • Table 13 shows the process solution for which the mother liquor has been circulated once.
  • Example 3-1 Example 3-2
  • Example 3-3 Example 3-4
  • Example 3-5 Dodecanedioic acid/cadaverine molar ratio 0.85 0.9 0.95 1 1.04 1.09 Crystallization supply New supply, ml - 1000 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g - 297 295 293 297 301
  • the generated decision, g - 62 66 70 63 56 Mother liquid, g - 235 229 223 234 245 result Purity, % - 98 98 99 88 78 transference number, % - 21 22 24 21 19 Total yield, % - 38 40 42 38 34
  • Table 14 shows the process solution that was circulated twice.
  • Example 3-1 Example 3-2
  • Example 3-3 Example 3-4
  • Example 3-5 Dodecanedioic acid/cadaverine molar ratio 0.85 0.9 0.95 1 1.04 1.09 Crystallization supply New supply, ml - 1000 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g - 401 395 389 400 411
  • the generated decision, g - 84 89 93 85 77 Mother liquid, g - 317 306 297 315 334 result Purity, % - 98 99 99 90 81 transference number, % - 21 22 24 21 19 Total yield, % - 51 53 56 51 46
  • Table 15 shows the process solution for which the mother liquor has been circulated three times.
  • Example 3-1 Example 3-2
  • Example 3-3 Example 3-4
  • Example 3-5 Example 3-6 Dodecanedioic acid/cadaverine molar ratio 0.85 0.9 0.95 1 1.04 1.09 Crystallization supply New supply, ml - 1000 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g - 483 472 463 481 500
  • the generated decision g - 101 106 110 102 94 Mother liquid, g - 382 366 353 379 406 result Purity, % - 98 99 99 99 91 84 transference number, % - 21 22 24 21 19 Total yield, % - 61 64 66 62 56
  • Table 16 shows the process solution that was circulated four times.
  • Example 3-1 Example 3-2
  • Example 3-3 Example 3-4
  • Example 3-5 Example 3-6 Dodecanedioic acid/cadaverine molar ratio 0.85 0.9 0.95 1 1.04 1.09 Crystallization supply New supply, ml - 1000 1000 1000 1000 1000 Amount of cadaverine in crystallized solution, g - 548 532 519 545 572
  • the generated decision, g - Decision not made 120 123 116 107 Mother liquid, g - - 413 395 429 465 result Purity, % - - 99 99 92 85 transference number, % - - 22 24 21 19 Total yield, % - - 72 74 70 65
  • Example 3-2 crystals were precipitated up to the third cycle of mother liquor circulation, but no crystals were formed in the fourth cycle. This is because the sequentially circulated mother liquor lowered the molar ratio of dodecanedioic acid salt to the crystallization feed solution, and thus the concentration of dodecanedioic acid salt was not sufficient to precipitate crystals of cadaverine dodecanedioic acid salt.
  • Example 3-5 the purity of the crystal was somewhat low at 86% when the mother liquor was not circulated, but the purity increased to 92% when the mother liquor was circulated four times.
  • Example 3-6 the purity of the crystal was low at 73% when the mother liquor was not circulated, but the purity increased to 81% when the mother liquor was circulated four times.
  • Example 3-3 obtained cadaverine dodecanedioic acid salt with a purity of 99% up to the fourth cycle of mother liquor circulation, and also achieved a high yield of approximately 72% in total yield.
  • Example 3-4 obtained cadaverine dodecanedioic acid salt with a purity of 99% up to the fourth cycle of mother liquor circulation, and also achieved a high yield of approximately 74% in total yield.
  • the purity of the manufactured cadaverine dodecanedioic acid salt may vary depending on the molar ratio of dodecanedioic acid and cadaverine in the conversion solution (process solution) supplied after the cadaverine conversion process.
  • the amount of added dodecanedioic acid was adjusted to a molar ratio of about 0.95 to 1.00 with respect to the amount of cadaverine in the process solution after the second step, it was possible to maintain a purity of 99% of cadaverine dodecanedioic acid salt even after two or more rounds of mother liquor circulation while exhibiting an excellent total yield of 53% or more.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

본 출원은 디암모늄 디카르복실산염 형태로 디카르복실산이 첨가된 배지에서 L-라이신 생산 미생물을 배양하여 라이신 디카르복실산염을 수득하는 제1 단계 및 라이신 디카르복실산염을 카다베린 디카르복실산염으로 전환하는 제2 단계를 포함하는 카다베린 디카르복실산염(카다베린 세바스산염, 카다베린 운데칸디오익산염, 또는 카다베린 도데칸디오익산염)의 제조 방법에 관한 것이다. 본 출원에 따르면 상술한 절차에 따라 공정을 수행함으로써 이온수지 교환, 탈탄산공정 및 증류 공정 없이도 고순도의 카다베린 디카르복실산염(카다베린 세바스산염, 카다베린 운데칸디오익산염, 또는 카다베린 도데칸디오익산염)을 수득할 수 있다.

Description

카다베린 디카르복실산염 제조 공정
본 출원은 미생물 발효 및 정제공정을 이용하여 높은 순도의 카다베린 디카르복실산염(카다베린 세바스산염, 카다베린 운데칸디오익산염, 또는 카다베린 도데칸디오익산염)을 제조하기 위한 기술에 관한 것이다.
카다베린은 동물 조직의 부패에 의해 생성되는 악취를 풍기는 독성 다이아민 화합물이다. 헥산디아민과 달리 카다베린은 상온에서 액체상태로 존재하며 공기중의 산성가스인 이산화탄소를 보다 쉽게 흡수하여 운송 및 보관에 많은 어려움을 초래한다. 따라서 염 형성 결정화는 고품질의 단량체를 얻을 뿐만 아니라 운송 및 보관에 용이하다.
한편, 카다베린 세바스산염, 카다베린 운데칸디오익산염, 카다베린 도데칸디오익산염은 바이오 폴리아미드(polyamide)의 중합 전구체로서, 바이오폴리아미드는 자동차, 전기전자 부품 등에 널리 사용되고 있는 엔지니어링 플라스틱 중의 하나이다.
카데베린 디카르복실산염 준비 공정에는 일반적으로 다음 단계가 포함된다:
카다베린의 합성: 카다베린 합성은 라이신의 카다베린으로의 탈카르복실화를 촉매하는 효소인 라이신 디카르복실라제를 생산할 수 있는 적절한 미생물 균주의 발효를 포함한다.
카다베린 디카르복실산염의 형성: 카다베린 디카르복실산염의 형성은 적절한 촉매의 존재 하에서 카다베린과 디카르복실산 사이의 반응을 포함한다. 반응은 전형적으로 두 단량체를 적절한 온도에서 혼합하고 완전한 반응을 보장하기 위해 특정 기간 동안 교반하는 것을 포함한다.
카다베린 디카르복실산염의 정제: 반응이 완료되면 용매추출, 크로마토그래피, 결정화 등의 다양한 분리 및 정제기술을 이용하여 원료인 카다베린 디카르복실산염을 정제한다.
종래 기술에 따르면, 세바스산염, 운데칸디오익산염 및 도데칸디오익산염은 용해도가 낮기 때문에 상술한 공정 중 결정화 과정에서 디카르복실산염(세바스산염, 운데칸디오익산염, 또는 도데칸디오익산염)이 카다베린 디카르복실산염(카다베린 세바스산염, 카다베린 운데칸디오익산염, 또는 카다베린 도데칸디오익산염)과 함께 결정으로 석출된다는 문제가 있었다. 따라서, 고순도의 카다베린 디카르복실산염을 생산하기 위해서는 디카르복실산염을 결정화 전에 제거해야 했고, 디카르복실산염 제거를 위한 추가 공정 수행에 따른 비용 부담, 공정 효율 저하, 화학 용제 사용에 따른 환경 오염 등의 문제가 있었다.
본 출원의 해결하고자 하는 과제는 카다베린 디카르복실산염(카다베린 세바스산염, 카다베린 운데칸디오익산염, 또는 카다베린 도데칸디오익산염)의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 하나의 목적은 디암모늄 디카르복실산염 형태로 디카르복실산이 첨가된 배지에서 L-라이신 생산 미생물을 배양하여 라이신 디카르복실산염을 수득하는 제1 단계, 및 라이신 디카르복실산염을 카다베린 디카르복실산염으로 전환하는 제2 단계를 포함하는 카다베린 디카르복실산염 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 일 양태에 따르면 디암모늄 디카르복실산염을 포함하는 배지에서 L-라이신 생산 미생물을 배양하여 라이신 디카르복실산염을 수득하고, 라이신 디카르복실산염을 카다베린 디카르복실산염으로 효소 전환함으로써, 디카르복실산염 제거를 위한 별도 공정이 필요하지 않아 공정이 단순화되면서도, 디카르복실산의 결정이 부산물로 함께 석출되지 않아 높은 순도의 C10, C11 또는 C12의 카다베린 디카르복실산염을 고수율로 제조할 수 있다.
도 1은 본 출원에 따른 카다베린 디카르복실산염 제조 공정을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 출원의 일 양태에 따른 카다베린 디카르복실산염 제조 공정을 나타낸 순서도이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 일 양태는 디암모늄 디카르복실산염 형태로 디카르복실산이 첨가된 배지에서 L-라이신 생산 미생물을 배양하여 라이신 디카르복실산염을 수득하는 제1 단계, 및 라이신 디카르복실산염을 카다베린 디카르복실산염으로 전환하는 제2 단계를 포함하는 카다베린 디카르복실산염 제조 방법을 제공한다.
본 출원에서 용어 "디카르복실산(Dicarboxylic Acid)"는 카르복실기 2개를 포함하는 2염기산을 의미하며, 생체 내의 대사 중간체로서 중요도가 높다. 구체적으로, 상기 디카르복실산은 탄소수 10개, 11개, 또는 12개의 지방족 디카르복실산일 수 있다. 즉, 본 출원에서 상기 디카르복실산은 세바스산, 운데칸디오익산, 및 도데칸디오익산 중 선택된 하나의 지방족 디카르복실산을 의미한다. 본 출원의 제조 방법에서 생산하고자 하는 카다베린 디카르복실산염이 카다베린 세바스산염일 경우, 첨가되거나 투입되는 디카르복실산은 모두 세바스산인 것으로 이해되어야 하며, 또한 본 출원의 제조 방법에서 생산하고자 하는 카다베린 디카르복실산염이 카다베린 운데칸디오익산염일 경우, 첨가되거나 투입되는 디카르복실산은 모두 운데칸디오익산인 것으로 이해되어야 하며, 또한 본 출원의 제조 방법에서 생산하고자 하는 카다베린 디카르복실산염이 카다베린 도데칸디오익산염일 경우, 첨가되거나 투입되는 디카르복실산은 모두 도데칸디오익산인 것으로 이해되어야 한다. 이처럼, 본 출원에서 디카르복실산은 다른 종류의 디카르복실산의 혼합물이 아닌, 한 종류의 지방족 디카르복실산을 지칭하는 것으로 이해된다.
본 출원에서 용어 "세바스산(Sebacic acid)"은 탄소수 10개의 디카르복실릭산으로서 C10H18O4의 화학식을 가지며, 일반적으로 백색의 분말 고체로서 존재한다. 상기 세바스산은 세박산, 세바식산 등으로도 명명되며, 폴리머 및 가소제를 포함한 다양한 산업 제품의 전구체로서 활용된다.
본 출원에서 용어 "운데칸디오익산(undecanedioic acid)"은 탄소수 11개의 디카르복실산으로서 C11H20O4의 화학식을 가진다. 상기 운데칸디오익산은 폴리머 및 가소제를 포함한 다양한 산업 제품의 전구체로서 활용된다.
본 출원에서 용어 "도데칸디오익산(Dodecanedioic acid)"은 탄소수 12개의 카르복실산으로서, C12H22O4의 화학식을 가진다. 상기 도데칸디오익산은 도데칸이산으로도 명명된다.
본 출원에서 용어 "카다베린(Cadaverine, CAD)"은 악취를 풍기는 독성 다이아민 화합물으로, 화학식은 NH2(CH2)5NH2으로 나타낸다. 카다베린은 또한 1,5-펜테인다이아민 또는 펜타메틸렌다이아민으로도 명명될 수 있다. 본 출원에서 카다베린은 카다베린 디카르복실산염 형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 출원에서 용어 "카다베린 디카르복실산염(Cadaverine Dicarboxylate)"은 상기 다이아민 형태의 카다베린에 디카르복실산 성분을 반응시켜 제조한 물질로서, 폴리아미드 수지의 제조 전구체로서 그 산업적 활용도가 높다. 구체적으로, 본 출원에서 카다베린 디카르복실산염은 카다베린 세바스산염, 카다베린 운데칸디오익산염, 및 카다베린 도데칸디오익산염 중 선택된 하나의 카다베린 디카르복실산염을 의미한다.
도 1과 도 2는 본 출원의 일 양태에 따른 카다베린 디카르복실산염 제조 공정을 나타낸 순서도이다.
본 출원에서 용어 "L-라이신 생산 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서 L-라이신의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
일 예에서 본 출원의 L-라이신을 생산하는 미생물은, 자연적으로 L-라이신 생산능을 가지고 있는 미생물, L-라이신 생산능이 없는 미생물에 L-라이신 생산능이 부여된 미생물, 또는 L-라이신 생산능이 현저히 적은 미생물에 L-라이신 생산능이 강화된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 출원에서 L-라이신을 생산하는 미생물, 또는 L-라이신 생산능을 갖는 미생물은, L-라이신 생합성 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화되거나, L-라이신 분해 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화된 미생물 일 수 있다. L-라이신 생산능이 "강화" 또는 "증가"한다는 것은, 모균주 또는 비변형 미생물과 비교하여 L-라이신 생산능이 향상된 것을 의미한다.
구체적인 예로, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 (the genus　Corynebacterium) 미생물 또는 에스케리키아 속 (the genus Escherichia) 미생물일 수 있다. 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 속에 속하는 모든 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 에스케리아 속 미생물은 에스케리아 속에 속하는 모든 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 대장균(Escherichia coli), 에스케리키아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리키아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리키아 퍼구소니 (Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르만니(Escherichia hermannii) 또는 에스케리아 불너리스(Escherichia vulneris)일 수 있고, 더욱 구체적으로는 상기 에스케리키아 속 균주는 대장균일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 L-라이신 생산 미생물의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지(medium)" 는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 L-라이신 생산 미생물의 배양에 사용되는 배지는 질소원의 일부 또는 전부로 디암모늄 디카르복실산염을 함유하는 점을 제외하면 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있다. 본 출원의 미생물은 디암모늄 디카르복실산염을 포함하는 질소원, 적당한 탄소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원의 카다베린 디카르복실산염 제조방법 중 제1 단계는 디암모늄 디카르복실산염 형태로 디카르복실산이 첨가된 배지에서 L-라이신 생산 미생물을 배양하여 라이신 디카르복실산염을 수득하는 단계이다. 이는 라이신 생산 미생물의 발효 공정을 통해 이루어질 수 있다.
제1 단계에서, 상기 디카르복실산은 배지에 디암모늄 디카르복실산염의 형태로 공급될 수 있으며, 그에 따라 본 출원에서 디카르복실산은 디암모늄 디카르복실산염 형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 출원에서 용어 "디암모늄 디카르복실산염(Diammonium Dicarboxylate)"은 디카르복실산의 두 수소 원자가 암모늄으로 치환된 형태로서, 상기 배지의 주요한 질소원으로 이용된다. 상기 디암모늄 디카르복실산염은 디카르복실산을 암모니아수에 온화하게 섞어주어 중성의 pH를 갖도록 조제한 후 농축을 통한 결정의 형태로 또는 액상 형태로 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 제조방법은, 공정 전체에서 공급되는 디카르복실산 중 81몰% 이상을 제1 단계에서, 배지에 디암모늄 디카르복실산염의 형태로 투입함으로써 공정을 단순화하면서도 높은 순도의 카다베린 디카르복실산염을 제조할 수 있으며, 디카르복실산염이 카다베린 디카르복실산염과 함께 석출되는 부작용을 감소시킬 수 있다.
구체적으로, 제 1단계의 디암모늄 디카르복실산염은 본 출원 제조 방법의 전체 공정에서 공급되는 디카르복실산에 대해 높은 비율로, 구체적으로 41몰% 이상으로 배지에 포함될 수 있다.
보다 구체적으로, 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 본 출원 제조 방법의 전체 공정에서 공급되는 디카르복실산의 43몰% 이상, 45몰% 이상, 53몰% 이상, 78몰% 이상, 80몰% 이상, 81몰% 이상, 82몰% 이상, 83몰% 이상, 84몰% 이상, 85몰% 이상, 86몰% 이상, 87몰% 이상, 88 몰% 이상, 89몰% 이상, 90몰% 이상, 91몰% 이상, 92몰% 이상, 93몰% 이상, 94몰% 이상, 95몰% 이상, 96몰% 이상, 97 몰% 이상, 98몰% 이상, 99몰% 이상 또는 100몰%로 포함될 수 있다.
본 출원의 제조방법은 디암모늄 디카르복실산염을 배지에 다량 포함함으로써 종래의 황산암모늄 등을 투입하던 공정과 달리, 이온수지 교환, 탈탄산공정 또는 증류 공정 등 별도의 디카르복실산염의 제거 단계를 수행하지 않아도, 고순도 카다베린 디카르복실산염을 제조할 수 있는 이점을 제공할 수 있다. 또한, 디암모늄 디카르복실산염을 이용함으로써 전체 공정에서 첨가되는 디카르복실산/제2 단계 이후 공정액 내 카다베린의 몰 비율의 조정을 용이하게 할 수 있다.
구체적으로, 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 생산하고자 하는 라이신과의 몰 비(디암모늄 디카르복실산염/라이신)가 0.7 내지 1.11이 되도록 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 생산하고자 하는 라이신과의 몰 비(디암모늄 디카르복실산염/라이신)가 0.74 내지 1.06, 0.76 내지 1.04, 0.78 내지 1.02, 또는 0.80 내지 1.00, 또는 0.82 내지 0.98이 되도록, 보다 더 구체적으로 0.84 내지 0.96이 되도록 포함될 수 있다. 이 때, 상기 생산하고자 하는 라이신의 양은 라이신 디카르복실산염 형태를 모두 포함한 총량을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
일 예로, 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 생산하고자 하는 라이신과의 몰 비(디암모늄 디카르복실산염/라이신)가 0.7, 0.72, 0.74, 0.78, 0.79, 0.80, 0.82, 0.84, 0.87, 0.88, 0.89, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 및 0.96 로부터 선택된 하나의 하한선 및/또는 1.11, 1.1, 1.08, 1.07, 1.06, 1.05, 1.04, 1.03, 1.02, 1.01, 및 1.0 로부터 선택된 하나의 상한선으로 구성된 범위의 몰 비로 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 디카르복실산염 및 디카르복실산은 세바스산염 및 세바스산이고, 상기 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 생산하고자 하는 라이신과의 몰 비 (디암모늄 디카르복실산염/라이신)가 0.84-0.86 이 되도록 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 디카르복실산염 및 디카르복실산은 운데칸디오익산염 및 운데칸디오익산이고, 상기 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 생산하고자 하는 라이신과의 몰 비 (디암모늄 디카르복실산염/라이신)가 0.84-0.90 이 되도록 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 디카르복실산염 및 디카르복실산은 도데칸디오익산염 및 도데칸디오익산이고, 상기 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 생산하고자 하는 라이신과의 몰 비 (디암모늄 디카르복실산염/라이신)가 0.86-0.96 이 되도록 포함될 수 있다.
구체적으로, 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 L-라이신 생산 미생물 발효액을 기준으로 0.3 mol/L 내지 0.5 mol/L이 되도록 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 L-라이신 생산 미생물 발효액을 기준으로 0.3 mol/L 내지 0.45 mol/L, 0.35 mol/L 내지 0.45 mol/L, 0.38 mol/L 내지 0.45 mol/L, 또는 0.38 mol/L 내지 0.4 mol/L이 되도록 포함할 수 있다. 디암모늄 디카르복실산염을 상기 농도로 첨가하여 암모늄 이온이 발효 중 질소원으로 작용하며, 디카르복실산과 라이신이 염을 형성하여 발효액 중에 용해된 상태로 포함될 수 있다.
디암모늄 디카르복실산염을 포함한 배지에서 L-라이신 생산 미생물의 발효를 통해 라이신 디카르복실산염이 생산될 수 있다. 라이신 디카르복실산염은 균체를 포함하는 발효액 그대로, 균체가 제거된 발효액 형태, 농축 또는 정제 후 후속 공정에 투입될 수 있다.
본 출원의 제 1단계 라이신 생산 미생물을 배양한 발효액 내 라이신의 농도는 제한되지 않으나, L-라이신 생산 미생물 발효액을 기준으로 50 g/L 내지 200 g/L, 60 g/L 내지 150 g/L, 60 g/L 내지 140 g/L, 또는 61 g/L 내지 69 g/L일 수 있다.
상기 배지의 탄소원으로는 포도당(glucose), 과당(fructose), 자당(sucrose), 맥아당(maltose) 및 이들의 이성질체 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적인 예로, 본 출원의 배양 배지에 포함될 수 있는 탄소원은 포도당, 맥아당 또는 맥아당 이성질체를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 포도당, 맥아당(말토오스: maltose) 및 맥아당 이성질체(이소말토오스: isomaltose) 중 선택된 하나 이상, 또는 둘 이상을 조합하여 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 배지의 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해, 예를 들어, 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 배지의 질소원으로는 디암모늄 디카르복실산염을 포함할 수 있다. 미생물 배양을 위한 통상적인 배지는 질소원으로 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원을 포함할 수 있으나 본 출원의 일 양태에서는 디암모늄 디카르복실산염을 단독 질소원으로 포함하거나 추가적인 질소원으로 포함할 수 있다.
디암모늄 디카르복실산염을 포함하는 배지에서 L-라이신 생산 미생물을 배양하여 라이신 디카르복실산염을 생산한 제1 단계 후에는 라이신 디카르복실산염을 카다베린 디카르복실산염으로 전환하는 제2 단계가 수행될 수 있다.
제2 단계는 라이신 디카르복실산염을 목적 산물인 카다베린 디카르복실산염(카다베린 세바스산염, 카다베린 운데칸디오익산염 또는 카다베린 도데칸디오익산염) 으로 전환하는 단계를 의미한다.
일 구체예에서, 상기 제2 단계는 공정액에 디카르복실산을 추가로 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 상기 공정액은 제1 단계에서 수득한 발효 공정액일 수 있다.
상기 제2 단계에서 첨가되는 디카르복실산은 첨가되지 않거나 공정액 부피 기준, 구체적으로 제1 단계에서 수득한 발효 공정액 부피 기준 0.57 mol/L 이하로, 0.53 mol/L 이하로, 0.48 mol/L 이하로, 0.4 mol/L 이하로, 0.18 mol/L 이하로, 0.15 mol/L 이하로, 0.12 mol/L 이하로, 0.1 mol/L 이하로, 0.08 mol/L 이하로, 0.06 mol/L 이하로, 0.05 mol/L 이하로, 0.04 mol/L 이하로, 0.03 mol/L 이하로, 0.02 mol/L 이하로 또는 0.01 mol/L 이하로 미량 첨가되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 디카르복실산이 세바스산일 경우, 제2 단계에서 첨가되는 디카르복실산은 0.01 mol/L 이상 0.06 mol/L 이하로, 예를 들어 0.04 mol/L 내지 0.06 mol/L로 미량 첨가되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 디카르복실산이 운데칸디오익산일 경우, 제2 단계에서 첨가되는 디카르복실산은0.01 mol/L 이상 0.06 mol/L 이하로, 예를 들어 0.02 mol/L 내지 0.04 mol/L 로 미량 첨가되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 디카르복실산이 도데칸디오익산일 경우, 제2 단계에서 첨가되는 디카르복실산은 0.02 mol/L 이하로, 예를 들어 0.005 mol/L 내지 0.015 mol/L 로 미량 첨가되는 것일 수 있다.
상기 제2 단계에서 디카르복실산이 공정액에 추가로 첨가될 경우, 디카르복실산은 전환 반응 이전, 이후 또는 동시에 첨가되는 것일 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.
제2 단계에서 디카르복실산이 추가로 첨가될 경우 본 출원 제조 방법의 공정 전체에서 첨가되는 디카르복실산의 양은 제1 단계의 배지에 첨가된 디암모늄 디카르복실산염의 양과 제2 단계에서 첨가되는 디카르복실산의 양의 총 합인 것으로 이해된다. 또한, 제2 단계에서 공정액에 디카르복실산을 추가로 첨가하지 않을 경우, 본 출원 제조 방법의 공정 전체에서 첨가되는 디카르복실산의 양은 제1 단계의 배지에 첨가된 디암모늄 디카르복실산염의 양과 동일한 것으로 이해된다.
구체적으로, 본 출원 제조 방법에서 첨가되는 디카르복실산의 양은 제2 단계 이후 수득될 공정액 내 카다베린 양을 고려하여 첨가될 수 있다. 구체적으로, 본 출원 제조 방법에서 첨가되는 디카르복실산의 양은 상기 제2 단계 이후 공정액 내 카다베린 양 대비 0.85 내지 1.12의 몰 비일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 출원 제조 방법에서 첨가되는 디카르복실산의 양은 상기 제2 단계 이후 공정액 내 카다베린 양 대비 0.86 내지 1.11, 0.87 내지 1.10, 0.88 내지 1.08, 0.89 내지 1.06, 0.90 내지 1.05, 0.91 내지 1.04, 0.92 내지 1.03, 0.93 내지 1.02, 0.94 내지 1.01, 또는 0.95 내지 1.0의 몰 비일 수 있다.
일 예로, 본 출원 제조 방법에서 첨가되는 디카르복실산의 양은 상기 제2 단계 이후 공정액 내 카다베린 양 대비 0.83, 0.84, 0.85, 0.86, 0.87, 0.88, 0.89, 0.9, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95 및 0.96으로부터 선택된 하나의 하한선 및/또는 1.10, 1.09, 1.08, 1.07, 1.06, 1.05, 1.04, 1.03, 1.02, 1.01 및 1.0으로부터 선택된 하나의 상한선으로 구성된 범위의 몰 비로 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 디카르복실산이 세바스산일 경우, 본 출원 제조 방법에서 첨가되는 디카르복실산의 양은 상기 제2 단계 이후 공정액 내 카다베린 양 대비 0.9 내지 1.10, 0.91 내지 1.09, 0.92 내지 1.08, 0.93 내지 1.06, 0.94 내지 1.02, 0.95 내지 1.01, 또는 0.96 내지 1.00의 몰 비일 수 있다.
본 출원의 제조 방법에 있어서 세바스산을, 제2 단계 이후 수득될 것으로 계산되는 카다베린 양과 대비하여 상기 범위의 몰 비로 첨가하였을 때, 세바스산이 카다베린 세바스산염과 함께 결정으로 석출되지 않아 고순도 및 고수율의 카다베린 세바스산염 생산이 가능함을 규명한 것에 하나의 기술적 의의가 존재한다.
또한, 수득될 카다베린과 첨가하는 세바스산의 몰 비 조정을 통해 모액 순환시, 순환 4회차까지 카다베린 세바스산염 순도 98% 이상 유지가 가능하면서도 모액 순환 횟수에 따라 총 수율 40% 이상, 42% 이상, 53% 이상, 56% 이상, 64% 이상, 66% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 또는 74% 이상으로 카다베린 세바스산염을 수득할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 디카르복실산이 운데칸디오익산일 경우, 본 출원 제조 방법에서 첨가되는 디카르복실산의 양은 상기 제2 단계 이후 공정액 내 카다베린 양 대비 0.9 내지 1.10, 0.91 내지 1.09, 0.92 내지 1.08, 0.93 내지 1.06, 0.94 내지 1.02, 또는 0.95 내지1.00의 몰 비일 수 있다.
본 출원의 제조 방법에 있어서 운데칸디오익산을, 제2 단계 이후 수득될 것으로 계산되는 카다베린 양과 대비하여 상기 범위의 몰 비로 첨가하였을 때, 운데칸디오익산이 카다베린 운데칸디오익산염과 함께 결정으로 석출되지 않아 고순도 및 고수율의 카다베린 운데칸디오익산염 생산이 가능함을 규명한 것에 하나의 기술적 의의가 존재한다.
또한, 수득될 카다베린과 첨가하는 운데칸디오익산의 몰 비 조정을 통해 모액 순환시, 순환 5회차까지 카다베린 운데칸디오익산염 순도 99% 이상 유지가 가능하면서도 모액 순환 횟수에 따라 총 수율 46% 이상, 48% 이상, 55% 이상, 56% 이상, 61% 이상, 63% 이상, 66% 이상, 68% 이상, 70% 이상, 72% 이상, 또는 73% 이상으로 카다베린 운데칸디오익산염을 수득할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 디카르복실산이 도데칸디오익산일 경우, 본 출원 제조 방법에서 첨가되는 도데칸디오익산의 양은 상기 제2 단계 이후 공정액 내 카다베린 양 대비 0.9 내지 1.10, 0.91 내지 1.09, 0.92 내지 1.08, 0.93 내지 1.06, 0.94 내지 1.02, 또는 0.95 내지1.00의 몰 비일 수 있다.
본 출원의 제조 방법에 있어서 도데칸디오익산을, 제2 단계 이후 수득될 것으로 계산되는 카다베린 양과 대비하여 상기 범위의 몰 비로 첨가하였을 때, 도데칸디오익산이 카다베린 도데칸디오익산염과 함께 결정으로 석출되지 않아 고순도 및 고수율의 카다베린 도데칸디오익산염 생산이 가능함을 규명한 것에 하나의 기술적 의의가 존재한다.
또한, 수득될 카다베린과 첨가하는 도데칸디오익산의 몰 비 조정을 통해 모액 순환시, 순환 4회차까지 카다베린 도데칸디오익산염 순도 98% 이상 유지가 가능하면서도 모액 순환 횟수에 따라 총 수율 40% 이상, 42% 이상, 53% 이상, 56% 이상, 64% 이상, 66% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 또는 74% 이상으로 카다베린 세바스산염을 수득할 수 있다.
제2 단계에서, 상기 라이신 디카르복실산염을 카다베린 디카르복실산염으로의 전환 반응은 효소 전환 반응일 수 있다.
일 구체예로, 상기 라이신 디카르복실산염은 제1 단계에서 수득된 라이신 디카르복실산염과, 또한 제2 단계에서 디카르복실산을 추가로 투입할 경우 제2 단계에서 생성된 라이신 디카르복실산염을 모두 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 제2 단계의 효소 전환 반응은 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질 또는 상기 활성을 가지는 단백질을 발현하는 미생물을 이용하여 수행될 수 있다.
하나의 구체예로, 제1단계의 발효 공정액에 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 투입하거나, 또는 상기 활성을 가지는 단백질을 발현하는 미생물의 종균 배양액을 투입할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어 "디카르복실라제(decarboxylase)"는 유기산인 카복실기를 이탈시켜 탄산의 생성을 촉매하는 효소로서, 데카복실라아제, 데카복실라제, 탈카르복실화효소, 탈탄산효소, 또는 탄산이탈효소 등으로도 명명될 수 있다.
상기 단백질은 라이신 디카르복실라제 활성을 나타내는 한 특별히 제한되지는 않으나 일 예로 슈도모나스 써모톨러란스(Pseudomonas thermotolerans) PtLDC 단백질 또는 대장균 유래의 CadA 단백질일 수 있으나, 공지된 데이터 베이스인 GenBank를 이용해 단백질 서열을 얻거나, 상기 미생물을 이용해 발현하거나, 또는 시중의 효소를 구입하여 사용할 수 있으며 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질을 발현하는 미생물은, 단백질을 발현하도록 형질전환된 미생물일 수 있다. 상기 형질 전환된 미생물은 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질이 발현되도록 형질 전환이 된 것이라면 원핵 미생물 및 진핵 미생물에 제한되지 않는다. 상기 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질을 발현하도록 형질전환된 미생물은 상기 효소 활성을 갖는 단백질을 종균 배양액 내로 배출하여 공정액 내의 라이신 디카르복실산염을 카다베린 디카르복실산염으로 전환 할 수 있다.
구체적인 예로, 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속 및 코리네형 미생물 균주가 포함될 수 있다. 상기 미생물은 구체적으로 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 제2 단계의 전환 반응은 20분 내지 3시간 동안 수행될 수 있으며, 보다 구체적으로 0.5 내지 1.5시간 동안 수행될 수 있고, 일 예로 1시간 동안 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 단계의 전환 반응은 30 내지 60℃에서 수행될 수 있으며, 보다 구체적으로 40 내지 55℃에서 수행될 수 있고, 일 예로 45℃ 내지 50℃에서 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 단계의 전환 반응은 pH는 7.5 내지 9에서 수행될 수 있으며, 보다 구체적으로 7.8 내지 8.7에서 수행될 수 있고, 보다 더 구체적으로 8 내지 8.5에서 수행될 수 있다. 제2 단계의 일 구현예에서 선택적으로 추가 투입되는 디카르복실산에 의해 pH가 상기 범위로 조정될 수 있으며, 또 다른 구현예에서 CO2를 첨가하여 pH가 상기 범위로 조정될 수 있다. 제2 단계 전환반응의 pH 범위가 상기 범위로 조정되었을 때, 라이신 디카르복실산염의 카다베린 디카르복실산염으로의 전환율이 현저히 증대될 수 있다.
본 출원의 카다베린 디카르복실산염 제조 방법은 상기 제2 단계 수행 후, 수득한 카다베린 디카르복실산염을 회수하는, 회수 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 회수는 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 카다베린 디카르복실산염을 수집하는 것일 수 있다.
예를 들어, 원심분리, 여과, 농축, 결정화, 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 카다베린 디카르복실산염을 수집할 수 있다.
본 출원의 일 구체예에서 상기 회수 단계는 여과 단계, 농축 단계 및 결정화 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 여과 단계는 제2 단계에서 수득된 카다베린 디카르복실산염을 포함하는 전환액의 불순물을 제거하는 단계를 의미한다. 일 예로서, 상기 여과는 카다베린 디카르복실산염 공정액 내의 균체를 막 분리 등을 수행하여 제거하거나, 활성탄 여과 등을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
상기 농축 단계는 전환액 내의 고형분 비율이 높아지도록 농축하는 단계를 의미하며, 상기 여과 단계 이후 수행되는 것일 수 있다. 일 예로서, 상기 농축은 회전식 증발기를 이용하여 감압 농축하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 농축 단계는 고형분 함량이 45 - 70%(w/w) 가 되도록 농축하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 46-68%(w/w), 48 - 67%(w/w), 45-65%(w/w), 50-70%(w/w) 가 되도록 농축하는 것일 수 있다. 일 예로, 45-55%(w/w) 가 되도록 농축하는 것일 수 있다. 일 예로, 60-70%(w/w)가 되도록 농축하는 것일 수 있다.
상기 농축 단계에서 고형분 함량이 위와 같은 범위로 농축될 때, 카다베린 디카르복실산염의 회수율 및 순도가 우수하게 유지될 수 있다.
상기 농축단계는 45 내지 80℃, 예를 들어 55℃ 내지 70℃에서 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 결정화 단계는 냉각 결정화 단계일 수 있으며, 이는 전환액을 냉각하고 결정으로 석출하여 최종적인 목적 산물인 카다베린 디카르복실산염 결정을 수득하는 단계를 의미한다.
구체적으로, 상기 냉각은 전환액을 30℃ 이하로 냉각하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 27℃이하, 25℃ 이하, 23℃ 이하, 20℃이하, 예를 들어 10℃까지 냉각하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 냉각 속도는 0.1-20℃/시간일 수 있고, 보다 구체적으로 0.5-1.5℃/시간일 수 있으며, 일 예로 1℃/시간일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 상기 회수 단계는 공정액을 교반하는, 교반 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 교반 단계는 상기 냉각결정화 단계와 동시에, 냉각결정화 단계의 중간에, 냉각결정화 단계 이전, 또는 냉각결정화 단계 이후에 수행될 수 있다. 이러한 교반 단계를 통해 공정액을 충분히 교반하는 시간을 부여하여 결정 석출을 보다 용이하게 할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 회수 단계는 결정화 단계 이후 결정화되지 않은 카다베린 디카르복실산염을 포함하는 모액을 농축 단계의 공급액으로 재순환하는, 모액 순환 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 모액 순환 단계에서, 모액의 순환 횟수는 0 내지 3회, 1 내지 3회, 1 내지 4회, 1 내지 5회, 1 내지 10회, 또는 그 이상일 수 있다. 이 때, 상기 모액의 순환 횟수가 0인 것은 모액 순환 단계를 수행하지 않은 것을 의미한다.
종래에는 카다베린 디카르복실산염을 결정화하는 단계에서 결정화 후에 남은 모액에도 여전히 비교적 많은 카다베린 디카르복실산염이 잔류하고 있어 50% 미만의 낮은 수율이 나타났다는 문제가 있었다. 본 출원에서는 카다베린 디카르복실산염의 수율을 개선시키는 방법으로서 카다베린 디카르복실산염 잔류 모액을 농축 단계의 공급액으로 1회 내지 3회, 1회 내지 4회, 1회 내지 5회, 1회 내지 10회 또는 그 이상 재순환시킴으로써, 카다베린 디카르복실산염의 총 수율을 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 상기 회수 단계는 결정화된 공정액을 세척, 분리 및 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 건조 단계에서, 결정에 포함된 수분을 건조를 통해 제거하고, 순도가 높은 카다베린 디카르복실산염을 제품화할 수 있다. 건조 후 카다베린 디카르복실산염 결정은 파우더 형태로 제공될 수 있으나 제형은 필요에 따라 달리할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 회수 단계는 탈색 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색은 활성탄, 음이온 수지 등을 이용하여 수행될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한 본 출원의 카다베린 디카르복실산염 제조 방법은 추가적인 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 카다베린 디카르복실산염 제조 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 공정과 정제 공정은 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 제조방법은 상기 회수 단계에서 디카르복실산염 제거를 위한 별도 공정을 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 종래 카다베린 디카르복실산염 생산 공정의 경우 결정화 과정에서 디카르복실산염이 함께 결정으로 석출되어 순도가 저하되어, 이를 방지하기 위해 디카르복실산염을 결정화 전에 제거하는 별도 공정이 필요하였다. 그러나, 본 출원의 제조방법은 별도의 디카르복실산염 제거 공정을 수행하지 않아도 고순도 카다베린 디카르복실산염을 제조할 수 있는 기술적 이점을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 디카르복실산이 세바스산일 경우, 본 출원의 방법은 모액의 순환 횟수 0 내지 4회차에서, 순도 99% 이상의 카다베린 세바스산염을 수득할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 디카르복실산이 세바스산일 경우, 상기 모액의 순환 횟수 4회를 기준으로, 카다베린 세바스산염의 누적된 총 수율이 70%이상일 수 있고, 보다 구체적으로 70% 초과, 71% 이상, 72% 이상, 73%이상 또는 74% 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 디카르복실산이 운데칸디오익산일 경우, 본 출원의 방법은 모액의 순환 횟수 0 내지 5회차에서, 순도 99% 이상의 카다베린 운데칸디오익산염을 수득할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 디카르복실산이 운데칸디오익산일 경우, 상기 모액의 순환 횟수 5회를 기준으로, 카다베린 운데칸디오익산염의 누적된 총 수율이 68% 초과, 예를 들어 70%이상이고, 순도는 99% 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 디카르복실산이 도데칸디오익산일 경우, 본 출원의 방법은 모액의 순환 횟수 0 내지 4회차에서, 순도 98% 이상의 카다베린 도데칸디오익산염을 수득할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 그 예로 상기 모액의 순환 횟수 2 내지 4회차에서, 순도 99% 이상의 카다베린 도데칸디오익산염을 수득할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 일 구현예에서, 디카르복실산이 도데칸디오익산일 경우 상기 모액의 순환 횟수 4회를 기준으로, 카다베린 도데칸디오익산염의 누적된 총 수율이 70% 이상 일 수 있고, 보다 구체적으로 70% 초과, 71% 이상, 또는 72% 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 본 출원의 방법은 상기 모액의 순환 횟수 0 내지 4회차에서, 총 수율 22% 이상으로 순도 98% 이상의 카다베린 디카르복실산염을 수득할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 출원의 방법을 통해 통상적인 카다베린 액상 제조 시 필요한 탈탄산공정(decarboxylation) 및 증류 공정이 없어도 고순도의 카다베린 디카르복실산염을 생산할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
이상에서는 본 출원의 일 양태에 따른 카다베린 디카르복실산염 (카다베린 세바스산염, 카다베린 운데칸디오익산염 또는 카다베린 도데칸디오익산염) 제조 공정에 대하여 살펴보았다. 이하에서는 카다베린 세바스산염, 카다베린 운데칸디오익산염 또는 카다베린 도데칸디오익산염 각각의 실시예와 비교예 실험 결과를 통해 본 출원에서 언급하는 유리한 효과에 대하여 살펴보고자 한다.
1. 카다베린 세바스산염
제조예 1-1. 라이신 세바스산염 생산 발효 공정
라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(KCCM12154P, 공개번호 US 2021-0355514 A1)를 고체상 배양, 플라스크 배양을 통해 종균을 확보하고, 발효조에서 종균배양(seed culture) 후 본 생산 발효를 수행하였다. 발효는 36℃에서 63시간 동안, 900 rpm으로 발효조 배양을 통해 수행되었다.
코리네박테리움을 활용한 라이신 세바스산염 생산을 위하여, 기존의 황산암모늄을 대체하기 위한 암모늄 세바스산염은 실시예마다 92 - 94 g/L 수준으로 공급하였고, 탄소원/질소원 균형을 유지하기 위하여 배양 배지에 포함되는 탄소원의 농도는 1.2 몰로 낮춰 공급한 반복 유가식 발효를 실시한 결과 136-139 g/L수준의 라이신세바스산염을 수득하였으며, 68 g/L 수준의 라이신을 수득하였다. 이 때, 실시예에서 발효공정액 상의 세바스산/라이신 몰 비는 0.83 내지 0.85 수준으로 조정되었다.
제조예 1-2. 라이신 세바스산염의 카다베린 세바스산염으로의 전환 반응
전환반응에는 슈도모나스 써모톨러란스(Pseudomonas thermotolerans) 유래 라이신 디카르복실라제 유전자인 PtLDC 효소를 pET-Deut1 벡터로 과발현시킨 대장균(미국 공개특허 US 2018-0030430 A1)을 사용하였다.
상기 제조예 1-1로부터 만들어진 라이신 세바스산염의 발효공정액에 상기 효소균주로 종균배양을 진행한 효소전환액을 공정액에 질량백분율을 기준으로 10% 수준으로 공급하여 전환반응을 수행하였다. 전환반응 온도는 45~50℃수준으로 유지하였으며, pH는 8.0 내지 8.5로 조정하였으며, 이를 위해 하기 실시예 1-1 내지 1-4의 경우, CO2를 투입하여 중화하였다. 한편, 실시예 1-2 내지 1-6은 전환반응 전 세바스산을 0.01 내지 0.06 mol/L 수준(라이신 세바스산염의 발효공정액 부피 기준)으로 추가 투입하였다. 그 결과, 카다베린 세바스산염의 전환율은 97~98% 수준임을 확인하였다. 구체적으로, 전환반응 후 119 - 140 g/L(라이신 세바스산염의 발효공정액 부피 기준) 수준의 카다베린 세바스산염을 수득하였고, 47 g/L 수준(라이신 세바스산염의 발효공정액 부피 기준) 의 카다베린을 수득하였다. 이후 실시예 1-5 및 1-6은 세바스산을 0.02 내지 0.05 mol/L 수준(라이신 세바스산염의 발효공정액 부피 기준)으로 추가 투입하였다.
제조예 1-3. 카다베린 세바스산염 수득 후 후속 공정
제조예 1-2에서 수득한 카다베린 세바스산염을 포함하는 공정액에 대하여 다음과 같은 후속 공정을 수행하여 결정 형태의 카다베린 세바스산염을 수득하였다.
[균체 제거 단계]
카다베린 세바스산염 공정액내의 균체를 0.1μm 사이즈의 막분리(membrane filtration)를 수행하여 제거 하였다.
[활성탄을 활용하여 불순물을 제거하는 단계]
균체 분리된 여과액내 카다베린 세바스산염 중량 기준 10% 수준으로 활성탄을 첨가한다. 활성탄을 첨가한 공정액을 60℃로 가온하여 1hr 동안 교반 시켜 탈색시킨 후 여과지를 통하여 활성탄을 여과시켰다.
[불순물이 제거된 카다베린 세바스산염 공정액을 농축 하는 단계]
위에 여과된 액을 회전식 증발기에서 여과액의 고형분 함량이 중량 기준 50%가 될 때까지 약 55~70℃, 120Torr에서 감압 농축하였다.
[카다베린 세바스산염 농축액을 냉각 결정화 및 분리 후 건조하는 단계]
상기 농축액을 50℃에서 25℃까지 1℃/hr속도로 냉각하였다. 석출된 결정은 원심분리기를 이용하여 모액과 분리시켰다. 결정은 카다베린 세바스산염 중량 기준 10%의 물로 수세되었다. 분리된 결정은 하루 동안 건조된 후 순도는 HPLC로 측정되었다.
[모액을 결정화 단계로 재순환하는 단계]
위에 분리된 모액은 불순물이 제거된 카다베린 세바스산염 공정액을 농축 하는 단계로 재순환되었다.
실험예 1-1. 카다베린 세바스산염 전환액 내 세바스산염과 카다베린의 몰비(molar ratio)에 따른 카다베린 세바스산염 순도 및 수율 변화 확인
실험예 1-1에서는 제조예 1-1 내지 1-3에 따른 방법을 이용하되 카다베린 세바스산염 전환액 내 세바스산염과 카다베린의 몰비(molar ratio)에 따라 카다베린 세바스산염의 순도, 수율이 어떻게 변화하는지 확인하였다.
실시예 1-1: 첨가되는 세바스산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 0.85인 경우
세바스산염/카다베린 몰비가 0.85인 카다베린 세바스산염 전환액 1,000ml를 공급받아 0.1μm 사이즈의 막을 통과시켜 미생물을 제거하였다. 세바스산염/카다베린 몰비가 0.85인 카다베린 세바스산염 전환액은 제조예 1-1과 제조예 1-2의 제조 방법을 따르되, 제조예 1-1. 라이신을 생산하기 위한 발효 공정에서 투입한 암모늄 세바스산염 중 세바스산염 투입양과 제조예 1-2. 카다베린 세바스산염 전환 반응에서 투입한 세바스산염 투입양의 도합이, 전환 완료된 카다베린의 몰 수의 0.85만큼 될 수 있도록 제어하여 제조하였다.
여과액은 활성탄을 사용하여 탈색한 후 여과지로 여과시킨 후 감압 농축 하 고형분 함량 중량 기준 50%수준으로 농축시켰다. 농축액은 50℃에서 25℃까지 냉각 결정화되었다. 원심분리를 통해 결정과 모액은 분리되었고, 분리된 결정은 하루 동안 건조한 후 순도는 HPLC로 측정되었다. 세바스산염이 잔류하고 있는 모액은 세바스산염/카다베린 몰비가 0.85인 카다베린 세바스산염 공급액으로 재순환된 후 다시 결정화 단계를 진행하였다. 모액의 재순환은 순차적으로 진행되었다.
실시예 1-2: 첨가되는 세바스산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 0.89인 경우
세바스산염/카다베린 몰비가 0.89인 카다베린 세바스산염 전환액을 공급받아 실시예 1-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
실시예 1-3: 첨가되는 세바스산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 0.96인 경우
세바스산염/카다베린 몰비가 0.96인 카다베린 세바스산염 전환액을 공급받아 실시예 1-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
실시예 1-4: 첨가되는 세바스산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 1.0인 경우
세바스산염/카다베린 몰비가 1.0인 카다베린 세바스산염 전환액을 공급받아 실시예 1-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
실시예 1-3 내지 1-4의 경우, 라이신 발효 단계에서의 세바스산/라이신의 몰 비가 0.85이 되도록 조정되었다.
실시예 1-5: 첨가되는 세바스산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 1.04인 경우
세바스산염/카다베린 몰비가 1.04인 카다베린 세바스산염 전환액을 공급받아 실시예 1 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
실시예 1-6: 첨가되는 세바스산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 몰비가 1.11인 경우
세바스산염/카다베린 몰비가 1.11인 카다베린 세바스산염 전환액을 공급받아 실시예 1-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
상술한 실시예 1-1 내지 1-6에 따라 제조된 공정액 및 카다베린 세바스산염에 대한 물성측정치는 다음 표 1 내지 5와 같다.
표 1은 모액을 순환하지 않은 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 없음 실시예1-1 실시예1-2 실시예 1-3 실시예 1-4 실시예 1-5 실시예 1-6
세바스산/카다베린 몰 비율 0.85 0.89 0.96 1 1.04 1.11
결정화 공급액
신규 공급액, ml 1000 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g 166 166 166 166 166 166
생성된 결정 내 카다베린 양, g 결정 미생성 35 37 40 35 31
모액 내 카다베린 양, g - 131 129 127 131 135
결과
순도, % - 98 99 99 86 73
수율, % - 21 22 24 21 19
총 수율, % - 21 22 24 21 19
표 2는 모액을 1회 순환한 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 1회 실시예 1-1 실시예 1-2 실시예 1-3 실시예 1-4 실시예 1-5 실시예 1-6
세바스산/카다베린 몰 비율 0.85 0.89 0.96 1 1.04 1.11
결정화 공급액
신규 공급액, ml - 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g - 297 295 293 297 301
생성된 결정 내 카다베린, g - 62 66 70 63 56
모액 내 카다베린, g - 235 229 223 234 245
결과
순도, % - 98 98 99 88 78
수율, % - 21 22 24 21 19
총 수율, % - 38 40 42 38 34
표 3은 모액을 2회 순환한 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 2회 실시예 1-1 실시예 1-2 실시예 1-3 실시예 1-4 실시예 1-5 실시예 1-6
세바스산/카다베린 몰 비율 0.85 0.89 0.96 1 1.04 1.11
결정화 공급액
신규 공급액, ml - 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g - 401 395 389 400 411
생성된 결정 내 카다베린 양, g - 84 89 93 85 77
모액 내 카다베린 양, g - 317 306 297 315 334
결과
순도, % - 98 99 99 90 81
수율, % - 21 22 24 21 19
총 수율, % - 51 53 56 51 46
표 4는 모액을 3회 순환한 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 3회 실시예 1-1 실시예 1-2 실시예 1-3 실시예 1-4 실시예 1-5 실시예 1-6
세바스산/카다베린 몰 비율 0.85 0.89 0.96 1 1.04 1.11
결정화 공급액
신규 공급액, ml - 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g - 483 472 463 481 500
생성된 결정 내 카다베린 양, g - 101 106 110 102 94
모액 내 카다베린 양, g - 382 366 353 379 406
결과
순도, % - 98 99 99 91 84
수율, % - 21 22 24 21 19
총 수율, % - 61 64 66 62 56
표 5는 모액을 4회 순환한 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 4회 실시예 1-1 실시예 1-2 실시예 1-3 실시예 1-4 실시예 1-5 실시예 1-6
세바스산/카다베린 몰 비율 0.85 0.89 0.96 1 1.04 1.11
결정화 공급액
신규 공급액, ml - 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g - 548 532 519 545 572
생성된 결정 내 카다베린 양, g - 결정 미생성 120 123 116 107
모액 내 카다베린 양, g - - 413 395 429 465
결과
순도, % - - 99 99 92 85
수율, % - - 22 24 21 19
총 수율, % - - 72 74 70 65
위의 표 1 내지 표 5에 따른 실험 결과를 종합하면, 제1 단계의 디암모늄 세바스산염을 전체 공급되는 세바스산의 78-100몰% 수준으로 다량 포함시킨, 본 출원 제조 방법을 통해, 전반적으로 향상된 결정화율, 고순도 및 고수율의 카다베린 세바스산염의 제조가 가능함을 확인하였다.
보다 구체적으로, 실시예 1-1의 경우 결정화 공정을 진행하여도 결정이 석출되지 않았다. 이는 세바스산염의 몰비가 낮아 카다베린 세바스산염의 결정이 석출되기 충분치 않기 때문이다.
실시예 1-2는 모액순환 3회차까지는 결정이 석출되었으나, 4회차 진행 시 결정이 생성되지 않았다. 이는 순차적으로 순환된 모액이 결정화 공급액에 세바스산염의 몰비를 낮췄고, 이에 따라 세바스산염의 농도가 카다베린 세바스산염의 결정을 석출하기 충분치 않았기 때문이다.
실시예 1-5은 모액 미순환 시 결정의 순도가 86%로 다소 낮았으나, 모액순환 4회차 진행 시 순도가 92%로 증가하였다.
실시예 1-6는 모액 미순환 시 결정의 순도가 73%로 낮았으나, 모액순환 4회차 진행 시 순도가 81%로 증가하였다.
반면, 실시예 1-3은 모액순환 4회차까지 99% 고순도 카다베린 세바스산염을 수득하였으며, 약 72%의 높은 총 수율을 달성할 수 있었다.
실시예 1-4는 모액순환 4회차까지 99% 고순도 카다베린 세바스산염을 수득하였으며, 약 74%의 높은 총 수율을 달성할 수 있었다.
이와 같이 카다베린 전환 공정 후 공급된 전환액(공정액) 내 세바스산과 카다베린의 몰 비율에 따라 고순도의 카다베린 세바스산염의 제조방법을 제공할 수 있음을 확인하였다. 특히 첨가되는 세바스산의 양이 상기 제2 단계 이후 공정액 내 카다베린 양 대비 약 0.84 내지 0.86의 몰 비로 조정될 때, 모액 순환 2회 이상에서도 99%의 카다베린 세바스산염 순도를 유지하면서도 53% 이상의 우수한 총 수율을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
2. 카다베린 운데칸디오익산염
제조예 2-1. 라이신 운데칸디오익산염 생산 발효 공정
라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(KCCM12154P, 미국특허공개번호 US 2021-0355514 A1)를 고체상 배양, 플라스크 배양을 통해 종균을 확보하고, 발효조에서 종균배양(seed culture) 후 본 생산 발효를 수행하였다. 발효는 36℃에서 30시간 동안, 900 rpm으로 발효조 배양을 통해 수행되었다.
도 5는 상술한 제조예 방법에 따라 암모늄 운데칸디오익산염을 활용하여 미생물 발효를 통해 라이신 운데칸디오익산염을 생산한 결과를 나타낸 그래프이다. 코리네박테리움을 활용한 라이신 운데칸디오익산염 생산을 위하여, 기존의 황산암모늄을 대체하기 위한 암모늄 운데칸디오익산염은 실시예마다 88 - 100 g/L 수준으로 공급하였고, 탄소원/질소원 균형을 유지하기 위하여 배양 배지에 포함되는 탄소원의 농도는 1.2 몰로 낮춰 공급한 반복 유가식 발효를 실시한 결과 127 - 145 g/L 수준의 라이신 운데칸디오익산염을 수득하였으며, 66 g/L수준의 라이신을 수득하였다. 이 때, 실시예에서 발효공정액 상의 운데칸디오익산/라이신 몰 비는 0.78 내지 0.89 수준으로 조정되었다.
제조예 2-2. 라이신 운데칸디오익산염의 카다베린 운데칸디오익산염으로의 전환 반응
전환반응에는 슈도모나스 써모톨러란스(Pseudomonas thermotolerans) 유래 라이신 디카르복실라제 유전자인 PtLDC 효소를 pET-Deut1 벡터로 과발현시킨 대장균(미국 공개특허 US 2018-0030430 A1)을 사용하였다.
상기 제조예 2-1로부터 만들어진 라이신 운데칸디오익산염의 발효공정액에 상기 효소균주로 종균배양을 진행한 효소전환액을 공정액에 질량백분율을 기준으로 10% 수준으로 공급하여 전환반응을 수행하였다. 전환반응 온도는 45~50℃수준으로 유지하였으며, pH는 8.0 내지 8.5로 조정하였으며, 이를 위해 하기 실시예 2-1 내지 2-4의 경우, CO2를 투입하여 중화하였다. 한편, 실시예 2-2 내지 2-4는 전환반응 전 0.02 내지 0.04 mol/L 수준(라이신 운데칸디오익산염의 발효공정액 부피 기준)으로 운데칸디오익산을 추가 투입하였다. 그 결과, 카다베린 운데칸디오익산염의 전환율은 97~98% 수준임을 확인하였다. 전환반응 후 111 - 140 g/L(라이신 운데칸디오익산염의 발효공정액 부피 기준) 수준의 카다베린 운데칸디오익산염을 수득하였고, 45 g/L 수준(라이신 운데칸디오익산염의 발효공정액 부피 기준) 의 카다베린을 수득하였다. 이후 실시예 2-5 및 2-6의 경우, 0.06 내지 0.08mol/L 수준으로 운데칸디오익산을 추가 투입하여 공정액을 제조하였다.
제조예 2-3. 카다베린 운데칸디오익산염 수득 후 후속 공정
제조예 2-2에서 수득한 카다베린 운데칸디오익산염을 포함하는 공정액에 대하여 다음과 같은 후속 공정을 수행하여 결정 형태의 카다베린 운데칸디오익산염을 수득하였다.
[균체 제거 단계]
카다베린 운데칸디오익산염 공정액내의 균체를 0.1μm 사이즈의 막분리(membrane filtration)를 수행하여 제거하였다.
[활성탄을 활용하여 불순물을 제거하는 단계]
균체 분리된 여과액내 카다베린 운데칸디오익산염 중량 기준 10% 수준으로 활성탄을 첨가한다. 활성탄을 첨가한 공정액을 60℃로 가온하여 1hr 동안 교반 시켜 탈색시킨 후 여과지를 통하여 활성탄을 여과시켰다.
[불순물이 제거된 카다베린 운데칸디오익산염 공정액을 농축하는 단계]
위에 여과된 액을 회전식 증발기에서 여과액의 고형분 함량이 중량 기준 65%가 될 때가지 약 55~70℃, 120Torr에서 감압 농축하였다.
[카다베린 운데칸디오익산염 농축액을 냉각 결정화 및 분리 후 건조하는 단계]
상기 농축액을 50℃에서 10℃까지 1℃/hr속도로 냉각하였다. 석출된 결정은 원심분리기를 이용하여 모액과 분리시켰다. 결정은 카다베린 운데칸디오익산염 중량 기준 10%의 물로 수세되었다. 분리된 결정은 하루 동안 건조된 후 순도는 HPLC로 측정되었다.
[모액을 결정화 단계로 재순환하는 단계]
위에 분리된 모액은 불순물이 제거된 카다베린 운데칸디오익산염 공정액을 농축하는 단계로 재순환되었다.
실험예 2-1. 카다베린 운데칸디오익산염 전환액 내 운데칸디오익산염과 카다베린의 몰비(molar ratio)에 따른 카다베린 운데칸디오익산염 순도 및 수율 변화 확인
실험예 2-1에서는 제조예 2-1 내지 2-3에 따른 방법을 이용하되 카다베린 운데칸디오익산염 전환액 내 운데칸디오익산염과 카다베린의 몰비(molar ratio)에 따라 카다베린 운데칸디오익산염의 순도, 수율이 어떻게 변화하는지 확인하였다.
실시예 2-1: 첨가되는 운데칸디오익산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 0.79인 경우
운데칸디오익산/카다베린 몰비가 0.79인 카다베린 운데칸디오익산염 전환액 1,000ml를 공급받아 0.1μm 사이즈의 막을 통과시켜 미생물을 제거하였다. 운데칸디오익산/카다베린 몰비가 0.79인 카다베린 운데칸디오익산염 전환액은 제조예 2-1과 제조예 2-2의 제조 방법을 따르되, 제조예 2-1의 라이신을 생산하기 위한 발효 공정에서 투입한 암모늄 운데칸디오익산염 중 운데칸디오익산염 투입양과 제조예 2-2의 카다베린 운데칸디오익산염 전환 반응에서 투입한 운데칸디오익산염 투입양의 도합이, 전환 완료된 카다베린의 몰 수의 0.79만큼 될 수 있도록 제어하여 제조하였다.
여과액은 활성탄을 사용하여 탈색한 후 여과지로 여과시킨 후 감압 농축하 고형분 함량 65%수준으로 농축시켰다. 농축액은 50℃에서 10℃까지 냉각 결정화되었다. 원심분리를 통해 결정과 모액은 분리되었고, 분리된 결정은 하루 동안 건조한 후 순도는 HPLC로 측정되었다. 운데칸디오익산염이 잔류하고 있는 모액은 운데칸디오익산/카다베린 몰비가 0.79인 카다베린 운데칸디오익산염 공급액으로 재순환된 후 다시 결정화 단계를 진행하였다. 모액의 재순환은 순차적으로 진행되었다.
실시예 2-2: 첨가되는 운데칸디오익산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 0.91인 경우
운데칸디오익산/카다베린 몰비가 0.91인 카다베린 운데칸디오익산염 전환액을 공급받아 실시예 2-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
실시예 2-3: 첨가되는 운데칸디오익산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 0.95인 경우
운데칸디오익산/카다베린 몰비가 0.95인 카다베린 운데칸디오익산염 전환액을 공급받아 실시예 2-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
실시예 2-4: 첨가되는 운데칸디오익산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 1.0인 경우
운데칸디오익산/카다베린 몰비가 1.0인 카다베린 운데칸디오익산염 전환액을 공급받아 실시예 2-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
실시예 2-3 내지 2-4의 경우, 라이신 발효 단계에서의 운데칸디오익산/라이신의 몰 비가 0.89이 되도록 조정되었다.
실시예 2-5: 첨가되는 운데칸디오익산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 1.04인 경우
운데칸디오익산/카다베린 몰비가 1.04인 카다베린 운데칸디오익산염 전환액을 공급받아 실시예 2-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
실시예 2-6: 첨가되는 운데칸디오익산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 1.09인 경우
운데칸디오익산/카다베린 몰비가 1.09인 카다베린 운데칸디오익산염 전환액을 공급받아 실시예 2-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
상술한 실시예 2-1 내지 2-6에 따라 제조된 공정액 및 카다베린 운데칸디오익산염에 대한 물성측정치는 다음 표 6 내지 11과 같다.
표 6은 모액을 순환하지 않은 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 없음 실시예 2-1 실시예 2-2 실시예 2-3 실시예 2-4 실시예 2-5 실시예 2-6
운데칸디오익산/카다베린 몰 비율 0.79 0.91 0.95 1.0 1.04 1.09
결정화 공급액
신규 공급액, ml 1000 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g 113 113 113 113 113 113
생성된 결정 양, g 109 119 124 127 132 136
모액 내 카다베린 양, g 78 75 73 72 75 77
결과
순도, % 99 99 99 99 91 82
수율, % 31 34 35 36 34 32
총 수율, % 31 34 35 36 34 32
표 7은 모액을 1회 순환한 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 1회 실시예 2-1 실시예 2-2 실시예 2-3 실시예 2-4 실시예 2-5 실시예 2-6
운데칸디오익산/카다베린 몰 비율 0.79 0.91 0.95 1.0 1.04 1.09
결정화 공급액
신규 공급액, ml 1000 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g 191 188 187 185 188 190
생성된 결정 양, g 178 195 203 209 227 245
모액 내 카다베린 양, g 134 125 122 118 119 119
결과
순도, % 99 100 99 99 93 87
수율, % 30 33 35 36 37 37
총 수율, % 41 45 46 48 47 47
표 8은 모액을 2회 순환한 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 2회 실시예 2-1 실시예 2-2 실시예 2-3 실시예 2-4 실시예 2-5 실시예 2-6
운데칸디오익산/카다베린 몰 비율 0.79 0.91 0.95 1.0 1.04 1.09
결정화 공급액
신규 공급액, ml 1000 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g 247 239 235 232 232 233
생성된 결정 양, g 219 243 253 261 277 293
모액 내 카다베린 양, g 177 160 154 148 147 146
결과
순도, % 99 99 99 99 94 89
수율, % 28 33 35 36 37 37
총 수율, % 48 53 55 56 57 57
표 9는 모액을 3회 순환한 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 3회 실시예 2-1 실시예 2-2 실시예 2-3 실시예 2-4 실시예 2-5 실시예 2-6
운데칸디오익산/카다베린 몰 비율 0.79 0.91 0.95 1.0 1.04 1.09
결정화 공급액
신규 공급액, ml 1000 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g 290 274 267 261 260 259
생성된 결정 양, g 243 274 385 294 309 323
모액 내 카다베린 양, g 212 186 176 167 165 163
결과
순도, % 99 99 100 100 95 90
수율, % 27 323 34 36 37 37
총 수율, % 53 59 61 63 64 64
표 10는 모액을 4회 순환한 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 4회 실시예 2-1 실시예 2-2 실시예 2-3 실시예 2-4 실시예 2-5 실시예 2-6
운데칸디오익산/카다베린 몰 비율 0.79 0.91 0.95 1.0 1.04 1.09
결정화 공급액
신규 공급액, ml 1000 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g 326 299 289 280 278 277
생성된 결정 양, g 256 292 305 315 329 343
모액 내 카다베린 양, g 243 205 19 179 177 174
결과
순도, % 99 99 99 100 95 91
수율, % 25 31 34 36 37 37
총 수율, % 57 64 66 68 69 69
표 11은 모액을 5회 순환한 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 5회 실시예 2-1 실시예 2-2 실시예 2-3 실시예 2-4 실시예 2-5 실시예 2-6
운데칸디오익산/카다베린 몰 비율 0.79 0.91 0.95 1.0 1.04 1.09
결정화 공급액
신규 공급액, ml 1000 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g 357 318 304 292 290 288
생성된 결정 양, g 262 304 318 329 342 355
모액 내 카다베린 양, g 273 221 202 186 184 181
결과
순도, % 99 100 99 100 96 92
수율, % 24 31 34 36 37 37
총 수율, % 60 68 70 73 73 73
위의 표 1 내지 표 6에 따른 실험 결과를 종합하면, 제1 단계의 디암모늄 운데칸디오익산염을 전체 공급되는 운데칸디오익산의 83-100몰% 수준으로 다량 포함시킨, 본 출원 제조 방법을 통해, 전반적으로 향상된 결정화율, 고순도 및 고수율의 카다베린 운데칸디오익산염의 제조가 가능함을 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2-1의 경우 99% 고순도 카다베린 운데칸디오익산염을 수득하였으나, 모액 순환 5회차까지 총 수율 62%로 낮은 수율을 달성하였다. 이는 운데칸디오익산염의 몰비가 낮아 카다베린 운데칸디오익산염의 결정이 석출되기 충분치 않기 때문이다.
실시예 2-2는 모액순환 99% 고순도 카다베린 운데칸디오익산염을 수득하였으나, 모액 순환 5회차까지 총 수율 67%로 낮은 수율을 달성하였다. 이는 운데칸디오익산염의 몰비가 낮아 카다베린 운데칸디오익산염의 결정이 석출되기 충분치 않기 때문이다.
실시예 2-5은 모액 미순환 시 결정의 순도가 91%로 다소 낮았으나, 모액순환 5회차 진행 시 순도가 96%로 증가하였다.
실시예 2-6은 모액 미순환 시 결정의 순도가 82%로 낮았으나, 모액순환 5회차 진행 시 순도가 92%로 증가하였다.
실시예 2-3은 모액순환 5회차까지 99% 고순도 카다베린 운데칸디오익산염을 수득하였으며, 총 수율도 약 70%의 고수율을 달성할 수 있었다.
실시예 2-4는 모액순환 5회차까지 99% 고순도 카다베린 운데칸디오익산염을 수득하였으며, 총 수율도 약 73%의 고수율을 달성할 수 있었다.
이와 같이 카다베린 전환 공정 후 공급된 전환액(공정액) 내 운데칸디오익산과 카다베린의 몰 비율에 따라 제조된 카다베린 운데칸디오익산염의 순도가 달라질 수 있음을 확인하였다. 특히 첨가되는 운데칸디오익산의 양이 상기 제2 단계 이후 공정액 내 카다베린 양 대비 약 0.95 내지 1.00의 몰 비로 조정될 때, 모액 순환 2회 이상에서도 99%의 카다베린 운데칸디오익산염 순도를 유지하면서도 55% 이상의 우수한 총 수율을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
3. 카다베린 도데칸디오익산염
제조예 3-1. 라이신 도데칸디오익산염 생산 발효 공정
라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(KCCM12154P, 미국특허공개번호 US 2021-0355514 A1)를 고체상 배양, 플라스크 배양을 통해 종균을 확보하고, 발효조에서 종균배양(seed culture) 후 본 생산 발효를 수행하였다. 발효는 36℃에서 30시간 동안, 900 rpm으로 발효조 배양을 통해 수행되었다.
코리네박테리움을 활용한 라이신 생산을 위하여, 기존의 황산암모늄을 대체하기 위한 암모늄 도데칸디오익산염은 실시예마다 93-106 g/L 수준으로 공급하였고, 탄소원/질소원 균형을 유지하기 위하여 배양 배지에 포함되는 탄소원의 농도는 1.2 몰로 낮춰 공급한 반복 유가식 발효를 실시한 결과 132- 151 g/L 수준의 라이신 도데칸디오익산염을 수득하였으며, 61 g/L수준의 라이신을 수득하였다. 이 때, 실시예에서 발효공정액 상의 도데칸디오익산/라이신 몰 비는 0.83 내지 0.95 수준으로 조정되었다.
제조예 3-2. 라이신 도데칸디오익산염의 카다베린 도데칸디오익산염으로의 전환 반응
전환반응에는 슈도모나스 써모톨러란스(Pseudomonas thermotolerans) 유래 라이신 디카르복실라제 유전자인 PtLDC 효소를 pET-Deut1 벡터로 과발현시킨 대장균(미국 공개특허 US 2018-0030430 A1)을 사용하였다.
상기 제조예 3-1로부터 만들어진 라이신 도데칸디오익산염의 발효공정액에 상기 효소균주로 종균배양을 진행한 효소전환액을 공정액에 질량백분율을 기준으로 10% 수준으로 공급하여 전환반응을 수행하였다. 전환반응 온도는 45~50℃ 수준으로 유지하였으며, pH는 8.0 내지 8.5로 조정하였으며, 이를 위해 하기 실시예 3-1 내지 3-4의 경우, CO2를 투입하여 중화하였다. 한편, 실시예 3-2 내지 3-4는 전환반응 전 도데칸디오익산을 0.01 mol/L 수준(라이신 도데칸디오익산염의 발효공정액 부피 기준)으로 추가 투입하였다. 그 결과, 카다베린 도데칸디오익산염의 전환율은 97~98% 수준임을 확인하였다. 구체적으로, 전환반응 후 116 - 136 g/L(라이신 도데칸디오익산염의 발효공정액 부피 기준) 수준의 카다베린 도데칸디오익산염을 수득하였고, 42 g/L 수준(라이신 도데칸디오익산염의 발효공정액 부피 기준) 의 카다베린을 수득하였다. 이후 실시예 3-5 및 3-6의 경우, 0.03 내지 0.05 mol/L 수준(라이신 도데칸디오익산염의 발효공정액 부피 기준)으로 도데칸디오익산을 추가 투입하여 공정액을 제조하였다.
제조예 3-3. 카다베린 도데칸디오익산염 수득 후 후속 공정
제조예 3-2에서 수득한 카다베린 도데칸디오익산염을 포함하는 공정액에 대하여 다음과 같은 후속 공정을 수행하여 결정 형태의 카다베린 도데칸디오익산염을 수득하였다.
[균체 제거 단계]
카다베린 도데칸디오익산염 공정액내의 균체를 0.1μm 사이즈의 막분리(membrane filtration)를 수행하여 제거 하였다.
[활성탄을 활용하여 불순물을 제거하는 단계]
균체 분리된 여과액내 카다베린 도데칸디오익산염 중량 기준 10% 수준으로 활성탄을 첨가한다. 활성탄을 첨가한 공정액을 60℃로 가온하여 1hr 동안 교반 시켜 탈색시킨 후 여과지를 통하여 활성탄을 여과시켰다.
[불순물이 제거된 카다베린 도데칸디오익산염 공정액을 농축 하는 단계]
위에 여과된 액을 회전식 증발기에서 여과액의 고형분 함량이 중량 기준 50%가 될 때가지 약 55~70℃, 120Torr에서 감압 농축하였다.
[카다베린 도데칸디오익산염 농축액을 냉각 결정화 및 분리 후 건조하는 단계]
상기 농축액을 50℃에서 10℃까지 1℃/hr속도로 냉각하였다. 석출된 결정은 원심분리기를 이용하여 모액과 분리시켰다. 결정은 카다베린 도데칸디오익산염 중량 기준 10%의 물로 수세되었다. 분리된 결정은 하루 동안 건조된 후 순도는 HPLC로 측정되었다.
[모액을 결정화 단계로 재순환하는 단계]
위에 분리된 모액은 불순물이 제거된 카다베린 도데칸디오익산염 공정액을 농축 하는 단계로 재순환되었다.
실험예 3-1. 카다베린 도데칸디오익산염 전환액 내 도데칸디오익산염과 카다베린의 몰비(molar ratio)에 따른 카다베린 도데칸디오익산염 순도 및 수율 변화 확인
실험예 3-1에서는 제조예 3-1 내지 3-3에 따른 방법을 이용하되 카다베린 도데칸디오익산염 전환액 내 도데칸디오익산염과 카다베린의 몰비(molar ratio)에 따라 카다베린 도데칸디오익산염의 순도, 수율이 어떻게 변화하는지 확인하였다.
실시예 3-1: 첨가되는 도데칸디오익산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 0.85인 경우
도데칸디오익산염/카다베린 몰비가 0.85인 카다베린 도데칸디오익산염 전환액 1,000ml를 공급받아 0.1μm 사이즈의 막을 통과시켜 미생물을 제거하였다. 도데칸디오익산염/카다베린 몰비가 0.85인 카다베린 도데칸디오익산염 전환액은 제조예 3-1과 제조예 3-2의 제조 방법을 따르되, 제조예 3-1. 라이신을 생산하기 위한 발효 공정에서 투입한 암모늄 도데칸디오익산염 중 도데칸디오익산염 투입양과 제조예 3-2. 카다베린 도데칸디오익산염 전환 반응에서 투입한 도데칸디오익산염 투입양의 도합이, 전환 완료된 카다베린의 몰 수의 0.85만큼 될 수 있도록 제어하여 제조하였다.
여과액은 활성탄을 사용하여 탈색한 후 여과지로 여과시킨 후 감압 농축 하 고형분 함량 50%수준으로 농축시켰다. 농축액은 50℃에서 10℃까지 냉각 결정화되었다. 원심분리를 통해 결정과 모액은 분리되었고, 분리된 결정은 하루 동안 건조한 후 순도는 HPLC로 측정되었다. 도데칸디오익산염이 잔류하고 있는 모액은 도데칸디오익산염/카다베린 몰비가 0.85인 카다베린 도데칸디오익산염 공급액으로 재순환된 후 다시 결정화 단계를 진행하였다. 모액의 재순환은 순차적으로 진행되었다.
실시예 3-2: 첨가되는 도데칸디오익산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 0.9인 경우
도데칸디오익산염/카다베린 몰비가 0.9인 카다베린 도데칸디오익산염 전환액을 공급받아 실시예 3-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
실시예 3-3: 첨가되는 도데칸디오익산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 0.95인 경우
도데칸디오익산염/카다베린 몰비가 0.95인 카다베린 도데칸디오익산염 전환액을 공급받아 실시예 3-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
실시예 3-4: 첨가되는 도데칸디오익산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 1.0인 경우
도데칸디오익산염/카다베린 몰비가 1.0인 카다베린 도데칸디오익산염 전환액을 공급받아 실시예 3-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
실시예 3-3 내지 3-4의 경우, 라이신 발효 단계에서의 도데칸디오익산/라이신의 몰 비가 0.9-0.95이 되도록 조정되었다.
실시예 3-5: 첨가되는 도데칸디오익산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 1.04인 경우
도데칸디오익산염/카다베린 몰비가 1.04인 카다베린 도데칸디오익산염 전환액을 공급받아 실시예 3-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
실시예 3-6: 첨가되는 도데칸디오익산/제2단계 이후 공정액 내 카다베린 몰비가 1.09인 경우
도데칸디오익산염/카다베린 몰비가 1.09인 카다베린 도데칸디오익산염 전환액을 공급받아 실시예 3-1과 동일하게 모액은 순차적으로 재순환되며 정제공정을 진행하였다.
상술한 실시예 3-1 내지 3-6에 따라 제조된 공정액 및 카다베린 도데칸디오익산염에 대한 물성측정치는 다음 표 12 내지 16과 같다.
표 12는 모액을 순환하지 않은 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 없음 실시예 3-1 실시예 3-2 실시예 3-3 실시예 3-4 실시예 3-5 실시예 3-6
도데칸디오익산/카다베린 몰 비율 0.85 0.9 0.95 1 1.04 1.09
결정화 공급액
신규 공급액, ml 1000 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g 166 166 166 166 166 166
생성된 결정, g 결정 미생성 35 37 40 35 31
모액, g - 131 129 127 131 135
결과
순도, % - 98 99 99 86 73
수율, % - 21 22 24 21 19
총 수율, % - 21 22 24 21 19
표 13은 모액을 1회 순환한 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 1회 실시예 3-1 실시예 3-2 실시예 3-3 실시예 3-4 실시예 3-5 실시예 3-6
도데칸디오익산/카다베린 몰 비율 0.85 0.9 0.95 1 1.04 1.09
결정화 공급액
신규 공급액, ml - 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g - 297 295 293 297 301
생성된 결정, g - 62 66 70 63 56
모액, g - 235 229 223 234 245
결과
순도, % - 98 98 99 88 78
수율, % - 21 22 24 21 19
총 수율, % - 38 40 42 38 34
표 14는 모액을 2회 순환한 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 2회 실시예 3-1 실시예 3-2 실시예 3-3 실시예 3-4 실시예 3-5 실시예 3-6
도데칸디오익산/카다베린 몰 비율 0.85 0.9 0.95 1 1.04 1.09
결정화 공급액
신규 공급액, ml - 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g - 401 395 389 400 411
생성된 결정, g - 84 89 93 85 77
모액, g - 317 306 297 315 334
결과
순도, % - 98 99 99 90 81
수율, % - 21 22 24 21 19
총 수율, % - 51 53 56 51 46
표 15는 모액을 3회 순환한 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 3회 실시예 3-1 실시예 3-2 실시예 3-3 실시예 3-4 실시예 3-5 실시예 3-6
도데칸디오익산/카다베린 몰 비율 0.85 0.9 0.95 1 1.04 1.09
결정화 공급액
신규 공급액, ml - 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g - 483 472 463 481 500
생성된 결정, g - 101 106 110 102 94
모액, g - 382 366 353 379 406
결과
순도, % - 98 99 99 91 84
수율, % - 21 22 24 21 19
총 수율, % - 61 64 66 62 56
표 16은 모액을 4회 순환한 공정액에 대한 것이다.
모액 순환 4회 실시예 3-1 실시예 3-2 실시예 3-3 실시예 3-4 실시예 3-5 실시예 3-6
도데칸디오익산/카다베린 몰 비율 0.85 0.9 0.95 1 1.04 1.09
결정화 공급액
신규 공급액, ml - 1000 1000 1000 1000 1000
결정화액 내 카다베린 양, g - 548 532 519 545 572
생성된 결정, g - 결정 미생성 120 123 116 107
모액, g - - 413 395 429 465
결과
순도, % - - 99 99 92 85
수율, % - - 22 24 21 19
총 수율, % - - 72 74 70 65
위의 표 12 내지 표 16에 따른 실험 결과를 종합하면, 제1 단계의 디암모늄 도데칸디오익산염을 전체 공급되는 도데칸디오익산의 89-100몰% 수준으로 다량 포함시킨, 본 출원 제조 방법을 통해, 전반적으로 향상된 결정화율, 고순도 및 고수율의 카다베린 도데칸디오익산염의 제조가 가능함을 확인하였다.구체적으로, 실시예 3-1의 경우 결정화 공정을 진행하여도 결정이 석출되지 않았다. 이는 도데칸디오익산염의 몰비가 낮아 카다베린 도데칸디오익산염의 결정이 석출되기 충분치 않기 때문이다.
실시예 3-2은 모액순환 3회차까지는 결정이 석출되었으나, 4회차 진행 시 결정이 생성되지 않았다. 이는 순차적으로 순환된 모액이 결정화 공급액에 도데칸디오익산염의 몰비를 낮췄고, 이에 따라 도데칸디오익산염의 농도가 카다베린 도데칸디오익산염의 결정을 석출하기 충분치 않았기 때문이다.
실시예 3-5는 모액 미순환 시 결정의 순도가 86%로 다소 낮았으나, 모액순환 4회차 진행 시 순도가 92%로 증가하였다.
실시예 3-6은 모액 미순환 시 결정의 순도가 73%로 낮았으나, 모액순환 4회차 진행 시 순도가 81%로 증가하였다.
실시예 3-3은 모액순환 4회차까지 99% 고순도 카다베린 도데칸디오익산염을 수득하였으며, 총 수율도 약 72%의 고수율을 달성할 수 있었다.
실시예 3-4는 모액순환 4회차까지 99% 고순도 카다베린 도데칸디오익산염을 수득하였으며, 총 수율도 약 74%의 고수율을 달성할 수 있었다.
이와 같이 카다베린 전환 공정 후 공급된 전환액(공정액) 내 도데칸디오익산과 카다베린의 몰 비율에 따라 제조된 카다베린 도데칸디오익산염의 순도가 달라질 수 있음을 확인하였다. 특히 첨가되는 도데칸디오익산의 양이 상기 제2 단계 이후 공정액 내 카다베린 양 대비 약 0.95 내지 1.00의 몰 비로 조정될 때, 모액 순환 2회 이상에서도 99%의 카다베린 도데칸디오익산염 순도를 유지하면서도 53% 이상의 우수한 총 수율을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

  1. 디암모늄 디카르복실산염 형태로 디카르복실산이 첨가된 배지에서 L-라이신 생산 미생물을 배양하여 라이신 디카르복실산염을 수득하는 제1 단계; 및
    라이신 디카르복실산염을 카다베린 디카르복실산염으로 전환하는 제2 단계를 포함하는 카다베린 디카르복실산염 제조 방법으로,
    첨가되는 디카르복실산의 양은 상기 제2 단계 이후 공정액 내 카다베린 양 대비 0.90 내지 1.05 몰 비이고,
    상기 디카르복실산은 탄소수 10 내지 12개의 지방족 디카르복실산인,
    카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 전체 공급되는 디카르복실산의 81 몰% 이상으로 포함되는,
    카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 생산하고자 하는 라이신과의 몰 비(디암모늄 디카르복실산염/라이신)가 0.84 - 0.96이 되도록 포함되는, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 디카르복실산염 및 디카르복실산은 세바스산염 및 세바스산이고,
    상기 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 생산하고자 하는 라이신과의 몰 비 (디암모늄 디카르복실산염/라이신)가 0.84-0.86이 되도록 포함되는, 카다베린 디카르복실산염 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 디카르복실산염 및 디카르복실산은 운데칸디오익산염 및 운데칸디오익산이고,
    상기 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 생산하고자 하는 라이신과의 몰 비 (디암모늄 디카르복실산염/라이신)가 0.84-0.90이 되도록 포함되는, 카다베린 디카르복실산염 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 디카르복실산염 및 디카르복실산은 도데칸디오익산염 및 도데칸디오익산이고,
    상기 제1 단계의 디암모늄 디카르복실산염은 생산하고자 하는 라이신과의 몰 비 (디암모늄 디카르복실산염/라이신)가 0.86-0.96이 되도록 포함되는, 카다베린 디카르복실산염 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제2 단계의 전환반응은 pH는 8.0 내지 8.5에서 수행되는 것인, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 디카르복실산염 및 디카르복실산은 세바스산염 및 세바스산이고,
    첨가되는 디카르복실산의 양은 상기 제2 단계 이후 공정액 내 카다베린 양 대비 0.96 내지 1.00의 몰 비인, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 디카르복실산염 및 디카르복실산은 운데칸디오익산염 및 운데칸디오익산이고,
    첨가되는 디카르복실산의 양은 상기 제2 단계 이후 공정액 내 카다베린 양 대비 0.95 내지 1.00의 몰 비인, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 디카르복실산염 및 디카르복실산은 도데칸디오익산염 및 도데칸디오익산이고,
    첨가되는 디카르복실산의 양은 상기 제2 단계 이후 공정액 내 카다베린 양 대비 0.95 내지 1.00의 몰 비인, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 제2 단계는 공정액에 디카르복실산을 추가로 첨가하는 것을 포함하는, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 제2 단계 수행 후 카다베린 디카르복실산염을 회수하는 회수 단계를 더 포함하는, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 회수 단계는 여과 단계, 농축 단계 및 냉각결정화 단계로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 단계를 포함하는, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 회수 단계는
    상기 냉각 결정화 단계 이후 결정화되지 않은 카다베린 디카르복실산염을 포함하는 모액을 농축 단계의 공급액으로 재순환하는 모액 순환 단계를 더 포함하는, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 농축 단계는 고형분 함량이 45 - 70%(w/w)가 되도록 농축하는 것인, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 제2 단계에서, 라이신 디카르복실산염을 카다베린 디카르복실염으로 전환하는 것은 라이신 디카르복실라제 활성을 가지는 단백질 또는 상기 활성을 가지는 단백질을 발현하는 미생물을 이용하여 수행되는, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 L-라이신 생산 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 회수 단계에서 공정액 내 디카르복실산염 제거를 위한 별도 공정을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 모액의 순환 횟수 0 내지 4회차에서, 순도 98% 이상의 카다베린 디카르복실산염을 수득할 수 있는, 카다베린 디카르복실산염 제조 방법.
PCT/KR2024/006742 2023-06-28 2024-05-17 카다베린 디카르복실산염 제조 공정 WO2025005470A1 (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2023-0083690 2023-06-28
KR20230083690 2023-06-28
KR20230104708 2023-08-10
KR10-2023-0104708 2023-08-10
KR10-2023-0118424 2023-09-06
KR20230118424 2023-09-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025005470A1 true WO2025005470A1 (ko) 2025-01-02

Family

ID=93938826

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2024/006742 WO2025005470A1 (ko) 2023-06-28 2024-05-17 카다베린 디카르복실산염 제조 공정

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20250001419A (ko)
WO (1) WO2025005470A1 (ko)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090005099A (ko) * 2006-03-30 2009-01-12 바스프 에스이 카다베린의 제조 방법
KR20140012099A (ko) * 2011-02-22 2014-01-29 바스프 에스이 카다베린의 생산을 위한 방법 및 재조합 미생물
KR20160097691A (ko) * 2015-02-09 2016-08-18 씨제이제일제당 (주) 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법
KR20180053631A (ko) * 2018-05-15 2018-05-23 씨제이제일제당 (주) 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법
KR20220153598A (ko) * 2020-03-14 2022-11-18 모지아 바이오테크 리미티드 유기 및 무기 불순물이 감소된 바이오-기반 나일론 전구체

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1482055B1 (en) 2003-05-26 2006-03-01 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing cadaverine dicarboxylate and its use for the production of nylon

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090005099A (ko) * 2006-03-30 2009-01-12 바스프 에스이 카다베린의 제조 방법
KR20140012099A (ko) * 2011-02-22 2014-01-29 바스프 에스이 카다베린의 생산을 위한 방법 및 재조합 미생물
KR20160097691A (ko) * 2015-02-09 2016-08-18 씨제이제일제당 (주) 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법
KR20180053631A (ko) * 2018-05-15 2018-05-23 씨제이제일제당 (주) 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법
KR20220153598A (ko) * 2020-03-14 2022-11-18 모지아 바이오테크 리미티드 유기 및 무기 불순물이 감소된 바이오-기반 나일론 전구체

Also Published As

Publication number Publication date
KR20250001419A (ko) 2025-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019164348A1 (ko) 신규 l-트립토판 배출 단백질 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법
WO2012091479A2 (en) Methods for production of l-methionine and related products
WO2020204427A1 (ko) 신규 l-트립토판 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법
WO2021049866A1 (ko) L-쓰레오닌 배출 단백질의 변이체 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산 방법
WO2021150029A1 (ko) Nadp 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하는 미생물을 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
WO2017069578A1 (ko) L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 l-이소루신을 생산하는 방법
WO2012053794A2 (en) Microorganism producing o-phosphoserine and method of producing l-cysteine or derivatives thereof from o-phosphoserine using the same
WO2021167414A1 (ko) 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법
WO2020226341A1 (ko) L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산을 생산하는 방법
WO2021261733A1 (ko) L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 신규 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산 방법
WO2022163951A1 (ko) 신규한 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법
WO2013085361A2 (ko) 4-하이드록시부티릭산 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 4-하이드록시부티릭산의 제조방법
EP4457216A1 (en) Method for preparation of benzimidazole derivatives
WO2019017706A2 (ko) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
WO2025005470A1 (ko) 카다베린 디카르복실산염 제조 공정
WO2019117612A1 (ko) 대사공학적으로 조작된 미생물을 이용한 헴의 세포외 생산방법
WO2022225075A1 (ko) 신규한 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022164118A1 (ko) 프리페네이트 탈수 효소 변이체 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산 방법
WO2025005469A1 (ko) 카다베린 디카르복실산염 제조 공정
WO2025005468A1 (ko) 카다베린 디카르복실산염 제조 공정
WO2022231036A1 (ko) 신규한 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
WO2022244932A1 (ko) 신규 프로모터 및 이의 용도
WO2023038250A1 (ko) 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물
WO2024237729A1 (ko) 카다베린 아디핀산염 제조 공정
WO2018212624A1 (ko) 수산화지방산류, 헤폭실린류 또는 트리오실린류 제조용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24832254

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1