[go: up one dir, main page]

WO2024166829A1 - 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 - Google Patents

形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2024166829A1
WO2024166829A1 PCT/JP2024/003568 JP2024003568W WO2024166829A1 WO 2024166829 A1 WO2024166829 A1 WO 2024166829A1 JP 2024003568 W JP2024003568 W JP 2024003568W WO 2024166829 A1 WO2024166829 A1 WO 2024166829A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
pha
strain
transformed microorganism
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2024/003568
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
紗也 加藤
尚志 有川
俊輔 佐藤
Original Assignee
株式会社カネカ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社カネカ filed Critical 株式会社カネカ
Publication of WO2024166829A1 publication Critical patent/WO2024166829A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a transformed microorganism capable of producing polyhydroxyalkanoic acid, and a method for producing polyhydroxyalkanoic acid using the transformed microorganism.
  • biodegradable plastics have been attracting attention as materials with low environmental impact.
  • a biodegradable plastic is polyhydroxyalkanoic acid (hereinafter referred to as PHA), which is produced from microorganisms.
  • PHA polyhydroxyalkanoic acid
  • PHA is expected to be used industrially as a non-petroleum-derived material, as its raw materials are sugars and oils and fats.
  • the production costs of PHA remain high, so there is a need to increase production volume and reduce costs.
  • chaperones are known as proteins that help proteins form the correct three-dimensional structure. When a protein folds incorrectly due to stress such as heat or oxidative stress, chaperones unfold the protein and assist in refolding. Low molecular weight chaperones such as IbpA and IbpB copolymerize with denatured proteins to stabilize them and prevent aggregation. In addition, chaperones GroESL and DnaKJ contained in Hsp60 and Hsp70 not only prevent aggregation but also assist in protein refolding. Furthermore, the chaperone ClpB has the function of unfolding and disaggregating aggregated proteins.
  • Non-Patent Document 1 reports that overexpression of the chaperone GroESL in Cupriavidus necator improved isopropanol productivity by 9 to 18%.
  • the present invention aims to provide a transformed microorganism with improved productivity of polyhydroxyalkanoic acid, and a method for producing polyhydroxyalkanoic acid by culturing the microorganism.
  • the present inventors discovered that the productivity of polyhydroxyalkanoic acid can be improved by introducing a gene encoding a chaperone belonging to the ClpB family or enhancing the expression of the gene in a microorganism capable of producing polyhydroxyalkanoic acid, and thus completed the present invention.
  • the present invention relates to a transformed microorganism capable of producing polyhydroxyalkanoic acid, Possessing the polyhydroxyalkanoate synthase gene,
  • the present invention relates to a transformed microorganism into which a gene encoding a chaperone belonging to the ClpB family has been introduced or whose expression has been enhanced.
  • the present invention also relates to a method for producing polyhydroxyalkanoic acid, which comprises the step of culturing the transformed microorganism.
  • the present invention provides a transformed microorganism with improved productivity of polyhydroxyalkanoic acid, and a method for producing polyhydroxyalkanoic acid by culturing the microorganism.
  • the present disclosure relates to a transformed microorganism capable of producing polyhydroxyalkanoic acid (hereinafter also referred to as PHA), and to a method for producing PHA by culturing the transformed microorganism.
  • PHA polyhydroxyalkanoic acid
  • the transformed microorganism disclosed herein is a PHA-producing microorganism having a PHA synthase gene, into which a chaperone gene belonging to the ClpB family has been introduced or whose expression has been enhanced.
  • the host of the transformed microorganism according to the present disclosure may be a wild-type strain that inherently has a PHA synthase gene, a mutant strain obtained by artificially mutating such a wild-type strain, or a transformed strain into which an exogenous PHA synthase gene has been introduced by genetic engineering techniques.
  • Hosts for the transformed microorganisms disclosed herein include, for example, bacteria belonging to the genera Ralstonia, Cupriavidus, Wautersia, Aeromonas, Escherichia, Alcaligenes, and Pseudomonas. From the viewpoints of safety and PHA productivity, bacteria belonging to the genera Ralstonia, Cupriavidus, Wautersia, and Escherichia are preferred, microorganisms belonging to the genus Cupriavidus are more preferred, and Cupriavidus necator is particularly preferred.
  • PHAs The type of PHA produced by the transformed microorganism according to the present disclosure is not particularly limited as long as it is a PHA that can be produced by a microorganism, but preferred are a homopolymer of one monomer selected from 3-hydroxyalkanoic acids having 4 to 16 carbon atoms, a copolymer of two or more monomers selected from 3-hydroxyalkanoic acids having 4 to 16 carbon atoms, a copolymer of one monomer selected from 3-hydroxyalkanoic acids having 4 to 16 carbon atoms and another hydroxyalkanoic acid (e.g., 2-hydroxyalkanoic acids, 4-hydroxyalkanoic acids, 5-hydroxyalkanoic acids, 6-hydroxyalkanoic acids, etc. having 4 to 16 carbon atoms), and a copolymer of two or more monomers selected from 3-hydroxyalkanoic acids having 4 to 16 carbon atoms and another hydroxyalkanoic acid.
  • 2-hydroxyalkanoic acids 4-hydroxyalkanoic acids, 5-hydroxyalkano
  • PHAs are homopolymers of 3-hydroxyalkanoic acid having 4 carbon atoms, or copolymers containing 3-hydroxyalkanoic acid having 4 carbon atoms.
  • Examples include P(3HB), which is a homopolymer of 3-hydroxybutyric acid (abbreviation: 3HB), P(3HB-co-3HV), a copolymer of 3HB and 3-hydroxyvaleric acid (abbreviation: 3HV), P(3HB-co-3HH) (abbreviation: P3HB3HH), P(3HB-co-4HB), a copolymer of 3HB and 4-hydroxybutyric acid (abbreviation: 4HB), and PHAs containing lactic acid (abbreviation: LA) as a component, such as P(LA-co-3HB), etc., but are not limited to these.
  • P3HB3HH is preferred from the viewpoint of its wide range of applications as a polymer.
  • the type of PHA produced can be appropriately selected depending on the purpose, such as the type of PHA synthesis enzyme gene possessed by the microorganism used or introduced separately, the type of metabolic gene involved in the synthesis, and the culture conditions.
  • the PHA synthase (PhaC) gene possessed by the transformed microorganism according to the present disclosure may be one that is inherent to the host or may be an exogenous one.
  • the PHA synthase gene is not particularly limited, and examples thereof include PHA synthase genes derived from Aeromonas kiyaviei, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas SP 61-3, or Capriavidus necator, chimeric PHA synthase genes combining two or more of the above PHA synthase genes, and genes encoding proteins consisting of amino acid sequences showing 90% or more sequence identity to the amino acid sequences of the above PHA synthases.
  • the sequence identity is preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and even more preferably 99% or more.
  • the number of PHA synthase genes possessed by the transformed microorganism according to the present disclosure may be one or more.
  • the genes may be the same or different.
  • the transformed microorganism according to the present disclosure is one into which a gene encoding a chaperone belonging to the ClpB family has been introduced or whose expression has been enhanced. By introducing the gene, the productivity of PHA by the transformed microorganism can be increased. The transformed microorganism can produce PHA with good productivity even under high stress, for example, at a relatively high culture temperature.
  • ClpB family also includes ClpB homologues.
  • Such homologues include, for example, HSP104 in yeast.
  • the gene encoding a chaperone belonging to the ClpB family is not particularly limited, but examples thereof include a gene encoding ClpB derived from the genus Cupriavidus (particularly Cupriavidus necator), a gene encoding ClpB derived from the genus Eschericia (particularly Eschericia coli), and a gene encoding HSP104 derived from the genus Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae).
  • the ClpB derived from Cupriavidus necator is preferably ClpB having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a protein having an amino acid sequence showing 65% or more sequence identity to said amino acid sequence and having ClpB activity.
  • the ClpB derived from Eschericia coli is preferably ClpB having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a protein having an amino acid sequence showing 65% or more sequence identity to said amino acid sequence and having ClpB activity.
  • the sequence identity between the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is 67%.
  • HSP104 derived from Saccharomyces cerevisiae
  • HSP104 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, or a protein having an amino acid sequence showing 90% or more sequence identity to said amino acid sequence and having HSP104 activity is preferred.
  • sequence identity is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 99% or more.
  • the method for introducing a target gene into a host is not particularly limited, and may include a method for directly inserting or replacing a target gene onto a chromosome of the host, a method for directly inserting or replacing a target gene onto a megaplasmid carried by the host, or a method for placing a target gene onto a vector such as a plasmid, a phage, or a phagemid and introducing the gene, and two or more of these methods may be used in combination.
  • a method in which the target gene is directly inserted or replaced onto the host chromosome or onto a megaplasmid carried by the host is preferred, and a method in which the target gene is directly inserted or replaced onto the host chromosome is even more preferred.
  • a “gene expression regulatory sequence” is a DNA sequence that includes a base sequence that controls the transcription amount of the gene (e.g., a promoter sequence) and/or a base sequence that controls the translation amount of messenger RNA transcribed from the gene (e.g., a Shine-Dalgarno sequence).
  • a “gene expression regulatory sequence” any base sequence that exists in nature can be used, or an artificially constructed or modified base sequence can be used.
  • the promoter sequence or Shine-Dalgarno sequence contained in the "gene expression regulatory sequence” includes, but is not limited to, the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 10 to 15, or a base sequence containing a part of these base sequences.
  • the substitution, deletion, insertion and/or addition of at least a portion of the genomic DNA can be performed by methods well known to those skilled in the art.
  • Representative methods include a method that utilizes the mechanism of transposon and homologous recombination (Ohman et al., J. Bacteriol., 162:1068-1074 (1985)) and a method based on the principle of site-specific integration caused by the mechanism of homologous recombination and loss by second-stage homologous recombination (Noti et al., Methods Enzymol., 154:197-217 (1987)).
  • the sacB gene from Bacillus subtilis can be coexisted to easily isolate a microbial strain from which the gene has been lost by a second-stage homologous recombination as a sucrose-resistant strain (Schweizer, Mol. Microbiol., 6:1195-1204 (1992); Lenz et al., J. Bacteriol., 176:4385-4393 (1994)).
  • genome editing technology using the CRISPR/Cas9 system to modify target DNA Y. Wang et al., ACS Synth Biol. 2016, 5(7):721-732
  • guide RNA gRNA
  • gRNA guide RNA
  • the method for introducing the vector into the cells is not particularly limited, but examples include the calcium chloride method, electroporation method, polyethylene glycol method, and spheroplast method.
  • the method for enhancing the expression of a gene encoding a chaperone belonging to the ClpB family is not particularly limited, but may include inserting a gene expression regulatory sequence upstream of a gene encoding an endogenous chaperone on a chromosome, introducing a copy of the gene encoding the endogenous chaperone at a position different from the original position to increase the expression level, or introducing a mutation into the gene encoding the endogenous chaperone to increase the ClpB activity of the gene. These methods may also be combined or used in combination.
  • a known method can be used, for example, a homologous recombination method.
  • the gene expression regulatory sequence described above can be used as the gene expression regulatory sequence.
  • the method of introduction is not particularly limited, but any of the following may be selected: a method of directly inserting or replacing the gene on the host chromosome; a form of introducing the gene on a megaplasmid possessed by the host; or a form of arranging the copy on a vector such as a plasmid, phage, or phagemid and introducing the copy; or two or more of these methods may be used in combination.
  • a method of directly inserting or replacing the gene on the host chromosome a form of introducing the gene on a megaplasmid possessed by the host
  • a form of arranging the copy on a vector such as a plasmid, phage, or phagemid and introducing the copy; or two or more of these methods may be used in combination.
  • the plasmid may be lost during culture, it is preferable that a copy of the gene encoding the endogenous chaperone is inserted or replaced on the host chromosome.
  • a known method can be used.
  • a homologous recombination method or the like can be used to replace or insert a gene encoding the endogenous chaperone on the host chromosome.
  • the copy of the gene encoding the endogenous chaperone to be introduced has a gene expression regulatory sequence related to its expression upstream.
  • a gene expression regulatory sequence to be linked upstream of the gene encoding the endogenous chaperone a gene expression regulatory sequence originally possessed by the host can be used, any gene expression regulatory sequence existing in nature can be used, or an artificially constructed or modified gene expression regulatory sequence can be used.
  • the gene expression regulatory sequence used for the gene encoding the endogenous chaperone is not particularly limited, and the gene expression regulatory sequence located upstream of the gene encoding the endogenous chaperone may be introduced as is together with the gene, or an appropriate gene expression regulatory sequence may be selected and linked to the gene before being introduced into the host.
  • the gene when inserting a copy of the gene encoding the endogenous chaperone onto the host chromosome, the gene may be inserted so that it is linked to a gene expression regulatory sequence that is originally present on the host chromosome.
  • the gene expression regulatory sequence selected here may be the gene expression regulatory sequence as described above.
  • a known method can be used.
  • a gene encoding the chaperone can be used as a template to perform error-prone PCR or PCR using a primer that has been mutated, thereby obtaining a gene with a mutation introduced into it.
  • the transformed microorganism according to the present disclosure preferably has a phaA gene and a phaB gene.
  • the phaA gene and/or the phaB gene may be the phaA gene and/or the phaB gene inherent to the host, but a gene encoding PhaA derived from a thermophilic bacterium and/or a gene encoding PhaB derived from a thermophilic bacterium may also be introduced.
  • the phaA gene and phaB gene code for ⁇ -ketothiolase (PhaA) and acetoacetyl-CoA reductase (PhaB), respectively. These genes are possessed by many microorganisms that can naturally accumulate PHA, and are involved in the biosynthesis of 3HB-CoA, the most common PHA biosynthetic substrate. Specifically, PhaA is involved in catalyzing the reaction that produces acetoacetyl-CoA by condensing two molecules of acetyl-CoA, and PhaB is involved in catalyzing the reaction that produces 3HB-CoA by reducing acetoacetyl-CoA.
  • PhaA ⁇ -ketothiolase
  • PhaB acetoacetyl-CoA reductase
  • thermophiles examples include, but are not limited to, a gene encoding PhaA having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 derived from Cupriavidus sp.
  • strain S-6 a gene encoding PhaA having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 derived from Caldimonas manganoxidans, a gene encoding PhaA having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 derived from Schlegelella thermodepolymerans, or a gene having an amino acid sequence that shows 90% or more sequence identity to these amino acid sequences and a base sequence that encodes a protein that exhibits ⁇ -ketothiolase activity.
  • sequence identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO:4 is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • sequence identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO:5 or 6 is also preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • thermophiles examples include, but are not limited to, a gene encoding PhaB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:7 derived from Cupriavidus sp.
  • strain S-6 a gene encoding PhaB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:8 derived from Caldimonas manganoxidans, a gene encoding PhaB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:9 derived from Schlegelella thermodepolymerans, or a gene having an amino acid sequence that shows 90% or more sequence identity to these amino acid sequences and a base sequence that encodes a protein that exhibits acetoacetyl-CoA reductase activity.
  • sequence identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO:7 is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • sequence identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO:8 or 9 is also preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • PHA can be accumulated in the cells.
  • the method for culturing the transformed microorganism according to the present disclosure can be a conventional microbial culture method, and the culture can be performed in a medium containing an appropriate carbon source.
  • the medium composition, the method for adding the carbon source, the culture scale, the aeration and agitation conditions, the culture temperature, the culture time, etc. are not particularly limited.
  • the carbon source is preferably added to the medium continuously or intermittently.
  • the transformed microorganisms disclosed herein can produce PHA with good productivity even at relatively high culture temperatures. For example, good productivity can be achieved even when cultured at temperatures of 35°C or higher.
  • carbon sources can be used as a carbon source during cultivation as long as it can be assimilated by the transformed microorganism according to the present disclosure.
  • carbon sources include, but are not limited to, sugars such as glucose, fructose, and sucrose; oils and fats such as palm oil and palm kernel oil (including palm olein, palm double olein, palm kernel oil olein, etc., which are low-melting point fractions obtained by fractionating these oils), corn oil, coconut oil, olive oil, soybean oil, rapeseed oil, and jatropha oil, and fractionated oils thereof, or by-products of their refinement; fatty acids such as lauric acid, oleic acid, stearic acid, palmitic acid, and myristic acid, and derivatives thereof, and glycerol.
  • sugars such as glucose, fructose, and sucrose
  • oils and fats such as palm oil and palm kernel oil (including palm olein, palm double olein, palm kernel oil olein
  • oils and fats may be partially or entirely degraded oils.
  • Degraded oils refer to oils and fats that have been thermally denatured or that have been altered by reacting with oxygen and/or water under heating.
  • the name of the oils and fats is not limited, and includes those called waste oil, discarded oil, waste cooking oil, waste edible oil, waste vegetable oil, used oil, etc.
  • gases or alcohols such as carbon dioxide, carbon monoxide, methane, methanol, and ethanol, these can also be used as carbon sources.
  • a nitrogen source which is a nutrient source other than the carbon source
  • inorganic salts and other organic nutrient sources.
  • nitrogen sources include, but are not limited to, ammonia; ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate; peptone, meat extract, yeast extract, and the like.
  • inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride, and the like.
  • examples of other organic nutrient sources include amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine, and proline, and vitamins such as vitamin B1, vitamin B12, and vitamin C, and the like.
  • PHA can be recovered from the cells using known methods. There are no particular limitations on the recovery method, but for example, after culturing is completed, the cells are separated from the culture liquid using a centrifuge or separation membrane, etc., and dried, and then PHA is extracted from the dried cells using an organic solvent such as chloroform, and cell components are removed from the organic solvent solution containing PHA by filtration, etc., a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate PHA, the supernatant is removed by filtration or centrifugation, and the PHA can be recovered by drying.
  • cell components other than PHA can be dissolved in water using a surfactant, alkali, enzyme, etc., and then the PHA particles can be separated from the aqueous phase by filtration or centrifugation, dried, and recovered.
  • [Item 1] A transformed microorganism capable of producing polyhydroxyalkanoic acid, Possessing the polyhydroxyalkanoate synthase gene, A transformed microorganism into which a gene encoding a chaperone belonging to the ClpB family has been introduced or whose expression has been enhanced.
  • [Item 2] 2. The transformed microorganism according to item 1, wherein the chaperone belonging to the ClpB family has an amino acid sequence showing 65 to 100% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • thermophilic bacterium The transformed microorganism according to any one of items 1 to 5, into which a gene encoding PhaA derived from a thermophilic bacterium and/or a gene encoding PhaB derived from a thermophilic bacterium have been introduced.
  • thermophilic bacterium is Cupriavidus sp. strain S-6.
  • thermophilic bacterium is Cupriavidus sp. strain S-6.
  • a method for producing a polyhydroxyalkanoic acid comprising a step of culturing the transformed microorganism according to any one of items 1 to 7.
  • Item 9 Item 9.
  • the present invention will be described in more detail below with reference to examples, although the present invention is not limited to these examples.
  • the overall genetic manipulation can be carried out, for example, as described in Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Enzymes, cloning hosts, and the like used in the genetic manipulation can be purchased from commercial suppliers and used according to their instructions. There are no particular limitations on the enzymes used, so long as they can be used in genetic manipulation.
  • the KNK005/dZ/trc-J4b strain used below is a strain in which the phaC1 gene (PHA synthase gene), phaZ1 gene, phaZ2 gene, and phaZ6 gene on the chromosome of the Capriavidus necator H16 strain have been deleted, expression of the R-specific enoyl-CoA hydratase gene (phaJ4b gene) on the chromosome has been enhanced, and a gene encoding a PHA synthase mutant (N149S/D171G mutant (NSDG) gene) derived from the Aeromonas genus having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 has been introduced, and can be prepared in accordance with the method described in WO 2015/115619.
  • a plasmid for expressing the chaperone (ClpB) gene was prepared as follows.
  • This DNA fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and MunI, and the resulting DNA fragment was ligated to a plasmid vector pCUP2 described in International Publication WO 2007/049716 that was cleaved with MunI, and the DNA fragment ligated in such an orientation that the restriction enzyme SpeI recognition sequence of pCUP2 was located downstream of the lacN17 promoter was selected to obtain pCUP2-lacN17.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 18) having the base sequence of a gene encoding ClpB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 was obtained by PCR using synthetic oligo DNA.
  • This DNA fragment was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, and the resulting DNA fragment was ligated to pCUP2-lacN17 cleaved with MunI and SpeI to obtain a plasmid for expressing the ClpB gene, pCUP2-lacN17-ClpBre.
  • a ClpB expression-enhanced strain was prepared using the ClpB gene expression plasmid pCUP2-lacN17-ClpBre as follows:
  • the ClpB gene expression plasmid pCUP2-lacN17-ClpBre was introduced into the KNK005/dZ/trc-J4b strain, and the resulting strain was named KNK005/dZ/trc-J4b/pCUP2-lacN17-ClpBre strain (hereinafter, sometimes referred to as "PHA-producing microbial strain (1)").
  • the plasmid vector was introduced into the cells by electroporation as follows.
  • a Biorad Gene Pulser was used as the gene introduction device, and a Biorad gap 0.2 cm cuvette was used. 400 ⁇ l of competent cells and 20 ⁇ l of expression vector were poured into the cuvette and set in the pulse device, and an electric pulse was applied under the conditions of capacitance 25 ⁇ F, voltage 1.5 kV, and resistance value 800 ⁇ .
  • the bacterial solution in the cuvette was shake-cultured in Nutrient Broth medium (DIFCO) at 30°C for 3 hours, and then cultured on a selection plate (Nutrient Agar medium (DIFCO), kanamycin 100 mg/L) at 30°C for 2 days to obtain the grown PHA-producing microbial strain (1).
  • DIFCO Nutrient Broth medium
  • DIFCO Nutrient Agar medium
  • kanamycin 100 mg/L kanamycin 100 mg/L
  • the PHA-producing microbial strain (1) is a strain in which the phaC1 gene (PHA synthase gene), phaZ1 gene, phaZ2 gene, and phaZ6 gene on the chromosome of the Cupriavidus necator strain H16 have been deleted, the expression of the R-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome has been enhanced, a gene encoding a PHA synthase mutant derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:19 has been introduced, and the expression of the gene encoding ClpB derived from the genus Cupriavidus having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1 has been enhanced.
  • a plasmid for expressing the chaperone (ClpB) gene was prepared as follows. The preparation was carried out as follows. A DNA fragment (SEQ ID NO: 20) having the base sequence of a gene encoding ClpB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 was obtained by PCR using synthetic oligo DNA. This DNA fragment was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, and the obtained DNA fragment was ligated to pCUP2-lacN17 cleaved with MunI and SpeI to obtain a plasmid pCUP2-lacN17-ClpBec for expressing the ClpB gene.
  • SEQ ID NO: 20 A DNA fragment having the base sequence of a gene encoding ClpB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 was obtained by PCR using synthetic oligo DNA. This DNA fragment was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, and the obtained DNA fragment was ligated to pCUP2-lacN17 cleaved with Mun
  • a ClpBec-introduced strain was prepared using the ClpB gene expression plasmid pCUP2-lacN17-ClpBec as follows.
  • the ClpB gene expression plasmid pCUP2-lacN17-ClpBec was introduced into the KNK005/dZ/trc-J4b strain by the same electroporation method as above, and the resulting strain was named KNK005/dZ/trc-J4b/pCUP2-lacN17-ClpBec strain (hereinafter, sometimes referred to as "PHA-producing microbial strain (2)").
  • the PHA-producing microbial strain (2) is a strain in which the phaC1 gene (PHA synthase gene), phaZ1 gene, phaZ2 gene, and phaZ6 gene on the chromosome of the Capriavidus necator H16 strain have been deleted, the expression of the R-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome has been enhanced, and a gene encoding a PHA synthase mutant derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:19 and a gene encoding ClpB derived from the genus Escherichia having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2 have been introduced.
  • a plasmid for expressing the chaperone (GroESL) gene was prepared as follows. The preparation was carried out as follows. A DNA fragment (SEQ ID NO: 23) having the base sequence of a gene encoding GroES having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 and GroEL having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22 was obtained by PCR using synthetic oligo DNA.
  • This DNA fragment was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, and the obtained DNA fragment was ligated to pCUP2-lacN17 cleaved with MunI and SpeI to obtain a plasmid for expressing the GroESL gene, pCUP2-lacN17-GroESL.
  • a strain with enhanced GroESL expression was created using the GroESL gene expression plasmid pCUP2-lacN17-GroESL as follows.
  • the GroESL gene expression plasmid pCUP2-lacN17-GroESL was introduced into the KNK005/dZ/trc-J4b strain by the same electroporation method as above, and the resulting strain was named KNK005/dZ/trc-J4b/pCUP2-lacN17-GroESL strain (hereinafter, sometimes referred to as "PHA-producing microbial strain (3)").
  • the PHA-producing microbial strain (3) is a strain in which the phaC1 gene (PHA synthase gene), phaZ1 gene, phaZ2 gene, and phaZ6 gene on the chromosome of the Cupriavidus necator strain H16 have been deleted, the expression of the R-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome has been enhanced, and a gene encoding a PHA synthase mutant derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:19 and a gene encoding GroESL derived from the genus Cupriavidus having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs:21 and 22 have been introduced.
  • a plasmid for expressing the chaperone (DnaKJ) gene was prepared.
  • the preparation was carried out as follows.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 26) having the base sequence of a gene encoding DnaK having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24 and DnaJ having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 was obtained by PCR using synthetic oligo DNA.
  • This DNA fragment was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, and the obtained DNA fragment was ligated to pCUP2-lacN17 cleaved with MunI and SpeI to obtain a plasmid for expressing the DnaKJ gene, pCUP2-lacN17-DnaKJ.
  • a DnaKJ-introduced strain was prepared as follows using the DnaKJ gene expression plasmid pCUP2-lacN17-DnaKJ.
  • the DnaKJ gene expression plasmid pCUP2-lacN17-DnaKJ was introduced into the KNK005/dZ/trc-J4b strain by the same electroporation method as above, and the resulting strain was named the KNK005/dZ/trc-J4b/pCUP2-lacN17-DnaKJ strain (hereinafter, sometimes referred to as the "PHA-producing microbial strain (4)").
  • the PHA-producing microbial strain (4) is a strain in which the phaC1 gene (PHA synthase gene), phaZ1 gene, phaZ2 gene, and phaZ6 gene on the chromosome of the Capriavidus necator H16 strain have been deleted, the expression of the R-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome has been enhanced, and a gene encoding a PHA synthase mutant derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:19 and a gene encoding DnaKJ derived from the genus Escherichia having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs:24 and 25 have been introduced.
  • a plasmid for disrupting the phaA and phaB genes was prepared as follows.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 27) having the nucleotide sequence upstream and downstream of the phaA and phaB structural genes of the Capriavidus necator H16 strain was obtained by PCR using synthetic oligo DNA.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the resulting DNA fragment was ligated with the vector pNS2X-sacB described in JP-A-2007-259708, which had also been digested with SwaI, using a DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)) to prepare a plasmid vector pNS2X-sacB+phaABUD for disrupting the phaAB genes.
  • a DNA ligase Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)
  • a phaAB gene-disrupted strain was prepared as follows using the plasmid vector pNS2X-sacB+phaABUD for disrupting the phaAB genes.
  • the Escherichia coli S17-1 strain (ATCC47055) was transformed with the plasmid vector pNS2X-sacB+phaABUD for disrupting the phaAB genes, and the transformed microorganism thus obtained was co-cultured with the KNK005/dZ/trc-J4b strain on Nutrient Agar medium (manufactured by Difco) to carry out conjugative transfer.
  • the obtained culture solution was inoculated on Son agar medium containing 250 mg/L kanamycin (sodium citrate 2 g/L, sodium chloride 5 g/L, magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g/L, ammonium dihydrogen phosphate 1 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g/L, agar 15 g/L, pH 6.8), and the strains that had grown on the agar medium were selected to obtain a strain in which the plasmid had been integrated on the chromosome of the KNK005/dZ/trc-J4b strain.
  • kanamycin sodium citrate 2 g/L, sodium chloride 5 g/L, magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g/L, ammonium dihydrogen phosphate 1 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g/L, agar 15 g/L, pH 6.8
  • plasmids for introducing the phaA and phaB genes were prepared as follows.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 28) was obtained by PCR using synthetic oligo DNA, which has the base sequences of the upstream and downstream of the phaA and phaB structural genes of the Capriavidus necator H16 strain, the gene encoding PhaA having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and the gene encoding PhaB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the resulting DNA fragment was ligated with the vector pNS2X-sacB described in JP-A-2007-259708, which had also been digested with SwaI, using a DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)) to prepare a plasmid vector pNS2X-sacB+phaAU-phaABsp-phaBD for introducing the phaA and phaB genes.
  • a DNA ligase Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)
  • the plasmid vector pNS2X-sacB+phaAU-phaABsp-phaBD for introducing the phaA and phaB genes was introduced into the KNK005/dZ/trc-J4b/dphaAB strain by the same conjugation transfer method as above. Furthermore, by culturing in the same manner as above and selecting with Nutrient Agar medium containing 15% sucrose, one strain into which a gene encoding PhaA having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:4 and a gene encoding PhaB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:7 were introduced was isolated. The obtained strain was named KNK005/dZ/trc-J4b/dphaAB::phaABsp strain.
  • a strain with enhanced ClpBre expression was prepared as follows using the ClpB gene expression plasmid pCUP2-lacN17-ClpBre.
  • the ClpB gene expression plasmid pCUP2-lacN17-ClpBre was introduced into the KNK005/dZ/trc-J4b/dphaAB::phaABsp strain by the same electroporation method as described above, and the resulting strain was named KNK005/dZ/trc-J4b/dphaAB::phaABsp/pCUP2-lacN17-ClpBre strain (hereinafter, sometimes referred to as "PHA-producing microbial strain (5)").
  • the PHA-producing microbial strain (5) is a strain in which the phaC1 gene (PHA synthase gene), phaZ1 gene, phaZ2 gene, phaZ6 gene, and phaAB gene on the chromosome of the Cupriavidus necator strain H16 have been deleted, the expression of the R-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome has been enhanced, and a gene encoding a PHA synthase mutant derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:19, and the phaA gene having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:4 and the phaB gene having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:7 derived from Cupriavidus sp. strain S-6 have been introduced, and the expression of the gene encoding ClpB derived from the genus Cupriavidus having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1 has been enhanced.
  • a ClpBec-introduced strain was prepared as follows using the ClpB gene expression plasmid pCUP2-lacN17-ClpBec.
  • the ClpB gene expression plasmid pCUP2-lacN17-ClpBre was introduced into the KNK005/dZ/trc-J4b/dphaAB::phaABsp strain by the same electroporation method as described above, and the resulting strain was named KNK005/dZ/trc-J4b/dphaAB::phaABsp/pCUP2-lacN17-ClpBec strain (hereinafter, sometimes referred to as "PHA-producing microbial strain (6)").
  • the PHA-producing microbial strain (6) is a strain in which the phaC1 gene (PHA synthase gene), phaZ1 gene, phaZ2 gene, phaZ6 gene, and phaAB gene on the chromosome of the Cupriavidus necator strain H16 have been deleted, the expression of the R-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome has been enhanced, and a gene encoding a PHA synthase mutant derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:19, the phaA gene having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:4 and the phaB gene having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:7 derived from Cupriavidus sp. strain S-6, and a gene encoding ClpB derived from the genus Escherichia having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2 have been introduced.
  • the phaC1 gene PHA synth
  • a GroESL-introduced strain was prepared as follows using the GroESL gene expression plasmid pCUP2-lacN17-GroESL.
  • the GroESL gene expression plasmid pCUP2-lacN17-GroESL was introduced into the KNK005/dZ/trc-J4b/dphaAB::phaABsp strain by the same electroporation method as described above, and the resulting strain was named KNK005/dZ/trc-J4b/dphaAB::phaABsp/pCUP2-lacN17-GroESL strain (hereinafter, sometimes referred to as "PHA-producing microbial strain (7)").
  • the PHA-producing microbial strain (7) is a strain in which the phaC1 gene (PHA synthase gene), phaZ1 gene, phaZ2 gene, phaZ6 gene, and phaAB gene on the chromosome of the Cupriavidus necator strain H16 have been deleted, the expression of the R-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome has been enhanced, and a gene encoding a PHA synthase mutant derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, the phaA gene having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and the phaB gene having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 derived from Cupriavidus sp. strain S-6, and a gene encoding GroESL derived from the genus Cupriavidus having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 have been introduced.
  • a DnaKJ-introduced strain was prepared as follows using the DnaKJ gene expression plasmid pCUP2-lacN17-DnaKJ.
  • the DnaKJ gene expression plasmid pCUP2-lacN17-DnaKJ was introduced into the KNK005/dZ/trc-J4b/dphaAB::phaABsp strain by the same electroporation method as described above, and the resulting strain was named KNK005/dZ/trc-J4b/dphaAB::phaABsp/pCUP2-lacN17-DnaKJ strain (hereinafter, sometimes referred to as "PHA-producing microbial strain (8)").
  • the PHA-producing microbial strain (8) is a strain in which the phaC1 gene (PHA synthase gene), phaZ1 gene, phaZ2 gene, phaZ6 gene, and phaAB gene on the chromosome of the Cupriavidus necator strain H16 have been deleted, the expression of the R-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome has been enhanced, and a gene encoding a PHA synthase mutant derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:19, the phaA gene having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:4 and the phaB gene having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:7 derived from Cupriavidus sp. strain S-6, and a gene encoding DnaKJ derived from the genus Escherichia having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs:24 and 25 have been introduced.
  • Example 1 PHA production using PHA-producing microbial strain (1)
  • Cultivation studies were carried out using PHA-producing microbial strain (1) under the following conditions.
  • the ratio of PHA accumulation to the dry cells was measured as follows. The cells were collected from the culture medium by centrifugation, washed with ethanol, and freeze-dried to obtain the dry cells, and the weight was measured. 100 ml of chloroform was added to 1 g of the obtained dry cells, and the mixture was stirred at room temperature for a day and night to extract the PHA (PHA mixture) in the cells. After filtering the cell residue, the mixture was concentrated in an evaporator until the total volume was 30 ml, and then 90 ml of hexane was gradually added and the mixture was left for 1 hour while slowly stirring. The precipitated PHA was filtered and then vacuum dried at 50° C. for 3 hours. The weight of the dried PHA was measured, and the PHA production amount was calculated.
  • the composition of the seed medium was 10 g/L meat extract, 10 g/L bactotryptone, 2 g/L yeast extract, 9 g/L sodium dihydrogen phosphate dodecahydrate, 1.5 g/L dipotassium hydrogen phosphate, and 100 ⁇ g/L kanamycin sulfate.
  • the composition of the PHA production medium was 11 g/L disodium hydrogen phosphate dodecahydrate, 1.9 g/L dipotassium hydrogen phosphate, 1.3 g/L ammonium sulfate, 5 mL/L magnesium solution, and 1 mL/L trace metal salt solution.
  • the magnesium solution was prepared by dissolving 200 g/L magnesium sulfate heptahydrate in water.
  • the trace metal salt solution was prepared by dissolving 0.218 g/L cobalt chloride hexahydrate, 16.2 g/L iron (III) chloride hexahydrate, 10.3 g/L calcium chloride dihydrate, 0.118 g/L nickel chloride hexahydrate, and 0.156 g/L copper sulfate pentahydrate in 0.1 N hydrochloric acid.
  • PHA production culture was carried out in a flask. 50 mL of PHA production medium was placed in a 500 mL shake flask. Just before inoculation, 250 ⁇ L of magnesium solution, 50 ⁇ L of trace metal solution, and 1 g of palm kernel oil were added. After medium preparation, 500 ⁇ L of preculture solution was inoculated into the shake flask and shake culture was carried out at 36°C for 72 hours. After culture was completed, the amount of PHA production was measured as described above.
  • Example 2 PHA production by PHA-producing microbial strain (2) Cultivation studies were carried out using the PHA-producing microbial strain (2) under the same conditions as in Example 1, and the PHA production amount was measured as described above. As in Example 1, the PHA production amount is shown in Table 1 as a relative value to the reference value.
  • Examples 1 and 2 are compared with Comparative Examples 2 and 3, it can be seen that Examples 1 and 2 have a higher PHA production amount than Comparative Examples 2 and 3. From this, it can be said that the introduction or enhanced expression of a gene encoding a chaperone belonging to the ClpB family is more effective in improving PHA productivity than the introduction or enhanced expression of a gene encoding other chaperones, GroESL or DnaKJ.
  • the composition of the seed mother medium was 1 w/v % meat extract, 1 w/v % Bacto-Tryptone, 0.2 w/v % yeast extract, 0.9 w/v % Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, and 0.15 w/v % KH 2 PO 4 (pH 6.8).
  • the composition of the preculture medium was 1.1 w/v% Na2HPO4.12H2O , 0.19 w /v % KH2PO4 , 1.29 w /v% ( NH4 ) 2SO4 , 0.1 w /v% MgSO4.7H2O, 2.5 w/v% palm olein oil, and 0.5 v/v% trace metal salt solution (1.6 w/v% FeCl3.6H2O, 1 w/v % CaCl2.2H2O, 0.02 w/v% CoCl2.6H2O , 0.016 w /v% CuSO4.5H2O , and 0.012 w/v% NiCl2.6H2O dissolved in 0.1 N hydrochloric acid ) .
  • the composition of the PHA production medium was 0.385 w/v% Na2HPO4.12H2O , 0.067 w /v % KH2PO4 , 0.291 w /v % ( NH4 ) 2SO4 , 0.1 w/v % MgSO4.7H2O , and 0.5 v/v% trace metal salt solution (1.6 w/v% FeCl3.6H2O, 1 w / v % CaCl2.2H2O, 0.02 w/v % CoCl2.6H2O, 0.016 w / v% CuSO4.5H2O , and 0.012 w/v% NiCl2.6H2O dissolved in 0.1 N hydrochloric acid).
  • PHA production culture was carried out as follows. First, a glycerol stock (50 ⁇ l) of the PHA-producing microbial strain (5) was inoculated into a seed medium (10 ml) and cultured for 24 hours to carry out seed culture. Next, the seed culture liquid was inoculated at 1.0 v/v% into a 3 L jar fermenter (Marubishi Bioengineering MDL-300 type) containing 1.8 L of preculture medium. The operating conditions were a culture temperature of 30°C, a stirring speed of 500 rpm, and aeration rate of 1.8 L/min, and the culture was continued for 28 hours while controlling the pH between 6.7 and 6.8 to carry out preculture. A 14% aqueous solution of ammonium hydroxide was used for pH control.
  • the preculture solution was inoculated at 5.0 v/v% into a 5 L jar fermenter (Marubishi Bioengineering MDS-U50 type) containing 2.5 L of PHA production medium.
  • the operating conditions were a culture temperature of 36°C, an agitation speed of 420 rpm, and an aeration rate of 2.1 L/min, and the pH was controlled between 6.7 and 6.8.
  • a 25% aqueous solution of ammonium hydroxide was used for pH control.
  • the carbon source was added intermittently. Palm olein oil was used as the carbon source.
  • the culture was carried out for 48 hours.
  • the amount of PHA produced was measured as described above.
  • Example 4 PHA production by PHA-producing microbial strain (6)
  • Cultivation studies were carried out using the PHA-producing microbial strain (6) under the same conditions as in Example 3, and the amount of PHA produced was measured as described above. As in Example 3, the amount of PHA produced is shown in Table 2 as a relative value to the reference value.
  • Examples 3 and 4 are compared with Comparative Examples 6 and 7, it is found that Examples 3 and 4 have higher PHA productivity than Comparative Examples 6 and 7. From this, it can be said that the introduction or enhanced expression of a gene encoding a chaperone belonging to the ClpB family is more effective in improving PHA productivity than the introduction or enhanced expression of a gene encoding other chaperones, GroESL or DnaKJ.

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

ポリヒドロキシアルカン酸の産生能を有する形質転換微生物であって、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンをコードする遺伝子が導入され、又はその発現が強化された、形質転換微生物。ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンは、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ属、又は、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ属由来のものであってよい。前記形質転換微生物を培養することにより、ポリヒドロキシアルカン酸を製造できる。

Description

形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
　本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸の産生能を有する形質転換微生物、及び、当該形質転換微生物を用いたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。
　近年、環境問題に関する意識の高まりから環境低負荷な物質として生分解性プラスチックが注目されている。生分解性プラスチックの一例として微生物から生産されるポリヒドロキシアルカン酸（以下ＰＨＡともいう）が挙げられる。ＰＨＡは生分解性を有する他に、原材料が糖や油脂であることから非石油由来として産業利用が期待される。しかしながら、ＰＨＡ生産コストは依然として高いため、生産量を向上し、コストを下げる必要がある。
　一方、タンパク質が正しい立体構造を形成する過程を助けるタンパク質として、シャペロンが知られている。熱や酸化ストレスなどのストレスによってタンパク質が誤った折りたたみをとると、シャペロンがタンパク質の誤った折りたたみを解きほぐし再折りたたみを補助する。ＩｂｐＡやＩｂｐＢなどの低分子のシャペロンは変性タンパク質と共重合して安定化させることで凝集を防ぐ。また、Ｈｓｐ６０やＨｓｐ７０に含まれるシャペロンＧｒｏＥＳＬやＤｎａＫＪなどは凝集を防ぐだけでなく、タンパク質の再折りたたみを補助している。さらに、シャペロンＣｌｐＢは、凝集したタンパク質を解きほぐし、脱凝集する働きをもつ。
　非特許文献１では、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒにシャペロンＧｒｏＥＳＬを過剰発現したところ、イソプロパノールの生産性が９～１８％向上したことが報告されている。
Ｍｅｔａｂ．　Ｅｎｇ．，４２，７４－８４（２０１７）
　上述の通り微生物にシャペロンＧｒｏＥＳＬを過剰発現することでイソプロパノールの生産性が向上したことが報告されているが、シャペロンがポリヒドロキシアルカン酸の生産性に与える影響は報告されていない。
　本発明は、上記現状に鑑み、ポリヒドロキシアルカン酸の生産性が向上した形質転換微生物、及び当該微生物を培養することによるポリヒドロキシアルカン酸の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者は前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ポリヒドロキシアルカン酸の産生能を有する微生物において、ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンをコードする遺伝子を導入し又はその発現を強化することでポリヒドロキシアルカン酸の生産性が向上することを見出し、本発明を完成させた。
　即ち本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸の産生能を有する形質転換微生物であって、
　ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、
　ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンをコードする遺伝子が導入され、又はその発現が強化された、形質転換微生物に関する。
　また本発明は、前記形質転換微生物を培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法にも関する。
　本発明によれば、ポリヒドロキシアルカン酸の生産性が向上した形質転換微生物、及び当該微生物を培養することによるポリヒドロキシアルカン酸の製造方法を提供することができる。
　以下に、本発明の実施形態について説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本開示は、ポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡともいう）の産生能を有する形質転換微生物に関する。また、当該形質転換微生物を培養することによるＰＨＡの製造方法に関する。
　本開示に係る形質転換微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有するＰＨＡ産生微生物であって、ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロン遺伝子が導入され、又はその発現が強化された形質転換微生物である。
　本開示に係る形質転換微生物の宿主は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を本来的に有する野生株であってもよいし、そのような野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株や、あるいは、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された形質転換株であってもよい。
　本開示に係る形質転換微生物の宿主としては、例えばラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する細菌類が挙げられる。安全性及びＰＨＡ生産性の観点から、好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属、エシェリキア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属に属する微生物であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）である。
　（ＰＨＡ）
　本開示に係る形質転換微生物が生産するＰＨＡの種類としては、微生物が生産し得るＰＨＡである限り特に限定されないが、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーの単独重合体、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーの共重合体、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸（例えば、炭素数４～１６の２－ヒドロキシアルカン酸、４－ヒドロキシアルカン酸、５－ヒドロキシアルカン酸、６－ヒドロキシアルカン酸など）との共重合体、及び、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸との共重合体が好ましい。
　特に好ましいＰＨＡは、炭素数４の３－ヒドロキシアルカン酸の単独重合体、又は、炭素数４の３－ヒドロキシアルカン酸を含む共重合体である。例えば、３－ヒドロキシ酪酸（略称：３ＨＢ）のホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）、３ＨＢと３－ヒドロキシ吉草酸（略称：３ＨＶ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）、３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（略称：３ＨＨ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）（略称：Ｐ３ＨＢ３ＨＨ）、３ＨＢと４－ヒドロキシ酪酸（略称：４ＨＢ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）、乳酸（略称：ＬＡ）を構成成分として含むＰＨＡ、例えば３ＨＢとＬＡの共重合体Ｐ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、Ｐ３ＨＢ３ＨＨが好ましい。
　なお、生産されるＰＨＡの種類は、目的に応じて、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
　（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）
　本開示に係る形質転換微生物が有するＰＨＡ合成酵素（ＰｈａＣ）遺伝子は、宿主が本来的に有するものであっても良いし、外来のものであってもよい。ＰＨＡ合成酵素遺伝子としては特に限定されず、アエロモナス・キヤビエ、アエロモナス・ハイドロフィラ、シュードモナス　ＳＰ　６１－３、又は、カプリアビダス・ネカトール由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子や、前記２つ以上のＰＨＡ合成酵素遺伝子を組み合わせたキメラＰＨＡ合成酵素遺伝子、又は、前述の各ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
　前記配列同一性は、９５％以上であることが好ましく、９７％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　本開示に係る形質転換微生物が有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の数は、１つでも良いし、複数であっても良い。また、複数のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する場合、それらは同一の遺伝子であっても良いし、異なる遺伝子であっても良い。
　（ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロン遺伝子）
　本開示に係る形質転換微生物は、ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンをコードする遺伝子が導入され、又はその発現が強化されたものである。当該遺伝子が導入されることによって、形質転換微生物によるＰＨＡの生産性を高めることができる。該形質転換微生物は、高ストレス下、例えば比較的高い培養温度下においても、良好な生産性にてＰＨＡを生産することができる。
　一般的なシャペロンであるＧｒｏＥＳＬやＤｎａＫＪは、タンパク質の再折りたたみを補助する機能を持つのに対して、本開示に関するＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンは、タンパク質の再折りたたみを補助する機能を持たず、ＡＴＰを使用して、凝集したタンパク質を解きほぐすという機能を持っている。
　本開示では、「ＣｌｐＢファミリー」にはＣｌｐＢのホモログも含まれる。そのようなホモログとしては、例えば、酵母が有するＨＳＰ１０４が挙げられる。
　前記ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンをコードする遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属（特に、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）由来のＣｌｐＢをコードする遺伝子や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ属（特に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ　ｃｏｌｉ）由来のＣｌｐＢをコードする遺伝子、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｓｅ属（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｓｅ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＨＳＰ１０４をコードする遺伝子などが挙げられる。
　より具体的には、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ由来のＣｌｐＢとして、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＣｌｐＢ、または、該アミノ酸配列に対して６５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつＣｌｐＢ活性を有するタンパク質が好ましい。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ　ｃｏｌｉ由来のＣｌｐＢとして、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＣｌｐＢ、または、該アミノ酸配列に対して６５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつＣｌｐＢ活性を有するタンパク質が好ましい。なお、配列番号１で示されるアミノ酸配列と、配列番号２で示されるアミノ酸配列間の配列同一性は、６７％である。
　さらに、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｓｅ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＨＳＰ１０４として、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＨＳＰ１０４、または、該アミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつＨＳＰ１０４活性を有するタンパク質が好ましい。
　前記配列同一性は、７０％以上であることが好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がより更に好ましく、９７％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
　（遺伝子の導入）
　対象遺伝子を宿主に導入する方法としては特に限定されないが、宿主の染色体上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法、宿主が保有するメガプラスミド上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法、あるいはプラスミド、ファージ、ファージミドなどのベクター上に対象遺伝子を配置して導入する方法などが選択でき、これらの方法のうち２つ以上を併用しても良い。
　導入遺伝子の安定性を考慮すると、宿主の染色体上または宿主が保有するメガプラスミド上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法が好ましく、宿主の染色体上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法がより好ましい。
　導入する遺伝子を確実に発現させるために、対象遺伝子が、宿主が元来有する「遺伝子発現調節配列」の下流に位置するように導入するか、または、対象遺伝子が、外来の「遺伝子発現調節配列」の下流に位置する形で導入することが好ましい。本開示における「遺伝子発現調節配列」とは、その遺伝子の転写量を制御する塩基配列（例えばプロモーター配列）、及び／または、その遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡの翻訳量を調節する塩基配列（例えばシャイン・ダルガノ配列）を含むＤＮＡ配列である。「遺伝子発現調節配列」としては、自然界に存在する任意の塩基配列を利用することもできるし、人工的に構築または改変された塩基配列を利用しても良い。
　「遺伝子発現調節配列」に含まれるプロモーター配列やシャイン・ダルガノ配列としては、例えば、配列番号１０～１５のいずれかに示される塩基配列、または、これら塩基配列の一部を含む塩基配列などが挙げられるが、特に限定されない。
　ゲノムＤＮＡの少なくとも一部の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、当業者に周知の方法により行うことができる。代表的な方法としてはトランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ohman et al., J. Bacteriol., 162:1068-1074 (1985)）や、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Noti et al., Methods Enzymol., 154:197-217 (1987)）などがある。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をスクロース耐性株として容易に単離する方法（Schweizer, Mol. Microbiol., 6:1195-1204 (1992)、Lenz et al., J. Bacteriol., 176:4385-4393 (1994)）も利用することができる。さらに別の方法として、標的ＤＮＡを改変するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編集技術（Y. Wang et al., ACS Synth Biol. 2016, 5(7):721-732）も利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は改変すべきゲノムＤＮＡの塩基配列の一部に結合しうる配列を有しており、Ｃａｓ９を標的に運ぶ役割をもつ。
　細胞へのベクターの導入方法としても特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
　（遺伝子の発現強化）
　ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンをコードする遺伝子の発現を強化する方法としては、特に限定されないが、染色体上の内生の前記シャペロンをコードする遺伝子の上流に遺伝子発現調節配列を挿入したり、内生の前記シャペロンをコードする遺伝子のコピーを本来存在する位置とは異なる位置に導入したりすることによって、発現量を増大させても良いし、内生の前記シャペロンをコードする遺伝子に変異を導入することによって該遺伝子によるＣｌｐＢ活性を上昇させても良い。また、それらを組み合わせても良いし、併用しても良い。
　染色体上の内生の前記シャペロンをコードする遺伝子の上流に遺伝子発現調節配列を挿入する場合、公知の方法を用いることができ、例えば、相同組換え法等が利用できる。また、遺伝子発現調節配列としては、上述した遺伝子発現調節配列を利用することができる。
　内生の前記シャペロンをコードする遺伝子のコピーを本来存在する位置とは異なる位置に導入する場合、該導入の方法は特に限定されないが、宿主の染色体上に直接挿入または置換する方法、宿主が保有するメガプラスミド上に導入する形式、あるいはプラスミド、ファージ、ファージミドなどのベクター上に該コピーを配置して導入する形式のいずれを選択しても良いし、これらの方法のうち２以上を併用しても良い。ただし、プラスミドは培養中に脱落する可能性があることから、宿主の染色体上に内生の前記シャペロンをコードする遺伝子のコピーが挿入または置換されていることが好ましい。前記導入、挿入、置換、または配置の方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、宿主の染色体上に内生の前記シャペロンをコードする遺伝子を置換または挿入するには、相同組換え法等が利用できる。
　また、導入する内生の前記シャペロンをコードする遺伝子のコピーは、その上流に、その発現に関わる遺伝子発現調節配列を有していることが好ましい。内生の前記シャペロンをコードする遺伝子の上流に連結する遺伝子発現調節配列としては、宿主が元々有する遺伝子発現調節配列を利用することもできるし、自然界に存在する任意の遺伝子発現調節配列を利用することもできるし、人工的に構築または改変された遺伝子発現調節配列を利用しても良い。
　内生の前記シャペロンをコードする遺伝子に対して使用される遺伝子発現調節配列は特に限定されず、内生の前記シャペロンをコードする遺伝子の上流に位置する遺伝子発現調節配列をそのまま一緒に導入しても良いし、適切な遺伝子発現調節配列を選択して前記遺伝子に連結させて、宿主に導入しても良い。また、宿主の染色体上に内生の前記シャペロンをコードする遺伝子のコピーを挿入する際に、宿主の染色体上にもともと存在する遺伝子発現調節配列に前記遺伝子が連結されるように挿入しても良い。ここで選択する遺伝子発現調節配列としては、上述したような遺伝子発現調節配列を利用することができる。
　内生の前記シャペロンをコードする遺伝子に変異を導入する場合、公知の方法を用いることができる。例えば、前記シャペロンをコードする遺伝子を鋳型とし、エラープローンＰＣＲや、変異を導入したプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、変異が導入された遺伝子を得ることができる。
　（好熱菌に由来するｐｈａＡ遺伝子及びｐｈａＢ遺伝子）
　本開示に係る形質転換微生物は、ｐｈａＡ遺伝子及びｐｈａＢ遺伝子を有することが好ましい。該ｐｈａＡ遺伝子及び／又はｐｈａＢ遺伝子は、宿主が本来有するｐｈａＡ遺伝子及び／又は宿主が本来有するｐｈａＢ遺伝子であってよいが、好熱菌に由来するＰｈａＡをコードする遺伝子及び／又は好熱菌に由来するＰｈａＢをコードする遺伝子が導入されてもよい。
　ｐｈａＡ遺伝子、及びｐｈａＢ遺伝子は、それぞれβ－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）をコードする遺伝子である。これらの遺伝子は、ＰＨＡを元来蓄積し得る微生物の多くが保有するものであり、最も一般的なＰＨＡの生合成基質である３ＨＢ－ＣｏＡの生合成に関わる。具体的には、ＰｈａＡは２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを生成する反応の触媒に関わり、ＰｈａＢはアセトアセチルＣｏＡを還元して３ＨＢ－ＣｏＡを生成する反応の触媒に関わる。
　好熱菌に由来するβ－ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）をコードする遺伝子としては、例えば、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６に由来する配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＡをコードする遺伝子、Ｃａｌｄｉｍｏｎａｓ　ｍａｎｇａｎｏｘｉｄａｎｓに由来する配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＡをコードする遺伝子、Ｓｃｈｌｅｇｅｌｅｌｌａ　ｔｈｅｒｍｏｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｎｓに由来する配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＡをコードする遺伝子、またはこれらのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ－ケトチオラーゼ活性を示すタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
　配列番号４に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性は、９０％以上であることが好ましいが、９５％以上がより好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９９％以上が特に好ましい。また、配列番号５又は６に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性も、９０％以上であることが好ましいが、９５％以上がより好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９９％以上が特に好ましい。
　好熱菌に由来するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）をコードする遺伝子としては、例えば、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６に由来する配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＢをコードする遺伝子、Ｃａｌｄｉｍｏｎａｓ　ｍａｎｇａｎｏｘｉｄａｎｓに由来する配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＢをコードする遺伝子、Ｓｃｈｌｅｇｅｌｅｌｌａ　ｔｈｅｒｍｏｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｎｓに由来する配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＢをコードする遺伝子、またはこれらのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ活性を示すタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
　配列番号７に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性は、９０％以上であることが好ましいが、９５％以上がより好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９８％以上がより更に好ましく、９９％以上が特に好ましい。また、配列番号８又は９に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性も、９０％以上であることが好ましいが、９５％以上がより好ましく、９７％以上がさらに好ましく、９９％以上が特に好ましい。
　ＰｈａＡをコードする遺伝子及び／又はＰｈａＢをコードする遺伝子の導入は、上述した方法によって実現することができる。
　（ＰＨＡの生産）
　本開示に係る形質転換微生物を培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積させることができる。本開示に係る形質転換微生物を培養する方法としては、常法の微生物培養法に従うことができ、適切な炭素源が存在する培地中で培養を行なえばよい。培地組成、炭素源の添加方法、培養スケール、通気攪拌条件や、培養温度、培養時間などは特に限定されない。炭素源は、連続的に、または間欠的に培地に添加することが好ましい。
　本開示に係る形質転換微生物は、比較的高温の培養温度下においても、良好な生産性にてＰＨＡを生産することができる。例えば３５℃以上の温度で培養しても、良好な生産性を達成することができる。
　培養時の炭素源としては、本開示に係る形質転換微生物が資化可能であればどのような炭素源でも使用可能である。特に限定されないが、例えば、グルコース、フルクトース、シュークロースなどの糖類；パーム油やパーム核油（これらを分別した低融点分画であるパームオレイン、パームダブルオレイン、パーム核油オレインなども含む）、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、あるいはその精製副産物；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体、あるいはグリセロール等が挙げられる。前記油脂は、その一部、又は、全部が、劣化油であってよい。劣化油とは、熱変性し、または、加熱下で酸素および／または水と反応して変質した油脂を指す。その呼称は限定されず、廃油、廃棄油、廃食油、廃食用油、廃植物油、使用済み油等と呼称されているものも含まれる。また、本開示に係る形質転換微生物が二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、エタノールなどのガスやアルコール類を利用可能である場合、これらを炭素源として使用することもできる。
　本開示におけるＰＨＡの製造では、上記炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。下記に限定されないが、窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
　培養を適切な時間行なって菌体内にＰＨＡを蓄積させた後、周知の方法を用いて菌体からＰＨＡを回収することができる。回収方法については特に限定されないが、例えば、培養終了後、培養液から遠心分離機や分離膜等で菌体を分離し、乾燥させた後、乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出し、このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から濾過等によって細胞成分を除去し、その濾液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させ、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収することができる。また、界面活性剤やアルカリ、酵素などを用いてＰＨＡ以外の細胞成分を水に溶解させた後、濾過や遠心分離によってＰＨＡ粒子を水相から分離し乾燥させて回収することもできる。
　以下の各項目では、本開示における好ましい態様を列挙するが、本発明は以下の項目に限定されるものではない。
［項目１］
　ポリヒドロキシアルカン酸の産生能を有する形質転換微生物であって、
　ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、
　ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンをコードする遺伝子が導入され、又はその発現が強化された、形質転換微生物。
［項目２］
　前記ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンが、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列に対して６５～１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、項目１に記載の形質転換微生物。
［項目３］
　前記ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンが、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、又は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ属由来である、項目１又は２に記載の形質転換微生物。
［項目４］
　前記ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンが、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ、又は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ　ｃｏｌｉ由来である、項目３に記載の形質転換微生物。
［項目５］
　前記形質転換微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する、項目１又は２に記載の形質転換微生物。
［項目６］
　好熱菌由来のＰｈａＡをコードする遺伝子及び／又は好熱菌由来のＰｈａＢをコードする遺伝子が導入された、項目１～５のいずれか１項に記載の記載の形質転換微生物。
［項目７］
　前記好熱菌がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６である、項目６に記載の形質転換微生物。
［項目８］
　項目１～７のいずれか１項に記載の形質転換微生物を培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
［項目９］
　ポリヒドロキシアルカン酸が、２種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体である、項目８に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
［項目１０］　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体である、項目９に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
　なお全体的な遺伝子操作は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
　以下で使用するＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＣ１遺伝子（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）、ｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪ４ｂ遺伝子）の発現を強化し、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体（Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体（ＮＳＤＧ）遺伝子）をコードする遺伝子を導入した株であり、国際公開第２０１５／１１５６１９号に記載の方法に準じて作製することができる。
　（微生物作製例１）
　まず、シャペロン（ＣｌｐＢ）遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、大腸菌のｌａｃプロモーター改変体であるｌａｃＮ１７プロモーターを有するＤＮＡ断片（配列番号１７）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＭｕｎＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、国際公開２００７／０４９７１６号に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断したものと連結して、ｌａｃＮ１７プロモーターの下流にｐＣＵＰ２の制限酵素ＳｐｅＩ認識配列が位置する向きに連結されたものを選抜し、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７を得た。
　次に、合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣｌｐＢをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１８）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結して、ＣｌｐＢ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｒｅを得た。
　次に、ＣｌｐＢ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｒｅを用いて、以下のようにしてＣｌｐＢ発現強化株の作製を行った。ＣｌｐＢ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｒｅを、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株に導入し、得られた菌株を、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｒｅ株と命名した（以下、「ＰＨＡ生産微生物株（１）」と記載することもある）。
　プラスミドベクターの細胞への導入は以下のようにエレクトロポレーション法によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきたＰＨＡ生産微生物株（１）を取得した。
　ＰＨＡ生産微生物株（１）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＣ１遺伝子（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）、ｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を強化し、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子を導入し、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属由来のＣｌｐＢをコードする遺伝子を発現強化した株である。
　（微生物作製例２）
　まず、シャペロン（ＣｌｐＢ）遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＣｌｐＢをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２０）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結して、ＣｌｐＢ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｅｃを得た。
　次に、ＣｌｐＢ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｅｃを用いて、以下のようにしてＣｌｐＢｅｃ導入株の作製を行った。ＣｌｐＢ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｅｃを、上記と同様のエレクトロポレーション法によって、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株に導入し、得られた菌株を、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｅｃ株と命名した（以下、「ＰＨＡ生産微生物株（２）」と記載することもある）。
　ＰＨＡ生産微生物株（２）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＣ１遺伝子（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）、ｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を強化し、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＥｓｃｈｒｉｃｈｉａ属由来のＣｌｐＢをコードする遺伝子を導入した株である。
　（微生物作製例３）
　まず、シャペロン（ＧｒｏＥＳＬ）遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＧｒｏＥＳおよび配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＧｒｏＥＬをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２３）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結して、ＧｒｏＥＳＬ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＧｒｏＥＳＬを得た。
　次に、ＧｒｏＥＳＬ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＧｒｏＥＳＬを用いて、以下のようにしてＧｒｏＥＳＬ発現強化株の作製を行った。ＧｒｏＥＳＬ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＧｒｏＥＳＬを、上記と同様のエレクトロポレーション法によって、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株に導入し、得られた菌株を、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＧｒｏＥＳＬ株と命名した（以下、「ＰＨＡ生産微生物株（３）」と記載することもある）。
　ＰＨＡ生産微生物株（３）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＣ１遺伝子（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）、ｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を強化し、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子と、配列番号２１および２２に記載のアミノ酸配列を有するＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属由来のＧｒｏＥＳＬをコードする遺伝子を導入した株である。
　（微生物作製例４）
　まず、シャペロン（ＤｎａＫＪ）遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＤｎａＫおよび配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するＤｎａＪをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２６）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結して、ＤｎａＫＪ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＤｎａＫＪを得た。
　次に、ＤｎａＫＪ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＤｎａＫＪを用いて、以下のようにしてＤｎａＫＪ導入株の作製を行った。ＤｎａＫＪ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＤｎａＫＪを、上記と同様のエレクトロポレーション法によって、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株に導入し、得られた菌株を、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＤｎａＫＪ株と命名した（以下、「ＰＨＡ生産微生物株（４）」と記載することもある）。
　ＰＨＡ生産微生物株（４）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＣ１遺伝子（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）、ｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を強化し、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子と、配列番号２４および２５に記載のアミノ酸配列を有するＥｓｃｈｒｉｃｈｉａ属由来のＤｎａＫＪをコードする遺伝子を導入した株である。
　（微生物作製例５）
　まず、ｐｈａＡおよびｐｈａＢ遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株のｐｈａＡ、ｐｈａＢ構造遺伝子より上流及び下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２７）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＡＢ遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢＵＤを作製した。
　次に、ｐｈａＡＢ遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢＵＤを用いて、以下のようにしてｐｈａＡＢ遺伝子破壊株の作製を行った。
　ｐｈａＡＢ遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢＵＤで大腸菌Ｓ１７－１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、それによって得た形質転換微生物を、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。
　得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲおよびＤＮＡシーケンサーによる解析により染色体上のｐｈａＡＢ遺伝子を欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ株と命名した。
　さらに、ｐｈａＡおよびｐｈａＢ遺伝子導入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株のｐｈａＡ、ｐｈａＢ構造遺伝子より上流及び下流の塩基配列と、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＡをコードする遺伝子及び配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＢをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２８）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＡおよびｐｈａＢ遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＵ－ｐｈａＡＢｓｐ－ｐｈａＢＤを作製した。
　次に、ｐｈａＡおよびｐｈａＢ遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＵ－ｐｈａＡＢｓｐ－ｐｈａＢＤを上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ株に導入した。さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＡをコードする遺伝子及び配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＰｈａＢをコードする遺伝子が導入された菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ：：ｐｈａＡＢｓｐ株と命名した。
　さらに、ＣｌｐＢ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｒｅを用いて、以下のようにしてＣｌｐＢｒｅ発現強化株の作製を行った。
　ＣｌｐＢ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｒｅを、上記と同様のエレクトロポレーション法によって、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ：：ｐｈａＡＢｓｐ株に導入し、得られた菌株を、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ：：ｐｈａＡＢｓｐ／ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｒｅ株と命名した（以下、「ＰＨＡ生産微生物株（５）」と記載することもある）。
　ＰＨＡ生産微生物株（５）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＣ１遺伝子（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）、ｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、ｐｈａＺ６遺伝子、及びｐｈａＡＢ遺伝子を欠失し、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を強化し、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子と、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６由来の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するｐｈａＡおよび配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するｐｈａＢ遺伝子が導入され、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属由来のＣｌｐＢをコードする遺伝子を発現強化した株である。
　（微生物作製例６）
　さらに、ＣｌｐＢ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｅｃを用いて、以下のようにしてＣｌｐＢｅｃ導入株の作製を行った。
　ＣｌｐＢ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｒｅを、上記と同様のエレクトロポレーション法によって、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ：：ｐｈａＡＢｓｐ株に導入し、得られた菌株を、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ：：ｐｈａＡＢｓｐ／ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｅｃ株と命名した（以下、「ＰＨＡ生産微生物株（６）」と記載することもある）。
　ＰＨＡ生産微生物株（６）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＣ１遺伝子（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）、ｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、ｐｈａＺ６遺伝子、及びｐｈａＡＢ遺伝子を欠失し、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を強化し、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子と、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６由来の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するｐｈａＡおよび配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するｐｈａＢ遺伝子と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属由来のＣｌｐＢをコードする遺伝子を導入した株である。
　（微生物作製例７）
　さらに、ＧｒｏＥＳＬ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＧｒｏＥＳＬを用いて、以下のようにしてＧｒｏＥＳＬ導入株の作製を行った。
　ＧｒｏＥＳＬ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＧｒｏＥＳＬを、上記と同様のエレクトロポレーション法によって、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ：：ｐｈａＡＢｓｐ株に導入し、得られた菌株を、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ：：ｐｈａＡＢｓｐ／ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＧｒｏＥＳＬ株と命名した（以下、「ＰＨＡ生産微生物株（７）」と記載することもある）。
　ＰＨＡ生産微生物株（７）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＣ１遺伝子（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）、ｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、ｐｈａＺ６遺伝子、及びｐｈａＡＢ遺伝子を欠失し、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を強化し、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子と、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６由来の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するｐｈａＡおよび配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するｐｈａＢ遺伝子と、配列番号２１および２２に記載のアミノ酸配列を有するＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属由来のＧｒｏＥＳＬをコードする遺伝子を導入した株である。
　（微生物作製例８）
　さらに、ＤｎａＫＪ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＤｎａＫＪを用いて、以下のようにしてＤｎａＫＪ導入株の作製を行った。
　ＤｎａＫＪ遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＤｎａＫＪを、上記と同様のエレクトロポレーション法によって、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ：：ｐｈａＡＢｓｐ株に導入し、得られた菌株を、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ：：ｐｈａＡＢｓｐ／ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＤｎａＫＪ株と命名した（以下、「ＰＨＡ生産微生物株（８）」と記載することもある）。
　ＰＨＡ生産微生物株（８）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＣ１遺伝子（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）、ｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、ｐｈａＺ６遺伝子、及びｐｈａＡＢ遺伝子を欠失し、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を強化し、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子とＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６由来の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するｐｈａＡおよび配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するｐｈａＢ遺伝子と、配列番号２４および２５に記載のアミノ酸配列を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属由来のＤｎａＫＪをコードする遺伝子を導入した株である。
　（実施例１）ＰＨＡ生産微生物株（１）によるＰＨＡ生産　下記の条件でＰＨＡ生産微生物株（１）を用いた培養検討を行なった。
　（ＰＨＡ蓄積量の測定方法）
　乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合は次のように測定した。遠心分離によって培養液から菌体を回収、エタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体を取得し、重量を測定した。得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡ（ＰＨＡ混合物）を抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、ＰＨＡ生産量を算出した。
　（フラスコでのＰＨＡ生産培養）
　種母培地の組成は、１０ｇ／Ｌ　肉エキス、１０ｇ／Ｌ　バクトトリプトン、２ｇ／Ｌ　酵母エキス、９ｇ／Ｌ　リン酸二水素ナトリウム１２水和物、１．５ｇ／Ｌ　リン酸水素二カリウム、１００μｇ／Ｌ　カナマイシン硫酸塩とした。
　ＰＨＡ生産培地の組成は、１１ｇ／Ｌ　リン酸水素二ナトリウム１２水和物、１．９ｇ／Ｌ　リン酸水素二カリウム、１．３ｇ／Ｌ　硫酸アンモニウム、５ｍＬ／Ｌ　マグネシウム溶液、１ｍＬ／Ｌ　微量金属塩溶液とした。マグネシウム溶液は、水に２００ｇ／Ｌ　硫酸マグネシウム七水和物を溶かして調製した。微量金属塩溶液は、０．１Ｎ塩酸に、０．２１８ｇ／Ｌ　塩化コバルト六水和物、１６．２ｇ／Ｌ　塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物、１０．３ｇ／Ｌ　塩化カルシウム二水和物、０．１１８ｇ／Ｌ　塩化ニッケル六水和物、０．１５６ｇ／Ｌ　硫酸銅五水和物を溶かして調製した。
　微生物作製例１で作製したＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＣｌｐＢｒｅ株のグリセロールストック溶液５０μＬを種母培地１０ｍＬに接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。得られた培養液を前培養液とした。
　ＰＨＡ生産培養は、フラスコで行った。５００ｍＬ容量の振盪フラスコにＰＨＡ生産培地５０ｍＬを入れた。植菌直前に、マグネシウム溶液を２５０μＬ、微量金属溶液を５０μＬ、パーム核油を１ｇ添加した。培地調製後、振盪フラスコに前培養液を５００μＬ接種し、３６℃で７２時間振盪培養を行った。培養終了後、ＰＨＡ生産量は前述のように測定した。ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株を同条件で培養した比較例１のＰＨＡ生産量を基準値とし、該基準値に対する相対値としてＰＨＡ生産量を表１に示す。
　（実施例２）ＰＨＡ生産微生物株（２）によるＰＨＡ生産
　実施例１と同様の条件で、ＰＨＡ生産微生物株（２）を用いた培養検討を行ない、ＰＨＡ生産量を前述のように測定した。実施例１と同様に、基準値に対する相対値としてＰＨＡ生産量を表１に示す。
　（比較例１～３）
　実施例１と同様の条件で、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株、ＰＨＡ生産微生物株（３）、又は、ＰＨＡ生産微生物株（４）を用いた培養検討を行ない、ＰＨＡ生産量を前述のように測定した。実施例１と同様に、基準値に対する相対値としてＰＨＡ生産量を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１より次のことが分かる。実施例１及び実施例２と比較例１を比較すると、実施例１及び２は、比較例１よりもＰＨＡ生産量が向上したことが分かる。このことより、ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンをコードする遺伝子が導入又は発現強化されたことでＰＨＡ生産性が向上したと言える。
　また、実施例１及び２と、比較例２及び３を比較すると、実施例１及び２は、比較例２及び３よりＰＨＡ生産量が高いことが分かる。このことより、ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンをコードする遺伝子の導入又は発現強化は、他のシャペロンＧｒｏＥＳＬ又はＤｎａＫＪをコードする遺伝子の導入又は発現強化よりもＰＨＡ生産性向上効果が良好であると言える。
　（実施例３）ＰＨＡ生産微生物株（５）によるＰＨＡ生産　下記の条件でＰＨＡ生産微生物株（５）を用いた培養検討を行なった。
　（高密度培養でのＰＨＡ生産培養）
　種母培地の組成は、１ｗ／ｖ％　Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％　Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％　Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％　ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
　前培養培地の組成は、１．１ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％　パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％　微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％　ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。
　ＰＨＡ生産培地の組成は、０．３８５ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％　ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％　微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％　ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。
　ＰＨＡ生産培養は次のように行った。まず、ＰＨＡ生産微生物株（５）のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
　次に、前培養液を、２．５ＬのＰＨＡ生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ－Ｕ５０型）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３６℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量２．１Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには２５％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は断続的に添加した。炭素源としてはパームオレインオイルを使用した。培養は４８時間行った。ＰＨＡ生産量は前述のように測定した。ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株を同条件で培養した比較例４のＰＨＡ生産量を基準値とし、該基準値に対する相対値としてＰＨＡ生産量を表２に示す。
　（実施例４）ＰＨＡ生産微生物株（６）によるＰＨＡ生産
　実施例３と同様の条件でＰＨＡ生産微生物株（６）を用いた培養検討を行ない、ＰＨＡ生産量を前述のように測定した。実施例３と同様に、基準値に対する相対値としてＰＨＡ生産量を表２に示す。
　（比較例４～７）
　実施例１と同様の条件で、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ株、ＫＮＫ００５／ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｐｈａＡＢ：：ｐｈａＡＢｓｐ株、ＰＨＡ生産微生物株（７）、又は、ＰＨＡ生産微生物株（８）を用いた培養検討を行ない、ＰＨＡ生産量を前述のように測定した。実施例３と同様に、基準値に対する相対値としてＰＨＡ生産量を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２より次のことが分かる。実施例３及び実施例４と比較例５とを比較すると、実施例３及び４は、比較例５よりもＰＨＡ生産量が高いことが分かる。このことより、ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンをコードする遺伝子が導入又は発現強化されたことでＰＨＡ生産性が向上したと言える。
　また、実施例３及び実施例４と、比較例６及び７とを比較すると、実施例３及び４は、比較例６及び７よりＰＨＡ生産性が高いことが分かる。このことより、ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンをコードする遺伝子の導入又は発現強化は、他のシャペロンＧｒｏＥＳＬ又はＤｎａＫＪをコードする遺伝子の導入又は発現強化よりもＰＨＡ生産性向上効果が良好であると言える。

Claims (10)

  1. 　ポリヒドロキシアルカン酸の産生能を有する形質転換微生物であって、
    　ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、
    　ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンをコードする遺伝子が導入され、又はその発現が強化された、形質転換微生物。
  2. 　前記ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンが、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列に対して６５～１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の形質転換微生物。
  3. 　前記ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンが、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、又は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ属由来である、請求項１又は２に記載の形質転換微生物。
  4. 　前記ＣｌｐＢファミリーに属するシャペロンが、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ、又は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ　ｃｏｌｉ由来である、請求項３に記載の形質転換微生物。
  5. 　前記形質転換微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する、請求項１又は２に記載の形質転換微生物。
  6. 　好熱菌由来のＰｈａＡをコードする遺伝子及び／又は好熱菌由来のＰｈａＢをコードする遺伝子が導入された、請求項１又は２に記載の記載の形質転換微生物。
  7. 　前記好熱菌がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｓｐ．　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ－６である、請求項６に記載の形質転換微生物。
  8. 　請求項１又は２に記載の形質転換微生物を培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

  9. 　ポリヒドロキシアルカン酸が、２種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体である、請求項８に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  10. 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体である、請求項９に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
PCT/JP2024/003568 2023-02-06 2024-02-02 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 WO2024166829A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023-015848 2023-02-06
JP2023015848 2023-02-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024166829A1 true WO2024166829A1 (ja) 2024-08-15

Family

ID=92262667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2024/003568 WO2024166829A1 (ja) 2023-02-06 2024-02-02 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024166829A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005073563A (ja) * 2003-08-29 2005-03-24 Canon Inc ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の取得方法
WO2009147918A1 (ja) * 2008-06-05 2009-12-10 国立大学法人東京工業大学 ポリヒドロキシアルカン酸共重合体及びその製造法
JP2021108581A (ja) * 2020-01-10 2021-08-02 株式会社カネカ 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
WO2023004135A1 (en) * 2021-07-23 2023-01-26 The Research Foundation For The State University Of New York Method of making polyhydroxyalkanoate copolymers from diverse substrates

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005073563A (ja) * 2003-08-29 2005-03-24 Canon Inc ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の取得方法
WO2009147918A1 (ja) * 2008-06-05 2009-12-10 国立大学法人東京工業大学 ポリヒドロキシアルカン酸共重合体及びその製造法
JP2021108581A (ja) * 2020-01-10 2021-08-02 株式会社カネカ 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
WO2023004135A1 (en) * 2021-07-23 2023-01-26 The Research Foundation For The State University Of New York Method of making polyhydroxyalkanoate copolymers from diverse substrates

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAYAKODY LAHIRU N., JOHNSON CHRISTOPHER W., WHITHAM JASON M., GIANNONE RICHARD J., BLACK BRENNA A., CLEVELAND NICHOLAS S., KLINGEM: "Thermochemical wastewater valorization via enhanced microbial toxicity tolerance", ENERGY & ENVIRONMENTAL SCIENCE, RSC PUBL., CAMBRIDGE, vol. 11, no. 6, 1 January 2018 (2018-01-01), Cambridge , pages 1625 - 1638, XP093198689, ISSN: 1754-5692, DOI: 10.1039/C8EE00460A *
THOMSON NICHOLAS M., SAIKA AZUSA, USHIMARU KAZUNORI, SANGIAMBUT SMITH, TSUGE TAKEHARU, SUMMERS DAVID K., SIVANIAH EASAN: "Efficient Production of Active Polyhydroxyalkanoate Synthase in Escherichia coli by Coexpression of Molecular Chaperones", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 79, no. 6, 15 March 2013 (2013-03-15), US , pages 1948 - 1955, XP093198690, ISSN: 0099-2240, DOI: 10.1128/AEM.02881-12 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11453896B2 (en) Transformed microorganism for producing PHA copolymer comprising 3HH monomer unit at high composition rate and method for producing PHA using same
JP7579396B2 (ja) 変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素、その遺伝子および形質転換体、並びに、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
WO2018021046A1 (ja) ３ｈｈ単位含有共重合ｐｈａを生産する形質転換体、及び当該ｐｈａの製造方法
JPWO2015115619A1 (ja) Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が調節された微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法
JP7256740B2 (ja) グリセロールキナーゼ活性を強化したｐｈａ産生微生物とそれを用いたｐｈａの製造方法
JP6313708B2 (ja) 高分子量ｐｈａ生産微生物とそれを用いた高分子量ｐｈａの製造方法
JP7598323B2 (ja) ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
JP2008029218A (ja) 酵素活性を低下させた微生物を用いる共重合ポリエステルの製造方法
JP2024091851A (ja) 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
JP7535527B2 (ja) 形質転換微生物、及び当該微生物を用いたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
JP2008086238A (ja) ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法
JP6853787B2 (ja) スクロース資化性を有するｐｈａ生産微生物、及び該微生物を用いたｐｈａの製造方法
JPWO2005098001A1 (ja) 新規形質転換体
JPWO2008090873A1 (ja) ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法
US10876140B2 (en) Method for producing polyhydroxyalkanoic acid, and microbes
US20240263130A1 (en) Engineered microorganisms expressing acetoacetyl- coa reductase variants and methods for increasing proportion of 3-hydroxyhexanoic acid in pha
WO2024166829A1 (ja) 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
WO2024166830A1 (ja) 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
JP2021108581A (ja) 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
JP7425783B2 (ja) 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
WO2024162411A1 (ja) 形質転換微生物、及び共重合ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
JP2009225775A (ja) ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
WO2024058182A1 (ja) 形質転換微生物、及び、共重合ポリエステルの製造方法
JP2007125004A (ja) ポリヒドロキシアルカン酸の製造法
CN101565722B (zh) 一种提高发酵生产的聚羟基脂肪酸酯中3-羟基戊酸单体含量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24753272

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1