WO2024005204A1

WO2024005204A1 - 融合タンパク質

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Publication number: WO2024005204A1
Application number: PCT/JP2023/024487
Authority: WO
Inventors: 康司中村; 修一橋本; 麻美吉岡; 恒太高橋; 俊和井上; 瞳佐野; ロレンツオ，クラウディアデ; パッサリエッロ，マルゲリータ
Original assignee: 株式会社カイオム・バイオサイエンス; セインジーバイオテクノロジーアバンツァートフランコサルバトーレスカール
Priority date: 2022-06-30
Filing date: 2023-06-30
Publication date: 2024-01-04
Also published as: KR20250029872A; EP4549572A1; JPWO2024005204A1; TW202405024A; CN119487194A; AU2023300945A1; IL317820A

Abstract

抗腫瘍効果を増大させた三重特異性トライボディとしての新規タンパク質等を提供する。本発明は、第１及び第２の２つの異なる鎖を含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質内に形成される３種の組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインが、（ｉ）５Ｔ４に対する結合能、（ｉｉ）Ｔ細胞のＣＤ３受容体複合体に対する結合能、及び（ｉｉｉ）ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３に対する結合能から選択されるいずれかの結合能を有する（但し、前記３種の組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインは、互いに異なる結合能を有する。）、前記融合タンパク質に係るものである。

Description

融合タンパク質

　本発明は、融合タンパク質、及びその用途等に関する。詳しくは、（ｉ）５Ｔ４、（ｉｉ）ＣＤ３受容体複合体、及び（ｉｉｉ）ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３に対する結合能を有する融合タンパク質、及びその用途等に関する。

　CD3ベースT細胞誘導体（T-cell Engager（TCE））は、抗体又は抗体様タンパク質であり、同時に、一方のアームが癌細胞の腫瘍関連抗原（TAA）に結合し、もう一方のアームがCD3複合体に結合して、TCRに依存しない人工免疫シナプスを形成してT細胞依存性免疫応答のHLA拘束性を回避する。TCEは、従来の治療法に耐性のある癌を治療するための最も興味深い様式の1つである。血液悪性腫瘍の分野では、ブリナツモマブ（Blinatumomab）は、急性リンパ芽球性白血病（ALL）のCD19抗原とT細胞上CD3とを同時に標的にして、白血病細胞の効率的な死滅を誘導する、二重特異性T細胞誘導体（Bispecific TCE（BiTE））（2014年にFDA承認）である。一方、TCEによる固形腫瘍の治療における重要な課題は、免疫抑制性腫瘍微小環境（TME）によって表される。固形腫瘍は、骨髄由来抑制細胞（MDSC）、腫瘍随伴マクロファージ（TAM）、及び制御性T細胞（Treg）などの免疫抑制細胞を動員してTMEを形成し、これらの細胞は全て細胞傷害性T細胞の活性を阻害する。

　したがって、固形腫瘍におけるTCEの最も効果的な使用では、免疫抑制性TMEを克服し、免疫排除又は免疫砂漠状態の「免疫コールド」な腫瘍を、炎症を起こした「免疫ホット」な腫瘍にするのに役立つ免疫チェックポイント阻害剤などの薬剤と組み合わせたTCEの使用が必要となる可能性がある（例えば、非特許文献１参照）。理想的には、TCE及び免疫チェックポイント阻害剤の両方の機能を有することが可能な単一分子が設計され得る。それにより、この新規構築物は、固形腫瘍における免疫抑制性TMEを克服し、組み合わせる2つの別々の薬剤の製造コストに比べて製造コストを下げることを可能にする。

　癌胎児性腫瘍関連抗原5T4は、TPBG又はWAIF1としても公知であり、8つのロイシンリッチリピートを含む72kDaの細胞表面糖タンパク質である。5T4は、妊娠9週という早い時期に胎児の栄養膜に発現される。健常な成人における5T4の発現は、いくつかの特殊な上皮細胞タイプに限定されるが、肝臓、肺、気管支、心臓、精巣、卵巣、脳、又は筋肉では検出されない。
　一方で、5T4は、卵巣癌、結腸癌、子宮頸癌、胃癌、及び肺癌を含む様々な種類の癌で発現されることが報告されている（例えば、非特許文献２～６参照）。さらに、その発現は、膀胱、子宮内膜、食道、膵臓、胃、及び精巣の非セミノーマ性胚細胞腫瘍でも観察されている。絨毛癌及び胎盤部位栄養膜腫瘍も、5T4陽性であった（例えば、非特許文献７参照）。したがって、5T4は、標的癌治療に適した標的抗原として提案されている（例えば、非特許文献８及び９参照）。

　腫瘍細胞上の5T4及びT細胞上に発現したCD3に関与する二重特異性抗体は、効率的な癌細胞の死滅を誘導するために、細胞傷害性T細胞を癌細胞に対してリダイレクトする興味深い戦略を呈する可能性がある。臨床試験において固形腫瘍を治療する目的で、腫瘍細胞上の5T4とT細胞上の共刺激分子であるCD3又は4-1BBとを標的とするいくつかの二重特異性抗体が存在する。しかしながら、今日まで、癌の治療に承認された抗5T4免疫療法は存在しない。

　ところで、トライボディ（Tribody）フォーマットは、足場としてFabドメインを含む多重特異性抗体であり、H鎖（V_H+CH₁）及びL鎖（V_L+C_L）のFabフラグメントは、インビボで自然にヘテロ二量体化可能であり、scFvなどの追加機能を足場に組み込み得る。トライボディの中でも、Tb535Hは、Fabドメイン及びscFvドメインの両方が5T4（二価結合）を標的とし、別のscFvがCD3（一価結合）を標的とする二重特異性トライボディであり、一定の抗腫瘍効果を発揮し得ることが知られている（例えば、特許文献１参照）。

WO 2016/097408 A1 WO 2019/180201 A2 WO 99/37791

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　このような状況下において、さらに抗腫瘍効果を増大させた多重特異性トライボディとしての新規タンパク質の開発が望まれていた。

　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、融合タンパク質その用途（医薬組成物等）等を提供するものである。

［１］第１及び第２の２つの異なる鎖を含む融合タンパク質であって、
　第１の鎖が、２つの抗体可変領域ＶＨ１及びＶＨ２、１つの抗体可変領域ＶＬ２、並びに１つの抗体定常領域ＣＨ１又はＣＬを含み、
　第２の鎖が、２つの抗体可変領域ＶＬ１及びＶＬ３、１つの抗体可変領域ＶＨ３、並びに１つの抗体定常領域ＣＬ又はＣＨ１を含み、
　第１及び第２の鎖は、ヘテロ二量体相互作用を含有し（好ましくは、一方の鎖のＣＨ１と他方の鎖のＣＬドメインとの間に当該ヘテロ二量体相互作用を含有し）、
　該融合タンパク質内に形成される３種の組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインである、ＶＨ１／ＶＬ１結合ドメイン、ＶＨ２／ＶＬ２結合ドメイン、及びＶＨ３／ＶＬ３結合ドメインが、
（ｉ）５Ｔ４に対する結合能、
（ｉｉ）ＣＤ３受容体複合体に対する結合能、及び
（ｉｉｉ）ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３に対する結合能
から選択されるいずれかの結合能を有する（但し、前記３種の組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインは、互いに異なる結合能を有する。）、
前記融合タンパク質。

［２］前記融合タンパク質は、前記第１の鎖と前記第２の鎖とを含むヘテロ二量体のタンパク質である、前記［１］に記載の融合タンパク質。

［３］前記２つの異なる鎖が、
ａ）第１の鎖：
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と
を組み合わせたもの、
ｂ）第１の鎖：
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と
を組み合わせたもの、
ｃ）第１の鎖：
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と
を組み合わせたもの、
ｄ）第１の鎖：
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と
を組み合わせたもの、
ｅ）第１の鎖：
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と
を組み合わせたもの、
ｆ）第１の鎖：
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と
を組み合わせたもの、
ｇ）第１の鎖：
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と
を組み合わせたもの、
ｈ）第１の鎖：
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と
を組み合わせたもの、
ｉ）第１の鎖：
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と
を組み合わせたもの、
ｊ）第１の鎖：
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と
を組み合わせたもの、
ｋ）第１の鎖：
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と
を組み合わせたもの、
あるいは、
ｌ）第１の鎖：
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と
を組み合わせたもの
［ここで、上記ａ）～ｌ）において、
　ＶＨ及びＶＬは、抗体可変領域であり、
　ＶＨ（５Ｔ４）及びＶＬ（５Ｔ４）は、５Ｔ４に対する抗体可変領域であり、
　ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）は、ＣＤ３受容体複合体に対する抗体可変領域であり、
　ＶＨ（Ｘ）及びＶＬ（Ｘ）は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３に対する抗体可変領域であり、
　ＣＨ１及びＣＬは、抗体定常領域であり、
　Ｌ１及びＬ２は、リンカーである。］
を含む、前記［１］又は［２］に記載の融合タンパク質。

［４］ＶＨ１、ＶＨ２及びＶＨ３における、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号３；配列番号４；及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、
配列番号９；配列番号１０；及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
配列番号２４；配列番号２５；及び配列番号２６又は２７に示されるアミノ酸配列、
配列番号３７；配列番号３８；及び配列番号３９に示されるアミノ酸配列、
配列番号４７；配列番号４８又は４９；及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列、あるいは、
配列番号５８；配列番号５９又は４９；及び配列番号６０に示されるアミノ酸配列
からなり、かつ
　ＶＬ１、ＶＬ２及びＶＬ３における、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号１９；配列番号２０；及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列、
配列番号１４；配列番号１５；及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列、
配列番号２９；配列番号３０；及び配列番号３１、３２又は３３に示されるアミノ酸配列、
配列番号４１；配列番号４２；及び配列番号４３に示されるアミノ酸配列、
配列番号５２；配列番号５３；及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列、あるいは、
配列番号６２；配列番号６３；及び配列番号６４に示されるアミノ酸配列
からなる、
前記［１］又は［２］に記載の融合タンパク質。

［５］ＶＨ１、ＶＨ２及びＶＨ３のアミノ酸配列は、互いに異なり、配列番号８８、９０、８、９２、２３、７８、４６、８１、５７、１０９、８２、８３、８４、又は３６に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ、
　ＶＬ１、ＶＬ２及びＶＬ３のアミノ酸配列は、互いに異なり、配列番号８９、９１、１３、９３、２８、７９、８０、５１、６１、８５、８６、８７、又は４０に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
前記［１］又は［２］に記載の融合タンパク質。

［６］ＶＨ（５Ｔ４）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３；配列番号４；及び配列番号５に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（５Ｔ４）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号１９；配列番号２０；及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる、
前記［３］に記載の融合タンパク質。

［７］ＶＨ（ＣＤ３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号９；配列番号１０；及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（ＣＤ３）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号１４；配列番号１５；及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる、
前記［３］に記載の融合タンパク質。

［８］ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－１である。）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号２４；配列番号２５；及び配列番号２６又は２７に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－１である。）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号２９；配列番号３０；及び配列番号３１、３２又は３３に示されるアミノ酸配列からなる、
前記［３］に記載の融合タンパク質。

［９］ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号４７；配列番号４８又は４９；及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号５２；配列番号５３；及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる、
前記［３］に記載の融合タンパク質。

［１０］ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号５８；配列番号５９又は４９；及び配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号６２；配列番号６３；及び配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなる、
前記［３］に記載の融合タンパク質。

［１１］ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＬＡＧ３である。）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３７；配列番号３８；及び配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＬＡＧ３である。）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号４１；配列番号４２；及び配列番号４３に示されるアミノ酸配列からなる、
前記［３］に記載の融合タンパク質。

［１２］ＶＨ（５Ｔ４）のアミノ酸配列が、配列番号８８又は９０に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ
　ＶＬ（５Ｔ４）のアミノ酸配列が、配列番号８９又は９１に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
前記［３］に記載の融合タンパク質。

［１３］ＶＨ（ＣＤ３）のアミノ酸配列が、配列番号８又は９２に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ
　ＶＬ（ＣＤ３）のアミノ酸配列が、配列番号１３又は９３に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
前記［３］に記載の融合タンパク質。

［１４］ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－１である。）のアミノ酸配列が、配列番号２３又は７８に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－１である。）のアミノ酸配列が、配列番号２８、７９又は８０に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
前記［３］に記載の融合タンパク質。

［１５］ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）のアミノ酸配列が、配列番号４６又は８１に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）のアミノ酸配列が、配列番号５１に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
前記［３］に記載の融合タンパク質。

［１６］ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）のアミノ酸配列が、配列番号５７、１０９、８２、８３又は８４に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）のアミノ酸配列が、配列番号６１、８５、８６又は８７に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
前記［３］に記載の融合タンパク質。

［１７］ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＬＡＧ３である。）のアミノ酸配列が、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＬＡＧ３である。）のアミノ酸配列が、配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
前記［３］に記載の融合タンパク質。

［１８］第１の鎖が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ、
　第２の鎖が、配列番号１７、３４、４４、５５、又は１０７に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
前記［１］又は［２］に記載の融合タンパク質。

［１９］第１の鎖：ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ、
　第２の鎖：ＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）が、配列番号１７、３４、４４、５５、又は１０７に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
前記［３］に記載の融合タンパク質。

［２０］（ａ）５Ｔ４、（ｂ）ＣＤ３受容体複合体、及び（ｃ）ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３に対する三重特異性抗体である、前記［１］～［１９］のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
［２１］抗腫瘍活性を有するものである、前記［１］～［２０］のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
［２２］腫瘍が、腫瘍細胞又は癌細胞において５Ｔ４を発現しているものである、前記［２１］に記載の融合タンパク質。
［２３］腫瘍が、ヒト中皮腫（例えば、胸膜中皮腫）、ヒト肺癌、ヒト胃癌、ヒト結腸直腸癌、ヒト食道癌、ヒト子宮体癌、ヒト卵巣癌、ヒト子宮頸癌、ヒト絨毛癌、ヒト胎盤部位栄養膜腫瘍、ヒト膀胱癌、ヒト乳癌、ヒト膵臓癌、ヒト前立腺癌、ヒト腎臓癌、ヒト頭頸部癌、及び、ヒト非セミノーマ性胚細胞腫瘍からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記［２１］又は［２２］に記載の融合タンパク質。

［２４］前記［１］～［２３］のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［２５］前記［２４］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［２６］前記［２５］に記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
［２７］前記［１］～［２３］のいずれか１つに記載の融合タンパク質の製造方法であって、前記［２６］に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物から前記融合タンパク質を回収することを含む、前記製造方法。

［２８］前記［１］～［２３］のいずれか１つに記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
［２９］腫瘍の治療、予防又は診断に用いるものである、前記［２８］に記載の医薬組成物。
［３０］腫瘍が、腫瘍細胞又は癌細胞において５Ｔ４を発現しているものである、前記［２９］に記載の医薬組成物。
［３１］腫瘍が、ヒト中皮腫（例えば、胸膜中皮腫）、ヒト肺癌、ヒト胃癌、ヒト結腸直腸癌、ヒト食道癌、ヒト子宮体癌、ヒト卵巣癌、ヒト子宮頸癌、ヒト絨毛癌、ヒト胎盤部位栄養膜腫瘍、ヒト膀胱癌、ヒト乳癌、ヒト膵臓癌、ヒト前立腺癌、ヒト腎臓癌、ヒト頭頸部癌、及び、ヒト非セミノーマ性胚細胞腫瘍からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記［２９］又は［３０］に記載の医薬組成物。

［３２］前記［２８］～［３１］のいずれか１つに記載の医薬組成物を、対象に投与することを含む、腫瘍の治療、予防又は診断方法。
［３３］腫瘍が、腫瘍細胞又は癌細胞において５Ｔ４を発現しているものである、前記［３２］に記載の方法。
［３４］腫瘍が、ヒト中皮腫（例えば、胸膜中皮腫）、ヒト肺癌、ヒト胃癌、ヒト結腸直腸癌、ヒト食道癌、ヒト子宮体癌、ヒト卵巣癌、ヒト子宮頸癌、ヒト絨毛癌、ヒト胎盤部位栄養膜腫瘍、ヒト膀胱癌、ヒト乳癌、ヒト膵臓癌、ヒト前立腺癌、ヒト腎臓癌、ヒト頭頸部癌、及び、ヒト非セミノーマ性胚細胞腫瘍からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記［３２］又は［３３］に記載の方法。

［３５］前記［１］～［２３］のいずれか１つに記載の融合タンパク質を含む、腫瘍の治療、予防又は診断用キット。
［３６］腫瘍が、腫瘍細胞又は癌細胞において５Ｔ４を発現しているものである、前記［３５］に記載のキット。
［３７］腫瘍が、ヒト中皮腫（例えば、胸膜中皮腫）、ヒト肺癌、ヒト胃癌、ヒト結腸直腸癌、ヒト食道癌、ヒト子宮体癌、ヒト卵巣癌、ヒト子宮頸癌、ヒト絨毛癌、ヒト胎盤部位栄養膜腫瘍、ヒト膀胱癌、ヒト乳癌、ヒト膵臓癌、ヒト前立腺癌、ヒト腎臓癌、ヒト頭頸部癌、及び、ヒト非セミノーマ性胚細胞腫瘍からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記［３５］又は［３６］に記載のキット。

　本発明によれば、従来の二重特異性トライボディである融合タンパク質Tb535Hに比べて有意に抗腫瘍効果が増大された多重特異性トライボディとしての融合タンパク質等を提供することができる。本発明に係る融合タンパク質は、５Ｔ４、及びＣＤ３受容体複合体に対する結合能を有するのみならず、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３に対する結合能も有する（すなわち、免疫チェックポイント阻害活性も有する）三重特異性トライボディであり、優れた抗腫瘍効果を発揮し得るものである。

トライボディの構造の概略図である。　A. 53Xトライボディ分子の構築物のスキーム。SP：ヒトインターロイキン（IL）-2シグナルペプチド；VH_5T4、VL_5T4：それぞれヒト5T4に特異的なTb535Hの免疫グロブリン重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列；CH1、CL：それぞれヒト免疫グロブリン重鎖定常領域1及びκ軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列；VH_CD3、VL_CD3：それぞれヒトCD3に特異的なscFvを構築するヒト化OKT3からの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列；L1、L2：それぞれフレキシブルリンカーを有するアミノ酸配列（GPGGGSPG（配列番号６）及びGGGGSGGGGSGGGGS [すなわち(GGGS)₃]（配列番号１０６）を含む）。VH_C及びVL_Cは、ヒトPD-1、PD-L1、又はLAG3に特異性を有するscFvを構築する、PD-1-1、PD-L1_1、10.12、 LAG3_1、又はパリビズマブ由来の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列。パリビズマブ由来scFvは、アイソタイプヒト抗体由来scFvコントロール用である。6xHisはヘキサヒスチジンタグをコードするアミノ酸配列。　B. Tb535H[(5T4)₂×CD3]、53D[5T4×CD3×PD-1]、53L1[5T4×CD3×PD-L1]、53L10[5T4×CD3×PD-L1]、53G[5T4×CD3×LAG3]、及び53P[5T4×CD3×アイソタイプコントロール]のそれぞれについて構築したトライボディタンパク質のスキーム。 ELISAにおける組換え5T4タンパク質へのTb535H及び構築した新規53Xトライボディの結合親和性を示す図である。　A. 組換えヒト5T4タンパク質へのトライボディ（0～500nM）のELISAアッセイによる結合曲線。　B. 各構築物の5T4結合のEC₅₀（nM）値。 ELISAにおける組換えCD3タンパク質へのTb535H及び構築した新規53Xトライボディの結合親和性を示す図である。　A. 組換えヒトCD3δ/εヘテロダイマータンパク質へのトライボディ（0～500nM）のELISAアッセイによる結合曲線。　B. 各トライボディ構築物のCD3結合のEC₅₀（nM）値。 ELISAにおける組換えPD-L1タンパク質又はPD-1タンパク質への示されたトライボディの結合親和性を示す図である。　A. 組換えヒトPD-L1タンパク質への53L1トライボディ及び53L10トライボディ（0～500nM）のELISAアッセイによる結合曲線。　B. 組換えヒトPD-1タンパク質への53Dトライボディ（0～500nM）のELISAアッセイによる結合曲線。 5T4発現標的細胞の存在下でのT細胞活性化バイオアッセイを示す図である。　A. T細胞活性化バイオアッセイ（NFAT）（Promega社、カタログ番号J1621）による5T4発現細胞の存在下でのTCR/CD3活性化の概略図。　B. NFAT応答エレメント（NFAT-RE）（「TCR/CD3エフェクター細胞」）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子改変Jurkat T細胞株を、CHO-K1-5T4細胞の存在下で、図中に示されたトライボディの濃度を上げながらインキュベートした。37℃で4時間インキュベートした後、Bio-Glo（商標）試薬を添加し、発光をルミノメーターで測定した。　C.各構築物の5T4を介したTCR/CD3活性化のEC₅₀（nM）値。競合ELISAアッセイによって試験した53Xトライボディのアンタゴニスト作用を示す図である。　ELISAアッセイは、各ビオチン標識リコンビナントヒトPD-L1又はMHCIIタンパク質（縞模様の棒）のPD-1又はLAG-3固定化タンパク質への結合をそれぞれ測定することによって、未標識競合抗PD-L1（53L1及び51L10）（A）、抗PD-1（53D）（B）、若しくは抗LAG-3（53G）（C）トライボディ（黒色の棒）、又はそれぞれの親mAb（灰色の棒）（飽和濃度で使用（抗PD-L1または抗PD-1の場合は5：1、抗LAG-3 の場合は3：1））の非存在下又は存在下で行った。ヒトIgG4アイソタイプコンロトールとして使用した（空の棒）。結合値は、3回の独立した実験で得られた少なくとも3回の測定の平均値として報告した。平均値±標準偏(SD)として示した。チューデントのt検定（2変数）によるP値は以下のとおりである。**P＜0.01、*P＜0.05。 hPBMCと共培養したMDA-MB-231ヒト乳癌細胞に対する新規トライボディ又はTb535H単独、または親mAbと併用投与した場合の細胞傷害活性を示す図である。　MDA-MB-231ヒト乳癌細胞をhPBMCと共培養し（エフェクター：標的細胞比5：1）、53L1及び53L10（A．縞模様の棒）、53D（B．縞模様の棒）、53G（C：縞模様の棒）で48時間処理した。Tb535H（明るい灰色の棒）、親の免疫調節mAb（暗い灰色の棒）、又はそれらの組み合わせ（黒色の棒）も示された濃度で試験した。無処理の共培養、またはトライボディ53P（C：空の棒）をネガティブコントロールとした。後述の「材料及び方法」に記載されているように、LDH放出を検出することによって細胞溶解を測定した。平均値±SDとして示した。スチューデントのt検定（2変数）によるP値は以下のとおりである。***P＜0.001、**P＜0.01、*P＜0.05。 hPBMCと共培養したA549ヒト肺癌細胞に対する新規トライボディ又はTb535H単独、または親mAbと併用投与した場合の細胞傷害活性を示す図である。　A549ヒト肺癌細胞をhPBMCと共培養し（エフェクター：標的細胞比5：1）、53L1及び53L10（A．縞模様の棒）、53D（B．縞模様の棒）、53G（C：縞模様の棒）で48時間処理した。Tb535H（明るい灰色の棒）、親の免疫調節mAb（暗い灰色の棒）、又はそれらの組み合わせ（黒色の棒）も示された濃度で試験した。無処理の共培養、またはトライボディ53P（C：空の棒）をネガティブコントロールとした。後述の「材料及び方法」に記載されているように、LDH放出を検出することによって細胞溶解を測定した。平均値±SDとして示した。スチューデントのt検定（2変数）によるP値は以下のとおりである。***P＜0.001、**P＜0.01、*P＜0.05。 MDA-MB-231ヒト乳癌細胞とhPBMCとの共培養によるIFN-γの分泌に対する新規トライボディ又はTb535H単独、または親mAbとの併用投与による効果を示す図である。　IFN-γの分泌は、53L1及び53L10（A．縞模様の棒）、53D（B.縞模様の棒）、53G（C．縞模様の棒）で48時間処理したMDA-MB-231ヒト乳癌細胞とhPBMCの共培養の培養上清をELISAによって測定した。Tb535H（明るい灰色の棒）、親の免疫調節mAb（暗い灰色の棒）、又はそれらの組み合わせ（黒色の棒）についても図中に示された濃度で試験した。無処理の共培養、またはトライボディ53P（C：空の棒）をネガティブコントロールとした。平均値±SDとして示した。スチューデントのt検定（2変数）によるP値は以下のとおりである。***P＜0.001、**P＜0.01、*P＜0.05。インビボにおけるTb535H並びに新規トライボディ53L1及び53L10の抗腫瘍効果を示す図である。　（A）Tb535H、（B）53L1、及び（C）53L10の投与によるヒトPBMCの存在下でのA549皮下腫瘍の腫瘍増殖曲線。●:溶媒（PBS）投与、〇:2μg/マウスでの投与、△:20μg/マウスでの投与。5×10⁶細胞のA549ヒト肺癌細胞を、同数のヒトPBMC（hPBMC）と共にNOD-scidマウスの右脇腹に皮下移植した。hPBMCは、移植前に、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28（Veritas社）で4日間刺激して活性化したものを使用した。図中に示された被験薬物を示された投与量で、細胞移植後0、2、4、6、8、及び10日目（合計6回投与）に静脈内投与を行った。腫瘍体積は平均値±標準偏差（SD）として表した。有意差検定はダネット検定（対溶媒投与群）によって行った。*P＜0.05。異なる実験セットにおける53L10トライボディの腫瘍退縮活性を示す図である。　A549異種移植モデルにおける53L10トライボディの腫瘍退縮活性。A549細胞及びhPBMCの調製、A549及びhPBMCの混合細胞の皮下移植は、図10と同様に行った。2μg/マウス（〇）又は20μg/マウス（△）の投与量で、53L10を、0、2、4、6、8、及び10日目に静脈内投与した。無投与群（●）の腫瘍増殖をコントロール群として使用した。腫瘍体積は平均±標準偏差（SD）として表した。有意差検定はダネット検定（対無投与群）によって行った。*P＜0.05。インビボにおける53Pと比較した53D及び53Gの抗腫瘍効果を示す図である。　（A）53P（ネガティブコントロール）、（B）53D、及び（C）53Gの投与によるヒトPBMCの存在下でのA549皮下腫瘍の腫瘍増殖曲線。●:溶媒（PBS）投与、〇:2μg/マウスでの投与、△:20μg/マウスでの投与。腫瘍体積は平均±標準偏差（SD）として表した。有意差検定はダネット検定（対溶媒投与群）によって行った。*P＜0.05。インビボにおけるTb535H、Tb535Hとペムブロリズマブとの併用投与、並びに新規トライボディ53L10の抗腫瘍効果を示す図である。　A. Tb535Hまたは新規トライボディ53L10の投与によるヒトPBMC存在下でのA549皮下腫瘍の腫瘍増殖曲線。　B. Tb535Hとペムブロリズマブの併用投与または新規トライボディ53L10の投与によるヒトPBMC存在下でのA549皮下腫瘍の腫瘍増殖曲線。上記［図１３Ａ］での説明が参照される。 ELISAにおける組換え5T4タンパク質への53L10、および53L10-M13の結合親和性を示す図である（N＝２）。　A. 組換えヒト5T4タンパク質への53L10、および53L10-M13（0～500nM）のELISAアッセイによる結合曲線。　B. 各構築物の5T4結合のEC₅₀（nM）値。 ELISAにおける組換えCD3タンパク質への53L10、および53L10-M13の結合親和性を示す図である（N＝２）。　A. 組換えヒトCD3δ/εヘテロダイマータンパク質への53L10、および53L10-M13（0～500nM）のELISAアッセイによる結合曲線。　B. 各構築物のCD3結合のEC₅₀（nM）値。 ELISAにおける組換えPD-L1タンパク質への53L10、および53L10-M13の結合親和性を示す図である（N＝２）。　A. 組換えヒトPD-L1タンパク質への53L10、および53L10-M13（0～500nM）のELISAアッセイによる結合曲線。　B. 各構築物のPD-L1結合のEC₅₀（nM）値。 5T4発現標的細胞の存在下でのT細胞活性化バイオアッセイを示す図である（N＝２）。　A. NFAT応答エレメント（NFAT-RE）（「TCR/CD3エフェクター細胞」）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子改変Jurkat T細胞株を、CHO-K1-5T4細胞の存在下で、図中に示されたトライボディの濃度を上げながらインキュベートした。37℃で6時間インキュベートした後、Bio-Glo（商標）試薬を添加し、発光をルミノメーターで測定した。　B. 各構築物の5T4を介したTCR/CD3活性化のEC₅₀（nM）値。 53L10-M13、およびTb535Hのh5T4、hPD-L1発現標的癌細胞（A549ヒト肺癌細胞）存在下でのT細胞活性化マーカー（CD25, CD69)測定試験を示す図である。　A. A549ヒト肺癌細胞上の標的分子（h5T4、hPD-L1）発現をフローサイトメトリーで確認した。　B. フローサイトメーターで測定したCD3陽性細胞に占めるCD69陽性細胞の割合。　C. フローサイトメーターで測定したCD3陽性細胞に占めるCD25陽性細胞の割合。　D. それぞれのT細胞活性化マーカーで評価した各構築物のT細胞活性化のEC₅₀（pM）値、およびE_max（％）値と、その95%信頼区間 (Confidence interval, CI)。n.c.（Not calculated)は算出不可。上記［図１８Ａ－Ｃ］での説明が参照される。 53L10-M13、およびTb535Hの標的癌細胞株非存在下でのT細胞活性化マーカー（CD25, CD69)測定試験を示す図である。　A. フローサイトメーターで測定したCD3陽性細胞に占めるCD69陽性細胞の割合。　B. フローサイトメーターで測定したCD3陽性細胞に占めるCD25陽性細胞の割合。 53L10-M13、およびTb535Hのh5T4発現標的癌細胞（MCF-7ヒト乳癌細胞）存在下でのT細胞活性化マーカー（CD25, CD69)測定試験を示す図である。　A. MCF-7ヒト乳癌細胞上の標的分子（h5T4、hPD-L1）発現をフローサイトメトリーで確認した。　B. フローサイトメーターで測定したCD3陽性細胞に占めるCD69陽性細胞の割合。　C. フローサイトメーターで測定したCD3陽性細胞に占めるCD25陽性細胞の割合。　D. それぞれのT細胞活性化マーカーで評価した各構築物のT細胞活性化のEC₅₀（pM）値、およびE_max（％）値と、その95%信頼区間。上記［図２０Ａ－Ｃ］での説明が参照される。 T細胞活性化試験における遊離サイトカインの培養上清中濃度を示す図である。　A. ELISAで測定したhTNFαの濃度。　B. ELISAで測定したhIL-2の濃度。　C. ELISAで測定したhIL-6の濃度。　D. ELISAで測定したヒトインターフェロンγ（hIFNγ）の濃度。上記［図２１Ａ］での説明が参照される。上記［図２１Ａ］での説明が参照される。上記［図２１Ａ］での説明が参照される。 h5T4、hPD-L1発現標的癌細胞（A549ヒト肺癌細胞）にhPBMC(活性化処理なし）、および53L10-M13もしくはTb535Hを添加したした際の細胞障害性を示す図である。　A. フローサイトメーターで測定した細胞障害性。　B. 各構築物の細胞障害活性のEC₅₀（pM）値、およびE_max（％）値と、その95%信頼区間。 h5T4、hPD-L1発現標的癌細胞（A549ヒト肺癌細胞）に活性化hPBMC、および53L10-M13もしくはTb535Hを添加したした際の細胞障害性を示す図である。　A. フローサイトメーターで測定した細胞障害性。　B. 各構築物の細胞障害活性のEC₅₀（pM）値、およびE_max（％）値と、その95%信頼区間。

　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
　なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる、特願2022-106054号明細書（2022年6月30日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。

１．本発明の概要
　本発明に係る融合タンパク質として、新規の三重特異性多機能トライボディ（三重特異性抗体ともいう；53Xトライボディ）が構築された。この新規53Xトライボディとしては、例えば、5T4結合Fab及びCD3結合scFvから構成されるが、親タンパク質のTb535Hとは異なり、残部のscFvは、PD-1、PD-L1、LAG-3などの免疫チェックポイント分子に特異的な抗体に由来するもの（例えば、前掲の特許文献２及び非特許文献１０参照）等が挙げられる。5T4を標的とする二重特異性T細胞誘導体である親タンパク質Tb535Hと比較して、新規53Xトライボディは、Tb535Hトライボディと同様の5T4ならびにＣＤ３受容体複合体に対する結合特性を保持したが、5T4を介したTCR/CD3活性化に加えて、単一分子にチェックポイント阻害活性が組み込まれることにより、さらに抗腫瘍効果の増大を示した。特に、5T4、CD3、及びPD-L1免疫チェックポイントを標的とする三重特異性T細胞誘導体である53L10と称される新規53Xトライボディは、インビトロ及びインビボで最も有望な抗腫瘍効果を示すものであった。

２．融合タンパク質（53Xトライボディ）
　本発明に係る融合タンパク質は、第１及び第２の２つの異なる鎖を含む融合タンパク質であり、
　第１の鎖が、２つの抗体可変領域ＶＨ１及びＶＨ２、１つの抗体可変領域ＶＬ２、並びに１つの抗体定常領域ＣＨ１又はＣＬを含み、
　第２の鎖が、２つの抗体可変領域ＶＬ１及びＶＬ３、１つの抗体可変領域ＶＨ３、並びに１つの抗体定常領域ＣＬ又はＣＨ１を含むものである。
　ここで、「抗体可変領域」は、所与の抗原（タンパク質等）、ひいてはその抗原におけるエピトープと特異的に結合又は相互作用できる抗体分子を構成するポリペプチドのモチーフである。上記ＶＨ１～ＶＨ３はいずれも、抗体分子における重鎖可変領域からなる、又は該可変領域を含むポリペプチドということができ、上記ＶＬ１～ＶＬ３はいずれも、抗体分子における軽鎖可変領域からなる、又は該可変領域を含むポリペプチドということができる。そして、ＶＨ１とＶＬ１、ＶＨ２とＶＬ２、ＶＨ３とＶＬ３は、それぞれ互いに組み合わさることで、所与の抗原への結合ドメインを形成する。これを、本発明においては、「組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメイン」と称し、それぞれの組み合わせごとに、「ＶＨ１／ＶＬ１結合ドメイン」、「ＶＨ２／ＶＬ２結合ドメイン」、及び「ＶＨ３／ＶＬ３結合ドメイン」と称する。また、「抗体定常領域」は、抗原結合に直接には関与しないが、例えば、抗体依存性、細胞介在性細胞傷害作用、及び補体活性化などの様々なエフェクター機能を示す、抗体分子を構成するポリペプチドのモチーフである。

　本発明に係る融合タンパク質は、第１及び第２の鎖は、その間にヘテロ二量体相互作用を含有する。ヘテロ二量体相互作用は、一方の鎖のＣＨ１と他方の鎖のＣＬドメインとの間に含有していてもよく、ＶＨ１とＶＬ１との間に含有していてもよいが、一方の鎖のＣＨ１と他方の鎖のＣＬドメインとの間に含有されていることが好ましい。これら相互作用によって、本発明に係る融合タンパク質は、第１の鎖と第２の鎖とのヘテロ二量体のタンパク質であることが好ましい。上記ヘテロ二量体相互作用は、限定はされないが、一般的には、Ｆａｂにおいて従来公知のヘテロ二量体化のための相互作用が好ましい。Ｆａｂとは、ＶＨ及びＣＨ１抗体ドメインを含むＦｄ鎖と、ＶＬ及びＣＬ抗体ドメインを含むＬ鎖との間のヘテロ二量体であり、このヘテロ二量体化のために、ＶＨ１とＶＬ１との間、及び／又はＣＨ１とＣＬとの間で相互作用（例えばジスルフィド結合など）が形成されている。当該相互作用については、例えば、前掲の特許文献３を参照することもできる。

　本発明に係る融合タンパク質は、当該タンパク質内に、前述した３種の組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメイン、すなわち、ＶＨ１／ＶＬ１結合ドメイン、ＶＨ２／ＶＬ２結合ドメイン、及びＶＨ３／ＶＬ３結合ドメインを形成するものである。これら３種の結合ドメインは、それぞれ互いに異なる物質（抗原タンパク質）に対する結合能を有する。具体的には、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの結合能を有することを特徴とする。
　（ｉ）５Ｔ４（腫瘍関連抗原(TAA)）に対する結合能；
　（ｉｉ）ＣＤ３受容体複合体に対する結合能；及び
　（ｉｉｉ）ＰＤ－１（Programmed death receptor-1）、ＰＤ－Ｌ１（Programmed cell Death 1- Ligand 1）、又はＬＡＧ３（Lymphocyte activation gene 3：CD223）に対する結合能。

　５Ｔ４（腫瘍関連抗原(TAA)）に対する結合能を有する、組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメイン（あるいはＶＨ及びＶＬ自体）は、例えば、抗原としての５Ｔ４を入手又は調製し、当該抗原に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体を作製した後、当該抗体由来の所望の断片（ＶＨ、ＶＬ）を調製することなどで適宜構築・入手可能である。同様の手法で、ＣＤ３受容体複合体に対する結合能や、ＰＤ－１に対する結合能や、ＰＤ－Ｌ１に対する結合能や、ＬＡＧ３に対する結合能、を有する種々の組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメイン（あるいはＶＨ及びＶＬ自体）も、適宜構築・入手可能である。このような、抗原の調製、ポリクローナル又はモノクローナル抗体の作製、遺伝子組換え抗体（キメラ抗体、ヒト型化抗体（ヒト化抗体）、及びヒト抗体（完全ヒト抗体）等）の作製、及び抗体断片の調製などの詳細・例示説明ついては、例えば、WO 2014/054820及びWO 2013/077458における記載を適宜参照・適用することができる。

　なお、ヒト５Ｔ４のアミノ酸配列（配列番号９６）の情報は、例えば、Uniprotウェブサイト（https://www.uniprot.org/（以下同様））に「Primary (citable) accession number：Q13641」として公表されており、
　ヒトＣＤ３受容体複合体のCD3イプシロンサブユニットのアミノ酸配列（配列番号９７）の情報は、例えば、Uniprotウェブサイトに「Primary (citable) accession number：P07766」として公表されており、CD3デルタサブユニット（Isoform 1）のアミノ酸配列（配列番号９８）の情報は、例えば、Uniprotウェブサイトに「Primary (citable) accession number：P04234-1」として公表されており、CD3デルタサブユニット（Isoform 2）のアミノ酸配列（配列番号９９）の情報は、例えば、Uniprotウェブサイトに「Primary (citable) accession number：P04234-2」として公表されており、
　ヒトＰＤ－１のアミノ酸配列（配列番号１００）の情報は、例えば、Uniprotウェブサイトに「Primary (citable) accession number：Q15116」として公表されており、
　ヒトＰＤ－Ｌ１（Isoform 1）のアミノ酸配列（配列番号１０１）の情報は、例えば、Uniprotウェブサイトに「Primary (citable) accession number：Q9NZQ7-1」として公表されており、ヒトＰＤ－Ｌ１（Isoform 2）のアミノ酸配列（配列番号１０２）の情報は、例えば、Uniprotウェブサイトに「Primary (citable) accession number：Q9NZQ7-2」として公表されており、ヒトＰＤ－Ｌ１（Isoform 3）のアミノ酸配列（配列番号１０３）の情報は、例えば、Uniprotウェブサイトに「Primary (citable) accession number：Q9NZQ7-3」として公表されており、
　ヒトＬＡＧ３（Isoform 1）のアミノ酸配列（配列番号１０４）の情報は、例えば、Uniprotウェブサイトに「Primary (citable) accession number：P18627-1」として公表されており、ヒトＬＡＧ３（Isoform 2）のアミノ酸配列（配列番号１０５）の情報は、例えば、Uniprotウェブサイトに「Primary (citable) accession number：P18627-2」として公表されている。抗原の調製や抗体及び抗体断片の作製又は調製においては、これらの配列情報を適宜利用することができる。

　本発明に係る融合タンパク質における、ＶＨ１、ＶＨ２及びＶＨ３は、それぞれ互いに異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。ＶＨ１、ＶＨ２及びＶＨ３に採用し得るＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、限定はされないが、例えば、それぞれ順に、
　配列番号３；配列番号４；及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、
　配列番号９；配列番号１０；及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
　配列番号２４；配列番号２５；及び配列番号２６又は２７に示されるアミノ酸配列（なお、配列番号２７のアミノ酸配列は、配列番号２６のアミノ酸配列に代えて好ましく採用し得るものである。）、
　配列番号３７；配列番号３８；及び配列番号３９に示されるアミノ酸配列、
　配列番号４７；配列番号４８又は４９；及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列、あるいは、
　配列番号５８；配列番号５９又は４９；及び配列番号６０に示されるアミノ酸配列
からなるものが好ましく挙げられる。

　同様に、本発明に係る融合タンパク質における、ＶＬ１、ＶＬ２及びＶＬ３は、それぞれ互いに異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。ＶＬ１、ＶＬ２及びＶＬ３に採用し得るＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、限定はされないが、例えば、それぞれ順に、
　配列番号１９；配列番号２０；及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列、
　配列番号１４；配列番号１５；及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列、
　配列番号２９；配列番号３０；及び配列番号３１、３２又は３３に示されるアミノ酸配列（なお、配列番号３２及び３３のアミノ酸配列は、配列番号３１のアミノ酸配列に代えて好ましく採用し得るものである。）、
　配列番号４１；配列番号４２；及び配列番号４３に示されるアミノ酸配列、
　配列番号５２；配列番号５３；及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列、あるいは、
　配列番号６２；配列番号６３；及び配列番号６４に示されるアミノ酸配列
からなるものが好ましく挙げられる。

　また、本発明に係る融合タンパク質における、ＶＨ１、ＶＨ２及びＶＨ３のアミノ酸配列は、それぞれ互いに異なり、例えば、配列番号８８、９０、８、９２、２３、７８、４６、８１、５７、１０９、８２、８３、８４、又は３６に示されるアミノ酸配列からなるものや、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものが、好ましく挙げられる。ここで、配列番号７８のアミノ酸は、配列番号２３のアミノ酸に代えて好ましく採用し得るものであり、配列番号８１のアミノ酸は、配列番号４６のアミノ酸に代えて好ましく採用し得るものであり、配列番号８２～８４及び１０９のアミノ酸は、配列番号５７のアミノ酸に代えて好ましく採用し得るものである。

　これに加えて、本発明に係る融合タンパク質における、ＶＬ１、ＶＬ２及びＶＬ３のアミノ酸配列は、それぞれ互いに異なり、例えば、配列番号８９、９１、１３、９３、２８、７９、８０、５１、６１、８５、８６、８７、又は４０に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものが、好ましく挙げられる。ここで、配列番号７９及び８０のアミノ酸は、配列番号２８のアミノ酸に代えて好ましく採用し得るものであり、配列番号８５～８７のアミノ酸は、配列番号６１のアミノ酸に代えて好ましく採用し得るものである。

　さらに、本発明に係る融合タンパク質においては、第１の鎖が、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであることが好ましい。これに加えて、第２の鎖が、例えば、配列番号１７、３４、４４、５５、又は１０７に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであることが好ましい。

　本発明に係る融合タンパク質の他の態様としては、例えば、前記第１と第２の２つの異なる鎖の組み合わせが、下記のａ）～ｌ）に示す組み合わせであることが好ましい。
ａ）第１の鎖：
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と
の組み合わせ。

ｂ）第１の鎖：
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と
の組み合わせ。

ｃ）第１の鎖：
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と
の組み合わせ。

ｄ）第１の鎖：
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と
の組み合わせ。

ｅ）第１の鎖：
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と
の組み合わせ。

ｆ）第１の鎖：
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と
の組み合わせ。

ｇ）第１の鎖：
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と
の組み合わせ。

ｈ）第１の鎖：
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と
の組み合わせ。

ｉ）第１の鎖：
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と
の組み合わせ。

ｊ）第１の鎖：
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と
の組み合わせ。

ｋ）第１の鎖：
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と
の組み合わせ。

ｌ）第１の鎖：
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と
の組み合わせ。

　ここで、上記ａ）～ｌ）で示す、第１の鎖及び／又は第２の鎖において、
　ＶＨ及びＶＬは、抗体可変領域であり、
　ＶＨ（５Ｔ４）及びＶＬ（５Ｔ４）は、５Ｔ４に対する抗体可変領域であり、
　ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）は、ＣＤ３受容体複合体に対する抗体可変領域であり、
　ＶＨ（Ｘ）及びＶＬ（Ｘ）は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３に対する抗体可変領域であり、
　ＣＨ１及びＣＬは、抗体定常領域であり、
　Ｌ１及びＬ２は、リンカーである。

　また、より具体的には、
　ＶＨ（５Ｔ４）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３；配列番号４；及び配列番号５に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（５Ｔ４）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号１９；配列番号２０；及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなることが好ましく、
　さらに、ＶＨ（５Ｔ４）のアミノ酸配列が、配列番号８８又は９０に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであり、かつ
　ＶＬ（５Ｔ４）のアミノ酸配列が、配列番号８９又は９１に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであることがより好ましい。

　また、より具体的には、
　ＶＨ（ＣＤ３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号９；配列番号１０；及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（ＣＤ３）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号１４；配列番号１５；及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなることが好ましく、
　さらに、ＶＨ（ＣＤ３）のアミノ酸配列が、配列番号８又は９２に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであり、かつ
　ＶＬ（ＣＤ３）のアミノ酸配列が、配列番号１３又は９３に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであることがより好ましい。

　また、より具体的には、
　ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－１である。）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号２４；配列番号２５；及び配列番号２６又は２７に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－１である。）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号２９；配列番号３０；及び配列番号３１、３２又は３３に示されるアミノ酸配列からなることが好ましく、
　さらに、ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－１である。）のアミノ酸配列が、配列番号２３又は７８に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－１である。）のアミノ酸配列が、配列番号２８、７９又は８０に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであることがより好ましい。

　また、より具体的には、
　ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１（より具体的にはPD-L1.1）である。）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号４７；配列番号４８又は４９；及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１（より具体的にはPD-L1.1）である。）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号５２；配列番号５３；及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなることが好ましく、
　さらに、ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１（より具体的にはPD-L1.1）である。）のアミノ酸配列が、配列番号４６又は８１に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１（より具体的にはPD-L1.1）である。）のアミノ酸配列が、配列番号５１に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであることがより好ましい。

　また、より具体的には、
　ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１（より具体的には10.12）である。）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号５８；配列番号５９又は４９；及び配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１（より具体的には10.12）である。）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号６２；配列番号６３；及び配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなることが好ましく、
　さらに、ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１（より具体的には10.12）である。）のアミノ酸配列が、配列番号５７、１０９、８２、８３又は８４に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１（より具体的には10.12）である。）のアミノ酸配列が、配列番号６１、８５、８６又は８７に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであることがより好ましい。

　また、より具体的には、
　ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＬＡＧ３である。）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３７；配列番号３８；及び配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＬＡＧ３である。）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号４１；配列番号４２；及び配列番号４３に示されるアミノ酸配列からなることが好ましく、
　さらに、ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＬＡＧ３である。）のアミノ酸配列が、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＬＡＧ３である。）のアミノ酸配列が、配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであることがより好ましい。

　また、より具体的には、
　抗体定常領域であるＣＨ１のアミノ酸配列は、配列番号９４に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであることが好ましく、
　抗体定常領域であるＣＬのアミノ酸配列は、配列番号９５に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであることが好ましく、
　リンカーであるＬ１は、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであることが好ましく、
　リンカーであるＬ２は、配列番号１２又は１０６に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであることが好ましい。

　さらに具体的には、本発明に係る融合タンパク質において、
　第１の鎖：ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであり、かつ、
　第２の鎖：ＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）が、配列番号１７、３４、４４、５５、又は１０７に示されるアミノ酸配列からなるもの、該アミノ酸配列を含むもの、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％（又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい）の同一性を有するものであることがより好ましい。

　当該好ましい態様に含まれる本発明の融合タンパク質について、Ｈ鎖誘導体、及び各種Ｌ鎖誘導体の全長、並びに個々のドメイン、領域及びリンカーの、アミノ酸配列を示す配列番号を一覧にした表を、以下に示す。

　以上のように具体的に説明することができる、本発明に係る融合タンパク質は、（ａ）５Ｔ４、（ｂ）Ｔ細胞のＣＤ３受容体複合体、及び（ｃ）ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３に対する三重特異性抗体（トライボディ）であることが好ましく、それにより当該抗体は抗腫瘍活性を有するものであり、しかも、従来のTb535Hトライボディや、それと抗ＰＤ－１抗体や抗ＰＤ－Ｌ１抗体との併用療法と比べても、抗腫瘍効果が有意に増大したものである。なかでも、特に抗腫瘍効果に優れている点で、（ａ）５Ｔ４、（ｂ）Ｔ細胞のＣＤ３受容体複合体、及び（ｃ）ＰＤ－Ｌ１に対する三重特異性抗体が好ましい。従って、本発明は、腫瘍又は癌の治療、予防又は診断に使用し得る三重特異性抗体としての融合タンパク質も提供するものである。

　ここで、上記腫瘍としては、限定はされず、腫瘍細胞又は癌細胞において５Ｔ４を発現しているものが好ましく、具体的には、例えば、ヒト中皮腫（例えば、胸膜中皮腫）、ヒト肺癌、ヒト胃癌、ヒト結腸直腸癌、ヒト食道癌、ヒト子宮体癌、ヒト卵巣癌、ヒト子宮頸癌、ヒト絨毛癌、ヒト胎盤部位栄養膜腫瘍、ヒト膀胱癌、ヒト乳癌、ヒト膵臓癌、ヒト前立腺癌、ヒト腎臓癌、ヒト頭頸部癌、及び、ヒト非セミノーマ性胚細胞腫瘍からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく挙げられる。これら腫瘍の例示については、後述の説明においても適宜同様に適用される。

３．ポリヌクレオチド、組換えベクター及び形質転換体
　本発明においては、上述した本発明に係る融合タンパク質（53Xトライボディ）をコードするポリヌクレオチド（遺伝子、DNA）も提供することができる。当該ポリヌクレオチドとしては、具体的には、上述した本発明に係る融合タンパク質の例示として示した各アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであることが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいし、当該ポリヌクレオチドを一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、SD配列、Kozak配列、ターミネーター等）、及び／又はタンパク質精製を容易とするような追加の配列（もしくはタグ配列、例えば６×His配列）をも含むものであってもよく、限定はされない。

　本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、翻訳後の個々のアミノ酸に対応するコドンは、特に限定はされず、転写後、ヒト等の哺乳類において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すヌクレオチドDNAを含むものであってもよいし、また、大腸菌や酵母等の微生物や、植物等において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すヌクレオチドDNAを含むものであってもよい。
　本発明においては、上記本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターや、当該組換えベクターを含む形質転換体を提供することもできる。

　組換えベクターとして用いる発現ベクターに組込むポリヌクレオチド（遺伝子、DNA）には、必要に応じて、予め、上流に転写プロモーター、SD配列（宿主が原核細胞の場合）及びKozak配列（宿主が真核細胞の場合）を連結しておいてもよいし、下流にターミネーターを連結しておいてもよく、その他、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー等を連結しておくこともできる。なお、上記転写プロモーター等の遺伝子発現に必要な各要素は、初めから当該ポリヌクレオチドに含まれていてもよいし、もともと発現ベクターに含まれている場合はそれを利用してもよく、各要素の使用態様は特に限定されない。

　発現ベクターに当該ポリヌクレオチドを組込む方法としては、例えば、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを用いる方法など、公知の遺伝子組換え技術を利用した各種方法が採用できる。また、発現ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、レトロウイルスベクター、人工染色体DNAなど、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子、DNA）を保持し得るものであれば、限定はされず、使用する宿主細胞に適したベクターを適宜選択して使用することができる。

　次いで、構築した上記組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得、これを培養することにより、本発明に係る融合タンパク質を発現させることができる。なお、本発明で言う「形質転換体」とは宿主に外来遺伝子が導入されたものを意味し、例えば、宿主にプラスミドDNA等を導入すること（形質転換）で外来遺伝子が導入されたもの、並びに、宿主に各種ウイルス及びファージを感染させること（形質導入）で外来遺伝子が導入されたものが含まれる。

　宿主としては、上記組換えベクターが導入された後、本発明に係る融合タンパク質を発現し得るものであれば、限定はされず、適宜選択することができるが、例えば、ヒトやマウス等の各種動物細胞、各種植物細胞、細菌、酵母、植物細胞等の公知の宿主が挙げられる。
　動物細胞を宿主とする場合は、例えば、ヒト繊維芽細胞、ヒト胎児腎細胞、HEK293細胞、293F細胞、CHO細胞、サル細胞COS-7、Vero、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等が用いられる。また、Sf9細胞、Sf21細胞等の昆虫細胞を用いることもできる。
　細菌を宿主とする場合、例えば、大腸菌、枯草菌等が用いられる。
　酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等が用いられる。
　植物細胞を宿主とする場合は、例えば、タバコBY-2細胞等が用いられる。

　形質転換体を得る方法は、限定はされず、宿主と発現ベクターとの種類の組み合わせを考慮し、適宜選択することができるが、例えば、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショック法、PEG法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、並びに、DNAウイルスやRNAウイルス等の各種ウイルスを感染させる方法などが好ましく挙げられる。
　得られる形質転換体においては、組換えベクターに含まれるポリヌクレオチドのコドン型は、用いた宿主のコドン型と一致していても異なっていてもよく、限定はされない。

　また、本発明においては、上記の形質転換体を培養し、得られた培養物から本発明に係る融合タンパク質（53Xトライボディ）を回収（さらには精製）することを含む、当該融合タンパク質（53Xトライボディ）の製造方法を提供することもできる。さらに、当該製造方法により得られる融合タンパク質（53Xトライボディ）も、本発明に含まれる。なお、上記培養や回収・精製等の方法及び条件等は、当業者の技術常識や公知の知見に基づいて、適宜選択及び採用することができる。

４．医薬組成物等
　本発明に係る融合タンパク質（53Xトライボディ）は、医薬組成物に含まれる有効成分として有用である。
　本発明に係る融合タンパク質は、前述のとおり抗腫瘍活性を有し得るものであるため、本発明に係る融合タンパク質は、腫瘍の治療用、予防用及び／又は診断用に使用されることが好ましい。従って、当該医薬組成物は、腫瘍の治療用及び／又は予防用、さらには診断用の医薬組成物として有用である。すなわち、本発明に係る融合タンパク質は、腫瘍治療剤及び腫瘍診断剤に含まれる有効成分として有用なものである。なお、本発明において、上記腫瘍の治療には、腫瘍の成長阻害及び成長抑制の意味も含むものとし、具体的には、例えば腫瘍治療剤であれば、腫瘍の成長阻害剤及び成長抑制剤の形態も含むものとする。

　本発明の医薬組成物は、本発明に係る融合タンパク質を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供されることが好ましい。
　本発明の医薬組成物の適用対象となる腫瘍については、前述した腫瘍又は癌の例示説明を同様に適用できる。適用対象となる腫瘍は、再発癌や転移癌であってもよく、本発明の医薬組成物（ひいては、本発明に係る融合タンパク質）は、再発癌や転移癌の治療剤、予防剤及び診断剤としても有効に用いることができる。

　「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、１つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。

　本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される本発明に係る融合タンパク質の種類などにより異なる。通常、成人一人あたり、一回につき600μgから6000mgの範囲で投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。
　例えば注射剤により投与する場合は、ヒト患者に対し、１回の投与において１kg体重あたり、0.1μg～100mgの量を、１日平均あたり１回～数回投与してもよく、好ましくは３日、１週間、１０日又は２週間に１回投与したり、あるいは単回（合計投与回数が１回）投与する態様も採ることができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。

　なお、本発明は、腫瘍を治療、予防及び／又は診断する医薬（薬剤）を製造するための本発明に係る融合タンパク質の使用を提供するものでもある。
　また、本発明は、腫瘍の治療用、予防用及び／又は診断用の本発明に係る融合タンパク質を提供するものでもある。
　さらに本発明は、本発明に係る融合タンパク質を用いる（すなわち対象（患者）に投与する）ことを特徴とする、腫瘍の治療、予防及び／又は診断方法を提供するものであり、また、腫瘍を治療、予防及び／又は診断するための、本発明に係る融合タンパク質の使用を提供するものでもある。

５．腫瘍の診断用又は検出用キット等
　本発明に係る融合タンパク質は、腫瘍の治療及び／又は予防用キットの形態のほか、腫瘍の診断用又は検出用キットの形態で提供することもできる。診断又は検出対象となる腫瘍の具体例については、前述した説明を同様に適用できる。
　当該診断及び検出は、例えば、本発明に係る融合タンパク質と、生体から採取された試料（以下、生体試料）とを反応させ、反応した抗体等のシグナルを検出することにより行うことができる。

　検出された抗体等のシグナルは、生体試料中の抗原量の指標となる。本発明に係る融合タンパク質を用いた腫瘍の診断及び検出は、まず、検体として被験者から採取した生体試料、例えば検査対象とする組織片又は血液等と、本発明に係る融合タンパク質（三重特異性抗体）とを、抗原抗体反応によって結合させる。次いで、結合した抗体量の測定結果に基づいて、生体試料中の目的とする抗原量を測定することにより行う。当該測定は、公知の免疫学的測定法に従って行えばよく、例えば、免疫沈降法、免疫凝集法、標識免疫測定法、免疫比懸濁法、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー法などを用いることができる。標識免疫測定法では、抗体のシグナルは、標識抗体を用いて直接検出した標識量で表すほか、既知濃度あるいは既知抗体価の抗体を標準液として相対的に表してもよい。すなわち、標準液と検体を測定計により測定し、標準液の値を基準にして生体試料中の抗体等のシグナルを相対的に表すことができる。標識免疫測定法としては、例えばELISA法、EI法、RIA法、蛍光免疫測定(FIA)法、化学発光免疫測定法(Luminescence immunoassay)等が挙げられる。なかでも特に、ELISA法が、簡便かつ高感度という点で好ましい。

　上記のようにして得られた検出結果を指標として腫瘍の状態を評価又は診断することができる。例えば、検出結果が所定の基準値を超えるものを陽性、所定の基準値以下のものを陰性とし、陽性の場合には、いずれかの腫瘍を発症している可能性があると判断し、腫瘍の状態を評価することができる。ここで、腫瘍の状態とは、腫瘍の罹患の有無又はその進行度を意味し、腫瘍の発症の有無、進行度、悪性度、再発の有無等が挙げられ、腫瘍については転移の有無等も挙げられる。

　上記評価にあたり、腫瘍の状態としては１つを選択してもよいし、複数個を組み合わせて選択してもよい。腫瘍の有無の評価は、得られた検出結果に基づいて、所定の基準値を境界として腫瘍に罹患しているか否かを判断することにより行うことができる。腫瘍の悪性度は、腫瘍の症状がどの程度進行しているのかを示す指標となるものである。検出結果に基づいて、病期(Stage)を分類して評価したり、あるいは早期癌や進行癌を分類して評価したりすることも可能である。例えば、検出結果を指標として早期癌又は進行癌であると評価することもできる。腫瘍の転移は、検出結果を指標として、原発巣の位置から離れた部位に新生物が出現しているか否かにより評価することができる。腫瘍の再発は、間欠期又は寛解の後に検出結果が再び所定の基準値を超えたか否かにより評価することができる。

　さらには、当該診断及び検出は、例えば、本発明に係る融合タンパク質と、生体から採取された試料（例えば、患者由来の腫瘍細胞及びPBMC）とを反応させ、反応した抗体等のシグナル及び殺細胞活性等を測定することにより、当該抗体及びそれを含む医薬品の効果測定又は当該医薬品を投与するか否かの判断の指標とすることを含む。

　本発明のキットは、本発明に係る融合タンパク質を含むほか、標識物質、あるいは他の抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含んでいてもよい。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質（発色性基質等）、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器（エッペンドルフチューブ等）、ブロッキング剤（Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat血清等の血清成分）、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよい。

　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

　本実施例においては、本発明に係る融合タンパク質（三重特異性トライボディ）に関する各種実験及び結果について説明するにあたり、まず「結果」の項目について説明した後、「材料及び方法」の項目について説明する。

１．結果
新規53Xトライボディの構築及び精製
　図1A及び図1Bに示され、下記表1にも列挙されるように、多機能な新規三重特異性トライボディを構築した。

　本実施例では、多機能な新規三重特異性多機能トライボディを生成した。トライボディは、足場としてのFabドメインから構成される多重特異性抗体であり、H鎖（V_H+CH₁）及びL鎖（V_L+C_L）のFdフラグメントは、インビボで自然にヘテロ二量体化可能であり、scFvなどの追加機能を足場に組み込み得る。Tb535Hは二重特異性トライボディであり、Fabドメイン及びscFvドメインを介した5T4の二価結合と、別のscFvを介した一価CD3結合を備える（前掲の特許文献１：WO 2016/097408（A1））。本実施例で生成した新規５３Ｘトライボディは、単一分子中の３つの異なる分子、５Ｔ４、ＣＤ３、及びＰＤ－Ｌ１（又はＰＤ－１若しくはＬＡＧ３）に対して結合特異性を有する。具体的には、Tb535HのL鎖-scFv誘導体の、5T4結合scFvアームを、
PD-1_1に由来する結合部分（配列番号２２）、
PD-L1_1に由来する結合部分（配列番号４５）、
10.12に由来する結合部分（配列番号５６、７５、７６、７７；ここで、配列番号７５、７６、７７は、構造安定化のために、配列番号５６中の任意のアミノ酸を変更し、scFv中にジスルフィド結合による架橋を入れることを意図した配列の一例である）、又は
LAG3_1に由来する結合部分（配列番号３５）、
あるいは
ネガティブコントロールとして使用したパリビズマブ（Palivizumab）に由来する結合部分（配列番号６６）
に置換した。

　構築した本発明に係る新規53Xトライボディは、上記表１にも記載のとおり、それぞれ、
53D[（Fab）5T4×（scFv）CD3×（scFv）PD-1（PD-1_1）]、
53L1[（Fab）5T4×（scFv）CD3×（scFv）PD-L1（PD-L1_1）]、
53L10[（Fab）5T4×（scFv）CD3×（scFv）PD-L1（10.12）]、
53G[（Fab）5T4×（scFv）CD3×（scFv）LAG3（LAG3_1）]、及び
53P[（Fab）5T4×（scFv）CD3×（scFv）パリビズマブ]
と称する。53Pのトライボディは、他の53Xトライボディに対する陰性対照として用いるために構築した。

酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）による組換え5T4に対する53Xトライボディの結合親和性
　新規に創生した三重特異性53Xトライボディである53D、53L1、53L10、53G、及び53Pがそれぞれ、Tb535Hの5T4抗原に結合する能力を保持しているかどうかを検証するために、精製したトライボディの5T4タンパク質への結合親和性をELISAで調べた（図2）。組換えヒト5T4タンパク質（AMSBio）を96ウェルELISAプレートに固定化した。Tb535Hと精製した新規トライボディとの結合アッセイは、後述の「材料及び方法」に記載されている手順に従って、濃度を上げながら（0～500nM）試験することによって行った。図2Aに示すように、構築した全てのトライボディは、濃度依存性に5T4への結合を示し、Tb535Hと同等又はそれ以上のKd（nM）値を示した（図2B）。Tb535HはFab及びscFvに由来する2つの5T4結合アームを有しており、構築した新規53Xトライボディは、単一Fabに由来する一価の5T4結合アームを有している。それにも関わらず、結果は、全ての新規53XトライボディでTB535Hの5T4結合を同様に保持するには、シングルアーム（Fab）で充分であることを示している。

ELISAによる組換えCD3に対する53Xトライボディの結合親和性
　構築した新規三重特異性53Xトライボディである53D、53L1、53L10、53G、及び53Pが、CD3抗原に結合するTb535Hの能力を保持しているかどうかを検証するために、精製したトライボディの組み換えCD3タンパク質への結合親和性をELISAで調べた（図3）。組換えヒトCD3δ／εヘテロ二量体性タンパク質（AMSBio）を96ウェルELISAプレートに固定化した。Tb535Hと精製した新規トライボディとの結合アッセイ試験は、後述の「材料及び方法」に記載されている手順に従って、濃度を上げながら（0～500nM）行った。図3Aに示すように、構築した全てのトライボディは、同様のKd（nM）値で濃度依存性のCD3結合を示した（図3B）。結果は、新規トライボディがヒトCD3タンパク質に結合するTb535Hの能力を保持していることを示唆している。

ELISAによるPD-L1又はPD-1結合アームを含む新規53Xトライボディの組換えPD-L1又はPD-1タンパク質への結合
　PD-L1又はPD-1に対する結合アームを含む新規トライボディがそれらの標的組換えタンパク質に対して充分な結合親和性を有するかどうかを検証するために、固定化したPD-1タンパク質又はPD-L1タンパク質でELISAアッセイを行った（図4）。PD-L1への結合アームを有するトライボディである53L1及び53L10は、濃度依存的に組換えPD-L1タンパク質への結合能力を示し、Kd値はそれぞれ79.85nM及び29.87nMであった（図4A）。PD-1への結合アームを有するトライボディ53Dも、濃度依存的に組換えPD-L1タンパク質への結合能力を示した（図4B）。

5T4発現標的細胞の存在下でのT細胞活性化バイオアッセイ
　新規トライボディ及びTb535Hによるエフェクター細胞上のT細胞受容体（TCR）/CD3の活性化を、標的細胞として5T4発現CHO-K1（CHO-5T4）細胞を使用して調べた。アッセイは、T細胞活性化バイオアッセイ（NFAT）（Promega社、カタログ番号J1621）を使用して行った。図5Aに、アッセイの概略図を示す。標的細胞上の細胞表面5T4及びエフェクター細胞上のCD3が二重特異性T細胞誘導体で架橋されると、TCR/CD3は細胞内シグナルを伝達し、NFAT-REを介した発光をもたらす。NFAT応答エレメント（NFAT-RE）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子改変Jurkat T細胞株（「TCR/CD3エフェクター細胞」）を、図示されるように、濃度上昇を伴うTb535H及び新規53Xトライボディの存在下で（図5B）、CHO-5T4細胞（「標的細胞」）と共培養した。Tb535Hは濃度依存的にルシフェラーゼ活性を誘導し、EC₅₀は0.11nMであった。新規トライボディはまた、0.03nM～0.29nMの範囲内のEC₅₀値で濃度依存性ルシフェラーゼ活性を誘導した（図5C）。新規トライボディ（53D以外）による5T4を介したCD3活性化は、Tb535Hのそれよりもわずかに優れるものであったが、新規トライボディのEC₅₀値は、Tb535HのEC₅₀値のほぼ3倍以下に収まるものであった。

競合ELISAアッセイによって試験した53Xトライボディのアンタゴニスト作用
　それぞれPD-1.1及びPD-L1.1の結合ドメインに由来する新規トライボディである53D、53L1、及び53L10が、親モノクローナル抗体（mAb）のPD-1/PD-L1相互作用に干渉する能力を保持しているかどうかを検証するために、モル過剰（5：1M/M）のトライボディ53D、53L1、53L10、又は並行アッセイにおいてポジティブコントロールとして、それらの親mAbであるPD-L1_1、10.12及びPD-1_1の非存在下又は存在下で、固定化PD-1受容体へのビオチン化PD-L1リガンドの結合を測定することによる競合ELISAアッセイを行った。ヒトIgG4アイソタイプコンロトールとして使用した。図6A及び図6Bに示されたように、ビオチン化PD-L1リガンドの結合は、単独で使用したビオチン化PD-L1の結合シグナルに対して、前記トライボディの存在下で大幅に減少した。これは新規トライボディが、PD-L1とPD-1との相互作用を妨害する親mAbの能力を保持していることを示唆している。

　同様に、LAG-3/MHCII（HLA-DRA）相互作用を妨害するトライボディ53Gの能力を競合ELISAアッセイより分析した。この目的のために、LAG-3-His-GST組換えタンパク質を、50nMの濃度でプレートにコーティングし、トライボディ53G又はその親mAbであるLAG-3_1を2μMの飽和濃度で添加し、ビオチン化MHCIIタンパク質（700nM）とLAG3-His-GST組換えタンパク質との結合を測定した。図6Cに示すように、ビオチン化MHCIIとLAG3-His-GST組換えタンパク質との結合は、ビオチン化MHCII単独で処理した場合の結合シグナルに対して、トライボディ53G又はコントロールとして使用した親LAG-3_1（mAb）の存在下で大幅に減少した。

インビトロのヒト癌細胞とヒトリンパ球の共培養における新規トライボディの細胞傷害活性
　PD-L1、PD-1、及びLAG-3を標的とする新規トライボディが、癌細胞に対するリンパ球の活性化を効率的に誘導するかどうかを検証するために、ヒト癌細胞とリンパ球の共培養の系でそれらの効果を調べた。この目的のために、PD-L1及び5T4を高発現するMDA-MB-231乳癌細胞及びヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株であるA-549をヒト末梢血単核細胞（hPBMC）と共培養し（エフェクター：ターゲット比5：1）、53D、53G、53L1、及び53L10の非存在下又は存在下で、37℃で48時間インキュベートした。並行して、同濃度の親トライボディTB535H及びTB535Hに由来するが免疫調節抗体フラグメントを欠くトライボディ（53P）、上記の親mAbであるPD-L1.1、10.12、PD-1.1、及びLAG-3.1、並びにTb535Hと親mAbの併用効果についても検討した。インキュベーション後、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）アッセイを用いて、細胞上清中に放出されたLDHによって細胞溶解を測定した。その結果、ネガティブコントロールとして使用した53Pを除いて全ての新規トライボディが、親mAb又はTB535Hとの組み合わせよりも高い有効性で腫瘍細胞溶解を誘導することが示された（図7及び図8を参照）。具体的には、全てのトライボディは、対応する親mAb及びTB535Hトライボディとの併用によるLDH放出レベルを少なくとも2倍にし、53L1及び53L10では、1nMの濃度で約80％～90％の細胞溶解に達した。

　新規トライボディによる腫瘍細胞溶解の増強が、リンパ球の活性化の増加と相関しているかどうかを明らかにするために、それらの共培養の培養上清に放出されたIFN-γ（hPBMC活性化の機能的なマーカー）濃度を測定し、新規トライボディの効果とTB535Hと親mAbと併用した場合の効果とを比較した。図9に示すように、IFN-γ濃度は、親トライボディTB535H、親mAbのPD-L1.1、10.12、PD-1.1、及びLAG-3.1、又はそれらの組み合わせで処理した場合に観察された濃度に対して、新規トライボディ（TRB）で処理したMDA-MB-231とhPBMCの共培養の培養上清で顕著に高かった。
　したがって、これらの結果は、抗腫瘍効果を高めるために親TB535Hに免疫調節部分を挿入するという戦略の妥当性を明確に裏付けるものである。

新規53Xトライボディのインビボ抗腫瘍効果
　新規トライボディのインビボ抗腫瘍効果は、A549（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株）異種移植マウスモデルで評価した。A549細胞における5T4及びPD-L1の細胞表面での発現は、フローサイトメトリー分析によって確認した（データは示さず）。ヒトPBMCは、移植前の4日間、Dynabeads Human T-activator CD3/CD28によって活性化した（活性化PBMC）。A549肺癌細胞は、同数の活性化ヒトPBMCと共に、免疫不全NOD-SCIDマウスに皮下移植した（0日目）。図に示したトライボディの静脈内投与を、0日目～10日目まで1日おきに行った（合計6回投与）（図10）。Tb535H投与群では、溶媒投与と比較して、20μg/マウスの投与量で有意な腫瘍増殖阻害が観察された（P＜0.05）が、2μg/マウスの投与量では有意な腫瘍増殖阻害を示さなかった（図10A）。一方、53L1（20μg/マウス）の抗腫瘍活性は、同じ投与量で使用したTb535Hと比較して、明らかに強い抗腫瘍活性が観察された（図10B）。さらには、53L10投与群では、溶媒投与と比較して、2μg/マウス及び20μg/マウスの投与量の両方で、投与によるA549腫瘍の有意な腫瘍増殖阻害が観察された（図10C）。50日目の53L10（2μg/マウス）投与群の腫瘍増殖阻害（TGI（％））は、溶媒投与群（P＜0.05）と比較して41.5％に達し、20μg/マウス投与群では、100％のTGIが観察され（P＜0.05）、本試験の最終日（50日目）でも全てのマウスで完全な腫瘍退縮が53L10（20μg/マウス）投与群で観察された。

　53L10投与による腫瘍退縮は、別の一連の研究でも再現された（図11）。A549皮下腫瘍の増殖は、53L10投与により用量依存的に有意に抑制され、53L10（20μg/マウス）投与群では、最終日（42日目）でも全てのマウスで完全な腫瘍退縮が観察された。
　53D及び53Gの抗腫瘍活性も、同モデルで、それぞれコントロールの53Pトライボディと比較により評価した（図12）。53Dにおいて、20μg/マウス投与群で53Pと比較して腫瘍増殖阻害が増強していた（図12）。53G投与による腫瘍増殖阻害は、2μg/マウス及び20μg/マウスの投与量の両方で、53P投与と比較して増強していた。53G（20μg/マウス）投与群では、本試験期間において、著しい腫瘍退縮が観察された。

２．材料及び方法
　細胞培養MDA-MB-231乳癌細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（Gibco（商標）DMEM、Life Technologies社）で培養した。A-549肺癌細胞は、Kaign’s Modification of Ham’s F-12培地（F-12K、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC））で培養した。細胞株はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から購入し、5％CO₂を含む加湿気中37℃で培養した。培地には10％（vol/vol）の非働化ウシ胎児血清（FBS、Sigma社）を添加し、50U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、2mM L-グルタミン（全てGibco（商標）、ライフテクノロジーズ社）を添加した後で用いた。

抗体及びヒト組換えタンパク質
　抗PD-L1抗体（PD-L1_1及び10.12）、抗PD-1抗体（PD-1_1）、抗LAG-3抗体（LAG3_1）、及びヒトIgG4アイソタイプコントロール抗体は、前述のように精製した（前掲の特許文献２及び非特許文献１０）。Tb535Hトライボディは、前掲の特許文献１に記載されているように調製した。組換えヒトPD-L1/Fc、PD-1/Fc、及びヒトLAG3/Fcタンパク質は、R＆D Systems社から購入した。ヒトLAG-3/His-GST及びヒトHLAクラスII組織適合性抗原-DRAはCusabio社から購入した。ヒト5T4/HisはACROBiosystems社、ヒトCD3δ／εヘテロ二量体タンパク質はAMSBio社から購入した。

新規53Xトライボディの製造及び精製
　各トライボディ（53D、53G、53L1、53L10、及び53P）のL鎖誘導体をコードする発現プラスミドと組み合わせたH鎖誘導体をコードする発現プラスミドは、Expi293細胞においてヘテロ二量体を産生するために一過性にトランスフェクションされ発現された。トランスフェクションの5日後、Hisタグアフィニティークロマトグラフィーと、その後のゲルろ過クロマトグラフィーとによって、細胞培養上清から各トライボディを精製した。このプロセスでは、生成物のバリアントなどの不純物を制限しながら、トライボディヘテロ二量体を回収する。トライボディの純度をSDS-PAGEで分析し、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分析を行って、トライボディヘテロ二量体の純度及び凍結融解安定性を評価した。LALに基づく方法により、＞95％L/Fd鎖トライボディヘテロ二量体、及び低濃度の内毒素が確認された。トライボディを0.2μmろ過で滅菌し、分注して-80°Cで保存した。

結合アッセイ（ELISA）
　新規に生成されてトライボディの結合特異性を確認するために、ELISAアッセイをヒトキメラ組換え標的タンパク質（5T4/His、CD3_δ/ε、PD-L1/Fc、PD-1/Fc、又はLAG-3/Fcを96ウェルプレートに1～5μg/mLでコーティング）で行った。
　コーティングされた組換え標的タンパク質のELISAアッセイは、コーティングしたプレートを5％スキムミルクPBSを含むにより37℃で1時間ブロッキングすることによって行った。精製したトライボディをPBS中の3％BSA（ウシ血清アルブミン）中のプレートに異なる濃度で添加し、穏やかに振とうすることにより室温で約90分間インキュベートした。PBSで充分に洗浄した後、プレートをHRP結合抗ヒトIgκ抗体（Southern Biotech社）又は抗His-HRP結合抗体（MBL）と1時間インキュベートし、再度洗浄し、TMB試薬（Sigma-Aldrich社）で10分間インキュベートした後、等量の1N塩酸（HCl）で反応停止した。
　450nmでの吸光度をEnvisionプレートリーダー（Perkin Elmer社 2102 Waltham, MA, USA）で測定した。

競合ELISAアッセイ
　対応する親mAbと比較して、新規に生成されたトライボディがPD-L1/PD-1又はLAG-3/MHC II（HLA-DRA）結合で競合する能力を検討する目的で、競合ELISAアッセイを、各ビオチン化キメラタンパク質（PD-L1/Fc又はMHCII）のPD-1又はLAG-3/GST-Hisへの結合を、未標識競合トライボディの非存在下又は存在下で試験することによって行った。この目的のために、Nunc（商標）平底96ウェルプレートをPD-1又はLAG-3タンパク質でコーティングした。次に、コーティングしたプレートを、未標識抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、又は抗LAG-3抗体と飽和濃度において室温で2時間プレインキュベートした（抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体の場合は5：1、及び抗LAG-3 の場合は3：1）。次に、室温で2時間、同じ濃度の競合抗体でプレートに添加したビオチン化PD-L1又はMHCIIキメラタンパク質でさらに処理した。結合したビオチン化タンパク質を検出するために、HRP結合ストレプトアビジン（Biorad社）をプレートに30分間添加し、次に上述のように吸光度を測定した。

細胞生存率及び細胞毒性アッセイ（LDH検出）
　ヒト末梢血単核細胞（hPBMC）は、Greiner Leucosep（登録商標）チューブ（Sigma-Aldrich社）を使用して健康なドナーの血液から分離し、製造元の指示に従って凍結保存した。以前に報告されたように、凍結保存した細胞バイアルを解凍し、休息させた細胞を収集し、使用前にカウントした（前掲の非特許文献１１）。
　新規に生成されたトライボディの細胞傷害活性を測定するために、標的腫瘍細胞をhPBMC（エフェクター：ターゲット比5：1）と共培養し、濃度を増加させて使用したトライボディ又は同じ濃度において並行アッセイで使用した親mAb及び対応する組み合わせで処理した。この目的のために、腫瘍細胞を96ウェル平底プレートに1×10⁴細胞/ウェルの密度で16時間プレーティングした。次に、健康なドナーから単離したhPBMCを、トライボディ又は抗体の非存在下又は存在下で添加し、37℃で48時間インキュベートした。未処理の細胞又はヒトIgG4アイソタイプコンロトールで処理した細胞をネガティブコントロールとして使用した。

　標的細胞の溶解は、LDH検出キット（Thermofisher Scientific社）を使用して、製造元の推奨に従って、共培養の上清に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の濃度を検出することによって測定した。細胞溶解は、未処理又はヒトIgG4アイソタイプコンロトールの抗体で処理された共培養物の上清に存在する量に関して、各処理の存在下でのＬＤＨの増加率を測定することによって分析し、百分率（％）として表した。

サイトカイン分泌アッセイ
　腫瘍細胞とhPBMCとの共培養物の上清、又はトライボディと対応する親mAbで処理したhPBMCの上清におけるヒトIL-2及びIFNγの分泌を、DuoSet（登録商標）ELISAキットアッセイによって評価した。簡潔には、処理後、培養上清を遠心分離し、IL-2及びIFNγキット（R＆D Systems社製）を使用して、製造元の推奨に従ってサイトカインを定量した。濃度値をpg/mLに変換し、少なくとも3回の測定の平均として算出した。

T細胞活性化バイオアッセイ
　5T4発現細胞の存在下でのTCR/CD3活性化は、製造元の指示に従ってT細胞活性化バイオアッセイ（NFAT）（Promega社、カタログ番号J1621）によって行った。簡潔には、NFAT応答エレメント（キットに含まれる）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子改変Jurkat T細胞株を、様々な濃度のTb535H及び新規53Xトライボディの存在下で5T4発現CHO-K1細胞と共培養した。37℃で4時間インキュベートした後、Bio-Glo（商標）試薬（キットに含まれる）を添加し、発光をルミノメーターで測定した。

インビボ有効性試験
　本実施例における全ての動物実験は、Chiome Bioscience社の動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee（IACUC））のガイドラインに従って承認及び実施された。5～6週齢の雌NOD/ShiJic-scidJclマウス（NOD-SCID）（日本CLEA社）を有効性研究に使用した。A549ヒト肺胞肺腺癌細胞株は、トリプシン処理によって細胞培養皿から採取し、PBSで洗浄し、細胞懸濁液を調製した。ヒトPBMC（Cellular Technology社）は、A549細胞のマウスへの接種前に、Dynabeads Human T-Activator（CD3/CD28）（Veritas社）の存在下4日間インビトロで培養した。5×10⁶個のA549細胞の細胞懸濁液を同数の活性化hPBMCと混合した（移植された活性化hPBMCとA549癌細胞との比率は1：1であった）。混合細胞懸濁液をNOD-SCIDマウスの右脇腹に皮下移植し（0日目）、示された投与量での示された試験品の静脈内投与を、細胞移植後0、2、4、6、8、及び10日目（合計6回投与）に行った。腫瘍増殖は、腫瘍の2つの垂直な寸法をノギスで測定し、腫瘍の体積（mm³）は、（幅²×長さ）×3.14/6の計算式で計算した。腫瘍体積は平均値±標準偏差（SD）として表した。統計的有意差は、ダネット検定（対溶媒投与群）を用いた。P＜0.05。

１．結果
新規トライボディ53L10とTb535H単剤、Tb535Hとペムブロリズマブの併用投与のインビボ抗腫瘍効果の比較
　更に、53L10単剤とTb535H単剤、Tb535Hとペムブロリズマブ (抗ヒトPD-1抗体、MSD株式会社)を併用投与した場合の、インビボ抗腫瘍効果をA549 (ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株)異種移植マウスモデルで比較検討した（図13）。5×10⁶個のA549細胞を同数の活性化ヒトPBMCsと混合した細胞懸濁液をNOD-scidマウスの右わき腹の皮下に移植した(day 0)。移植当日から、1日おきに合計6回（day 0, 2, 4, 6, 8,10）、溶媒（PBS）、Tb535H (6, 12, 20μg/マウス)、または53L10 (6, 12, 20μg/マウス)を尾静脈内投与を行った。ペムブロリズマブ（200μg/マウス）はday 0, day 4, day 8の合計３回、尾静脈内投与を行い、Tb535Hとペムブロリズマブの併用投与は、Tb535Hとペムブロリズマブの投与をそれぞれ組み合わせた。腫瘍体積は移植3日後から測定し、以後、週に2回測定し、移植後50日まで行った。

　図13AにTb535Hと53L10のインビボ抗腫瘍効果を比較した結果を示し、図13BにTb535Hとペムブロリズマブの併用投与と53L10のインビボ抗腫瘍効果を比較した結果を示した。Tb535H投与群では、20μg/マウス投与群で、溶媒（PBS）投与群と比較して有意な腫瘍増殖阻害が観察され、試験最終日（50日目）におけるTGIは36.5%であった（*P < 0.05）（図13A）。

　一方、53L10投与群では、投与量に応じた腫瘍増殖阻害効果が観察され、すべての投与群で溶媒(PBS)投与群に対して、有意な腫瘍増殖阻害が観察された（*P < 0.05）。また、53L10投与群はいずれも、Tb535H投与群（各6μg/マウス, 12μg/マウス, 20μg/マウス）と比較して、著しい腫瘍体積の減少が観察された。53L10投与群の試験最終日（50日間）における腫瘍増殖阻害（TGI（％）は、6μg/マウス投与群では64.8%、12μg/マウス投与群では76.0%、20μg/マウス投与群では95.7%であった。53L10 (20μg/マウス)投与群では、試験最終日（50日目）において、8個体中5個体において、完全な腫瘍の退縮が観察された(図13A)。

　次に、Tb535Hとペムブロリズマブの併用投与群と53L10トライボディ単独投与群の比較を行った（図13 B）。ペムブロリズマブ（200μg/マウス）投与群では、溶媒(PBS)投与群と比較して有意な抗腫瘍効果は観察されなかった(図13B)。Tb535Hとペムブロリズマブの併用投与群では、Tb535H (6μg/マウス)＋ペムブロリズマブ(200μ/マウス)投与群、Tb535H (12μg/マウス)＋ペムブロリズマブ(200μg/マウス)投与群のいずれも溶媒(PBS)投与群と比較して有意な抗腫瘍効果は観察されなかった(図13B)。Tb535H(20μg/マウス)+ペムブロリズマブ(200μg/マウス)投与群では、溶媒（PBS）投与群と比較して有意な腫瘍増殖阻害が観察され、試験最終日（50日目）におけるTGIは38.0% (*P < 0.05)であった(図13B)。

　一方、上述したとおり、53L10投与群では、投与量に応じた腫瘍増殖効果が観察され、すべての投与群で溶媒(PBS)投与群に対して、有意な腫瘍増殖阻害が観察された（*P < 0.05）。また、53L10投与群はいずれも、Tb535H＋ペムブロリズマブ投与群（Tb535H 6μg/マウス, 12μg/マウス, 20μg/マウス）と比較して、著しい腫瘍体積の減少が観察された。53L10投与群の試験最終日（50日間）におけるTGIは、6μg/マウス投与群では64.8%、12μg/マウス投与群では76.0%、20μg/マウス投与群では95.7%であった。53L10 (20μg/マウス)投与群では、試験最終日（50日目）において、8個体中5個体において、完全な腫瘍の退縮が観察された(図13 B)。

53L10-M13の作成
　抗体や抗体結合断片等を用いて、ヒトに投与可能な治療用抗体を製造する場合、その製造過程において抗体の精製後に化学的な修飾がしばしば起こることが知られている。このような化学的修飾への対応は、精製抗体の品質確保および安全性の確保において重要であることとして、当該技術分野において認識されている。具体的には、抗体のCDR領域を含む配列の中に、N型糖鎖修飾、タンパク切断、脱アミド化、ラセミ化、酸化などの修飾を受やすいアミノ酸配列モチーフがあった場合に精製抗体の品質低下を招くことが予想される。修飾をうけやすいアミノ酸配列モチーフとしては、例えば、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基を含むモチーフが知られており（例えば、Sydowら, （2014）. Structure-based prediction of asparagine and aspartate degradation sites in antibody variable regions. PLoS ONE, 9（6）など）、抗体の活性を保ったままそれらのアミノ酸モチーフを改変することが可能であることを示すことは、抗体の有用性をより高める。

　scFv (10.12) (配列番号56)の62番目のアスパラギン酸残基（D）をセリン残基(S)に変異させ、scFv (10.12)-M13 (配列番号108)を作成した。これはscFv (10.12) (配列番号56)に含まれる重鎖CDR-H2 (配列番号59)をCDR-H2#2 (配列番号49)に置き換えたものである。scFv (10.12)-M13 (配列番号108)を含む53L10_L鎖誘導体 (配列番号107)を、配列番号1のH鎖誘導体と前述の方法で、Expi293細胞に共発現させ、培養上清から53L10変異体（53L10-M13）を精製した。

53L10-M13のELISAによる組換え5T4に対する結合親和性
　精製した53L10-M13の5T4抗原に対する結合親和性をELISAで調べた（図14）。図2（実施例1）で実施した方法と同じ方法を用いて、組換えヒト5T4タンパク質（ACRO Biosystems）を96ウェルプレートに固定化した。53L10-M13と53L10のヒト5T4に対する結合親和性は、記載されている手順に従って、濃度を上げながら（0～500nM）行った。図14Aに示すように、53L10-M13（〇）は濃度依存的に5T4への結合を示した。53L10-M13の5T4への結合親和性を示す曲線は53L10（●）の5T4への結合親和性を示す曲線と重なり、EC₅₀の値は、53L10-M13が0.58 nM, 53L10が0.53 nMであった（図14B）。

53L10-M13のELISAによる組換えCD3に対する結合親和性
　精製した53L10-M13の組換えCD3タンパク質への結合親和性をELISAで調べた（図15）。図3で実施した方法と同じ方法を用いて、組換えヒトCD3δ/εヘテロ二量体タンパク質（ACRO Biosystems）を96ウェルプレートに固定化した。53L10-M13と53L10のヒトCD3タンパク質に対する結合アッセイは、後述の「材料及び方法」に記載されている手順に従って、濃度を上げながら（0～500nM）行った。図15Aに示すように、53L10-M13（〇）および53L10（●）はいずれも濃度依存的にCD3タンパク質に対して結合活性を示し、53L10のEC₅₀は39.9 nM、53L10-M13のEC₅₀は65.5 nMであった（図15B）。

53L10-M13のELISAによる組換えPD-L1に対する結合親和性
　精製した53L10-M13の組換えPD-L1タンパク質への結合親和性をELISAで調べた（図16）。図4で実施した方法と同じ方法を用いて、組換えヒトPD-L1/Fcタンパク質（R&D systems）を96ウェルプレートに固定化した。53L10-M13と53L10のヒトPD-L1タンパク質に対する結合アッセイは、後述の「材料及び方法」に記載されている手順に従って、濃度を上げながら（0～500nM）行った。図16Aに示すように、53L10-M13（〇）は濃度依存的にPD-L1への結合活性を示した。53L10-M13のPD-L1への結合親和性を示す曲線は、53L10（●）のPD-L1への結合親和性を示す曲線と重なり、EC₅₀の値は、53L10-M13が36.9 nM, 53L10が34.4 nMであった（図16B）。

53L10-M13の5T4発現標的細胞の存在下でのT細胞活性化バイオアッセイ
　次に、T細胞活性化バイオアッセイ（NFAT）（Promega社、カタログ番号J1621）を用いて、図５で実施した方法と同じ方法を用いて、53L10-M13による5T4発現標的細胞存在下でのエフェクター細胞上のT細胞受容体（TCR）/CD3の活性化を調べた（図17）。比較対象として53L10も同時に調べた。標的細胞上の細胞表面5T4及びエフェクター細胞上のCD3が53L10-M13または53L10で架橋されると、TCR/CD3は細胞内シグナルを伝達し、NFAT-REを介した発光をもたらす。NFAT応答エレメント（NFAT-RE）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子改変Jurkat T細胞株（「TCR/CD3エフェクター細胞」）を、図示されるように、濃度上昇を伴う53L10-M13及び53L10の存在下で、CHO-5T4細胞（「標的細胞」）と共培養した（図17A）。53L10-M13（〇）および53L10（●）は、いずれも濃度依存的にルシフェラーゼ活性を誘導し、両者の濃度依存的なルシフェラーゼ活性の上昇を示す曲線は重なり（図17A）、53L10-M13のEC₅₀は0.016 nM, 53L10のEC₅₀は0.010 nMであった（図17B）。

　以上の結果から、53L10-M13の抗原結合活性(5T4, CD3,およびPD-L1)と、5T4発現標的細胞存在下でのエフェクター細胞上のTCR/CD3複合体の活性化能は、53L10と同等であることが示された。

A549細胞（5T4陽性PD-L1陽性ヒト癌細胞株）とヒト末梢血単核球（hPBMC）の共培養における、53L10-M13とTb535HによるT細胞活性化
　53L10-M13が標的腫瘍細胞存在下でT細胞を効率的に活性化できるかどうかを、CD3陽性細胞上でのT細胞活性化マーカー（CD25, CD69）の発現を測定することで調べた。比較対象としてTb535Hも同時に調べた。標的腫瘍細胞としては、まず5T4陽性PD-L1陽性のヒト癌細胞株であるA549細胞で試験した（図18A）。後述の「材料及び方法」に記載されている手順に従ってターゲット細胞とhPBMC(Cellular Technology Limited社、lot.HHU20211125及びlot. HHU20220224、lot.HHU20220329、以降PBMC1及びPBMC2、PBMC3と称する)をそれぞれ共培養し（エフェクター：ターゲット比=10:1）、0.001 pM～10 nM(10倍公比)の53L10-M13、またはTb535Hを添加して24時間後にCD3およびCD69の発現を、48時間後にCD3およびCD25の発現をフローサイトメトリーで測定して、CD3陽性細胞集団に占めるCD69陽性細胞の割合（図18B）、CD3陽性細胞集団に占めるCD25陽性細胞の割合(図18C)をそれぞれ求めた。その結果、53L10-M13（●、■、▲）及びTb535H（〇、□、△）は、両者ともに濃度依存的にエフェクター細胞上でのCD25、CD69の発現を誘導したが、いずれのhPBMCのロットにおいても、53L0-M13の方がTb535Hよりも同濃度におけるT細胞活性化マーカーの発現を強く誘導することが示された（図18B及び図18C）。算出可能であったEC₅₀について、53L10-M13とTb535Hを比較すると、CD69発現においては53L10-M13で34.9～99.1 pM、Tb535Hで100.2～1548.0 pMといずれのhPBMCのロットにおいても53L10-M13で低値であることが示された。一方、最大応答(E_max)についても、CD69発現においては、53L10-M13で34.9～57.1 %、Tb535Hで22.9～42.5 ％といずれのhPBMCのロットにおいてTb535Hよりも53L10-M13で高値となり、これらの結果から、53L10-M13ではTb535Hに比べてT細胞活性化が増強されていることが示された。

hPBMC (ヒト癌細胞非存在下)に対する、53L10-M13とTb535HによるT細胞活性化
　一方、標的腫瘍細胞非存在下でも同様に、53L10-M13とTb535HによるT細胞の活性化を調べた。標的腫瘍細胞非存在下では、hPBMCに0.01～1,000 nM(10倍公比)の53L10-M13、またはTb535Hを添加した。その結果、53L10-M13（●、■、▲）の方がTb535H（〇、□、△）よりも10 nM以上の高濃度域でわずかにマーカー発現が上昇するものの、いずれも標的腫瘍細胞非存在下では標的腫瘍細胞存在下に比べてCD3陽性細胞上のT細胞活性化マーカー（CD25, CD69）の発現が低いままであり、ほとんどT細胞を活性化しないことが示された（図19A及びB）。
　以上の結果より、53L10-M13は標的腫瘍細胞であるA549細胞存在下でT細胞を活性化させること、また、A549細胞存在下ではTb535Hよりも高いT細胞活性化を引き起こすことが示された。

MCF-7細胞（5T4陽性PD-L1陰性ヒト癌細胞株）とhPBMCの共培養における、53L10-M13とTb535HによるT細胞活性化
　次に、ヒト乳癌細胞株であるMCF-7細胞とhPBMCの共培養における53L10-M13とTb535HによるT細胞活性化を同様の方法で調べた。MCF-7細胞は、5T4陽性PD-L1陰性の標的腫瘍細胞として使用した（図20A）。その結果、53L10-M13（●、■、▲）及びTb535H（〇、□、△）は、いずれも濃度依存的にエフェクター細胞上でのCD25、CD69の発現を誘導したが、5T4とPD-L1の両方を発現しているA549細胞を標的腫瘍細胞とした場合と異なり、濃度依存的なT細胞活性化マーカーの発現の上昇を示す曲線は、53L10-M13とTb535Hにおいて、CD69（図20B）とCD25(図20C)のいずれも重なっていた。EC₅₀はCD69発現においては、53L10-M13で0.10～2.85 pM、Tb535Hで2.63～5.49 pMであり、CD25発現においては53L10-M13で0.49～6.78 pM、Tb535Hで12.57～50.79 pMといずれも53L10-M13がわずかに低い数値を示したが、E_maxは、CD69発現において53L10-M13が41.85～50.68 %、Tb535Hが42.56～50.41 ％、CD25発現において53L10-M13で19.99～24.21 %、Tb535Hで27.30～29.49 %といずれも同程度であり、5T4陽性PD-L1陰性のMCF-7細胞を標的腫瘍細胞とした場合には、53L10-M13とTb535HのT細胞活性化能は、両者でほぼ同等であることが示された（図20B, C, D）。

　これらの結果は、Tb535Hと比較した際の53L10-M13によるT細胞活性化の増強が、標的腫瘍細胞にPD-L1が発現している条件下でみられる現象であること、及び、PD-L1を発現していない腫瘍に対しては５T4に対する結合部位が２価であるTb535Hと同レベルのT細胞活性化が誘導されていることを示唆している。そのため、5T4とPD-L1の両者を発現する標的腫瘍細胞に対し、Tb535Hに抗PD-L1 結合アームを追加することで腫瘍免疫を増強させるという53L10、および53L10-M13の戦略の妥当性を明確に裏付けているとともに、PD-L1を発現しない腫瘍細胞に対しても53L10及び53L10-M13が、Tb535Ｈが有する腫瘍免疫能と同等の能力を有していることを示している。

53L10-M13とTb535HによるA549細胞（5T4陽性PD-L1陽性ヒト癌細胞株）存在下、非存在下でのhPBMCによるサイトカイン産生
　続いて、A549細胞の存在下と非存在下（hPBMCのみ）での53L10-M13とTb535HによるhPBMCからのサイトカイン産生を測定した。上述のT細胞活性化試験において得られた48時間後の培養上清を回収し、後述の「材料及び方法」に記載されている手順に従ってT細胞から分泌されるヒトTNFα、ヒトIL-2、ヒトIL-6、ヒトインターフェロンγの４種のサイトカインについて培養上清中の濃度を測定した。その結果、A549細胞の非存在下（hPBMCのみ）では、53L10-M13とTb535Hのどちらにおいても濃度依存的なサイトカイン産生を起こさなかった。一方、A549細胞の存在下では、Tb535Hにおいては濃度依存的にIL-6の産生がみられたが、その他のサイトカインについては濃度依存的な産生が見られなかった。53L10-M13においては４種すべてのサイトカインについて、添加した53L10-M13の濃度依存的にサイトカイン産生が見られた（図21A～D（A:ヒトTNFα, B:ヒトIL-2, C:ヒトIL-6, D:ヒトインターフェロンγ））。53L10-M13によるサイトカインの産生は、T細胞活性化（図18B, C）と同様に100pM以上の53L10-M13添加で引き起こされており、４種すべてのサイトカインの産生がTb535H添加より53L10-M13添加で、増強されていた。このことからも、53L10-M13がA549細胞存在下においてTb535Hよりも強くT細胞活性化を誘導していることが示された。

A549細胞（5T4陽性PD-L1陽性ヒト癌細胞株）とhPBMC (活性化処理なし)の共培養における、53L10-M13とTb535HのA549細胞に対する細胞障害性試験
　次に、53L10-M13が標的腫瘍細胞に対する細胞障害性を効率的に誘導できるか検証した。T細胞活性化試験と同様の条件でA549細胞をhPBMCと共培養し（エフェクター：ターゲット比=10:1）、0.001pM～10 nM(10倍公比)の53L10-M13及びTb535Hを添加した際の細胞障害性を調べた。後述の「材料及び方法」に記載されている手順に従って、あらかじめPKH67で細胞膜を標識したA549細胞にhPBMCを加え、53L10-M13、およびTb535Hを濃度を振って添加し、48時間培養した後に細胞を回収した。死細胞をPropidium Iodide(PI)で染色し、PKH67陽性PI陰性細胞の数をフローサイトメーターで測定して細胞障害（％）を求めた。その結果、53L10-M13（●、■、▲）とTb535H（〇、□、△）のいずれも濃度依存的に細胞障害を誘導していたが、いずれのhPBMCのロットにおいても同濃度ではTb535Hより53L10-M13で高い細胞障害が誘導されることが示された（図22A）。EC₅₀とE_maxが53L10-M13とTb535Hの両者で算出できたPBMC3については、EC₅₀が53L10-M13で11.5 pM、Tb535Hで33.7 pMと53L10-M13で低く、E_maxが53L10-M13で85.2 %、Tb535Hで69.4 ％と53L10-M13で高くなっており、53L10-M13ではTb535Hよりも細胞障害性が増強されていることが示された (図22B)。図22B中、「n.c.」は、Not Calculatedを示す。

A549細胞（5T4陽性PD-L1陽性ヒト癌細胞株）と活性化hPBMCの共培養における、53L10-M13とTb535HのA549細胞に対する細胞障害性試験
　さらに、活性化したhPBMCにおいても、53L10-M13及びTb535H の標的癌細胞に対する細胞障害性の誘導を調べた。後述の「材料及び方法」に記載されている手順に従って、あらかじめ抗CD3抗体/抗CD28抗体固相磁気ビーズにて活性化したhPBMCをA549細胞と共培養し（エフェクター：ターゲット比=1:1）、53L10-M13（●、▲）及びTb535H（〇、△）を添加した際の細胞障害性を調べた。その結果、活性化されたhPBMCにおいても、53L10-M13とTb535Hは両者ともに添加濃度依存的な細胞障害を誘導したが、Tb535Hでは最大でも50%強の細胞障害しか誘導されていなかったのに対し、53L10-M13では最大で90%以上の細胞障害が誘導されていた(図23A)。EC₅₀とE_maxが53L10-M13とTb535Hの両者で算出できたPBMC3については、EC₅₀が53L10-M13で15.3 pM、Tb535Hで10.4 pMとTb535Hでわずかに低くかったものの、E_maxは53L10-M13で90.0 %、Tb535Hで65.4 ％と53L10-M13で大幅に高くなっており、活性化されたPBMCにおいても、53L10-M13はTb535Hよりも細胞障害性を増強することが示された (図23B)。図23B中、「n.c.」は、Not Calculatedを示す。

　これら結果より、53L10-M13は標的腫瘍細胞の存在下でTb535HよりもT細胞活性化を増強するだけでなく、活性化されたT細胞の細胞障害性も大幅に増強することが示された。このことは、Tb535Hに抗PD-L1結合アームを追加することで標的腫瘍細胞に対する腫瘍免疫を増強させるという53L10-M13の戦略の妥当性を明確に裏付けている。

２．材料及び方法
細胞培養
　A549ヒト肺癌細胞は、Kaign’s Modification of Ham’s F-12培地（F-12K、Fujifilm-Wako社）で培養した。細胞株はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から購入し、5％CO₂を含む加湿気中37℃で培養した。培地には10％（vol/vol）の非働化ウシ胎児血清（FBS、Cytiva社）を添加し、50U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシンを添加した後で用いた。MCF-7ヒト乳癌細胞は、Minimun Essential Medium Eagle培地（EMEM、Sigma-Aldrich社）で培養した。細胞株はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から購入し、5％CO₂を含む加湿気中37℃で培養した。培地には10％（vol/vol）の非働化ウシ胎児血清（FBS、Cytiva社）を添加し、50U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、0.01 mg/mlヒトリコンビナントインシュリン（Fujifilm-Wako社）を添加した後で用いた。hPBMCはCellular Technology Limited社から購入し、解凍後のOvernight restingにおいてはCTL-Test medium（Cellular Technology Limited社）を用いて、5％CO₂を含む加湿気中37℃で培養した。培地には2mM L-glutamine(Thermo fisher scientific社)を添加した後に用いた。一方、活性化誘導時にはImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium（STEM CELL Technologies社）を用いて、5％CO₂を含む加湿気中37℃で培養した。培地には3ng/mL ヒトIL-2（PeproTech社）を添加した後に用いた。

T細胞活性化マーカー測定
　健常人ドナー由来ヒト末梢血単核細胞（hPBMC）は、販売元（Cellular Technology Limited社）の指示に従って解凍し、一晩休息させた細胞を回収し、使用前にカウントした。標的腫瘍細胞は24ウェル平底プレートに8×10⁴細胞/ウェルの密度で4時間プレーティングした。hPBMCを標的腫瘍細胞存在下（エフェクター：ターゲット比10：1）、及び非存在下に添加した。次に、標的腫瘍細胞存在下では0.001 pM～10 nMの範囲で、標的腫瘍細部の非存在下では0.01 nM～1,000 nMの範囲で、53L10-M13及びTb535Hを濃度を振って添加し、37℃で24時間又は48時間インキュベートした。T細胞活性化マーカーの染色は、24時間後と48時間後にプレートからそれぞれ浮遊細胞を回収し、24時間後に回収した細胞はFITC anti-human CD3 antibody（Biolegend社）とAPC anti-human CD69 antibody（Biolegend社）で、48時間後に回収した細胞はFITC anti-human CD3 antibody（Biolegend社）とAPC anti-human CD25 antibody（Biolegend社）で、染色を行った。測定はFACSLyric（BD biosciences社）にて24時間後にCD3およびCD69の発現を、48時間後にCD3およびCD25の発現を測定した。解析はFlow jo 10.8.1（BD biosciences社）解析ソフトウェアを使い、24時間後のCD3陽性細胞集団に占めるCD69陽性細胞の割合、48時間後のCD3陽性細胞集団に占めるCD25陽性細胞の割合をそれぞれ求めた。グラフ作成とEC₅₀、E_max、95%信頼区間（Confidence interval, CI）の算出は統計ソフトPrism（GraphPad Software社）で行った。

サイトカイン産生定量
　53L10-M13及びTb535H存在下での腫瘍細胞とhPBMCとの共培養物の上清におけるヒトTNFα、ヒトIL-2、ヒトIL-6、ヒトインターフェロンγの分泌を、それぞれELISAによって評価した。簡潔には、T細胞活性化試験の48時間後の培養上清を遠心分離し、ヒトTNFαはBD OptEIA^TM Human TNF ELISA Set(BD bioscience社)、ヒトIL-2はBD OptEIA^TM Human IL-2 ELISA Set (BD bioscience社)、ヒトIL-6はHuman IL-6 ELISA Kit（R＆D Systems社製）、Human IFN-gamma ELISA Kit（R＆D Systems社）を使用して、製造元の推奨に従ってサイトカインを定量し、濃度値をpg/mLに変換した。

フローサイトメーターを用いた細胞障害アッセイ
　健常人ドナー由来ヒト末梢血単核細胞（hPBMC）は、販売元（CTL社）の指示に従って解凍し、一晩休息させた細胞を回収し、使用前にカウントした。活性化PBMCはさらにDynabeads Human T-activator CD3/CD28（Thermo fisher scientific）で3日間培養し、磁気ビーズを除いて一晩休息させた細胞を回収し、使用前にカウントした。標的腫瘍細胞はPKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit（Sigma-Aldrich社）を用いて製造元の推奨に従い標識した後（25℃、3min標識反応）、48ウェル平底プレートに4×10⁴細胞/ウェルの密度で4時間プレーティングした。そこにhPBMCを活性化処理なしhPBMCではエフェクター：ターゲット比10：1になるように、活性化hPBMCではエフェクター：ターゲット比1：1になるように加え、次に、53L10-M13及びTb535Hを濃度を振って添加し、37℃で48時間インキュベートした。48時間後、細胞を回収して、死細胞をPI(Thermo fisher scientific社)で染色し、FACSLyric（BD biosciences社）PKH67陽性PI陰性細胞の数を測定した。解析はFlow jo 10.8.1（BD biosciences社）解析ソフトウェアを使い、細胞障害性（Cytotoxicity）(%)=(1-(活性化PBMCと各構築物を各濃度で添加した際のPKH67陽性PI陰性細胞集団の割合）/(活性化PBMCのみA549に添加した際のPKH67陽性PI陰性細胞集団の割合)で算出した。グラフ作成とEC₅₀、E_max、95%信頼区間（Confidence interval, CI）の算出は統計ソフトPrism（GraphPad Software社）で行った。

配列番号１～９５及び１０６～１０９：組換えペプチド

Claims

　第１及び第２の２つの異なる鎖を含む融合タンパク質であって、
　第１の鎖が、２つの抗体可変領域ＶＨ１及びＶＨ２、１つの抗体可変領域ＶＬ２、並びに１つの抗体定常領域ＣＨ１又はＣＬを含み、
　第２の鎖が、２つの抗体可変領域ＶＬ１及びＶＬ３、１つの抗体可変領域ＶＨ３、並びに１つの抗体定常領域ＣＬ又はＣＨ１を含み、
　第１及び第２の鎖は、ヘテロ二量体相互作用を含有し、
　該融合タンパク質内に形成される３種の組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインである、ＶＨ１／ＶＬ１結合ドメイン、ＶＨ２／ＶＬ２結合ドメイン、及びＶＨ３／ＶＬ３結合ドメインが、
（ｉ）５Ｔ４に対する結合能、
（ｉｉ）ＣＤ３受容体複合体に対する結合能、及び
（ｉｉｉ）ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３に対する結合能
から選択されるいずれかの結合能を有する（但し、前記３種の組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインは、互いに異なる結合能を有する。）、
前記融合タンパク質。
　前記融合タンパク質は、前記第１の鎖と前記第２の鎖とを含むヘテロ二量体のタンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
　前記２つの異なる鎖が、
ａ）第１の鎖：
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と
を組み合わせたもの、
ｂ）第１の鎖：
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と
を組み合わせたもの、
ｃ）第１の鎖：
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と
を組み合わせたもの、
ｄ）第１の鎖：
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＬ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と
を組み合わせたもの、
ｅ）第１の鎖：
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と
を組み合わせたもの、
ｆ）第１の鎖：
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と
を組み合わせたもの、
ｇ）第１の鎖：
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と
を組み合わせたもの、
ｈ）第１の鎖：
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）又は
　ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＨ（Ｘ）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と
を組み合わせたもの、
ｉ）第１の鎖：
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と
を組み合わせたもの、
ｊ）第１の鎖：
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と、
　第２の鎖：
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と
を組み合わせたもの、
ｋ）第１の鎖：
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と
を組み合わせたもの、
あるいは、
ｌ）第１の鎖：
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）又は
　ＶＬ（Ｘ）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）と、
　第２の鎖：
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＬ（５Ｔ４）又は
　ＶＨ（Ｘ）－ＣＬ－Ｌ１－ＶＬ（５Ｔ４）－Ｌ２－ＶＨ（５Ｔ４）と
を組み合わせたもの
［ここで、上記ａ）～ｌ）において、
　ＶＨ及びＶＬは、抗体可変領域であり、
　ＶＨ（５Ｔ４）及びＶＬ（５Ｔ４）は、５Ｔ４に対する抗体可変領域であり、
　ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）は、ＣＤ３受容体複合体に対する抗体可変領域であり、
　ＶＨ（Ｘ）及びＶＬ（Ｘ）は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３に対する抗体可変領域であり、
　ＣＨ１及びＣＬは、抗体定常領域であり、
　Ｌ１及びＬ２は、リンカーである。］
を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ１、ＶＨ２及びＶＨ３における、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号３；配列番号４；及び配列番号５に示されるアミノ酸配列、
配列番号９；配列番号１０；及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
配列番号２４；配列番号２５；及び配列番号２６又は２７に示されるアミノ酸配列、
配列番号３７；配列番号３８；及び配列番号３９に示されるアミノ酸配列、
配列番号４７；配列番号４８又は４９；及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列、あるいは、
配列番号５８；配列番号５９又は４９；及び配列番号６０に示されるアミノ酸配列
からなり、かつ
　ＶＬ１、ＶＬ２及びＶＬ３における、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号１９；配列番号２０；及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列、
配列番号１４；配列番号１５；及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列、
配列番号２９；配列番号３０；及び配列番号３１、３２又は３３に示されるアミノ酸配列、
配列番号４１；配列番号４２；及び配列番号４３に示されるアミノ酸配列、
配列番号５２；配列番号５３；及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列、あるいは、
配列番号６２；配列番号６３；及び配列番号６４に示されるアミノ酸配列
からなる、
請求項１に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ１、ＶＨ２及びＶＨ３のアミノ酸配列は、互いに異なり、配列番号８８、９０、８、９２、２３、７８、４６、８１、５７、１０９、８２、８３、８４、又は３６に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ、
　ＶＬ１、ＶＬ２及びＶＬ３のアミノ酸配列は、互いに異なり、配列番号８９、９１、１３、９３、２８、７９、８０、５１、６１、８５、８６、８７、又は４０に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
請求項１に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ（５Ｔ４）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３；配列番号４；及び配列番号５に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（５Ｔ４）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号１９；配列番号２０；及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる、
請求項３に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ（ＣＤ３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号９；配列番号１０；及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（ＣＤ３）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、
配列番号１４；配列番号１５；及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる、
請求項３に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－１である。）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号２４；配列番号２５；及び配列番号２６又は２７に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－１である。）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号２９；配列番号３０；及び配列番号３１、３２又は３３に示されるアミノ酸配列からなる、
請求項３に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号４７；配列番号４８又は４９；及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号５２；配列番号５３；及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる、
請求項３に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号５８；配列番号５９又は４９；及び配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号６２；配列番号６３；及び配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなる、
請求項３に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＬＡＧ３である。）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３７；配列番号３８；及び配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなり、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＬＡＧ３である。）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号４１；配列番号４２；及び配列番号４３に示されるアミノ酸配列からなる、
請求項３に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ（５Ｔ４）のアミノ酸配列が、配列番号８８又は９０に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ
　ＶＬ（５Ｔ４）のアミノ酸配列が、配列番号８９又は９１に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
請求項３に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ（ＣＤ３）のアミノ酸配列が、配列番号８又は９２に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ
　ＶＬ（ＣＤ３）のアミノ酸配列が、配列番号１３又は９３に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
請求項３に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－１である。）のアミノ酸配列が、配列番号２３又は７８に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－１である。）のアミノ酸配列が、配列番号２８、７９又は８０に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
請求項３に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）のアミノ酸配列が、配列番号４６又は８１に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）のアミノ酸配列が、配列番号５１に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
請求項３に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）のアミノ酸配列が、配列番号５７、１０９、８２、８３又は８４に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＰＤ－Ｌ１である。）のアミノ酸配列が、配列番号６１、８５、８６又は８７に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
請求項３に記載の融合タンパク質。
　ＶＨ（Ｘ）（但し、ＸがＬＡＧ３である。）のアミノ酸配列が、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ
　ＶＬ（Ｘ）（但し、ＸがＬＡＧ３である。）のアミノ酸配列が、配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
請求項３に記載の融合タンパク質。
　第１の鎖が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ、
　第２の鎖が、配列番号１７、３４、４４、５５、又は１０７に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
請求項１に記載の融合タンパク質。
　第１の鎖：ＶＨ（５Ｔ４）－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ、
　第２の鎖：ＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ－Ｌ１－ＶＨ（Ｘ）－Ｌ２－ＶＬ（Ｘ）が、配列番号１７、３４、４４、５５、又は１０７に示されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列を含む、あるいは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、
請求項３に記載の融合タンパク質。
　（ａ）５Ｔ４、（ｂ）ＣＤ３受容体複合体、及び（ｃ）ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３に対する三重特異性抗体である、請求項１又は３に記載の融合タンパク質。
　抗腫瘍活性を有するものである、請求項１又は３に記載の融合タンパク質。
　腫瘍が、腫瘍細胞又は癌細胞において５Ｔ４を発現しているものである、請求項２１に記載の融合タンパク質。
　腫瘍が、ヒト中皮腫、ヒト肺癌、ヒト胃癌、ヒト結腸直腸癌、ヒト食道癌、ヒト子宮体癌、ヒト卵巣癌、ヒト子宮頸癌、ヒト絨毛癌、ヒト胎盤部位栄養膜腫瘍、ヒト膀胱癌、ヒト乳癌、ヒト膵臓癌、ヒト前立腺癌、ヒト腎臓癌、ヒト頭頸部癌、及び、ヒト非セミノーマ性胚細胞腫瘍からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２２に記載の融合タンパク質。
　請求項１又は３に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
　請求項２５に記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
　請求項１又は３に記載の融合タンパク質の製造方法であって、請求項２６に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物から前記融合タンパク質を回収することを含む、前記製造方法。
　請求項１又は３に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
　　　腫瘍の治療、予防又は診断に用いるものである、請求項２８に記載の医薬組成物。
　腫瘍が、腫瘍細胞又は癌細胞において５Ｔ４を発現しているものである、請求項２９に記載の医薬組成物。
　腫瘍が、ヒト中皮腫、ヒト肺癌、ヒト胃癌、ヒト結腸直腸癌、ヒト食道癌、ヒト子宮体癌、ヒト卵巣癌、ヒト子宮頸癌、ヒト絨毛癌、ヒト胎盤部位栄養膜腫瘍、ヒト膀胱癌、ヒト乳癌、ヒト膵臓癌、ヒト前立腺癌、ヒト腎臓癌、ヒト頭頸部癌、及び、ヒト非セミノーマ性胚細胞腫瘍からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項３０に記載の医薬組成物。
　請求項２８に記載の医薬組成物を、対象に投与することを含む、腫瘍の治療、予防又は診断方法。
　腫瘍が、腫瘍細胞又は癌細胞において５Ｔ４を発現しているものである、請求項３２に記載の方法。
　腫瘍が、ヒト中皮腫、ヒト肺癌、ヒト胃癌、ヒト結腸直腸癌、ヒト食道癌、ヒト子宮体癌、ヒト卵巣癌、ヒト子宮頸癌、ヒト絨毛癌、ヒト胎盤部位栄養膜腫瘍、ヒト膀胱癌、ヒト乳癌、ヒト膵臓癌、ヒト前立腺癌、ヒト腎臓癌、ヒト頭頸部癌、及び、ヒト非セミノーマ性胚細胞腫瘍からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項３３に記載の方法。
　請求項１又は３に記載の融合タンパク質を含む、腫瘍の治療、予防又は診断用キット。
　腫瘍が、腫瘍細胞又は癌細胞において５Ｔ４を発現しているものである、請求項３５に記載のキット。
　腫瘍が、ヒト中皮腫、ヒト肺癌、ヒト胃癌、ヒト結腸直腸癌、ヒト食道癌、ヒト子宮体癌、ヒト卵巣癌、ヒト子宮頸癌、ヒト絨毛癌、ヒト胎盤部位栄養膜腫瘍、ヒト膀胱癌、ヒト乳癌、ヒト膵臓癌、ヒト前立腺癌、ヒト腎臓癌、ヒト頭頸部癌、及び、ヒト非セミノーマ性胚細胞腫瘍からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項３６に記載のキット。