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WO2023077925A1 - 一种治疗和/或预防癌症的药物和应用 - Google Patents

一种治疗和/或预防癌症的药物和应用 Download PDF

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WO2023077925A1
WO2023077925A1 PCT/CN2022/114957 CN2022114957W WO2023077925A1 WO 2023077925 A1 WO2023077925 A1 WO 2023077925A1 CN 2022114957 W CN2022114957 W CN 2022114957W WO 2023077925 A1 WO2023077925 A1 WO 2023077925A1
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cancer
mbp
gene
fusion protein
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蔡炯
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元本(珠海横琴)生物科技有限公司
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    • C07K2319/24—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a MBP (maltose binding protein)-tag

Definitions

  • the Provenge vaccine is also controversial in use because it cannot prolong the patient's disease progression time and is expensive.
  • the Phase III clinical trials of the PROSTVAC recombinant viral vector vaccine as well as the MAGE-A3 fusion protein vaccine were terminated due to the lack of clinical benefit to patients in the Phase III clinical trials.
  • Cancer vaccines have long been envisioned to be designed to enhance tumor-specific immune responses, especially T cell responses, through active immunization, and serve as a key tool for effective cancer immunotherapy.
  • Existence, cancer vaccines yield only modest clinical benefit. Therefore, it is particularly important to break the immune tolerance microenvironment and improve the clinical benefits of vaccines!
  • Cancer vaccines can generate an immune response at the tumor site, and vaccine-mediated tumor cell death leads to the release of more cascade antigens.
  • the combined application of cancer vaccines and PD-1 antibodies can complement each other, thereby improving tumor killing activity.
  • cancer vaccine combined with PD-1 antibody has become one of the current research hotspots. So far, the combination of cancer vaccines and PD-1 antibodies is still in the early stage of research, among which T-VEC combined with pembrolizumab (PD-1 antibody) has been tested in phase I in patients with advanced colon cancer and advanced squamous cell carcinoma of the head and neck.
  • the present invention also provides the application of recombinant MBP-MUC1-N fusion protein vaccine combined with anti-PD-1 antibody in the preparation of drugs for preventing and/or treating cancer.
  • nucleotide sequence of the MUCl-N gene is shown in SEQ ID NO.1, and the preferred MBP gene is shown in SEQ ID NO.2.
  • the present invention also provides the application of the recombinant MBP-MUCl-N fusion protein vaccine combined with oxaliplatin in the preparation of medicaments for preventing and/or treating cancer.
  • Figure 1 is the result of the inhibitory effect of the recombinant MBP-MUC1-N fusion protein vaccine provided by the present invention combined with anti-PD-1 antibody on MC38 colon cancer;
  • Fig. 3 is the impact result that recombinant MBP-MUC1-N fusion protein vaccine provided by the present invention combined with oxaliplatin produces on the life span of cancerous mice;
  • Fig. 5 is the effect of different buffers on the effect of the vaccine in treating MC38 colon cancer.
  • the present invention provides a medicine for treating and/or preventing cancer, the medicine comprising recombinant MBP-MUCl-N fusion protein vaccine and anti-PD-1 antibody and/or oxaliplatin combination.
  • the present invention has no special limitation on the source of the anti-PD-1 antibody and/or oxaliplatin combination, and conventional commercially available anti-PD-1 antibody and/or oxaliplatin combination can be used.
  • nucleotide sequence of the MUC1-N protein is shown in SEQ ID NO.1:
  • the nucleotide sequence of the MBP protein is shown in SEQ ID NO.2:
  • the fusion protein sequence (SEQ ID NO.3) was KIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIP ALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELVKDP RIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSNNNNNNNNLGIEGRISGVTSAPDDTRPAPGST
  • Tandem synthesis was carried out according to the gene sequence of MBP and Muc1-N fusion protein. To this end, first synthesize 1a_1, 1a_2, 1a_3, 1a_4, 1a_5, 1a_6, 1a_7, 1a_8, 1a_9, 1a_10, 1a_11, 1a_12, 1a_13, 1a_14, 1a_15, 1a_16, 1a_17, 1a_18, 1a_19, 1a_20, 1a_21, 1 a_22, 1a_23 , 1a_24, 1a_25, 1a_26, 1a_27, 1a_28, 1a_29, 1a_30 oligonucleotide sequences, then synthesize 1b_1, 1b_2, 1b_3, 1b_4 sequences, use 1-seq2, 1-R sequences for gene amplification, and obtain MUC1-N fusion MBP optimized gene sequence.
  • a drug for treating and/or preventing cancer and its application according to the present invention will be further described in detail below in conjunction with specific examples.
  • the technical solutions of the present invention include but are not limited to the following examples.
  • Example 1 Treatment of MC38 colon cancer in combination with PD-1 antibody
  • the recombinant MBP-MUC1-N fusion protein was prepared using the method of this application, and prepared by conventional vaccine preparation methods.
  • the anti-PD-1 antibody was purchased from Shanghai Junshi Biomedical Technology Co., Ltd.; MC38 colon cancer cells were purchased from the National Experimental Cell Resource Center; normal saline for injection was purchased from Beijing Tiantan Biological Products Co., Ltd.
  • the muscle was immunized with the recombinant MBP-MUC1-N fusion protein vaccine preparation.
  • Anti-PD-1 antibody injection dose 250 ⁇ g/monkey (diluted with NS, total 500 ⁇ l/bird).
  • Combined administration of recombinant MBP-MUC1-N fusion protein vaccine and oxaliplatin can more effectively inhibit the growth of MC38 colon cancer tumors, and can improve the tumor cure rate, reaching the highest cure rate.
  • Experimental reagents use the method of this application to recombine MBP-MUC1-N fusion protein expression strains.
  • Anti-PD-1 antibody was purchased from Bioxcell; MC38 colon cancer cells were purchased from National Experimental Cell Resource Center; saline injection was purchased from Beijing Tiantan Biological Products Co., Ltd.
  • Bacteria-breaking solution 20ml, sterilized in an ultrasonic ice bath, sterile filtered after high-speed low-temperature centrifugation, and placed at 4°C for 0, 3, 6, and 24 hours. The results showed that the total amount of protein reached 100%, 86%, 75% and 56% of 0 hour respectively.
  • the recombinant MBP-MUC1-N fusion protein vaccine preparation was immunized with a dose of 50 ⁇ g/monkey (100 ⁇ l in total), and the immune checkpoint inhibitor anti-PD-1 was injected intraperitoneally.
  • Antibody the injection dose is 200 ⁇ g/monkey (total amount 100 ⁇ l/bird).
  • buffer salts include 20mM acetic acid-sodium acetate (pH5.0), 150mMNaCl, referred to as Ac5.0 group; 20mM acetic acid-sodium acetate (pH7.3), 150mM NaCl, referred to as Ac7.3 group; 20mM Tris salt (pH7.3), 150mM NaCl, referred to as Tris7.3 group.
  • PBS was purchased from Beijing Tiantan Biological Products Co., Ltd.
  • the tumors shrank significantly at 2, 4, 6, and 8 days after injection of Tris7.3 vaccine. Respectively shrink from 1.28 ⁇ 0.44cm3 to 0.51 ⁇ 0.19m3, from 1.94 ⁇ 0.44cm3 to 1.12 ⁇ 0.48cm3, from 2.53 ⁇ 1.20cm3 to 1.40 ⁇ 0.52cm3, from 3.02 ⁇ 0.80cm3 to 1.98 ⁇ 0.83cm3.
  • the p-values are 0.0002, 0.0009, 0.018, 0.011, respectively, and there are significant differences.

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Abstract

本发明提供了一种治疗和/或预防癌症的药物和应用。本发明所述药物包括重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗和PD-1抗体和/或奥沙利铂，所述药物能增强MUC1特异性抗肿瘤免疫应答。

Description

一种治疗和/或预防癌症的药物和应用
本申请要求享有2021年11月4日向中国国家知识产权局提交的，专利申请号为2021113022704，发明名称为“一种抗胰腺癌的疫苗、及其医药用途”的在先申请的优先权权益。所述在先申请的全文通过引用的方式结合于本申请中。
技术领域
本发明涉及免疫学治疗药物技术领域，具体涉及一种治疗和/或预防癌症的药物和应用。
背景技术
癌症疫苗是一种主动免疫疗法，通过靶向肿瘤抗原而特异性杀伤癌细胞，癌症疫苗主要包括有DNA疫苗、DC疫苗、溶瘤病毒疫苗或重组病毒载体疫苗、以及基于肽或蛋白质的疫苗。至今为止，癌症疫苗的研究多数处于I-II期临床试验阶段，有10余个产品进入III期临床试验阶段，有两个上市的治疗性癌症疫苗：一是2010年被美国FDA批准的治疗前列腺癌的Provenge疫苗，二是2015年被美国FDA批准的治疗晚期结肠癌的T-VEC疫苗。二者在III期临床试验中分别延长患者生存期为4个月和4.4个月，均只能产生适度的临床效益。其中Provenge疫苗还因不能延长患者的疾病进展时间以及价格昂贵等因素而在使用中存在争议。此外，由于在III期临床试验中缺乏对患者的临床效益，PROSTVAC重组病毒载体疫苗以及针对MAGE-A3融合蛋白疫苗的III期临床试验被终止。长期以来，人们一直设想将癌症疫苗设计为通过主动免疫提高肿瘤特异性免疫应答，尤其是T细胞应答，并将其作为有效癌症免疫疗法的关键工具，然而，由于体内的免疫耐受微环境的存在，癌症疫苗只能产生适度的临床效益。因此，打破免疫耐受微环境，提高疫苗的临床效益尤为重要！
在癌症疫苗单一疗法方面，只能产生适度的临床效益，不能克服免疫耐受的微环境，而PD-1抗体可以弥补癌症疫苗的缺陷，打破免疫耐受微环境，从而激发肿瘤抗原特异性的免疫应答，特异性杀伤肿瘤细胞；在PD-1单一疗法方面，其在大多数癌症中客观缓解率仅约20-30％，并且对先前具有肿瘤浸润免疫反应的肿瘤疗效显著，对非免疫原性肿瘤效果较差，杀伤肿瘤缺乏特异性，容易引起自身免疫。而癌症疫苗恰能弥补PD-1抗体的不足，癌症疫苗可以在肿瘤部位产生免疫反应，并且疫苗介导的肿瘤细胞死亡导致更多的级联抗原的释放。癌症疫苗与PD-1抗体的联合应用能互补不足，进而提高肿瘤杀伤活性。基于上述的理论基础，癌 症疫苗联合PD-1抗体成为目前研究的热点之一。迄今为止，关于癌症疫苗和PD-1抗体的联用还处于早期研究阶段，其中T-VEC联合pembrolizumab(PD-1抗体)在晚期结肠癌和头颈部晚期鳞状细胞癌患者中进行Ⅰ期临床试验，联合疗法与单独疗法相比，客观缓解率都明显提高，尤其在晚期结肠癌患者中，联合疗法的客观缓解率达到单独疗法的2-3倍。并且联合疗法具有可控的安全性。此外，Nivolumab(PD-1抗体)联合肽疫苗(MART-1/NY-ESO-1/gp100联合Montanide)在晚期结肠癌患者的Ⅰ期临床试验显示：联合疗法的的无复发生存率是疫苗单独疗法的两倍(47.1个月vs.12-21个月)。然后癌症疫苗联合PD-1抗体也有失败的案例，其中PD-1抗体联合肽疫苗在难治性和初治性结肠癌的I期临床实验中未能改善PD-1单一疗法的临床疗效。因此，癌症疫苗与PD-1抗体的联用急需注入新鲜的血液。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗和/或预防癌症的药物和应用。本发明所述药物将重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗与抗PD-1的抗体和/或奥沙利铂联用有望清除肿瘤微环境的免疫细胞尤其是T细胞的免疫耐受状态，增强MUC1特异性抗肿瘤免疫应答，并且有望完全清除肿瘤，为广大癌症患者带来福音。
本发明提供了一种治疗和/或预防癌症的药物，所述药物包括重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗和抗PD-1抗体。
优选的是，所述重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗含有麦芽糖结合蛋白MBP基因和人黏蛋白MUC1-N基因串联而成。
更优选MUC1-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优选MBP基因如SEQ ID NO.2所示。
优选的是，所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤。
本发明还提供了重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
优选的是，所述重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗含有麦芽糖结合蛋白MBP基因和人黏蛋白MUC1-N基因串联而成。
更优选MUC1-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优选MBP基因如SEQ ID NO.2所示。
优选的是，所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤。
本发明还提供了一种治疗和/或预防癌症的药物，其特征在于，所述药物包括重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗和奥沙利铂。
优选的是，所述重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗含有麦芽糖结合蛋白MBP基因和人黏蛋白MUC1-N基因串联而成。
更优选MUC1-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优选MBP基因如SEQ ID NO.2所示。
优选，所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤，优选结直肠癌或结肠癌。
本发明还提供了重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗联合奥沙利铂在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
优选的是，所述重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗含有麦芽糖结合蛋白MBP基因和人黏蛋白MUC1-N基因串联而成。
更优选MUC1-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优选MBP基因如SEQ ID NO.2所示。
优选，所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤，优选结直肠癌或结肠癌。
本发明还提供了重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗联合奥沙利铂在制备延迟癌症患者的药物中的应用。
本发明的有益效果:
本发明提供了一种治疗和/或预防癌症的药物和应用。本发明所述药物将重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗和抗PD-1抗体联用，能够显著增强重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗的抗肿瘤效果，本发明所述药物，能够高效抑制表达MUC1的结肠癌生长。试验结果表明，与抗PD-1抗体或者重组MUC1融合蛋白疫苗单独疗法相比，重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗与抗PD-1抗体联用可显著提高肿瘤抑制率，肿瘤抑制率达到以上，并且肿瘤治愈率明显提高，肿瘤治愈率在之间，因此，重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗与抗PD-1抗体联用有望打破肿瘤微环境的免疫耐受状态，增强MUC1特异性抗肿瘤免疫应答，并且有望完全清除肿瘤，为广大癌症患者带来福音。
此外，本发明所述药物将重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗和奥沙利铂联用，能够显著增强重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗的抗肿瘤效果，本发明所述药物，能够高效抑制表达MUC1的结肠癌生长。试验结果表明，与奥沙利铂或者重组MUC1融合蛋白疫苗单独疗法相比，重 组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗与奥沙利铂联用可显著提高肿瘤抑制率，肿瘤抑制率达到以上，并且肿瘤治愈率明显提高，肿瘤治愈率在之间，因此，重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗与奥沙利铂联用有望打破肿瘤微环境的免疫耐受状态，增强MUC1特异性抗肿瘤免疫应答，并且有望完全清除肿瘤，为广大癌症患者带来福音。
附图说明
图1为本发明提供的重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体对MC38结肠癌的抑制作用结果；
图2为本发明提供的重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗联合奥沙利铂对MC38结肠癌的抑制作用结果；
图3为本发明提供的重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗联合奥沙利铂对患癌小鼠的寿命产生的影响结果；
图4为本发明提供的重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗对MC38结肠癌的抑制作用结果；
图5为不同缓冲液对疫苗治疗MC38结肠癌效果的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种治疗和/或预防癌症的药物，所述药物包括重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗和抗PD-1抗体和/或奥沙利铂联。本发明对所述抗PD-1抗体和/或奥沙利铂联的来源没有特殊限定，采用常规市售抗PD-1抗体和/或奥沙利铂联即可。
1、重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗的制备；
其中，MUC1-N蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
Figure PCTCN2022114957-appb-000001
MBP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
Figure PCTCN2022114957-appb-000002
Figure PCTCN2022114957-appb-000003
MUC1-N融合MBP优化基因序列的合成
为实现MBP和Muc1-N的依次串联表达，获得融合蛋白序列(SEQ ID NO.3)为KIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELVKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAH的蛋白质。根据MBP和Muc1-N融合蛋白质的基因序列进行串联合成。为此，先合成1a_1、1a_2、1a_3、1a_4、1a_5、1a_6、1a_7、1a_8、1a_9、1a_10、1a_11、1a_12、1a_13、1a_14、1a_15、1a_16、1a_17、1a_18、1a_19、1a_20、1a_21、1a_22、1a_23、1a_24、1a_25、1a_26、1a_27、1a_28、1a_29、1a_30寡核苷酸序列，再合成1b_1、1b_2、1b_3、1b_4序列，利用1-seq2、1-R序列进行基因扩增，获得MUC1-N融合MBP优化基因序列。
Figure PCTCN2022114957-appb-000004
Figure PCTCN2022114957-appb-000005
2、蛋白质重组表达与纯化
将融合基因的5’PCR引物附加NcoI酶切位点，3’PCR引物附加EcoI酶切位点，扩增出的基因双酶切，插入到同样双酶切的pET26b(+)大肠杆菌表达载体中。经过抗性细菌培养板的 筛选和单克隆挑选，用卡那霉素抗性的培养基培养和IPTG诱导操纵子的表达。将未优化的序列、优化的序列进行实验。最后得到的全菌液用含有SDS的缓冲液进行95℃预处理，用5％-12％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。结果显示：优化前的序列MBP-Muc1-N表达量只有总蛋白的2％，优化后的序列1MBP-Muc1-N表达量占总蛋白的51％，上升了25.5倍。经过亲和柱纯化后，未优化的基因表达的蛋白质进行10倍浓缩才能上样观察，浓缩后纯化蛋白质产量为100ml培养物0.8mg，而优化后的序列MBP-Muc1-N产量为9.6mg，上升了12倍。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种治疗和/或预防癌症的药物和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1.联合PD-1抗体用药治疗MC38结肠癌
1.材料
实验试剂：使用本申请的方法重组MBP-MUC1-N融合蛋白，采用常规疫苗制备方法进行制备得到，抗PD-1抗体购自上海君实生物医药科技股份有限公司；MC38结肠癌细胞购自国家实验细胞资源中心；注射生理盐水购自北京天坛生物制品股份有限公司。
实验动物：C57 BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司。
2.方法
2.1小鼠免疫
将小鼠称重，随机分组，每组6只鼠，将MC38结肠癌细胞按照5×105个细胞/只用IMDM基础培养液稀释，总量100μl/只)接种到C57BL/J小鼠右侧腋下，建模。待肿瘤直径达到5mm后分为4组，分别是生理盐水对照组(NS组)、免疫检测点抑制剂抗PD-1抗体注射组(PD-1组)、重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗组(疫苗组)、重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗制剂联合免疫检测点抑制剂抗PD1抗体组(联合组)。于荷瘤后第3、7、10、14、17天肌肉进行免疫重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗制剂注射剂量为100μg/只(用NS稀释，总量200μl)、腹腔注射免疫检测点抑制剂抗PD-1抗体，注射剂量250μg/只(用NS稀释，总量500μl/只)。
2.2重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体对MC38结肠癌的抑制作用
计算各组皮下结肠癌移植瘤抑制率和肿瘤抑制率。公式如下：[肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤重－实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％]。[肿瘤治愈率＝(未长肿瘤小鼠个数/小鼠总只数)×100％]。
3.结果
表1小鼠肿瘤瘤重(g)及肿瘤抑制率(％)和肿瘤治愈率
Figure PCTCN2022114957-appb-000006
从表1和图1中可以看出，PD-1抗体联合MBP-Muc1-N相对于单独使用PD-1抗体，可以显著消除肿瘤。注射PD-1抗体联合MBP-Muc1-N后的3、5、7、10、12、14、17、19天，肿瘤显著缩小。分别从0.58±0.21cm3缩小到0.31±0.06cm3；从0.74±0.24cm3缩小到0.34±0.99cm3；从0.52±0.20cm3缩小到0.30±0.10cm3；从0.57±0.19cm3缩小到0.30±0.15cm3；从0.89±0.42cm3缩小到0.22±0.15cm3；从0.98±0.31cm3缩小到0.30±0.11cm3；从2.34±1.30cm3缩小到0.66±0.56cm3；从2.22±1.11cm3缩小到0.80±0.55cm3；p值分别为0.024、0.008、0.049、0.023、0.01、0.002、0.022、和0.025，存在显著差异。
4.结论
重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗能够对肿瘤有一定的抑制作用，与免疫检测点抑制剂PD-1抗体联合给药后能够更加有效抑制MC38结肠癌肿瘤生长，且能提高肿瘤治愈率，最高达到治愈。
实施例2.联合化疗药奥沙利铂治疗MC38结肠癌
1.材料
实验试剂：使用本申请的方法重组MBP-MUC1-N融合蛋白，采用常规疫苗制备方法进行制备得到，奥沙利铂购自Sigma-Aldrich(美国)；注射生理盐水购自北京天坛生物制品股份有限公司。
实验动物：C57 BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司。
2.方法
2.1小鼠免疫
将小鼠称重，随机分组，每组8只鼠，将MC38结肠癌细胞按照5×105个细胞/只用IMDM基础培养液稀释，总量100μl/只)接种到C57BL/J小鼠右侧腋下，建模。待肿瘤直径达到5mm后分为4组，分别是生理盐水对照组(NS组)、奥沙利铂注射组(奥沙利铂组)、重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗组(疫苗组)、奥沙利铂联合重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗制剂组(联合组)。于荷瘤后第3、7、10、14、17天肌肉进行免疫重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗制剂注射剂量为100μg/只(用NS稀释，总量200μl)、腹腔注射奥沙利铂，注射剂量3mg/Kg(用12％DMSO稀释)。
3.结果
表2小鼠肿瘤瘤重(g)及肿瘤抑制率(％)和肿瘤治愈率(％)
Figure PCTCN2022114957-appb-000007
由表2和图2可知，与疫苗单独疗法组相比，奥沙利铂联合MBP-Muc1-N相对于单独使用奥沙利铂，可以显著消除肿瘤。注射奥沙利铂联合MBP-Muc1-N后的5、7天，肿瘤极显著缩小。分别从0.46±0.12cm3缩小到0.29±0.12cm3；从0.81±0.20cm3缩小到0.46±0.12cm3。
如图3所示，奥沙利铂联合MBP-Muc1-N相对于单独使用奥沙利铂，可以延长患癌小鼠的寿命。患癌存活期从29天延长到32天。
4.结论
重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗与奥沙利铂联合给药后能够更加有效抑制MC38结肠癌肿瘤生长，且能提高肿瘤治愈率，最高达到治愈。
MBP-Muc1-N与奥沙利铂联合使用，能够显著消除结肠癌肿瘤，并延长寿命。
实施例3.三步纯化制备的疫苗单药治疗MC38结肠癌
1.材料
实验试剂：使用本申请的方法重组MBP-MUC1-N融合蛋白表达菌株。抗PD-1抗体购自Bioxcell公司；MC38结肠癌细胞购自国家实验细胞资源中心；注射生理盐水购自北京天坛生物制品股份有限公司。
实验动物：C57 BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司。
2.方法
2.1 MBP-MUC1-N融合蛋白的生产
2.1.1发酵配方：5.0g/L酵母提取物、10.0g/L胰蛋白胨、5.0g/L NaCl、3.5g/L KH2PO4、6.6g/L K2HPO4.3H2O、3.5g/L(NH4)2HPO4、1.0g/L MgSO4.7H2O、1mL消泡剂灭菌后加入除菌过滤的0.1g/L VB1、10.0g/L葡萄糖。
2.1.2发酵程序：按照1：1000比例接种37℃、200rpm培养14小时制备种子，再按照1：10比例接种到2L发酵培养基37℃培养，搅拌转数为400-700rpm，诱导前溶氧为30％，关联搅拌。pH为7.0,关联磷酸和氨水。OD600nm值达到30时开始诱导。加入IPTG终浓度为0.5mM，28℃，诱导培养4h，葡萄糖低于1.0g/L添加补料培养基(200g/L酵母提取物、200g/L葡萄糖)，速度为1-2％。诱导结束后取样，并经过超声破碎后做SDS-PAGE分析，结果表明：诱导产生的蛋白质位于破碎上清中，菌泥单位产量分别为69g/L。
2.1.3菌体澄清和破碎
菌体破碎后采用深层过滤+0.2微米过滤(深层过滤后用0.2m2、0.2微米滤器过滤)、澄清的样本浊度小于15NTU(Nephelometric turbility unit)。
破菌液20ml，超声冰浴破菌，高速低温离心后无菌过滤，4℃放置0、3、6、24h。结果显示其蛋白质总量分别达到0小时的100％、86％、75％和56％。
2.1.4 MBP-MUC1-N融合蛋白纯化
澄清液先用结合缓冲液1(20mM Tris-HCl，0.2M NaCl，1mM EDTA，pH7.5)平衡天地人和公司亲和层析柱Dextrin Beads 6FF体积20ml，上样超声破碎上清30ml，再用结合缓冲液洗涤，最后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，0.2M NaCl，1mM EDTA，10mM麦芽糖，pH7.4)洗脱目的蛋白质。
再使用Bestarose Q HP进行一级精纯。Bestarose Q HP的上样缓冲液为50mM Tris-HCl(pH8.0)，洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl(pH 8.0)。在经过POROS XS纯化，结合缓冲液为20mM柠檬酸-柠檬酸钠(pH 4.6)，洗脱缓冲液为20mM柠檬酸-柠檬酸钠，0.5M NaCl(pH 4.6)。
2.2小鼠免疫
将小鼠称重，随机分组，每组10只鼠，将MC38结肠癌细胞按照3×106个细胞/只用IMDM基础培养液稀释，总量100μl/只)接种到C57BL/J小鼠右侧腋下，建模。待肿瘤直径达到5mm后分为4组，分别是PBS对照组(NS组)、免疫检测点抑制剂抗PD-1抗体注射组(PD-1组)、重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗组(疫苗组)。于荷瘤后第3、7、10、14天肌肉进行免疫重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗制剂注射剂量为50μg/只(用总量100μl)、腹腔注射免疫检测点抑制剂抗PD-1抗体，注射剂量200μg/只(总量100μl/只)。
2.3比较重组治疗终点(肿瘤平均值大于3cm3)MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗和抗PD-1抗体对MC38结肠癌的抑制作用
计算各组皮下结肠癌移植瘤抑制率和肿瘤抑制率。公式如下：[肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤重－实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％]。[肿瘤治愈率＝(未长肿瘤小鼠个数/6只))×100％]。
3.结果
表3小鼠肿瘤瘤重(g)及肿瘤抑制率(％)和肿瘤治愈率
Figure PCTCN2022114957-appb-000008
从表3和图4中可以看出，MBP-Muc1-N疫苗治疗组相对于对照组，可以显著消除肿瘤。注射MBP-Muc1-N疫苗后的3、7、10天，肿瘤显著缩小。分别从0.82±0.10cm3缩小到0.41±0.17cm3；从1.93±0.79cm3缩小到1.11±0.83cm3；从3.10±0.93cm3缩小到1.53±0.55cm3；p值分别为0.00001、0.036、0.0004，存在显著差异。相比之下，阳性对照PD-1抗体给药后的3、7、10天，肿瘤显著缩小。分别从0.82±0.10cm3缩小到0.63±0.17cm3；从1.93±0.79cm3缩小到1.13±0.52cm3；从3.10±0.93cm3缩小到1.35±0.60cm3；p值分别为0.010、0.017、0.0001，存在显著差异。表明MBP-Muc1-N疫苗起效快，PD-1起效慢。
4.结论
重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗能够对肿瘤有较好的抑制作用，其作用与免疫检测点抑制剂PD-1抗体接近，但起效时间更早。
实施例4.不同缓冲液对疫苗治疗MC38结肠癌的影响
1.材料
实验试剂：使用本申请的方法重组MBP-MUC1-N融合蛋白，缓冲盐包括20mM醋酸-醋酸钠(pH5.0)，150mMNaCl，简称Ac5.0组；20mM醋酸-醋酸钠(pH7.3)，150mM NaCl，简称Ac7.3组；20mM Tris盐(pH7.3)，150mM NaCl，简称Tris7.3组。采用常规疫苗制备方法进行制备得到；PBS购自北京天坛生物制品股份有限公司。
实验动物：C57 BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司。
2.方法
2.1小鼠免疫
将小鼠称重，随机分组，每组10只鼠，将MC38结肠癌细胞按照3×106个细胞/只用IMDM基础培养液稀释，总量100μl/只)接种到C57BL/J小鼠右侧腋下，建模。待肿瘤直径达到5mm后分为4组，分别是PBS对照组(PBS组)、Ac5.0组、Ac7.3组、Tris7.3组。于荷瘤后第3、7、10、14、17天肌肉进行免疫重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗制剂注射剂量为100μg/只。
3.结果
表4小鼠肿瘤瘤重(g)及肿瘤抑制率(％)和肿瘤治愈率(％)
Figure PCTCN2022114957-appb-000009
由表4和图5可知，与PBS对照组相比，Tris7.3疫苗组的肿瘤从3.02±0.80cm3缩小到1.98±0.83cm3(p＝0.011)；而Ac5.0组和Ac7.3组没有缩小，分别为3.03±0.54和3.18±0.86cm3。
与PBS对照组相比，注射Tris7.3疫苗后的2、4、6、8天，肿瘤显著缩小。分别从1.28±0.44cm3缩小到0.51±0.19m3、从1.94±0.44cm3缩小到1.12±0.48cm3、从2.53±1.20cm3缩小到1.40±0.52cm3、从3.02±0.80cm3缩小到1.98±0.83cm3。p值分别为0.0002、0.0009、0.018、0.011，存在显著差异。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

  1. 一种治疗和/或预防癌症的药物，其特征在于，所述药物包括重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗和抗PD-1抗体。
  2. 根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗含有麦芽糖结合蛋白MBP基因和人黏蛋白MUC1-N基因串联而成，其中优选MUC1-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优选MBP基因如SEQ ID NO.2所示。
  3. 根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤，优选结直肠癌或结肠癌。
  4. 重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
  5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗含有麦芽糖结合蛋白MBP基因和人黏蛋白MUC1-N基因串联而成，其中优选MUC1-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优选MBP基因如SEQ ID NO.2所示，优选所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤，更优选结直肠癌或结肠癌。
  6. 一种治疗和/或预防癌症的药物，其特征在于，所述药物包括重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗和奥沙利铂。
  7. 根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗含有麦芽糖结合蛋白MBP基因和黏蛋白MUC1-N基因串联而成，其中优选MUC1-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优选MBP基因如SEQ ID NO.2所示，优选，所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤，更优选结直肠癌或结肠癌。
  8. 重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗联合奥沙利铂在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
  9. 重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗联合奥沙利铂在制备延迟癌症患者的药物中的应用。
  10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗含有麦芽糖结合蛋白MBP基因和人黏蛋白MUC1-N基因串联而成，其中优选MUC1-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优选MBP基因如SEQ ID NO.2所示，优选所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤，更优选结 直肠癌或结肠癌。
  11. 一种治疗和/或预防癌症的组合物，其特征在于，所述药物包括重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗和缓冲体系，所述缓冲体系包括Tris盐和NaCl。
  12. 根据权利要求11所述的治疗和/或预防癌症的组合物，所述缓冲体系包括20mM Tris盐，150mM NaCl，其pH为7.3。
  13. 根据权利要求11-12任一项所述的治疗和/或预防癌症的组合物，所述重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗含有麦芽糖结合蛋白MBP基因和人黏蛋白MUC1-N基因串联而成，其中优选MUC1-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优选MBP基因如SEQ ID NO.2所示。
  14. 根据权利要求11-13任一项所述的治疗和/或预防癌症的组合物，优选所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤，更优选直肠癌或结肠癌。
  15. 如权利要求11-14任一项所述的组合物在制备治疗和/或预防癌症药物中的应用，优选所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤，更优选直肠癌或结肠癌。
  16. MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗在制备治疗和/或预防癌症药物中的应用，所述癌症为直肠癌或结肠癌，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO.3所示。
  17. 如权利要求16所述的应用，所述重组MBP-MUC1-N融合蛋白疫苗含有麦芽糖结合蛋白MBP基因和人黏蛋白MUC1-N基因串联而成，其中优选MUC1-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优选MBP基因如SEQ ID NO.2所示。
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