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WO2022126486A1 - 一种工程化神经细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种工程化神经细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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WO2022126486A1
WO2022126486A1 PCT/CN2020/137206 CN2020137206W WO2022126486A1 WO 2022126486 A1 WO2022126486 A1 WO 2022126486A1 CN 2020137206 W CN2020137206 W CN 2020137206W WO 2022126486 A1 WO2022126486 A1 WO 2022126486A1
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WO
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engineered
pluripotent stem
medium
induced pluripotent
cell
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PCT/CN2020/137206
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French (fr)
Inventor
陈爽
洪伟
陈平
Original Assignee
深圳先进技术研究院
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Abstract

提供了一种工程化神经细胞及其制备方法和应用。所述工程化神经细胞来源于工程化诱导多能干细胞，所述工程化诱导多能干细胞为含有质粒的诱导多能干细胞，所述质粒包括pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA。通过病毒载体转导快速、大规模制备工程化诱导多能干细胞，随后经抗生素诱导、筛选以及分化培养得到工程化神经细胞，最后使用β-淀粉样蛋白诱导所述工程化神经细胞获得具有阿尔兹海默症表型的细胞，整个制备过程操作简单，周期短，且可大规模制备，为药物开发研究提供性质均一、可重复的实验材料。

Description

一种工程化神经细胞及其制备方法和应用 技术领域
本申请属于生物技术领域，涉及一种工程化神经细胞及其制备方法和应用。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease，AD)是一种以β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)沉积、神经原纤维缠结(NFTs)和老年斑(SP)形成为主要特征的神经退行性疾病。目前，AD是神经疾病领域的重要攻关对象，而理想的AD模型则是探究其发病机制与新药研发的重要基础，AD模型的构建是其病理特征的人为再现，也是抗AD药物筛选和研发的重要平台，相比于体内模型，体外模型在获取和建立上更方便快捷，其高效的操作与数据获取也非常适用于最初的高通量药物筛选。
Aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经蛋白酶加工而来的一种小分子多肽，根据氨基酸序列差异可分为Aβ 1-42、Aβ 1-40和Aβ 25-35。Aβ级联假说认为，Aβ因疏水而发生异常沉积最终产生SP，引起系列下游级联反应，包括氧化应激、线粒体功能损伤、钙稳态失衡和兴奋性毒性等，进而导致神经元损伤与凋亡，加速AD的发生和发展。因此，Aβ常被用于构建AD体外模型。
现有技术常通过将诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)诱导分化为神经细胞后再使用Aβ诱导构建AD模型。如Liu(Liu X Q,Deng Y X,Dai Z,et al.Sodium tanshinone IIA sulfonate protects against Aβ 1-42-induced cellular toxicity by modulating Aβ-degrading enzymes in HT22 cells[J].International Journal of Biological Macromolecules,2020,151:47-55.)等采用20μmol/L的Aβ 1-42诱导HT22细胞24h，胞内活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平显著升高，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著降低，多数细胞胞体变圆，突触变短或消失，线粒体膜电位和ATP酶活力下降。Zhong(Zhong L,Tong Y,Chuan J,et al.Protective effect of ethyl vanillin against Aβ-induced neurotoxicity in PC12 cells via the reduction of oxidative stress and apoptosis[J].Experimental&Therapeutic Medicine,2019,17(4):2666-2674.)等采用20μmol/L的Aβ 1-42诱导PC12细胞，细胞内ROS和MDA水平显著升高，SOD、过氧化氢 酶(CAT)和GSH-Px活性明显降低，凋亡相关蛋白Caspase-3与Bax/Bcl-2水平显著升高。但iPSC和神经元细胞培养及诱导难度较高，诱导过程较为复杂，周期长，且神经元细胞只能分化无法增殖，每次诱导数量有限，多次诱导难以满足均一性要求，严重影响了AD研究的重复性。
综上所述，如何提供一种标准化和精确的建立AD体外模型的方法，操作简单，周期短，制备量大，成为AD研究领域亟待解决的问题之一。
发明内容
本申请提供了一种工程化神经细胞及其制备方法和应用，所述工程化神经细胞来源于工程化诱导多能干细胞，所述工程化诱导多能干细胞制备方法简单，且可大量制备并保存，其经过抗生素诱导、分化培养以及β-淀粉样蛋白诱导后可分化为阿尔兹海默症细胞系。
第一方面，本申请提供一种工程化诱导多能干细胞，所述工程化诱导多能干细胞为含有质粒的诱导多能干细胞，其中所述质粒包括pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA。
本申请的工程化诱导多能干细胞中，质粒FUdeltaGW-rtTA含有调控pTet-O-Ngn2-puro和Tet-O-FUW-EGFP表达的开关，可经多西霉素诱导表达，其表达后能够调控pTet-O-Ngn2-puro和Tet-O-FUW-EGFP表达；pTet-O-Ngn2-puro表达能够启动工程化诱导多能干细胞向工程化神经细胞转变，还能使细胞具有嘌呤霉素抗性，便于快速筛选工程化神经细胞；Tet-O-FUW-EGFP能够表达绿色荧光蛋白，便于快速观察工程化神经细胞。
本申请中，通过抗生素诱导所述工程化诱导多能干细胞即可获得工程化神经细胞，操作简单，周期短，且能够大规模制备。
优选地，所述诱导多能干细胞包括人源诱导多能干细胞。
本申请中，使用人源诱导多能干细胞，能够更真实模拟人体内细胞。
第二方面，本申请提供一种工程化神经细胞，所述工程化神经细胞来源于第一方面所述的工程化诱导多能干细胞。
优选地，所述工程化神经细胞为将第一方面所述的工程化诱导多能干细胞进行抗生素诱导和筛选后分化培养得到。
第三方面，本申请提供一种具有阿尔兹海默症表型的细胞，所述具有阿尔 兹海默症表型的细胞来源于第二方面所述的工程化神经细胞。
优选地，所述具有阿尔兹海默症表型的细胞为将第二方面所述的工程化神经细胞进行处理得到。
第四方面，本申请提供一种第三方面所述的具有阿尔兹海默症表型的细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA导入诱导多能干细胞，培养获得工程化诱导多能干细胞；
(2)将所述工程化诱导多能干细胞进行抗生素诱导和筛选后分化培养，得到工程化神经细胞；以及
(3)采用β-淀粉样蛋白处理所述工程化神经细胞，获得所述具有阿尔兹海默症表型的细胞。
本申请中，通过病毒载体转导快速、大规模制备工程化诱导多能干细胞，随后经抗生素诱导、筛选以及分化培养得到工程化神经细胞，最后使用β-淀粉样蛋白处理所述工程化神经细胞获得具有阿尔兹海默症表型的细胞，整个制备过程操作简单，周期短，且可大规模制备，为药物开发研究提供性质均一、可重复的实验材料。
优选地，步骤(1)所述导入包括：将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA质粒分别包装为慢病毒，利用慢病毒系统将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA导入诱导多能干细胞。
优选地，步骤(1)所述工程化诱导多能干细胞的冻存液为CryoStor CS10细胞冻存液。
优选地，步骤(2)所述诱导采用的抗生素为多西霉素。
优选地，步骤(2)所述筛选采用的抗生素为嘌呤霉素。
优选地，步骤(2)所述分化培养采用的培养基包括第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基。
优选地，所述第一培养基为含有多西霉素的KSR培养基。
优选地，所述多西霉素的浓度为1～3μg/mL，包括但不限于1.2μg/mL、1.4μg/mL、1.6μg/mL、2.0μg/mL、2.4μg/mL、2.6μg/mL或2.8μg/mL。
优选地，所述KSR培养基的配方如表1所示。
表1
名称 含量(mL) 储存温度(℃)
KnockOut Medium 415 4
KnockOut Serum Replacement 75 -20
MEM non-essential amino acids 5 4
β-mercaptoethanol 0.5 4
GlutaMAX(100x) 5 4
优选地，所述第二培养基为含有多西霉素和嘌呤霉素的KSR+N2B培养基。
优选地，所述多西霉素的浓度为1～3μg/mL，包括但不限于1.2μg/mL、1.4μg/mL、1.6μg/mL、2.0μg/mL、2.4μg/mL、2.6μg/mL或2.8μg/mL。
优选地，所述嘌呤霉素的浓度为0.3～0.7μg/mL，包括但不限于0.35μg/mL、0.4μg/mL、0.45μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、或0.65μg/mL。
优选地，所述KSR培养基和N2B培养基的体积比为1:1。
优选地，所述N2B培养基的配方如表2所示。
表2
名称 含量(mL) 储存温度(℃)
DMEM/F-12Medium 500 4
GlutaMAX(100x) 5 4
20％Dextrose 7.5 4
N2-supplement B(100x) 5 -20
优选地，所述第三培养基为含有多西霉素、嘌呤霉素和B27添加剂(B27，Gibco，17504-044)的N2B培养基。
优选地，所述第四培养基为含有1～3μg/mL多西霉素、0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素、5～15ng/mL脑源性神经营养因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor，BDNF)、5～15ng/mL睫状神经营养因子(Ciliary Neurotrophic Factor，CNTF)、5～15ng/mL胶质细胞源性神经营养因子(Glialcellline-Derived Neurotrophic Factor，GDNF)和B27添加剂的NBM培养基。
优选地，所述NBM培养基的配方如表3所示。
表3
名称 含量(mL) 储存温度(℃)
Neurobasal Medium 485 4
GlutaMAX(100x) 5 4
20％Dextrose 7.5 4
MEM non-essential amino acids 2.5 4
优选地，所述多西霉素的浓度为1～3μg/mL，包括但不限于1.2μg/mL、1.4μg/mL、1.6μg/mL、2.0μg/mL、2.4μg/mL、2.6μg/mL或2.8μg/mL。
优选地，所述嘌呤霉素的浓度为0.3～0.7μg/mL，包括但不限于0.35μg/mL、0.4μg/mL、0.45μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、或0.65μg/mL。
优选地，步骤(3)所述β-淀粉样蛋白包括人源β-淀粉样蛋白。
本申请中，使用人源β-淀粉样蛋白诱导，能够更真实模拟人体细胞的阿尔兹海默症的相关表型。
优选地，步骤(3)所述定向分化培养的时间为24～72h，包括但不限于26h、28h、30h、35、40h、45h、50h、60h、65h、68h或70h。
作为优选的技术方案，所述具有阿尔兹海默症表型的细胞的制备方法包括以下步骤：
(1)使用含有8～12μM Rock抑制剂的mTeSR1培养基培养人源诱导多能干细胞36～60h；
(2)将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA质粒分别包装为慢病毒，使用含有所述慢病毒的mTeSR1培养基培养人源诱导多能干细胞4～8h，补充mTeSR1培养基培养，获得工程化人源诱导多能干细胞；
(3)使用含有8～12μM Rock抑制剂的mTeSR1培养基培养所述工程化诱导多能干细胞至细胞密度达40％～50％，将培养基替换为含有1～3μg/mL多西霉素的KSR培养基继续培养20～24h，将培养基替换为含有1～3μg/mL多西霉素和0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素的KSR+N2B培养基继续培养20～24h，将培养基替换为含有1～3μg/mL多西霉素、0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素和B27的N2B培养基继续培养20～24h，获得预分化状态的工程化人源神经细胞；使用含有1～3μg/mL 多西霉素、0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素、5～15ng/mL BDNF、5～15ng/mL CNTF、5～15ng/mL GDNF和B27的NBM培养基连续培养预分化的工程化人源神经细胞18～24天，获得分化成熟的工程化人源神经细胞；以及
(4)使用含有β-淀粉样蛋白的mTeSR1培养基处理所述工程化人源神经细胞48～96h，获得人源具有阿尔兹海默症表型的细胞。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
(1)本申请的工程化诱导多能干细胞中，通过抗生素诱导所述工程化诱导多能干细胞中pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA的表达，即可获得工程化神经细胞，操作简单，周期短，且能够大规模制备；
(2)本申请中，通过病毒载体转导快速、大规模制备工程化诱导多能干细胞，随后经抗生素诱导、筛选以及分化培养得到工程化神经细胞，最后使用β-淀粉样蛋白诱导所述工程化神经细胞获得具有阿尔兹海默症表型的细胞，整个制备过程操作简单，周期短，且可大规模制备，为药物开发研究提供性质均一、可重复的实验材料。
附图说明
图1为未经Aβ处理的工程化人源神经细胞；
图2为实施例1制备的人源具有阿尔兹海默症表型的细胞。
具体实施方式
为便于理解本申请，本申请列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅是帮助理解本申请，不应视为对本申请的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例制备人源具有阿尔兹海默症表型的细胞，所述人源具有阿尔兹海默症表型的细胞的制备方法包括以下步骤：
(1)在12孔板中使用1mL含有10μM Rock抑制剂的mTeSR1培养基培养人源诱导多能干细胞(中国科学院细胞库，DYR0100)48h；
(2)将pTet-O-Ngn2-puro(购买于addgene，Plasmid#52047)、 Tet-O-FUW-EGFP(购买于addgene，Plasmid#30130)和FUdeltaGW-rtTA(购买于addgene，Plasmid#19780)质粒分别包装为慢病毒，使用含有所述慢病毒的mTeSR1培养基培养人源诱导多能干细胞6h，吸去含有慢病毒的培养基，更换为新鲜的mTeSR1培养基培养，之后每天更换新鲜的mTeSR1培养基，直至细胞铺满整个孔板底部，再将细胞以1传16的密度传代培养，直至有足够使用的细胞，用Accutase消化细胞3min，获得工程化人源诱导多能干细胞，并使用CryoStorTM CS10冻存细胞，；
(3)在10cm细胞培养皿中，使用10mL含有10μM Rock抑制剂的mTeSR1培养基培养所述工程化诱导多能干细胞至细胞铺满培养皿的45％，将培养基替换为含有2μg/mL多西霉素的KSR培养基继续培养24h，将培养基替换为含有2μg/mL多西霉素和0.5μg/mL嘌呤霉素的KSR+N2B培养基继续培养24h，将培养基替换为含有2μg/mL多西霉素、0.5μg/mL嘌呤霉素和B27的N2B培养基继续培养24h，获得预分化状态的工程化人源神经细胞；使用含有2μg/mL多西霉素、0.5μg/mL嘌呤霉素、10ng/mL BDNF、10ng/mL CNTF、10ng/mL GDNF和B27的NBM培养基连续培养预分化的工程化人源神经细胞20天，获得分化成熟的工程化人源神经细胞。
(4)使用含有50ng/mL的人源β-淀粉样蛋白(Sigma，PP69)的mTeSR1培养基处理所述工程化神经细胞72h，获得人源具有阿尔兹海默症表型的细胞。
试验例1
本试验例使用显微成像系统(Incucyte)观察实施例1中未经Aβ处理的工程化人源神经细胞和人源具有阿尔兹海默症表型的细胞。
如图1和图2所示，图1为未经Aβ处理的工程化人源神经细胞，图2为实施例1制备的人源具有阿尔兹海默症表型的细胞，可观察到未经Aβ处理的工程化人源神经细胞神经丝延伸相交，而实施例1制备的人源具有阿尔兹海默症表型的细胞的神经丝出现断裂，可见，本申请制备的人源具有阿尔兹海默症表型的细胞具有阿尔兹海默症表型，可用于后续阿尔兹海默症研究实验。
综上所述，本申请中，通过病毒载体转导快速、大规模制备工程化诱导多能干细胞，随后经抗生素诱导、筛选以及分化培养得到工程化神经细胞，最后使用β-淀粉样蛋白处理所述工程化神经细胞获得具有阿尔兹海默症表型的细胞，整个制备过程操作简单，周期短，且可大规模制备，为药物开发研究提供 性质均一、可重复的实验材料。
申请人声明，本申请通过上述实施例来说明本申请的详细方法，但本申请并不局限于上述详细方法，即不意味着本申请必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本申请的任何改进，对本申请产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本申请的保护范围和公开范围之内。

Claims (12)

  1. 一种工程化诱导多能干细胞，其包括含有质粒的诱导多能干细胞；
    其中所述质粒包括pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA。
  2. 根据权利要求1所述的工程化诱导多能干细胞，其中，所述诱导多能干细胞包括人源诱导多能干细胞。
  3. 一种工程化神经细胞，其来源于权利要求1或2所述的工程化诱导多能干细胞。
  4. 根据权利要求3所述的工程化神经细胞，其中，所述工程化神经细胞为将权利要求1或2所述的工程化诱导多能干细胞进行抗生素诱导和筛选后分化培养得到。
  5. 一种具有阿尔兹海默症表型的细胞，其来源于权利要求1或2所述的工程化诱导多能干细胞或权利要求3或4所述的工程化神经细胞。
  6. 根据权利要求5所述的具有阿尔兹海默症表型的细胞，其中，所述具有阿尔兹海默症表型的细胞为将权利要求3或4所述的工程化神经细胞进行定向分化培养得到。
  7. 一种权利要求5或6所述的具有阿尔兹海默症表型的细胞的制备方法，其包括以下步骤：
    (1)将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA导入诱导多能干细胞，培养获得工程化诱导多能干细胞；
    (2)将所述工程化诱导多能干细胞进行抗生素诱导和筛选后分化培养，得到预分化状态的工程化神经细胞；将所述预分化状态的工程化神经细胞在含有神经生长因子的环境中连续培养后，得到分化成熟的工程化神经细胞；以及
    (3)采用β-淀粉样蛋白处理所述分化成熟的工程化神经细胞，获得所述具有阿尔兹海默症表型的细胞。
  8. 根据权利要求7所述的制备方法，其中，步骤(1)所述导入包括：
    将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA质粒分别包装为慢病毒，利用慢病毒系统将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA导入诱导多能干细胞。
  9. 根据权利要求7或8所述的制备方法，其中，步骤(1)所述工程化诱导多能干细胞的冻存液为CryoStor CS10细胞冻存液。
  10. 根据权利要求7-9任一项所述的制备方法，其中，步骤(2)所述诱导采用的抗生素为多西霉素；
    任选地，步骤(2)所述筛选采用的抗生素为嘌呤霉素；
    任选地，步骤(2)所述分化培养采用的培养基包括第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基；
    任选地，所述第一培养基为含有1～3μg/mL多西霉素的KSR培养基；
    任选地，所述第二培养基为含有1～3μg/mL多西霉素和0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素的KSR+N2B培养基；
    任选地，所述第三培养基为含有1～3μg/mL多西霉素、0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素和B27的N2B培养基；
    任选地，所述第四培养基为含有1～3μg/mL多西霉素、0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素、5～15ng/mL脑源性神经营养因子、5～15ng/mL睫状神经营养因子、5～15ng/mL胶质细胞源性神经营养因子和B27的NBM培养基。
  11. 根据权利要求7-10任一项所述的制备方法，其中，步骤(3)所述定向分化培养的时间为24～72h。
  12. 根据权利要求7-11任一项所述的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：
    (1)使用含有8～12μM Rock抑制剂的mTeSR1培养基培养人源诱导多能干细胞36～60h；
    (2)将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA质粒分别包装为慢病毒，使用含有所述慢病毒的mTeSR1培养基培养人源诱导多能干细胞4～8h，补充mTeSR1培养基培养，获得工程化人源诱导多能干细胞；
    (3)使用含有8～12μM Rock抑制剂的mTeSR1培养基培养所述工程化诱导多能干细胞至细胞密度达40％～50％，将培养基替换为含有1～3μg/mL多西霉素的KSR培养基继续培养20～24h，将培养基替换为含有1～3μg/mL多西霉素和0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素的KSR+N2B培养基继续培养20～24h，将培养基替换为含有1～3μg/mL多西霉素、0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素和B27的N2B培养基继续培养20～24h，获得预分化状态的工程化人源神经细胞；使用含有1～3μg/mL多西霉素、0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素、5～15ng/mL脑源性神经营养因子、5～15ng/mL睫状神经营养因子、5～15ng/mL胶质细胞源性神经营养因子和B27的 NBM培养基培养上述预分化状态的工程化人源神经细胞18～24天，获得分化成熟的工程化人源神经细胞；以及
    (4)使用含有β-淀粉样蛋白的mTeSR1培养基培养所述工程化神经细胞48～96h，获得人源具有阿尔兹海默症表型的细胞。
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