WO2021192726A1

WO2021192726A1 - コリン取り込み抑制剤、細胞死誘導剤、抗がん剤、およびその用途

Info

Publication number: WO2021192726A1
Application number: PCT/JP2021/005541
Authority: WO
Inventors: 正人稲津
Original assignee: 学校法人東京医科大学
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2021-02-15
Publication date: 2021-09-30

Abstract

抗がん剤として使用できる新たな薬剤の提供を目的とする。　本発明のコリン取り込み抑制剤は、細胞に対するコリンの取り込みを抑制する抑制剤であり、下記式（１）で表されるイソキノリン化合物またはその誘導体を含むことを特徴とする。

Description

コリン取り込み抑制剤、細胞死誘導剤、抗がん剤、およびその用途

　本発明は、コリン取り込み抑制剤、細胞死誘導剤、抗がん剤、およびその用途に関する。

　がんは、中年期以降の年齢における死因として大半を占めていることから、抗がん剤は、非常に重要な開発対象である。そして、低分子化合物、抗体、核酸等、様々な種類の抗がん剤の実用化が試みられている。

　しかしながら、がんの中には、いまだ有効な抗がん剤が開発されていないものもあり、また、抗がん剤の中には、耐性が出現するもの、副作用が問題になるもの等もある。このため、医療分野においては、新たな抗がん剤の提供が望まれている。

　そこで、本発明は、抗がん剤として使用できる新たな薬剤の提供を目的とする。

　前記目的を達成するために、本発明のコリン取り込み抑制剤は、細胞に対するコリンの取り込みを抑制する抑制剤であり、下記式（１）で表されるイソキノリン化合物またはその誘導体を含むことを特徴とする。

　本発明の細胞死誘導剤は、前記本発明のコリン取り込み抑制剤を含むことを特徴とする。

　本発明の抗がん剤は、前記本発明のコリン取り込み抑制剤を含むことを特徴とする。

　本発明のコリン取り込みを抑制する抑制方法は、がん細胞に、前記本発明のコリン取り込み抑制剤を添加する工程を含むことを特徴とする。

　本発明の細胞死誘導方法は、がん細胞に、前記本発明のコリン取り込み抑制剤を添加する工程を含むことを特徴とする。

　本発明のがんの治療方法は、患者に前記本発明のコリン取り込み抑制剤を投与する工程を含むことを特徴とする。

　本発明によれば、がん細胞によるコリンの取り込みを抑制することで、がん細胞の細胞死を誘導できる。また、抗がん剤のうち、植物由来の化合物を有効成分としているものは、多くが臨床応用されており、本発明における各種化合物は、植物由来の化合物を骨格とする。このため、本発明も、すでに臨床応用されている植物由来の化合物を有効成分とする抗がん剤と同様に、非常に有用な抗がん剤として、臨床応用となる可能性も高い。このため、本発明は、例えば、医療分野において、非常に有用といえる。

図１は、舌がん細胞におけるコリン取り込み量と化合物濃度との関係を示すグラフである。図２（Ａ）は、舌がん細胞（HCS-3）の生存率と化合物濃度と前記化合物による処理時間との関係を示すグラフであり、図２（Ｂ）は、舌がん細胞の生存率を示すグラフであり、図２（Ｃ）は、舌がん細胞のcaspase-3/7活性を示すグラフである。図３は、グリオーマ細胞（U251MG）および膵臓がん細胞（MIA PaCa-2）におけるコリン取り込み量と化合物濃度との関係を示すグラフである。図４は、グリオーマ細胞（U251MG）または膵臓がん細胞（MIA PaCa-2）の生存率と化合物濃度との関係を示すグラフである。図５は、化合物＃１を添加した際の各種がん細胞の生存率と化合物濃度との間関係を示すグラフである。図６は、化合物＃１６を添加した際の各種がん細胞の生存率と化合物濃度との間関係を示すグラフである。図７（Ａ）は、グリオーマ細胞（U251MG）に関し、左の２つグラフは、化合物＃１を用いた細胞の生存率と、caspase-3/7活性の結果であり、右の２つのグラフは、化合物＃１６を用いた細胞の生存率と、caspase-3/7活性の結果である。図７（Ｂ）は、膵臓がん細胞（MIA PaCa-2）に関し、左の２つグラフは、化合物＃１を用いた細胞の生存率と、caspase-3/7活性の結果であり、右の２つのグラフは、化合物＃１６を用いた細胞の生存率と、caspase-3/7活性の結果である。図８は、グリオーマ細胞（U251MG）を移植したモデルマウスに前記化合物＃１（化合物Ｘ）を投与した結果であり、（Ａ）のグラフは、投与後の日数と、モデルマウスの腫瘍体積（mm^３／mouse）との関係を示し、（Ｂ）のグラフは、投与後０日目から１８日目までの腫瘍体積の合計を示し、（Ｃ）のグラフは、投与後の日数と、モデルマウスの体重との関係を示す。図９は、膵臓がん細胞（MIAPaCa-2）を移植したモデルマウスに前記化合物＃１または＃１６を投与した結果であり、（Ａ）のグラフは、投与後の日数と、モデルマウスの腫瘍体積（mm^３／mouse）との関係を示し、（Ｂ）のグラフは、投与後０日目から１１日目までの腫瘍体積の合計を示し、（Ｃ）のグラフは、投与後の日数と、モデルマウスの体重との関係を示す。図１０は、舌がん細胞（HSC-3）を移植したモデルマウスに前記化合物＃２を投与した結果であり、（Ａ）のグラフは、投与後の日数と、モデルマウスの腫瘍体積（mm^３／mouse）との関係を示し、（Ｂ）のグラフは、投与後０日目から１７日目までの腫瘍体積の合計を示し、（Ｃ）のグラフは、投与後の日数と、モデルマウスの体重との関係を示す。

　本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。

（コリン取り込み抑制剤）
　本発明のコリン取り込み抑制剤は、前述のように、前記式（１）で表されるイソキノリン化合物またはその誘導体を含むことを特徴とする。以下、前記式（１）の化合物とその誘導体とをあわせて、本発明における薬剤ともいう。本発明のコリン取り込み抑制剤は、前記薬剤を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。

　本発明のコリン取り込み抑制剤によれば、がん細胞のコリンの取り込みを抑制することによって、がん細胞の細胞死を誘導できる。このため、本発明のコリン取り込み抑制剤は、例えば、後述するような細胞死誘導剤として使用できる。

　本発明のコリン取り込み抑制剤を使用した場合、がん細胞の細胞死の様式は、特に制限されず、例えば、アポトーシスによるものがあげられる。このため、本発明のコリン取り込み抑制剤は、例えば、細胞死誘導剤、具体的に、例えば、アポトーシス誘導剤ということもできる。以下、がん細胞のコリン取り込みを抑制するコリン取り込み抑制剤は、例えば、細胞死誘導剤、またはアポトーシス誘導剤と読み替え可能であり、細胞死誘導の効果は、例えば、アポトーシス誘導の効果と読み替え可能である。

　本発明における薬剤は、前述のように、前記式（１）で表されるイソキノリン化合物（＃１）、またはその誘導体である。

　前記誘導体は、特に制限されず、前記誘導体におけるイソキノリン環の構造は、例えば、表２の下記式（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかの構造で表される。また、前記誘導体において、前記イソキノリン環の置換基Ｒは、例えば、表３の下記式（Ｂ１）～（Ｂ１８）のいずれかの構造で表される。前記誘導体の構造は、例えば、下記式（Ａ１）のイソキノリン環と下記式（Ｂ１）～（Ｂ１８）のいずれかの置換基Ｒとの組み合わせ、下記式（Ａ２）のイソキノリン環と下記式（Ｂ１）～（Ｂ１８）のいずれかの置換基Ｒとの組み合わせ、下記式（Ａ３）のイソキノリン環と下記式（Ｂ１）～（Ｂ１８）のいずれかの置換基Ｒとの組み合わせ、下記式（Ａ４）のイソキノリン環と下記式（Ｂ１）～（Ｂ１８）のいずれかの置換基Ｒとの組み合わせ等があげられる。下記表２において、右列の番号（＃）は、左列の各イソキノリン環を有する後述する誘導体の具体例の番号である。表３において、式（Ｂ１）～（Ｂ１８）の番号は、それぞれ、後述する誘導体の具体例の番号と対応する。

　表４、表５、表６に、前記誘導体の具体例を示す。表４の誘導体＃２は、式（Ａ２）と式（Ｂ２）との組み合わせであり、表５の誘導体＃３～＃１０は、式（Ａ１）と式（Ｂ３）～（Ｂ１０）との組み合わせであり、表６において、誘導体＃１１、＃１２、＃１４～＃１６は、式（Ａ１）と式（Ｂ１１）、（Ｂ１２）、（Ｂ１４）～（Ｂ１６）との組み合わせであり、誘導体＃１３および＃１７は、式（Ａ３）と式（Ｂ１３）または（Ｂ１７）との組み合わせであり、誘導体＃１８は、式（Ａ４）と式（Ｂ１８）との組み合わせである。

　本発明において、前記薬剤は、例えば、前記式（１）の化合物の塩、水和物、溶媒和物、異性体等、前記誘導体の塩、水和物、溶媒和物、異性体等でもよい。前記異性体は、例えば、立体異性体および互変異生体等があげられる。

　本発明のコリン取り込み抑制剤は、有効成分として前記薬剤を含む。本発明のコリン取り込み抑制剤は、例えば、有効成分のみから構成されてもよいし、有効成分とその他の成分とを含んでもよい。前記有効成分は、例えば、前記薬剤のみから構成されてもよいし、前記薬剤とその他の有効成分とを含んでもよい。前記有効成分として含まれる前記薬剤は、例えば、一種類のみでもよいし、二種類以上を含んでもよい。本発明のコリン取り込み抑制剤を医薬品または医薬部外品として使用する場合、前記他の成分は、例えば、薬学上許容される添加剤である。

　本発明のコリン取り込み抑制剤は、例えば、in vivoで使用してもよいし、in vitroで使用してもよい。本発明のコリン取り込み抑制剤は、例えば、研究用試薬として使用することもでき、医薬品または医薬部外品として使用することもできる。

　本発明のコリン取り込み抑制剤の添加対象は、特に制限されず、例えば、細胞、または、前記細胞を含む組織、器官、もしくは生体等である。前記添加対象は、例えば、がん化した対象でもよいし、がん化していない正常な対象でもよいし、がん化しているか否か不明な対象でもよい。前記添加対象の由来の生物は、特に制限されず、ヒト、または、ヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ネコ、ヤギ、サル、モルモット、ウシ等の非ヒト哺乳類等があげられる。

　本発明のコリン取り込み抑制剤の添加方法は、特に制限されない。添加対象が生体の場合、添加（投与）の形態は、例えば、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。

　本発明のコリン取り込み抑制剤の形態は、特に制限されず、例えば、添加対象および添加方法等によって適宜設定できる。前記形態は、例えば、液体、エマルジョン、クリーム、ゲル、軟膏等があげられる。本発明のコリン取り込み抑制剤は、例えば、これらの形態に応じて、適宜、前記他の成分を含んでもよい。

　具体例として、本発明のコリン取り込み抑制剤をがん細胞に添加する場合、一回の培養において、細胞１万個／１ｍＬ（培地）／１ウェルでの前記コリン取り込み抑制剤（前記薬剤）の前記培地における濃度は、その下限が、例えば、０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬであり、その上限が、例えば、１０ｍｇ／ｍＬであり、その範囲が、例えば、０．００１～１０ｍｇ／ｍＬ、０．０１～１０ｍｇ／ｍＬ、０．１～１０ｍｇ／ｍＬである。本発明のコリン取り込み抑制剤を生体に添加する場合、後述する本発明の抗がん剤における記載を援用できる。

（細胞死誘導剤）
　本発明の細胞死誘導剤は、前述のように、本発明のコリン取り込み抑制剤を含むことを特徴とする。本発明の細胞死誘導剤は、前記本発明のコリン取り込み抑制剤を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の細胞死誘導剤は、例えば、アポトーシス誘導剤ともいえる。本発明の細胞死誘導剤は、前記本発明のコリン取り込み抑制剤等の記載を援用できる。本発明の細胞死誘導剤によれば、がん細胞の細胞死を、コリンの取り込みを抑制することによって誘導できる。

（抗がん剤）
　本発明の抗がん剤は、前述のように、本発明のコリン取り込み剤を含むことを特徴とする。本発明の抗がん剤は、前記本発明のコリン取り込み抑制剤を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の抗がん剤は、前記本発明のコリン取り込み抑制剤および前記本発明の細胞死誘導剤の記載を援用できる。本発明の抗がん剤によれば、がん細胞におけるコリンの取り込みを抑制して、がん細胞の細胞死を誘導することによって、がんを治療できる。

　本発明において、がんの治療は、例えば、いわゆる、がんの進行の緩和、がんの治癒等のための行為の意味も含む。本発明の抗がん剤は、例えば、いずれか１つを目的として使用されてもよいし、２つ以上を目的として使用されてもよい。

　本発明の抗がん剤は、例えば、前記本発明のコリン取り込み抑制剤における前記薬剤の他、薬学上許容される添加剤を含んでもよい。前記添加剤は、例えば、賦形剤、安定剤、界面活性剤、保存剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤、キレート剤、着色剤、着香剤、保湿成分、ビタミン類、アミノ酸類等があげられる。本発明において、前記添加剤の配合量は、特に制限されず、例えば、前記コリン取り込み抑制剤の機能を妨げるものでなければよい。

　本発明の抗がん剤の投与方法は、特に制限されず、非経口投与、経口投与があげられ、例えば、治療の目的、対象部位、がんの進行度等に応じて、適宜設定できる。

　前記非経口投与の場合、投与部位は、例えば、治療部位、すなわちがん化した部位でもよいし、がん化した部位まで本発明の抗がん剤の有効成分をデリバリーできる部位でもよい。前記非経口投与の方法は、例えば、患部注射、静脈注射、皮下注射、皮内注射、点滴注射、経皮投与等があげられる。非経口投与の場合、剤型は、特に制限されず、投与方法により適宜決定でき、例えば、液状、クリーム状、ジェル状等であり、媒質と前記本発明のコリン取り込み抑制剤における前記薬剤とを混合することで調製できる。前記媒質のうち、水性溶媒は、例えば、生理食塩水、等張液等であり、油性溶媒は、例えば、大豆油等であり、乳化溶媒は、例えば、これらの混合液である。前記非経口投与剤は、例えば、さらに、アルコール、ポリアルコール、界面活性剤等を含んでもよい。また、本発明の抗がん剤は、例えば、前記本発明のコリン取り込み抑制剤における前記薬剤を、前記治療部位以外から前記治療部位に効果的にデリバリーするためのＤＤＳ剤を含んでもよいし、前記治療部位の中でもがん細胞に効果的にデリバリーするためのＤＤＳを含んでもよい。

　前記経口投与の場合、経口投与剤の剤型は、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤等があげられる。前記経口投与剤は、例えば、希釈剤、賦形剤、担体等を含んでもよい。

　前記賦形剤は、例えば、グリセリン、ポリエチレングリコール等の多価アルコールまたはその誘導体等があげられる。前記安定剤は、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾール等のフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；ソルビン酸等があげられる。前記界面活性剤は、例えば、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸ソルビタン等のＷ／Ｏ型乳化剤；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリソルベート６０等のＯ／Ｗ型乳化剤があげられる。前記保存剤は、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、フェノキシエタノール、チモール等があげられる。前記抗酸化剤は、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸、トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン、エデト酸ナトリウム水和物、ベンゾトリアゾール等があげられる。前記ｐＨ調整剤は、例えば、クエン酸水和物、クエン酸ナトリウム水和物、乳酸、ジイソプロパノールアミン、酢酸、酢酸ナトリウム水和物等があげられる。

　本発明の抗がん剤の投与条件は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類、性別、年齢、投与対象の部位等に応じて、投与時期、投与期間、投与量等を適宜設定できる。

　具体例として、本発明の抗がん剤をヒトに患部注射する場合、１日あたりの前記薬剤の投与量合計は、例えば、０．００１～１０００ｍｇ、０．０１～１０００ｍｇ、０．１～１０００ｍｇ、投与期間は、例えば、１～１４日、１日あたりの投与回数は、例えば、１～５回、投与間隔は、例えば、毎日、３～７日ごとである。

（コリン取り込み抑制方法）
　本発明のコリン取り込み抑制方法は、がん細胞のコリン取り込みを抑制する方法であり、がん細胞に、前記本発明のコリン取り込み抑制剤を添加する工程を含むことを特徴とする。本発明は、前記本発明のコリン取り込み抑制剤を添加する工程を含むことが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のコリン取り込み抑制剤は、前述の通りである。本発明のコリン取り込み抑制剤の添加条件等は、特に制限されず、例えば、本発明のコリン取り込み抑制剤における記載と同様である。

（細胞死誘導方法）
　本発明の細胞死誘導方法は、がん細胞の細胞死を誘導する方法であり、がん細胞に、前記本発明のコリン取り込み抑制剤を添加する工程を含むことを特徴とする。本発明は、前記本発明のコリン取り込み抑制剤または前記本発明の細胞死誘導剤を添加する工程を含むことが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のコリン取り込み抑制剤および細胞死誘導剤は、前述の通りである。本発明のコリン取り込み抑制剤および細胞死誘導剤の添加条件等は、特に制限されず、例えば、本発明のコリン取り込み抑制剤および細胞死誘導剤における記載と同様である。

（治療方法）
　本発明のがんの治療方法は、患者に前記本発明のコリン取り込み抑制剤を投与する工程を含むことを特徴とする。本発明は、前記本発明のコリン取り込み抑制剤、細胞死誘導剤、または抗がん剤を投与する工程を含むことが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のコリン取り込み抑制剤、細胞死誘導剤、または抗がん剤は、前述の通りである。本発明のコリン取り込み抑制剤、細胞死誘導剤、または抗がん剤の投与条件等は、特に制限されず、例えば、本発明のコリン取り込み抑制剤、細胞死誘導剤、または抗がん剤における記載と同様である。

（薬剤の使用）
　本発明は、がん細胞のコリン取り込み抑制、細胞死誘導、またはがん治療に使用するための、前記式（１）で表されるイソキノリン化合物またはその誘導体（前記薬剤）の使用である。本発明は、コリン取り込み抑制剤、細胞死誘導剤、または抗がん剤の製造のための前記薬剤の使用である。本発明は、例えば、前記本発明のコリン取り込み抑制剤、細胞死誘導剤、抗がん剤、コリン取り込み抑制方法、細胞死誘導方法、およびがんの治療方法の説明を援用できる。

　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。

（化合物）
　後述する表１に示す１８種類の化合物（＃１～＃１８）は、植物由来化合物であり、市販品を使用した（Greenpharma社）。前記化合物は、それぞれ１００μｍｏｌ／ＬとなるようにＤＭＳＯと混合して、使用した。前記化合物に対するネガティブコントロールは、化合物未添加のＤＭＳＯを使用した。

（細胞培養）
　ヒトすい臓がん細胞株MIA PaCa-2(RCB2094：理化学研究所バイオリソースセンター)の培養は、１０％牛胎児血清ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するD-MEM培地を使用した。ヒトグリオーマ細胞株U251MG（JCRB細胞バンク）の培養は、１０％FBS含有D-MEM培地を使用した。ヒト舌がん細胞株（HCS-3： JCRB細胞バンク）の培養は、PMI-1640培地を用いて確認した。不死化ヒト正常アストロサイト（HASTR/ci35、千葉大学医学部より供与）の培養は、blastcidin S含有Gibco（登録商標）Astrocyte Medium(A1261301：Gibco)を使用した。いずれの細胞も培養条件は、３７℃、５％ＣＯ_２とした。

（RT-PCR法）
　Total RNAは、RNeasy（登録商標） Mini Kit (Qiagen)を用いて抽出し、mRNA発現は、各ターゲット遺伝子に対するTaqMan（登録商標） Probe (Applied Biosystems)およびTaqMan（登録商標） RNA-to-Ct（商標） 1-Step Kit (Applied Biosystems)を用い、LightCycler（登録商標） 96 システム (Roche)により定量化した。

（コリン取り込み測定）
　コリントランスポーター(CTL1)を介する取り込み機構が存在する不死化ヒト正常アストロサイト（HASTR/ci35）細胞を使用した。前記細胞を24ウェルプレートに1x10⁵個/wellになるように播種し、24時間後、[³H]コリン取り込み実験を行った。細胞を培養したウェルプレートの培地を捨てた後、uptake buffer (125 mmol/L NaCl, 4.8 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L CaCl₂, 1.2 mmol/L KH₂PO₄, 5.6 mmol/L glucose, 1.2 mmol/L MgSO₄ および25 mmol/L HEPES, pH 7.4)で洗浄した。前記uptake bufferの添加後、最終濃度が10 μmol/Lになるように、[³H]コリンを添加して取り込みを開始した。[³H]コリンの取り込みを所定時間（２０分間）行った後、前記uptake bufferを吸引除去し、予め冷やしておいたuptake bufferで、ウェルを２回洗浄した。そして、細胞を、0.1 ｍｏｌ／Ｌ NaOH含有0.1 % Triton X-100溶液で溶解させ、細胞内に取り込まれた[³H]コリン量を、液体シンチレーションカウンター（Tri-Carb 2100 TR）により測定した。前記化合物＃１～＃１８は、[³H]コリンを添加する前に添加した。また、ネガティブコントロールとして、化合物に代えて、ＤＭＳＯを添加した。前記化合物を添加した際のコリン取り込み量は、ネガティブコントロールの測定結果を１００％として相対値を算出した。

（細胞生存測定）
　細胞の生存は、CellTiter-Glo（登録商標） Luminescent Cell Viability Assay (Promega)を用いて、発光アッセイにより培養中の細胞における生細胞数を測定した。前記化合物＃１～＃１８は、細胞培養の２４時間後に添加した。また、ネガティブコントロールとして、前記化合物に代えて、ＤＭＳＯを添加した。前記化合物を添加した際の細胞生存率は、ネガティブコントロールの生細胞数を１００％として相対値を算出した。

（Caspase-3/7活性測定）
　アポトーシスの指標であるcaspase-3/7 活性は、Caspase-Glo（登録商標） 3/7 activity（Promega）を使用して測定した。そして、caspase-3/7活性の測定と同時に生細胞数を測定し、単位生細胞数あたりの活性として評価した。

（ヒトがん異種移植モデルマウスにおける化合物の抗腫瘍効果の観察）
　雄BALB/cAJcl-nu/nuヌードマウスの背部皮下に、がん細胞の懸濁液を皮下注射して移植した。定着後は、その固形腫瘍をブロック状にし、次のマウスに植え継いだ。腫瘍体積が200mm³を超えてから、化合物X/Yを10 mg/kgを腹腔内投与した。対照は、同容量の100% DMSOを用いた。体重と、腫瘍の長径(L)、および短径(W)を測定し、L×W2×1/2を推定腫瘍体積として観察した。各種臓器のTotal RNAの抽出は、PS 2000 Cell Destroyer（商品名）を用いて臓器を破砕後に行った。

（データ解析）
　統計解析ソフトInstat 3を用いて、2群間の比較は、unpaired t-test、３群以上の比較は、Dunnett’sの多重比較検定を行った。結果は、p値が0.05以下の場合、統計学的に有意な差とみなした。Kinetic解析は、Prism 5の非線形回帰法およびEadie-hofsteeのプロット解析を用いて行った。

［実施例１］
　本発明の薬剤について、コリン取り込み阻害作用および各種がんに対する抗腫瘍効果を確認した。

　前記化合物＃１～＃１８を不死化ヒト正常アストロサイト（HASTR/ci35）に添加して、コリン取り込み量を測定した。また、前記化合物＃１～＃１８をヒトすい臓がん細胞株MIA PaCa-2、ヒトグリオーマ細胞株U251MG、ヒト舌がん細胞株（HCS-3）に添加して、細胞生存率を測定した。これらの結果を表７に示す。いずれの化合物も、コリンの取り込みを抑制し、さらにがん細胞の生存率を抑制することができた。中でも化合物＃１および＃１６は、いずれのがん細胞にも効果的な生存抑制を示した。

［実施例２］
　本発明の薬剤のうち、化合物＃２（GPN000316/Amb544925）について、コリン取り込み阻害作用と舌がん細胞に対する抗腫瘍効果を確認した。

（２－１）コリン取り込み阻害
　前記化合物＃２について、コリン取り込み阻害作用の濃度依存性を、舌がん細胞（HCS-3）を用いて確認した。この結果を、図１に示す。図１は、コリン取り込み量と化合物濃度との関係を示すグラフである。コリン取り込み量の単位（% of vehicle）は、ネガティブコントロール（ＤＭＳＯ添加）のコリン取り込み量を１００％とする相対値で示した。図１に示すように、前記化合物＃２は、舌がん細胞におけるコリン取り込みを、濃度依存的に阻害できた。

（２－２）細胞生存への影響
　前記化合物＃２について、細胞生存への影響を、舌がん細胞（HCS-3）を用いて確認した。前記化合物での処理時間を２４ｈ、４８ｈ、７２ｈとした。この結果を、図２（Ａ）に示す。図２（Ａ）は、生存率と化合物濃度と前記化合物での処理時間との関係を示すグラフである。生存率の単位（% of vehicle）は、ネガティブコントロール（ＤＭＳＯ添加）の生細胞数を１００％とする相対値で示した。図２（Ａ）に示すように、化合物＃２は、がん細胞の生存を、濃度依存的および時間依存的に抑制できた。このことから、化合物＃２は、細胞周期依存的に細胞生存を抑制すると考えられる。

（２－３）Caspase-3/7活性への影響
　前記化合物＃２は、細胞死を誘導すると考えられる。そこで、細胞死のメカニズムの検討のため、前記化合物＃２での処理後における、舌がん細胞（HCS-3）生存およびcaspase-3/7活性を確認した。また、ネガティブコントロールとして、前記各化合物に代えて、ＤＭＳＯを添加して、同様の確認を行った。

　これらの結果を、図２（Ｂ）および（Ｃ）に示す。（Ｂ）は、化合物＃２で処理した舌がん細胞の生存率を示すグラフであり、（Ｃ）は、化合物＃２で処理した舌がん細胞のcaspase-3/7活性の結果である。各グラフの「ＤＭＳＯ」は、ネガティブコントロールの結果である。図２に示すように、ネガティブコントロールと比較して、舌がん細胞に前記化合物＃２を添加することによって、caspase-3/7活性の有意な増加が見られ、細胞率の有意な抑制が確認された。これらの結果から、化合物＃２は、アポトーシス誘導による細胞死を引き起こすことで、抗腫瘍活性を示すと考えられる。

［実施例３］
　本発明の薬剤のうち、化合物＃１（Amb4269951）および化合物＃１６（Amb4269675）について、コリン取り込み阻害作用および各種がん細胞に対する抗腫瘍効果を確認した。

（３－１）コリン取り込み阻害
　前記化合物＃１および＃１６について、コリン取り込み阻害作用の濃度依存性を、グリオーマ細胞（U251MG）および膵臓がん細胞（MIA PaCa-2）を用いて確認した。

　これらの結果を、図３に示す。図３において、（Ａ）のグラフは、グリオーマ細胞におけるコリン取り込み量と化合物濃度との関係を示すグラフであり、（Ｂ）のグラフは、膵臓がん細胞におけるコリン取り込み量と化合物濃度との関係を示すグラフであり、左は、化合物＃１の結果、右は、化合物＃１６の結果である。コリン取り込み量の単位（% of vehicle）は、ネガティブコントロール（ＤＭＳＯ添加）のコリン取り込み量を１００％とする相対値で示した。図３に示すように、いずれの化合物も、グリオーマ細胞および膵臓がん細胞におけるコリン取り込みを、濃度依存的に阻害できた。それぞれのＩＣ_５０値は、グリオーマ細胞（U251MG）に対して、化合物＃１が２．４μｍｏｌ／Ｌ、化合物＃１６が３．６μｍｏｌ／Ｌであり、膵臓がん細胞（MIA PaCa-2）に対して、化合物＃１が２．４μｍｏｌ／Ｌ、化合物＃１６が６．０μｍｏｌ／Ｌであった。

（３－２）細胞生存への影響
　前記化合物＃１および＃１６について、細胞生存への影響を、グリオーマ細胞（U251MG）および膵臓がん細胞（MIA PaCa-2）を用いて確認した。

　これらの結果を、図４に示す。図４において、（Ａ）のグラフは、グリオーマ細胞の生存率と化合物濃度との関係を示すグラフであり、（Ｂ）のグラフは、処理時間ごとの膵臓がん細胞の生存率と化合物濃度との関係を示すグラフであり、左は、化合物＃１の結果、右は、化合物＃１６の結果である。生存率の単位（% of vehicle）は、ネガティブコントロール（ＤＭＳＯ添加）の生細胞数を１００％とする相対値で示した。図４に示すように、いずれの化合物も、グリオーマ細胞および膵臓がん細胞の細胞生存を、濃度依存的および時間依存的に抑制できた。このことから、化合物＃１および＃１６は、いずれも、細胞周期依存的に細胞生存を抑制すると考えられる。

（３－３）様々ながん細胞の細胞生存への影響
　前記（３－２）と同様にして、前記化合物＃１および＃１６について、様々ながん細胞の生存率を確認した。がん細胞は、ヒト食道扁平上皮がん細胞（KYSE450）、ヒト膵臓腺がん細胞（PANC-1）、ヒト乳腺がん細胞（MCF-7）、ヒト妊娠性絨毛がん細胞（JEG-3）、ヒト前立腺がん細胞（PC-3）、ヒト口腔扁平上皮がん細胞（HSC-3）、ヒト結腸腺がん細胞（HT-29）、ヒト肺小細胞がん細胞（H69）、ヒト悪性メラノーマ細胞（MeWo）、ヒト神経芽細胞腫細胞（SH-SY5Y）、ヒト肝がん細胞（HepG2）、ヒト前立腺がん細胞（LNCaP）、ヒト子宮頚部がん細胞（HeLa）を使用した。各細胞の処理条件は、前記化合物での処理時間を２４時間とした以外は、前記（３－２）と同様にした。

　これらの結果を、図５および図６に示す。図５および図６において、各グラフは、細胞の生存率と化合物濃度との関係を示すグラフであり、図５は、前記化合物＃１の結果、図６は、化合物＃１６の結果である。生存率の単位（% of vehicle）は、ネガティブコントロール（ＤＭＳＯ添加）の生細胞数を１００％とする相対値で示した。図５および図６に示すように、いずれの化合物も、様々ながん細胞の細胞生存を、濃度依存的および時間依存的に抑制できた。

（３－４）Caspase-3/7活性への影響
　前記化合物＃１および＃１６は、細胞生存の抑制によって、細胞死を誘導すると考えられる。そこで、細胞死のメカニズムの検討のため、２４時間処理した際における、細胞生存およびcaspase-3/7活性を確認した。また、ネガティブコントロールとして、前記各化合物に代えて、ＤＭＳＯを添加して、同様の確認を行った。

　これらの結果を、図７に示す。図７において、（Ａ）は、グリオーマ細胞（U251MG）に関し、左の２つグラフは、化合物＃１を用いた細胞の生存率と、caspase-3/7活性の結果であり、右の２つのグラフは、化合物＃１６を用いた細胞の生存率と、caspase-3/7活性の結果である。また、（Ｂ）は、膵臓がん細胞（MIA PaCa-2）に関し、左の２つグラフは、化合物＃１を用いた細胞の生存率と、caspase-3/7活性の結果であり、右の２つのグラフは、化合物＃１６を用いた細胞の生存率と、caspase-3/7活性の結果である。各グラフの左のバー「ＤＭＳＯ」は、ネガティブコントロールの結果であり、右のバーの濃度（μＭ）は、前記各化合物の添加濃度である。図７に示すように、いずれの化合物を使用した場合も、ネガティブコントロールと比較して、グリオーマ細胞および膵臓がん細胞の両方について、caspase-3/7活性の有意な増加が見られ、細胞率の有意な抑制が確認された。これらの結果から、化合物＃１および化合物＃１６は、アポトーシス誘導による細胞死を引き起こすことで、抗腫瘍活性を示すと考えられる。

［実施例４］
　本発明の薬剤について、in vivoにおける各種がんに対する抗腫瘍活性を確認した。

（１）グリオーマ
　薬剤は、化合物＃１（Amb4269951）を使用した。グリオーマ細胞（U251MG）を移植したヒトがん細胞異種移植モデルマウスに、前記化合物＃１を１０ｍｇ／ｋｇの条件で腹腔内投与した。投与は、Ｄａｙ０（実験開始日）、３、７、１０、１５、１８に１日１回行った。また、ネガティブコントロールとして、前記各化合物に代えて、ＤＭＳＯを投与した。そして、経時的に、腫瘍体積と体重とを測定した。

　これらの結果を、図８に示す。図８において、（Ａ）は、実験開始日（Ｄａｙ０）からの日数と、モデルマウスの腫瘍体積（mm^３／mouse）との関係を示すグラフであり、（Ｂ）は、０日目（実験開始日Ｄａｙ０）から１８日目（Ｄａｙ１８）までの腫瘍体積の合計を、面積（ＡＵＣ；Area Under the Curve）により示すグラフであり、（Ｃ）は、実験開始日（Ｄａｙ０）からの日数と、モデルマウスの体重との関係を示すグラフである。

　前記化合物＃１を投与したモデルマウスは、ネガティブコントロールと比較して、図８（Ａ）および（Ｂ）に示すように、腫瘍体積の増加が有意に抑制され、一方、図８（Ｃ）に示すように、体重の低下は見られなかった。このことから、化合物＃１は、体重低下につながる毒性が低く、且つ、抗腫瘍効果を示すことがわかった。

（２）膵臓がん
　薬剤は、化合物＃１（Amb4269951）および化合物＃１６（Amb4269675）を使用した。膵臓がん細胞（MIAPaCa-2）を移植したヒトがん細胞異種移植モデルマウスに、前記化合物＃１または化合物＃１６を、１０ｍｇ／ｋｇの条件で腹腔内投与した。投与は、Ｄａｙ０（実験開始日）－４およびＤａｙ７－１１に１日１回行った。また、ネガティブコントロールとして、前記各化合物に代えて、ＤＭＳＯを投与した。そして、経時的に、腫瘍体積と体重とを測定した。

　これらの結果を、図９に示す。図９において、（Ａ）は、実験開始日（Ｄａｙ０）からの日数と、モデルマウスの腫瘍体積（mm^３／mouse）との関係を示すグラフであり、（Ｂ）は、０日目（実験開始日Ｄａｙ０）から１１日目（Ｄａｙ１１）までの腫瘍体積の合計を、面積（ＡＵＣ）により示すグラフであり、（Ｃ）は、実験開始日（Ｄａｙ０）からの日数と、モデルマウスの体重との関係を示すグラフである。

　前記化合物＃１または＃１６のいずれを投与したモデルマウスも、ネガティブコントロールと比較して、図９（Ａ）および（Ｂ）に示すように、腫瘍体積の増加が有意に抑制され、一方、図９（Ｃ）に示すように、体重の低下は見られなかった。このことから、化合物＃１および＃１６は、体重低下につながる毒性が低く、且つ、抗腫瘍効果を示すことがわかった。

（３）舌がん
　薬剤は、化合物＃２（GPN000316/Amb544925）を使用した。舌がん細胞（HSC-3）を移植したヒトがん細胞異種移植モデルマウスに、前記化合物＃２を、１０ｍｇ／ｋｇの条件で腹腔内投与した。投与は、実験開始日をＤａｙ０として、Ｄａｙ１―８に１日１回行った。また、ネガティブコントロールとして、前記各化合物に代えて、ＤＭＳＯを投与した。そして、経時的に、腫瘍体積と体重とを測定した。

　これらの結果を、図１０に示す。図１０において、（Ａ）は、実験開始日（Ｄａｙ０）からの日数と、モデルマウスの腫瘍体積（mm^３／mouse）との関係を示すグラフであり、（Ｂ）は、０日目（実験開始日Ｄａｙ０）から１７日目（Ｄａｙ１７）までの腫瘍体積の合計を、面積（ＡＵＣ）により示すグラフであり、（Ｃ）は、実験開始開始日（Ｄａｙ０）からの日数と、モデルマウスの体重との関係を示すグラフである。

　前記化合物＃２を投与したモデルマウスは、ネガティブコントロールと比較して、図１０（Ａ）および（Ｂ）に示すように、腫瘍体積の増加が有意に抑制され、一方、図１０（Ｃ）に示すように、体重はわずかな低下がみられたが、前記化合物＃２の投与終了後には、回復した。このことから、化合物＃２は、体重低下につながる毒性が低く、且つ、抗腫瘍効果を示すことがわかった。

　以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。

　この出願は、２０２０年３月２４日に出願された日本出願特願２０２０－５３２５９を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

Claims

下記式（１）で表されるイソキノリン化合物またはその誘導体を含むことを特徴とする細胞に対するコリン取り込み抑制剤。
前記誘導体のイソキノリン環が、下記式（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかで表される構造である、請求項１に記載のコリン取り込み抑制剤。
前記イソキノリン環における置換基Ｒが、下記式（Ｂ１）～（Ｂ１８）のいずれかで表される構造である、請求項２に記載のコリン取り込み抑制剤。
前記誘導体が、下記式（２）～（１８）のいずれかで表される構造である、請求項１から３のいずれか一項に記載のコリン取り込み抑制剤。
前記細胞が、がん細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載のコリン取り込み抑制剤。
さらに、経口用または非経口用の添加剤を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のコリン取り込み抑制剤。
前記添加剤が、医薬用添加剤である、請求項６に記載のコリン取り込み抑制剤。
請求項１から７のいずれか一項に記載のコリン取り込み抑制剤を含むことを特徴とする細胞に対する細胞死誘導剤。
請求項１から７のいずれか一項に記載のコリン取り込み抑制剤を含むことを特徴とする抗がん剤。
対象がんが、膵臓がん、グリオーマ、および舌癌からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項９に記載の抗がん剤。
対象がんが、食道扁平上皮がん、膵臓腺がん、乳腺がん、妊娠性絨毛がん、前立腺がん、口腔扁平上皮がん、結腸腺がん、肺小細胞がん、悪性メラノーマ、神経芽細胞腫、肝がん、および子宮頚部がんからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項９に記載の抗がん剤。
がん細胞に、請求項１から７のいずれか一項に記載のコリン取り込み抑制剤を添加する工程を含むことを特徴とするがん細胞のコリン取り込みを抑制する抑制方法。
がん細胞に、請求項１から７のいずれか一項に記載のコリン取り込み抑制剤を添加する工程を含むことを特徴とするがん細胞の細胞死を誘導する誘導方法。
患者に請求項１から７のいずれか一項に記載のコリン取り込み抑制剤を投与する工程を含むことを特徴とするがんの治療方法。