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WO2021150019A1 - 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조 방법 - Google Patents

타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조 방법 Download PDF

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Publication number
WO2021150019A1
WO2021150019A1 PCT/KR2021/000799 KR2021000799W WO2021150019A1 WO 2021150019 A1 WO2021150019 A1 WO 2021150019A1 KR 2021000799 W KR2021000799 W KR 2021000799W WO 2021150019 A1 WO2021150019 A1 WO 2021150019A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polynucleotide
amino acid
fructose
seq
mutant
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/000799
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이영미
김성보
최은정
정기준
전은정
조민수
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이제일제당 (주), 한국과학기술원 filed Critical 씨제이제일제당 (주)
Priority to US17/793,927 priority Critical patent/US20230041854A1/en
Priority to EP21743844.9A priority patent/EP4074822A4/en
Priority to CN202180010689.4A priority patent/CN115485376A/zh
Publication of WO2021150019A1 publication Critical patent/WO2021150019A1/ko

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12P19/02—Monosaccharides
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    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
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    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
    • C12Y401/0204—Tagatose-bisphosphate aldolase (4.1.2.40)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)

Definitions

  • the increase in the expression level of the enzyme and the increase in the production of tagatose is a microorganism of the genus Corynebacterium into which the mutated nucleotide is not introduced, that is, a microorganism of the genus Corynebacterium into which the unmutated nucleotide is introduced or a wild-type Corynebacterium. It may be an increase compared to the microorganisms of the genus Nebacterium.
  • the mutated enzyme may have increased activity of the mutated protein compared to the natural wild-type or unmodified protein, but is not limited thereto.
  • Hybridization requires that two polynucleotides have complementary sequences, although mismatches between bases are possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine. Accordingly, the present application may also include substantially similar polynucleotide sequences as well as isolated polynucleotide fragments complementary to the overall sequence.
  • Default parameters for the GAP program are: (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
  • the term “homology” or “identity” refers to a relevance between sequences.
  • the recombinant microorganism may include either a prokaryotic microorganism or a eukaryotic microorganism, as long as it is a microorganism capable of producing a fructose-4-epimerase or a mutant enzyme thereof, including the mutant polynucleotide of the present application or a vector including the same.
  • Escherichia genus, Erwinia genus, Serratia genus, Providencia genus, Corynebacterium genus, and Brevibacterium genus It may include a microbial strain belonging to, specifically, Corynebacterium ( Corynebacterium ) It may be a genus, for example, Corynebacterium ( Corynebacterium ) The genus is Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ), Corynebacterium Ammonia Genes ( Corynebacterium ammoniagenes ), Corynebacterium crudilactis ( Corynebacterium crudilactis ), Corynebacterium deserti ( Corynebacterium deserti ), Corynebacterium efficiens ( Corynebacterium efficiens ), Corynebacterium caluna ( Corynebacterium callunae ), Corynebacterium
  • Another aspect of the present application is a variant polynucleotide of the present application; or a vector comprising the variant polynucleotide; It is to provide a method for producing a fructose-4-epimerase or a mutant enzyme thereof, comprising the step of culturing a microorganism of the genus Corynebacterium comprising any one in a medium.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium is a fructose-4-epimerase derived from Cosmotoga Oelia; and mutant enzymes thereof; It may be to express any one, but is not limited thereto.
  • composition for producing tagatose may further include fructose, but is not limited thereto.
  • Comparative Example 1 Assay of expression rate and tagatose conversion rate of fructose-4-epimerase derived from Thermotoga neapolitana to which the same nucleotide mutation was applied

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Abstract

본 출원은 비변이형 폴리뉴클레오티드보다 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이 효소의 발현양이 현저히 높은 변이형 폴리뉴클레오티드와 변이형 폴리뉴클레오티드를 이용한 타가토스 생산용 조성물 및 타가토스 제조 방법에 관한 것이다.

Description

타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조 방법
본 출원은 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조 방법에 관한 것이다.
타가토스는 우유, 치즈 및 카카오 등의 식품, 그리고 사과와 귤과 같은 단맛이 나는 천연과일에 소량 존재하는 천연 감미료이다. 타가토스의 칼로리는 1.5 kcal/g으로 설탕의 1/3 수준이며, GI(Glycemic index, 혈당지수)는 3으로 설탕의 5% 수준인데 반해, 설탕과 물리적 성질이 유사하고, 유사한 단맛을 내면서 다양한 건강 기능성을 가지고 있기 때문에 건강과 맛을 동시에 만족시킬 수 있는 설탕 대체 감미료로 여러 제품에 이용될 수 있다.
종래 공지되거나 공용된 타가토스의 제조방법은 갈락토스를 주원료로 한 화학적 방법(촉매 반응)과 생물학적 방법(이성화 효소반응)이 있다(PCT WO2006/058092). 그러나 상기 종래의 제조방법에서 주원료로 사용되는 갈락토스의 기초 원료가 되는 유당은 국제 시장에서의 원유(原乳) 및 유당의 생산량, 수요 및 공급량 등에 따라 가격이 불안정하여 안정적 수급에 한계가 있으므로, 보편화된 당(설탕, 포도당, 과당 등)을 원료로 하는 타가토스 생산 시스템이 요구되고 있다.
이에, 현재 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 기반의 세포 반응을 통해 과당을 원료로 타가토스를 생산하는 기술이 적용되고 있다. 타가토스 전환효소를 생산하는 세포에 과당을 첨가하면 세포 반응을 통해 과당이 타가토스로 전환되어, 타가토스가 생산된다. 타가토스로의 전환 효율을 높이기 위해서는 무엇보다도 세포내 타가토스 전환효소의 양을 증가시킬 필요가 있으며 이를 위해 세포내 타가토스 전환효소의 고발현 시스템이 절대적으로 필요한 실정이다.
본 발명자들은 타가토스 전환효소인 과당-4-에피머화 효소의 발현을 증대시키기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 발현이 현저히 증대된 과당-4-에피머화 효소의 변이형 폴리뉴클레오티드를 발굴함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원은 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소; 또는 이의 변이 효소;를 코딩하는 변이형 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원은 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원은 상기 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는, 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소; 및 이의 변이 효소; 중 어느 하나를 발현하는, 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원은 상기 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 과당-4-에피머화 효소 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원은 상기 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는, 타가토스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원은 상기 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 과당과 접촉시키는 단계를 포함하는, 타가토스 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원은 상기 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물의 타가토스 생산 용도를 제공한다.
본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 비변이형 폴리뉴클레오티드 보다 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이 효소의 발현양이 현저히 높아 이를 포함하는 미생물로부터 효소 생성 시 경제성이 높다.
도 1은 변이형 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 과당-4-에피머화 효소의 발현량이다. E; empty plasmid, WT; #7_H4_KO(KNF4E), variant; #7_H4_KO(KNF4E) variant.
도 2는 변이형 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 과당-4-에피머화 효소의 타가토스 전환율이다.
도 3은 변이형 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 과당-4-에피머화 변이 효소의 발현량이다. 1; Empty, 2; #7_H4_KO(KNF4E), 3; #7_H4_KO(KNF4E)_variant, 4; #7_H4_KO(KNF4E)_variant_3aa mutation (N97Y, T124W, N367V), 5; #7_H4_KO(KNF4E)_variant_1aa mutation(T124W).
도 4는 변이형 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 과당-4-에피머화 변이 효소의 타가토스 전환율이다.
도 5는 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 유래의 과당-4-에피머화 변이 효소에 뉴클레오티드 변이를 적용한 변이형 폴리뉴클레오티드의 발현량이다. Con; empty plasmid, WT; H4_TN_original, variant2; H4_TN_variant_2, CJ; mUxaE, variant1; H4_TN_ variant_1.
도 6은 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 유래의 과당-4-에피머화 변이 효소에 뉴클레오티드 변이를 적용한 변이형 폴리뉴클레오티드의 타가토스 전환율이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소; 또는 이의 변이 효소;를 코딩하는 변이형 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
상기 변이형 폴리뉴클레오티드는 과당-4-에피머화 효소; 또는 이의 변이 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에서, 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 어느 하나 이상 변이된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드는 i) 류신(L)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CTC, CTG, CTT 및 TTG로 이루어지는 군으로부터 선택; ii) 이소류신(I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ATC 및 ATT로 이루어지는 군으로부터 선택; iii) 쓰레오닌(T)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ACT, ACG 및 ACC로 이루어지는 군으로부터 선택; iv) 아르기닌(R)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CGT, CGC 및 CGG로 이루어지는 군으로부터 선택; v) 글리신(G)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GGC, GGT 및 GGA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하는 것일 수 있고, i) 내지 v) 의 변이를 모두 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
추가적으로, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드는 vi) 발린(V)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GTA, GTC, GTG 및 GTT로 이루어지는 군으로부터 선택; vii) 세린(S)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 TCA, TCT, TCC 및 AGC로 이루어지는 군으로부터 선택; viii) 알라닌(A)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GCG, GCT, GCC 및 GCA로 이루어지는 군으로부터 선택; 및 ix) 글루타민(Q)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CAG 및 CAA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드는 i) 류신(L)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CTC, CTG, CTT 및 TTG로 이루어지는 군으로부터 선택; ii) 이소류신(I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ATC 및 ATT로 이루어지는 군으로부터 선택; iii) 쓰레오닌(T)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ACT, ACG 및 ACC로 이루어지는 군으로부터 선택; iv) 아르기닌(R)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CGT, CGC 및 CGG로 이루어지는 군으로부터 선택; v) 글리신(G)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GGC, GGT 및 GGA로 이루어지는 군으로부터 선택; vi) 발린(V)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GTA, GTC, GTG 및 GTT로 이루어지는 군으로부터 선택; vii) 세린(S)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 TCA, TCT, TCC 및 AGC로 이루어지는 군으로부터 선택; viii) 알라닌(A)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GCG, GCT, GCC 및 GCA로 이루어지는 군으로부터 선택; 및 ix) 글루타민(Q)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CAG 및 CAA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 변이형 뉴클레오티드는 코리네박테리움 속 미생물 내에 도입되어 발현되는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 변이형 뉴클레오티드가 도입된 코리네박테리움 속 미생물은, 미생물 내에서 발현되는 과당-4-에피머화 효소의 발현량이 증가하거나 타가토스 생산량이 증가할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 효소 발현량의 증가 및 타가토스 생산량의 증가는 상기 변이형 뉴클레오티드가 도입되지 않은 코리네박테리움 속 미생물, 즉, 변이되지 않은 뉴클레오티드가 도입된 코리네박테리움 속 미생물 또는 야생형 코리네박테리움 속 미생물에 비해 증가한 것일 수 있다.
일반적으로, 각 미생물마다 아미노산을 코딩하는 염기서열이 존재하며, 일 예로 코스모토가 속 미생물 유래 야생형 단백질은 서열번호 1의 염기서열이 서열번호 2의 아미노산 서열로 번역된다.
이에, 본 출원에서는 코스모토가 속 미생물 유래 야생형 단백질을 코딩하는 유전자를 코리네박테리움 속 미생물 내에서 번역이 적합하게 이루어지도록 변이하였다. 상기 변이는, 예를 들면, 페닐알라닌(F)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 TTT가 TTC로의 변이 또는 TTC가 TTT로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 류신(L)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 TTG가 CTC로의 변이, CTT가 CTC로의 변이, TTG가 CTG로의 변이, CTT가 CTG로의 변이, CTA가 CTG로의 변이, TTG가 CTT로의 변이, CTC가 CTT로의 변이, TTA가 CTT로의 변이, CTT가 TTG로의 변이, CTG가 TTG로의 변이, CTC가 TTG로의 변이, CCT가 TTG로의 변이 또는 TTA가 TTG로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 이소류신(I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 ATT가 ATC로의 변이, ATA가 ATC로의 변이, ATC가 ATT로의 변이 또는 ATA가 ATT로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 발린(V)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 GTT가 GTA로의 변이, GTC가 GTA로의 변이, GTT가 GTC로의 변이, GTA가 GTC로의 변이, GTA가 GTG로의 변이, GTT가 GTG로의 변이 또는 GTA가 GTT로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 세린(S)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 AGC가 TCA로의 변이, TCT가 TCA로의 변이, AGC가 TCT로의 변이, AGC가 TCC로의 변이, AGT가 TCC로의 변이, TCA가 TCC로의 변이, TCT가 TCC로의 변이, TCA가 AGC로의 변이 또는 TCG가 AGC로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 티로신(Y)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 TAT가 TAC로의 변이 또는 TAC가 TAT로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 히스티딘(H)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 CAT가 CAC로의 변이 또는 CAC가 CAT로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 글루타민(Q)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 CAA가 CAG로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 아스파라긴(N)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 AAT가 AAC로의 변이 또는 AAC가 AAT로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 리신(K)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 AAG가 AAA로의 변이 또는 AAA가 AAG로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 아스파르트산(D)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 GAT가 GAC로의 변이 또는 GAC가 GAT로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 글루탐산(E)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 GAA가 GAG로의 변이 또는 GAG가 GAA로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 시스테인(C)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 TGC가 TGT로의 변이 또는 TGT가 TGC로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 아르기닌(R)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 AGA가 CGT로의 변이, AGG가 CGT로의 변이, CGA가 CGT로의 변이, AGA가 CGC로의 변이, CGA가 CGC로의 변이, CGG가 CGC로의 변이, CGT가 CGC로의 변이, AGA가 CGG로의 변이, CGA가 CGG로의 변이 또는 CGT가 CGG로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 글리신(G)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 GGA가 GGC로의 변이, GGG가 GGC로의 변이, GGT가 GGC로의 변이, GGA가 GGT로의 변이, GGC가 GGT로의 변이, GGG가 GGT로의 변이, GGC가 GGA로의 변이, GGG가 GGA로의 변이 또는 GGT가 GGA로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 프롤린(P)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 CCA가 CCC로의 변이, CCG가 CCC로의 변이, CCT가 CCC로의 변이, CCA가 CCT로의 변이, CCC가 CCT로의 변이, CCG가 CCT로의 변이, CCC가 CCG로의 변이, CCG가 CCA로의 변이 또는 CCT가 CCA로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 쓰레오닌(T)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 ACA가 ACT로의 변이, ACA가 ACG로의 변이, ACT가 ACC로의 변이 또는 ACA가 ACC로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택; 알라닌(A)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 GCA가 GCT로의 변이, GCC가 GCT로의 변이, GCG가 GCT로의 변이, GCG가 GCC로의 변이, GCA가 GCC로의 변이, GCT가 GCC로의 변이, GCC가 GCA로의 변이, GCG가 GCA로의 변이 또는 GCT가 GCA로의 변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다.
본 출원에서 용어 "변이형 폴리뉴클레오티드"는 폴리뉴클레오티드를 구성하는 어느 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환되어 변이된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 변이형 폴리뉴클레오티드는 변이 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 변이 효소 등의 용어와 혼용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "과당-4-에피머화 효소"는 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 과당을 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성을 갖는 효소이다. 본 출원의 목적상 과당을 기질로 하여 타가토스를 생산할 수 있다면 제한없이 포함될 수 있으며, 'D-과당 C4-에피머화 효소'와 혼용되어 사용될 수 있다. 일례로 공지의 데이터 베이스인 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에서 EC 4.1.2.40 인 타가토스 이인산 알돌레이즈 또는 타가토스-이인산 알돌레이즈 class II 악세서리 단백질(Tagatose-bisphosphate aldolase or tagatose- bisphosphate class II accessory protein)이 과당을 기질로 타가토스로 전환하는 활성을 가진다면 과당-4-에피머화 효소로 포함될 수 있다. 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 기존에 하기 [반응식 1]과 같이 D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 기질로 하여 글리세론 포스페이트(glycerone phosphate)와 D-글리세랄데하이드 3-포스페이트(D-glyceraldehyde 3-phosphate)를 생산하는 효소로 공지되어 있다.
[반응식 1]
D-타가토스 1,6-이인산 <=> 글리세론 포스페이트 + D-글리세랄데하이드 3-포스페이트
일 예로 타가토스-6-인산 키나아제 (Tagatose 6 phosphate kinase; EC 2.7.1.144)가 과당을 기질로 타가토스로 전환하는 활성을 가진다면 과당-4-에피머화 효소로 포함될 수 있다. 상기 타가토스-6-인산 키나아제는 기존에 하기 [반응식 2]와 같이 ATP와 D-타가토스 6-인산(D-tagatose 6-phosphate)를 기질로 하여 ADP와 D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 생산하는 효소로 공지되어 있다.
[반응식 2]
ATP + D-타가토스 6-인산 <=> ADP + D-타가토스 1,6-이인산
상기 과당-4-에피머화 효소의 활성은 기질인 과당으로부터 타가토스로의 전환율(전환율=타가토스 중량/초기 과당 중량 *100)이 0.01% 이상, 구체적으로 0.1% 이상, 더욱 구체적으로 0.3% 이상인 것일 수 있다. 보다 구체적으로 전환율은 0.01% 내지 100%의 범위, 0.1% 내지 50%의 범위일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 과당-4-에피머화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 1은 과당-4-에피머화 효소를 코딩하는 염기서열로, 상기 서열번호 1의 염기서열은 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 1에 상응하는 효능을 나타내는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드도 본 출원의 서열번호 1의 염기서열의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드', '특정 서열번호로 기재된 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, '서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드’는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드'에 속할 수 있음은 자명하다.
본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 2은 과당-4-에피머화 효소를 코딩하는 아미노산 서열로, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 2에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드도 본 출원의 서열번호 2의 아미노산 서열의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원의 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 변이 효소는 상기 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소의 아미노산 서열에서 어느 하나 이상의 아미노산이 치환되고, 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 아미노산 치환은 구체적으로 1개 내지 20개, 1개 내지 15개, 1개 내지 12개, 1개 내지 10개, 1개 내지 9개, 또는 1개 내지 7개의 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 일례로, a) 97 번 위치에 상응하는 아미노산이 티로신(Y)으로 치환, b) 124번 위치에 상응하는 아미노산이 트립토판(W)으로 치환 및 c) 367번 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V)으로 치환된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 치환을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "변이 효소"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열(the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다. 변이 효소는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)과 상이하다. 이러한 변이 효소는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이 효소의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이 효소는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이 효소를 포함할 수 있다. 다른 변이 효소는 성숙 단백질 (mature protein) 의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이 효소를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이 효소"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이형 폴리펩티드, 변이, 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 목적상, 상기 변이 효소는 천연의 야생형 또는 비변형 단백질 대비 변이된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이 효소는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 상기 비극성 아미노산 중 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다.
또한, 변이 효소는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
상기 '다른 아미노산으로 치환'은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 즉, 서열번호 2의 아미노산 서열의 97번 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴(N)이 아스파라긴 이외의 다른 아미노산 잔기로, 124번 위치에 상응하는 아미노산인 쓰레오닌(T)이 쓰레오닌 이외의 다른 아미노산 잔기로 또는 367번 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴(N)이 아스파라긴 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이라면 제한되지 않는다. 한편, 본 출원에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.
상기 변이 효소는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 97, 124 또는 367번 위치에 상응하는 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 또는 상기 변이 효소는 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는, 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된, 변이 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 변이 효소는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 a) 97 번 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환, b) 124번 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환 및 c) 367번 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 치환을 포함하는 변이 효소일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 변이 효소는 a) 97 번 위치에 상응하는 아미노산이 티로신(Y)으로 치환, b) 124번 위치에 상응하는 아미노산이 트립토판(W)으로 치환 및 c) 367번 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V)으로 치환되는 것일 수 있다.
본 출원에서 제공하는 과당-4-에피머화 변이 효소는, 상기에서 설명한 과당-4-에피머화능을 갖는 단백질 중 특이적 위치의 아미노산이 치환되어, 과당-4-에피머화능을 갖거나 과당-4-에피머화능이 변이 전 단백질 대비 활성 및/또는 안정성이 증가된 변이 효소를 의미할 수 있다.
상기 변이 효소는 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 변이 효소는 서열번호 2의 97, 124 또는 367번 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로의 치환을 포함하고, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상, 100% 의 서열 상동성을 가지며, 과당-4-에피머화 활성을 가지는 것일 수 있다.
또한, 상기 변이 효소는 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에서, 97, 124 또는 367번 위치에 상응하는 아미노산 중 선택된 하나 이상의 아미노산은 고정되고, 이와 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 출원의 변이 효소는 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 97, 124 또는 367번 위치에 상응하는 아미노산 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 과당-4-에피머화 효소를 코딩하는 서열번호 1의 염기서열 또는 과당-4-에피머화 효소의 아미노산 서열에서 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 과당-4-에피머화 변이 효소를 코딩하는 염기서열에서, 단일 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 어느 하나 이상 변이된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 변이는 i) 류신(L)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CTC, CTG, CTT 및 TTG로 이루어지는 군으로부터 선택; ii) 이소류신(I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ATC 및 ATT로 이루어지는 군으로부터 선택; iii) 발린(V)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GTA, GTC, GTG 및 GTT로 이루어지는 군으로부터 선택; iv) 세린(S)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 TCA, TCT, TCC 및 AGC로 이루어지는 군으로부터 선택; v) 쓰레오닌(T)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ACT, ACG 및 ACC로 이루어지는 군으로부터 선택; vi) 알라닌(A)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GCT, GCC 및 GCA로 이루어지는 군으로부터 선택; vii) 글루타민(Q)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CAG로 선택; viii) 아르기닌(R)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CGT, CGC 및 CGG로 이루어지는 군으로부터 선택; 및 ix) 글리신(G)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GGC, GGT 및 GGA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리뉴클레오티드 변이는 과당-4-에피머화 효소를 코딩하는 아미노산의 서열에 변경 없이, 코돈(Codon)만이 변경되는 범위 내에서 이루어지는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로, 상기 서열번호 1의 염기서열에서 i) 6, 12, 36, 47, 82, 89, 94, 126, 128, 134, 145, 156, 157, 159, 172, 209, 219, 253, 278, 289, 295, 299, 306, 313, 320, 333, 352, 359, 362, 368, 378, 382, 389, 391, 407, 408, 415, 422 및 424번째 중 어느 하나 이상의 류신(L)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CTC, CTG, CTT 및 TTG로 이루어지는 군으로부터 선택; ii) 9, 17, 32, 48, 76, 80, 87, 88, 112, 115, 150, 178, 195, 227, 242, 257, 263, 288, 309, 379, 387, 392, 403, 413, 416 및 420번째 중 어느 하나 이상의 이소류신(I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ATC 및 ATT로 이루어지는 군으로부터 선택; iii) 34, 35, 44, 45, 51, 62, 65, 154, 180, 198, 206, 210, 254, 270, 274, 296, 317, 373, 380, 384, 390, 421 및 431번째 중 어느 하나 이상의 쓰레오닌(T)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ACT, ACG 및 ACC로 이루어지는 군으로부터 선택; iv) 29, 70, 109, 116, 133, 153, 163, 173, 205, 225, 247, 249, 251, 300, 330, 348, 351, 354, 361, 363, 372, 404, 409 및 419번째 중 어느 하나 이상의 아르기닌(R)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CGT, CGC 및 CGG로 이루어지는 군으로부터 선택; v) 16, 20, 43, 59, 60, 63, 81, 90, 91, 95, 101, 122, 139, 170, 179, 186, 187, 192, 218, 224, 234, 238, 267, 285, 292, 319, 345 및 406번째 중 어느 하나 이상의 글리신(G)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GGC, GGT 및 GGA로 이루어지는 군으로부터 선택; vi) 10, 21, 24, 31, 46, 55, 73, 149, 175, 177, 182, 197, 200, 207, 226, 229, 230, 231, 235, 264, 282, 286, 291, 325, 327, 328, 371, 375 및 423번째 발린(V)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GTA, GTC, GTG 및 GTT로 이루어지는 군으로부터 선택; vii) 11, 23, 26, 75, 104, 131, 168, 171, 194, 199, 269, 307, 308, 322, 357, 393 및 414번째 중 어느 하나 이상의 세린(S)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 TCA, TCT, TCC 및 AGC로 이루어지는 군으로부터 선택; viii) 27, 39, 50, 67, 77, 107, 111, 119, 121, 130, 135, 151, 155, 161, 164, 169, 188, 213, 222, 228, 250, 256, 275, 277, 287, 294, 298, 302, 305, 331, 353, 374 및 430번째 중 어느 하나 이상의 알라닌(A)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GCG, GCT, GCC 및 GCA로 이루어지는 군으로부터 선택; ix) 7, 13, 15, 54, 57, 102, 106, 189, 201, 232 및 273번째 중 어느 하나 이상의 글루타민(Q)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CAG 및 CAA로 이루어지는 군으로부터 선택되어 변이된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 효소를 이루는 아미노산 서열에서 쓰레오닌(T), 아스팔트산(D), 세린(S) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산이 두 개 연속으로 동일한 아미노산으로 배열될 경우, 상기 동일한 아미노산 중 첫 번째 아미노산과 두 번째 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일하지 않는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 효소를 이루는 아미노산 서열에서 프롤린(P), 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산이 세 개 이상 동일한 아미노산으로 연속으로 배열될 경우, 상기 동일한 아미노산을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 두 개의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열에서 a) 97 번 위치에 상응하는 아미노산이 티로신(Y)으로 치환, b) 124번 위치에 상응하는 아미노산이 트립토판(W)으로 치환 및 c) 367번 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V)으로 치환된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 치환을 포함하는, 과당-4-에피머화 변이 효소는 상기 97 번 위치의 티로신(Y)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 TAC, 상기 124번 위치의 트립토판(W)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 TGG, 상기 367번 위치의 발린(V)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 GTT일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 변이형 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 3의 염기서열은 과당-4-에피머화 효소를 이루는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하고, 서열번호 4의 염기서열은 과당-4-에피머화 변이 효소를 이루는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하며, 서열번호 6의 염기서열은 과당-4-에피머화 변이 효소를 이루는 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 서열번호 4 및 서열번호 6의 염기서열은, 서열번호 3의 염기서열이 코딩하는 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소의 아미노산 서열에서 a) 97 번 위치에 상응하는 아미노산이 티로신(Y)으로 치환, b) 124번 위치에 상응하는 아미노산이 트립토판(W)으로 치환 및 c) 367번 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V)으로 치환된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어지도록 적절한 염기로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 적절한 염기로의 치환은 전술한 바와 같이, 상기 97 번 위치의 티로신(Y)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 TAC, 상기 124번 위치의 트립토판(W)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 TGG, 상기 367번 위치의 발린(V)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 GTT로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 3의 염기서열이 코딩하는 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소의 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 번역될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서의 변이형 폴리뉴클레오티드는 비록 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 6로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 갖는 것이라고 정의하였으나, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 6의 염기서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적인 예를 들어, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 6의 염기서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 변이형 폴리뉴클레오티드에 상응하는 효능을 나타내는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드도 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 과당 4-에피머화 효소의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 70% 이상, 80% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다.
본 출원에서 용어 "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) 이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들면, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
상기 변이형 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
상기 벡터는 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 형태일 수 있다.
본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pHCP(대한민국 공개특허 제10-2018-0092110호), pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는, 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소; 및 이의 변이 효소; 중 어느 하나를 발현하는 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물을 제공하는 것이다.
상기 변이형 폴리뉴클레오티드, 벡터, 과당-4-에피머화 효소 및 이의 변이 효소는 전술한 바와 같다.
본 출원에서, 용어 "코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소; 및 이의 변이 효소; 중 어느 하나를 발현하는 미생물"이란, 자연적으로 약한 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이 효소 생산능을 가지고 있는 미생물, 혹은 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이 효소 생산능이 없는 모균주에 상기 효소 또는 이의 변이 효소 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 본 출원의 목적상, 구체적으로 상기 미생물은 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이 효소를 발현하는 미생물로서, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드는 i) 류신(L)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CTC, CTG, CTT 및 TTG로 이루어지는 군으로부터 선택; ii) 이소류신(I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ATC 및 ATT로 이루어지는 군으로부터 선택; iii) 쓰레오닌(T)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ACT, ACG 및 ACC로 이루어지는 군으로부터 선택; iv) 아르기닌(R)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CGT, CGC 및 CGG로 이루어지는 군으로부터 선택; v) 글리신(G)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GGC, GGT 및 GGA로 이루어지는 군으로부터 선택; vi) 발린(V)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GTA, GTC, GTG 및 GTT로 이루어지는 군으로부터 선택; vii) 세린(S)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 TCA, TCT, TCC 및 AGC로 이루어지는 군으로부터 선택; viii) 알라닌(A)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GCG, GCT, GCC 및 GCA로 이루어지는 군으로부터 선택; 및 ix) 글루타민(Q)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CAG 및 CAA로 이루어지는 군으로부터 선택 되는 변이를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물은, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내로 도입하는 방법을 이용하여 제작한 재조합 미생물일 수 있다. 상기 벡터를 형질전환시키는 방법은 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함될 수 있으며, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAEdextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 및 열 충격법 등이 포함될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다.
형질전환된 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 폴리뉴클레오티드로써 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 재조합 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 출원에서, 용어 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 "발현되도록/되는"은 목적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 미생물 내에 도입되거나, 미생물 내에서 발현되도록 변형된 상태를 의미하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 미생물 내 존재하는 단백질인 경우 내재적 또는 변형 전에 비하여 그 활성이 강화된 상태를 의미한다.
구체적으로, "폴리펩티드(또는 단백질)의 도입"은, 목적 폴리펩티드의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것 또는 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 폴리펩티드의 활성을 나타내게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다. 또한, "활성의 강화"는 미생물이 가진 특정 폴리펩티드의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 말한다.
구체적으로, 본 출원의 활성 강화는
1) 상기 단백질 또는 이의 변이 효소를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가;
2) 상기 단백질 또는 이의 변이 효소를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열에 변이 도입;
3) 상기 단백질 또는 이의 변이 효소를 암호화하는 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체;
4) 염색체상의 자연형 단백질을 코딩하는 유전자를 상기 변이형 폴리뉴클레오티드로 대체;
5) 상기 단백질 또는 이의 변이 효소의 활성이 강화되도록 상기 단백질 또는 이의 변이 효소를 암호화하는 유전자에 변이를 추가적으로 도입;
6) 미생물에 단백질 또는 이의 변이 효소를 도입; 또는
7) 상기 1) 내지 6) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서 유전자의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되는 것일 수 있다. 또는, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 도입되는 것일 수 있다. 상기 변이형 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
다음으로, 변이형 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 변이형 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 프로모터가 연결될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1783170호), O2 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1632642), tkt 프로모터 및 yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
아울러, 염색체상의 변이형 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
이와 같은 목적 폴리펩티드(또는 단백질)의 도입 및 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 발현, 활성 또는 농도가 야생형이나 비변형 미생물 균주에서의 폴리펩티드의 발현, 활성 또는 농도를 기준으로 그보다 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어 "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드 및 목적 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하지 않는 미생물, 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드 및 목적 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 미생물을 의미한다.
본 출원의 목적상, 상기 목적 폴리펩티드는 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 미생물은 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하여 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이 효소를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속일 수 있고, 예를 들면, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스Cxorynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens) 등일 수 있으며, 보다 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 목적상, 상기 재조합 미생물은 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이 효소 생산이 야생형이나 비변형 미생물 균주보다 증대된 미생물일 수 있다.
본 출원의 미생물은 상기 핵산 또는 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이 효소를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이 효소의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 변이형 폴리뉴클레오티드, 벡터, 과당-4-에피머화 효소, 이의 변이 효소 및 미생물은 전술한 바와 같다.
본 발명의 목적상, 상기 코리네박테리움 속 미생물은, 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소; 및 이의 변이 효소; 중 어느 하나를 발현하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
배지의 온도는 20℃ 내지 50℃, 구체적으로는 30℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10시간 내지 100시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 배양에 의하여 생산된 과당-4-에피머화 효소 또는 과당-4-에피머화 변이 효소는 배지 중으로 배출되거나 미처 배출되지 못하고 세포 내에 잔류할 수 있다.
상기 생산 방법은 배양된 배지 또는 미생물에서 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이 효소를 회수(recover)하는 단계를 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이 효소를 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 효소를 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 효소를 회수할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 효소는 정제된 형태 또는 효소를 함유한 미생물 발효액일 수 있다(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물의, 타가토스 생산 용도를 제공하는 것이다.
상기 변이형 폴리뉴클레오티드, 벡터, 과당-4-에피머화 효소, 이의 변이 효소 및 미생물은 전술한 바와 같다.
본 발명의 목적상, 상기 코리네박테리움 속 미생물은, 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소; 및 이의 변이 효소; 중 어느 하나를 발현하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 타가토스 생산용 조성물은 과당을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 당해 타가토스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 금속이온 또는 금속염을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 금속이온 또는 금속염의 금속은 2가 양이온을 포함하는 금속일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 금속은 니켈(Ni), 철(Fe), 코발트(Co), 마그네슘(Mg) 또는 망간(Mn)일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 금속염은 MgSO4, FeSO4, NiSO4, NiCl2, MgCl2, CoSO4, MnCl2 또는 MnSO4일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 과당과 접촉시키는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 변이형 폴리뉴클레오티드, 벡터, 과당-4-에피머화 효소, 이의 변이 효소 및 미생물은 전술한 바와 같다.
본 발명의 목적상, 상기 코리네박테리움 속 미생물은, 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소; 및 이의 변이 효소; 중 어느 하나를 발현하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 코리네박테리움 속 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 과당과 접촉시키는 단계는, 상기 코리네박테리움 속 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 과당과 접촉시켜, 과당을 타가토스로 전환시키는 단계인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 과당-4-에피머화 변이 효소는 과당-4-에피머화 효소로 사용되어 과당으로부터 타가토스를 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 pH 9.0 조건에서, 30℃ 내지 80℃ 온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 6.0 내지 pH 9.0 조건 또는 pH 7.0 내지 pH 9.0 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 35℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 80℃, 45℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 80℃, 30℃ 내지 70℃, 35℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 70℃, 45℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 65℃, 35℃ 내지 65℃, 40℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 65℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 35℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 60℃ 또는 55℃ 내지 60℃ 온도 조건에서 수행할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 0.5시간 내지 36시간 동안, 0.5시간 내지 24시간 동안, 0.5시간 내지 12시간 동안, 0.5시간 내지 6시간 동안, 1시간 내지 48시간 동안, 1시간 내지 36시간 동안, 1시간 내지 24시간 동안, 1시간 내지 12시간 동안, 1시간 내지 6시간 동안, 3시간 내지 48시간 동안, 3시간 내지 36시간 동안, 3시간 내지 24시간 동안, 3시간 내지 12시간 동안, 3시간 내지 6시간 동안, 6시간 내지 48시간 동안, 6시간 내지 36시간 동안, 6시간 내지 24시간 동안, 6시간 내지 12시간 동안, 12시간 내지 48시간 동안, 12시간 내지 36시간 동안, 12시간 내지 24시간 동안, 18시간 내지 48시간 동안, 18시간 내지 36시간 동안 또는18시간 내지 30시간 동안 수행할 수 있다.
또한, 본 출원의 접촉은 금속이온 또는 금속염 존재하에서 수행할 수 있다. 사용될 수 있는 금속이온 또는 금속염은 전술한 양태에서와 같다.
본 출원의 제조방법은 제조된 타가토스를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및/또는 정제는 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며. 비제한적인 예로, 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 이온교환 크로마토그래피 및 분별 결정 등을 사용할 수 있다. 상기 정제는 하나의 방법만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 상기 분리 및/또는 정제하는 단계 이전 또는 이후에 탈색 및/또는 탈염을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 보다 품질이 우수한 타가토스를 얻을 수 있다.
다른 예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 타가토스로 전환하는 단계, 분리 및/또는 정제하는 단계, 또는 탈색 및/또는 탈염하는 단계 이후 타가토스를 결정화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 결정화는 통상적으로 사용하는 결정화 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 냉각결정화 방법을 사용하여 결정화를 수행할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조 방법은 상기 결정화하는 단계 이전에 타가토스를 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 농축은 결정화 효율을 높일 수 있다.
다른 예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 분리 및/또는 정제하는 단계 이후 미반응된 과당을 본 출원의 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시키는 단계, 본 출원의 결정화하는 단계 이후 결정이 분리된 모액을 상기 분리 및/또는 정제 단계에 재사용하는 단계, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 변이형 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소 발현량 검정
한국 공개 10-2018-0111678A에서 공지된 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소를 코리네박테리움 균주(C. glutamicum)에서 유전자 발현 효율 증대시키기 위해 변이형 폴리뉴클레오티드인 과당-4-에피머화 효소 유전자 (서열번호 3)을 제작하였다. 과당-4-에피머화 효소 유전자 제작 시 분리를 위해서 6X His-tag의 서열을 추가하여 제조하였다.
플라스미드는 고복제수를 위해 orfA2(parB)의 21번째 위치를 아데닌(A)으로 변이한 pHCP 플라스미드(한국 공개 10-2018-0092110A)를 이용하였다. 본 출원에서는 기존 pHCP보다 높은 복제수의 플라스미드를 얻고자 하였고, 이를 위하여 pHCP의 ctRNA 부분인 98bp의 서열을 무작위로 변경하여 스크리닝한 결과, 최종적으로 ctRNA 부분의 22번째 뉴클레오티드가 C(시토신)으로 치환된 폴리뉴클레오티드, 79번째 뉴클레오티드가 C(시토신)으로 치환된 폴리뉴클레오티드를 확인하였고 이를 포함하는 높은 복제수의 플라스미드를 pHCP7 벡터로 명명하였고(서열번호 8), 해당 벡터를 이용하여 과당-4-에피머화 효소 유전자 서열이 포함된 플라스미드를 제조하였다.
pHCP7 벡터에 상기 변이된 과당-4-에피머화 효소 유전자를 각각 삽입하고 이를 코리네박테리움 균주(C. glutamicum ATCC13032)에 형질전환하였다. 형질전환된 코리네박테리움 균주는 카나마이신(kanamycin, Km) 25 μg/mL를 포함하는 BHI 배지 10mL에서 30℃, 200 rpm 교반 하에서 24 시간 동안 배양하였다. 이후, 배양된 배지를 Km 25 μg/mL를 포함하는 새 BHI 배지 50mL에 대하여 1/100 부피 비율로 넣고 30℃, 200 rpm 교반 하에서 24 시간 동안 배양하였다.
배양된 균주의 O.D600nm를 4로 맞추어 회수하고 300 μL PBS에 풀어 얼음이 담긴 통 안에서 초음파분쇄(sonication; 총 7min at 50% pulse, 20% amplitude)하였다. 파쇄된 균주를 원심분리하여 얻어진 상층액을 5x 샘플 버퍼(sample buffer)와 혼합하고 100℃에서 5분 동안 가열하였다. 12% SDS-PAGE에 로딩하고 후 쿠마씨 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue)를 이용한 염색 용액(staining solution)과 탈염색 용액(destaining solution)을 이용하여 단백질을 확인하였다. 단백질의 발현양 분석을 위하여 겔 분석 프로그램(gel analyzer program)을 이용하여 총 단백질 중 과당-4-에피머화 효소의 발현양을 확인하였다.
그 결과, 도 1과 같이 변이형 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 과당-4-에피머화 효소의 발현양이 과당-4-에피머화 효소 야생형(변이 전) 폴리뉴클레오티드(wild type, WT)에 비하여 약 6% 이상 증가한 것을 확인하였다.
실시예 2: 변이형 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 과당-4-에피머화 효소의 타가토스 전환율 검정
실시예 1에서 배양한 코리네박테리움 균주 배양액 45ml을 4℃에서 10분 동안 3,500rpm으로 원심분리한 후 10mL Tris-HCl pH8.0 완충액을 이용하여 세척하였다. 이후 위와 동일한 조건으로 원심분리하고 무게를 측정하였다. 회수된 균주의 최종 반응 부피의 20% 무게에 해당하는 양을 2mL 튜브에 분주하고, 60℃에서 30분 동안 열 전처리하였다. 타가토스 전환 반응을 위해 첨가할 CoSO4 또는 NiSO4도 함께 열 전처리하였다. 균주와 기질(30% 과당) 및 3mM의 CoSO4 또는 NiSO4를 포함한 50mM tris-HCl(pH 8.0)을 혼합하고 60℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 시료를 4℃에서 10분 동안 13,000rpm으로 원심분리하여 상층액을 회수하고 HPLC로 분석하였다. HPLC는 5mM H2SO4 용매를 이용한 Aminex HPX-87H 컬럼을 이용하였으며, 생성된 타가토스 양을 분석하였다.
그 결과, 도 2와 같이 변이형 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 과당-4-에피머화 효소의 타가토스 전환율이 약 22%로 WT(#7_KO(KNF4E))에 비해 7% 우수함을 확인하였다.
실시예 3: 변이형 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 과당-4-에피머화 변이 효소의 발현량 검정
실시예 1의 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소에서 일부 아미노산 서열이 변이된 경우에도 발현량이 상승하는지 확인하고자 실험을 진행하였다. 변이형 폴리뉴클레오티드인 과당-4-에피머화 효소 유전자(서열번호 3)에서 아미노산을 변이시킨 변이 효소 2종(N97Y, T124W, N367V 변이: 서열번호 4, T124W 변이: 서열번호 6)의 유전자 서열을 각각 제작하였다. 변이 효소(서열번호 4)를 포함하는 균주는 Corynebacterium glutamicum CF01-0014으로 명명하고, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2019년 10월 18일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12610P 를 부여받았다.
pHCP7 벡터에 상기 변이된 과당-4-에피머화 효소 유전자를 각각 삽입하고 이를 코리네박테리움 균주에 도입한 후, 실시예 1의 방법으로 균주 내에서 변이 효소 2종의 발현량을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
그 결과, 도 3과 같이 변이형 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 과당-4-에피머화 변이 효소는 N97Y, T124W, N367V 변이 효소(lane 4)의 발현양이 WT(lane 2)에 비하여 약 8%, T124W 변이 효소(lane 5)의 발현양이 과당-4-에피머화 효소 야생형(변이 전) 폴리뉴클레오티드(wild type, WT)에 비하여 약 12% 이상 증가한 것을 확인하였으며, 변이형 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 과당-4-에피머화 효소(lane 3)에 비해서는 유사함을 확인하였다.
실시예 4: 변이형 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 과당-4-에피머화 변이 효소의 타가토스 전환율 검정
실시예 3의 변이 효소 2종에 대하여 실시예 2의 방법으로 타가토스 전환율을 확인하였다.
그 결과, 도 4와 같이 N97Y, T124W, N367V 변이 효소(3 aa mutation)의 전환율이 약 32%로 WT과 비교하여 19% 증가한 것을 확인하였다. T124W 변이 효소의 전환율도 27.8%로 우수하였다.
비교예 1: 동일한 뉴클레오티드 변이를 적용한 써모토가 네아폴리타나 유래의 과당-4-에피머화 효소의 발현율 및 타가토스 전환율 검정
한국 공개 10-2017-0015250 A에서 공지된 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 유래의 과당-4-에피머화 효소(헥수론산 C4-에피머화 효소, 서열번호 9)의 변이 효소(서열번호 10)를 코딩하는 염기서열(서열번호 9)에 실시예 1과 동일한 뉴클레오티드 변이를 적용한 변이형 폴리뉴클레오티드 variant2 및 variant1(서열번호 12 및 13)을 제작하고, 이를 pHCP 벡터에 삽입하고 코리네박테리움 균주에 도입한 후 발현율 및 타가토스 전환율을 실시예 1 및 실시예 2의 방법으로 확인하였다.
그 결과, 도 5와 같이 변이형 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 과당-4-에피머화 변이 효소(variant1/TN_variant_1, variant2/TN_variant_2, CJ)는 WT에 비해 발현양이 낮았으며, 타가토스 전환율 또한 WT에 비해 낮았다(도 6).
특히, 한국 공개 10-2017-0015250 A에서 과당-4-에피머화 변이 효소는 야생형(변이전) 과당-4-에피머화 효소에 비해 활성이 높으나, 상기 변이 효소의 폴리뉴클레오티드를 변이하는 경우 야생형(변이 전) 과당-4-에피머화 효소에 비해 활성이 낮아지는 것을 확인하여 발현량이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
이에, 본 출원에 따른 뉴클레오티드 변이는 코스모토가 오엘리아 유래의 효소에 유효한 것으로 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2021000799-appb-I000001

Claims (15)

  1. 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소; 또는 이의 변이 효소;를 코딩하는 변이형 폴리뉴클레오티드로서, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드는 하기 i) 내지 v)의 변이를 포함하는 것인, 변이형 폴리뉴클레오티드:
    i) 류신(L)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CTC, CTG, CTT 및 TTG로 이루어지는 군으로부터 선택;
    ii) 이소류신(I)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ATC 및 ATT로 이루어지는 군으로부터 선택;
    iii) 쓰레오닌(T)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ACT, ACG 및 ACC로 이루어지는 군으로부터 선택;
    iv) 아르기닌(R)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CGT, CGC 및 CGG로 이루어지는 군으로부터 선택; 및
    v) 글리신(G)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GGC, GGT 및 GGA로 이루어지는 군으로부터 선택.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소를 이루는 아미노산 서열에서 쓰레오닌(T), 아스팔트산(D), 세린(S) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산이 두 개 연속으로 동일한 아미노산으로 배열될 경우, 상기 동일한 아미노산 중 첫 번째 아미노산과 두 번째 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일하지 않는 것인, 변이형 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 효소를 이루는 아미노산 서열에서 프롤린(P), 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산이 세 개 이상 동일한 아미노산으로 연속으로 배열될 경우, 상기 동일한 아미노산을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 두 개의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 것인, 변이형 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1을 포함하는 것인, 변이형 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 변이 효소는 상기 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소의 아미노산 서열에서 어느 하나 이상의 아미노산이 치환되고, 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 것인, 변이형 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 변이 효소는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 a) 97 번 위치에 상응하는 아미노산이 티로신(Y)으로 치환, b) 124번 위치에 상응하는 아미노산이 트립토판(W)으로 치환 및 c) 367번 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V)으로 치환된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 치환을 포함하는 것인, 변이형 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 변이 효소는 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 변이형 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열은 서열번호 4의 염기서열로 코딩되고, 서열번호 7의 아미노산 서열은 서열번호 6의 염기서열로 코딩되는 것인, 변이형 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 갖는 것인, 변이형 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는, 코스모토가 오엘리아 유래의 과당-4-에피머화 효소; 및 이의 변이 효소; 중 어느 하나를 발현하는, 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 과당-4-에피머화 효소 또는 이의 변이 효소의 생산 방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조성물은 과당을 추가로 포함하는 것인, 타가토스 생산용 조성물.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 변이형 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 과당과 접촉시키는 단계를 포함하는, 타가토스 제조방법.
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