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WO2020054572A1 - ヘモグロビン類測定用試薬及びヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents

ヘモグロビン類測定用試薬及びヘモグロビン類の測定方法 Download PDF

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Publication number
WO2020054572A1
WO2020054572A1 PCT/JP2019/034972 JP2019034972W WO2020054572A1 WO 2020054572 A1 WO2020054572 A1 WO 2020054572A1 JP 2019034972 W JP2019034972 W JP 2019034972W WO 2020054572 A1 WO2020054572 A1 WO 2020054572A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
component
reagent
polyoxyethylene
hemoglobin
less
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/034972
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
和之 大石
博暁 太平
智雅 井上
凌 竹本
Original Assignee
積水メディカル株式会社
徳山積水工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=69777593&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2020054572(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 積水メディカル株式会社, 徳山積水工業株式会社 filed Critical 積水メディカル株式会社
Priority to EP19860272.4A priority Critical patent/EP3851850A4/en
Priority to US17/256,919 priority patent/US20210278422A1/en
Priority to CN201980041169.2A priority patent/CN112334767B/zh
Priority to JP2019566860A priority patent/JP6651066B1/ja
Publication of WO2020054572A1 publication Critical patent/WO2020054572A1/ja

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G—PHYSICS
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    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation

Definitions

  • the present invention relates to a reagent for measuring hemoglobins containing a surfactant.
  • the present invention also relates to a method for measuring hemoglobins using the above reagent for measuring hemoglobins.
  • the concentration of hemoglobins has been measured for diagnosis of diabetes, abnormal hemoglobin disease, and the like.
  • hemoglobins such as hemoglobin A1a, hemoglobin A1b, hemoglobin F, hemoglobin A1c, hemoglobin A0 and hemoglobin A2, modified hemoglobins such as acetylated hemoglobin and carbamylated hemoglobin, and abnormal hemoglobins such as hemoglobin S and hemoglobin C.
  • the concentration has been measured.
  • the hemoglobin A1c value is particularly measured.
  • a liquid chromatography method is mainly used as a liquid chromatography method.
  • a hemolytic reagent is added to a sample such as blood, the sample after hemolysis is measured by cation exchange liquid chromatography, and the peak of the obtained chromatogram is subjected to arithmetic processing to obtain the hemoglobin A1c value and the like. Determine the concentration of hemoglobins.
  • a composition containing polyoxyethylene octyl phenyl ether having an average number of added oxyethylene groups of 10 has been used as a hemolytic reagent.
  • Patent Document 1 discloses a method for separating hemoglobin A1c in which hemoglobin A1c in a human blood sample is separated from other glycosylated and non-glycosylated hemoglobin and the Schiff base of a precursor of hemoglobin A1c.
  • a hemolytic reagent containing 0.33% by weight of Triton X-100 is used.
  • Patent Document 2 discloses a hemolysis reagent used for hemolyzing a blood sample in a method for measuring hemoglobins by cation exchange liquid chromatography.
  • the hemolytic reagent contains a chaotropic ion.
  • a hemolytic reagent containing 0.1% by weight of Triton X-100 is used.
  • a hemolysis reagent (reagent for measuring hemoglobins) containing polyoxyethylene octylphenyl ether having an average number of moles of added oxyethylene groups of 10 as described in Patent Documents 1 and 2 is excellent in hemolysis performance. Therefore, when a sample such as whole blood is treated with the hemolytic reagent and measured by cation exchange liquid chromatography, a peak of hemoglobins is obtained favorably. In addition, shoulder peaks and peak cracks are less likely to occur in all of the obtained peaks. Therefore, hemoglobins can be measured with high accuracy.
  • the hemolytic reagent containing polyoxyethylene octyl phenyl ether having an average number of added moles of oxyethylene groups of 10 has a small carryover when measured by cation exchange liquid chromatography. Therefore, even when a large number of samples are continuously measured, hemoglobins can be measured with high accuracy.
  • Another object of the present invention is to provide a method for measuring hemoglobins using the above reagent for measuring hemoglobins.
  • a reagent for measuring hemoglobins used for measuring hemoglobins by cation exchange liquid chromatography, comprising a nonionic surfactant or an amphoteric surfactant,
  • the ionic surfactant is Component A1, Component A2, Component A3, Component A4, Component A5, Component A6, Component A7, Component A8, or Component A9 described below.
  • component B1 the following component B2 or the following component B3.
  • Component A1 a polyoxyethylene alkyl ether having an average number of moles of added oxyethylene groups of 8 or more and 20 or less and an alkyl group of 12 or more and 17 or less.
  • Component A2 polyoxyethylene stearyl ether having an average number of added moles of oxyethylene groups of 40 or more and 60 or less
  • Component A3 polyoxyethylene oleyl ether having an average number of moles of added oxyethylene groups of 9 or more and 15 or less
  • Component A4 a polyoxyethylene-sec-alkyl ether having an average number of added moles of oxyethylene groups of 6 to 10 and an alkyl group of 11 to 15 inclusive
  • Component A5 polyoxyethylene tridecyl ether having an average number of moles of added oxyethylene groups of 15
  • Component A6 polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether having an HLB value of 11 or more and 15 or less
  • Component A8 n-octyl- ⁇ -D-glucopyranoside
  • Component B1 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonate
  • Component B2 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonate
  • Component B3 lauryl dimethylamine oxide
  • the reagent contains the nonionic surfactant, and the nonionic surfactant contains the component A1, the component A2, the component A3, and the component A4.
  • the component A1 comprises polyoxyethylene lauryl ether having an average addition mole number of oxyethylene groups of 9, 12, or 19, or an average addition mole number of oxyethylene groups of 13 or 20 is a polyoxyethylene cetyl ether
  • the component A2 is a polyoxyethylene stearyl ether having an average number of moles of oxyethylene groups of 50
  • the component A3 is a polyoxyethylene stearyl ether having an average number of moles of oxyethylene groups of 50.
  • a polyoxyethylene oleyl ether which is 9 or 13, wherein the component A4 is oxyethylene Is a polyoxyethylene-sec-alkyl ether having an average addition mole number of 7 or 9 and an alkyl group having 11 to 15 carbon atoms, and the component A6 has an HLB value of 12.5 or 12.7. Or 14.0 polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether.
  • the non-ionic surfactant comprises the non-ionic surfactant
  • the non-ionic surfactant comprises the component A1 or the component A3, the component A1,
  • the polyoxyethylene alkyl ether having an average number of moles of oxyethylene group of 10 or more and 15 or less and an alkyl group of 12 or more and 17 or less, wherein the component A3 is an average number of moles of oxyethylene group added. Is 10 or more and 15 or less.
  • the component A1 is preferably a polyoxyethylene lauryl ether having an average addition mole number of oxyethylene groups of 12 or an average addition mole number of oxyethylene groups of 13
  • the component A3 is a polyoxyethylene oleyl ether having an average number of added moles of 13 of the oxyethylene group of 13.
  • the reagent contains the nonionic surfactant, and the content of the nonionic surfactant is 0.01% by weight or more and 1.0% by weight or less. It is.
  • the reagent contains the amphoteric surfactant, and the content of the amphoteric surfactant is 0.01% by weight or more and 1.0% by weight or less.
  • the method includes a step of mixing a red blood cell-containing specimen and the above-described reagent for measuring hemoglobins to obtain a mixed liquid, and a step of measuring the mixed liquid by cation exchange liquid chromatography. And a method for measuring hemoglobins.
  • the reagent for measuring hemoglobin according to the present invention is used for measuring hemoglobin by cation exchange liquid chromatography.
  • the reagent for measuring hemoglobins according to the present invention contains a nonionic surfactant or an amphoteric surfactant.
  • the nonionic surfactant is any one of the following components A1 to A9
  • the amphoteric surfactant is any one of the following components B1 to B3. This is the component.
  • Component A1 a polyoxyethylene alkyl ether having an average number of moles of added oxyethylene groups of 8 or more and 20 or less and an alkyl group having 12 or more and 17 or less.
  • Component A2 polyoxyethylene stearyl ether having an average number of added moles of oxyethylene groups of 40 or more and 60 or less.
  • Component A3 a polyoxyethylene oleyl ether having an average number of added moles of oxyethylene groups of 9 or more and 15 or less.
  • Component A4 a polyoxyethylene-sec-alkyl ether having an average number of added moles of oxyethylene groups of 6 or more and 10 or less and an alkyl group of 11 or more and 15 or less.
  • Component A5 polyoxyethylene tridecyl ether having an average number of moles of added oxyethylene groups of 15
  • Component A6 a polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether having an HLB value of 11 or more and 15 or less.
  • Component A7 n-nonanoyl-N-methyl-D-glucamine.
  • Component A8 n-octyl- ⁇ -D-glucopyranoside.
  • Component A9 saponin.
  • Component B1 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonate.
  • Component B2 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonate.
  • Component B3 lauryl dimethylamine oxide. Since the reagent for measuring hemoglobins according to the present invention has the above-described configuration, hemolysis can be favorably performed, and hemoglobins can be measured with high accuracy.
  • FIG. 1 is an example of a chromatogram obtained when measurement is performed by cation exchange liquid chromatography using a reagent for measuring hemoglobins according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is an example of a chromatogram obtained when measurement is performed by cation exchange liquid chromatography using a conventional reagent for measuring hemoglobins.
  • FIGS. 3A and 3B are examples of chromatograms for evaluating the shape of the hemoglobin A0 peak.
  • FIGS. 4A and 4B are examples of chromatograms for evaluating the peak shape of the first fraction.
  • FIGS. 5A to 5C are examples of chromatograms for evaluating the hemoglobin A0 peak height.
  • FIGS. 6A and 6B are diagrams showing the relationship between the storage days, the hemoglobin A1c value, and the amount of change in the hemoglobin A1c value in a mixed solution of a hemoglobin-measuring reagent and whole blood.
  • FIGS. 7 (a) and 7 (b) show changes in the number of storage days, hemoglobin A1c value and hemoglobin A1c value in a mixture of a reagent for measuring hemoglobins and a hemoglobin A1c substance (low concentration) (IRC-L) for measurement control. It is a figure which shows the relationship with quantity.
  • FIGS. 9A and 9B are diagrams showing the column durability of a mixed solution of a reagent for measuring hemoglobins and a hemoglobin A1c substance for measurement management (high concentration) (IRC-H).
  • the reagent for measuring hemoglobin according to the present invention is used for measuring hemoglobin by cation exchange liquid chromatography.
  • the reagent for measuring hemoglobins according to the present invention contains a nonionic surfactant or an amphoteric surfactant.
  • the nonionic surfactant has a polyoxyethylene group having an average number of added moles of 8 to 20 and an alkyl group having 12 to 17 carbon atoms.
  • a polyoxyethylene-sec-alkyl ether having an average addition mole number of 6 to 10 and an alkyl group having 11 to 15 carbon atoms, and a polyoxyethylene having an average addition mole number of oxyethylene group of 15 Tridecyl ether, polyoxy having an HLB value of 11 or more and 15 or less Chi Ren polyoxypropylene alkyl ether, n- nonanoyl -N- methyl -D- glucamine, n- octyl-bet
  • the amphoteric surfactant is 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonate, 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]- 2-hydroxypropanesulfonate or lauryl dimethylamine oxide.
  • polyoxyethylene alkyl ether having an average number of added moles of oxyethylene groups of 8 or more and 20 or less and an alkyl group of 12 or more and 17 or less is referred to as "component A1". There is.
  • component A1 polyoxyethylene alkyl ether having an average number of added moles of oxyethylene groups of 10 or more and 15 or less and an alkyl group of 12 or more and 17 or less referred to as “component A1 ′ ”.
  • polyoxyethylene stearyl ether having an average number of added moles of oxyethylene groups of 40 or more and 60 or less may be referred to as “component A2”.
  • polyoxyethylene oleyl ether having an average number of added moles of oxyethylene groups of 9 or more and 15 or less may be referred to as “component A3”.
  • component A3 “polyoxyethylene oleyl ether having an average number of moles of added oxyethylene groups of 10 or more and 15 or less” may be referred to as “component A3 ′” in this specification.
  • polyoxyethylene-sec-alkyl ether in which the average number of moles of oxyethylene groups added is 6 or more and 10 or less and the alkyl group has 11 or more and 15 or less” is referred to as “component A4”. May be described.
  • polyoxyethylene tridecyl ether having an average number of moles of added oxyethylene groups of 15 may be referred to as “component A5”.
  • polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether having an HLB value of 11 or more and 15 or less may be referred to as “component A6”.
  • n-nonanoyl-N-methyl-D-glucamine may be referred to as “component A7”.
  • n-octyl- ⁇ -D-glucopyranoside may be referred to as “component A8”.
  • saponin may be referred to as “component A9”.
  • component B1 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonate
  • component B2 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonate
  • “lauryldimethylamine oxide” may be described as “component B3”.
  • polyoxyethylene octyl phenyl ether having an average number of added moles of oxyethylene groups of 10 may be referred to as “component X”.
  • the reagent for measuring hemoglobins comprises a nonionic surfactant or an amphoteric surfactant, wherein the nonionic surfactant comprises component A1, component A2, component A3, component A4, component A5, component A6, Component A7, Component A8 or Component A9, or the amphoteric surfactant is Component B1, Component B2 or Component B3.
  • the reagent for measuring hemoglobins according to the present invention has the above-described configuration, so that hemolysis can be performed well and hemoglobins can be measured with high accuracy.
  • the conventional reagent for measuring hemoglobin containing the component X can satisfactorily lyse hemolysis and measure hemoglobin with high accuracy.
  • a reagent for measuring hemoglobin that does not contain component X it is difficult to satisfactorily lyse hemoglobin and measure hemoglobin with high accuracy.
  • the reagent for measuring hemoglobin according to the present invention is provided with the above-described configuration, so that even when component X is not contained, the same level as the reagent for measuring hemoglobin mixed with component X is obtained. And hemoglobins can be measured with equal accuracy.
  • the reagent for measuring hemoglobins according to the present invention can satisfactorily lyse hemolysins, and thus can obtain good hemoglobin peaks when measured by cation exchange liquid chromatography. In addition, shoulder peaks and peak cracks are less likely to occur in all of the obtained peaks. Therefore, hemoglobins can be measured with high accuracy. Further, the reagent for measuring hemoglobins according to the present invention can reduce carryover. Therefore, even when a large number of samples are continuously measured, hemoglobins can be measured with high accuracy.
  • the mixture is stored for a certain period of time (for example, about several days) before the mixture is measured by cation exchange chromatography. May be done.
  • the storage stability of a liquid mixture in which the reagent and the test substance are mixed can be enhanced.
  • the test substance include not only erythrocyte-containing specimens such as blood (for example, blood of a subject), but also hemoglobin-containing specimens that do not contain erythrocytes (for example, hemoglobin standard substances and measurement management hemoglobin substances). Etc.) are also included.
  • the reagent for measuring hemoglobins according to the present invention even when the mixed solution is stored for a certain period of time, the peak shape of hemoglobin hardly changes before and after storage, and the measured value hardly fluctuates.
  • the hemoglobin measurement reagent according to the present invention contains the component A1 ′ or the component A3 ′, the storage stability of the mixed solution in which the hemoglobin measurement reagent and the test substance are mixed is further enhanced. In addition, the storage stability of the reagent for measuring hemoglobins can be improved.
  • the reagent for measuring hemoglobin according to the present invention is used for measuring hemoglobin by cation exchange liquid chromatography.
  • the reagent for measuring hemoglobins is preferably used for measuring hemoglobins by cation exchange high performance liquid chromatography.
  • hemoglobin examples include hemoglobin A1a, hemoglobin A1b, hemoglobin F, hemoglobin A1c, hemoglobin such as hemoglobin A0 and hemoglobin A2, modified hemoglobin such as acetylated hemoglobin and carbamylated hemoglobin, and abnormal hemoglobin S and hemoglobin C and the like. Is mentioned.
  • the reagent for measuring hemoglobins according to the present invention is suitably used for measuring the above hemoglobin A1c value (concentration of hemoglobin A1c).
  • FIG. 1 is an example of a chromatogram obtained when measurement is performed by cation exchange liquid chromatography using the reagent for measuring hemoglobins according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is an example of a chromatogram obtained when measurement is performed by cation exchange liquid chromatography using a conventional reagent for measuring hemoglobin (a conventional reagent for measuring hemoglobin including component X).
  • FIG. 1 and FIG. 2 are examples of chromatograms measured under the measurement conditions measured in Examples described later, for example.
  • reagent for measuring hemoglobins In the reagent for measuring hemoglobins according to the present invention, components that are subject to REACH regulation can be eliminated, so that the effect on the environment is reduced compared to conventional reagents for measuring hemoglobins containing component X. Can increase safety.
  • the reagent for measuring hemoglobins according to the present invention may contain the nonionic surfactant, or may contain the amphoteric surfactant, and may contain the nonionic surfactant and the amphoteric surfactant. And both may be included.
  • Nonionic surfactant It is preferable that the reagent for measuring hemoglobins contains a nonionic surfactant.
  • the nonionic surfactant is any one of the components A1 to A9.
  • As the nonionic surfactant only one of components A1 to A9 may be used, or two or more of them may be used in combination.
  • Component A1 is a polyoxyethylene alkyl ether in which the average number of moles of oxyethylene groups added is 8 to 20 and the alkyl group has 12 to 17 carbon atoms.
  • Component A1 is a component represented by the following formula (1). As the component A1, only one type may be used, or two or more types may be used in combination.
  • R represents an alkyl group having 12 to 17 carbon atoms
  • n represents a number of 8 to 20.
  • the average number of moles of oxyethylene groups in the component A1 is preferably 9 or more, more preferably 10 or more, More preferably, it is 11 or more, preferably 19 or less.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group of the component A1 is preferably It is 17 or less, more preferably 16 or less, and particularly preferably 12 or 16.
  • the component A1 is polyoxyethylene lauryl ether
  • the component A1 is polyoxyethylene cetyl ether.
  • the component A1 is a polyoxyethylene lauryl ether having an average addition mole number of oxyethylene groups of 8 to 20 or a polyoxyethylene cetyl ether having an average addition mole number of oxyethylene groups of 8 to 20. Is particularly preferred.
  • the average number of moles of oxyethylene groups added in the polyoxyethylene lauryl ether is preferably 9 or more, more preferably 10 or more, still more preferably 11 or more, and preferably 19 or more. Or less, more preferably 16 or less, still more preferably 13 or less.
  • the average number of moles of oxyethylene groups added to the polyoxyethylene lauryl ether is preferably 9, 12, or 19, and most preferably 12.
  • the solubility of the surfactant can be further increased, hemolysis can be performed well, and hemoglobins can be measured with higher accuracy.
  • the storage stability of a mixture obtained by mixing the reagent for measuring hemoglobins and the test substance can be further enhanced.
  • the average number of moles of oxyethylene groups in the polyoxyethylene cetyl ether is preferably 10 or more, more preferably 12 or more, preferably 19 or less, more preferably 16 or less. Or less, more preferably 14 or less.
  • the average number of moles of oxyethylene groups added in the polyoxyethylene cetyl ether is preferably 13 or 20, and most preferably 13.
  • the solubility of the surfactant can be further increased, hemolysis can be performed well, and hemoglobins can be measured with higher accuracy.
  • the storage stability of a mixture obtained by mixing the reagent for measuring hemoglobins and the test substance can be further enhanced.
  • the component A1 is a polyoxyethylene lauryl ether having an average addition mole number of oxyethylene groups of 9, 12, or 19, or a polyoxyethylene cetyl ether having an average addition mole number of oxyethylene groups of 13 or 20. Is preferred. Most preferably, the component A1 is a polyoxyethylene lauryl ether having an average addition mole number of oxyethylene groups of 12 or a polyoxyethylene cetyl ether having an average addition mole number of oxyethylene groups of 13.
  • component A1 is an oxy group. It is preferable that the polyoxyethylene alkyl ether has an average number of moles of added ethylene group of 10 or more and 15 or less and an alkyl group of 12 or more and 17 or less. That is, component A1 is preferably component A1 '.
  • the HLB (Hydrophilc Lipophile Balance) value of the component A1 is preferably 10 or more, more preferably 12 or more, preferably 18 or less, and more preferably 16 or less.
  • the HLB value is at least the lower limit, generation of micelles can be suppressed, and clogging of the column can be effectively suppressed.
  • the HLB value is equal to or less than the upper limit, the cell membrane of the blood cell component can be sufficiently dissolved, and clogging of the column can be effectively suppressed.
  • H The HLB value of the component A1 and the HLB value of each component described later represent the HLB value by the Griffin method.
  • the HLB value ranges from 0 to 20. The smaller the HLB value, the stronger the hydrophobicity (lipophilicity), and the larger the HLB value, the stronger the hydrophilicity.
  • the HLB value by the Griffin method is calculated by the following equation.
  • HLB value 20 ⁇ (molecular weight of hydrophilic group / molecular weight)
  • the cloud point of component A1 is preferably 80 ° C or higher, more preferably 90 ° C or higher, preferably 150 ° C or lower, more preferably 120 ° C or lower.
  • the cloud point is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the solubility of the surfactant can be increased, and the reagent for measuring hemoglobins can be favorably prepared.
  • the cloud point is a temperature at which a transparent or translucent liquid undergoes phase separation due to a change in temperature, and as a result, the liquid becomes opaque.
  • the cloud point may be commonly referred to as the lower critical solution temperature.
  • the content of the component A1 is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.05% by weight or more, further preferably 0.08% by weight or more, and particularly preferably. 0.1% by weight or more. In 100% by weight of the above reagent for measuring hemoglobins, the content of the component A1 is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight or less, further preferably 0.6% by weight or less, particularly preferably. 0.5% by weight or less.
  • the effects of the present invention can be more effectively exerted, and a mixture of the reagent for measuring hemoglobins and the test substance is mixed.
  • the storage stability of the liquid can be further improved.
  • Examples of commercially available products of the component A1 include “Emulgen 109P” manufactured by Kao Corporation (polyoxyethylene lauryl ether and polyoxyethylene (9) lauryl ether having an average number of moles of added oxyethylene group of 9), and “Emulgen 120” manufactured by Kao Corporation ( Polyoxyethylene lauryl ether having an average number of added moles of oxyethylene group of 12, polyoxyethylene (12) lauryl ether), “Emulgen 147” manufactured by Kao Corporation (polyoxyethylene lauryl ether having an average number of moles of added oxyethylene group of 19; Polyoxyethylene (19) lauryl ether), “Emulgen 220” (polyoxyethylene cetyl ether having an average number of moles of oxyethylene group of 13 added, polyoxyethylene (13) cetyl ether) manufactured by Kao Corporation, and Sigma-Aldrich "Brij R) 58 "(polyoxyethylene cetyl ether having an average addition mol number 20 of oxyethylene groups, polyoxyethylene (20) cety
  • Component A2 is a polyoxyethylene stearyl ether having an average number of moles of added oxyethylene groups of 40 or more and 60 or less.
  • Component A2 is a component represented by the following formula (2). As the component A2, only one type may be used, or two or more types may be used in combination.
  • n represents a number of 40 or more and 60 or less.
  • polyoxyethylene stearyl ether having an average number of moles of oxyethylene group added of less than 40 the surfactant is difficult to dissolve, and a reagent for measuring hemoglobins may not be prepared. Further, in the case of polyoxyethylene stearyl ether having an average number of moles of added oxyethylene group of less than 40, a good peak may not be obtained. Further, in the case of polyoxyethylene stearyl ether having an average number of added moles of oxyethylene group of more than 60, a good peak may not be obtained or carry-over may occur.
  • the average number of moles of oxyethylene groups in the component A2 is preferably 45 or more, and more preferably 55 or less.
  • the average number of moles of oxyethylene groups in the component A2 may be 50. Most preferred.
  • the HLB value of the component A2 is preferably 13 or more, more preferably 15 or more, preferably 19 or less, more preferably 18 or less.
  • the HLB value is at least the lower limit, generation of micelles can be suppressed, and clogging of the column can be effectively suppressed.
  • the HLB value is equal to or less than the upper limit, the cell membrane of the blood cell component can be sufficiently dissolved, and clogging of the column can be effectively suppressed.
  • H The HLB value of the component A2 can be obtained by the method described above.
  • the cloud point of the component A2 is preferably 80 ° C or higher, more preferably 90 ° C or higher.
  • the solubility of the surfactant can be increased, and the reagent for measuring hemoglobins can be favorably prepared.
  • the content of the component A2 is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.05% by weight or more, further preferably 0.08% by weight or more, and particularly preferably. 0.1% by weight or more.
  • the content of the component A2 is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight or less, still more preferably 0.6% by weight or less, and particularly preferably. 0.5% by weight or less.
  • Examples of the commercially available component A2 include “Emulgen 350” (polyoxyethylene stearyl ether and polyoxyethylene (50) stearyl ether having an average number of moles of added oxyethylene group of 50) manufactured by Kao Corporation.
  • Component A3 is a polyoxyethylene oleyl ether having an average number of added moles of oxyethylene groups of 9 or more and 15 or less.
  • Component A3 is a component represented by the following formula (3). As the component A3, only one type may be used, or two or more types may be used in combination.
  • n represents a number of 9 or more and 15 or less.
  • the average number of moles of oxyethylene groups added in the component A3 is preferably 14 or less.
  • the average number of moles of oxyethylene groups added in the component A3 is 9 or 13 from the viewpoint of further increasing the solubility of the surfactant, from the viewpoint of better hemolysis, and measuring hemoglobins with higher accuracy. Is particularly preferred, and 13 is most preferred.
  • the component A3 is an oxy group. It is preferable that the polyoxyethylene oleyl ether has an average number of moles of added ethylene groups of 10 or more and 15 or less. That is, component A3 is preferably component A3 '.
  • the HLB value of the component A3 is preferably 10 or more, more preferably 12 or more, preferably 17 or less, and more preferably 15 or less.
  • the HLB value is at least the lower limit, generation of micelles can be suppressed, and clogging of the column can be effectively suppressed.
  • the HLB value is equal to or less than the upper limit, the cell membrane of the blood cell component can be sufficiently dissolved, and clogging of the column can be effectively suppressed.
  • H The HLB value of the component A3 can be obtained by the method described above.
  • the cloud point of the component A3 is preferably 50 ° C or higher, more preferably 85 ° C or higher, preferably 100 ° C or lower, more preferably 95 ° C or lower.
  • the cloud point is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the solubility of the surfactant can be increased, and the reagent for measuring hemoglobins can be favorably prepared.
  • the content of the component A3 is preferably at least 0.01% by weight, more preferably at least 0.05% by weight, still more preferably at least 0.08% by weight, and particularly preferably. 0.1% by weight or more. In 100% by weight of the above reagent for measuring hemoglobins, the content of the component A3 is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight or less, further preferably 0.6% by weight or less, and particularly preferably. 0.5% by weight or less. When the content of the component A3 is equal to or more than the lower limit and equal to or less than the upper limit, the effects of the present invention can be more effectively exerted.
  • Component A4 is a polyoxyethylene-sec-alkyl ether in which the average number of moles of oxyethylene groups added is 6 or more and 10 or less, and the alkyl group has 11 or more and 15 or less carbon atoms.
  • Component A4 is a component represented by the following formula (4).
  • Component A4 is an adduct of ethylene oxide with a secondary alcohol having 11 to 15 carbon atoms.
  • Component A4 is different from component A1. As the component A4, only one type may be used, or two or more types may be used in combination.
  • n a number of 6 or more and 10 or less.
  • the average number of moles of oxyethylene groups added to the component A4 is preferably 7 or more, and more preferably 9 or less. , 7 or 9 is more preferable.
  • the HLB value of the component A4 is preferably 10 or more, more preferably 12 or more, preferably 17 or less, and more preferably 15 or less.
  • the HLB value is at least the lower limit, generation of micelles can be suppressed, and clogging of the column can be effectively suppressed.
  • the HLB value is equal to or less than the upper limit, the cell membrane of the blood cell component can be sufficiently dissolved, and clogging of the column can be effectively suppressed.
  • H The HLB value of the component A4 can be obtained by the method described above.
  • the cloud point of the component A4 is preferably 30 ° C or higher, and more preferably 60 ° C or lower.
  • the solubility of the surfactant can be increased, and the reagent for measuring hemoglobins can be favorably prepared.
  • the content of the component A4 is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.05% by weight or more, further preferably 0.08% by weight or more, and particularly preferably. 0.1% by weight or more.
  • the content of the component A4 is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight or less, further preferably 0.6% by weight or less, and particularly preferably. 0.5% by weight or less.
  • component A4 Commercially available products of component A4 include "Emulgen 707” (polyoxyethylene-sec-alkyl ether having an average number of moles of added oxyethylene group of 7 and alkyl group of 11 to 15 carbon atoms) manufactured by Kao Corporation, and Kao Corporation "Emulgen 709” (polyoxyethylene-sec-alkyl ether having an average number of added moles of oxyethylene group of 9 and an alkyl group of 11 to 15 carbon atoms) and the like.
  • “Emulgen 707” polyoxyethylene-sec-alkyl ether having an average number of moles of added oxyethylene group of 7 and alkyl group of 11 to 15 carbon atoms
  • Kao Corporation Kao Corporation
  • Emgen 709 polyoxyethylene-sec-alkyl ether having an average number of added moles of oxyethylene group of 9 and an alkyl group of 11 to 15 carbon atoms
  • Component A5 is a polyoxyethylene tridecyl ether having an average number of added moles of 15 oxyethylene groups of 15.
  • Component A5 is a component represented by the following formula (5). As the component A5, only one type may be used, or two or more types may be used in combination.
  • the content of the component A5 is preferably at least 0.01% by weight, more preferably at least 0.05% by weight, still more preferably at least 0.08% by weight, and particularly preferably. 0.1% by weight or more.
  • the content of the component A5 is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight or less, further preferably 0.6% by weight or less, and particularly preferably. 0.5% by weight or less.
  • Component A6 is a polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether having an HLB value of 11 or more and 15 or less.
  • the polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether has an oxypropylene group and an oxyethylene group.
  • Component A6 is a component represented by the following formula (6). As the component A6, only one type may be used, or two or more types may be used in combination.
  • R represents an alkyl group
  • m represents a number of 1 or more
  • n represents a number of 1 or more.
  • the HLB value of the component A6 is preferably 11.5 or more, more preferably 12 or more, and preferably 14.5 or less.
  • the HLB value is at least the lower limit, generation of micelles can be suppressed, and clogging of the column can be effectively suppressed.
  • the HLB value is equal to or less than the upper limit, the cell membrane of the blood cell component can be sufficiently dissolved, and clogging of the column can be effectively suppressed.
  • the HLB value of the component A6 is 12.5, 12.7 or 14.0. Is preferred.
  • H The HLB value of the component A6 can be obtained by the method described above.
  • the cloud point of component A6 is preferably 30 ° C or higher, more preferably 50 ° C or higher, preferably 95 ° C or lower, more preferably 90 ° C or lower.
  • the cloud point is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, the solubility of the surfactant can be increased, and the reagent for measuring hemoglobins can be favorably prepared.
  • the content of the component A6 is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.05% by weight or more, still more preferably 0.08% by weight or more, and particularly preferably. 0.1% by weight or more.
  • the content of the component A6 is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight or less, further preferably 0.6% by weight or less, and particularly preferably. 0.5% by weight or less.
  • component A6 Commercial products of component A6 include “Emulgen LS-106” (polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether having an HLB value of 12.5) manufactured by Kao Corporation and “Emulgen LS-114” (having an HLB value of 14.0) manufactured by Kao Corporation. Polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl (C12-14) ether) and “Emulgen MS-110” (polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether having an HLB value of 12.7) manufactured by Kao Corporation.
  • Component A7 is n-nonanoyl-N-methyl-D-glucamine.
  • the content of the component A7 is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.05% by weight or more, further preferably 0.08% by weight or more, and particularly preferably. 0.1% by weight or more.
  • the content of the component A7 is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight or less, further preferably 0.6% by weight or less, and particularly preferably. 0.5% by weight or less.
  • Component A8 is n-octyl- ⁇ -D-glucopyranoside.
  • the content of the component A8 is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.05% by weight or more, further preferably 0.08% by weight or more, and particularly preferably. 0.1% by weight or more.
  • the content of the component A8 is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight or less, still more preferably 0.6% by weight or less, and particularly preferably. 0.5% by weight or less.
  • n-octyl- ⁇ -D-glucopyranoside manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd. and the like can be mentioned.
  • Component A9 is saponin.
  • the component A9 is preferably soybean saponin, and more preferably soybean saponin represented by the following formula (9).
  • the content of the component A9 is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.05% by weight or more, further preferably 0.08% by weight or more, and particularly preferably. 0.1% by weight or more.
  • the content of the component A9 is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight or less, still more preferably 0.6% by weight or less, and particularly preferably. 0.5% by weight or less.
  • amphoteric surfactant It is preferable that the reagent for measuring hemoglobins contains an amphoteric surfactant.
  • the surfactant is one of the components B1 to B3.
  • As the amphoteric surfactant only one of the components B1 to B3 may be used, or two or more may be used in combination.
  • Component B1 is 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonate (CHAPS).
  • the content of the component B1 is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.05% by weight or more, further preferably 0.08% by weight or more, and particularly preferably. 0.1% by weight or more.
  • the content of the component B1 is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight or less, further preferably 0.6% by weight or less, and particularly preferably. 0.5% by weight or less.
  • Component B2 is 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonate (CHAPSO).
  • the content of the component B2 is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.05% by weight or more, still more preferably 0.08% by weight or more, and particularly preferably. 0.1% by weight or more.
  • the content of the component B2 is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight or less, further preferably 0.6% by weight or less, and particularly preferably. 0.5% by weight or less.
  • Component B3 is lauryl dimethylamine oxide.
  • the content of the component B3 is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.05% by weight or more, further preferably 0.08% by weight or more, and particularly preferably. 0.1% by weight or more. In 100% by weight of the above reagent for measuring hemoglobins, the content of the component B3 is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight or less, further preferably 0.6% by weight or less, and particularly preferably. 0.5% by weight or less. When the content of the component B3 is equal to or more than the lower limit and equal to or less than the upper limit, the effects of the present invention can be more effectively exerted.
  • the reagent for measuring hemoglobins preferably contains a buffer. By including the above buffer, fluctuation of pH can be suppressed.
  • the buffer may be used alone or in combination of two or more.
  • buffer examples include sodium phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, potassium phosphate, phosphates such as dipotassium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate, sodium carbonate and sodium hydrogen carbonate, and the like.
  • borate such as sodium borate, carboxylic acid, dicarboxylic acid, carboxylic acid derivative, hydroxycarboxylic acid, aniline, aniline derivative, amino acid, amine compound, imidazole compound, alcohol compound, ethylenediaminetetraacetic acid, pyrophosphoric acid, Pyridine, cacodylic acid, glycerol phosphate, 2,4,6-collidine, N-ethylmorpholine, morpholine, 4-aminopyridine, ammonia, ephedrine, hydroxyproline, piperidine, tris (hydroxymethyl) aminomethane, and glycylglycine Etc.
  • the buffer is preferably a phosphate.
  • the content of the buffer in the reagent for measuring hemoglobins is not particularly limited as long as it is a content that can exert a buffering action.
  • the content of the buffer may be 0.01% by weight or more, 0.02% by weight or more, or 0.2% by weight or less. And may be 0.1% by weight or less.
  • the reagent for measuring hemoglobins preferably contains inorganic salts.
  • the inorganic salts By including the inorganic salts, the osmotic pressure can be adjusted favorably. Only one kind of the inorganic salts may be used, or two or more kinds may be used in combination.
  • inorganic salts examples include sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, and potassium sulfate.
  • the inorganic salts are preferably sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, or potassium sulfate, and preferably sodium chloride. More preferred.
  • the content of the inorganic salts in the reagent for measuring hemoglobins is not particularly limited. In 100% by weight of the reagent for measuring hemoglobins, the content of the inorganic salts may be 0.1% by weight or more and 1.0% by weight or less.
  • the reagent for measuring hemoglobins preferably contains water.
  • the content of the water is preferably 80% by weight or more, more preferably 90% by weight or more, and further preferably 95% by weight or more.
  • the reagent for measuring hemoglobins may contain components other than the components described above.
  • the other components include a preservative, a hemoglobin stabilizer, and a pH adjuster.
  • Each of the other components described above may be used alone or in combination of two or more.
  • Examples of the preservative include sodium azide, thymol, and sodium propionate.
  • hemoglobin stabilizer examples include chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and glutathione.
  • Examples of the pH adjuster include acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, nitric acid, and sulfuric acid, and bases such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide, magnesium hydroxide, barium hydroxide, and calcium hydroxide. No.
  • the reagent for measuring hemoglobins preferably contains the nonionic surfactant, and contains the component A1, the component A2, the component A3, the component A4, the component A5, or the component A6 as the nonionic surfactant. More preferably, the composition further includes component A1 or component A3, and particularly preferably component A1 ′ or component A3 ′. In this case, the effects of the present invention can be exhibited even more effectively. In addition, the storage stability of the mixed solution in which the hemoglobin measurement reagent and the test substance are mixed can be further enhanced.
  • the content of the nonionic surfactant in 100% by weight of the reagent for measuring hemoglobins is preferably at least 0.01% by weight, more preferably at least 0.05% by weight, further preferably at least 0.08% by weight, particularly preferably at least 0.1% by weight.
  • the content of the nonionic surfactant (total content of the components A1 to A9) in 100% by weight of the reagent for measuring hemoglobins is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight. %, More preferably 0.6% by weight or less, particularly preferably 0.5% by weight or less.
  • the content of the nonionic surfactant (the total content of the components A1 to A9) is equal to or more than the lower limit and equal to or less than the upper limit, the effects of the present invention can be more effectively exerted.
  • the storage stability of the mixed solution in which the hemoglobin measurement reagent and the test substance are mixed can be further enhanced.
  • the content of the amphoteric surfactant (the total content of components B1 to B3) in 100% by weight of the reagent for measuring hemoglobins is as follows: It is preferably at least 0.01% by weight, more preferably at least 0.05% by weight, further preferably at least 0.08% by weight, particularly preferably at least 0.1% by weight.
  • the content of the amphoteric surfactant (the total content of components B1 to B3) in 100% by weight of the reagent for measuring hemoglobins is preferably 1.0% by weight or less, more preferably 0.8% by weight or less. , More preferably 0.6% by weight or less, particularly preferably 0.5% by weight or less.
  • the reagent for measuring hemoglobins preferably does not contain the component X.
  • the effects of the present invention can be exerted even without the component X.
  • the storage stability of a liquid mixture obtained by mixing the reagent for measuring hemoglobins and the test substance can be enhanced without including the component X.
  • the reagent for measuring hemoglobins may include the component X.
  • the reagent for measuring hemoglobins may contain the component X at a concentration not subject to REACH regulation (the content of the component X is less than 0.1% by weight in 100% by weight of the reagent for measuring hemoglobins). Good.
  • the pH of the reagent for measuring hemoglobins is preferably 6.0 or more, more preferably 7.0 or more, preferably 8.5 or less, more preferably 8.0 or less.
  • the pH is equal to or higher than the lower limit and equal to or lower than the upper limit, hemolysis can be performed more favorably.
  • the osmotic pressure of the reagent for measuring hemoglobins is preferably 50 mOsm or more, more preferably 75 mOsm or more, preferably 200 mOsm or less, more preferably 150 mOsm or less.
  • hemolysis can be more favorably performed.
  • the osmotic pressure can be measured using an osmometer (eg, “Osmometer 3250” manufactured by Advanced Instruments).
  • an osmometer eg, “Osmometer 3250” manufactured by Advanced Instruments.
  • the above hemoglobin measurement reagent is suitably used for lysing red blood cells.
  • the reagent for measuring hemoglobins is preferably a hemolysis reagent.
  • the reagent for measuring hemoglobins is suitably used by being mixed with a test substance.
  • the test substance include a red blood cell-containing specimen such as blood, a hemoglobin standard substance, and a hemoglobin substance for measurement management.
  • the reagent for measuring hemoglobins is suitably used as a diluent for dissolving or diluting a sample (hemoglobin standard substance, measurement management hemoglobin substance, etc.) which does not contain red blood cells and has a known hemoglobin concentration. Further, the above-mentioned reagent for measuring hemoglobins is suitably used as a washing liquid for a liquid chromatograph and a washing liquid for a column.
  • the method for measuring hemoglobins includes the steps of mixing a red blood cell-containing sample and the above-described reagent for measuring hemoglobins to obtain a mixed solution, and measuring the mixed solution by cation exchange liquid chromatography. Is provided.
  • the cation exchange liquid chromatography is preferably a cation exchange high performance liquid chromatography.
  • red blood cell-containing specimen examples include blood.
  • the concentration of hemoglobin that does not contain red blood cells and is to be measured is known.
  • a mixture prepared from the sample is also measured.
  • Samples that do not contain the red blood cells and have known concentrations of hemoglobins to be measured include hemoglobin standard substances to be measured (hemoglobins having a known concentration to be measured) and hemoglobin substances to be measured and managed by the measurement target ( Hemoglobins of a known concentration to be measured, preferably a plurality of concentrations such as a low concentration, a medium concentration, and a high concentration are measured).
  • the hemoglobin standard substance and the hemoglobin substance for measurement management are preferably a freshly prepared specimen, a lyophilized specimen, or a frozen specimen.
  • the hemoglobin standard substance and the hemoglobin substance for measurement control are commercially available as a lyophilized product or a frozen product.
  • the concentration of hemoglobins as follows. (1) The mixture containing the red blood cell-containing sample and the reagent for measuring hemoglobins is obtained. (2) The above mixture is measured by cation exchange liquid chromatography. (3) The ratio of the peak area of the hemoglobin to be measured to the total peak area of hemoglobin (the peak area of the hemoglobin to be measured / the sum of the peak areas of hemoglobin) is the hemoglobin value of the measurement target (the concentration of hemoglobin).
  • the hemoglobin A1c value when calculating the hemoglobin A1c value, in the above (3), the ratio of the peak area of hemoglobin A1c to the sum of the peak areas of hemoglobin (the sum of the peak area of hemoglobin A1c / the sum of the peak areas of hemoglobin) is defined as the hemoglobin A1c value.
  • the concentration of hemoglobins can be determined as follows. (1) The first mixed solution is obtained by mixing the red blood cell-containing sample and the hemoglobin measurement reagent. (2) A hemoglobin-containing sample whose concentration of hemoglobins to be measured is known is mixed with the hemoglobin-measuring reagent to obtain a second liquid mixture. (3) The first mixture and the second mixture are measured by cation exchange liquid chromatography. (4) A measurement value obtained by measuring the mixture containing the hemoglobin-containing sample whose concentration of the hemoglobin to be measured is known by cation exchange liquid chromatography, and the mixture containing the red blood cell-containing sample. The concentration of hemoglobins in the erythrocyte-containing specimen is determined by comparing the measured value of the liquid with cation exchange liquid chromatography and the measured value.
  • the reagent for measuring hemoglobins is mixed with 1 mL of the red blood cell-containing sample, preferably at least 25 mL, more preferably at least 50 mL, preferably at most 400 mL, more preferably at most 200 mL. Is preferred.
  • the cation exchange liquid chromatography is preferably measured with a salt concentration gradient or a pH gradient.
  • the gradient may be a linear gradient or a step gradient.
  • the gradient measurement it is preferable to use two or more eluents.
  • the eluent having a low salt concentration and the eluent having a high salt concentration (for example, an eluent having a NaCl concentration of 50 mM and an eluent having a NaCl concentration of 200 mM) are used as the eluent. ) Can be used.
  • two types of eluents having different pHs for example, an eluent having a pH of 5.4 and an eluent having a pH of 8.0
  • eluent 80A Commercially available product can be used as the eluent.
  • Commercially available eluents include “Eluent 80A”, “Eluent 80B”, “Eluent 60A-VP / TP”, “Eluent 60B-VP / TP”, and “Eluent 60C-” manufactured by ARKRAY. VP "and the like.
  • a conventionally known cation exchange column can be used.
  • the cation exchange column is preferably a column packed with a filler having a cation exchange group such as a carboxyl group, a sulfonic acid group, or a phosphate group.
  • Commercially available cation exchange columns include, for example, “Column Unit 80” and “Column Unit HSVI-VP” manufactured by Arkley.
  • a first composition was obtained by mixing potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sodium chloride, sodium azide, and water.
  • Surfactants shown in Tables 2 to 6 were added to the obtained first composition and mixed to prepare a reagent for measuring hemoglobins.
  • the composition of the obtained reagent for measuring hemoglobins is shown in Table 1 below.
  • the types, contents, HLB values and cloud points of the surfactants in Table 1 are shown in Tables 2 to 6.
  • the HLB value of the surfactant is a value measured by the method described above.
  • Cation exchange chromatography conditions HPLC apparatus: glycohemoglobin analyzer ("HA-8180" manufactured by ARKRAY) Cation exchange column: Column unit 80 (Arkley) Eluent A: Eluent 80A (Arkray) Eluent B: Eluent 80B (Arkray)
  • FIG. 3 (a) An example of a chromatogram determined to be good is shown in FIG. 3 (a), and an example of a chromatogram determined to be bad is shown in FIG. 3 (b).
  • FIG. 4A shows an example of a chromatogram determined to be good
  • FIG. 4B shows an example of a chromatogram determined to be bad.
  • the peak shown by the arrow in FIG. 4B is a shoulder peak.
  • Hemoglobin A0 peak height In the first measurement of the reagent for measuring hemoglobins, the peak height of hemoglobin A0 obtained in Reference Example A was compared with the peak height of hemoglobin A0 obtained in Examples and Comparative Examples. did. For the peak height of hemoglobin A0 obtained in Reference Example A, it is determined to be good when the peak height of obtained hemoglobin A0 has not increased by 100 or more on the basis of absorbance, and has been increased beyond 100. Was determined to be defective.
  • FIG. 5A shows an example of a chromatogram obtained in Reference Example A
  • FIG. 5B shows an example of a chromatogram determined to be good, and an example of a chromatogram determined to be bad. This is shown in FIG.
  • the reagents for measuring hemoglobins obtained in Examples 1 to 30 are capable of satisfactorily hemolyzing and measuring hemoglobins with high accuracy.
  • hemoglobin measurement reagents are stored at room temperature.
  • the hemoglobin measurement reagent is stored and evaluated under a severer temperature condition than a normal storage condition.
  • Hemoglobin A1c value (%) peak area of hemoglobin A1c / total peak area of hemoglobin
  • FIG. 6 (a) is a diagram showing the relationship between the number of storage days and the hemoglobin A1c value in a mixed solution with whole blood.
  • FIG. 6B is a diagram showing the relationship between the number of storage days and the amount of change in the hemoglobin A1c value in the mixed liquid with whole blood.
  • the mixture Before and on the first, second, third, ninth and fourteenth days after storage, the mixture is repeated three times under the measurement conditions of “(2) Measurement by cation exchange liquid chromatography”.
  • the hemoglobin A1c value and the amount of change in the hemoglobin A1c value were determined from the average value in the same manner as described above.
  • FIG. 7 (a) is a diagram showing the relationship between the number of storage days and the hemoglobin A1c value in a mixed solution with the hemoglobin A1c substance for measurement management (low concentration) (IRC-L).
  • FIG. 7B is a diagram showing the relationship between the number of storage days and the amount of change in the hemoglobin A1c value in a mixed solution with the hemoglobin A1c substance for measurement management (low concentration) (IRC-L).
  • the absolute value of the difference is more than 0.2% and not more than 0.4% ⁇ ⁇ : In the variation of the hemoglobin A1c value on the 14th day, the absolute value of the difference from Reference Example A is more than 0.4% and 0 0.7% or less ⁇ : In the amount of change in hemoglobin A1c value on day 14, the absolute value of the difference from Reference Example A exceeds 0.7%
  • the hemoglobin A1c substance for measurement control (low concentration) (IRC-L) has a hemoglobin A1c value of 10%.
  • FIG. 8 (a) is a diagram showing the relationship between the number of storage days and the hemoglobin A1c value in a mixed solution with the hemoglobin A1c substance for measurement management (high concentration) (IRC-H).
  • FIG. 8B is a diagram showing the relationship between the number of storage days and the amount of change in the hemoglobin A1c value in a mixed solution with the hemoglobin A1c substance for measurement management (high concentration) (IRC-H).
  • ⁇ ⁇ In the variation of hemoglobin A1c value on the 14th day, the absolute value of the difference from Reference Example A is more than 0.45% and 0 ⁇ : 75% or less ⁇ : Absolute value of difference from Reference Example A in the amount of change in hemoglobin A1c value on day 14 exceeds 0.75%
  • the storage stability of the reagents for measuring hemoglobins obtained in Examples 31 to 36 was improved as compared with the reagents for measuring hemoglobins obtained in Examples 37 and 38. Further, in the reagents for measuring hemoglobins obtained in Examples 31 to 36, the storage stability of the mixed solution in which the reagents and the test substances were mixed could be improved. In the reagents for measuring hemoglobins obtained in Examples 31 to 36, the hemoglobins can be measured with high accuracy even after the mixture containing the reagents for measuring hemoglobin and the test substance is stored for a long time. can do.
  • the obtained liquid (2) was measured three times. Thereafter, the liquid (2) was measured three times each time the obtained liquid (1) was passed through the column a plurality of times (several tens to 200 times). The liquid (1) and the liquid (2) were repeatedly measured in accordance with the above procedure until the number of specimens loaded on the column reached about 3,000.
  • HPLC apparatus Glycohemoglobin analyzer ("HA-8160VP” manufactured by ARKRAY)
  • Cation exchange column Column unit HSVI-VP (Arkley) Eluent A: Eluent 60A-VP / TP (Arkley) Eluent B: Eluent 60B-VP / TP (Arkley) Eluent C: Eluent 60C-VP (Arkley)
  • FIG. 9A is a diagram showing the relationship between the number of specimens loaded on the column and the change in hemoglobin A1c value.
  • FIG. 9B is a diagram showing the relationship between the number of specimens loaded on the column and the amount of change in the number of theoretical plates.
  • the vertical axis represents the difference between the hemoglobin A1c value in the liquid (2) measured first and the hemoglobin A1c value in the liquid (2) measured at each load sample (the liquid (first measured Hemoglobin A1c value in 2)-hemoglobin A1c value in solution (2) measured at each number of loaded specimens).
  • the vertical axis represents the difference between the theoretical plate number of the liquid (2) measured first and the theoretical plate number of the liquid (2) measured at each load sample (the liquid (2) measured first). In (theoretical plate number in the liquid (2) measured at each load sample number).
  • Example 32 The reagent for measuring hemoglobins obtained in Example 32 was more excellent in column durability than the reagent for measuring hemoglobins obtained in Reference Example A.

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Abstract

良好に溶血させることができ、かつ高い精度でヘモグロビン類を測定することができるヘモグロビン類測定用試薬を提供する。　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるヘモグロビン類測定用試薬であって、特定の非イオン性界面活性剤又は特定の両性界面活性剤を含む。

Description

ヘモグロビン類測定用試薬及びヘモグロビン類の測定方法
　本発明は、界面活性剤を含むヘモグロビン類測定用試薬に関する。また、本発明は、上記ヘモグロビン類測定用試薬を用いたヘモグロビン類の測定方法に関する。
　従来、糖尿病及び異常ヘモグロビン病等の診断のために、ヘモグロビン類の濃度が測定されている。例えば、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＡ０及びヘモグロビンＡ２等のヘモグロビン、アセチル化ヘモグロビン及びカルバミル化ヘモグロビン等の修飾ヘモグロビン、並びにヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣ等の異常ヘモグロビン等のヘモグロビン類の濃度が測定されている。これらのヘモグロビン類の中でも、特に、ヘモグロビンＡ１ｃ値が測定されている。ヘモグロビン類の濃度を測定する方法としては、主に液体クロマトグラフィー法が挙げられる。
　液体クロマトグラフィー法では、血液等の検体に溶血試薬を添加し、溶血後の試料を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定し、得られたクロマトグラムのピークを演算処理することによりヘモグロビンＡ１ｃ値等のヘモグロビン類の濃度を求める。従来、溶血試薬として、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（例えば商品名「トリトンＸ－１００」）を含む組成物が用いられている。
　下記の特許文献１には、ヒトの血液のサンプル中のヘモグロビンＡ１ｃを他のグリコシル化及び非グリコシル化ヘモグロビン並びにヘモグロビンＡ１ｃの前駆体のシッフ塩基から分離するヘモグロビンＡ１ｃの分離方法が開示されている。また、特許文献１の実施例では、０．３３重量％のトリトンＸ－１００を含む溶血試薬が用いられている。
　下記の特許文献２には、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬が開示されている。上記溶血試薬は、カオトロピックイオンを含有する。また、特許文献２の実施例では、０．１重量％のトリトンＸ－１００を含む溶血試薬が用いられている。
特開昭５８－１９１９６８号公報 特開２００１－０２１５５５号公報
　特許文献１，２に記載のようなオキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含む溶血試薬（ヘモグロビン類測定用試薬）は、溶血性能に優れる。そのため、全血等の検体を該溶血試薬で処理して、陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定すると、ヘモグロビン類のピークが良好に得られる。また、得られる全てのピークにおいてショルダーピーク及びピーク割れ等が生じにくい。そのため、高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。
　また、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含む溶血試薬は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定したときに、キャリーオーバーが少ない。そのため、多数の検体を連続測定した場合でも、高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。
　一方、欧州において、ＲＥＡＣＨ規制（Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，Ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が２００７年に発効し、特定の化学品の使用が制限されることとなった。また、２０１７年には、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを０．１重量％以上含む製品がＲＥＡＣＨ規制の対象とされた。また、欧州以外の国でもオキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルの使用量を削減することは、環境負荷の軽減と人体の安全性の向上に寄与する。
　本発明の目的は、良好に溶血させることができ、かつ高い精度でヘモグロビン類を測定することができるヘモグロビン類測定用試薬を提供することである。より具体的には、本発明の目的は、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含まなくても、該成分が配合されたヘモグロビン類測定用試薬と同等のレベルで溶血させることができ、かつ同等の精度でヘモグロビン類を測定することができるヘモグロビン類測定用試薬を提供することである。
　また、本発明の目的は、上記ヘモグロビン類測定用試薬を用いたヘモグロビン類の測定方法を提供することである。
　本発明の広い局面によれば、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるヘモグロビン類測定用試薬であって、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤が、下記成分Ａ１、下記成分Ａ２、下記成分Ａ３、下記成分Ａ４、下記成分Ａ５、下記成分Ａ６、下記成分Ａ７、下記成分Ａ８又は下記成分Ａ９であり、前記両性界面活性剤が、下記成分Ｂ１、下記成分Ｂ２又は下記成分Ｂ３である、ヘモグロビン類測定用試薬が提供される。
　成分Ａ１：オキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテル
　成分Ａ２：オキシエチレン基の平均付加モル数が４０以上６０以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテル
　成分Ａ３：オキシエチレン基の平均付加モル数が９以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテル
　成分Ａ４：オキシエチレン基の平均付加モル数が６以上１０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン－ｓｅｃ－アルキルエーテル
　成分Ａ５：オキシエチレン基の平均付加モル数が１５であるポリオキシエチレントリデシルエーテル
　成分Ａ６：ＨＬＢ値が１１以上１５以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル
　成分Ａ７：ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン
　成分Ａ８：ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド
　成分Ａ９：サポニン
　成分Ｂ１：３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート
　成分Ｂ２：３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシプロパンスルホネート
　成分Ｂ３：ラウリルジメチルアミンオキサイド
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬のある特定の局面では、前記非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤が、前記成分Ａ１、前記成分Ａ２、前記成分Ａ３、前記成分Ａ４、前記成分Ａ５又は前記成分Ａ６を含み、前記成分Ａ１が、オキシエチレン基の平均付加モル数が９、１２若しくは１９であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が１３若しくは２０であるポリオキシエチレンセチルエーテルであり、前記成分Ａ２が、オキシエチレン基の平均付加モル数が５０であるポリオキシエチレンステアリルエーテルであり、前記成分Ａ３が、オキシエチレン基の平均付加モル数が９又は１３であるポリオキシエチレンオレイルエーテルであり、前記成分Ａ４が、オキシエチレン基の平均付加モル数が７又は９であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下のポリオキシエチレン－ｓｅｃ－アルキルエーテルであり、前記成分Ａ６が、ＨＬＢ値が１２．５、１２．７又は１４．０であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルである。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬のある特定の局面では、前記非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤が、前記成分Ａ１又は前記成分Ａ３を含み、前記成分Ａ１が、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテルであり、前記成分Ａ３が、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテルである。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬のある特定の局面では、前記成分Ａ１が、オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が１３であるポリオキシエチレンセチルエーテルであり、前記成分Ａ３が、オキシエチレン基の平均付加モル数が１３であるポリオキシエチレンオレイルエーテルである。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬のある特定の局面では、前記非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤の含有量が、０．０１重量％以上１．０重量％以下である。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬のある特定の局面では、前記両性界面活性剤を含み、前記両性界面活性剤の含有量が、０．０１重量％以上１．０重量％以下である。
　本発明の広い局面によれば、赤血球含有検体と、上述したヘモグロビン類測定用試薬とを混合して混合液を得る工程と、前記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する工程とを備える、ヘモグロビン類の測定方法が提供される。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられる。本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含む。本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記非イオン性界面活性剤が、以下の成分Ａ１～Ａ９のいずれかの成分であるか、上記両性界面活性剤が、以下の成分Ｂ１～Ｂ３のいずれかの成分である。成分Ａ１：オキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテル。成分Ａ２：オキシエチレン基の平均付加モル数が４０以上６０以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテル。成分Ａ３：オキシエチレン基の平均付加モル数が９以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテル。成分Ａ４：オキシエチレン基の平均付加モル数が６以上１０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン－ｓｅｃ－アルキルエーテル。成分Ａ５：オキシエチレン基の平均付加モル数が１５であるポリオキシエチレントリデシルエーテル。成分Ａ６：ＨＬＢ値が１１以上１５以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル。成分Ａ７：ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン。成分Ａ８：ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド。成分Ａ９：サポニン。成分Ｂ１：３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート。成分Ｂ２：３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシプロパンスルホネート。成分Ｂ３：ラウリルジメチルアミンオキサイド。本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記の構成が備えられているので、良好に溶血させることができ、かつ高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。
図１は、本発明の一実施形態に係るヘモグロビン類測定用試薬を用いて陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する際に得られるクロマトグラムの例である。 図２は、従来のヘモグロビン類測定用試薬を用いて陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する際に得られるクロマトグラムの例である。 図３（ａ）及び（ｂ）は、ヘモグロビンＡ０ピークの形状を評価したクロマトグラムの例である。 図４（ａ）及び（ｂ）は、ファーストフラクションのピーク形状を評価したクロマトグラムの例である。 図５（ａ）～（ｃ）は、ヘモグロビンＡ０ピーク高さを評価したクロマトグラムの例である。 図６（ａ）及び（ｂ）は、ヘモグロビン類測定用試薬と全血との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値及びヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。 図７（ａ）及び（ｂ）は、ヘモグロビン類測定用試薬と測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ－Ｌ）との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値及びヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。 図８（ａ）及び（ｂ）は、ヘモグロビン類測定用試薬と測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ－Ｈ）との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値及びヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。 図９（ａ）及び（ｂ）は、ヘモグロビン類測定用試薬と測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ－Ｈ）との混合液におけるカラム耐久性を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられる。本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含む。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記非イオン性界面活性剤が、オキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテル、オキシエチレン基の平均付加モル数が４０以上６０以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテル、オキシエチレン基の平均付加モル数が９以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテル、オキシエチレン基の平均付加モル数が６以上１０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン－ｓｅｃ－アルキルエーテル、オキシエチレン基の平均付加モル数が１５であるポリオキシエチレントリデシルエーテル、ＨＬＢ値が１１以上１５以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド、又はサポニンである。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記両性界面活性剤が、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシプロパンスルホネート、又はラウリルジメチルアミンオキサイドである。
　本明細書において、「オキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテル」を「成分Ａ１」と記載することがある。
　成分Ａ１のうち、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテル」を、本明細書において、「成分Ａ１’」と記載することがある。
　本明細書において、「オキシエチレン基の平均付加モル数が４０以上６０以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテル」を「成分Ａ２」と記載することがある。
　本明細書において、「オキシエチレン基の平均付加モル数が９以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテル」を「成分Ａ３」と記載することがある。
　成分Ａ３のうち、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテル」を、本明細書において、「成分Ａ３’」と記載することがある。
　本明細書において、「オキシエチレン基の平均付加モル数が６以上１０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン－ｓｅｃ－アルキルエーテル」を「成分Ａ４」と記載することがある。
　本明細書において、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１５であるポリオキシエチレントリデシルエーテル」を「成分Ａ５」と記載することがある。
　本明細書において、「ＨＬＢ値が１１以上１５以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル」を「成分Ａ６」と記載することがある。
　本明細書において、「ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン」を「成分Ａ７」と記載することがある。
　本明細書において、「ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド」を「成分Ａ８」と記載することがある。
　本明細書において、「サポニン」を「成分Ａ９」と記載することがある。
　本明細書において、「３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート」を「成分Ｂ１」と記載することがある。
　本明細書において、「３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシプロパンスルホネート」を「成分Ｂ２」と記載することがある。
　本明細書において、「ラウリルジメチルアミンオキサイド」を「成分Ｂ３」と記載することがある。
　本明細書において、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル」を「成分Ｘ」と記載することがある。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含み、上記非イオン性界面活性剤が、成分Ａ１、成分Ａ２、成分Ａ３、成分Ａ４、成分Ａ５、成分Ａ６、成分Ａ７、成分Ａ８又は成分Ａ９であるか、上記両性界面活性剤が、成分Ｂ１、成分Ｂ２又は成分Ｂ３である。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記の構成が備えられているので、良好に溶血させることができ、かつ高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。
　成分Ｘを含む従来のヘモグロビン類測定用試薬では、良好に溶血させることができ、かつ高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。一方、成分Ｘを含まないヘモグロビン類測定用試薬では、良好に溶血させ、かつ高い精度でヘモグロビン類を測定することは困難である。
　これに対して、本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記の構成が備えられているので、成分Ｘを含まない場合にも、成分Ｘが配合されたヘモグロビン類測定用試薬と同等のレベルで溶血させることができ、かつ同等の精度でヘモグロビン類を測定することができる。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、良好に溶血させることができるので、陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定したときに、ヘモグロビン類のピークを良好に得ることができる。また、得られる全てのピークにおいてショルダーピーク及びピーク割れ等が生じにくい。そのため、高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。また、本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、キャリーオーバーを少なくすることができる。そのため、多数の検体を連続測定した場合でも、高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。
　また、検査センターでは、溶血試薬（ヘモグロビン類測定用試薬）と、被検査物質とを混合したあと、混合液が陽イオン交換クロマトグラフィーで測定されるまでに、一定期間（例えば数日程度）保存されることがある。本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、該試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性を高めることができる。なお、上記被検査物質には、血液等の赤血球含有検体（例えば、被検者の血液）だけではなく、赤血球を含まないヘモグロビン類含有検体（例えば、ヘモグロビン類標準物質及び測定管理用ヘモグロビン類物質等）も含まれる。本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記混合液が一定期間保存されても、保存前後でヘモグロビン類のピーク形状が変化しにくく、測定値が変動しにくい。
　特に、本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬が、成分Ａ１’又は成分Ａ３’を含む場合には、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性をより一層高めることができ、また、ヘモグロビン類測定用試薬の保存安定性も高めることができる。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられる。上記ヘモグロビン類測定用試薬は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられることが好ましい。
　上記ヘモグロビン類としては、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＡ０及びヘモグロビンＡ２等のヘモグロビン、アセチル化ヘモグロビン及びカルバミル化ヘモグロビン等の修飾ヘモグロビン、並びにヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣ等の異常ヘモグロビン等が挙げられる。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、上記ヘモグロビンＡ１ｃ値（ヘモグロビンＡ１ｃの濃度）を測定するために好適に用いられる。
　図１は、本発明の一実施形態に係るヘモグロビン類測定用試薬を用いて陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する際に得られるクロマトグラムの例である。
　図２は、従来のヘモグロビン類測定用試薬（成分Ｘを含む従来のヘモグロビン類測定用試薬）を用いて陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する際に得られるクロマトグラムの例である。
　図１及び図２において、約１９秒に検出されたピークがヘモグロビンＡ１ｃのピークであり、約４０秒に検出されたピークがヘモグロビンＡ０のピークである。図１及び図２は、例えば、後述する実施例で測定された測定条件で測定した際のクロマトグラムの例である。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、成分Ｘを含む従来のヘモグロビン類測定用試薬と同等のピーク形状を得ることができる。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、ＲＥＡＣＨ規制の対象となっている成分を含まなくすることができるので、成分Ｘを含む従来のヘモグロビン類測定用試薬と比べて、環境への影響を小さくすることができ、安全性を高めることができる。
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、上記非イオン性界面活性剤を含んでいてもよく、上記両性界面活性剤を含んでいてもよく、上記非イオン性界面活性剤と上記両性界面活性剤との双方を含んでいてもよい。
　（非イオン性界面活性剤）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。上記非イオン性界面活性剤は、成分Ａ１～Ａ９のいずれかの成分である。上記非イオン性界面活性剤は、成分Ａ１～Ａ９のうちの１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　＜成分Ａ１＞
　成分Ａ１は、オキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテルである。成分Ａ１は、下記式（１）で表される成分である。成分Ａ１は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　Ｒ－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ　　　・・・（１）
　上記式（１）中、Ｒは炭素数１２以上１７以下のアルキル基を表し、ｎは８以上２０以下の数を表す。
　オキシエチレン基の平均付加モル数が８未満であり、かつアルキル基の炭素数が１２未満であるポリオキシエチレンアルキルエーテルでは、該界面活性剤が溶解しにくく、ヘモグロビン類測定用試薬を調製できないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が８未満であり、かつアルキル基の炭素数が１２未満であるポリオキシエチレンアルキルエーテルでは、良好なピークが得られないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が２０を超え、かつアルキル基の炭素数が１７を超えるポリオキシエチレンアルキルエーテルでは、良好なピークが得られなかったり、キャリーオーバーが生じたりすることがある。
　界面活性剤の溶解性を高める観点、良好に溶血させ、高い精度でヘモグロビン類を測定する観点から、成分Ａ１におけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、好ましくは９以上、より好ましくは１０以上、更に好ましくは１１以上、好ましくは１９以下である。
　本発明の効果を効果的に発揮する観点及びヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性を高める観点からは、成分Ａ１のアルキル基の炭素数は、好ましくは１７以下、より好ましくは１６以下であり、特に好ましくは１２又は１６である。なお、上記アルキル基の炭素数が１２である場合、成分Ａ１はポリオキシエチレンラウリルエーテルであり、上記アルキル基の炭素数が１６である場合、成分Ａ１はポリオキシエチレンセチルエーテルである。
　したがって、成分Ａ１は、オキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であるポリオキシエチレンセチルエーテルであることが特に好ましい。
　成分Ａ１がポリオキシエチレンラウリルエーテルである場合に、該ポリオキシエチレンラウリルエーテルにおけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、好ましくは９以上、より好ましくは１０以上、更に好ましくは１１以上、好ましくは１９以下、より好ましくは１６以下、更に好ましくは１３以下である。また、該ポリオキシエチレンラウリルエーテルにおけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、９、１２又は１９であることも好ましく、１２であることが最も好ましい。上記オキシエチレン基の平均付加モル数が上述の好ましい範囲又は値であると、界面活性剤の溶解性をより一層高めることができ、良好に溶血させ、より一層高い精度でヘモグロビン類を測定することができ、また、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性をより一層高めることができる。
　成分Ａ１がポリオキシエチレンセチルエーテルである場合に、該ポリオキシエチレンセチルエーテルにおけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、好ましくは１０以上、より好ましくは１２以上、好ましくは１９以下、より好ましくは１６以下、更に好ましくは１４以下である。また、該ポリオキシエチレンセチルエーテルにおけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、１３又は２０であることも好ましく、１３であることが最も好ましい。上記オキシエチレン基の平均付加モル数が上述の好ましい範囲又は値であると、界面活性剤の溶解性をより一層高めることができ、良好に溶血させ、より一層高い精度でヘモグロビン類を測定することができ、また、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性をより一層高めることができる。
　したがって、成分Ａ１は、オキシエチレン基の平均付加モル数が９、１２若しくは１９であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が１３若しくは２０であるポリオキシエチレンセチルエーテルであることが好ましい。また、成分Ａ１は、オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が１３であるポリオキシエチレンセチルエーテルであることが最も好ましい。
　本発明の効果を効果的に発揮する観点、ヘモグロビン類測定用試薬の保存安定性及び該試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性を高める観点からは、成分Ａ１は、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテルであることが好ましい。すなわち、成分Ａ１は、成分Ａ１’であることが好ましい。
　成分Ａ１のＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｃ　Ｌｉｐｏｐｈｉｌｃ　Ｂａｌａｎｃｅ）値は、好ましくは１０以上、より好ましくは１２以上、好ましくは１８以下、より好ましくは１６以下である。上記ＨＬＢ値が上記下限以上であると、ミセルの発生を抑えることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。上記ＨＬＢ値が上記上限以下であると、血球成分の細胞膜を十分に溶解させることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。
　成分Ａ１のＨＬＢ値、及び後述する各成分のＨＬＢ値は、グリフィン法によるＨＬＢ値を表す。ＨＬＢ値は、０以上２０以下の値をとり、ＨＬＢ値が小さいほど疎水性（親油性）が強く、ＨＬＢ値が大きいほど親水性が強い。グリフィン法によるＨＬＢ値は、下記式により算出される。
　ＨＬＢ値＝２０×（親水基の分子量／分子量）
　成分Ａ１の曇点は、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上、好ましくは１５０℃以下、より好ましくは１２０℃以下である。上記曇点が上記下限以上及び上記上限以下であると、界面活性剤の溶解性を高めることができ、ヘモグロビン類測定用試薬を良好に調製することができる。
　なお、曇点とは、透明又は半透明な液体で温度変化によって相分離が起き、その結果、液体が不透明になる温度のことである。曇点は、一般に、下限臨界溶解温度と呼ばれることもある。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ１の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ１の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ１の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができ、また、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性をより一層高めることができる。
　成分Ａ１の市販品としては、花王社製「エマルゲン１０９Ｐ」（オキシエチレン基の平均付加モル数９のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル）、花王社製「エマルゲン１２０」（オキシエチレン基の平均付加モル数１２のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１２）ラウリルエーテル）、花王社製「エマルゲン１４７」（オキシエチレン基の平均付加モル数１９のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１９）ラウリルエーテル）、花王社製「エマルゲン２２０」（オキシエチレン基の平均付加モル数１３のポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレン（１３）セチルエーテル）、及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製「Ｂｒｉｊ（登録商標）５８」（オキシエチレン基の平均付加モル数２０のポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル）等が挙げられる。
　＜成分Ａ２＞
　成分Ａ２は、オキシエチレン基の平均付加モル数が４０以上６０以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテルである。成分Ａ２は、下記式（２）で表される成分である。成分Ａ２は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　Ｃ１８Ｈ３７Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ　　　・・・（２）
　上記式（２）中、ｎは４０以上６０以下の数を表す。
　オキシエチレン基の平均付加モル数が４０未満であるポリオキシエチレンステアリルエーテルでは、該界面活性剤が溶解しにくく、ヘモグロビン類測定用試薬を調製できないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が４０未満であるポリオキシエチレンステアリルエーテルでは、良好なピークが得られないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が６０を超えるポリオキシエチレンステアリルエーテルでは、良好なピークが得られなかったり、キャリーオーバーが生じたりすることがある。
　界面活性剤の溶解性を高める観点、良好に溶血させ、高い精度でヘモグロビン類を測定する観点から、成分Ａ２におけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、好ましくは４５以上、好ましくは５５以下である。界面活性剤の溶解性をより一層高める観点、より一層良好に溶血させ、より一層高い精度でヘモグロビン類を測定する観点から、成分Ａ２におけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、５０であることが最も好ましい。
　成分Ａ２のＨＬＢ値は、好ましくは１３以上、より好ましくは１５以上、好ましくは１９以下、より好ましくは１８以下である。上記ＨＬＢ値が上記下限以上であると、ミセルの発生を抑えることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。上記ＨＬＢ値が上記上限以下であると、血球成分の細胞膜を十分に溶解させることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。
　成分Ａ２のＨＬＢ値は、上述した方法で求めることができる。
　成分Ａ２の曇点は、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上である。上記曇点が上記下限以上であると、界面活性剤の溶解性を高めることができ、ヘモグロビン類測定用試薬を良好に調製することができる。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ２の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ２の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ２の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　成分Ａ２の市販品としては、花王社製「エマルゲン３５０」（オキシエチレン基の平均付加モル数５０のポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレン（５０）ステアリルエーテル）等が挙げられる。
　＜成分Ａ３＞
　成分Ａ３は、オキシエチレン基の平均付加モル数が９以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテルである。成分Ａ３は、下記式（３）で表される成分である。成分Ａ３は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　Ｃ１８Ｈ３５Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ　　　・・・（３）
　上記式（３）中、ｎは９以上１５以下の数を表す。
　オキシエチレン基の平均付加モル数が９未満であるポリオキシエチレンオレイルエーテルでは、該界面活性剤が溶解しにくく、ヘモグロビン類測定用試薬を調製できないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が９未満であるポリオキシエチレンオレイルエーテルでは、良好なピークが得られないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が１５を超えるポリオキシエチレンオレイルエーテルでは、良好なピークが得られなかったり、キャリーオーバーが生じたりすることがある。
　界面活性剤の溶解性を高める観点、良好に溶血させ、高い精度でヘモグロビン類を測定する観点から、成分Ａ３におけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、好ましくは１４以下である。界面活性剤の溶解性をより一層高める観点、より一層良好に溶血させ、より一層高い精度でヘモグロビン類を測定する観点から、成分Ａ３におけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、９又は１３であることが特に好ましく、１３であることが最も好ましい。
　本発明の効果を効果的に発揮する観点、ヘモグロビン類測定用試薬の保存安定性及び該試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性を高める観点からは、成分Ａ３は、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテルであることが好ましい。すなわち、成分Ａ３は、成分Ａ３’であることが好ましい。
　成分Ａ３のＨＬＢ値は、好ましくは１０以上、より好ましくは１２以上、好ましくは１７以下、より好ましくは１５以下である。上記ＨＬＢ値が上記下限以上であると、ミセルの発生を抑えることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。上記ＨＬＢ値が上記上限以下であると、血球成分の細胞膜を十分に溶解させることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。
　成分Ａ３のＨＬＢ値は、上述した方法で求めることができる。
　成分Ａ３の曇点は、好ましくは５０℃以上、より好ましくは８５℃以上、好ましくは１００℃以下、より好ましくは９５℃以下である。上記曇点が上記下限以上及び上記上限以下であると、界面活性剤の溶解性を高めることができ、ヘモグロビン類測定用試薬を良好に調製することができる。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ３の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ３の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ３の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　成分Ａ３の市販品としては、花王社製「エマルゲン４０９ＰＶ」（オキシエチレン基の平均付加モル数９のポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン（９）オレイルエーテル）、及び花王社製「エマルゲン４２０」（オキシエチレン基の平均付加モル数１３のポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１３）オレイルエーテル）等が挙げられる。
　＜成分Ａ４＞
　成分Ａ４は、オキシエチレン基の平均付加モル数が６以上１０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン－ｓｅｃ－アルキルエーテルである。成分Ａ４は、下記式（４）で表される成分である。成分Ａ４は、炭素数が１１以上１５以下である第２級アルコールのエチレンオキシドの付加物である。成分Ａ４は、成分Ａ１とは異なる。成分Ａ４は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　ＣｍＨ２ｍ＋１Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ　　　・・・（４）
　上記式（４）中、ｍは１１以上１５以下の数を表し、ｎは６以上１０以下の数を表す。
　オキシエチレン基の平均付加モル数が６未満であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン－ｓｅｃ－アルキルエーテルでは、該界面活性剤が溶解しにくく、ヘモグロビン類測定用試薬を調製できないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が６未満であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン－ｓｅｃ－アルキルエーテルでは、良好なピークが得られないことがある。
　界面活性剤の溶解性を高める観点、良好に溶血させ、高い精度でヘモグロビン類を測定する観点から、成分Ａ４におけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、好ましくは７以上、好ましくは９以下であり、７又は９であることがより好ましい。
　成分Ａ４のＨＬＢ値は、好ましくは１０以上、より好ましくは１２以上、好ましくは１７以下、より好ましくは１５以下である。上記ＨＬＢ値が上記下限以上であると、ミセルの発生を抑えることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。上記ＨＬＢ値が上記上限以下であると、血球成分の細胞膜を十分に溶解させることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。
　成分Ａ４のＨＬＢ値は、上述した方法で求めることができる。
　成分Ａ４の曇点は、好ましくは３０℃以上、好ましくは６０℃以下である。上記曇点が上記下限以上及び上記上限以下であると、界面活性剤の溶解性を高めることができ、ヘモグロビン類測定用試薬を良好に調製することができる。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ４の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ４の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ４の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　成分Ａ４の市販品としては、花王社製「エマルゲン７０７」（オキシエチレン基の平均付加モル数７、かつアルキル基の炭素数１１以上１５以下のポリオキシエチレン－ｓｅｃ－アルキルエーテル）、及び花王社製「エマルゲン７０９」（オキシエチレン基の平均付加モル数９、かつアルキル基の炭素数１１以上１５以下のポリオキシエチレン－ｓｅｃ－アルキルエーテル）等が挙げられる。
　＜成分Ａ５＞
　成分Ａ５は、オキシエチレン基の平均付加モル数が１５であるポリオキシエチレントリデシルエーテルである。成分Ａ５は、下記式（５）で表される成分である。成分Ａ５は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　Ｃ１３Ｈ２７Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１５Ｈ　　　・・・（５）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ５の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ５の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ５の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　成分Ａ５の市販品としては、ライオン社製「レオコールＴＤ－１５０」等が挙げられる。
　＜成分Ａ６＞
　成分Ａ６は、ＨＬＢ値が１１以上１５以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルである。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルは、オキシプロピレン基とオキシエチレン基とを有する。成分Ａ６は、下記式（６）で表される成分である。成分Ａ６は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　Ｒ－（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｍ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ　　　・・・（６）
　上記式（６）中、Ｒはアルキル基を表し、ｍは１以上の数を表し、ｎは１以上の数を表す。
　成分Ａ６のＨＬＢ値は、好ましくは１１．５以上、より好ましくは１２以上、好ましくは１４．５以下である。上記ＨＬＢ値が上記下限以上であると、ミセルの発生を抑えることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。上記ＨＬＢ値が上記上限以下であると、血球成分の細胞膜を十分に溶解させることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点及びカラムの目詰まりをより一層効果的に抑える観点からは、成分Ａ６のＨＬＢ値は、１２．５、１２．７又は１４．０であることが好ましい。
　成分Ａ６のＨＬＢ値は、上述した方法で求めることができる。
　成分Ａ６の曇点は、好ましくは３０℃以上、より好ましくは５０℃以上、好ましくは９５℃以下、より好ましくは９０℃以下である。上記曇点が上記下限以上及び上記上限以下であると、界面活性剤の溶解性を高めることができ、ヘモグロビン類測定用試薬を良好に調製することができる。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ６の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ６の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ６の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　成分Ａ６の市販品としては、花王社製「エマルゲンＬＳ－１０６」（ＨＬＢ値１２．５のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル)、花王社製「エマルゲンＬＳ－１１４」（ＨＬＢ値１４．０のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキル（Ｃ１２－１４）エーテル）、及び花王社製「エマルゲンＭＳ－１１０」（ＨＬＢ値１２．７のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル）等が挙げられる。
　＜成分Ａ７＞
　成分Ａ７は、ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミンである。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ７の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ７の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ７の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　成分Ａ７の市販品としては、同仁化学社製「ＭＥＧＡ－９」等が挙げられる。
　＜成分Ａ８＞
　成分Ａ８は、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシドである。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ８の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ８の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ８の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　成分Ａ８の市販品としては、同仁化学社製「ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド」等が挙げられる。
　＜成分Ａ９＞
　成分Ａ９は、サポニンである。成分Ａ９は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　成分Ａ９は、大豆サポニンであることが好ましく、下記式（９）で表される大豆サポニンであることがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ９の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ９の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ９の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　成分Ａ９の市販品としては、ナカライテスク社製「サポニン」等が挙げられる。
　（両性界面活性剤）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、両性界面活性剤を含むことが好ましい。上記界面活性剤は、成分Ｂ１～Ｂ３のいずれかの成分である。上記両性界面活性剤は、成分Ｂ１～Ｂ３のうちの１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　＜成分Ｂ１＞
　成分Ｂ１は、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）である。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｂ１の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｂ１の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ｂ１の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　成分Ｂ１の市販品としては、同仁化学社製「ＣＨＡＰＳ」等が挙げられる。
　＜成分Ｂ２＞
　成分Ｂ２は、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシプロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）である。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｂ２の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｂ２の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ｂ２の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　成分Ｂ２の市販品としては、同仁化学社製「ＣＨＡＰＳＯ」等が挙げられる。
　＜成分Ｂ３＞
　成分Ｂ３は、ラウリルジメチルアミンオキサイドである。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｂ３の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｂ３の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ｂ３の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　成分Ｂ３の市販品としては、花王社製「アンヒトール２０Ｎ」等が挙げられる。
　（緩衝剤）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、緩衝剤を含むことが好ましい。上記緩衝剤を含むことにより、ｐＨの変動を抑えることができる。上記緩衝剤は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記緩衝剤としては、リン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム及びリン酸二水素カリウム等のリン酸塩、炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウム等の炭酸塩、ホウ酸ナトリウム等のホウ酸塩、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリン、アニリン誘導体、アミノ酸、アミン化合物、イミダゾール化合物、アルコール化合物、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６－コリジン、Ｎ－エチルモルホリン、モルホリン、４－アミノピリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリン、ピペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、並びにグリシルグリシン等が挙げられる。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬のｐＨを後述する好ましい範囲に維持する観点からは、上記緩衝剤は、リン酸塩であることが好ましい。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬中の上記緩衝剤の含有量は、緩衝作用を発揮できる含有量であれば特に限定されない。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記緩衝剤の含有量は、０．０１重量％以上であってもよく、０．０２重量％以上であってもよく、０．２重量％以下であってもよく、０．１重量％以下であってもよい。
　（無機塩類）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、無機塩類を含むことが好ましい。上記無機塩類を含むことにより、浸透圧を良好に調整することができる。上記無機塩類は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記無機塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、及び硫酸カリウム等が挙げられる。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬の浸透圧を後述する好ましい範囲に維持する観点からは、上記無機塩類は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、又は硫酸カリウムであることが好ましく、塩化ナトリウムであることがより好ましい。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬中の上記無機塩類の含有量は、特に限定されない。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記無機塩類の含有量は、０．１重量％以上であってもよく、１．０重量％以下であってもよい。
　（水）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、水を含むことが好ましい。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記水の含有量は、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、更に好ましくは９５重量％以上である。
　（その他の成分）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、上述した成分以外の他の成分を含んでいてもよい。上記他の成分としては、防腐剤、ヘモグロビン安定剤、及びｐＨ調整剤等が挙げられる。上記他の成分はそれぞれ、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記防腐剤としては、アジ化ナトリウム、チモール、及びプロピオン酸ナトリウム等が挙げられる。
　上記ヘモグロビン安定剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、及びグルタチオン等が挙げられる。
　上記ｐＨ調整剤としては、塩酸、リン酸、硝酸、及び硫酸等の酸、並びに、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、及び水酸化カルシウム等の塩基が挙げられる。
　（ヘモグロビン類測定用試薬の他の詳細）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、上記非イオン性界面活性剤を含むことが好ましく、上記非イオン性界面活性剤として成分Ａ１、成分Ａ２、成分Ａ３、成分Ａ４、成分Ａ５又は成分Ａ６を含むことがより好ましく、成分Ａ１、又は成分Ａ３を含むことが更に好ましく、成分Ａ１’、又は成分Ａ３’を含むことが特に好ましい。この場合には、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。また、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性をより一層高めることができる。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬が、上記非イオン性界面活性剤を含む場合に、上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記非イオン性界面活性剤の含有量（成分Ａ１～Ａ９の合計の含有量）は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記非イオン性界面活性剤の含有量（成分Ａ１～Ａ９の合計の含有量）は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。上記非イオン性界面活性剤の含有量（成分Ａ１～Ａ９の合計の含有量）が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。また、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性をより一層高めることができる。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬が、上記両性界面活性剤を含む場合に、上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記両性界面活性剤の含有量（成分Ｂ１～Ｂ３の合計の含有量）は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記両性界面活性剤の含有量（成分Ｂ１～Ｂ３の合計の含有量）は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。上記両性界面活性剤の含有量（成分Ｂ１～Ｂ３の合計の含有量）が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、成分Ｘを含まないことが好ましい。本発明では、成分Ｘを含まなくても、本発明の効果を発揮させることができる。また、本発明では、成分Ｘを含まなくても、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性を高めることができる。ただし、上記ヘモグロビン類測定用試薬は、成分Ｘを含んでいてもよい。例えば、上記ヘモグロビン類測定用試薬は、成分Ｘを、ＲＥＡＣＨ規制の対象とならない濃度（ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｘの含有量が０．１重量％未満）で含んでいてもよい。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬のｐＨは、好ましくは６．０以上、より好ましくは７．０以上、好ましくは８．５以下、より好ましくは８．０以下である。上記ｐＨが上記下限以上及び上記上限以下であると、より一層良好に溶血させることができる。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬の浸透圧は、好ましくは５０ｍＯｓｍ以上、より好ましくは７５ｍＯｓｍ以上、好ましくは２００ｍＯｓｍ以下、より好ましくは１５０ｍＯｓｍ以下である。上記浸透圧が上記下限以上及び上記上限以下であると、より一層良好に溶血させることができる。
　上記浸透圧は、浸透圧計（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製「オズモメーター３２５０」）を用いて測定することができる。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、赤血球を溶血させるために好適に用いられる。上記ヘモグロビン類測定用試薬は、溶血試薬であることが好ましい。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、被検査物質と混合されて好適に用いられる。上記被検査物質としては、血液等の赤血球含有検体、ヘモグロビン類標準物質、及び測定管理用ヘモグロビン類物質等が挙げられる。
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、赤血球を含まず、かつヘモグロビンの濃度が既知である検体（ヘモグロビン類標準物質、及び測定管理用ヘモグロビン類物質等）を溶解又は希釈する希釈液として好適に用いられる。さらに、上記ヘモグロビン類測定用試薬は、液体クロマトグラフの洗浄液及びカラムの洗浄液としても好適に用いられる。
　（ヘモグロビン類の測定方法）
　本発明に係るヘモグロビン類の測定方法は、赤血球含有検体と、上述したヘモグロビン類測定用試薬とを混合して混合液を得る工程と、上記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する工程とを備える。
　上記陽イオン交換液体クロマトグラフィーは、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーであることが好ましい。
　上記赤血球含有検体としては、血液等が挙げられる。
　一般に、上記陽イオン交換液体クロマトグラフィーにおいては、患者等から採取した血液（赤血球含有検体）から調製された混合液に加えて、赤血球を含まず、かつ測定対象のヘモグロビン類の濃度が既知である検体から調製された混合液も測定される。上記赤血球を含まず、かつ測定対象のヘモグロビン類の濃度が既知である検体としては、測定対象のヘモグロビン類標準物質（測定対象の既知濃度のヘモグロビン類）、測定対象の測定管理用ヘモグロビン類物質（測定対象の既知濃度のヘモグロビン類、好ましくは低濃度、中濃度、高濃度等の複数濃度を測定）等が挙げられる。上記ヘモグロビン類標準物質及び上記測定管理用ヘモグロビン類物質は、好ましくは用時調製検体、凍結乾燥検体又は凍結検体である。また、上記ヘモグロビン類標準物質及び上記測定管理用ヘモグロビン類物質は、凍結乾燥品又は凍結品として市販されている。
　上記ヘモグロビン類の測定方法では、例えば、以下のようにしてヘモグロビン類の濃度を求めることが好ましい。（１）上記赤血球含有検体と、上記ヘモグロビン類測定用試薬とを混合して混合液を得る。（２）上記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する。（３）測定対象のヘモグロビン類のピーク面積の、ヘモグロビンのピーク面積の合計に対する比（測定対象のヘモグロビン類のピーク面積／ヘモグロビンのピーク面積の合計）を測定対象のヘモグロビン値（ヘモグロビン類の濃度）とする。例えば、ヘモグロビンＡ１ｃ値を求める場合には、上記（３）において、ヘモグロビンＡ１ｃのピーク面積の、ヘモグロビンのピーク面積の合計に対する比（ヘモグロビンＡ１ｃのピーク面積／ヘモグロビンのピーク面積の合計）をヘモグロビンＡ１ｃ値とする。
　上記ヘモグロビン類の測定方法では、例えば、以下のようにしてヘモグロビン類の濃度を求めることもできる。（１）上記赤血球含有検体と、上記ヘモグロビン類測定用試薬とを混合して第１の混合液を得る。（２）測定対象のヘモグロビン類の濃度が既知であるヘモグロビン類含有検体と、上記ヘモグロビン類測定用試薬とを混合して第２の混合液を得る。（３）上記第１の混合液及び上記第２の混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する。（４）測定対象のヘモグロビン類の濃度が既知である上記ヘモグロビン類含有検体を含む上記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定して得られた測定値と、上記赤血球含有検体を含む上記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定して得られた測定値とを比較することで、上記赤血球含有検体中のヘモグロビン類の濃度を決定する。
　より一層良好に溶血させる観点からは、上記赤血球含有検体１ｍＬに対して、上記ヘモグロビン類測定用試薬を、好ましくは２５ｍＬ以上、より好ましくは５０ｍＬ以上、好ましくは４００ｍＬ以下、より好ましくは２００ｍＬ以下で混合することが好ましい。
　上記陽イオン交換液体クロマトグラフィーは、塩濃度のグラジエント又はｐＨのグラジエントで測定されることが好ましい。上記グラジエントは、リニアグラジエントであってもよく、ステップグラジエントであってもよい。
　上記グラジエントの測定では、２種以上の溶離液が用いられることが好ましい。上記塩濃度のグラジエントで測定する場合には、上記溶離液として、低塩濃度の溶離液及び高塩濃度の溶離液（例えば、ＮａＣｌ濃度が５０ｍＭである溶離液及びＮａＣｌ濃度が２００ｍＭである溶離液）を用いることができる。上記ｐＨグラジエントで測定する場合には、ｐＨの異なる２種の溶離液（例えば、ｐＨ５．４の溶離液とｐＨ８．０の溶離液）を用いることができる。また、上記溶離液として、市販品を用いることもできる。上記溶離液の市販品としては、アークレイ社製「溶離液８０Ａ」、「溶離液８０Ｂ」、「溶離液６０Ａ－ＶＰ／ＴＰ」、「溶離液６０Ｂ－ＶＰ／ＴＰ」、及び「溶離液６０Ｃ－ＶＰ」等が挙げられる。
　上記陽イオン交換液体クロマトグラフィーで用いられる陽イオン交換カラムとして、従来公知の陽イオン交換カラムを用いることができる。上記陽イオン交換カラムは、カルボキシル基、スルホン酸基、又はリン酸基等のカチオン交換基を有する充填剤が充填されたカラムであることが好ましい。陽イオン交換カラムの市販品としては、例えば、アークレイ社製「カラムユニット８０」及び「カラムユニットＨＳＶＩ－ＶＰ」等が挙げられる。
　以下、実施例、参考例及び比較例を挙げることにより、本発明を具体的に説明する。本発明は、以下の実施例に限定されない。
　（実施例１～３０、参考例Ａ及び比較例１～６９）
　ヘモグロビン類測定用試薬の調製：
　リン酸二水素カリウムと、リン酸水素二カリウムと、塩化ナトリウムと、アジ化ナトリウムと、水とを混合し第１の組成物を得た。得られた第１の組成物に、表２～６に示す界面活性剤を添加して混合し、ヘモグロビン類測定用試薬を調製した。得られたヘモグロビン類測定用試薬の組成を以下の表１に示す。表１中の界面活性剤の種類、含有量、ＨＬＢ値及び曇点は、表２～６に示した。なお、界面活性剤のＨＬＢ値は、上述した方法で測定された値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（評価）
　（１）界面活性剤の溶解性
　上記第１の組成物に界面活性剤を添加して混合した際の界面活性剤の溶解性を目視にて確認した。界面活性剤の溶解性を以下の基準で判定した。
　［界面活性剤の溶解性の判定基準］
　○○：界面活性剤が１５分未満で完全に溶解する
　○：界面活性剤が１５分以上３０分未満で完全に溶解する
　△：界面活性剤が３０分以上１時間未満で完全に溶解する
　×：界面活性剤が１時間以上で完全に溶解する、又は溶解しない
　（２）陽イオン交換液体クロマトグラフィーによる測定
　採血管（積水メディカル社製）に収容された全血（赤血球含有検体）を用意した。全血１ｍＬに対して、得られたヘモグロビン類測定用試薬１００ｍＬを混合し、混合液を得た。得られた混合液を以下の条件で測定した。なお、「（１）界面活性剤の溶解性」の判定結果が×であるヘモグロビン類測定用試薬では、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによる測定を行わなかった。
　陽イオン交換クロマトグラフィー条件：
　ＨＰＬＣ装置：グリコヘモグロビン分析装置（アークレイ社製「ＨＡ－８１８０」）
　陽イオン交換カラム：カラムユニット８０（アークレイ社製）
　溶離液Ａ：溶離液８０Ａ(アークレイ社製)
　溶離液Ｂ：溶離液８０Ｂ(アークレイ社製)
　ＨＰＬＣ装置に搭載されている測定メソッドを用いて、測定を行った。
　（２－１）ピーク分離パターン
　混合液を測定して得られたクロマトグラムについて、以下のｉ）～ｉｉｉ）を確認した。なお、参考例Ａでは、図２に示すクロマトグラムのピークパターンが得られた。得られるクロマトグラムにおいて、約１９秒に検出されたピークがヘモグロビンＡ１ｃのピークであり、約４０秒に検出されたピークがヘモグロビンＡ０のピークである。
　ｉ）ヘモグロビンＡ１ｃピークの分離
　参考例Ａで得られたヘモグロビンＡ１ｃのピーク高さと、実施例及び比較例で得られたヘモグロビンＡ１ｃのピーク高さとを比較した。参考例Ａで得られたヘモグロビンＡ１ｃのピーク高さに対して、得られたヘモグロビンＡ１ｃのピーク高さが吸光度基準で５０以上低下していない場合に、ヘモグロビンＡ１ｃピークの分離が良好と判定し、５０を超えて低下している場合に不良と判定した。
　ｉｉ）ヘモグロビンＡ０ピークの形状
　参考例Ａでは、ヘモグロビンＡ０ピークのピークテール部分において、ピークは検出されない。実施例及び比較例で得られたヘモグロビンＡ０ピークのピークテールの形状を確認した。このピークテール部分において、ピークが検出されてない場合に、ヘモグロビンＡ０ピークの形状が良好と判定し、ピークが検出された場合に不良と判定した。
　なお、良好と判定されるクロマトグラムの例を図３（ａ）に示し、不良と判定されるクロマトグラムの例を図３（ｂ）に示した。
　ｉｉｉ）ファーストフラクションのピーク形状
　参考例Ａでは、ファーストフラクションのピークにおいて、ショルダーピークは検出されない。実施例及び比較例で得られたファーストフラクションのピーク形状を確認した。このファーストフラクションのピークにおいて、ショルダーピークが検出されてない場合に、ファーストフラクションのピーク形状が良好と判定し、ショルダーピークが検出された場合に不良と判定した。
　なお、良好と判定されるクロマトグラムの例を図４（ａ）に示し、不良と判定されるクロマトグラムの例を図４（ｂ）に示した。図４（ｂ）において矢印で示したピークがショルダーピークである。
　［ピーク分離パターンの判定基準］
　○：ｉ）～ｉｉｉ）の判定が全て良好
　×：ｉ）～ｉｉｉ）の判定のいずれかが不良
　（２－２）キャリーオーバー
　全血とヘモグロビン類測定用試薬とを混合した混合液を測定した後に続けて、ヘモグロビン類測定用試薬のみを５回連続して測定した。得られたクロマトグラムについて、以下のｉ）～ｉｉｉ）を確認した。
　ｉ）ヘモグロビンＡ０ピーク高さ
　１回目のヘモグロビン類測定用試薬の測定において、参考例Ａで得られたヘモグロビンＡ０のピーク高さと、実施例及び比較例で得られたヘモグロビンＡ０のピーク高さとを比較した。参考例Ａで得られたヘモグロビンＡ０のピーク高さに対して、得られたヘモグロビンＡ０のピーク高さが吸光度基準で１００以上増加していない場合に良好と判定し、１００を超えて増加している場合に不良と判定した。
　なお、参考例Ａで得られたクロマトグラムの例を図５（ａ）に示し、良好と判定されるクロマトグラムの例を図５（ｂ）に示し、不良と判定されるクロマトグラムの例を図５（ｃ）に示した。
　ｉｉ）ヘモグロビンＡ１ｃピークの有無
　１回目のヘモグロビン類測定用試薬の測定において、ヘモグロビンＡ１ｃピークの有無を確認した。ヘモグロビンＡ１ｃピークが観察されない場合に良好と判定し、ヘモグロビンＡ１ｃピークが観察される場合に不良と判定した。
　ｉｉｉ）ドリフトの発生の有無
　１回目のヘモグロビン類測定用試薬の測定において、ヘモグロビンＡ０ピークのドリフトの有無を確認した。ドリフトが観察されない場合に良好と判定し、ドリフトが観察される場合に不良と判定した。
　［キャリーオーバーの判定基準］
　○：ｉ）～ｉｉｉ）の判定が全て良好
　×：ｉ）～ｉｉｉ）の判定のいずれかが不良
　（３）ｐＨ
　参考例Ａ及び実施例で得られたヘモグロビン類測定用試薬のｐＨを、ｐＨ計（堀場製作所社製「Ｆ－５２」）を用いて測定した。
　（４）浸透圧
　参考例Ａ及び実施例で得られたヘモグロビン類測定用試薬の浸透圧を、浸透圧計（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製「オズモメーター３２５０」）を用いて測定した。
　組成及び結果を下記の表２～６に示す。なお、表２，３，５中、「Ｅ．Ｏ．」で表される値は、オキシエチレン基の平均付加モル数を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　実施例１～３０で得られたヘモグロビン類測定用試薬では、良好に溶血させることができ、かつ高い精度でヘモグロビン類を測定することができていることが理解できる。
　（参考例Ａ及び実施例３１～３８）
　表７に示す組成に変更したこと以外は、実施例１と同様にしてヘモグロビン類測定用試薬を調製した。
　（５）ヘモグロビン類測定用試薬の保存安定性
　参考例Ａ及び界面活性剤の濃度が０．５重量％である実施例３２，３４，３６～３８で得られたヘモグロビン類測定用試薬をそれぞれ、ガラス製バイアル瓶に密封し、６０℃で７日間保存した。保存後、目視にて、ヘモグロビン類測定用試薬の性状を確認した。
　一般に、ヘモグロビン類測定用試薬は室温で保存されるものである。本評価項目では、通常の保存条件よりも苛酷な温度条件でヘモグロビン類測定用試薬を保存し評価している。
　［ヘモグロビン類測定用試薬の保存安定性（６０℃、７日間）の判定基準］
　Ａ：相分離が生じない
　Ｂ：相分離が生じる
　（６）混合液の保存安定性
　（６－１）全血との混合液の保存安定性
　全血（赤血球含有検体）を用意した。また、参考例Ａ及び実施例３１～３６で得られたヘモグロビン類測定用試薬を用意した。全血を、ヘモグロビン類測定用試薬で１０１倍希釈し、混合液を得た。得られた混合液を、ガラス製バイアル瓶に収容し、４℃で保存した。保存前、保存後１日目，２日目，５日目，７日目，９日目に、「（２）陽イオン交換液体クロマトグラフィーによる測定」に記載の測定条件で混合液を繰り返し３回測定し、その平均値からヘモグロビンＡ１ｃ値及びヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量を求めた。
　ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）＝ヘモグロビンＡ１ｃのピーク面積／ヘモグロビンのピーク面積の合計
　ヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量（％）＝保存前のヘモグロビンＡ１ｃ値－保存後のヘモグロビンＡ１ｃ値
　図６（ａ）は全血との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値との関係を示す図である。図６（ｂ）は、全血との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。
　［全血との混合液の判定基準］
　○：５日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．２％以下である
　△：５日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．２％を超え０．４％以下である
　△△：５日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．４％を超え０．７％以下である
　×：５日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．７％を超える
　（６－２）測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ－Ｌ）との混合液の保存安定性
　ヘモグロビンＡ１ｃ値が５．８％である測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ－Ｌ）を用意した。また、参考例Ａ及び実施例３１～３６で得られたヘモグロビン類測定用試薬を用意した。測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ－Ｌ）を、ヘモグロビン類測定用試薬で１０１倍希釈し、混合液を得た。得られた混合液を、ガラス製バイアル瓶に収容し、４℃で保存した。保存前、保存後１日目，２日目，３日目，９日目，１４日目に、「（２）陽イオン交換液体クロマトグラフィーによる測定」での測定条件で混合液を繰り返し３回測定し、その平均値から上記と同様にしてヘモグロビンＡ１ｃ値及びヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量を求めた。
　図７（ａ）は測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ－Ｌ）との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値との関係を示す図である。図７（ｂ）は、測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ－Ｌ）との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。
　［測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ－Ｌ）との混合液の保存安定性の判定基準］
　○：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．２％以下である
　△：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．２％を超え０．４％以下である
　△△：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．４％を超え０．７％以下である
　×：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．７％を超える
　（６－３）測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ－Ｈ）との混合液の保存安定性
　測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ－Ｌ）を、ヘモグロビンＡ１ｃ値が１０．４％である測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ－Ｈ）に変更したこと以外は、「（６－２）測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ－Ｌ）との混合液の保存安定性」と同様にして、ヘモグロビンＡ１ｃ値及びヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量を求めた。
　図８（ａ）は測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ－Ｈ）との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値との関係を示す図である。図８（ｂ）は、測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ－Ｈ）との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。
　［測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ－Ｈ）との混合液の保存安定性の判定基準］
　○：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．２５％以下である
　△：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．２５％を超え０．４５％以下である
　△△：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．４５％を超え０．７５％以下である
　×：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．７５％を超える
　組成及び結果を下記の表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　実施例３１～３６で得られたヘモグロビン類測定用試薬では、実施例３７，３８で得られたヘモグロビン類測定用試薬と比べて、該試薬の保存安定性を高めることができた。また、実施例３１～３６で得られたヘモグロビン類測定用試薬では、該試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性も高めることができた。実施例３１～３６で得られたヘモグロビン類測定用試薬では、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液を長期間保存した後であっても、高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。
　（７）カラム耐久性
　全血（赤血球含有検体）と、ヘモグロビンＡ１ｃ値が１０．４％である測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ－Ｈ）と、参考例Ａ及び実施例３２で得られたヘモグロビン類測定用試薬とを用意した。全血を、ヘモグロビン類測定用試薬で１０１倍希釈し、液（１）を得た。また、測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質を、ヘモグロビン類測定用試薬で１０１倍希釈し、液（２）を得た。液（１）は、カラムに負荷を与えるための測定試料であり、液（２）は、ヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量及び理論段数の変化量を確認するための測定試料である。得られた液（１）及び液（２）を以下の手順及び条件で測定した。
　先ず、得られた液（２）を３回測定した。その後、得られた液（１）を複数回（数十回～２００回）カラムに通すごとに液（２）を３回測定した。カラムへの負荷検体数が約３０００検体となるまで、上記の手順に従って液（１）及び液（２）を繰り返し測定した。
　陽イオン交換クロマトグラフィー条件：
　ＨＰＬＣ装置：グリコヘモグロビン分析装置（アークレイ社製「ＨＡ－８１６０ＶＰ」）
　陽イオン交換カラム：カラムユニットＨＳＶＩ－ＶＰ（アークレイ社製）
　溶離液Ａ：溶離液６０Ａ－ＶＰ／ＴＰ（アークレイ社製）
　溶離液Ｂ：溶離液６０Ｂ－ＶＰ／ＴＰ（アークレイ社製）
　溶離液Ｃ：溶離液６０Ｃ－ＶＰ（アークレイ社製）
　ＨＰＬＣ装置に搭載されている測定メソッドを用いて、測定を行った。
　図９（ａ）はカラムへの負荷検体数と、ヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。図９（ｂ）はカラムへの負荷検体数と、理論段数の変化量との関係を示す図である。
　図９（ａ）において、縦軸は、最初に測定した液（２）におけるヘモグロビンＡ１ｃ値と、各負荷検体数で測定した液（２）におけるヘモグロビンＡ１ｃ値との差（最初に測定した液（２）におけるヘモグロビンＡ１ｃ値－各負荷検体数で測定した液（２）におけるヘモグロビンＡ１ｃ値）である。図９（ｂ）において、縦軸は、最初に測定した液（２）における理論段数と、各負荷検体数で測定した液（２）における理論段数との差（最初に測定した液（２）における理論段数－各負荷検体数で測定した液（２）における理論段数）である。
　実施例３２で得られたヘモグロビン類測定用試薬は、参考例Ａで得られたヘモグロビン類測定用試薬よりもカラム耐久性に優れていた。

Claims (7)

  1. 　陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるヘモグロビン類測定用試薬であって、
    　非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含み、
    　前記非イオン性界面活性剤が、下記成分Ａ１、下記成分Ａ２、下記成分Ａ３、下記成分Ａ４、下記成分Ａ５、下記成分Ａ６、下記成分Ａ７、下記成分Ａ８又は下記成分Ａ９であり、
    　前記両性界面活性剤が、下記成分Ｂ１、下記成分Ｂ２又は下記成分Ｂ３である、ヘモグロビン類測定用試薬。
    　成分Ａ１：オキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテル
    　成分Ａ２：オキシエチレン基の平均付加モル数が４０以上６０以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテル
    　成分Ａ３：オキシエチレン基の平均付加モル数が９以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテル
    　成分Ａ４：オキシエチレン基の平均付加モル数が６以上１０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン－ｓｅｃ－アルキルエーテル
    　成分Ａ５：オキシエチレン基の平均付加モル数が１５であるポリオキシエチレントリデシルエーテル
    　成分Ａ６：ＨＬＢ値が１１以上１５以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル
    　成分Ａ７：ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン
    　成分Ａ８：ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド
    　成分Ａ９：サポニン
    　成分Ｂ１：３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート
    　成分Ｂ２：３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシプロパンスルホネート
    　成分Ｂ３：ラウリルジメチルアミンオキサイド
  2. 　前記非イオン性界面活性剤を含み、
    　前記非イオン性界面活性剤が、前記成分Ａ１、前記成分Ａ２、前記成分Ａ３、前記成分Ａ４、前記成分Ａ５又は前記成分Ａ６を含み、
    　前記成分Ａ１が、オキシエチレン基の平均付加モル数が９、１２若しくは１９であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が１３若しくは２０であるポリオキシエチレンセチルエーテルであり、
    　前記成分Ａ２が、オキシエチレン基の平均付加モル数が５０であるポリオキシエチレンステアリルエーテルであり、
    　前記成分Ａ３が、オキシエチレン基の平均付加モル数が９又は１３であるポリオキシエチレンオレイルエーテルであり、
    　前記成分Ａ４が、オキシエチレン基の平均付加モル数が７又は９であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下のポリオキシエチレン－ｓｅｃ－アルキルエーテルであり、
    　前記成分Ａ６が、ＨＬＢ値が１２．５、１２．７又は１４．０であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルである、請求項１に記載のヘモグロビン類測定用試薬。
  3. 　前記非イオン性界面活性剤を含み、
    　前記非イオン性界面活性剤が、前記成分Ａ１又は前記成分Ａ３を含み、
    　前記成分Ａ１が、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテルであり、
    　前記成分Ａ３が、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテルである、請求項１に記載のヘモグロビン類測定用試薬。
  4. 　前記成分Ａ１が、オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が１３であるポリオキシエチレンセチルエーテルであり、
    　前記成分Ａ３が、オキシエチレン基の平均付加モル数が１３であるポリオキシエチレンオレイルエーテルである、請求項１～３のいずれか１項に記載のヘモグロビン類測定用試薬。
  5. 　前記非イオン性界面活性剤を含み、
    　前記非イオン性界面活性剤の含有量が、０．０１重量％以上１．０重量％以下である、請求項１～４のいずれか１項に記載のヘモグロビン類測定用試薬。
  6. 　前記両性界面活性剤を含み、
    　前記両性界面活性剤の含有量が、０．０１重量％以上１．０重量％以下である、請求項１～５のいずれか１項に記載のヘモグロビン類測定用試薬。
  7. 　赤血球含有検体と、請求項１～６のいずれか１項に記載のヘモグロビン類測定用試薬とを混合して混合液を得る工程と、
    　前記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する工程とを備える、ヘモグロビン類の測定方法。
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