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WO2019188867A1 - 細胞内動態を改善した新規カチオン性脂質 - Google Patents

細胞内動態を改善した新規カチオン性脂質 Download PDF

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WO2019188867A1
WO2019188867A1 PCT/JP2019/012302 JP2019012302W WO2019188867A1 WO 2019188867 A1 WO2019188867 A1 WO 2019188867A1 JP 2019012302 W JP2019012302 W JP 2019012302W WO 2019188867 A1 WO2019188867 A1 WO 2019188867A1
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WO
WIPO (PCT)
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group
carbon atoms
nucleic acid
cationic lipid
lipid
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/012302
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English (en)
French (fr)
Inventor
悠太 中井
耕太 丹下
宏樹 吉岡
晋也 玉川
英万 秋田
浩揮 田中
奈依 高田
真奈美 小西
達成 ▲高▼橋
Original Assignee
日油株式会社
国立大学法人千葉大学
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a cationic lipid having improved intracellular kinetics, a lipid membrane structure containing the cationic lipid, and uses thereof.
  • Viral vectors are nucleic acid delivery carriers with good expression efficiency, but have practical problems from the viewpoint of safety. Therefore, development of a non-viral nucleic acid delivery carrier that can be used more safely has been developed, and among them, a carrier using a cationic lipid is the most commonly used non-viral nucleic acid delivery carrier.
  • Cationic lipids are roughly composed of an amine moiety and a lipid moiety, and a cationic amine moiety and a polyanion nucleic acid interact electrostatically to form a positively charged liposome or lipid membrane structure. Thus, uptake into cells is promoted and nucleic acids are delivered into cells.
  • Non-patent document 1 Examples of known cationic lipids that are widely used include DOTAP and DODAP. These known cationic lipids, when combined with phospholipids, form positively charged liposomes or lipid membrane structures that can interact with nucleic acids electrostatically to deliver nucleic acids to target cells.
  • a lipid membrane structure using a cationic lipid in order for a lipid membrane structure using a cationic lipid to exhibit a practical effect in vivo as a nucleic acid delivery carrier, it has good pharmacokinetics, specifically, stability in blood. It is necessary to satisfy requirements such as high density and high accumulation on a target such as a tumor. To solve this problem, the pKa on the surface of the lipid membrane structure is adjusted to near neutral, and the lipid membrane structure into which PEG lipids are introduced has a long blood life after intravenous injection and accumulates at the tumor site. It has been known.
  • Cationic lipids with improved pharmacokinetics have been developed in this way.
  • nucleic acid delivery carriers that generally introduce foreign substances into cells, it is desirable to exert a large effect with a small amount of uptake. ing. That is, when a lipid membrane structure is used as a carrier for delivering an expression vector into a cell, it is required to increase the expression level per unit lipid membrane structure incorporated into the cell and increase the expression efficiency in the cell. It has been.
  • intracellular kinetics such as uptake into cells, escape from endosomes, and nuclear membrane permeation in addition to pharmacokinetics.
  • transfer in a cell it is known that it is necessary to dissociate a nucleic acid from a carrier and to improve the binding property with a transcription factor (nonpatent literature 2).
  • nucleic acid delivery carrier it is necessary for the nucleic acid delivery carrier to improve not only the pharmacokinetics but also the intracellular kinetics, and in particular, it is important to promote cell uptake, endosome escape, and nucleic acid release from the carrier. It becomes. There are the following reports about these examples of improvement in intracellular kinetics.
  • Patent Document 1 describes an example in which the amount of uptake into cells is increased.
  • This document describes a cationic lipid containing a large number of amino groups for the purpose of increasing the amount taken up into cells.
  • the lipid membrane structure containing this cationic lipid can increase the amount of uptake into the cell, but on the other hand, since it has many amino groups that interact with nucleic acids, The nucleic acid dissociation is suppressed, and improvement in nucleic acid delivery efficiency cannot be expected.
  • Non-Patent Document 3 Non-Patent Document 4
  • the structure around the amino group of the cationic lipid is modified to adjust the pKa on the surface of the lipid membrane structure to a value favorable for endosome escape.
  • the escape of the lipid membrane structure from the endosome is promoted and the nucleic acid can be efficiently delivered into the cytoplasm.
  • not all lipid membrane structures having an appropriate pKa show high nucleic acid delivery efficiency, and for the cationic lipids of these documents, there are no effects on the effects other than the ability to adjust the pKa of the lipid membrane structure. There is no description.
  • Non-Patent Document 5 membrane fusion ability (hemolysis activity) is evaluated as one index of endosome escape ability. It is stated that the membrane fusion ability is changed by modifying the structure of the cationic lipid constituting the lipid membrane structure, and the membrane fusion ability in the endosomal environment affects the nucleic acid delivery efficiency. However, there is no description as to what specific structure improves membrane fusion ability.
  • Patent Documents 2 and 3 there are examples in which dissociation of nucleic acid from a lipid membrane structure is promoted in cells.
  • Patent Documents 2 and 3 a cationic lipid having a structure in which compounds composed of one or two amine moieties and one lipid moiety are linked by a biodegradable disulfide bond is described.
  • the cationic lipid can improve pharmacokinetics such as blood stability and tumor targeting, and the pKa as a lipid membrane structure can be changed by changing the structure around the amine site.
  • nucleic acid delivery carrier such as promoting cellular uptake, endosome escape, and dissociation of nucleic acid from the carrier.
  • efficiency of nucleic acid delivery to cells achieved by lipid membrane structures using these cationic lipids is still not fully satisfactory, and further improvements Is required.
  • An object of the present invention is to achieve a further improvement in intracellular kinetics that could not be achieved by the prior art, a cationic lipid that can be used as a nucleic acid delivery carrier, a lipid membrane structure using the cationic lipid, and the It is to provide a nucleic acid introduction agent using a cationic lipid.
  • Another object of the present invention is to provide a method for achieving nucleic acid introduction using a nucleic acid introduction agent containing a cationic lipid.
  • a cationic lipid that can adjust the pKa of a lipid membrane structure that affects endosome escape efficiency and has high membrane fusion ability.
  • it is a cationic lipid having a structure in which an aromatic ring is introduced in the vicinity of a lipid site and a compound in which this is bonded to an amine site is linked by a disulfide bond. The bond is cleaved, and the nucleic acid is also dissociated from the lipid membrane structure.
  • the lipid membrane structure containing this novel cationic lipid has a high membrane fusion ability in the endosomal environment and has a high endosomal escape efficiency, and thus has been found to be able to efficiently deliver nucleic acids into the cytoplasm.
  • R 1a and R 1b each independently represents an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group, or 2 to 5 carbon atoms
  • R 2a and R 2b each independently represent an alkylene group having 8 or less carbon atoms or an oxydialkylene group
  • Y a and Y b each independently represent an ester bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond or a urea bond
  • Z a and Z b are each independently a divalent group derived from an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms, having at least one aromatic ring, and optionally having a hetero atom.
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride, or a sterol derivative having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric acid. It represents a residue derived from a reaction product with an anhydride, or an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms. ) (Sometimes abbreviated as “cationic lipid (1)” in the present specification).
  • Z a and Z b are each independently Z 1 :
  • X a and X b are each independently a cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 to 2 tertiary amino groups.
  • the cationic lipid of any one of.
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride, or an aliphatic hydrocarbon having 12 to 22 carbon atoms
  • the cationic lipid according to any one of [1] to [4], which is a group.
  • a lipid membrane structure comprising the cationic lipid according to any one of [1] to [7] as a constituent lipid of the membrane.
  • a nucleic acid introduction agent comprising the cationic lipid according to any one of [1] to [7] or the lipid membrane structure according to [8].
  • a method for introducing the nucleic acid into the cell comprising contacting the nucleic acid-introducing agent according to [9] and the cell in vitro with the nucleic acid encapsulated.
  • a method for introducing the nucleic acid into the cell comprising administering the nucleic acid introduction agent according to [9] encapsulating the nucleic acid to a living body so as to be delivered to the target cell.
  • the present invention relates to an ester having a tertiary amino group and an aromatic ring, a lipid moiety, and a cationic lipid having a disulfide bond as a biodegradable group, and a lipid membrane structure containing the same.
  • the cationic lipid of the present invention can form a lipid membrane structure, and can be used as a nucleic acid introduction agent containing the cationic lipid.
  • the cationic lipid of the present invention can adjust the pKa of the lipid membrane structure that affects the efficiency of endosomal escape, and in addition, it has a high membrane fusion ability in the endosomal environment, thus promoting endosomal escape.
  • the disulfide bond contained in the cationic lipid of the present invention is cleaved in the reducing environment in the cell, and the release of the inclusion (nucleic acid) is promoted. Therefore, the nucleic acid introduction agent using the cationic lipid of the present invention can achieve high nucleic acid delivery efficiency into the cytoplasm.
  • nucleic acid When nucleic acid is introduced using the cationic lipid of the present invention or a lipid membrane structure containing the cationic lipid, nucleic acid degradation by serum components is suppressed. Therefore, introduction of nucleic acid in the presence of serum or in vivo It is advantageous for nucleic acid introduction.
  • FIG. 5 shows the hemolysis activity (membrane fusion ability) of LNP prepared from the cationic lipid (O-Ph-P4C2) of the present invention at pH 7.4 and 5.5.
  • FIG. 2 is a diagram showing hemolysis activity at various lipid concentrations at pH 5.5 of various LNPs prepared from the cationic lipids of the present invention (O-Ph-P4C2 and O-Bn-P4C2) and Comparative Example 1.
  • FIG. 3 shows in vitro gene expression activities of the cationic lipids of the present invention (O-Ph-P4C1, O-Ph-P4C2) and various LNPs prepared from Comparative Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing in vitro gene expression activities of various types of LNPs prepared from the cationic lipids of the present invention (O-Ph-P4C2 and O-Bn-P4C2) and Comparative Example 1.
  • 2 shows in vivo gene expression activities of the cationic lipids of the present invention (O-Ph-P4C2 and O-Bn-P4C2), various LNPs prepared from Comparative Example 1, and a commercially available gene introduction reagent TransIT (registered trademark). It is a figure.
  • FIG. 2 is a graph showing the knockdown activity of FVII gene in vivo for the cationic lipids (O-Ph-P4C2, O-Bn-P4C2) of the present invention and various LNPs prepared from Comparative Example 1.
  • the cationic lipids of the present invention (O-Ph-P4C2, E-Ph-P4C2, HD-Ph-P4C2, O-Ph-amide-P4C2) and various LNPs prepared from Comparative Example 1 at pH 7.4 and pH 5 5 shows the hemolytic activity (membrane fusion ability) at .5.
  • FIG. 3 is a graph showing the total amount of gene expression in vitro of LNP prepared from the cationic lipid (O-Ph-P4C2) of the present invention and a gene introduction reagent (Lipofectamine MessengerMAX).
  • FIG. 3 is a graph showing the homogeneity of gene expression in cells in vitro of LNP and a gene introduction reagent prepared from the cationic lipid (O-Ph-P4C2) of the present invention.
  • FIG. 3 shows in vivo (subcutaneous) gene expression activities of the cationic lipid (E-Ph-P4C2) of the present invention and various LNPs prepared from Comparative Example 2.
  • the present invention provides a cationic lipid represented by the formula (1).
  • R 1a and R 1b each independently represents an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, and may be linear or branched, but is preferably linear.
  • the alkylene group preferably has 1 to 4 carbon atoms, more preferably 1 to 2.
  • Specific examples of the alkylene group having 1 to 6 carbon atoms include a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, an isopropylene group, a tetramethylene group, an isobutylene group, a pentamethylene group, and a neopentylene group.
  • R 1a and R 1b are preferably each independently a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, an isopropylene group, or a tetramethylene group, and most preferably an ethylene group.
  • R 1a may be different be the same as R 1b, but preferably, R 1a is the same group as R 1b.
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group, or 2 to 5 carbon atoms, and A cyclic alkylene tertiary amino group having 1 to 2 tertiary amino groups, preferably each independently a cyclic alkylene having 2 to 5 carbon atoms and 1 to 2 tertiary amino groups An alkylene tertiary amino group.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms in the acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group is branched even if it is linear. Or may be annular.
  • the alkyl group preferably has 1 to 3 carbon atoms. Specific examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, pentyl group, and isopentyl group.
  • Neopentyl group, t-pentyl group, 1,2-dimethylpropyl group, 2-methylbutyl group, 2-methylpentyl group, 3-methylpentyl group, 2,2-dimethylbutyl group, 2,3-dimethylbutyl group, A cyclohexyl group etc. can be mentioned, Preferably they are a methyl group, an ethyl group, a propyl group, or an isopropyl group, Most preferably, it is a methyl group.
  • a preferred specific structure of an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group is represented by X 1 .
  • R 5 of X 1 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and may be linear, branched or cyclic.
  • the alkyl group preferably has 1 to 3 carbon atoms.
  • Specific examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, pentyl group, and isopentyl group.
  • Neopentyl group, t-pentyl group, 1,2-dimethylpropyl group, 2-methylbutyl group, 2-methylpentyl group, 3-methylpentyl group, 2,2-dimethylbutyl group, 2,3-dimethylbutyl group, A cyclohexyl group etc. can be mentioned, Preferably they are a methyl group, an ethyl group, a propyl group, or an isopropyl group, Most preferably, it is a methyl group.
  • the number of carbon atoms in the cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 to 2 tertiary amino groups is preferably 4 to 5.
  • Specific examples of the cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 to 2 tertiary amino groups include aziridylene group, azetidylene group, pyrrolidylene group, piperidylene group, imidazolidylene group, A piperazylene group, preferably a pyrrolidylene group, a piperidylene group or a piperazylene group, and most preferably a piperidylene group.
  • Number is 2 to 5 carbon atoms, and preferred specific structure of alkylene tertiary amino groups containing 1 annular tertiary amino group represented by X 2.
  • P of X 2 is 1 or 2.
  • X 2 is a pyrrolidylene group
  • X 2 is a piperidylene group.
  • a preferred specific structure of a cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 2 tertiary amino groups is represented by X 3 .
  • W of X 3 is 1 or 2.
  • X 3 is an imidazolidylene group
  • X 3 is a piperazylene group.
  • X a may be different be identical to X b, but preferably, X a is X b the same group.
  • R 2a and R 2b each independently represent an alkylene group or an oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms, preferably each independently an alkylene group having 8 or less carbon atoms.
  • the alkylene group having 8 or less carbon atoms may be linear or branched, but is preferably linear.
  • the number of carbon atoms contained in the alkylene group is preferably 6 or less, and most preferably 4 or less.
  • Specific examples of the alkylene group having 8 or less carbon atoms include methylene group, ethylene group, propylene group, isopropylene group, tetramethylene group, isobutylene group, pentamethylene group, hexamethylene group, heptamethylene group, octamethylene group, and the like.
  • Preferred are a methylene group, an ethylene group, a propylene group, and a tetramethylene group, and most preferred is an ethylene group.
  • the oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms refers to an alkylene group (alkylene-O-alkylene) via an ether bond, and the total number of carbon atoms of two alkylene groups is 8 or less.
  • the two alkylenes may be the same or different, but are preferably the same.
  • Specific examples of the oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms include an oxydimethylene group, an oxydiethylene group, an oxydipropylene group, and an oxydibutylene group. Preferred are an oxydimethylene group, an oxydiethylene group, and an oxydipropylene group, and most preferred is an oxydiethylene group.
  • R 2a may be the be the same or different and R 2b, but preferably, R 2a is the same group as R 2b.
  • Y a and Y b are each independently an ester bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond or a urea bond, preferably each independently an ester bond, an amide bond or a carbamate bond, more preferably each Independently, an ester bond or an amide bond, and most preferably an ester bond. While Y binding orientation of a and Y b are not limited, if Y a and Y b is an ester bond, preferably, -Z a -CO-O-R 2a - and -Z b -CO-O-R 2b -Structure.
  • Y a may be different even identical to Y b, but preferably, Y a is Y b and same group.
  • Z a and Z b are each independently a divalent group derived from an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms, having at least one aromatic ring, and optionally having a hetero atom. Represents.
  • the number of carbon atoms contained in the aromatic compound is preferably 6 to 12, and most preferably 6 to 7.
  • the number of aromatic rings contained in the aromatic compound is preferably one.
  • aromatic rings contained in the aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms as for aromatic hydrocarbon rings, benzene ring, naphthalene ring, anthracene ring, and aromatic heterocycles as imidazole ring, pyrazole ring, oxazole ring, Isoxazole ring, thiazole ring, isothiazole ring, triazine ring, pyrrole ring, furanthiophene ring, pyrimidine ring, pyridazine ring, pyrazine ring, pyridine ring, purine ring, pteridine ring, benzimidazole ring, indole ring, benzofuran ring, quinazoline Ring, phthalazine ring, quinoline ring, isoquinoline ring, coumarin ring, chromone ring, benzodiazepine ring, phenoxazine ring, phenothi
  • the aromatic ring may have a substituent.
  • substituents include an acyl group having 2 to 4 carbon atoms, an alkoxycarbonyl group having 2 to 4 carbon atoms, a carbamoyl group having 2 to 4 carbon atoms, and 2 to 2 carbon atoms.
  • acyloxy groups acylamino groups having 2 to 4 carbon atoms, alkoxycarbonylamino groups having 2 to 4 carbon atoms, fluorine atoms, chlorine atoms, bromine atoms, iodine atoms, alkylsulfanyl groups having 1 to 4 carbon atoms, 1 carbon atom Alkylsulfonyl group having 4 to 4, arylsulfonyl group having 6 to 10 carbon atoms, nitro group, trifluoromethyl group, cyano group, alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, ureido group having 1 to 4 carbon atoms, 1 to carbon atoms 4 alkoxy groups, aryl groups having 6 to 10 carbon atoms, aryloxy groups having 6 to 10 carbon atoms, and the like.
  • Preferred examples include acetyl groups, methoxycarbonyl groups, methyl carbonate groups, and the like. Moyl group, acetoxy group, acetamide group, methoxycarbonylamino group, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, methylsulfanyl group, phenylsulfonyl group, nitro group, trifluoromethyl group, cyano group, methyl group, ethyl group Propyl group, isopropyl group, t-butyl group, ureido group, methoxy group, ethoxy group, propoxy group, isopropoxy group, t-butoxy group, phenyl group and phenoxy group.
  • a preferred specific structure of Z a and Z b includes Z 1 .
  • s represents an integer of 0 to 3
  • t represents an integer of 0 to 3
  • u represents an integer of 0 to 4
  • R 4 represents a u-number of R 4 is independently a substituent.
  • S in Z 1 is preferably an integer of 0 to 1, more preferably 0.
  • T in Z 1 is preferably an integer of 0 to 2, more preferably 1.
  • U in Z 1 is preferably an integer of 0 to 2, more preferably an integer of 0 to 1.
  • R 4 in Z 1 is a substituent of an aromatic ring (benzene ring) contained in an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms that does not inhibit the reaction in the process of synthesizing the cationic lipid.
  • the substituent include an acyl group having 2 to 4 carbon atoms, an alkoxycarbonyl group having 2 to 4 carbon atoms, a carbamoyl group having 2 to 4 carbon atoms, an acyloxy group having 2 to 4 carbon atoms, and an acylamino group having 2 to 4 carbon atoms.
  • Z a may be different even identical to the Z b, but preferably, Z a is Z b the same group.
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride, or a sterol derivative having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric acid.
  • a C 12-22 aliphatic hydrocarbon group and most preferably each independently an aliphatic hydrocarbon group having 12-22 carbon atoms.
  • the fat-soluble vitamin having a hydroxyl group examples include retinol, ergosterol, 7-dehydrocholesterol, calciferol, corcalciferol, dihydroergocalciferol, dihydrotaxolol, tocopherol, and tocotrienol.
  • the fat-soluble vitamin having a hydroxyl group is preferably tocopherol.
  • Examples of the sterol derivative having a hydroxyl group include cholesterol, cholestanol, stigmasterol, ⁇ -sitosterol, lanosterol, ergosterol and the like, preferably cholesterol or cholestanol.
  • the aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms may be linear or branched.
  • the aliphatic hydrocarbon group may be saturated or unsaturated.
  • the number of unsaturated bonds contained in the aliphatic hydrocarbon group is usually 1 to 6, preferably 1 to 3, and more preferably 1 to 2.
  • Unsaturated bonds include carbon-carbon double bonds and carbon-carbon triple bonds, with carbon-carbon double bonds being preferred.
  • the number of carbon atoms contained in the aliphatic hydrocarbon group is preferably 13 to 19, and most preferably 13 to 17.
  • the aliphatic hydrocarbon group includes an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group and the like, and preferably includes an alkyl group or an alkenyl group.
  • Specific examples of the aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms include dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl, icosyl, heicosyl, docosyl , Dodecenyl group, tridecenyl group, tetradecenyl group, pentadecenyl group, hexadecenyl group, heptadecenyl group, octadecenyl group, nonadecenyl group, icocenyl group, henicocenyl group, dococenyl group
  • the aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms is preferably a tridecyl group, a pentadecyl group, a heptadecyl group, a nonadecyl group, a heptadecenyl group, a heptadecadienyl group, or a 1-hexylnonyl group, particularly preferably a tridecyl group, A heptadecyl group, a heptadecenyl group, and a heptadecadienyl group.
  • the aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms represented by R 3a and R 3b is derived from a fatty acid.
  • the carbonyl carbon derived from the fatty acid is contained in —CO—O— in the formula (1).
  • Specific examples of the aliphatic hydrocarbon group include a heptadecenyl group when linoleic acid is used as the fatty acid, and a heptadecenyl group when oleic acid is used as the fatty acid.
  • R 3a may be different be the same as R 3b, but preferably, R 3a is the same group as R 3b.
  • R 1a is the same as R 1b
  • X a is the same as X b
  • R 2a is the same as R 2b
  • Y a is the same as Y b
  • Z a is is identical to the Z b
  • R 3a is the same as R 3b.
  • cationic lipid represented by the formula (1) of the present invention include the following cationic lipids.
  • R 1a and R 1b are each independently an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms (eg, methylene group, ethylene group);
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group (eg, —N (CH 3 ) —), Or a cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 to 2 tertiary amino groups (eg, piperidylene group);
  • R 2a and R 2b are each independently an alkylene group having 8 or less carbon atoms (eg, methylene group, ethylene group, propylene group);
  • Y a and Y b are each independently an ester bond or an amide bond;
  • Z a and Z b are each independently a and Z b are
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group (eg, tocopherol) and succinic anhydride or glutaric anhydride, or an aliphatic group having 12 to 22 carbon atoms
  • a hydrocarbon group eg, heptadecenyl group, heptadecadienyl group, 1-hexylnonyl group
  • Cationic lipid (1) e.g, heptadecenyl group, heptadecadienyl group, 1-hexylnonyl group.
  • R 1a and R 1b are each independently an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms (eg, methylene group, ethylene group);
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 3 carbon atoms and 1 tertiary amino group (eg, —N (CH 3 ) —), Or a cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 tertiary amino group (eg, piperidylene group);
  • R 2a and R 2b are each independently an alkylene group having 6 or less carbon atoms (eg, methylene group, ethylene group, propylene group);
  • Y a and Y b are each independently an ester bond or an amide bond;
  • Z a and Z b are each independently a divalent group derived from an aromatic compound having 6 to 12 carbon atoms, one aromatic ring, and optionally having a hetero atom
  • R 1a and R 1b are each independently an alkylene group having 1 to 2 carbon atoms (eg, methylene group, ethylene group);
  • X a and X b are each independently X 1 :
  • R 5 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms (eg, a methyl group)
  • X 2 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms (eg, a methyl group)
  • R 2a and R 2b are each independently an alkylene group having 4 or less carbon atoms (eg, methylene group, ethylene group, propylene group); Y a and Y b are each independently an ester bond or an amide bond; Z a and Z b are each independently Z 1 :
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group (eg, tocopherol) and succinic anhydride, or an aliphatic hydrocarbon group having 13 to 17 carbon atoms (eg, , Heptadecenyl group, heptadecadienyl group, 1-hexylnonyl group); Cationic lipid (1).
  • cationic lipid (1) of the present invention include the following O-Ph-P3C1, O-Ph-P4C1, O-Ph-P4C2, O-Bn-P4C2, E-Ph-P4C2, L-Ph- P4C2, HD-Ph-P4C2, O-Ph-amide-P4C2, and O-Ph-C3M can be mentioned.
  • the cationic lipid (1) of the present invention has a —SS— (disulfide) bond. Therefore, as a manufacturing method, an SH (thiol) compound having R 3a —CO—O—Z a —Y a —R 2a —X a —R 1a —, and R 3b —CO—O—Z b —Y b After producing SH (thiol) compounds having —R 2b —X b —R 1b —, these are oxidized (coupled) to obtain the cationic lipid (1) of the present invention containing an —S—S— bond. Examples thereof include a method, a method of sequentially synthesizing necessary portions of a compound containing a —SS— bond, and finally obtaining the cationic lipid (1) of the present invention. The latter method is preferable.
  • Starting compounds include: both terminal carboxylic acids containing —S—S— bonds, both terminal amines, both terminal isocyanates, both terminal alcohols, both terminal alcohols having leaving groups such as methanesulfonyl groups, p-nitrophenyl carbonate groups And both-terminal carbonates having a leaving group such as
  • R 1a and R 1b are the same and R 1
  • X a and X b are the same and X
  • R 2a and R 2b are the same and R 2
  • Y a and Y b are the same and Y
  • the target formula A cationic lipid product of 1 ′
  • compound (III) can be produced by the method described in Patent Document 2 or Patent Document 3.
  • a basic catalyst such as potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydroxide, triethylamine, 4-dimethylaminopyridine (hereinafter referred to as “DMAP”) is used as a catalyst.
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • the reaction may be carried out in the presence of an acid catalyst such as p-toluenesulfonic acid or methanesulfonic acid, or without a catalyst.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • the compound (IV) may be reacted directly with the compound (V) using a condensing agent such as), or the compound (IV) may be converted into an anhydride using a condensing agent and then the compound. You may make it react with (V).
  • the amount of compound (IV) to be charged is usually 1 to 50 mol equivalent, preferably 1 to 10 mol equivalent, relative to compound (V).
  • the catalyst used for the reaction between compound (IV) and compound (V) may be appropriately selected depending on the type of compound to be reacted.
  • the amount of the catalyst is usually 0.05 to 100 mol equivalent, preferably 0.1 to 20 mol equivalent, more preferably 0.1 to 5 mol equivalent based on the compound (V).
  • the solvent used for the reaction between the compound (IV) and the compound (V) may be any solvent that does not inhibit the reaction, and can be used without any particular limitation.
  • water, ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, toluene and the like can be mentioned. Of these, chloroform and toluene are preferred.
  • the reaction temperature is usually 0 to 150 ° C., preferably 0 to 80 ° C., more preferably 10 to 50 ° C.
  • the reaction time is usually 1 to 48 hours, preferably 1 to 24 hours.
  • the reaction product (VI) obtained by the above reaction can be appropriately purified by a general purification method such as extraction purification, recrystallization, adsorption purification, reprecipitation, column chromatography, ion exchange chromatography and the like.
  • potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydroxide, triethylamine, 4-dimethylamino is used as a catalyst.
  • a base catalyst such as pyridine may be used, and the reaction may be performed in the presence of an acid catalyst such as p-toluenesulfonic acid and methanesulfonic acid, or without a catalyst.
  • a condensing agent such as DCC, DIC, or EDC may be used to directly react compound (III) with compound (VI), or compound (VI) may be anhydrided using a condensing agent. After conversion to the above, it may be reacted with compound (III).
  • the amount of compound (VI) to be charged is usually 1 to 50 mol equivalent, preferably 1 to 10 mol equivalent, relative to compound (III).
  • the catalyst used for the reaction between the compound (III) and the compound (VI) may be appropriately selected depending on the type of compound to be reacted.
  • the amount of the catalyst is usually 0.05 to 100 mol equivalents, preferably 0.1 to 20 mol equivalents, more preferably 0.1 to 5 mol equivalents relative to compound (III).
  • the solvent used for the reaction between the compound (III) and the compound (VI) may be any solvent that does not inhibit the reaction, and can be used without any particular limitation.
  • water, ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, toluene and the like can be mentioned. Of these, chloroform and toluene are preferred.
  • the reaction temperature is usually 0 to 150 ° C., preferably 0 to 80 ° C., more preferably 10 to 50 ° C.
  • the reaction time is usually 1 to 48 hours, preferably 1 to 24 hours.
  • the cationic lipid (1) of the present invention obtained by the above reaction is appropriately purified by a general purification method such as extraction purification, recrystallization, adsorption purification, reprecipitation, column chromatography, ion exchange chromatography and the like. Can do.
  • the lipid membrane structure of the present invention contains the cationic lipid of the present invention, that is, the cationic lipid represented by the general formula (1) as a constituent of the membrane.
  • the “lipid membrane structure” in the present invention means a particle having a membrane structure in which hydrophilic groups of amphiphilic lipids are arranged toward the aqueous phase side of the interface.
  • Amphiphilic lipid means a lipid having both a hydrophilic group exhibiting hydrophilicity and a hydrophobic group exhibiting hydrophobicity. Examples of amphiphilic lipids include cationic lipids and phospholipids.
  • the form of the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited.
  • liposomes for example, monolayer liposomes, multilamellar liposomes, etc.
  • O / W type examples thereof include emulsions, W / O type emulsions, spherical micelles, string micelles, lipid nanoparticles (hereinafter referred to as “LNP”) or unspecified layered structures.
  • LNP lipid nanoparticles
  • the lipid membrane structure of the present invention is preferably a liposome.
  • the lipid membrane structure of the present invention is preferably LNP.
  • the lipid membrane structure of the present invention may further contain other components in addition to the cationic lipid of the present invention.
  • the other components include lipids (phospholipids (such as phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine), glycolipids, peptide lipids, cholesterol, Cationic lipids other than cationic lipids, PEG lipids, etc.), surfactants (eg 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] propane sulfonate, cholic acid sodium salt, octyl glycoside, ND-gluco -N-methylalkanamides), polyethylene glycol, proteins and the like.
  • the content of the other constituents in the lipid membrane structure of the present invention is usually 5 to 95 mol%, preferably 10 to 90 mol%, more preferably 30 to
  • the content of the cationic lipid of the present invention contained in the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited. Usually, in order to introduce a nucleic acid when the lipid membrane structure is used as a nucleic acid introduction agent described later. A sufficient amount of the cationic lipid of the present invention is included. For example, it is 5 to 100 mol%, preferably 10 to 90 mol%, more preferably 20 to 70 mol% of the total lipid.
  • the lipid membrane structure of the present invention is prepared by dispersing the cationic lipid of the present invention and other components (lipids, etc.) in a suitable solvent or dispersion medium, for example, an aqueous solvent or an alcoholic solvent, and if necessary, tissue It can be prepared by performing an operation that induces crystallization.
  • a suitable solvent or dispersion medium for example, an aqueous solvent or an alcoholic solvent, and if necessary, tissue It can be prepared by performing an operation that induces crystallization.
  • Examples of the “operation for inducing organization” include an ethanol dilution method using a microchannel or a vortex, a simple hydration method, an ultrasonic treatment, a heating, a vortex, an ether injection method, a French press method, and a cholic acid method. Examples thereof include, but are not limited to, methods known per se such as Ca 2+ fusion method, freeze-thaw method, and reverse phase evaporation method.
  • the nucleic acid can be introduced into the cell in vivo and / or in vitro by encapsulating the nucleic acid in the lipid membrane structure containing the cationic lipid of the present invention and bringing it into contact with the cell. Therefore, the present invention provides a nucleic acid introduction agent comprising the cationic lipid or lipid membrane structure of the present invention.
  • the nucleic acid introduction agent of the present invention can introduce any nucleic acid into cells.
  • the nucleic acid include, but are not limited to, DNA, RNA, RNA chimeric nucleic acid, DNA / RNA hybrid, and the like.
  • the nucleic acid can be any one of 1 to 3 strands, but is preferably single strand or double strand.
  • Nucleic acids may be other types of nucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, or other oligomers having a non-nucleotide backbone (eg, commercially available peptide nucleic acids (PNA), etc.) or other oligomers with special linkages (However, the oligomer may contain nucleotides having a configuration that allows base pairing or base attachment as found in DNA or RNA).
  • the nucleic acid may be substituted with, for example, a known modified nucleic acid, a labeled nucleic acid, a capped nucleic acid, a methylated nucleic acid, or one or more natural nucleotides known in the art.
  • Nucleic acids intramolecular nucleotide modified nucleic acids, nucleic acids with uncharged bonds (eg methyl sulfonate, phosphotriester, phosphoramidate, carbamate, etc.), charged bonds or sulfur containing bonds (eg phosphorothioate, phospho Having side chain groups such as proteins (eg, nucleases, nuclease inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monosaccharides).
  • uncharged bonds eg methyl sulfonate, phosphotriester, phosphoramidate, carbamate, etc.
  • sulfur containing bonds eg phosphorothioate, phospho Having side chain groups
  • proteins eg, nucleases, nuclease inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.
  • sugars eg, monosaccharides
  • Nucleic acids and nucleic acids with intercurrent compounds eg, acridine, psoralen, etc.
  • Nucleic acids containing chelate compounds eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.
  • nucleic acids containing alkylating agents eg, alpha anomeric nucleic acids, etc.
  • nucleic acids with modified bonds eg, alpha anomeric nucleic acids, etc.
  • the type of DNA that can be used in the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the purpose of use.
  • Examples include plasmid DNA, cDNA, antisense DNA, chromosomal DNA, PAC, BAC, CpG oligo and the like, preferably plasmid DNA, cDNA, and antisense DNA, and more preferably plasmid DNA.
  • Circular DNA such as plasmid DNA can be appropriately digested with a restriction enzyme or the like and used as linear DNA.
  • RNA that can be used in the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the purpose of use.
  • siRNA, miRNA, shRNA, antisense RNA messenger RNA (mRNA), single-stranded RNA genome, double-stranded RNA genome, RNA replicon, transfer RNA, ribosomal RNA, etc., preferably siRNA, miRNA, shRNA, mRNA, antisense RNA, RNA replicon.
  • the nucleic acid used in the present invention is preferably purified by a method commonly used by those skilled in the art.
  • the nucleic acid-introducing agent of the present invention encapsulating nucleic acid can be administered in vivo for the purpose of, for example, prevention and / or treatment of diseases.
  • the nucleic acid used in the present invention is preferably a nucleic acid having preventive and / or therapeutic activity against a given disease (prophylactic / therapeutic nucleic acid).
  • examples of such nucleic acids include nucleic acids used for so-called gene therapy.
  • the nucleic acid was encapsulated by coexisting the target nucleic acid when forming the lipid membrane structure of the present invention.
  • the lipid membrane structure of the present invention is formed.
  • the aqueous solution of nucleic acid and the ethanol solution of the components of the lipid membrane structure of the present invention are vigorously mixed by vortex or microchannel, etc. Is diluted with an appropriate buffer.
  • the components (lipids, etc.) of the lipid membrane structure of the present invention are dissolved in an appropriate organic solvent, the solution is placed in a glass container, and the solvent is retained by drying under reduced pressure. Leave to obtain a lipid film.
  • an aqueous solution of nucleic acid is added and hydrated, followed by sonication with a sonicator.
  • the present invention also provides the above lipid membrane structure in which such a nucleic acid is encapsulated.
  • LNP lipid membrane structure in which a nucleic acid is encapsulated
  • This LNP can be used as a drug delivery system for selectively delivering a nucleic acid or the like into a specific cell.
  • a DNA vaccine by introducing an antigen gene into a dendritic cell, a gene therapy drug for a tumor, RNA It is useful for nucleic acid drugs that suppress the expression of target genes using interference.
  • the particle diameter of the lipid membrane structure of the present invention encapsulating nucleic acid is not particularly limited, but is preferably 10 nm to 500 nm, more preferably 30 nm to 300 nm.
  • the particle diameter can be measured using a particle size distribution measuring apparatus such as Zetasizer Nano (Malvern).
  • the particle diameter of the lipid membrane structure can be appropriately adjusted according to the method for preparing the lipid membrane structure.
  • the surface potential (zeta potential) of the lipid membrane structure of the present invention encapsulating nucleic acid is not particularly limited, but is preferably ⁇ 15 to +15 mV, more preferably ⁇ 10 to +10 mV.
  • particles having a positive surface potential have been mainly used. While this is useful as a method to promote electrostatic interaction with negatively charged cell surface heparin sulfate and promote cellular uptake, positive surface charge is delivered intracellularly.
  • the nucleic acid release from the carrier due to the interaction with the nucleic acid is suppressed, and the protein synthesis due to the interaction between the mRNA and the delivery nucleic acid is suppressed.
  • the surface charge can be measured by using a zeta potential measuring device such as Zetasizer Nano.
  • the surface charge of the lipid membrane structure can be adjusted by the composition of the components of the lipid membrane structure containing the cationic lipid of the present invention.
  • the lipid membrane surface pKa (hereinafter referred to as Liposomal pKa) of the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited, but preferably has a pKa of 5.5 to 7.2, and more preferably a pKa of 6.0. 6.8. Liposomal pKa is used as an index indicating that the lipid membrane structure taken up by endocytosis is susceptible to protonation of the lipid membrane structure in a weakly acidic environment within the endosome.
  • Liposomal pKa can be adjusted by the composition of the components of the lipid membrane structure containing the cationic lipid of the present invention.
  • the hemolysis activity (membrane fusion ability) of the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited, but preferably has no hemolysis activity (less than 5%) at physiological pH (pH 7.4), and is endosomal. It has activity in a slightly acidic environment (pH 5.5).
  • hemolysis is one of the means for the lipid membrane structure taken up by endocytosis to escape from the endosome. The higher the hemolysis activity, the more efficiently the nucleic acid can be delivered into the cytoplasm.However, if the hemolysis activity is present at physiological pH, the nucleic acid will be delivered to unintended cells during residence in the blood, resulting in decreased target-directedness and It also leads to toxicity. Therefore, it is preferable to have hemolysis activity only in the endosomal environment as described above.
  • the hemolysis activity can be adjusted by the composition of the components of the lipid membrane structure containing the cationic lipid of the present invention.
  • the encapsulated nucleic acid By bringing the lipid membrane structure of the present invention in which nucleic acid is encapsulated into contact with the cell, the encapsulated nucleic acid can be introduced into the cell.
  • the type of the “cell” is not particularly limited, and prokaryotic and eukaryotic cells can be used, but eukaryotes are preferable.
  • the kind of eukaryote is not particularly limited, and for example, mammals including humans (eg, humans, monkeys, mice, rats, hamsters, cattle, etc.), birds (eg, chickens, ostriches, etc.), amphibians (eg, frogs).
  • the cells targeted by the present invention are animal or plant cells, more preferably mammalian cells.
  • the cell may be a cultured cell line containing cancer cells, a cell isolated from an individual or tissue, or a tissue or tissue piece cell. Further, the cells may be adherent cells or non-adherent cells.
  • the step of bringing the lipid membrane structure of the present invention encapsulating nucleic acid into contact with cells in vitro will be specifically described below.
  • Cells are suspended in an appropriate medium several days before contact with the lipid membrane structure and cultured under appropriate conditions. Upon contact with the lipid membrane structure, the cell may or may not be in the growth phase.
  • the culture medium at the time of the contact may be a serum-containing medium or a serum-free medium, but the serum concentration in the medium is preferably 30% by weight or less, more preferably 20% by weight or less. If the medium contains excessive protein such as serum, the contact between the lipid membrane structure and the cell may be inhibited.
  • the cell density at the time of the contact is not particularly limited and can be appropriately set in consideration of the cell type and the like, but is usually in the range of 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • a suspension of the lipid membrane structure of the present invention in which the above-described nucleic acid is encapsulated is added to the cells thus prepared.
  • the addition amount of the suspension is not particularly limited, and can be appropriately set in consideration of the number of cells and the like.
  • the concentration of the lipid membrane structure at the time of contacting the cell is not particularly limited as long as the introduction of the target nucleic acid into the cell can be achieved, but the lipid concentration is usually 1 to 100 nmol / mL, preferably 10 to
  • the concentration of nucleic acid is usually 0.01 to 100 ⁇ g / mL, preferably 0.1 to 10 ⁇ g / mL.
  • the cells After adding the above suspension to the cells, the cells are cultured.
  • the culture temperature, humidity, CO 2 concentration, etc. are appropriately set in consideration of the cell type.
  • the temperature is usually about 37 ° C.
  • the humidity is about 95%
  • the CO 2 concentration is about 5%.
  • the culture time can be appropriately set in consideration of conditions such as the type of cells used, but is usually in the range of 0.1 to 76 hours, preferably in the range of 0.2 to 24 hours, and more preferably 0. .5-12 hours. If the culture time is too short, the nucleic acid is not sufficiently introduced into the cells, and if the culture time is too long, the cells may be weakened.
  • the nucleic acid is introduced into the cells by the above-described culture.
  • the medium is replaced with a fresh medium, or the fresh medium is added to the medium and the cultivation is further continued.
  • the fresh medium preferably contains serum or nutrient factors.
  • the lipid membrane structure of the present invention it is possible to introduce a nucleic acid into a cell not only in vitro but also in vivo. That is, by administering to the subject the lipid membrane structure of the present invention in which nucleic acid is encapsulated, the lipid membrane structure reaches and contacts the target cell, and the nucleic acid encapsulated in the lipid membrane structure in vivo. Is introduced into the cell.
  • the subject to which the lipid membrane structure can be administered is not particularly limited, and examples thereof include mammals (eg, humans, monkeys, mice, rats, hamsters, cows, etc.), birds (eg, chickens, ostriches, etc.), amphibians ( Examples thereof include vertebrates such as frogs, fish (for example, zebrafish and medaka), invertebrates such as insects (for example, moths, moths, and fruit flies), plants, and the like.
  • the subject of administration of the lipid membrane structure of the present invention is preferably a human or other mammal.
  • the type of target cell is not particularly limited, and by using the lipid membrane structure of the present invention, various tissues (for example, liver, kidney, pancreas, lung, spleen, heart, blood, muscle, bone, brain, stomach, Nucleic acids can be introduced into cells in the small intestine, large intestine, skin, adipose tissue, lymph nodes, tumors, etc.).
  • tissues for example, liver, kidney, pancreas, lung, spleen, heart, blood, muscle, bone, brain, stomach, Nucleic acids can be introduced into cells in the small intestine, large intestine, skin, adipose tissue, lymph nodes, tumors, etc.
  • a method for administering a lipid membrane structure into which a nucleic acid and / or a compound other than a nucleic acid has been introduced for example, a vertebrate, an invertebrate, etc.
  • the lipid membrane structure reaches and contacts a target cell
  • the method is not particularly limited as long as the compound introduced into the lipid membrane structure can be introduced into the cell, and the administration method known per se (for example, the type of the introduced compound, the type and site of the target cell, etc.)
  • Oral administration and parenteral administration for example, intravenous administration, intramuscular administration, topical administration, transdermal administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, spray, etc.
  • intravenous administration, intramuscular administration, topical administration, transdermal administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, spray, etc. can be appropriately selected.
  • the dosage of the lipid membrane structure is not particularly limited as long as the introduction of the compound into the cell can be achieved, and the type of administration target, the method of administration, the type of introduced compound, the type and site of the target cell It can be appropriately selected in consideration of the above.
  • the cationic lipid or lipid membrane structure of the present invention When used as a nucleic acid introduction agent, it can be formulated according to conventional means.
  • the nucleic acid introduction agent of the present invention can be used as it is, for example, water or other physiologically acceptable liquid (for example, water)
  • a sterile solution with a water-soluble solvent eg, malic acid buffer, etc.
  • an organic solvent eg, ethanol, methanol, DMSO, tert-butanol, etc.
  • a mixture of a water-soluble solvent and an organic solvent, etc. can be provided using a suspension.
  • the nucleic acid introduction agent of the present invention can appropriately contain physiologically acceptable additives known per se (for example, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc.).
  • the nucleic acid introduction agent of the present invention is used as it is, or a known pharmaceutically acceptable additive (for example, a carrier) , Flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc.) and admixed in a unit dosage form as required for the practice of accepted formulations, for example, orally (eg, tablets, capsules) Agent) or parenteral agents (for example, injections, sprays, etc.), preferably parenteral agents (more preferably, injections).
  • a known pharmaceutically acceptable additive for example, a carrier
  • admixed in a unit dosage form as required for the practice of accepted formulations, for example, orally (eg, tablets, capsules) Agent) or parenteral agents (for example, injections, sprays, etc.), preferably parenteral agents (more preferably, injections).
  • the nucleic acid-introducing agent of the present invention can be a preparation for children in addition to adults.
  • the nucleic acid introduction agent of the present invention can also be provided in the form of a kit.
  • the kit can contain a reagent used for nucleic acid introduction.
  • the nucleic acid introduction agent (or kit) of the present invention further comprises a polycation (eg, protamine).
  • a polycation eg, protamine
  • siRNA Small interfering RNA mRNA: Messenger RNA Chol: cholesterol
  • DMG-PEG2k 1,2-dimyristoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene glycol (PEG MW 2000)
  • DSG-PEG5k 1,2-distearoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene glycol (PEG MW 5000)
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • PBS phosphate buffered saline
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid
  • TNS 6- (p-Toluidino) -2-naphthalenesulfonic acid sodium salt
  • Table 1 shows the names and structures of the cationic lipids produced in the following examples and comparative examples. Comparative Examples 1 and 2 were produced according to the production method of Patent Document 2.
  • the reaction solution was washed twice with 216 g of a 10% aqueous acetic acid solution and twice with 216 g of ion-exchanged water, and then 12.9 g of magnesium sulfate (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) was added to the organic layer and stirred for 30 minutes. After filtering the magnesium sulfate, the filtrate was concentrated with an evaporator. The concentrate was redissolved with 284 g of hexane, the insoluble material was filtered, and extraction with 168 g of acetonitrile was performed 6 times. The acetonitrile layer was collected and concentrated with an evaporator to obtain 18.1 g of a crude product. Column purification of 14.5 g of the resulting crude product yielded 3.66 g of 4-oleoyloxyphenylacetic acid.
  • reaction solution was washed twice with 6.80 g of 20% brine and then dehydrated with 0.340 g of magnesium sulfate. After filtering magnesium sulfate, the filtrate was concentrated with an evaporator to obtain 0.870 g of a crude product. The obtained crude product was subjected to column purification to obtain 0.584 g of O-Ph-P3C1.
  • Example 2 Synthesis of O-Ph-P4C1 O-Ph-P4C1 was synthesized by the same synthesis route as in Example 1. 0.340 g (0.975 mmol) of bis ⁇ 2- [4- (hydroxymethyl) piperidyl] ethyl ⁇ disulfide (di-4PM form) synthesized by the method described in Patent Document 2, and 4-oleoyloxyphenylacetic acid 0 .853 g (2.05 mmol) and DMAP 0.0477 g (0.390 mmol) were dissolved in 10.2 g of chloroform at room temperature. Thereto was added 0.561 g (2.93 mmol) of EDC and reacted at 30-35 ° C. for 3 hours.
  • reaction solution was washed twice with 6.80 g of 20% brine and then dehydrated with 0.340 g of magnesium sulfate. After filtering the magnesium sulfate, the filtrate was concentrated with an evaporator to obtain 0.900 g of a crude product. The obtained crude product was subjected to column purification to obtain 0.629 g of O-Ph-P4C1.
  • Example 3 Synthesis of O-Ph-P4C2 O-Ph-P4C2 was synthesized by the same synthesis route as in Example 1. 0.350 g (0.929 mmol) of bis ⁇ 2- [4- (2-hydroxyethyl) piperidyl] ethyl ⁇ disulfide (di-4PE form) synthesized by the method described in Patent Document 2, and 4-oleoyloxyphenyl Acetic acid 0.813 g (1.95 mmol) and DMAP 0.0454 g (0.372 mmol) were dissolved in chloroform 10.5 g at room temperature. Thereto was added 0.534 g (2.79 mmol) of EDC and reacted at 30-35 ° C. for 4 hours.
  • reaction solution was washed twice with 7.00 g of 20% brine and then dehydrated with 0.350 g of magnesium sulfate. After filtering magnesium sulfate, the filtrate was concentrated with an evaporator to obtain 1.10 g of a crude product. The obtained crude product was subjected to column purification to obtain 0.722 g of O-Ph-P4C2.
  • O-Bn-P4C2 O-Bn-P4C2 was synthesized by the same synthesis route as in Example 1. ⁇ Synthesis of 4- (oleoyloxymethyl) phenylacetic acid> 13.2 g (24.1 mmol) of oleic anhydride and 2.01 g (12.1 mmol) of 4- (hydroxymethyl) phenylacetic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) were dissolved in 198 g of chloroform. DMAP 0.590g (4.83mmol) was added there, and reaction was performed at room temperature for 7 hours.
  • the reaction solution was washed twice with 66 g of a 10% aqueous acetic acid solution and twice with 66 g of ion-exchanged water, and then 4.00 g of magnesium sulfate (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) was added to the organic layer and stirred for 30 minutes. After filtering the magnesium sulfate, the filtrate was concentrated with an evaporator. The concentrate was redissolved with 87.0 g of hexane, insoluble matters were filtered, and extraction with 51.5 g of acetonitrile was performed 6 times. The acetonitrile layer was collected and concentrated with an evaporator to obtain 7.47 g of a crude product. Column purification of 5.98 g of the resulting crude product yielded 1.03 g of 4- (oleoyloxymethyl) phenylacetic acid.
  • E-Ph-P4C2 was synthesized by the same synthesis route as in Example 1.
  • ⁇ Acid anhydride conversion of succinic acid D- ⁇ -tocopherol> 70.0 g (132 mmol) of D- ⁇ -tocopherol succinate (manufactured by SIGMA-ALDRICH) was dissolved in 560 g of chloroform at room temperature and cooled to 10-15 ° C.
  • the reaction solution was filtered, and the filtrate was concentrated by an evaporator.
  • the obtained concentrate was redissolved in 210 g of hexane, and insoluble matters were removed by filtration.
  • the obtained filtrate was concentrated by an evaporator to obtain 64.2 g of D- ⁇ -tocopherol succinic anhydride.
  • the reaction solution was washed twice with 216 g of a 10% aqueous acetic acid solution and twice with 216 g of ion-exchanged water, and then 12.9 g of magnesium sulfate (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) was added to the organic layer and stirred for 30 minutes. After filtering the magnesium sulfate, the filtrate was concentrated with an evaporator. The concentrate was redissolved with 284 g of hexane, the insoluble material was filtered, and extraction with 168 g of acetonitrile was performed 6 times. The acetonitrile layer was collected and concentrated with an evaporator to obtain 17.0 g of a crude product. The obtained crude product (13.6 g) was subjected to column purification to obtain 3.44 g of 4- (D- ⁇ -tocopherol hemisuccinyl) phenylacetic acid.
  • Example 6 L-Ph-P4C2 L-Ph-P4C2 was synthesized by the same synthesis route as in Example 1.
  • HD-Ph-P4C2 was synthesized by the same synthesis route as in Example 1.
  • the concentrate was redissolved with 4 g of methanol, and 5.08 g (65.0 mmol) of ethylenediamine monohydrate (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) was added, The reaction was carried out at 35-45 ° C. for 3 hours. After the reaction solution was concentrated with an evaporator, the concentrate was redissolved with 10 g of 5% aqueous sodium dihydrogen phosphate solution and washed three times with 10 g of ethyl acetate.
  • the aqueous layer was adjusted to pH 12 using an aqueous sodium hydroxide solution, extracted twice with 10 g of dichloromethane, and dehydrated with 1 g of sodium sulfate (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.). After filtering sodium sulfate, the filtrate was concentrated with an evaporator to obtain 0.572 g of a di-4PE-amine body.
  • di-MAP form bis [ ⁇ N-methyl-N- (3-hydroxypropyl) amino ⁇ ethyl] disulfide
  • reaction solution was washed twice with 7.00 g of 20% brine and then dehydrated with 0.350 g of magnesium sulfate. After filtering magnesium sulfate, the filtrate was concentrated with an evaporator to obtain 0.871 g of a crude product. The obtained crude product was purified by column to obtain 0.498 g of O-Ph-C3M.
  • the solution was concentrated to 4 mL using PBS, and concentrated again under centrifugation conditions (25 ° C., 1000 g, 10 min). Finally, the volume was increased to the target lipid concentration using PBS.
  • each of the LNPs had a particle diameter of 30 to 300 nm, which is a preferable form, and a charge (zeta potential) at a physiological pH was ⁇ 10 to +10 mV, which was a preferable form.
  • Liposomal pKa measurement A 20 mM citrate buffer solution, sodium phosphate buffer solution and Tris HCl buffer solution containing NaCl at a final concentration of 150 mM, adjusted to various pH values in the range of pH 3.0 to 10.0 were prepared. [Test Example 3] The LNP prepared in step 1 was diluted with PBS so that the lipid concentration was 0.5 mM. TNS (manufactured by Sigma) was diluted with ultrapure water so as to have a concentration of 0.6 mM. 2 ⁇ L of TNS solution, 12 ⁇ L of various LNP solutions, and 186 ⁇ L of buffers adjusted to various pH values were added to a black 96 well plate.
  • the plate was protected from light and shaken at 400 rpm for 10 minutes.
  • the fluorescence intensity (excitation: 321 nm / emission: 447 nm) was measured using a plate reader (manufactured by TECAN).
  • the relative fluorescence intensity was calculated as a percentage, with the maximum value of fluorescence intensity in each LNP being 100% and the minimum value being 0%.
  • the pH at which the relative fluorescence intensity was 50% was defined as Liposomal pKa.
  • Table 13 shows the evaluation results of Liposomal pKa of various LNPs.
  • mice 6-7 weeks old were euthanized and approximately 1000 ⁇ L of blood was collected from the inferior vena cava.
  • the obtained blood was immediately mixed with 0.5 ⁇ L of heparin solution (5000 U / 5 mL).
  • About 9 mL of PBS was added to the blood to make a total volume of 10 mL, mixed by inversion, and then centrifuged (4 ° C., 400 g, 10 min).
  • the supernatant containing plasma components was removed with a Pasteur pipette.
  • About 9 mL of PBS was added to the blood cell component to make the total volume 10 mL, and centrifuged again. The same washing operation was repeated 4 times to obtain mouse erythrocytes.
  • Each tube was shaken at 1900 rpm for 30 minutes. Each sample was centrifuged under centrifugal conditions (4 ° C., 400 g, 5 min), 200 ⁇ L of the supernatant was transferred to a transparent 96-well plate, and the absorbance at 545 nm was measured. As a negative control, untreated erythrocytes were used. As a positive control, 1% (w / v) Triton-X was used. The absorbance of each sample was normalized with a negative control and a positive control.
  • the final lipid concentration was 1.56, 6.25, 25, 100, 400 ⁇ M and the final volume of the solution was 250 ⁇ L.
  • Each tube was shaken at 1900 rpm for 30 minutes.
  • Each sample was centrifuged under centrifugal conditions (4 ° C., 400 g, 5 min), 200 ⁇ L of the supernatant was transferred to a transparent 96-well plate, and the absorbance at 545 nm was measured.
  • Untreated erythrocytes were used as a negative control, and 1% (w / v) Triton-X100 was added as a positive control.
  • the absorbance of each sample was normalized with a negative control and a positive control.
  • the result is shown in FIG. Higher values, that is, higher total luciferase activity means higher gene expression.
  • the LNPs using the cationic lipids of the present invention (O-Ph-P4C1_LNP and O-Ph-P4C2_LNP) have higher gene expression than the LNPs using the cationic lipid of Comparative Example 1 (O-P4C2_LNP). Indicated.
  • LNPs using the cationic lipids of the present invention showed a higher gene expression activity than the LNP of Comparative Example 1.
  • O-Ph-P4C2_LNP has a gene expression activity that is about 10 times higher than that of Comparative Example 1, indicating that it has excellent in vitro mRNA delivery ability.
  • the prepared mRNA-encapsulated LNP was diluted with PBS so that the concentration of mRNA was 5 ⁇ g / mL.
  • Diluted mRNA-encapsulated LNP was administered into 6-week-old female Balb / c mice via the tail vein so that the amount was 10 ⁇ L / g body weight (mRNA dose of 0.05 mg / kg).
  • mRNA dose 10 ⁇ L / g body weight
  • 15 ⁇ L of blood was collected from the tail vein of the mouse.
  • the collected blood was immediately mixed with 0.3 ⁇ L of heparin solution (5000 U / 5 mL).
  • Each blood sample was centrifuged under centrifugal conditions (25 ° C., 2000 g, 20 min), and the supernatant was collected.
  • the erythropoietin concentration in the supernatant was measured by the method described in the Kit protocol using a Mouse Erythropoietin Quantikine ELISA Kit (manufactured by R & D Systems).
  • siRNA-encapsulated LNP was diluted with PBS so that the concentration of siRNA was 2 ⁇ g / mL.
  • Diluted siRNA-encapsulated LNP was administered into 4-week-old male ICR mice via the tail vein so that the amount was 10 ⁇ L / g body weight (siRNA dosage was 0.02 mg / kg).
  • the mice were euthanized and approximately 500 ⁇ L of blood was obtained from the inferior vena cava.
  • the obtained blood was immediately mixed with 0.5 ⁇ L of heparin solution (5000 U / 5 mL) and stored on ice until assayed.
  • the FVII concentration in the blood was measured by the method described in the Kit protocol using Biophen VII assay kit (Aniara).
  • the blood concentration of FVII at 24 hours after administration of each sample was normalized by the blood FVII concentration of untreated mice.
  • lipid ethanol solution was prepared by mixing 5 mM cationic lipid, 5 mM phospholipid, and 5 mM cholesterol in a 5 mL tube at a desired ratio so that the total lipid amount was 2550 nmol, and DMG-PEG2k ( 1 mM ethanol solution) was further added in an amount corresponding to 1.5% of the total lipid amount, and ethanol was added so that the total amount was 510 ⁇ L.
  • nucleic acid acidic buffer solution is 10.8 ⁇ g of mRNA solution (concentration varies depending on the efficiency of in vitro translation, but generally 0.6-0.8 ⁇ g / ⁇ L) in a 5 mL tube. It was prepared by adding an acidic malic acid buffer (containing 20 mM, pH 3.0, 30 mM NaCl) so that the total amount was 1300 ⁇ L.
  • an acidic malic acid buffer containing 20 mM, pH 3.0, 30 mM NaCl
  • Liposomal pKa was calculated by the method described in [Test Example 3].
  • Table 22 shows the Liposomal pKa values of various LNPs.
  • Liposomal pKa of all LNPs was within the range of pKa (5.5 to 7.2) preferred for endosome escape.
  • the pKa was improved by adding O-Ph-amide-P4C2.
  • Mouse erythrocytes were obtained by the method described in 2 of [Test Example 4].
  • HeLa cells which are human cervical cancer cells, were seeded in a 3.5 cm dish at 5.0 ⁇ 10 4 cells / 2 mL / Dish. After 24 hours, the medium was changed to a culture medium (D-MEM) containing 0.1 mM D-luciferin.
  • D-MEM culture medium
  • the prepared mRNA-encapsulated LNP was diluted with PBS so that the concentration of mRNA was about 8 ⁇ g / mL.
  • About 50 ⁇ L of diluted mRNA-encapsulated LNP solution (0.4 ⁇ g of mRNA) was added to a 3.5 cm dish and set in an incubator type luminometer KronosDio. The luminescence intensity of luciferase was measured every hour for 2 minutes. From the resulting change in expression over time, the cumulative luminescence intensity for 24 hours was calculated.
  • LNP using the cationic lipid of the present invention (O-Ph-P4C2_LNP, L-Ph-P4C2_LNP, HD-Ph-P4C2_LNP, O-Ph-P4C2 + O-Ph-amide-P4C2_LNP, and L-Ph-P4C2_LNP)
  • LNP using the cationic lipid of Comparative Example 1
  • the gene expression was high.
  • O-Ph-P4C2_LNP and O-Ph-P4C2 + O-Ph-amide-P4C2_LNP showed higher gene expression activity than commercially available mRNA introduction reagents.
  • Lipofectamine-mRNA Complex Using Gene Transfer Reagent (Lipofectamine MsengerMAX) This complex was prepared according to the manufacturer's protocol. In an Eppendorf tube, 125 ⁇ L of Opti-MEM medium and 7.5 ⁇ L of Lipofectamine Messenger MAX reagent were added and incubated for 10 minutes. In a separate Eppendorf tube, a solution of 2.5 ⁇ g mRNA / 125 ⁇ L Opti-MEM medium was prepared. A Lipofectamine-mRNA complex was prepared by adding 125 ⁇ L of the incubated Lipofectamine solution thereto and incubating for 5 minutes.
  • mRNA-encapsulated LNP solution prepared at various concentrations (0.4, 0.8, 1.6, 3.2 ⁇ g as mRNA) or 40, 80, 160, 320 ⁇ L of Lipofectamine-mRNA complex (mRNA As 0.4, 0.8, 1.6, 3.2 ⁇ g) and set in an incubator type luminometer KronosDio.
  • the luminescence intensity of luciferase was measured every 3 hours for 2 minutes. From the temporal change in the expression obtained, the cumulative luminescence intensity for 48 hours was calculated.
  • the culture solution was replaced with FACS buffer (PBS containing 0.5% bovine serum albumin (BSA) and 0.1% NaN 3 ), and measured with a flow cytometer (NovoCyte; manufactured by ACEA Biosciences) to introduce the gene. Cell analysis was performed.
  • FACS buffer PBS containing 0.5% bovine serum albumin (BSA) and 0.1% NaN 3
  • BSA bovine serum albumin
  • NaN 3 0.1% NaN 3
  • the prepared mRNA-encapsulated LNP was subcutaneously administered to a 6-week-old female C57 / BL6J mouse at the back of the neck so that the body weight was 10 ⁇ l / g (0.05 mg / mRNA as the dose of mRNA). kg).
  • luciferin was intraperitoneally administered to the mice so that the amount was 10 ⁇ L per gram of body weight (1.5 g / kg as the dose of luciferin).
  • imaging was performed using the IVIS imaging system. From the acquired image, the average value of luminance in the back of the neck of the mouse was calculated as Photos / sec, and this was used as an index of gene expression activity in the back of the neck.
  • nucleic acid into cells with high efficiency, which is useful for nucleic acid medicine, gene therapy, and biochemical experiments.

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Abstract

細胞内動態を改善したカチオン性脂質、これを含む脂質膜構造体、及びこれらの用途を提供すること。 （式（１）中、　Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、　Ｘａ及びＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、又は炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、　Ｒ２ａ及びＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基又はオキシジアルキレン基を表し、　Ｙａ及びＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又はウレア結合を表し、　Ｚａ及びＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し　Ｒ３ａ及びＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表す。）で示されるカチオン性脂質。

Description

細胞内動態を改善した新規カチオン性脂質
　本発明は細胞内動態を改善したカチオン性脂質、これを含む脂質膜構造体、及びこれらの用途に関する。
　核酸治療を実用化するために、効果的で安全な核酸送達キャリアが求められている。ウイルスベクターは、発現効率のよい核酸送達キャリアであるが、安全性の観点から実用上問題がある。そのため、より安全に使用できる非ウイルス核酸送達キャリアの開発が進められており、そのなかでもカチオン性脂質を用いたキャリアは、現在最も一般的に使用されている非ウイルス核酸送達キャリアである。
　カチオン性脂質は大別してアミン部位と脂質部位から構成されており、カチオン性を示すアミン部位とポリアニオンである核酸が静電的に相互作用し、正に帯電したリポソーム又は脂質膜構造体を形成することで、細胞への取り込みを促進し、核酸を細胞内へ送達するものである。
　一般に広く用いられている公知のカチオン性脂質としてはＤＯＴＡＰやＤＯＤＡＰが挙げられる。これらの公知のカチオン性脂質はリン脂質と組み合わせることによって、正に帯電したリポソーム又は脂質膜構造体を形成し、核酸と静電的に相互作用することで、標的細胞に核酸を送達し得る（非特許文献１）。
　一方で、カチオン性脂質を用いた脂質膜構造体が、核酸送達キャリアとして生体内で実用的な効果を発揮するためには、体内動態が良いこと、具体的には血中での安定性が高いこと、腫瘍等の標的への集積性が高いことなどの要件を満たす必要がある。この課題に対し、脂質膜構造体の表面のｐＫａを中性付近に調整し、ＰＥＧ脂質を導入した脂質膜構造体が、静脈内注射後に長い血中寿命を示すこと、腫瘍部位に集積することが知られている。
　このように体内動態を改善したカチオン性脂質が開発されているが、一般的に外来物質を細胞内に導入するという核酸送達キャリアの性質上、少ない取り込み量で大きな効果を発揮することが望まれている。即ち、脂質膜構造体を発現ベクターの細胞内への送達キャリアとして用いた場合、細胞内に取り込まれた単位脂質膜構造体当たりの発現量を高め、細胞内での発現効率を高めることが求められている。細胞内での発現効率を高めるためには、体内動態の他に、細胞への取り込み、エンドソームからの脱出、核膜透過などの細胞内動態を改善する必要がある。さらに細胞内における転写を促進する上では、核酸をキャリアから解離させ、転写因子との結合性を高める必要があることがわかっている（非特許文献２）。
　以上のように、核酸送達キャリアとしては、体内動態だけでなく、細胞内動態を改善する必要があり、特に、細胞への取り込み、エンドソーム脱出、核酸のキャリアからの解離、を促進させることが重要となる。これらの細胞内動態の改善例については以下の報告がある。
　特許文献１には、細胞への取り込み量を増加させた例が述べられている。この文献では、細胞への取り込み量を増加させる目的でアミノ基を多く含有したカチオン性脂質が記載されている。このカチオン性脂質を含む脂質膜構造体は、細胞への取り込み量を増加させることはできるが、一方で、核酸と相互作用するアミノ基を多く有するため、細胞内においては、脂質膜構造体からの核酸の解離が抑制されることになり、核酸送達効率の改善は期待できない。
　次に、エンドソーム脱出効率を改善した例がある（非特許文献３および非特許文献４）。これらの文献では、カチオン性脂質のアミノ基周辺構造を改変し、脂質膜構造体の表面のｐＫａをエンドソーム脱出に好ましい値に調整している。その結果、脂質膜構造体のエンドソームからの脱出が促進され、細胞質内へ効率良く核酸を送達できることが述べられている。しかし、適切なｐＫａを有する脂質膜構造体のすべてが、高い核酸送達効率を示すわけではなく、また、これら文献のカチオン性脂質については、脂質膜構造体のｐＫａを調整できる以外の効果についての記載はない。
　また、エンドソーム脱出効率を改善する方法として、脂質膜構造体の膜融合能を向上させることも１つの手法である（非特許文献５）。この文献では、エンドソーム脱出能の指標の1つとして、膜融合能（ヘモライシス活性）を評価している。脂質膜構造体を構成するカチオン性脂質の構造を改変することで、膜融合能が変化し、エンドソーム内環境での膜融合能が、核酸送達効率に影響することが述べられている。しかし、具体的にどのような構造が膜融合能を改善させるかについての記載はない。
　さらに、細胞内での核酸の脂質膜構造体からの解離を促進させた例がある（特許文献２及び３）。これら文献では、１つまたは２つのアミン部位と１つの脂質部位からなる化合物同士を、生分解性を示すジスルフィド結合で繋いだ構造を有するカチオン性脂質について述べられている。これらの文献では、当該カチオン性脂質が血中安定性や腫瘍標的性などの体内動態を改善することができ、また、アミン部位周辺の構造を変更することで、脂質膜構造体としてのｐＫａを細胞内でのエンドソーム脱出に有利な値に調整でき、さらに、細胞内でジスルフィド結合が切断されることを利用し、核酸を脂質膜構造体から解離させる効果を有することが示されている。実際、公知のカチオン性脂質であるＤＯＴＡＰやＤＯＤＡＰと比較して、高い核酸送達効率を示すことから、当該カチオン性脂質は核酸の細胞質内への送達効率の向上などの細胞内動態を改善できることが明らかとなっている。
　以上のように、細胞への取り込み、エンドソーム脱出、核酸のキャリアからの解離を促進させるなど、核酸送達キャリアの細胞内動態の改善に関する報告は複数ある。しかしながら、こうした当該分野での技術進捗にも関らず、これらカチオン性脂質を用いた脂質膜構造体によって達成される細胞への核酸送達効率は、いまだ十分に満足されるものではなく、さらなる改善が求められている。
特開２０１１－１２１９６６号公報 ＵＳ２０１４／０３３５１５７Ａ１ 国際公開第２０１６／１２１９４２号
Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　２９（２４―２５）：３４７７―９６，２００８ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１３（４）：７８６―７９４，２００６ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２４（４）：７８８－７９５，２０１６ Ａｎｇｅｗａｎｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　５１：８５２９－８５３３，２０１２ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１１０（３２）：１２８８１－１２８８６，２０１３
　本発明の課題は、従来技術では達成し得なかった細胞内動態のさらなる改善を達成し、核酸送達キャリアとして用いることができるカチオン性脂質、当該カチオン性脂質を用いた脂質膜構造体、および当該カチオン性脂質を用いた核酸導入剤を提供することである。
　また、本発明の課題は、カチオン性脂質を含む核酸導入剤を用いて核酸導入を達成する方法を提供することである。
　本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、エンドソーム脱出効率に影響する脂質膜構造体のｐＫａを調整でき、かつ高い膜融合能を有したカチオン性脂質を見出した。具体的には、脂質部位近傍に芳香環を導入し、これをアミン部位と結合させた化合物をジスルフィド結合で繋いだ構造を有するカチオン性脂質であり、ジスルフィド結合を有することから、細胞内でジスルフィド結合が切断され、核酸を脂質膜構造体から解離させる効果も併せ持つ。
　この新規カチオン性脂質を含んだ脂質膜構造体は、エンドソーム内環境において高い膜融合能を有し、エンドソーム脱出効率が高いことから、核酸を効率良く細胞質内へ送達できることを見出した。
　即ち、本発明は、以下の内容を包含する。
［１］式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式（１）中、
　Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
　Ｘａ及びＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、又は炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
　Ｒ２ａ及びＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基又はオキシジアルキレン基を表し、
　Ｙａ及びＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又はウレア結合を表し、
　Ｚａ及びＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、
　Ｒ３ａ及びＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表す。）で示されるカチオン性脂質（本明細書中、「カチオン性脂質（１）」と略記する場合がある）。
［２］Ｚａ及びＺｂがそれぞれ独立してＺ１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、
　ｓは０～３の整数を表し、
　ｔは０～３の整数を表し、
　ｕは０～４の整数を表し
　ｕ個のＲ４はそれぞれ独立して置換基を表す。）
である［１］記載のカチオン性脂質。
［３］ｓが０である［２］記載のカチオン性脂質。
［４］Ｘａ及びＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基である［１］～［３］のいずれか１に記載のカチオン性脂質。
［５］Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基である［１］～［４］のいずれか１に記載のカチオン性脂質。
［６］Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基である［５］記載のカチオン性脂質。
［７］Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基である［５］記載のカチオン性脂質。
［８］［１］～［７］のいずれか１に記載のカチオン性脂質を膜の構成脂質として含む脂質膜構造体。
［９］［１］～［７］のいずれか１に記載のカチオン性脂質、又は［８］記載の脂質膜構造体を含む核酸導入剤。
［１０］生体外において、核酸を内封した［９］記載の核酸導入剤と細胞とを接触させることを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
［１１］核酸を内封した［９］記載の核酸導入剤を、標的細胞へ送達されるように、生体へ投与することを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
　本発明は、３級アミノ基と芳香環を有するエステル、脂質部位、そして生分解性基であるジスルフィド結合を有するカチオン性脂質、またそれを含む脂質膜構造体に関するものである。本発明のカチオン性脂質は、脂質膜構造体を形成することができ、また当該カチオン性脂質を含む核酸導入剤とすることができる。本発明のカチオン性脂質はエンドソーム脱出効率に影響する脂質膜構造体のｐＫａを調整でき、それに加え、エンドソーム内環境において膜融合能が高いため、エンドソーム脱出が促進される。さらに、本発明のカチオン性脂質に含まれるジスルフィド結合が、細胞内の還元的環境において切断され、内包物（核酸）の放出が促進される。そのため、本発明のカチオン性脂質を用いた核酸導入剤は、細胞質内への高い核酸送達効率を達成することができる。
　本発明のカチオン性脂質、又はそれを含む脂質膜構造体を用いて、核酸導入を行うと、血清成分による核酸の分解が抑制されるので、血清存在下での核酸導入や、生体内での核酸導入に有利である。
本発明のカチオン性脂質（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２）から調製されるＬＮＰのｐＨ７．４および５．５でのヘモライシス活性（膜融合能）を示した図である。 本発明のカチオン性脂質（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２およびＯ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２）と比較例１から調製される各種ＬＮＰのｐＨ５．５における各種脂質濃度でのヘモライシス活性を示した図である。 本発明のカチオン性脂質（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ１、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２）および比較例１から調製される各種ＬＮＰのインビトロでの遺伝子発現活性を示した図である。 本発明のカチオン性脂質（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２およびＯ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２）と比較例１から調製される各種ＬＮＰのインビトロでの遺伝子発現活性を示した図である。 本発明のカチオン性脂質（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２およびＯ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２）と比較例１から調製される各種ＬＮＰ、および市販の遺伝子導入試薬ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）のインビボでの遺伝子発現活性を示した図である。 本発明のカチオン性脂質（Ｏ―Ｐｈ―Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２）および比較例１から調製される各種ＬＮＰのインビボでのＦＶＩＩ遺伝子のノックダウン活性を示した図である。 本発明のカチオン性脂質（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｅ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＨＤ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２）、および比較例１から調製される各種ＬＮＰのｐＨ７．４およびｐＨ５．５でのヘモライシス活性（膜融合能）を示した図である。 本発明のカチオン性脂質（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｌ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＨＤ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２）と比較例１から調製される各種ＬＮＰのインビトロでの遺伝子発現活性を示した図である。 本発明のカチオン性脂質（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２）から調製されるＬＮＰおよび遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ）のインビトロでの遺伝子発現の総量を示した図である。 本発明のカチオン性脂質（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２）から調製されるＬＮＰおよび遺伝子導入試薬のインビトロでの細胞への遺伝子発現の均一性を示した図である。 本発明のカチオン性脂質（Ｅ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２）および比較例２から調製される各種ＬＮＰのインビボ（皮下）での遺伝子発現活性を示した図である。
　以下、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　本発明は、式（１）で示されるカチオン性脂質を提供するものである。
　Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、直鎖状であっても良く、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。該アルキレン基の炭素数は、好ましくは１～４であり、より好ましくは１～２である。炭素数１～６のアルキレン基としては、具体的にはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ネオペンチレン基等を挙げることができる。Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、好ましくはそれぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基又はテトラメチレン基であり、最も好ましくはそれぞれエチレン基である。
　Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一の基である。
　Ｘａ及びＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、又は炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基である。
　炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基中の炭素数１～６のアルキル基は、直鎖状であっても分岐状であっても環状であっても良い。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１～３である。炭素数１～６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができ、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基又はイソプロピル基であり、最も好ましくはメチル基である。
　炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基の好ましい具体的な構造は、Ｘ１で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　Ｘ１のＲ５は炭素数１～６のアルキル基を表し、直鎖状であっても分岐状であっても環状であっても良い。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１～３である。炭素数１～６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができ、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基又はイソプロピル基であり、最も好ましくはメチル基である。
　炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基中の炭素数は、好ましくは４～５である。炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基としては、具体的にはアジリジレン基、アゼチジレン基、ピロリジレン基、ピペリジレン基、イミダゾリジレン基、ピペラジレン基であり、好ましくはピロリジレン基、ピペリジレン基、ピペラジレン基であり、最も好ましくはピペリジレン基である。
　炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１の環状のアルキレン３級アミノ基の好ましい具体的な構造はＸ２で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　Ｘ２のｐは１又は２である。ｐが１のときＸ２はピロリジレン基であり、ｐが２のときＸ２はピペリジレン基である。
　炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が２の環状のアルキレン３級アミノ基の好ましい具体的な構造はＸ３で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　Ｘ３のｗは１又は２である。ｗが１のときＸ３はイミダゾリジレン基であり、ｗが２のときＸ３はピペラジレン基である。
　ＸａはＸｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＸａはＸｂと同一の基である。
　Ｒ２ａ及びＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基又はオキシジアルキレン基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基である。
　炭素数８以下のアルキレン基は、直鎖状であっても、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。当該アルキレン基に含まれる炭素数は、好ましくは６以下であり、最も好ましくは４以下である。炭素数８以下のアルキレン基としては、具体的にはメチレン基、エチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基等を挙げることができ、好ましくはメチレン基、エチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基であり、最も好ましくはエチレン基である。
　炭素数８以下のオキシジアルキレン基とは、エーテル結合を介したアルキレン基（アルキレン－Ｏ－アルキレン）を示し、２つ存在するアルキレン基の炭素数の合計が８以下のものである。ここで、２つ存在するアルキレンは同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。炭素数８以下のオキシジアルキレン基としては、具体的にはオキシジメチレン基、オキシジエチレン基、オキシジプロピレン基、オキシジブチレン基等を挙げることができる。好ましくは、オキシジメチレン基、オキシジエチレン基、オキシジプロピレン基であり、最も好ましくはオキシジエチレン基である。
　Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であっても異なっていても良いが、好ましくは、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一の基である。
　Ｙａ及びＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又はウレア結合であり、好ましくはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合又はカーバメート結合であり、より好ましくはそれぞれ独立して、エステル結合又はアミド結合であり、最も好ましくはそれぞれエステル結合である。Ｙａ及びＹｂの結合の向きは制限されないが、ＹａおよびＹｂがエステル結合の場合、好ましくは、－Ｚａ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ２ａ－および－Ｚｂ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ２ｂ－の構造を呈する。
　ＹａはＹｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＹａはＹｂと同一の基である。
　Ｚａ及びＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表す。当該芳香族化合物に含まれる炭素数は好ましくは６～１２であり、最も好ましくは６～７である。また、当該芳香族化合物に含まれる芳香環は、好ましくは１つである。
　炭素数３～１６の芳香族化合物に含まれる芳香環の種類として、芳香族炭化水素環については、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、芳香族ヘテロ環についてはイミダゾール環、ピラゾール環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、トリアジン環、ピロール環、フランチオフェン環、ピリミジン環、ピリダジン環、ピラジン環、ピリジン環、プリン環、プテリジン環、ベンズイミダゾール環、インドール環、ベンゾフラン環、キナゾリン環、フタラジン環、キノリン環、イソキノリン環、クマリン環、クロモン環、ベンゾジアゼピン環、フェノキサジン環、フェノチアジン環、アクリジン環等を挙げることができ、好ましくは、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環であり、最も好ましくは、ベンゼン環である。
　芳香環は置換基を有してもよく、その置換基としては、炭素数２～４のアシル基、炭素数２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数２～４のカルバモイル基、炭素数２～４のアシルオキシ基、炭素数２～４のアシルアミノ基、炭素数２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１～４のアルキルスルファニル基、炭素数１～４のアルキルスルホニル基、炭素数６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のウレイド基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素６～１０のアリール基、炭素数６～１０のアリールオキシ基等を挙げることができ、好ましい例としてはアセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、t-ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、t-ブトキシ基、フェニル基およびフェノキシ基等が挙げられる。
　Ｚａ及びＺｂの好ましい具体的な構造としては、Ｚ１が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　式中、ｓは０～３の整数を表し、ｔは０～３の整数を表し、ｕは０～４の整数を表し、ｕ個のＲ４はそれぞれ独立して置換基を表す。
　Ｚ１のｓは、好ましくは０～１の整数であり、より好ましくは０である。
　Ｚ１のｔは、好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは１である。
　Ｚ１のｕは、好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは０～１の整数である。
　Ｚ１のＲ４は、当該カチオン性脂質の合成過程における反応を阻害しない、炭素数３～１６の芳香族化合物に含まれる芳香環（ベンゼン環）の置換基である。該置換基としては、炭素数２～４のアシル基、炭素数２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数２～４のカルバモイル基、炭素数２～４のアシルオキシ基、炭素数２～４のアシルアミノ基、炭素数２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１～４のアルキルスルファニル基、炭素数１～４のアルキルスルホニル基、炭素数６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のウレイド基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素６～１０のアリール基、炭素数６～１０のアリールオキシ基等を挙げることができ、好ましい例としてはアセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、t-ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、t-ブトキシ基、フェニル基およびフェノキシ基等が挙げられる。Ｒ４が複数個存在する場合、各Ｒ４は同一であっても異なっていてもよい。
　ＺａはＺｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＺａはＺｂと同一の基である。
　Ｒ３ａ及びＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基であり、最も好ましくはそれぞれ独立して、炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基である。
　水酸基を有する脂溶性ビタミンとしては、例えばレチノール、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、トコトリエノール等を挙げることができる。水酸基を有する脂溶性ビタミンは、好ましくはトコフェロールである。
　水酸基を有するステロール誘導体としては、例えばコレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、β－シトステロール、ラノステロール、及びエルゴステロール等が挙げられ、好ましくはコレステロール、又はコレスタノールである。
　炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基は、直鎖状であっても、分岐を有していても良い。当該脂肪族炭化水素基は、飽和であっても不飽和であっても良い。不飽和脂肪族炭化水素基の場合、当該脂肪族炭化水素基に含まれる不飽和結合の数は通常１～６個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個である。不飽和結合には炭素－炭素二重結合及び炭素－炭素三重結合が含まれるが、好ましくは炭素－炭素二重結合である。当該脂肪族炭化水素基に含まれる炭素数は、好ましくは１３～１９であり、最も好ましくは１３～１７である。脂肪族炭化水素基には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が含まれるが、好ましくはアルキル基又はアルケニル基が含まれる。炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基としては、具体的にはドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ドコセニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基、１－ヘキシルヘプチル基、１－ヘキシルノニル基、１－オクチルノニル基、１－オクチルウンデシル基、１－デシルウンデシル基等を挙げることができる。炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基は、好ましくはトリデシル基、ペンタデシル基、ヘプタデシル基、ノナデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基であり、特に好ましくはトリデシル基、ヘプタデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基である。
　本発明の一態様において、Ｒ３ａ及びＲ３ｂで表される炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基は脂肪酸由来である。この場合、脂肪酸由来のカルボニル炭素は式（１）中の－ＣＯ－Ｏ－に含まれる。脂肪族炭化水素基の具体例としては、脂肪酸としてリノール酸を用いた場合ではヘプタデカジエニル基となり、脂肪酸としてオレイン酸を用いた場合ではヘプタデセニル基となる。
　Ｒ３ａはＲ３ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一の基である。
　本発明の一態様において、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であり、ＸａはＸｂと同一であり、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、ＹａはＹｂと同一であり、ＺａはＺｂと同一であり、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
　本発明の式（１）で示されるカチオン性脂質の好適な例としては、以下のカチオン性脂質が挙げられる。
［カチオン性脂質（１－１）］
　Ｒ１ａ及びＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
　Ｘａ及びＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基（例、－Ｎ（ＣＨ３）－）、又は炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基（例、ピペリジレン基）であり；
　Ｒ２ａ及びＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、プロピレン基）であり；
　Ｙａ及びＹｂがそれぞれ独立してエステル結合又はアミド結合であり；
　Ｚａ及びＺｂがそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基（例、－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－）であり；
　Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基）である；
カチオン性脂質（１）。
［カチオン性脂質（１－２）］
　Ｒ１ａ及びＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１～４のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
　Ｘａ及びＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が１～３であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基（例、－Ｎ（ＣＨ３）－）、又は炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１の環状のアルキレン３級アミノ基（例、ピペリジレン基）であり；
　Ｒ２ａ及びＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数６以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、プロピレン基）であり；
　Ｙａ及びＹｂがそれぞれ独立してエステル結合又はアミド結合であり；
　Ｚａ及びＺｂがそれぞれ独立して、炭素数が６～１２であり、１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基（例、－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－）であり；
　Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１３～１９の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基）である；
カチオン性脂質（１）。
［カチオン性脂質（１－３）］
　Ｒ１ａ及びＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１～２のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
　Ｘａ及びＸｂがそれぞれ独立して、Ｘ１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　（式中、Ｒ５は炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）である。）、又はＸ２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　（式中、ｐは１又は２である。）
であり；
　Ｒ２ａ及びＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数４以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、プロピレン基）であり；
　Ｙａ及びＹｂがそれぞれ独立してエステル結合又はアミド結合であり；
　Ｚａ及びＺｂがそれぞれ独立して、Ｚ１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　（式中、ｓは０～１の整数であり、ｔは０～２の整数であり、ｕは０～２の整数（好ましくは０）であり、ｕ個のＲ４は、それぞれ独立して置換基を表す。）
であり；
　Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１３～１７の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基）である；
カチオン性脂質（１）。
　本発明のカチオン性脂質（１）の具体例として、以下のＯ－Ｐｈ－Ｐ３Ｃ１、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ１、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２、Ｅ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｌ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＨＤ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｐｈ－Ｃ３Ｍを挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　次に本発明のカチオン性脂質（１）の製造方法について説明する。
　本発明のカチオン性脂質（１）は、－Ｓ－Ｓ－（ジスルフィド）結合を有している。そのため、製造方法としては、Ｒ３ａ－ＣＯ－Ｏ－Ｚａ－Ｙａ－Ｒ２ａ－Ｘａ－Ｒ１ａ－を有するＳＨ（チオール）化合物、及びＲ３ｂ－ＣＯ－Ｏ－Ｚｂ－Ｙｂ－Ｒ２ｂ－Ｘｂ－Ｒ１ｂ－を有するＳＨ（チオール）化合物を製造後、これらを酸化（カップリング）することで－Ｓ－Ｓ－結合を含む本発明のカチオン性脂質（１）を得る方法、－Ｓ－Ｓ－結合を含む化合物に、必要な部分を順次合成していき、最終的に本発明のカチオン性脂質（１）を得る方法等が挙げられる。好ましくは、後者の方法である。
　後者の方法の具体例を以下に挙げるが、製造方法はこれらに限定されない。
　出発化合物としては、－Ｓ－Ｓ－結合を含む両末端カルボン酸、両末端アミン、両末端イソシアネート、両末端アルコール、メタンスルホニル基などの脱離基を有する両末端アルコール、ｐ－ニトロフェニルカーボネート基などの脱離基を有する両末端カーボネートなどが挙げられる。
　例えば、Ｒ１ａおよびＲ１ｂが同一でＲ１であり、ＸａおよびＸｂが同一でＸであり、Ｒ２ａおよびＲ２ｂが同一でＲ２であり、ＹａおよびＹｂが同一でＹであり、Ｚａ及びＺｂが同一でＺであり、かつＲ３ａおよびＲ３ｂが同一でＲ３であるカチオン性脂質（１）を製造する場合、以下に示す合成経路にて目的とする式（１’）のカチオン性脂質物を得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　－Ｓ－Ｓ－結合を含む化合物（Ｉ）中の両末端官能基（ＦＧ１）を、二級アミンと末端に１つの官能基(ＦＧ２)を有する化合物（ＩＩ）中の二級アミンに反応させて化合物（ＩＩＩ）を合成する。Ｒ３を有する化合物（ＩＶ）と、水酸基と反応性官能基（ＦＧ３）を有するＺを含む化合物（Ｖ）中の水酸基とを反応させて化合物（ＶＩ）を合成し、最後に化合物（ＶＩ）の反応性官能基（ＦＧ３）と化合物（ＩＩＩ）の反応性官能基（ＦＧ２）とを反応させることにより、－Ｓ－Ｓ－結合、Ｒ１、Ｘ、Ｒ２、Ｙ、ＺおよびＲ３を含む式（１’）のカチオン性脂質を得ることができる。
　上述の製造方法のうち、化合物（ＩＩＩ）は、特許文献２又は特許文献３に記載された方法により製造することが出来る。
　化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）の反応には、触媒として炭酸カリウムや炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、４－ジメチルアミノピリジン（以下、「ＤＭＡＰ」と称する）などの塩基触媒を使用しても良く、ｐ－トルエンスルホン酸やメタンスルホン酸などの酸触媒存在下、または無触媒で行ってもよい。
　また、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、「ＤＣＣ」と称する）、ジイソプロピルカルボジイミド（以下、「ＤＩＣ」と称する）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＣ」と称する）などの縮合剤を使用して、化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）を直接反応させてもよく、または、化合物（ＩＶ）を、縮合剤を使用して無水物などに変換した後、化合物（Ｖ）と反応させてもよい。
　化合物（ＩＶ）の仕込み量は、化合物（Ｖ）に対して、通常1～５０ｍｏｌ当量であり、好ましくは１～１０ｍｏｌ当量である。
　化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）との反応に使用される触媒は、反応させる化合物種によって、適宜選択してよい。
　触媒量は、化合物（Ｖ）に対して、通常０．０５～１００ｍｏｌ当量であり、好ましくは、０．１～２０ｍｏｌ当量であり、より好ましくは０．１～５ｍｏｌ当量である。
　化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）の反応に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒であればよく、特に制限なく使用することができる。例えば水、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、トルエンなどが挙げられる。これらの中ではクロロホルム、トルエンが好ましい。
　反応温度は、通常０～１５０℃であり、好ましくは０～８０℃であり、より好ましくは１０～５０℃である。反応時間は、通常１～４８時間であり、好ましくは１～２４時間である。
　上記反応によって得られた反応物（ＶＩ）は、抽出精製、再結晶、吸着精製、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。
　化合物（ＩＩＩ）と化合物（ＶＩ）とを反応させる場合には、化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）の反応のように、触媒として炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、４－ジメチルアミノピリジンなどの塩基触媒を使用しても良く、ｐ－トルエンスルホン酸やメタンスルホン酸などの酸触媒存在下、または無触媒で行ってもよい。
　また、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣなどの縮合剤を使用して、化合物（ＩＩＩ）と化合物（ＶＩ）とを直接反応させてもよく、または、化合物（ＶＩ）を、縮合剤を使用して無水物などに変換した後、化合物（ＩＩＩ）と反応させてもよい。
　化合物（ＶＩ）の仕込み量は、化合物（ＩＩＩ）に対して、通常1～５０ｍｏｌ当量であり、好ましくは１～１０ｍｏｌ当量である。
　化合物（ＩＩＩ）と化合物（ＶＩ）との反応に使用される触媒は、反応させる化合物種によって、適宜選択してよい。
　触媒量は、化合物（ＩＩＩ）に対して、通常０．０５～１００ｍｏｌ当量であり、好ましくは、０．１～２０ｍｏｌ当量であり、より好ましくは０．１～５ｍｏｌ当量である。
　化合物（ＩＩＩ）と化合物（ＶＩ）の反応に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒であればよく、特に制限なく使用することができる。例えば水、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、トルエンなどが挙げられる。これらの中ではクロロホルム、トルエンが好ましい。
　反応温度は、通常０～１５０℃であり、好ましくは０～８０℃であり、より好ましくは１０～５０℃である。反応時間は、通常１～４８時間であり、好ましくは１～２４時間である。
　上記反応によって得られた本発明のカチオン性脂質（１）は、抽出精製、再結晶、吸着精製、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。
　具体的な実施例は後述する（実施例１～９）。当業者であれば、適宜原料を選択し、本明細書の実施例の方法に準じて反応を行うことにより、所望のカチオン性脂質（１）を製造することができる。
　次に本発明の脂質膜構造体について説明する。
　本発明の脂質膜構造体とは、本発明のカチオン性脂質、即ち、上記一般式（１）で表わされるカチオン性脂質を膜の構成物質として含有するものである。ここで、本発明における「脂質膜構造体」とは、両親媒性脂質の親水基が界面の水相側に向かって配列した膜構造を有する粒子を意味する。「両親媒性脂質」とは、親水性を示す親水性基、および疎水性を示す疎水性基の両方を有する脂質のことを意味する。両親媒性脂質としては、例えば、カチオン性脂質やリン脂質等を挙げることができる。
　本発明の脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に本発明のカチオン性脂質が分散した形態として、リポソーム（例えば一枚膜リポソーム、多重層リポソームなど）、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、脂質ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ　Ｎａｎｏ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ、以下「ＬＮＰ」と称する）または不特定の層状構造物などを挙げることができる。本発明の脂質膜構造体は、好ましくはリポソームである。本発明の別の実施態様において、本発明の脂質膜構造体は、好ましくはＬＮＰである。
　本発明の脂質膜構造体は、本発明のカチオン性脂質に加え、それ以外のその他の構成成分をさらに含有してもよい。当該その他の構成成分としては、例えば、脂質（リン脂質（ホルファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホルファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン等）、糖脂質、ペプチド脂質、コレステロール、本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質、ＰＥＧ脂質等）、界面活性剤（例えば、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート、コール酸ナトリウム塩、オクチルグリコシド、Ｎ－Ｄ－グルコ－Ｎ－メチルアルカンアミド類等）、ポリエチレングリコール、タンパク質などが挙げられる。本発明の脂質膜構造体における当該その他の構成成分の含有量は、通常５～９５ｍｏｌ％であり、好ましくは１０～９０ｍｏｌ％であり、より好ましくは、３０～８０ｍｏｌ％である。
　本発明の脂質膜構造体に含まれる本発明のカチオン性脂質の含有量は特に限定されないが、通常は、脂質膜構造体を後述の核酸導入剤として用いた場合に、核酸を導入するために十分な量の本発明のカチオン性脂質が含まれる。例えば、総脂質の５～１００ｍｏｌ％、好ましくは１０～９０ｍｏｌ％、より好ましくは２０～７０ｍｏｌ％である。
　本発明の脂質膜構造体は、本発明のカチオン性脂質及びその他の構成成分（脂質等）を適当な溶媒または分散媒、例えば、水性溶媒やアルコール性溶媒中に分散させ、必要に応じて組織化を誘導する操作を行うことにより調製することができる。
　「組織化を誘導する操作」としては、例えば、マイクロ流路又はボルテックスを用いたエタノール希釈法、単純水和法、超音波処理、加熱、ボルテックス、エーテル注入法、フレンチ・プレス法、コール酸法、Ｃａ２＋融合法、凍結－融解法、逆相蒸発法等の自体公知の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体に核酸を内封させ、これを細胞へ接触させることにより、生体内及び／又は生体外において該核酸を該細胞内へ導入することができる。従って、本発明は、上記本発明のカチオン性脂質又は脂質膜構造体を含む、核酸導入剤を提供するものである。
　本発明の核酸導入剤は、任意の核酸を細胞内へ導入することができる。核酸の種類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド等を挙げることができるがこれらに限定されない。また、核酸は１～３本鎖のいずれも用いることができるが、好ましくは１本鎖又は２本鎖である。核酸は、プリン又はピリミジン塩基のＮ－グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のオリゴマー（例えば、市販のペプチド核酸（ＰＮＡ）等）、又は特殊な結合を有するその他のオリゴマー（但し、該オリゴマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置を持つヌクレオチドを含有する）などであってもよい。さらに該核酸は、例えば、公知の修飾の付加された核酸、当該分野で知られた標識のある核酸、キャップの付いた核酸、メチル化された核酸、１個以上の天然ヌクレオチドを類縁物で置換した核酸、分子内ヌクレオチド修飾された核酸、非荷電結合（例えば、メチルスルホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カーバメート等）を持つ核酸、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を持つ核酸、例えば蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジン等）や糖（例えば、モノサッカライド等）等の側鎖基を有している核酸、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレン等）を持つ核酸、キレート化合物（例えば、金属、放射活性を持つ金属、ホウ素、酸化性の金属等）を含有する核酸、アルキル化剤を含有する核酸、修飾された結合を持つ核酸（例えば、αアノマー型の核酸等）等であってもよい。
　本発明において使用できるＤＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができる。例えば、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＣｐＧオリゴ等が挙げられ、好ましくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡであり、より好ましくはプラスミドＤＮＡである。プラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡは適宜制限酵素等により消化され、線形ＤＮＡとして用いることもできる。
　本発明において使用できるＲＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡゲノム、二本鎖ＲＮＡゲノム、ＲＮＡレプリコン、トランスファーＲＮＡ、リボゾーマルＲＮＡ等が挙げられ、好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡレプリコンである。
　本発明において用いられる核酸は、当業者が通常用いる方法により精製されていることが好ましい。
　核酸を内封した本発明の核酸導入剤は、例えば疾患の予防および／又は治療を目的として、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）投与することができる。従って、本発明において用いられる核酸は、ある所定の疾患に対して予防および／又は治療活性を有するもの（予防・治療用核酸）が好ましい。そのような核酸としては、例えば、いわゆる遺伝子治療に用いられる核酸などが挙げられる。
　本発明の核酸導入剤を用いて、核酸を細胞内へ導入するためには、本発明の脂質膜構造体を形成する際に、目的とする核酸を共存させることにより、該核酸を内封した本発明の脂質膜構造体を形成させる。例えば、エタノール希釈法によりリポソームを形成する場合、核酸の水溶液と、本発明の脂質膜構造体の構成成分（脂質等）のエタノール溶液とをボルテックスやマイクロ流路等で激しく混合した後で、混合物を適切な緩衝液で希釈する。単純水和法によりリポソームを形成する場合、本発明の脂質膜構造体の構成成分（脂質等）を適切な有機溶媒に溶解し、該溶液をガラス容器に入れ、減圧乾燥することにより溶媒を留去し、脂質薄膜を得る。ここへ、核酸の水溶液を加え、水和させた後に、ソニケーターで超音波処理する。本発明はこのような核酸を内封した上記脂質膜構造体をも提供するものである。
　核酸を内封した脂質膜構造体の一形態として、核酸とカチオン性脂質との間の静電的複合体を形成することによって核酸封入したＬＮＰが挙げられる。このＬＮＰは、核酸等を特定の細胞内に選択的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして用いることができ、例えば、樹状細胞への抗原遺伝子導入によるＤＮＡワクチンや腫瘍の遺伝子治療薬や、ＲＮＡ干渉を利用した標的遺伝子の発現を抑制する核酸医薬品などに有用である。
　核酸を内封した本発明の脂質膜構造体の粒子径は、特に制限は無いが、好ましくは１０ｎｍ～５００ｎｍであり、より好ましくは３０ｎｍ～３００ｎｍである。粒子径の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ社）などの粒度分布測定装置を用いて行うことができる。脂質膜構造体の粒子径は、脂質膜構造体の調製方法により、適宜調整することができる。
　核酸を内封した本発明の脂質膜構造体の表面電位（ゼータ電位）は、特に制限は無いが、好ましくは－１５～＋１５ｍＶ、さらに好ましくは－１０～＋１０ｍＶである。従前の遺伝子導入においては、表面電位がプラスに荷電された粒子が主に用いられてきた。これは、負電荷を有する細胞表面のヘパリン硫酸との静電的相互作用を促進し、細胞への取り込みを促進するための方法としては有用であるが、正の表面電荷は、細胞内において送達核酸との相互作用によるキャリアからの核酸の放出の抑制や、ｍＲＮＡと送達核酸との相互作用によるタンパク質の合成が抑制される可能性がある。表面電荷を上記の範囲内に調整することにより、この問題を解決し得る。表面電荷の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏなどのゼータ電位測定装置を用いて行うことができる。脂質膜構造体の表面電荷は、本発明のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体の構成成分の組成により、調整することができる。
　本発明の脂質膜構造体の脂質膜表面ｐＫａ（以下、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａと称する）は、特に制限はないが、好ましくはｐＫａが５．５～７．２であり、さらに好ましくはｐＫａが６．０～６．８である。Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａは、エンドサイトーシスで取り込まれた脂質膜構造体がエンドソーム内の弱酸性環境下において、脂質膜構造体のプロトン化の受け易さを示す指標とされている。非特許文献３や４に記載されているようにエンドソームから脱出し、核酸を砂防室内へ送達するには、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａをエンドソーム脱出に好ましい値とすることが重要であり、上記の範囲内に調整することにより、効率良く細胞質内へ核酸の送達を行うことができる。Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａは、本発明のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体の構成成分の組成により、調整することができる。
　本発明の脂質膜構造体のヘモライシス活性（膜融合能）は、特に制限はないが、好ましくは生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）ではヘモライシス活性を有しておらず（５％未満）、エンドソーム内の弱酸性環境下（ｐＨ５．５）において活性を有している。非特許文献５に記載されているようにヘモライシスは、エンドサイトーシスで取り込まれた脂質膜構造体がエンドソームから脱出するための手段の１つである。ヘモライシス活性が高い方が効率よく核酸を細胞質内へ送達できるが、生理的ｐＨにおいてヘモライシス活性を有する場合、血中滞留中に意図しない細胞へ核酸を送達することになり、標的指向性の低下や毒性にも繋がる。そのため、上記のようにエンドソーム内環境においてのみヘモライシス活性を有することが好ましい。ヘモライシス活性は、本発明のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体の構成成分の組成により、調整することができる。
　核酸を内封した本発明の脂質膜構造体と細胞とを接触させることで、内封された核酸を細胞内へ導入することができる。当該「細胞」の種類は、特に限定されず、原核生物及び真核生物の細胞を用いることができるが、好ましくは真核生物である。真核生物の種類も、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（例えば、カエル等）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ等）等の脊椎動物、昆虫（蚕、蛾、ショウジョウバエ等）等の無脊椎動物、植物、微生物（例えば、酵母等）等が挙げられる。より好ましくは、本発明で対象とされる細胞は、動物もしくは植物細胞、さらに好ましくは哺乳動物細胞である。当該細胞は、癌細胞を含む培養細胞株であっても、個体や組織より単離された細胞、あるいは組織もしくは組織片の細胞であってもよい。また、細胞は接着細胞であっても、非接着細胞であってもよい。
　生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）において核酸を内封した本発明の脂質膜構造体と細胞とを接触させる工程を以下において具体的に説明する。
　細胞は当該脂質膜構造体との接触の数日前に適当な培地に懸濁し、適切な条件で培養する。脂質膜構造体との接触時において、細胞は増殖期にあってもよいし、そうでなくてもよい。
　当該接触時の培養液は、血清含有培地であっても血清不含培地であってもよいが、培地中の血清濃度は３０重量％以下が好ましく、２０重量％以下であることがより好ましい。培地中に過剰な血清等の蛋白質が含まれていると、当該脂質膜構造体と細胞との接触が阻害される可能性がある。
　当該接触時の細胞密度は、特には限定されず、細胞の種類等を考慮して適宜設定することが可能であるが、通常１×１０４～１×１０７細胞／ｍＬの範囲である。
　このように調製された細胞に、例えば、上述の核酸が内封された本発明の脂質膜構造体の懸濁液を添加する。該懸濁液の添加量は、特に限定されず、細胞数等を考慮して適宜設定することが可能である。細胞へ接触させる際の脂質膜構造体の濃度は、目的とする核酸の細胞内への導入が達成可能な限り特には限定されないが、脂質濃度として、通常１～１００ｎｍｏｌ／ｍＬ、好ましくは１０～５０ｎｍｏｌ／ｍＬであり、核酸の濃度として、通常０．０１～１００μｇ／ｍＬ、好ましくは０．１～１０μｇ／ｍＬである。
　上述の懸濁液を細胞に添加した後、該細胞を培養する。培養時の温度、湿度、ＣＯ２濃度等は、細胞の種類を考慮して適宜設定する。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、通常、温度は約３７℃、湿度は約９５％、ＣＯ２濃度は約５％である。また、培養時間も用いる細胞の種類等の条件を考慮して適宜設定できるが、通常０．１～７６時間の範囲であり、好ましくは０．２～２４時間の範囲であり、より好ましくは０．５～１２時間の範囲である。上記培養時間が短すぎると、核酸が十分細胞内へ導入されず、培養時間が長すぎると、細胞が弱ることがある。
　上述の培養により、核酸が細胞内へ導入されるが、好ましくは培地を新鮮な培地と交換するか、又は培地に新鮮な培地を添加して更に培養を続ける。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、新鮮な培地は、血清又は栄養因子を含むことが好ましい。
　また、上述の通り、本発明の脂質膜構造体を用いることで、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）のみならず、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）においても核酸を細胞内へ導入することが可能である。即ち、核酸を内封した本発明の脂質膜構造体を対象へ投与することにより、該脂質膜構造体が標的細胞へ到達・接触し、生体内で該脂質膜構造体に内封された核酸が細胞内へ導入される。該脂質膜構造体を投与可能な対象としては、特に限定されず、例えば、哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（例えば、カエル等）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ等）等の脊椎動物、昆虫（例えば、蚕、蛾、ショウジョウバエ等）等の無脊椎動物、植物等を挙げることができる。本発明の脂質膜構造体の投与対象としては、好ましくはヒト又は他の哺乳動物である。
　標的細胞の種類は特に限定されず、本発明の脂質膜構造体を用いることで、種々の組織（例えば、肝臓、腎臓、膵臓、肺、脾臓、心臓、血液、筋肉、骨、脳、胃、小腸、大腸、皮膚、脂肪組組織、リンパ節、腫瘍等）中の細胞へ、核酸を導入することが可能である。
　核酸および／または核酸以外の化合物が導入された脂質膜構造体の対象（例えば、脊椎動物、無脊椎動物など）への投与方法は、標的細胞へ該脂質膜構造体が到達・接触し、該脂質膜構造体に導入された化合物を細胞内へ導入可能な方法であれば特に限定されず、導入化合物の種類、標的細胞の種類や部位等を考慮して、自体公知の投与方法（例えば、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、スプレー等）等）を適宜選択することができる。該脂質膜構造体の投与量は、化合物の細胞内への導入を達成可能な範囲であれば、特に限定されず、投与対象の種類、投与方法、導入化合物の種類、標的細胞の種類や部位等を考慮して適宜選択することができる。
　本発明のカチオン性脂質又は脂質膜構造体を核酸導入剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
　該核酸導入剤が研究用試薬として提供される場合、当該本発明の核酸導入剤は、本発明の脂質膜構造体をそのままで、あるいは例えば水もしくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば、水溶性溶媒（例えば、リンゴ酸緩衝液、等）、有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、ｔｅｒｔ－ブタノールなど）もしくは水溶性溶媒と有機溶媒との混合液等）との無菌性溶液もしくは懸濁液を用いて提供され得る。本発明の核酸導入剤は適宜、自体公知の生理学的に許容し得る添加剤（例えば、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）を含むことが出来る。
　また、該核酸導入剤が医薬として提供される場合、当該本発明の核酸導入剤は、本発明の脂質膜構造体をそのままで用いて、あるいは医薬上許容される公知の添加剤（例えば、担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）とともに用い、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって、経口剤（例えば、錠剤、カプセル剤等）あるいは非経口剤（例えば注射剤、スプレー剤等）として、好ましくは非経口剤（より好ましくは、注射剤）として製造することができる。
　本発明の核酸導入剤は、成人用に加えて、小児用の製剤とすることもできる。
　本発明の核酸導入剤はキットの態様で提供することも可能である。当該キットには、本発明のカチオン性脂質又は脂質膜構造体に加えて、核酸導入の際に使用する試薬を含むことができる。一態様において、本発明の核酸導入剤（又はキット）は、ポリカチオン（例、プロタミン）を更に含む。当該態様の本発明の核酸導入剤（又はキット）を用いることにより、容易に核酸とポリカチオン（例、プロタミン）との間の静電的複合体を、本発明の脂質膜構造体に封入することができ、核酸を細胞内導入へ供することができる。
　以下に本発明の実施例について更に詳細に説明するが、本発明は当該実施例に何ら限定されない。
　実施例の説明において使用している略語の意味は、それぞれ以下の通りである。
　ｓｉＲＮＡ：スモールインターフェリングＲＮＡ
　ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
　Ｃｈｏｌ：コレステロール
　ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ：１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール，メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ　ＭＷ　２０００）
　ＤＳＧ－ＰＥＧ５ｋ：１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール，メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ　ＭＷ　５０００）
　ＤＯＰＥ：１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン
　ＤＯＰＣ：１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン
　ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
　ＭＥＳ：２－モルホリノエタンスルホン酸
　ＴＮＳ：６－（ｐ－トルイジノ）－２－ナフタレンスルホン酸ナトリウム
　表１に、以下の実施例及び比較例において製造したカチオン性脂質の名称と構造を示した。比較例１および２は、特許文献２の製造方法に準じて製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　［実施例１］Ｏ－Ｐｈ－Ｐ３Ｃ１の合成
　Ｏ－Ｐｈ－Ｐ３Ｃ１は式（２）の方法で製造したが、製造はこの方法に限定されない。
　式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　＜オレイン酸の酸無水物化＞
　オレイン酸（日油（株）製）７０．０ｇ（２４８ｍｍｏｌ）をクロロホルム５６０ｇに室温で溶解させ、１０－１５℃まで冷却した。そこへ、ＤＣＣ（（株）大阪合成有機化学研究所製）２５．１ｇ（１２１ｍｍｏｌ）をクロロホルム１４０ｇで溶解させた懸濁液を滴下により加え、１０－２５℃で２時間反応させた。反応溶液をろ過後、ろ液をエバポレーターにより濃縮した。得られた濃縮物をヘキサン２１０ｇに再溶解させ、不溶物をろ過により除去した。得られたろ液をエバポレーターにより濃縮し、オレイン酸無水物を６４．２ｇ得た。
　オレイン酸無水物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８６－０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ）、δ１．２５－１．４０ｐｐｍ（ｍ、４０Ｈ）、δ１．６１－１．６８（ｍ、４Ｈ）、δ１．９４－２．０５（ｍ、８Ｈ）、δ２．３９－２．４６（ｔ、４Ｈ）、δ５．３０－５．３８（ｍ、４Ｈ）
　＜４－オレオイルオキシフェニル酢酸の合成＞
　オレイン酸無水物４３．１ｇ（７８．９ｍｍｏｌ）および４－ヒドロキシフェニル酢酸（東京化成工業（株）製）６．００ｇ（３９．４ｍｍｏｌ）をクロロホルム６４７ｇに溶解させた。そこへＤＭＡＰ（広栄化学（株）製）１．９３ｇ（１５．８ｍｍｏｌ）を加えて、室温で９時間反応を行った。反応溶液を１０％酢酸水溶液２１６ｇで２回、イオン交換水２１６ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム（関東化学（株）製）１２．９ｇを有機層へ加え、３０分間攪拌した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮した。濃縮物をヘキサン２８４ｇで再溶解し、不溶物をろ過後、アセトニトリル１６８ｇを用いた抽出を６回行った。アセトニトリル層を回収し、エバポレーターにて濃縮することで、１８．１ｇの粗体を得た。得られた粗体１４．５ｇをカラム精製することで、４－オレオイルオキシフェニル酢酸を３．６６ｇ得た。
　４－オレオイルオキシフェニル酢酸の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．７７－０．８９（ｔ、３Ｈ）、δ１．２７－１．４２（ｍ、２０Ｈ）、δ１．７１－１．７７（ｍ、２Ｈ）、δ１．９９－２．０３（ｍ、４Ｈ）、δ２．５２－２．５６（ｍ、２Ｈ）、δ３．６４（ｓ、２Ｈ）、δ５．３２－５．３８（ｍ、２Ｈ）、δ７．０３－７．０６（ｍ、２Ｈ）、δ７．２８－７．３１（ｍ、２Ｈ）
　＜Ｏ－Ｐｈ－Ｐ３Ｃ１の合成＞
　特許文献２に記載の方法で合成したビス｛２－［３－（ヒドロキシメチル）ピペリジル］エチル｝ジスルフィド（ｄｉ－３ＰＭ体）０．３４０ｇ（０．９７５ｍｍｏｌ）と、４－オレオイルオキシフェニル酢酸０．８１３ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４７７ｇ（０．３９０ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．２ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ（東京化成工業（株）製）０．５６１ｇ（２．９３ｍｍｏｌ）を加え、３０－３５℃で３時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水６．８０ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３４０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、０．８７０ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ３Ｃ１を０．５８４ｇ得た。
　Ｏ－Ｐｈ－Ｐ３Ｃ１の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８６－０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ０．９２－１．０５（ｍ、２Ｈ）、δ１．２０－１．４２（ｍ、４０Ｈ）、δ１．５０－１．６０（ｍ、２Ｈ）、δ１．６２－１．８０（ｍ、１０Ｈ）、δ１．９０－２．０４（ｍ、１２Ｈ）、δ２．５２－２．５６（ｍ、４Ｈ）、δ２．６１－２．６５（ｍ、４Ｈ）、δ２．７８－２．８２（ｍ、８Ｈ）、δ３．６１（ｓ、４Ｈ）、δ３．８９－４．０２（ｍ、４Ｈ）、δ５．３４－５．３７（ｍ、４Ｈ）、δ７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、δ７．２６－７．３０（ｍ、４Ｈ）
　［実施例２］Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ１の合成
　Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ１は実施例１と同様の合成経路で合成した。
　特許文献２に記載の方法で合成したビス｛２－［４－（ヒドロキシメチル）ピペリジル］エチル｝ジスルフィド（ｄｉ－４ＰＭ体）０．３４０ｇ（０．９７５ｍｍｏｌ）と、４－オレオイルオキシフェニル酢酸０．８５３ｇ（２．０５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４７７ｇ（０．３９０ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．２ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．５６１ｇ（２．９３ｍｍｏｌ）を加え、３０－３５℃で３時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水６．８０ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３４０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、０．９００ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ１を０．６２９ｇ得た。
　Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ１の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８６－０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ１．２７－１．４２（ｍ、４４Ｈ）、δ１．６２－１．７６（ｍ、１０Ｈ）、δ１．９６－２．００（ｍ、１２Ｈ）、δ２．５２－２．５６（ｍ、４Ｈ）、δ２．６４－２．６７（ｍ、４Ｈ）、δ２．８１－２．９３（ｍ、８Ｈ）、δ３．６０（ｓ、４Ｈ）、δ３．９３－３．９５（ｄ、４Ｈ）、δ５．３４－５．３７（ｍ、４Ｈ）、δ７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、δ７．２６－７．３０（ｍ、４Ｈ）
　［実施例３］Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２の合成
　Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２は実施例１と同様の合成経路で合成した。
　特許文献２に記載の方法で合成したビス｛２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペリジル］エチル｝ジスルフィド（ｄｉ－４ＰＥ体）０．３５０ｇ（０．９２９ｍｍｏｌ）と、４－オレオイルオキシフェニル酢酸０．８１３ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４５４ｇ（０．３７２ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．５３４ｇ（２．７９ｍｍｏｌ）を加え、３０－３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水７．００ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３５０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、１．１０ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２を０．７２２ｇ得た。
　Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８６－０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ１．２２－１．４２（ｍ、４６Ｈ）、δ１．５４－１．７６（ｍ、１２Ｈ）、δ１．９４－２．０３（ｍ、１２Ｈ）、δ２．５２－２．５６（ｍ、４Ｈ）、δ２．６２－２．６６（ｍ、４Ｈ）、δ２．８０－２．８９（ｍ、８Ｈ）、δ３．５９（ｓ、４Ｈ）、δ４．１１－４．１４（ｔ、４Ｈ）、δ５．３４－５．３７（ｍ、４Ｈ）、δ７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、δ７．２６－７．３０（ｍ、４Ｈ）
　［実施例４］Ｏ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２
　Ｏ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２は実施例１と同様の合成経路で合成した。
　＜４－（オレオイルオキシメチル）フェニル酢酸の合成＞
　オレイン酸無水物１３．２ｇ（２４．１ｍｍｏｌ）および４－（ヒドロキシメチル）フェニル酢酸（東京化成工業（株）製）２．０１ｇ（１２．１ｍｍｏｌ）をクロロホルム１９８ｇに溶解させた。そこへＤＭＡＰ ０．５９０ｇ（４．８３ｍｍｏｌ）を加えて、室温で７時間反応を行った。反応溶液を１０％酢酸水溶液６６ｇで２回、イオン交換水６６ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム（関東化学（株）製）４．００ｇを有機層へ加え、３０分間攪拌した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮した。濃縮物をヘキサン８７．０ｇで再溶解し、不溶物をろ過後、アセトニトリル５１．５ｇを用いた抽出を６回行った。アセトニトリル層を回収し、エバポレーターにて濃縮することで、７．４７ｇの粗体を得た。得られた粗体５．９８ｇをカラム精製することで、４－（オレオイルオキシメチル）フェニル酢酸を１．０３ｇ得た。
４－（オレオイルオキシメチル）フェニル酢酸の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８６－０．８９（ｔ、３Ｈ）、δ１．１５－１．３７（ｍ、２０Ｈ）、δ１．６０－１．６６（ｍ、２Ｈ）、δ１．９８－２．０４（ｍ、４Ｈ）、δ２．３２－２．３６（ｍ、２Ｈ）、δ３．６６（ｓ、２Ｈ）、δ５．０９（ｓ、２Ｈ）、δ５．３１－５．３８（ｍ、２Ｈ）、δ７．２５－７．２９（ｍ、２Ｈ）、δ７．３１－７．４４（ｍ、２Ｈ）
　＜Ｏ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２の合成＞
　ｄｉ－４ＰＥ体 ０．２５０ｇ（０．６６４ｍｍｏｌ）、４－（オレオイルオキシメチル）フェニル酢酸０．６００ｇ（１．３９ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０３２４ｇ（０．２６６ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム７．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．３８２ｇ（１．９９ｍｍｏｌ）を加え、３０－３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水５．００ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．２５０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、０．８２３ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｏ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２を０．４６３ｇ得た。
Ｏ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８６－０．８９（ｔ、６Ｈ）、δ１．２０－１．３０（ｍ、４６Ｈ）、δ１．５０－１．６５（ｍ、１２Ｈ）、δ１．９２－２．０３（ｍ、１２Ｈ）、δ２．３２－２．３６（ｔ、４Ｈ）、δ２．６２－２．６５（ｍ、４Ｈ）、δ２．８０－２．９０（ｍ、８Ｈ）、δ３．６１（ｓ、４Ｈ）、δ４．１１－４．１４（ｔ、４Ｈ）、δ５．０９（ｓ、４Ｈ）、δ５．３１－５．３８（ｍ、４Ｈ）、δ７．２６－７．２８（ｍ、４Ｈ）、δ７．３０－７．３２（ｍ、４Ｈ）
　［実施例５］Ｅ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２
　Ｅ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２は実施例１と同様の合成経路で合成した。
　＜コハク酸Ｄ－α－トコフェロールの酸無水物化＞
　コハク酸Ｄ－α－トコフェロール（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ製）７０．０ｇ（１３２ｍｍｏｌ）をクロロホルム５６０ｇに室温で溶解させ、１０－１５℃まで冷却した。そこへ、ＤＣＣ（（株）大阪合成有機化学研究所製）１３．７ｇ（６６ｍｍｏｌ）をクロロホルム１４０ｇで溶解させた懸濁液を滴下により加え、１０－２５℃で２時間反応させた。反応溶液をろ過後、ろ液をエバポレーターにより濃縮した。得られた濃縮物をヘキサン２１０ｇに再溶解させ、不溶物をろ過により除去した。得られたろ液をエバポレーターにより濃縮し、無水コハク酸Ｄ－α－トコフェロールを６４．２ｇ得た。
　無水コハク酸Ｄ－α－トコフェロールの１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８４－０．８７ｐｐｍ（ｍ、２４Ｈ）、δ１．０２－１．８５ｐｐｍ（ｍ、５２Ｈ）、δ１．９６（ｓ、６Ｈ）、δ２．０１（ｓ、６Ｈ）、δ２．０８（ｓ、６Ｈ）、δ２．５６－２．５９（ｔ、４Ｈ）、δ２．９０－２．９５（ｍ、８Ｈ）
　＜４－（Ｄ－α－トコフェロールヘミスクシニル）フェニル酢酸の合成＞
　無水コハク酸Ｄ－α－トコフェロール４３．１ｇ（４１．３ｍｍｏｌ）および４－ヒドロキシフェニル酢酸（東京化成工業（株）製）３．１３ｇ（２０．６ｍｍｏｌ）をクロロホルム６４７ｇに溶解させた。そこへＤＭＡＰ（広栄化学（株）製）１．０１ｇ（８．２６ｍｍｏｌ）を加えて、室温で９時間反応を行った。反応溶液を１０％酢酸水溶液２１６ｇで２回、イオン交換水２１６ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム（関東化学（株）製）１２．９ｇを有機層へ加え、３０分間攪拌した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮した。濃縮物をヘキサン２８４ｇで再溶解し、不溶物をろ過後、アセトニトリル１６８ｇを用いた抽出を６回行った。アセトニトリル層を回収し、エバポレーターにて濃縮することで、１７．０ｇの粗体を得た。得られた粗体１３．６ｇをカラム精製することで、４－（Ｄ－α－トコフェロールヘミスクシニル）フェニル酢酸を３．４４ｇ得た。
　４－（Ｄ－α－トコフェロールヘミスクシニル）フェニル酢酸の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８３－０．８７ｐｐｍ（ｍ、１２Ｈ）、δ１．０２－１．８５ｐｐｍ（ｍ、２６Ｈ）、δ１．９６ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ）、δ２．０１ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ）、δ２．０８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ）、δ２．５６－２．５９ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ）、δ２．７１－２．７６ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、δ２．９２－２．９６ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、δ３．６６ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ）、δ７．０５－７．０８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、δ７．２７－７．３１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）
　＜Ｅ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２の合成＞
　ｄｉ－４ＰＥ体 ０．３５０ｇ（０．９２９ｍｍｏｌ）と、４－（Ｄ－α－トコフェロールヘミスクシニル）フェニル酢酸１．０４ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４５４ｇ（０．３７２ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．５３４ｇ（２．７９ｍｍｏｌ）を加え、３０－３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水７．００ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３５０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、１．３１ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｅ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２を０．８６０ｇ得た。
　Ｅ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８３－０．８７ｐｐｍ（ｍ、２４Ｈ）、δ１．０２－１．８５ｐｐｍ（ｍ、６６Ｈ）、δ１．９４－１．９８ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ）、δ２．００ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ）、δ２．０８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ）、δ２．５３－２．６６ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、δ２．７１－２．８５ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、δ２．８５－２．９５ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、δ３．６５ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ）、δ４．１１－４．１４ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ）、δ７．０５－７．０８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、δ７．２７－７．３１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）
　［実施例６］Ｌ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２
　Ｌ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２は実施例１と同様の合成経路で合成した。
　＜リノール酸の酸無水物化＞
　リノール酸（日油（株）製）６９．６ｇ（２４８ｍｍｏｌ）をクロロホルム５６０ｇに室温で溶解させ、１０－１５℃まで冷却した。そこへ、ＤＣＣ２５．１ｇ（１２１ｍｍｏｌ）をクロロホルム１４０ｇで溶解させた懸濁液を滴下により加え、１０－２５℃で２時間反応させた。反応溶液をろ過後、ろ液をエバポレーターにより濃縮した。得られた濃縮物をヘキサン２１０ｇに再溶解させ、不溶物をろ過により除去した。得られたろ液をエバポレーターにより濃縮し、リノール酸無水物を６３．８ｇ得た。
　リノール酸無水物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８６－０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ）、δ１．２５－１．４０ｐｐｍ（ｍ、３２Ｈ）、δ１．６１－１．６８（ｍ、４Ｈ）、δ１．９４－２．０５（ｍ、８Ｈ）、δ２．３９－２．４６（ｔ、４Ｈ）、δ５．３０－５．３８（ｍ、８Ｈ）
　＜４－リノレオイルオキシフェニル酢酸の合成＞
　リノール酸無水物４２．８ｇ（７８．９ｍｍｏｌ）および４－ヒドロキシフェニル酢酸６．００ｇ（３９．４ｍｍｏｌ）をクロロホルム６４７ｇに溶解させた。そこへＤＭＡＰ１．９３ｇ（１５．８ｍｍｏｌ）を加えて、１５－２０℃で９時間反応を行った。反応溶液を１０％酢酸水溶液２１６ｇで２回、イオン交換水２１６ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム１２．９ｇを有機層へ加え、３０分間攪拌した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮した。濃縮物をヘキサン２８４ｇで再溶解し、不溶物をろ過後、アセトニトリル１６８ｇを用いた抽出を６回行った。アセトニトリル層を回収し、エバポレーターにて濃縮することで、１８．１ｇの粗体を得た。得られた粗体１４．５ｇをカラム精製することで、４－リノレオイルオキシフェニル酢酸を３．６６ｇ得た。
　４－リノレオイルオキシフェニル酢酸の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．７７－０．８９（ｔ、３Ｈ）、δ１．２７－１．４２（ｍ、４Ｈ）、δ１．７１－１．７７（ｍ、２Ｈ）、δ１．９９－２．０３（ｍ、４Ｈ）、δ２．５２－２．５６（ｍ、２Ｈ）、δ３．６４（ｓ、２Ｈ）、δ５．３４－５．３９（ｍ、４Ｈ）、δ７．０３－７．０６（ｍ、２Ｈ）、δ７．２８－７．３１（ｍ、２Ｈ）
　＜Ｌ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２の合成＞
　ｄｉ－４ＰＥ体 ０．３５０ｇ（０．９２９ｍｍｏｌ）と、４－リノレオイルオキシフェニル酢酸０．８０８ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４５４ｇ（０．３７２ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．５３４ｇ（２．７９ｍｍｏｌ）を加え、３０－３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水７．００ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３５０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、１．０２ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｌ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２を０．６６８ｇ得た。
　Ｌ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８７－０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ１．２４－１．４１（ｍ、３８Ｈ）、δ１．５５－１．７６（ｍ、１２Ｈ）、δ１．９３－２．０７（ｍ、１２Ｈ）、δ２．５３－２．５６（ｍ、４Ｈ）、δ２．６３－２．６５（ｍ、４Ｈ）、δ２．７７－２．８９（ｍ、８Ｈ）、δ３．５９（ｓ、４Ｈ）、δ４．１１－４．１３（ｔ、４Ｈ）、δ５．３４－５．３９（ｍ、８Ｈ）、δ７．０２－７．０５（ｍ、４Ｈ）、δ７．２６－７．３０（ｍ、４Ｈ）
　［実施例７］ＨＤ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２
　ＨＤ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２は実施例１と同様の合成経路で合成した。
　＜２－ヘキシルデカン酸の酸無水物化＞
　２－ヘキシルデカン酸（東京化成工業（株）製）６．３６ｇ（２４．８ｍｍｏｌ）をクロロホルム５６ｇに室温で溶解させ、１０－１５℃まで冷却した。そこへ、ＤＣＣ２．５１ｇ（１２．１ｍｍｏｌ）をクロロホルム１４ｇで溶解させた懸濁液を滴下により加え、１０－２５℃で２時間反応させた。反応溶液をろ過後、ろ液をエバポレーターにより濃縮した。得られた濃縮物をヘキサン２１ｇに再溶解させ、不溶物をろ過により除去した。得られたろ液をエバポレーターにより濃縮し、２－ヘキシルデカン酸無水物を５．８３ｇ得た。
　２－ヘキシルデカン酸無水物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８６－０．９０ｐｐｍ（ｍ、１２Ｈ）、δ１．２５－１．４０ｐｐｍ（ｍ、４０Ｈ）、δ１．６１－１．６８（ｍ、８Ｈ）、δ２．３９－２．４６（ｍ、２Ｈ）
　＜２－ヘキシルデカノイルオキシフェニル酢酸の合成＞
　２－ヘキシルデカン酸無水物３．９０ｇ（７．８９ｍｍｏｌ）および４－ヒドロキシフェニル酢酸０．６００ｇ（３．９４ｍｍｏｌ）をクロロホルム６５ｇに溶解させた。そこへＤＭＡＰ０．１９３ｇ（１．５８ｍｍｏｌ）を加えて、室温で９時間反応を行った。反応溶液を１０％酢酸水溶液２２ｇで２回、イオン交換水２２ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム１．５ｇを有機層へ加え、３０分間攪拌した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮した。濃縮物をヘキサン２８ｇで再溶解し、不溶物をろ過後、アセトニトリル１７ｇを用いた抽出を６回行った。アセトニトリル層を回収し、エバポレーターにて濃縮することで、１．６４ｇの粗体を得た。得られた粗体１．３２ｇをカラム精製することで、２－ヘキシルデカノイルオキシフェニル酢酸を０．３３３ｇ得た。
　２－ヘキシルデカノイルオキシフェニル酢酸の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．７７－０．８９（ｔ、６Ｈ）、δ１．２７－１．４２（ｍ、２０Ｈ）、δ１．７１－１．７７（ｍ、４Ｈ）、δ２．５２－２．５６（ｍ、２Ｈ）、δ３．６４（ｓ、２Ｈ）、δ７．０３－７．０６（ｍ、２Ｈ）、δ７．２８－７．３１（ｍ、２Ｈ）
　＜ＨＤ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２の合成＞
　ｄｉ－４ＰＥ体 ０．１１７ｇ（０．３１０ｍｍｏｌ）と、２－ヘキシルデカノイルオキシフェニル酢酸０．２５４ｇ（０．６５０ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０１５１ｇ（０．１２４ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム３．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．１７８ｇ（０．９３０ｍｍｏｌ）を加え、３０－３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水３ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、０．３２０ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、ＨＤ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２を０．２１０ｇ得た。
　ＨＤ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８７－０．９０（ｔ、１２Ｈ）、δ１．２３－１．４１（ｍ、４０Ｈ）、δ１．５４－１．７６（ｍ、２０Ｈ）、δ１．９３－１．９７（ｍ、４Ｈ）、δ２．５４－２．５７（ｍ、２Ｈ）、δ２．６３－２．６５（ｍ、４Ｈ）、δ２．８１－２．８９（ｍ、８Ｈ）、δ３．５９（ｓ、４Ｈ）、δ４．１１－４．１３（ｔ、４Ｈ）、δ７．００－７．０２（ｍ、４Ｈ）、δ７．２６－７．２９（ｍ、４Ｈ）
　［実施例８］Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２
　＜ｄｉ－４ＰＥ体水酸基のアミノ化＞
　ｄｉ－４ＰＥ体 ０．８１５ｇ（２．１６ｍｍｏｌ）と、フタルイミド（関東化学（株）製）０．８９２ｇ（６．０６ｍｍｏｌ）、およびトリフェニルホスフィン（関東化学（株）製） １．５９ｇ（６．０６ｍｍｏｌ）を室温でジクロロメタン５ｇに溶解させた。そこへアゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＡＣＲＯＳ　ＯＲＧＡＮＩＣＳ製）１．０５ｇ（５．２０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間反応させた。反応溶液にメタノール１０gを加え、エバポレーターにて濃縮した後、濃縮物をメタノール４gで再溶解し、エチレンジアミン・一水和物（関東化学（株）製）５．０８g（６５．０ｍｍｏｌ）を加え、３５－４５℃で３時間反応させた。反応溶液をエバポレーターにて濃縮した後、濃縮物を５％リン酸二水素ナトリウム水溶液１０gで再溶解し、酢酸エチル１０gで３回洗浄を行った。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて水層をｐＨ１２に調整し、ジクロロメタン１０gで抽出を２回行い、硫酸ナトリウム（関東化学（株）製）１gを用いて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮することで、ｄｉ－４ＰＥ－ａｍｉｎｅ体を０．５７２g得た。
　ｄｉ－４ＰＥ－ａｍｉｎｅ体の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ１．２０－１．５５ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ）、δ１．５１－１．５４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、δ１．９５－２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、δ２．５８－２．６６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、δ２．７２ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ）、δ２．７８－２．８３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、δ２．８９－２．９２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）
　＜Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２の合成＞
　ｄｉ－４ＰＥ－ａｍｉｎｅ体 ０．３４８ｇ（０．９２９ｍｍｏｌ）と、４－オレオイルオキシフェニル酢酸０．８１３ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４５４ｇ（０．３７２ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．５３４ｇ（２．７９ｍｍｏｌ）を加え、３０－３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水７．００ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３５０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、１．１０ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２を０．６２９ｇ得た。
　Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８６－０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ１．２２－１．４２（ｍ、４６Ｈ）、δ１．６１－１．７７（ｍ、１２Ｈ）、δ１．９２－２．０３（ｍ、１２Ｈ）、δ２．５２－２．５６（ｍ、４Ｈ）、δ２．６２－２．６６（ｍ、４Ｈ）、δ２．８０－２．８９（ｍ、８Ｈ）、δ３．２２－３．２５（ｍ、４Ｈ）、δ３．５４（ｓ、４Ｈ）、δ５．３２－５．３７（ｍ、６Ｈ）、δ７．０５－７．０５（ｍ、４Ｈ）、δ７．２５－７．２６（ｍ、４Ｈ）
　［実施例９］Ｏ－Ｐｈ－Ｃ３Ｍ
　＜Ｏ－Ｐｈ－Ｃ３Ｍの合成＞
　特許文献２に記載の方法で合成したビス[｛Ｎ－メチル－Ｎ－（３-ヒドロキシプロピル）アミノ｝エチル]ジスルフィド（ｄｉ－ＭＡＰ体） ０．２７５ｇ（０．９２９ｍｍｏｌ）と、４－オレオイルオキシフェニル酢酸０．８１３ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４５４ｇ（０．３７２ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．５３４ｇ（２．７９ｍｍｏｌ）を加え、３０－３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水７．００ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３５０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、０．８７１ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｏ－Ｐｈ－Ｃ３Ｍを０．４９８ｇ得た。
　Ｏ－Ｐｈ－Ｃ３Ｍの１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８６－０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ１．２２－１．４２（ｍ、４４Ｈ）、δ１．７７－１．８２（ｍ、８Ｈ）、δ１．９９－２．０３（ｍ、８Ｈ）、δ２．２６（ｓ、６Ｈ）、δ２．２８－２．３０（ｔ、４Ｈ）、δ２．５２－２．５６（ｍ、４Ｈ）、δ２．６７－２．６９（ｍ、４Ｈ）、δ２．７９－２．８１（ｍ、４Ｈ）、δ３．５４（ｓ、４Ｈ）、δ４．１０－４．１３（ｔ、４Ｈ）、δ５．３２－５．３７（ｍ、４Ｈ）、δ７．０５－７．０５（ｍ、４Ｈ）、δ７．２５－７．２６（ｍ、４Ｈ）
　［比較例１］Ｏ－Ｐ４Ｃ２の合成
　特許文献２に記載の合成経路にて合成した。
　Ｏ－Ｐ４Ｃ２の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８６－０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ１．２０－１．３５（ｍ、４０Ｈ）、δ１．５８－１．７０（ｍ、４Ｈ）、δ１．７５－１．８３（ｍ、４Ｈ）、δ１．９５－２．０５（ｍ、８Ｈ）、δ２．２４－２．３２（ｍ、１０Ｈ）、δ２．６６－２．７０（ｍ、４Ｈ）、δ２．７８－２．８２（ｍ、４Ｈ）、δ４．１０－４．１３（ｔ、４Ｈ）、δ５．１３－５．３８（ｍ、４Ｈ）
　［比較例２］Ｅ－Ｐ４Ｃ２の合成
　特許文献２に記載の合成経路にて合成した。
　Ｅ－Ｐ４Ｃ２の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
　δ０．８３－０．８８（ｍ、２４Ｈ）、δ１．００－１．８１（ｍ、６６Ｈ）、δ１．９５－２．１０（ｍ、２２Ｈ）、δ２．５５－２．６０（ｔ、４Ｈ）、δ２．６２－２．６６（ｍ、４Ｈ）、δ２．７３－２．７７（ｔ、４Ｈ）、δ２．８０－２．８４（ｍ、４Ｈ）、δ２．８６－２．９５（ｍ、８Ｈ）、δ４．１２－４．１７（ｔ、４Ｈ）
［試験例１］ｍＲＮＡ封入粒子の調製と物性評価
１．エタノール希釈法によるｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製
（１）脂質のエタノール溶液の調製
　脂質のエタノール溶液は、５ｍＬチューブに５ｍＭのカチオン性脂質、５ｍＭリン脂質、５ｍＭコレステロールを総脂質量１３１．５ｎｍｏｌとなるように目的の割合で混合し、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ（１ｍＭエタノール溶液）をさらに総脂質量の３％相当量添加し、全量が３０μＬとなるようにエタノールを加えることで調製した。
（２）核酸の酸性バッファー溶液の調製
　核酸の酸性バッファー溶液は、エッペンドルフチューブにｍＲＮＡ溶液（濃度はインビトロ翻訳の効率により変化するが概ね０．６－０．８μｇ／μＬ）を３μｇとなるようにはかり取り、全量が４５μＬとなるように酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０，３０ｍＭ　ＮａＣｌを含む）を加えることで調製した。
（３）エタノール希釈法によるＬＮＰ調製
　核酸の酸性バッファー溶液４５μＬを脂質のエタノール溶液３０μＬにボルテックスしながら加えた。続いて混合液へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）を９２５μＬ加えた。事前にＭＥＳ緩衝液１ｍＬを加えておいたＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）へＬＮＰ溶液を全量移した。ＬＮＰ溶液の入っていた５ｍＬチューブへ１ｍＬのＭＥＳ緩衝液を加え、洗い込みを行った。本洗い込みは二度行った。遠心条件（２５℃，１０００ｇ，３ｍｉｎ）で約１００μＬまで限外濾過し濃縮した後、ＰＢＳを用いて４ｍＬまでメスアップし、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，１０ｍｉｎ）で濃縮した。最後に、ＰＢＳを用いて目的の脂質濃度になるようメスアップした。
２．各種ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの粒子径、及び表面電位の測定
　粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ；Ｍａｌｖｅｒｎ社）により測定した。上記１．の方法で調製した各種ＬＮＰの粒子径、表面電位の１例を表３～９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
３．結果
　いずれのＬＮＰも好ましい形態である粒子径３０～３００ｎｍであり、生理的ｐＨでの電荷（ゼータ電位）も、好ましい形態である－１５～＋１５ｍＶであった。
［試験例２］ｓｉＲＮＡ封入粒子の調製と物性評価
１．マイクロ流路法によるｓｉＲＮＡ封入ＬＮＰの調製
（１）脂質のエタノール溶液の調製
　脂質のエタノール溶液は、エッペンドルフチューブに５ｍＭのカチオン性脂質、５ｍＭコレステロールを総脂質量９００ｎｍｏｌとなるように目的の割合で混合し、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ（２ｍＭエタノール溶液）をさらに総脂質量の１．５％相当量添加し、全量が１００μＬとなるようにエタノールを加えることで調製した。
（２）核酸の酸性バッファー溶液の調製
　核酸の酸性バッファー溶液は、５ｍＬチューブに４ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ溶液を４．５μｇとなるようにはかり取り、全量が９００μＬとなるように酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）を加えることで調製した。
（３）マイクロ流路を用いたＬＮＰ調製
　核酸の酸性バッファー溶液および脂質のエタノール溶液をそれぞれシリンジにはかり取った。超高速ナノ医薬作成装置ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、核酸溶液を１８ｍＬ／ｍｉｎ、脂質溶液を２ｍＬ／ｍｉｎ、シリンジホルダー温度を３０℃の条件にて、ＬＮＰを調製し、１５ｍＬチューブへ回収した。１５ｍＬチューブへＰＢＳを３０００μＬ加えた後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、遠心条件（３０℃，１０００ｇ，６ｍｉｎ）で約１００μＬまで限外濾過し濃縮した。その後、ＰＢＳを用いて４ｍＬまでメスアップし、再度、遠心条件（３０℃，１０００ｇ，６ｍｉｎ）で濃縮した。最後に、ＰＢＳを用いて目的の脂質濃度になるようメスアップした。
２．各種ｓｉＲＮＡ封入ＬＮＰの粒子径、及び表面電位の測定
　粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法により測定した。［試験例５］の１に記載の方法で調製した各種ＬＮＰの粒子径、表面電位の１例を表１０～１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
３．結果
　いずれのＬＮＰも好ましい形態である粒子径３０～３００ｎｍであり、生理的ｐＨでの電荷（ゼータ電位）も、好ましい形態である－１０～＋１０ｍＶであった。
［試験例３］Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａの測定
１．各種ＬＮＰの調製
　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａの評価には核酸を封入していない空のＬＮＰを使用した。空のＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＰ－ＰＥＧ２ｋ＝６０：１０：３０：３）は［試験例１］に記載の方法において核酸を使用せずに粒子調製を行うことで作製した。
２．Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａの測定
　ｐＨ３．０～１０．０の範囲で種々のｐＨに合わせた、終濃度１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液およびトリスＨＣｌ緩衝液を用意した。［試験例３］１．で調製したＬＮＰを脂質濃度として０．５ｍＭとなるようにＰＢＳで希釈した。ＴＮＳ（Ｓｉｇｍａ製）は０．６ｍＭとなるように超純水で希釈した。黒色９６ｗｅｌｌプレートにＴＮＳ溶液を２μＬ、各種ＬＮＰ溶液を１２μＬ、および種々のｐＨに調整した緩衝液を１８６μＬ加えた。プレートを遮光し、４００ｒｐｍで１０分間振盪した。プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ製）を用いて、蛍光強度（励起：３２１ｎｍ／発光：４４７ｎｍ）を測定した。各ＬＮＰにおける蛍光強度の最大値を１００％、最小値を０％として、相対蛍光強度を百分率で算出した。また、相対蛍光強度が５０％であるｐＨをＬｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａとした。各種ＬＮＰのＬｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａの評価結果を表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
３．結果
　いずれのＬＮＰのＬｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａも、エンドソーム脱出に好ましいｐＫａ（５．５～７．２）の範囲内であった。また、カチオン性脂質のアミノ基周辺構造を改変することで、ＬＮＰのＬｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａを調整することができた。
［試験例４］ｐＨ７．４および５．５でのヘモライシス活性（膜融合能）の評価
１．各種ＬＮＰの調整
　ヘモライシス活性の評価には核酸を封入していない空のＬＮＰを使用した。空のＬＮＰは［試験例２］の１に記載の方法において核酸を使用せずに粒子調製を行うことで作製した。
２．マウス赤血球の取得
　６－７週齢の雄のＩＣＲマウスを安楽死させ、下大静脈から血液約１０００μＬを採取した。取得した血液は直ちに０．５μＬのヘパリン溶液（５０００Ｕ／５ｍＬ）と混合した。血液にＰＢＳ約９ｍＬを加え全量を１０ｍＬとし、転倒混和した後、遠心分離を行った（４℃，４００ｇ，１０ｍｉｎ）。血漿成分を含む上清をパスツールピペットにより取り除いた。血球成分へＰＢＳ約９ｍＬを加え全量を１０ｍＬとし、再度遠心分離を行った。同様の洗浄作業を４度繰り返し、マウス赤血球を得た。
３．ヘモライシス活性の評価
　マウス赤血球を２、４、６、８、１０μＬはかり取り、１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含むＰＢＳで希釈した。全量を透明９６ｗｅｌｌプレートへ移し、プレートリーダーを用いて５４５ｎｍにおける吸光度を測定した。本希釈系列を用いて検量線を作成し、吸光度が１になる点をヘモライシスアッセイに使用する血球量として決定した。空のＬＮＰ溶液をエッペンドルフチューブにはかり取り、リンゴ酸－ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．５，ｐＨ６．５，ｐＨ７．４）で希釈し、さらにマウス赤血球を加えた。脂質の終濃度を１００μＭ、溶液の最終体積を２５０μＬとした。各チューブを１９００ｒｐｍで３０分間振盪した。各サンプルを遠心条件（４℃，４００ｇ，５ｍｉｎ）で遠心分離し、上清２００μＬを透明９６ｗｅｌｌプレートに移し５４５ｎｍにおける吸光度を測定した。ネガティブコントロールとして、未処理赤血球を用いた。ポジティブコントロールとして１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ－Ｘを用いた。各サンプルの吸光度はネガティブコントロールとポジティブコントロールで規格化した。
４．結果
　結果を図１に示す。値が高い程、膜融合能（ヘモライシス活性）が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は生理的ｐＨ（７．４）ではヘモライシス活性を有さなかった。一方で、エンドソーム内環境ｐＨ（５．５）では８０％以上の高いヘモライシス活性を示した。
［試験例５］各種ＬＮＰのｐＨ５．５でのヘモライシス活性の評価
１．各種ＬＮＰの調整
　空のＬＮＰは［試験例２］の１に記載の方法において核酸を使用せずに粒子調製を行うことで作製した。
２．マウス赤血球の取得
　マウス赤血球の取得は「試験例４」に記載の方法で行った。
３．ヘモライシス活性の評価
　マウス赤血球を２、４、６、８、１０μＬ測り取り、１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含むＰＢＳで希釈した。全量を透明９６ｗｅｌｌプレートへ移し、プレートリーダーを用いて５４５ｎｍにおける吸光度を測定した。本希釈系列を用いて検量線を作成し、吸光度が１になる点をヘモライシスアッセイに使用する血球量として決定した。空のＬＮＰ溶液をエッペンドルフチューブにはかり取り、リンゴ酸－ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈し、さらにマウス赤血球を加えた。脂質の終濃度を１．５６、６．２５、２５、１００、４００μＭ、溶液の最終体積を２５０μＬとした。各チューブを１９００ｒｐｍで３０分間振盪した。各サンプルを遠心条件（４℃，４００ｇ，５ｍｉｎ）で遠心分離し、上清２００μＬを透明９６ｗｅｌｌプレートに移し５４５ｎｍにおける吸光度を測定した。ネガティブコントロールとして未処理赤血球、ポジティブコントロールとして１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を添加したものを用いた。各サンプルの吸光度はネガティブコントロールとポジティブコントロールで規格化した。
４．結果
　結果を図２に示す。値が高い程、膜融合能（ヘモライシス活性）が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰおよびＯ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）はいずれも、比較例１のＬＮＰよりも、各種脂質濃度においてヘモライシス活性が高かった。Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰとＯ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰはヘモライシス活性に差はなかった。ｐＨ５．５においてヘモライシス活性が高いことは、エンドソーム内環境においてエンドソーム膜との相互作用が高いこと、つまり、エンドソームからの脱出効率が高いことを意味している。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰおよびＯ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は、ヘモライシス活性が高いので、エンドソーム脱出に優位であることが分かる。
［試験例６］インビトロにおける遺伝子発現の評価１
１．各種ＬＮＰの調製
　ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝６０：１０：３０）を［試験例１］の１に記載の方法で調製した。
２．インビトロにおける遺伝子発現の経時評価
　トランスフェクション２４時間前にヒト腎がん細胞ＯＳＲＣ２を１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／Ｄｉｓｈとなるように３．５ｃｍディッシュに播種した。２４時間後、培地を０．１ｍＭのＤ－ルシフェリンを含む培養培地（ＲＰＭＩ１６４０）へ交換した。調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で６μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰ溶液３３μＬ（ｍＲＮＡ０．２μｇ）を３．５ｃｍディッシュに加え、インキュベーター型ルミノメーターＫｒｏｎｏｓＤｉｏ（ＡＴＴＯ製）にセットした。ルシフェラーゼの発光強度を１時間ごとに２分間計測した。得られた発現の時間変化から、２４時間の累積発光強度を算出した。
３．結果
　結果を図３に示す。値が高い程、即ち総ルシフェラーゼ活性が高い程、遺伝子発現が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ１_ＬＮＰおよびＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は、比較例１のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）と比較して、高い遺伝子発現を示した。
［試験例７］インビトロにおける遺伝子発現の評価２
１．各種ＬＮＰの調製
　ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５２．５：７．５：４０）を［試験例１］の１に記載の方法で調製した。
２．インビトロにおける遺伝子発現の経時評価
　トランスフェクション２４時間前にマウス大腸がん細胞ＣＴ２６を８．０×１０４／２ｍＬ／Ｄｉｓｈとなるように３．５ｃｍディッシュに播種した。２４時間後、培地を０．１ｍＭのＤ－ルシフェリンを含む培養培地へ交換した。調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で６μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰ溶液６７μＬ（ｍＲＮＡ０．４μｇ）を３．５ｃｍディッシュに加え、インキュベーター型ルミノメーターＫｒｏｎｏｓＤｉｏにセットした。ルシフェラーゼの発光強度を1時間ごとに２分間計測した。得られた発現の時間変化から、２４時間の累積発光強度を算出した。
３．結果
　結果を図４に示す。値が高い程、即ち総ルシフェラーゼ活性が高い程、遺伝子発現が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰおよびＯ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は、比較例１のＬＮＰと比較して、高い遺伝子発現活性を示した。特に、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰは、比較例１のＬＮＰよりも１０倍程度高い遺伝子発現活性を示しており、インビトロでの優れたｍＲＮＡの送達能を有していることがわかる。
［試験例８］インビボにおける遺伝子発現の経時評価
１．各種ＬＮＰの調製
　エリスロポエチンを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５２．５：７．５：４０）を［試験例１］に記載の方法で調製した。
２．インビボにおける遺伝子発現の経時評価
　調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、６週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように尾静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０５ｍｇ/ｋｇ）。投与後０．５、１、２、３、６、９、２４時間後にマウス尾静脈から血液１５μＬを採取した。採取した血液は直ちに０．３μＬのヘパリン溶液（５０００Ｕ／５ｍＬ）と混合した。各血液サンプルを遠心条件（２５℃，２０００ｇ，２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上清を回収した。上清中のエリスロポエチン濃度をＭｏｕｓｅ　Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ　Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、Ｋｉｔのプロトコルに記載の方法で測定した。
３．市販の遺伝子導入試薬ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）を用いたｍＲＮＡ－ＴｒａｎｓＩＴ複合体の調製
　本複合体の調製は文献（Ｔｈｅｓｓ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ．　２０１７）を参考に行った。ｍＲＮＡ溶液をｍＲＮＡが５μｇとなるようにエッペンドルフチューブにはかり取った。ｍＲＮＡ溶液をダルベッコ改変イーグル培地（Ｈｉｇｈ－Ｇｌｕｃｏｓｅ）で希釈し４９１μＬとした。そこへＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ試薬５．５μＬとｍＲＮＡ　Ｂｏｏｓｔ試薬を３．５μＬ加え、２分インキュベーションすることでｍＲＮＡ－ＴｒａｎｓＩＴ複合体を調製した。
４．インビボにおけるｍＲＮＡ－ＴｒａｎｓＩＴ複合体の遺伝子発現の経時評価
　本遺伝子発現活性評価は文献（Ｔｈｅｓｓ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ．　２０１７）を参考に行った。調製したｍＲＮＡ－ＴｒａｎｓＩＴ複合体を６週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内へ体重１ｇあたり５μＬ投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０５ｍｇ/ｋｇ）。各種タイムポイントでのマウス尾静脈からの血液採取、並びにエリスロポエチン濃度の定量を［試験例７］の２に記載の方法で行った。
５．結果
　結果を図５に示す。値が高い程、即ちエリスロポエチン活性が高い程、遺伝子発現が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰおよびＯ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）はいずれも、市販の遺伝子導入試薬（ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標））と比較して、高い遺伝子発現活性を示した。特に、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰは、市販の遺伝子導入試薬よりも１０倍程度高い遺伝子発現活性を示しており、インビボでの優れたｍＲＮＡの送達能を有していることがわかる。
［試験例９］インビボにおける遺伝子ノックダウン活性の評価（肝臓へのｓｉＲＮＡの送達）
１．各種ＬＮＰの調製
　肝臓特異的タンパク質である凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）に対するｓｉＲＮＡ封入ＬＮＰを［試験例２］の１に記載の方法で調製した。
２．インビボ肝臓における遺伝子ノックダウン活性の評価
　調製したｓｉＲＮＡ封入ＬＮＰをｓｉＲＮＡの濃度で２μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｓｉＲＮＡ封入ＬＮＰを、４週齢の雄のＩＣＲマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように尾静脈内投与した（ｓｉＲＮＡの投与量として０．０２ｍｇ/ｋｇ）。２４時間後にマウスを安楽死させ、下大静脈から血液約５００μＬを取得した。取得した血液は直ちに０．５μＬのヘパリン溶液（５０００Ｕ／５ｍＬ）と混合し、アッセイまで氷上で保存した。血中のＦＶＩＩ濃度はＢｉｏｐｈｅｎ　ＶＩＩ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ａｎｉａｒａ社）を用い、Ｋｉｔのプロトコルに記載の方法にて測定した。各サンプル投与後２４時間におけるＦＶＩＩの血中濃度は未処理マウスの血中ＦＶＩＩ濃度により規格化した。
３．結果
　結果を図６に示す。値が低い程、即ちＦＶＩＩタンパク質の発現活性が低い程、遺伝子ノックダウン活性が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰおよびＯ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）はいずれも、比較例１のＬＮＰよりも遺伝子ノックダウン活性が高く、特に、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰは、インビボでの優れたｓｉＲＮＡの送達能を有していることがわかる。
［試験例１０］ｍＲＮＡ封入粒子の調製と物性評価
１．マイクロ流路法によるｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製
（１）脂質のエタノール溶液の調製
　脂質のエタノール溶液は、５ｍＬチューブに５ｍＭのカチオン性脂質、５ｍＭリン脂質、５ｍＭコレステロールを総脂質量２５５０ｎｍｏｌとなるように目的の割合で混合し、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ（１ｍＭエタノール溶液）をさらに総脂質量の１．５％相当量添加し、全量が５１０μＬとなるようにエタノールを加えることで調製した。
（２）核酸の酸性バッファー溶液の調製
　核酸の酸性バッファー溶液は、５ｍＬチューブにｍＲＮＡ溶液（濃度はインビトロ翻訳の効率により変化するが概ね０．６－０．８μｇ／μＬ）を１０．８μｇとなるようにはかり取り、全量が１３００μＬとなるように酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０，３０ｍＭ　ＮａＣｌを含む）を加えることで調製した。
（３）マイクロ流路を用いたＬＮＰ調製
　核酸の酸性バッファー溶液および脂質のエタノール溶液をそれぞれシリンジにはかり取った。超高速ナノ医薬作成装置ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒを用いて、核酸溶液を３ｍＬ／ｍｉｎ、脂質溶液を１ｍＬ／ｍｉｎにてＬＮＰ調製を行い、１．２ｍＬを１５ｍＬチューブへ回収した。１５ｍＬチューブへｐＨ６．５の２０ｍＭのＭＥＳ（ＮａＯＨで調製）を３０００μＬ加えた後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４へ移し、遠心（２５℃，１０００ｇ，３ｍｉｎ）を繰り返し、約３００μＬまで限外濾過し濃縮した。その後、ＰＢＳを用いて４ｍＬまでメスアップし、再度、遠心（２５℃，１０００ｇ，3ｍｉｎ）を繰り返し、濃縮した。最後に、ＰＢＳを用いて目的の脂質濃度になるようメスアップした。
２．各種ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの粒子径、及び表面電位の測定
　粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法により測定した。上記１．の方法で調製した各種ＬＮＰの粒子径、表面電位の１例を表１４～２１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
３．結果
　いずれのＬＮＰも好ましい形態である粒子径３０～３００ｎｍであり、生理的ｐＨでの電荷（ゼータ電位）も、好ましい形態である－１５～＋１５ｍＶであった。
［試験例１１］Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａの測定
１．各種ＬＮＰの調製
　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａの評価には核酸を封入していない空のＬＮＰを使用した。空のＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ＝５２．５：７．５：４０：１．５）は［試験例１０］に記載の方法において核酸を使用せずに粒子調製を行うことで作製した。
２．Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａの測定
　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａは［試験例３］に記載の方法で算出した。各種ＬＮＰのＬｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａの値を表２２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
３．結果
　いずれのＬＮＰのＬｉｐｏｓｏｍａｌ　ｐＫａも、エンドソーム脱出に好ましいｐＫａ（５．５～７．２）の範囲内であった。Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２を加えることでｐＫａが向上した。
［試験例１２］ｐＨ７．４および５．５でのヘモライシス活性（膜融合能）の評価
１．各種ＬＮＰの調整
　ヘモライシス活性の評価には核酸を封入していない空のＬＮＰを使用した。空のＬＮＰは［試験例１１］の１に記載の方法で作製した。
２．マウス赤血球の取得
　［試験例４］の２に記載の方法でマウス赤血球を得た。
３．ヘモライシス活性の評価
　［試験例４］の３に記載の方法でヘモライシス活性を評価した。
４．結果
　結果を図７に示す。本発明のカチオン性脂質または比較例１のカチオン性脂質を用いたＬＮＰはいずれも生理的ｐＨ（７．４）ではヘモライシス活性を有さなかった。一方で、エンドソーム内環境ｐＨ（５．５）では本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰはいずれも比較例１のカチオン性脂質を用いたＬＮＰよりも優れたヘモライシス活性を有することがかわる。
［試験例１３］インビトロにおける遺伝子発現の評価３
１．各種ＬＮＰの調製
　ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５２．５：７．５：４０）を［試験例１０］の１に記載の方法で調製した。
２．インビトロにおける遺伝子発現の経時評価
　トランスフェクション２４時間前にヒト子宮頚がん細胞であるＨｅＬａ細胞を５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／Ｄｉｓｈとなるように３．５ｃｍディッシュに播種した。２４時間後、培地を０．１ｍＭのＤ－ルシフェリンを含む培養培地（Ｄ－ＭＥＭ）へ交換した。調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で約８μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰ溶液約５０μＬ（ｍＲＮＡ　０．４μｇ）を３．５ｃｍディッシュに加え、インキュベーター型ルミノメーターＫｒｏｎｏｓＤｉｏにセットした。ルシフェラーゼの発光強度を１時間ごとに２分間計測した。得られた発現の時間変化から、２４時間の累積発光強度を算出した。
３．結果
　結果を図８に示す。値が高い程、即ち総ルシフェラーゼ活性が高い程、遺伝子発現が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ、Ｌ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ、ＨＤ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２＋Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ、およびＬ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は、比較例１のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）と比較して、高い遺伝子発現を示した。さらに、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰおよびＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２＋Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰは、市販のｍＲＮＡ導入試薬よりも高い遺伝子発現活性を示した。
［試験例１４］インビトロにおける遺伝子発現の評価４
１．ＬＮＰの調製
　ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ＝５２．５：７．５：４０：０．７５）を［試験例１０］の１の記載に類する方法で調製した。
２．遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＭｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ）を用いたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－ｍＲＮＡの複合体の調製
　本複合体の調製は、メーカー記載のプロトコルに従って行った。エッペンドルフチューブにＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１２５μＬおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ試薬を７．５μＬ加え、１０分間インキュベーションした。別のエッペンドルフチューブにｍＲＮＡ２．５μｇ／Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地１２５μＬの溶液を調製した。そこへインュベートしたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ溶液を１２５μＬ加えて、５分間インキュベートすることでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－ｍＲＮＡの複合体を調製した。
３．インビトロにおける遺伝子発現の経時評価
　トランスフェクション２４時間前にヒト白血病Ｔ細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１．８ｍＬ／Ｄｉｓｈとなるように３．５ｃｍディッシュに播種した。２４時間後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＤ－ルシフェリン入りの培地（ＲＰＭＩ１６４０）を各ディッシュに２００μＬ加えた。そこへ、各種濃度に調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰ溶液を８０μＬ（ｍＲＮＡとして０．４、０．８、１．６、３．２μｇ）、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－ｍＲＮＡ複合体を４０、８０、１６０、３２０μＬ（ｍＲＮＡとして０．４、０．８、１．６、３．２μｇ）加え、インキュベーター型ルミノメーターＫｒｏｎｏｓＤｉｏにセットした。ルシフェラーゼの発光強度を３時間ごとに２分間計測した。得られた発現の時間変化から、４８時間の累積発光強度を算出した。
４．結果
　結果を図９に示す。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は、いずれのｍＲＮＡ量においても遺伝子導入試薬と比較して優れた遺伝子発現活性を示した。
［試験例１５］インビトロにおける遺伝子発現の評価５
１．ＬＮＰの調製
　ＥＧＦＰを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ＝５２．５：７．５：４０：０．７５）を［試験例１０］の１の記載に類する方法で調製した。
２．遺伝子導入試薬を用いたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－ｍＲＮＡの複合体の調製
　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－ｍＲＮＡの複合体は［試験例１４］の２に記載の方法にて調製した。
３．インビトロにおける遺伝子発現の経時評価
　トランスフェクション２４時間前にヒト白血病Ｔ細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／Ｄｉｓｈとなるように３．５ｃｍディッシュに播種した。２４時間後、各種濃度に調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰ溶液を８０μＬ（ｍＲＮＡとして　０．４、０．８、１．６、３．２μｇ）、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－ｍＲＮＡ複合体を４０、８０、１６０、３２０μＬ（ｍＲＮＡとして　０．４、０．８、１．６、３．２μｇ）３．５ｃｍディッシュに加え、インキュベーターで２４時間培養した。培養液をＦＡＣＳバッファー（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ＮａＮ３含有ＰＢＳ）に交換し、フローサイトメーター（ＮｏｖｏＣｙｔｅ；ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）にて測定を行い、遺伝子導入された細胞の分析を行った。
４．結果
　結果を図１０に示す。値が高いほど多くの細胞に遺伝子導入されていることを表す。遺伝子導入試薬では、いずれのｍＲＮＡ量でも一部の細胞でのみ遺伝子発現しており、発現の均一性が低かった。対して、本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰでは、ｍＲＮＡ量に関係なく殆ど全ての細胞に遺伝子導入されており、発現の均一性が非常に高いことが分かる。
［試験例１６］インビボにおける遺伝子発現の評価（皮下投与）
１．各種ＬＮＰの調製
　ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝６０：３０：１０）を、[試験例１０]に記載のマイクロ流路を用いた方法にて調製した。
２．インビボにおける遺伝子ノックダウン活性の評価
　調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、６週齢の雌のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように頸背部に皮下投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０５ｍｇ／ｋｇ）。投与５時間半後、体重１ｇあたり１０μＬとなるようにマウスにルシフェリンを腹腔内投与した（ルシフェリンの投与量として１．５ｇ／ｋｇ）。３０分後、ＩＶＩＳイメージングシステムを用いてイメージングを行った。取得した画像からマウスの頸背部における輝度の平均値をＰｈｏｔｏｍｓ／ｓｅｃとして算出し、これを頸背部における遺伝子発現活性の指標とした。
３．結果
　結果を図１１に示す。値が高い程、即ち総ルシフェラーゼ活性が高い程、遺伝子発現が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｅ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は、マウスの皮下において比較例２よりも高い遺伝子発現活性を示した。
　本発明によると、高効率で核酸を細胞内へ導入することが可能であるので、核酸医薬や遺伝子治療、生化学実験に有用である。
　本出願は、日本で出願された特願２０１８－０６０７６４を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。

Claims (11)

  1. 　式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（１）中、
    　Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
    　Ｘａ及びＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、又は炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
    　Ｒ２ａ及びＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基又はオキシジアルキレン基を表し、
    　Ｙａ及びＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又はウレア結合を表し、
    　Ｚａ及びＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し
    　Ｒ３ａ及びＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表す。）で示されるカチオン性脂質。
  2. 　Ｚａ及びＺｂがそれぞれ独立してＺ１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、
    　ｓは０～３の整数を表し、
    　ｔは０～３の整数を表し、
    　ｕは０～４の整数を表し、
    　ｕ個のＲ４はそれぞれ独立して置換基を表す。）
    である請求項１記載のカチオン性脂質。
  3. 　ｓが０である請求項２記載のカチオン性脂質。
  4. 　Ｘａ及びＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基である請求項１～３のいずれか１項に記載のカチオン性脂質。
  5. 　Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基である請求項１～４のいずれか１項に記載のカチオン性脂質。
  6. 　Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基である請求項５記載のカチオン性脂質。
  7. 　Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基である請求項５記載のカチオン性脂質。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のカチオン性脂質を膜の構成脂質として含む脂質膜構造体。
  9. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のカチオン性脂質、又は請求項８記載の脂質膜構造体を含む核酸導入剤。
  10. 　生体外において、核酸を内封した請求項９記載の核酸導入剤と細胞とを接触させることを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
  11. 　核酸を内封した請求項９記載の核酸導入剤を、標的細胞へ送達されるように、生体へ投与することを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
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