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WO2019131829A1 - 標的遺伝子改変用組成物 - Google Patents

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WO2019131829A1
WO2019131829A1 PCT/JP2018/048034 JP2018048034W WO2019131829A1 WO 2019131829 A1 WO2019131829 A1 WO 2019131829A1 JP 2018048034 W JP2018048034 W JP 2018048034W WO 2019131829 A1 WO2019131829 A1 WO 2019131829A1
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WO
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rna
seq
nucleic acid
cell
composition
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/048034
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English (en)
French (fr)
Inventor
秋津 堀田
正隆 井福
藤本　直子
久美子 岩渕
江利也 見城
幸正 蒔田
留美子 落合
Original Assignee
国立大学法人京都大学
武田薬品工業株式会社
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Publication date
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Priority to AU2018397951A priority patent/AU2018397951B2/en
Priority to CN201880084068.9A priority patent/CN111527204B/zh
Priority to EP18894951.5A priority patent/EP3733844B1/en
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Definitions

  • the present invention relates to a composition capable of introducing a substance used in a CRISPR system as an active ingredient into cells. Furthermore, the present invention relates to a method of inducing genetic modification at a target locus in cells using such a composition, for example, a method of preventing or treating muscular dystrophy by modifying the dystrophin gene of muscle cells.
  • class 1 and class 2 are known, and in class 1, type I, type III, type IV are known, and in class 2, type II, type V, and type VI are known.
  • Cas9 of class 2 type II which binds and cuts DNA is widely used, but Cpf1 (Cas12a) and C2c1 (Cas12b) of class 2 type V which similarly bind and cut DNA It's being used.
  • Cas13a (C2c2) and Cas13b of class 2 type VI which bind to and cleave RNA, have also been reported.
  • lipid nanoparticles capable of encapsulating nucleic acids such as gRNA and mRNA are known.
  • LNP lipid nanoparticles
  • prior art documents describing delivery of a gene modification tool of CRISPR / Cas9 system by LNP to hepatocytes include the following.
  • Non-Patent Document 1 uses C12-200 (a lipid-like molecule), cholesterol, C14 PEG 2000 (a polyethylene glycol lipid), DOPE (1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) and arachidonic acid.
  • C12-200 a lipid-like molecule
  • C14 PEG 2000 a polyethylene glycol lipid
  • DOPE 1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • arachidonic acid arachidonic acid.
  • Patent Document 1 describes a lipid particle containing gRNA, a cationic lipid and a noncationic lipid.
  • cationic lipids include 1,2-dilinoleyloxy-N, N-dimethylaminopropane (DLinDMA).
  • LNP containing Cas9 mRNA and gRNA into a mouse, indel was observed in Pcsk9 gene and HBV RT gene of hepatocytes.
  • Non-patent Document 2 mRNA of SpCas9 and modified sgRNA are expressed in mice using cKK-E12 (a lipid-like molecule that is a derivative from a lysine based dipeptide), cholesterol, C14PEG2000 and LNP made using DOPE. It is described that indel was observed in the Pcsk9 gene, Fah gene and Rosa26 gene of hepatocytes by intravenous injection.
  • Patent Document 2 discloses a viral vector (for example, adeno-associated virus (AAV)) of a gene encoding gRNA and Cas9 for the purpose of correcting deficiency of mouse dystrophin gene (Dmd) to treat Duchenne muscular dystrophy. It is described to be used for delivery to muscle cells and the like.
  • AAV adeno-associated virus
  • a recombinant AAV including a vector carrying sgRNA and spCas9 gene for skipping the exon is administered by injection. It has been described that dystrophin is positive in parts of myofibers and cardiomyocytes.
  • Patent Document 3 also describes that genes such as Dmd can be corrected by delivering genes encoding gRNA and Cas9 to muscle cells and the like.
  • Examples Examples 9, 11 and the like
  • Non-Patent Document 3 describes that gRNA and mRNA of SaCas9 or mRNA of SpCas9 were intravenously or intramuscularly administered to mdx mice (muscular dystrophy model) by AAV, and deletion of exon 23 was observed in cardiac muscle and skeletal muscle. It is done.
  • An object of the present invention is to provide a delivery technique for delivering a gene modification tool capable of realizing high gene modification efficiency in various cells.
  • a lipid particle formed of a compound represented by the following formula (a kind of cationic lipid) or a salt thereof and another structural lipid Can efficiently deliver guide RNA (gRNA), RNA-inducible nuclease protein represented by Cas9 or a nucleic acid containing a sequence encoding the same, etc. into various cells, and the above problems can be solved
  • gRNA guide RNA
  • Cas9 RNA-inducible nuclease protein represented by Cas9
  • nucleic acid containing a sequence encoding the same etc.
  • Formula (I) [In the formula (I), n is an integer of 2 to 5, R represents a linear C 1-5 alkyl group, a linear C 7-11 alkenyl group or a linear C 11 alkadienyl group Each wavy line indicates a cis or trans bond independently. ]
  • a compound represented by or a salt thereof 2) structured lipids, and 3) A composition for inducing genetic modification at a target locus in a cell, comprising a guide RNA or a DNA comprising a sequence encoding the same, and / or a nucleic acid comprising an RNA-inducible nuclease or a sequence encoding the same.
  • the RNA-inducible nuclease is Cas9; Guide RNA is (A) chimeric RNA, or (b) two or more RNAs including crRNA and tracrRNA
  • the composition according to Item 1 which is [2a] The composition according to Item 1, wherein the RNA-inducible nuclease is Cpf1. [3] Item 3. The composition according to item 1 or 2, wherein Cas9 is purulent Streptococcus-derived Cas9. [4] Item 4. The composition according to any one of Items 1 to 3, wherein the guide RNA is two or more types of guide RNAs. [5] Item 5. The composition according to any one of Items 1 to 4, wherein the cells are muscle cells.
  • Guide RNA is (1) a chimeric RNA comprising the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or (2) (i) a crRNA comprising the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4; Or tracrRNA comprising the nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 8 7.
  • the RNA-inducible nuclease is Cas9; Guide RNA is (A) chimeric RNA, or (b) two or more RNAs including crRNA and tracrRNA 9.
  • Cas9 is purulent Streptococcus-derived Cas9.
  • the target locus comprises a nucleotide sequence of a dystrophin gene.
  • Guide RNA is (1) a chimeric RNA comprising the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or (2) (i) a crRNA comprising the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4; Or tracrRNA comprising the nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 8
  • Item 14 A cell in which a target locus obtained by the method according to any one of items 8 to 13 is modified.
  • a medicament comprising the composition according to item 6.
  • RNA-inducible nuclease is Cas9; Guide RNA is (A) chimeric RNA, or (b) two or more RNAs including crRNA and tracrRNA
  • Guide RNA is (A) chimeric RNA, or (b) two or more RNAs including crRNA and tracrRNA
  • Item 17 The medicament according to Item 15 or 16, wherein Cas9 is S. pylori-derived Cas9.
  • Guide RNA is (1) a chimeric RNA comprising the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or (2) (i) a crRNA comprising the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4; Or tracrRNA comprising the nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 8
  • Item 20 The medicine according to any one of Items 15 to 19, which is a repairable dystrophin protein producing agent.
  • a method for preventing and / or treating muscular dystrophy in a mammal which comprises administering an effective amount of the composition according to item 6 or 7 to the mammal.
  • Item 8. A method for producing repairable dystrophin protein in a mammal, which comprises administering an effective amount of the composition according to Item 6 or 7 to a mammal.
  • composition according to item 6 or 7 for use in the prophylaxis or treatment of muscular dystrophy.
  • Item 8. A method for producing a cell having a modified target locus, which comprises the step of contacting the cell with the composition according to any one of items 1 to 7. [26] (1) contacting the composition according to any one of items 1 to 7 with a non-human mammal fertilized egg, an embryonic stem cell or an oocyte; (2) selecting the fertilized egg, embryonic stem cell or oocyte in which the target locus has been modified, and (3) selecting the selected fertilized egg, embryonic stem cell or oocyte as a non-human mammal A method of producing a non-human mammal having a modified target locus, which comprises the step of implanting in a female animal.
  • Formula (I) [In the formula (I), n is an integer of 2 to 5, R represents a linear C 1-5 alkyl group, a linear C 7-11 alkenyl group or a linear C 11 alkadienyl group Each wavy line indicates a cis or trans bond independently.
  • a lipid particle dispersion comprising a compound represented by the formula: or a salt thereof, and 2) a structured lipid, 3) mixing with a guide RNA or a DNA containing a sequence encoding the same, and / or an aqueous solution containing an RNA-inducible nuclease or a nucleic acid containing a sequence encoding the same;
  • Item 28 The production method according to Item 27, wherein the guide RNA is two or more types of guide RNAs.
  • the compound represented by the formula (I) may be described as “the compound (I)”.
  • the “compound represented by the formula (I) or a salt thereof” may be referred to as “the compound of the present invention”.
  • the “lipid particle containing the compound represented by the formula (I) or a salt thereof (the compound of the present invention)” may be referred to as “the lipid particle of the present invention”.
  • a DNA comprising a guide RNA or a sequence encoding the same, and / or a nucleic acid comprising an RNA-inducible nuclease or a sequence encoding the same may be referred to as "the active ingredient of the present invention”.
  • a guide RNA or a DNA containing a sequence encoding it may be referred to as “gRNA etc.”
  • an "RNA-inducible nuclease or a nucleic acid containing a sequence encoding this” may be referred to as “RNA-inducible nuclease etc.”
  • a composition containing the compound of the present invention, a structural lipid, gRNA or the like and an RNA-inducible nuclease or the like may be referred to as "the composition of the present invention”.
  • the shape of the lipid particle of the present invention is not particularly limited.
  • a complex in which the compound of the present invention or the like is assembled so as to constitute a sphere a complex which is assembled without constituting a specific shape, a complex dissolved in a solvent And a complex uniformly or nonuniformly dispersed in a dispersion medium.
  • RNA-inducible nuclease or the like such as gRNA used for the CRISPR system as an active ingredient into various cells, tissues or organs.
  • FIG. 1 shows the results of [1-3] “Evaluation of DNA mutation transduction efficiency using MmRosa26sgRNA in C57BL / 6J mice” in Example 1.
  • FIG. 1 shows the results of [1-3] “Evaluation of DNA mutation transduction efficiency using MmRosa26sgRNA in C57BL / 6J mice” in Example 1.
  • FIG. 2 shows an electropherogram for [2-4] “evaluation of DNA mutation introduction efficiency in skeletal muscle” in Example 2 and the result of mutation (indel) introduction efficiency calculated from its concentration.
  • FIG. 3 shows an electropherogram for [2-5] “exon skipping efficiency evaluation in skeletal muscle” in Example 2 and the result of the exon skipping efficiency calculated from its concentration.
  • FIG. 4 shows the results of Western blotting and the expression level of dystrophin protein (relative value of dystrophin / Gapdh) calculated from the concentration of [2-6] “evaluation of dystrophin protein recovery in skeletal muscle” in Example 2. Indicates FIG.
  • FIG. 5 shows the results of the electrophoresis diagram and the mutation (indel) introduction efficiency calculated from the concentration for [3-4] “evaluation of DNA mutation introduction efficiency in human iPS cell-derived myoblasts” in Example 3.
  • FIG. 6 shows an electropherogram for [3-5] “exon skipping efficiency evaluation in human iPS cell-derived myoblasts” in Example 3 and the result of the exon skipping efficiency calculated from the concentration thereof.
  • FIG. 7 shows an electropherogram for [4-5] “exon skipping efficiency evaluation in human iPS cell-derived myoblasts” in Example 4 and the result of the exon skipping efficiency calculated from the concentration thereof.
  • FIG. 6 shows an electropherogram for [3-5] “exon skipping efficiency evaluation in human iPS cell-derived myoblasts” in Example 3 and the result of the exon skipping efficiency calculated from the concentration thereof.
  • FIG. 7 shows an electropherogram for [4-5] “exon skipping efficiency evaluation in human iPS cell-derived myoblasts”
  • FIG. 8 shows Western blot and the expression amount of dystrophin protein (distrophin / GAPDH calculated from [4-6] “evaluation of dystrophin protein recovery in human iPS cell-derived myoblasts” in Example 4). Relative value) is shown.
  • FIG. 9 shows the results of the mutagenesis efficiency in Example 5 “Analysis of DNA cleavage activity in various tissues upon intravenous administration of LNP”.
  • FIG. 10 shows the results of the exon skipping efficiency in Example 6 “exon skipping efficiency evaluation in skeletal muscle using Dual sgRNAs”.
  • the dystrophin protein shown in FIGS. 4 and 8 is a repairable dystrophin protein (human dystrophin protein translated from mRNA in which exon 43 and exon 46 are linked).
  • linear C 1-5 alkyl group examples include methyl, ethyl, propyl, butyl and pentyl.
  • examples of the “linear C 7-11 alkenyl group” include 1-heptenyl, 2-heptenyl, 3-heptenyl, 4-heptenyl, 5-heptenyl, 6-heptenyl, 1-octenyl, 2 -Octenyl, 3-octenyl, 4-octenyl, 5-octenyl, 6-octenyl, 7-octenyl, 1-nonenyl, 2-nonenyl, 3-nonenyl, 4-nonenyl, 5-nonenyl, 6-nonenyl, 7-nonenyl , 8-nonenyl, 1-decenyl, 2-decenyl, 3-decenyl, 4-decenyl, 5-decenyl, 6-decenyl, 7-decenyl, 8-decenyl, 9-decenyl, 1-undecenyl, 2-undecenyl, 2-unde
  • examples of the “linear C 11 alkadienyl group” include 1,3-undecadienyl, 1,4-undecadienyl, 1,5-undecadienyl, 1,6-undecadienyl, 1,7-undecadienyl, 1 , 8-Undecadienyl, 1,9-Undecadienyl, 1,10-Undecadienyl, 2,4-Undecadienyl, 2,5-Undecadienyl, 2,6-Undecadienyl, 2,7-Undecadienyl, 2, 8-Undecadienyl, 2, 9 -Undecadienyl, 2,10-undecadienyl, 3,5-undecadienyl, 3,6-undecadienyl, 3,7-undecadienyl, 3,8-undecadienyl, 3,9-undecadienyl, 3,10-undecadienyl, 4,
  • n and wavy line in formula (I) are as follows.
  • n is preferably an integer of 3 to 5, and more preferably 3.
  • the wavy lines are preferably both cis bonds.
  • Compound (I) a compound wherein n is an integer of 3 to 5 and R is a linear C 7-11 alkenyl group in cis form, and both wavy lines are cis form.
  • Compound (B) a compound wherein n is 4 and R is a linear C 11 alkadienyl group in cis form at both of two carbon-carbon double bonds, and the wave lines are both cis form bonds .
  • Compound (A1) a compound wherein n is an integer of 3 to 5 and R is a cis form of 5-heptenyl, 7-nonenyl or 9-undecenyl and the wave line is a cis form.
  • Compound (B1) A compound wherein n is 4 and R is a cis-form 2,5-undecadienyl at both of two carbon-carbon double bonds, and the wave lines are both cis-form bonds.
  • Compound (C1) A compound wherein n is 2 or 3, R is methyl, propyl or pentyl and the wave lines are both cis-linkage.
  • a further preferred embodiment of the compound (I) is 3-((4- (dimethylamino) butanoyl) oxy) -2,2-bis (((9Z, 9'Z) -tetradeca-9-enoyloxy) methyl) Propyl (9Z) -tetradeca-9-enoate.
  • the salt of compound (I) is preferably a pharmacologically acceptable salt, such as a salt with an inorganic base, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, basicity or acidity Salts with amino acids may be mentioned.
  • a pharmacologically acceptable salt such as a salt with an inorganic base, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, basicity or acidity Salts with amino acids may be mentioned.
  • salts with inorganic bases include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts; aluminum salts and ammonium salts. Preferred are sodium salts, potassium salts, calcium salts and magnesium salts, and more preferred are sodium salts and potassium salts.
  • salts with organic bases include trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, tromethamine [tris (hydroxymethyl) methylamine], tert-butylamine, cyclohexylamine, benzylamine, Examples thereof include salts with dicyclohexylamine, N, N-dibenzylethylenediamine.
  • salts with inorganic acids include salts with hydrofluoric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitric acid, sulfuric acid and phosphoric acid.
  • salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid And salts with p-toluenesulfonic acid.
  • salts with basic amino acids include salts with arginine, lysine and ornithine.
  • salts with acidic amino acids include salts with aspartic acid and glutamic acid.
  • the compounds of the invention form lipid particles with a structured lipid.
  • this lipid particle encapsulates a guide RNA or a DNA containing a sequence encoding the same, and / or a nucleic acid containing an RNA-inducible nuclease or a sequence encoding the same.
  • the structured lipid is not particularly limited as long as it can form lipid particles after being mixed with the compound of the present invention to prepare a mixed lipid component.
  • structural lipids for example, Sterols (eg, cholesterol, cholesterol ester, cholesterol hemisuccinic acid, etc.); Phospholipids (eg, phosphatidyl choline (eg, dipalmitoyl phosphatidyl choline, distearoyl phosphatidyl choline, lysophosphatidyl choline, dioleoylphosphatidyl choline, palmitoyl oleoyl phosphatidyl choline, dilinorenoyl phosphatidyl choline, MC-1010 (NOF CORPORATION), MC-2020 (NOF CORPORATION)) , MC-4040 (NOF CORPORATION, etc.), Phosphatidylserine (eg, dipalmitoyl
  • the ratio of the compound of the present invention to the structured lipid in the composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the purpose.
  • the structural lipid when a lipid particle is formed by a mixed lipid component containing the compound of the present invention and a structural lipid, the structural lipid is usually 0.008 to 1 mol per 1 compound of the present invention.
  • the ratio is 4 moles, preferably 0.4 to 1.5 moles.
  • the compound of the present invention is usually 1 to 4 moles, sterols are usually 0 to 3 moles, phospholipids are usually 0 to 2 moles, polyethylene glycol lipids are usually It is a ratio of 0 to 1 mole.
  • a more preferable embodiment when the compound of the present invention and other lipid component are mixed and used is 1 to 1.5 mol of the compound of the present invention, 0 to 1.25 mol of sterols, 0 to 0.5 mol of phospholipid And a ratio of 0 to 0.125 moles of polyethylene glycol lipid.
  • a substance for inducing genetic modification at a target locus in a cell specifically, a DNA containing a guide RNA or a sequence encoding the same, and / or an RNA corresponding to the CRISPR system
  • a nucleic acid containing an inducible nuclease or a sequence encoding it is used.
  • basic matters about substances corresponding to the CRISPR system for genetic modification are well known, and various applied matters are also known, and those well known or known matters are also known for the present invention. It can be applied (see, for example, the prior art documents listed above). Those skilled in the art can design, select, and manufacture appropriate ones for each element of the target locus and the CRISPR system, depending on the purpose.
  • Cells and target loci can be appropriately selected depending on the purpose of genetic modification, and are not particularly limited, but typically, cells involved in genetic diseases and that may be targets for gene therapy And the locus.
  • compositions of the invention can be used to introduce active ingredients into many types of cells, tissues or organs.
  • the cells to which the present invention can be applied include, for example, mesenchymal stem cells, neural stem cells, skin stem cells, squamous cells, nerve cells, glial cells, pancreatic B cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, Epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells (eg, skeletal muscle cells, cardiomyocytes, myoblasts, muscle satellite cells, smooth muscle cells), adipocytes, blood cells (eg, macrophages, T cells) , B cells, natural killer cells, mast cells, leukocytes, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, megakaryocytes, hematopoietic stem cells), synoviocytes, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, rupture Osteocytes, mamm
  • any tissue or organ in which the above-mentioned cells are present for example, brain, each part of brain (eg, olfactory bulb, bald nucleus, basal bulb, cerebrum, hippocampus, Thalamus, hypothalamus, subthalamic nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, substantia nigra), spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, Liver, gonads, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal, skin, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, peripheral blood cells, prostate, placenta, uterus , Bones, joints
  • the cells are muscle cells (eg cardiomyocytes, skeletal muscle cells, muscle satellite cells), fibroblasts, mesenchymal stem cells, blood cells or iPS cells, more preferably muscle cells (In particular, skeletal muscle cells or muscle satellite cells) are preferred.
  • muscle cells are collected from humans (patients or healthy persons) or other mammals (eg, non-human primates (cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, chimpanzees etc.), disease model animals such as cattle, pigs, mice, rats etc.) Muscle cells, muscle cells of living bodies (eg, in vivo), muscle cell lines, and muscle cells induced to differentiate from stem cells (eg, iPS cells, ES cells).
  • mammals eg, non-human primates (cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, chimpanzees etc.), disease model animals such as cattle, pigs, mice, rats etc.
  • Muscle cells muscle cells of living bodies (eg, in vivo), muscle cell lines, and muscle cells induced to differentiate from stem cells (eg, iPS cells, ES cells).
  • the target locus comprises the nucleotide sequence of the dystrophin gene.
  • the dystrophin gene is a large gene of over 2.2 million bases, which is present on the X chromosome. There are various isoforms depending on the transcription start point, and there are various isoforms, Dp71 expressed in whole body, Dp116 expressed in terminal nerve cells, Dp140 expressed in brain and kidney, Dp260 expressed in retina, Dp417p expressed in Purkinje nerve cells , Dp 427 b expressed in the brain, and D p 427 m expressed in skeletal muscle are known.
  • the dystrophin protein produced from Dp 427m isoform is a protein mainly expressed in muscle cells, which binds to cytoskeleton actin through the actin binding domain present on the N-terminal side, and is high on the C-terminal side
  • the cysteine domain also binds to the dystroglycan complex and constitutes a cytoskeleton with actin.
  • the dystrophin gene of the Dp 427m isoform is composed of 79 exons.
  • Duchenne muscular dystrophy functional by having a deletion or duplication mutation of any exon of the dystrophin gene, or by point mutation (nonsense mutation) or insertion deletion mutation (frame shift mutation) of bases in the exon
  • the dystrophin protein is scarcely expressed (less than 3% of the protein content of a healthy person as detected by Western blotting).
  • Becker's muscular dystrophy patients who are relatively milder than Duchenne muscular dystrophy, normal dystrophin protein if there is no stop codon in the middle even if exon deletion or base point mutation is present. It expresses a dystrophin protein in which the amino acid sequence is shorter or in which some amino acids are substituted.
  • deletion of one or more exons accounts for more than half.
  • the exon 44 and the exon 55 is known as a site where many deletions are often found.
  • exon skipping is performed for any exon by referring to previously reported articles (eg van Deutekom JC, van Ommen GJ., Nat Rev Genet. 2003). It can be confirmed that the appropriate repair type dystrophin can be expressed.
  • a method of adjusting the reading frame by introducing a microdeletion or insertion into the dystrophin gene other than exon skipping, or homologous recombination of the deleted exon can also be implemented by inserting by means of, for example.
  • dystrophin gene If there is an abnormality in the dystrophin gene as described above, (i) by not incorporating (skipping) one or more exons into the mRNA, the exons before and after that will be prevented so that a frame shift does not occur. Correct the abnormality by any operation such as linking, (ii) correcting a frameshift by inserting or deleting one or more bases, (iii) knocking in a deleted exon can do.
  • a dystrophin protein is produced in which the amino acid sequence is shorter or longer than that of a normal dystrophin protein, or in which some amino acids are substituted.
  • normal dystrophin protein can also be produced by the above (ii) or (iii). Such modification of the dystrophin gene makes it possible to prevent or treat diseases such as muscular dystrophy.
  • the nucleotide sequence of the human dystrophin gene is available, for example, from the National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1756).
  • the guide RNA may be in the form of a single RNA linked with crRNA and tracrRNA, ie, a chimeric RNA (sometimes referred to as a single guide RNA, sgRNA etc.), or one unlinked one. It may be in the form of RNA (combination of two RNAs, or combination of more RNAs).
  • the composition of the present invention may contain such a guide RNA in the form of RNA itself or in the form of a DNA (such as an expression plasmid) containing a sequence encoding the guide RNA.
  • the guide RNA may be in a form targeting one base sequence (one sgRNA, or one set of crRNA and tracrRNA), or a form targeting two or more base sequences (two or more sgRNA, or two or more sets of crRNA and tracrRNA).
  • each target base sequence may be referred to as a “type” of guide RNA. Therefore, in the present specification, a guide RNA in a form targeted to two or more base sequences may be described as “two or more types of guide RNAs”.
  • the guide RNA is preferably two or more types.
  • the distance between the base sequences targeted by these guide RNAs is not particularly limited, but it is preferable that the target sequences of two guide RNAs do not overlap. Moreover, it is preferable that the target sequences of two guide RNAs are separated by one or more bases.
  • the DNA cleavage site generated by the CRISPR system using these two types of guide RNAs is a specific base sequence on a target locus or target locus in a cell that induces genetic modification. It is preferred to include.
  • including the nucleotide sequence means that a DNA cleavage site is present upstream and downstream of the nucleotide sequence.
  • the target sequences of the two types of guide RNAs are not particularly limited.
  • the target recognition sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 can be a base sequence to be hybridized.
  • the crRNA of the present invention is a nucleic acid sequence (about 18 to 20 bases in length) that hybridizes to a specific base sequence (sometimes referred to herein as "target sequence") in a target locus in a cell. In the text, it may be referred to as "target recognition sequence”.
  • the target recognition sequence is preferably the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • the crRNA comprises the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • the crRNA comprises the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
  • the target sequence is flanked by a short sequence (PAM (proto-spacer flanking motif)) recognized by the CRISPR system.
  • PAM proto-spacer flanking motif
  • Conditions for PAM sequence and length vary depending on the type of nuclease used, but PAM is typically a 2-5 base pair sequence adjacent to the target sequence.
  • the guide RNA is a chimeric RNA (sgRNA) comprising the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • sgRNA chimeric RNA
  • the guide RNA comprises (i) a crRNA comprising the nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 and (ii) the nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 It is a combination of tracrRNA.
  • Sequence number 1 Example “HsDMDEx 45 # 1” corresponding sgRNA whole sequence 5′-U (M) ⁇ G (M) ⁇ G (M) ⁇ UAUCUACAAGGACACUCGUUUAGAGCUGAAAUAUAGCAAGUUAAAAAGGCUAGUCCAUUACAACUGAAAAGUGAGCCAGCAGAGUCG (M) ⁇ U (M) ⁇ (M) 3 ' SEQ ID NO: 2: Example “HsDMDEx 45 # 23” corresponding sgRNA whole sequence 5′-A (M) ⁇ G (M) ⁇ C (M) UG AG 3 ' SEQ ID NO: 3: Target recognition sequence of SEQ ID NO: 5'- U (M) ⁇ G (M) ⁇ G (M) ⁇ UAUCUUACAGGAACUCC-3 ' SEQ ID NO: 4: Target recognition sequence of SEQ ID NO 2 5′-A (M) ⁇ G (M) ⁇ C (M) ⁇ UGUCAGACAGAAAAAA G
  • the bond between 2'-O-methyl riboses or the bond between 2'-O-methyl ribose and ribose represented by " ⁇ " in SEQ ID NOs: 1 to 8 is a phosphodiester bond, although it may be a phosphorothioate bond, it is preferably a phosphorothioate bond.
  • the target recognition sequence of the present invention has a sequence substantially identical to the nucleic acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3 and 4 above.
  • the crRNA and chimeric RNA (sgRNA) of the present invention have substantially the same sequence as the nucleic acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1, 2, 5 and 6 above in the sequences other than the target recognition sequence.
  • the tracrRNA of the present invention has a sequence substantially identical to the nucleic acid sequence represented by any of SEQ ID NOS: 7 and 8 above.
  • substantially identical sequences herein is meant sequences having at least about 75% sequence identity.
  • the target recognition sequences of the present invention have at least 75%, 76%, 77%, 78%, 79, and the corresponding SEQ ID NOs. %, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, It may have 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity.
  • the sequence identity is preferably at least 85% or 90%, more preferably at least 95% or 97%, particularly preferably at least 99%.
  • sequence identity means the percentage (%) of base pairs that match between the two sequences when the two gene sequences are aligned so as to maximize the base pair match.
  • Sequence identity may be determined by any method known to the person skilled in the art. For example, it can be determined by Clustal (Gene 73, 1,237-244, 1988), which is a multiple alignment program by Higgins et al. The Clustal program is available, for example, on the Internet website of the European Bioinformatics Institute (EBI).
  • RNA-inducible nucleases used in the present invention include RNA-inducible endonucleases.
  • RNA-inducible endonuclease comprises at least one nuclease domain and at least one domain that interacts with gRNA.
  • RNA-inducible endonucleases are induced by gRNA to target sites in the genome.
  • RNA-inducible endonucleases may be derived from a clustered regulated interspersed short palindromic repeats (Crisps) / Crisps-associated (Cas) system.
  • the CRISPR / Cas system can be Type I, Type III, Type IV in Class 1, or Type II, Type V, and Type VI systems in Class 2.
  • Non-limiting examples of suitable CRISPR / Cas proteins include Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (or CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8a, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas10d, Cas12a (or Cpf1), Cas12b (or C2c1), Cas12c, Cas13a1 (or C2c2), Cas13a2, Cas13b, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (or CasA), Cse2 (or CasB), Cse3 (or CasE), Cse4 (or CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cm 3, Cmr4, Cmr5, C
  • the RNA-inducible endonuclease is from a class 2 type II CRISPR / Cas system. In certain embodiments, the RNA inducible endonuclease is derived from a Cas9 protein.
  • the Cas9 protein is a purulent Streptococcus (Streptococcus pyogenes), Streptococcus thermophilus, Streptococcus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus, Nocardiposis rouge viei, Streptomyces pristinae espilalis, Streptomyces viridochromogene Ness (Streptomyces viridochromogenes), Streptosporium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenithedos, Iggiobacterium sibiricum (Exiguobacterium sibiricum), Franciella nobiida (Francisella novicida) ), Lactobacillus ⁇ L.
  • the RNA-inducible endonuclease is from the class 2 type V CRISPR-Cas 12a / Cpf1 system. In certain embodiments, the RNA-inducible endonuclease is derived from a Cpf1 protein.
  • the Cpf1 protein may be derived from Acidaminococci, Lachnospiraceae, Chlamydomonas reinhardtii, Francisella nonicida.
  • the CRISPR / Cas protein may be a wild type CRISPR / Cas protein, a modified CRISPR / Cas protein, or a fragment of a wild type or modified CRISPR / Cas protein.
  • the CRISPR / Cas protein may be modified to increase nucleic acid binding affinity and / or specificity, alter enzyme activity, or alter other properties of the protein.
  • the RNA-inducible nuclease may be a Cas nuclease or a Cas nickase.
  • Cas nuclease or Cas nickase refers to an essential protein component in the CRISPR / Cas system, and forms a complex with two RNAs called CRISPR RNA (crRNA) and trans-activated crRNA (tracrRNA).
  • CRISPR RNA CRISPR RNA
  • tracrRNA trans-activated crRNA
  • nickase refers to a DNA cleaving enzyme that puts a nick only in one DNA strand.
  • the Cas9 protein contains at least two nuclease (ie, DNase) domains.
  • the Cas9 protein can comprise a RuvC-like nuclease domain and an HNH-like nuclease domain.
  • the RuvC and HNH domains cooperate to cleave a single strand to effect a duplex cleavage in DNA (Jinek et al., Science, 337: 816-821).
  • the Cas9-derived protein may be modified to include only one functional nuclease domain (either RuvC-like or HNH-like nuclease domain).
  • the protein from Cas9 may be modified such that one of the nuclease domains is deleted or mutated such that it is no longer functional (ie there is no nuclease activity).
  • the Cas9-derived protein can introduce a nick into the double stranded nucleic acid but can not cleave double stranded DNA.
  • aspartate to alanine conversion (D10A) in the RuvC-like domain converts a Cas9 derived protein to a nickase.
  • histidine to alanine conversion (H840A or H839A) in the HNH domain converts the Cas9 derived protein into a nickase.
  • Each nuclease domain can be modified using well known methods such as site-directed mutagenesis, PCR-mediated mutagenesis, and whole gene synthesis, as well as other methods known in the art.
  • the RNA-inducing nucleases include, among others, Cas nucleases or Cas nickases derived from Streptococcus sp. (Streptococcus sp.) Or Staphylococcus sp. (Staphylococcus sp.), Francicella novicida (Francisella novicida), Campylobacter jejuni (Campylobacter jejuni) It can be used.
  • S. pyogenes is preferred as a source of origin
  • Staphylococcus spp. S. aureus is preferred.
  • the Cas9 nuclease or Cas9 nickase from purulent Streptococcus recognizes NGG or NAG trinucleotides as PAM sequences.
  • composition of the present invention may contain such RNA-inducible nuclease in the form of a protein, or a nucleic acid (mRNA or DNA such as an expression plasmid) containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the protein Etc.) may be included.
  • a nucleic acid mRNA or DNA such as an expression plasmid
  • a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the protein Etc.
  • Cas9 is preferred.
  • Cas9 is Cas9 (SpCas9) derived from S. pyogenes (P. pyogenes).
  • S. pyogenes S. pyogenes
  • Cas9 those derived from various bacteria or archaea are known, and in the present invention, Cas9 having a desired nuclease activity, for example, Cas9 (SaCas9) derived from Staphylococcus aureus (S. aureus), is also known. Can be used.
  • the ratio of the active ingredient of the present invention to the compound of the present invention and the structured lipid (or lipid particles formed by them) in the composition of the present invention can be appropriately adjusted according to the purpose and the type of the active ingredient.
  • the composition of the present invention when a lipid particle is formed by the mixed lipid component containing the compound of the present invention and the structural lipid, and RNA is encapsulated in the lipid particle as the active component of the present invention,
  • the active ingredient of the present invention is usually in a proportion of 1 to 20% by mass, preferably 2 to 10% by mass, based on the mass of the lipid particles (that is, the total mass of the compound of the present invention and the structured lipid).
  • RNA ribonucleic acid
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • nucleic acid may contain only naturally occurring ribonucleotides or deoxyribonucleotides, and optionally in addition to them, nuclease resistant In order to improve, stabilize, improve the affinity to a complementary nucleic acid, improve the cell permeability, etc., it may contain nucleotide analogues in which a part of the structure of these molecules is modified.
  • nucleotide analogues examples include sugar-modified nucleotides (2′-O-methyl ribose, 2′-O-propyl ribose, 2′-O-methoxyethoxy ribose, 2′-O-methoxyethyl ribose, 2′- O- [2- (guanidinium) ethyl] ribose, 2'-O-fluoro ribose etc .; Cross-linked artificial nucleic acid (BNA) (locked artificial nucleic acid (LNA), ethylene-cross-linked artificial nucleic acid (ENA) etc.); Phosphate diester bond modified nucleotides (such as substitution of phosphodiester bond to phosphorothioate bond, substitution of N3′-P5 ′ phosphoamidate bond, etc.) can be mentioned.
  • BNA cross-linked artificial nucleic acid
  • LNA locked artificial nucleic acid
  • ENA ethylene-cross-linked artificial
  • the nucleic acid may be 5'-polyamine adduct, cholesterol adduct, steroid adduct, bile acid adduct, vitamin adduct, fluorochrome adduct, biotin adduct derivative or the like.
  • RNA may be single-stranded or double-stranded.
  • the guide RNA is preferably the nucleotide analogue.
  • nucleotide analogues sugar-modified nucleotides and phosphodiester bond-modified nucleotides are preferable, and more specifically, substitution of phosphorothioate bonds of 2'-O-methyl ribose and phosphodiester bonds is preferable.
  • at least one base at both 3 'and 5' ends of the sequence is preferably a nucleotide analogue, and at least two bases or 3 'bases of both 3' and 5 'ends of the sequence are nucleotides More preferably, they are analogues.
  • the guide RNA is a chimeric RNA
  • both guide RNA and the like and RNA-inducible nuclease and the like are in the form of a gene construct such as an expression plasmid
  • both a sequence encoding guide RNA and a sequence encoding RNA-inducible nuclease protein are contained in one gene construct. Or their sequences may be contained in separate gene constructs.
  • the gene construct may optionally contain sequences of promoter, enhancer, start codon, stop codon, polyadenylation signal, nuclear localization signal (NLS), drug selection gene, reporter gene and the like.
  • the composition of the present invention comprises (i) only a guide RNA or the like (a guide RNA or a DNA comprising a sequence encoding the same), and an RNA-inducible nuclease or the like (a RNA comprising an RNA-inducible nuclease or a sequence encoding the same) And (ii) an embodiment containing only an RNA-inducible nuclease etc., and an embodiment containing both a guide RNA etc. and an RNA-inducible nuclease etc. May be When a guide RNA or the like is included, the guide RNA may be of one type, or two or more types. In one aspect of the composition of the present invention, two or more types of guide RNAs are preferred.
  • the lipid particle in the composition may encapsulate only one of a plurality of elements required for the CRISPR system, or may encapsulate a plurality of types (eg, mRNA of gRNA and Cas9). It may be done.
  • a lipid particle encapsulates a plurality of elements, for example, an aqueous solution containing each element at an appropriate concentration (ratio) may be used at the time of its production.
  • the composition of the present invention may contain multiple types of lipid particles encapsulating one type of element.
  • lipid particles that encapsulate only gRNA and lipid particles that encapsulate Cas9 mRNA may be mixed in the composition.
  • each element may be made to have an appropriate concentration (ratio) while considering the modification efficiency of the gene and the like.
  • the lipid particle encapsulating the gRNA or the like and the lipid particle encapsulating the RNA-inducible nuclease or the like into the cell by the same composition (mixed solution) or by separate compositions. Is added.
  • composition of the present invention comprising lipid particles encapsulating both gRNA etc and RNA inducible nuclease etc is added to cells.
  • compositions of the present invention can be used stably, with low toxicity and safely.
  • an effective amount of the active ingredient in the composition of the present invention is applied to the subject (human or non-human mammal, preferably human) to be administered.
  • the composition may be administered to be delivered to targeted cells.
  • the composition of the present invention When the composition of the present invention is used in vitro or as a reagent, the composition of the present invention (especially, the active ingredient contained therein) is encapsulated in cells being cultured, for example, by adding to the culture medium. The effective amount of the active ingredient may be transferred into cells by contacting the lipid particle).
  • the concentration of the active components (guide RNA and the like and RNA-inducible nuclease and the like) in the composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the use of the composition, and is not particularly limited.
  • the composition of the present invention when used in vitro, the composition is stored as a composition containing the active ingredient at a high concentration, and the composition diluted with an appropriate solvent to a suitable concentration is prepared.
  • it may be added to a medium or the like to be used.
  • a medium (culture fluid) to which a lipid particle having the active ingredient of the present invention encapsulated is added is also an embodiment of the composition of the present invention, and it is one of the active ingredients encapsulated in lipid particles in the medium.
  • the concentration can also be adjusted accordingly.
  • the raw materials and reagents used in each step of the following production method, and the obtained compound may each form a salt.
  • Such salts include, for example, those similar to the salts in the aforementioned compounds of the present invention.
  • the compound obtained in each step When the compound obtained in each step is a free compound, it can be converted to a target salt by a known method. Conversely, when the compound obtained in each step is a salt, it can be converted to a free form or another type of desired salt by known methods.
  • the compound obtained in each step may be used as the reaction solution or as a crude product and then used in the next reaction, or the compound obtained in each step may be concentrated from the reaction mixture according to a conventional method It can be isolated and / or purified by separation means such as crystallization, recrystallization, distillation, solvent extraction, fractionation, chromatography and the like.
  • the reaction time may vary depending on the reagent and solvent to be used, but unless otherwise specified, it is usually 1 minute to 48 hours, preferably 10 minutes to 8 hours.
  • the reaction temperature may vary depending on the reagent and solvent to be used, but unless otherwise specified, it is usually -78 ° C to 300 ° C, preferably -78 ° C to 150 ° C.
  • the pressure may differ depending on the reagent and solvent to be used, but unless otherwise specified, it is usually 1 to 20 atm, preferably 1 to 3 atm.
  • a microwave synthesizer such as Biotage's Initiator may be used.
  • the reaction temperature may vary depending on the reagent and solvent to be used, but unless otherwise specified, it is usually room temperature to 300 ° C., preferably room temperature to 250 ° C., more preferably 50 ° C. to 250 ° C.
  • the reaction time may vary depending on the reagent and solvent used, but unless otherwise specified, it is usually 1 minute to 48 hours, preferably 1 minute to 8 hours.
  • the reagent is used in an amount of 0.5 to 20 equivalents, preferably 0.8 to 5 equivalents, relative to the substrate, unless otherwise specified.
  • the reagent is used as a catalyst, the reagent is used in 0.001 equivalent to 1 equivalent, preferably 0.01 equivalent to 0.2 equivalent, relative to the substrate.
  • the reagent also serves as the reaction solvent, the amount of the solvent is used.
  • Alcohols methanol, ethanol, isopropanol, isobutanol, tert-butyl alcohol, 2-methoxyethanol etc .
  • Ethers diethyl ether, diisopropyl ether, diphenyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane etc .
  • Aromatic hydrocarbons chlorobenzene, toluene, xylene etc .
  • Saturated hydrocarbons cyclohexane, hexane, heptane etc .
  • Amides N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone and the like
  • Halogenated hydrocarbons dichloromethane, carbon tetrachloride etc .
  • Nitriles acetonitrile, etc .
  • Sulfoxides dimethyl sulfoxide and the like
  • Aromatic organic bases pyridine and the like
  • Acid anhydrides acetic anhydride etc .
  • Inorganic bases sodium hydroxide, potassium hydroxide, magnesium hydroxide etc .
  • Basic salts sodium carbonate, calcium carbonate, sodium hydrogen carbonate etc .
  • Organic bases triethylamine, diethylamine, pyridine, 4-dimethylaminopyridine, N, N-dimethylaniline, 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane, 1,8-diazabicyclo [5.4.0]- 7-Undecene, imidazole, piperidine etc .
  • Metal alkoxides sodium ethoxide, potassium tert-butoxide, sodium tert-butoxide etc .
  • Alkali metal hydrides sodium hydride etc .
  • Metal amides sodium amide, lithium diisopropylamide, lithium hexamethyldisilazide etc .
  • Organic lithiums n-butyllithium, sec-butyllithium and the like.
  • an acid or acidic catalyst is used in the reaction of each step, for example, the acid or acidic catalyst shown below, or the acid or acidic catalyst described in the examples is used.
  • Inorganic acids hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid etc .
  • Organic acids acetic acid, trifluoroacetic acid, citric acid, p-toluenesulfonic acid, 10-camphorsulfonic acid, etc .
  • Lewis acid boron trifluoride diethyl ether complex, zinc iodide, anhydrous aluminum chloride, anhydrous zinc chloride, anhydrous iron chloride and the like.
  • protection or deprotection reaction of a functional group is carried out according to a known method, for example, Wiley-Interscience 2007, “Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed.” (Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts). The method is carried out according to the method described in Thieme Corporation 2004 “Protecting Groups 3rd Ed.” (P. J. Kocienski), etc. or the method described in the examples.
  • protecting groups for hydroxyl group and phenolic hydroxyl group such as alcohol include, for example, ether type such as methoxymethyl ether, benzyl ether, p-methoxybenzyl ether, t-butyldimethylsilyl ether, t-butyldiphenylsilyl ether, tetrahydropyranyl ether and the like Protective groups; carboxylic acid ester type protective groups such as acetic acid ester; sulfonic acid ester type protective groups such as methane sulfonic acid ester; carbonate type protective groups such as t-butyl carbonate and the like.
  • Examples of the protecting group for the carbonyl group of aldehyde include an acetal type protecting group such as dimethyl acetal; and a cyclic acetal type protecting group such as cyclic 1,3-dioxane.
  • Examples of the protective group for the carbonyl group of ketone include ketal type protective groups such as dimethyl ketal; cyclic ketal type protective groups such as cyclic 1,3-dioxane; oxime type protective groups such as O-methyloxime; And hydrazone type protective groups such as dimethyl hydrazone.
  • protecting groups for carboxyl groups include ester-type protecting groups such as methyl ester; and amide-type protecting groups such as N, N-dimethylamide.
  • thiol protecting group examples include ether-type protecting groups such as benzyl thioether; and ester-type protecting groups such as thioacetic acid ester, thiocarbonate and thiocarbamate.
  • the removal of the protecting group can be carried out by known methods, for example, acid, base, ultraviolet light, hydrazine, phenylhydrazine, sodium N-methyldithiocarbamate, tetrabutylammonium fluoride, palladium acetate, trialkylsilyl halide (eg, trimethylsilyl iodide) , Trimethylsilyl bromide), a reduction method, or the like.
  • the reducing agent used is lithium aluminum hydride, sodium triacetoxyborohydride, sodium cyanoborohydride, diisobutylaluminum hydride (DIBAL-H), sodium borohydride
  • Metal hydrides such as triacetoxyborohydride and tetramethylammonium hydride; boranes such as borane-tetrahydrofuran complex; Raney nickel; Raney cobalt; hydrogen; formic acid and the like.
  • Raney nickel or Raney cobalt can be used in the presence of hydrogen or formic acid.
  • a catalyst such as palladium-carbon or Lindlar catalyst.
  • examples of the oxidizing agent used include m-chloroperbenzoic acid (MCPBA), hydrogen peroxide, peracids such as t-butyl hydroperoxide, etc .; tetrabutyl ammonium perchlorate, etc.
  • MCPBA m-chloroperbenzoic acid
  • hydrogen peroxide hydrogen peroxide
  • peracids such as t-butyl hydroperoxide, etc .
  • tetrabutyl ammonium perchlorate etc.
  • Perchlorates such as sodium chlorate; chlorites such as sodium chlorite; periodic acids such as sodium periodate; high-valent iodine reagents such as iodosylbenzene; manganese dioxide Reagents having manganese such as potassium manganate; Leads such as lead tetraacetate; pyridinium chlorochromate (PCC), pyridinium dichromate (PDC), reagents having chromium such as Jones reagent; N-bromosuccinimide (NBS) Halogen compounds such as; oxygen; ozone; sulfur trioxide / pyridine complex; male tetraoxide Um; dioxide Zeren; 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone (DDQ) and the like.
  • PCC pyridinium chlorochromate
  • PDC pyridinium dichromate
  • NBS N-bromosuccinimide
  • radical initiator When performing radical cyclization reaction in each process, as a radical initiator used, azo compounds such as azobisisobutyronitrile (AIBN); 4-4′-azobis-4-cyanopentanoic acid (ACPA) Water soluble radical initiators; triethyl boron in the presence of air or oxygen; benzoyl peroxide and the like. Further, as a radical reaction agent to be used, tributylstannane, tristrimethylsilylsilane, 1,1,2,2-tetraphenyldisilane, diphenylsilane, samarium iodide and the like can be mentioned.
  • AIBN azobisisobutyronitrile
  • ACPA 4-4′-azobis-4-cyanopentanoic acid
  • tributylstannane tristrimethylsilylsilane, 1,1,2,2-tetraphenyldisilane, diphenylsilane, samarium iod
  • Examples of the Wittig reagent used include alkylidene phosphoranes and the like.
  • Alkylidene phosphoranes can be prepared by known methods, for example, by reacting a phosphonium salt with a strong base.
  • phosphonoacetic acid esters such as methyl dimethylphosphonoacetate and ethyl diethylphosphonoacetate
  • bases such as alkali metal hydrides and organic lithiums It can be mentioned.
  • examples of reagents used include Lewis acids and acid chlorides or alkylating agents (eg, halogenated alkyls, alcohols, olefins, etc.).
  • Lewis acids eg, halogenated alkyls, alcohols, olefins, etc.
  • an organic acid or inorganic acid can be used, and instead of the acid chloride, an acid anhydride such as acetic anhydride can be used.
  • a nucleophile eg, amines, imidazole etc.
  • a base eg, basic salts, organic bases etc.
  • nucleophilic addition reaction When performing nucleophilic addition reaction with carbanion, nucleophilic 1,4-addition reaction with carbanion (Michael addition reaction), or nucleophilic substitution reaction with carbanion in each step, a base used to generate carbanion And organic lithiums, metal alkoxides, inorganic bases, organic bases and the like.
  • examples of the Grignard reagent include aryl magnesium halides such as phenyl magnesium bromide; and alkyl magnesium halides such as methyl magnesium bromide and isopropyl magnesium bromide.
  • the Grignard reagent can be prepared by a known method, for example, by reacting an alkyl halide or aryl halide with metallic magnesium using ether or tetrahydrofuran as a solvent.
  • active methylene compounds eg, malonic acid, diethyl malonate, malononitrile etc.
  • bases eg, organic bases, etc. sandwiched between two electron withdrawing groups Metal alkoxides, inorganic bases
  • examples of the azidation agent to be used include diphenylphosphoryl azide (DPPA), trimethylsilyl azide, sodium azide and the like.
  • DPPA diphenylphosphoryl azide
  • examples of azidation agent to be used include diphenylphosphoryl azide (DPPA), trimethylsilyl azide, sodium azide and the like.
  • DPPA diphenylphosphoryl azide
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5,4,0] undec-7-ene
  • the reducing agent used includes sodium triacetoxyborohydride, sodium cyanoborohydride, hydrogen, formic acid and the like.
  • the substrate is an amine compound
  • examples of the carbonyl compound used include paraformaldehyde as well as aldehydes such as acetaldehyde and ketones such as cyclohexanone.
  • the amines to be used include ammonia, primary amines such as methylamine; secondary amines such as dimethylamine, and the like.
  • azodicarboxylic acid esters eg, diethyl azodicarboxylate (DEAD), diisopropyl azodicarboxylate (DIAD), etc.
  • triphenylphosphine eg, triphenylphosphine
  • acyl chloride such as acid chloride and acid bromide
  • acid anhydride active ester
  • sulfuric acid ester And activated carboxylic acids.
  • Carbodiimide-based condensing agents such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSCD) as a carboxylic acid activating agent; 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-) Triazine-based condensing agents such as triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride-n-hydrate (DMT-MM); Carbonate-based condensing agents such as 1,1-carbonyldiimidazole (CDI); diphenyl Phosphorus azide (DPPA); benzotriazol-1-yloxy-trisdimethylaminophosphonium salt (BOP reagent); 2-chloro-1-methyl-pyridinium iodide (Mukayama reagent); thionyl chloride; haloformic acid such as ethyl chloroformate Lower alkyl; O- (7-azabenzotriazol-1-yl)
  • additives such as 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), N-hydroxysuccinimide (HOSu), dimethylaminopyridine (DMAP) and the like may be further added to the reaction.
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • HOSu N-hydroxysuccinimide
  • DMAP dimethylaminopyridine
  • the metal catalyst used is palladium (II) acetate, tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0), dichlorobis (triphenylphosphine) palladium (II), dichlorobis (triethyl) Phosphine compounds such as phosphine) palladium (II), tris (dibenzylideneacetone) dipalladium (0), 1,1'-bis (diphenyl phosphino) ferrocene palladium (II) chloride, palladium (II) acetate etc; Nickel compounds such as phenyl phosphine) nickel (0); rhodium compounds such as tris (triphenyl phosphine) rhodium (III) chloride; cobalt compounds; copper compounds such as copper oxide and copper (I) iodide; platinum compounds etc. Be Furthermore, a base may be added to the reaction,
  • diphosphorus pentasulfide is used as the thiocarbonylating agent, but in addition to diphosphorus pentasulfide, 2,4-bis (4-methoxyphenyl) Reagents with 1,3,2,4-dithiadiphosphetan-2,4-disulfide structure such as 1,3), 2,4-dithiadiphosphetan-2,4-disulfide (Lowesson's reagent) May be used.
  • N-iodosuccinimide N-bromosuccinimide (NBS), N-chlorosuccinimide (NCS), bromine, sulfuryl chloride and the like
  • NBS N-bromosuccinimide
  • NCS N-chlorosuccinimide
  • the reaction can be accelerated by adding a radical initiator such as heat, light, benzoyl peroxide, azobisisobutyronitrile or the like to the reaction.
  • an acid halide of a hydrohalic acid and an inorganic acid specifically, in chlorination, hydrochloric acid, thionyl chloride, oxy
  • a method of obtaining a halogenated alkyl from an alcohol by the action of triphenylphosphine and carbon tetrachloride or carbon tetrabromide may be used.
  • a method may be used in which a halogenated alkyl is synthesized through a two-step reaction in which an alcohol is converted to a sulfonic acid ester and then reacted with lithium bromide, lithium chloride or sodium iodide.
  • examples of the reagent to be used include alkyl halides such as ethyl bromoacetate; and phosphites such as triethyl phosphite and tri (isopropyl) phosphite.
  • a sulfone esterification reaction is carried out in each step, as a sulfonating agent to be used, methanesulfonyl chloride, p-toluenesulfonyl chloride, methanesulfonic acid anhydride, p-toluenesulfonic acid anhydride, trifluoromethanesulfonic acid anhydride Things etc.
  • an acid or a base is used as a reagent.
  • formic acid, triethylsilane or the like may be added to reductively trap the by-produced t-butyl cation.
  • examples of the dehydrating agent used include sulfuric acid, phosphorus pentoxide, phosphorus oxychloride, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide, alumina, polyphosphoric acid and the like.
  • Compound (I) can be produced, for example, by the following process.
  • any of the compounds in which both of the wavy lines are in a cis form and the compounds in which one or both of the wavy lines are in a trans form are produced by the same production method as described below. be able to.
  • it is possible to synthesize a compound (I) of a desired structure by using an appropriate raw material according to the structure of the target compound (I), particularly in esterification.
  • the salt of compound (I) can be obtained by appropriate mixing with an inorganic base, an organic base, an organic acid, a basic or acidic amino acid.
  • lipid particle containing the compound of the present invention a composition containing the lipid particle and a guide RNA or a DNA encoding the same, and / or a nucleic acid containing an RNA-inducible nuclease or a sequence encoding the same
  • the manufacturing method of is described.
  • the lipid particle of the present invention can be produced by a known method for preparing a lipid particle from a lipid component after the compound of the present invention (cationic lipid) is mixed with other lipid components.
  • it can be produced as a lipid particle dispersion by dissolving the above (mixed) lipid component in an organic solvent and mixing the resulting organic solvent solution with water or a buffer (for example, an emulsification method).
  • the above mixing can be performed using a microfluidic mixing system (for example, NanoAssemblr device (Precision NanoSystems)).
  • the obtained lipid particles may be subjected to desalting or dialysis and sterile filtration.
  • pH adjustment and osmotic pressure adjustment may be performed as necessary.
  • Compound (I) can have a plurality of structures according to a combination of n, R and the definition of wavy line of formula (I).
  • one type of compound having a specific structure may be used alone as the compound (I), or may be used as a mixture of a plurality of types of compounds having different structures.
  • “Other lipid components” include structured lipids as described above, such as sterols, phospholipids, polyethylene glycol lipids.
  • the “other lipid component” is used, for example, 0.008 to 4 mol, per 1 mol of the compound of the present invention.
  • the compounds of the invention are preferably used in admixture with other lipid components, in particular cholesterol, phosphatidyl choline and polyethylene glycol lipids.
  • Preferred embodiments when the compound of the present invention and the other lipid component are mixed and used are 1 to 4 mol of the compound of the present invention, 0 to 3 mol of sterols, 0 to 2 mol of phospholipid and 0 to 1 of polyethylene glycol lipid. It is a mixture of moles.
  • a more preferable embodiment when the compound of the present invention and other lipid component are mixed and used is 1 to 1.5 mol of the compound of the present invention, 0 to 1.25 mol of sterols, 0 to 0.5 mol of phospholipid And a mixture of 0 to 0.125 moles of polyethylene glycol lipid.
  • the concentration of the compound of the present invention or the mixture of the compound of the present invention and other lipid components in the organic solvent solution described above is preferably 0.5 to 100 mg / mL.
  • organic solvent examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, tert-butanol, acetone, acetonitrile, N, N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, or a mixture thereof.
  • the organic solvent may contain 0-20% water or buffer.
  • an acidic buffer eg, acetate buffer, citrate buffer, 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer, phosphate buffer
  • a neutral buffer eg, 4- (2) Hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer, tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) buffer, phosphate buffer, phosphate buffered saline (PBS)
  • the flow rate of the mixture is preferably 0.1 to 10 mL / min, and the temperature is preferably 15 to 45 ° C.
  • composition of the present invention can be used as a nucleic acid as an active ingredient in water or buffer when producing lipid particles or lipid particle dispersions (for example, a DNA containing a guide RNA or a sequence encoding the same, and / or an RNA derivative type
  • lipid particles or lipid particle dispersions for example, a DNA containing a guide RNA or a sequence encoding the same, and / or an RNA derivative type
  • a lipid particle dispersion containing an active ingredient can be prepared by adding and including a nuclease or a nucleic acid containing a sequence encoding the same.
  • the active ingredient is preferably added such that the concentration of the active ingredient in water or buffer is 0.05 to 2.0 mg / mL.
  • water or a buffer containing an active ingredient “includes an active ingredient (a guide RNA or a DNA comprising a sequence encoding the same, and / or an RNA-inducible nuclease or a nucleic acid comprising a sequence encoding the same) It may be described as "aqueous solution”.
  • composition of the present invention containing two or more types of guide RNA as an active ingredient
  • the composition of the present invention can also be produced as a lipid particle dispersion containing an active ingredient by mixing the lipid particle or lipid particle dispersion with the active ingredient or an aqueous solution thereof by a known method.
  • the lipid particle dispersion can be prepared by dispersing lipid particles in a suitable dispersion medium.
  • an aqueous solution of the active ingredient can be prepared by dissolving the active ingredient in a suitable solvent.
  • the content of the compound of the present invention in the composition of the present invention excluding the dispersion medium and the solvent is preferably 40 to 70% by weight.
  • the content of the active ingredient in the composition of the present invention excluding the dispersion medium and the solvent is preferably 1 to 20% by weight.
  • the dispersion medium of the lipid particle dispersion or the dispersion containing the composition can be replaced by water or buffer by dialysis.
  • the dialysis is performed at 4 ° C. to room temperature using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 10 to 20 K. Repeated dialysis may be performed. Tangential flow filtration (TFF) may be used to replace the dispersion medium.
  • pH adjustment and osmotic pressure adjustment may be performed as necessary.
  • lipid particle containing the compound of the present invention a composition containing the lipid particle and a guide RNA or a DNA encoding the same, and / or a nucleic acid containing an RNA-inducible nuclease or a sequence encoding the same Describe the analysis method of
  • the particle size of the lipid particles (in the composition) can be measured by known means. For example, using Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments), a particle size measurement device based on NIBS (non-contact back scattering) technology, it can be calculated as a Z average particle size by cumulant analysis of an autocorrelation function.
  • the particle size (average particle size) of the lipid particles (in the composition) is preferably 10 to 200 nm.
  • a nucleic acid Concentration and inside of a nucleic acid (specifically, a guide RNA or a DNA containing the sequence encoding the same, and / or a nucleic acid containing the RNA inducible nuclease or the sequence encoding the same) as an active ingredient in the composition of the present invention
  • the sealing ratio can be measured by a known means. For example, fluorescently labeled nucleic acid using the Quant-iT TM RiboGreen (TM) (Invitrogen), it is possible to determine the concentration and the encapsulating rate by measuring the fluorescence intensity.
  • TM Quant-iT TM RiboGreen
  • the concentration of nucleic acid in the composition can be calculated using a standard curve generated from an aqueous solution of nucleic acid whose concentration is known, and the encapsulation rate is Triton-X100 (surfactant for disintegrating lipid particles) It can calculate based on the difference in the fluorescence intensity by the existence of addition of.
  • the concentration in the composition refers to the total concentration of the nucleic acid encapsulated in the lipid particle and the nucleic acid not encapsulated, and the encapsulation ratio is encapsulated in the lipid particle of the entire nucleic acid in the composition. Refers to the proportion of
  • composition of the present invention can, in one embodiment, be used in a method of modifying a target locus in a cell, comprising the step of contacting the cell with the composition of the present invention. Such methods yield cells in which the target locus has been altered.
  • composition of the present invention can, in one embodiment, be used to produce a medicament comprising the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention can be prepared or formulated as a pharmaceutical.
  • the medicament is an agent for the prophylaxis or treatment of dystrophin abnormality (eg, muscular dystrophy (Duchenne muscular dystrophy), dystrophin gene-related dilated cardiomyopathy), or restorable dystrophin protein producing agent.
  • dystrophin abnormality eg, muscular dystrophy (Duchenne muscular dystrophy), dystrophin gene-related dilated cardiomyopathy), or restorable dystrophin protein producing agent.
  • the composition of the present invention can be administered in an effective amount to cause dystrophinopathy (eg, muscular dystrophy (eg, Duchenne muscular dystrophy, Becker muscular dystrophy) in a mammal).
  • dystrophinopathy eg, muscular dystrophy (eg, Duchenne muscular dystrophy, Becker muscular dystrophy) in a mammal).
  • Dytrophin gene-related dilated cardiomyopathy in particular for the method for preventing and treating Duchenne muscular dystrophy or for the method for producing restorative dystrophin protein .
  • Muscular dystrophy is defined as "a hereditary disease in which degeneration and necrosis of skeletal muscle are the main lesions, and clinically, progressive muscle weakness is observed".
  • muscular dystrophies Duchenne muscular dystrophy, Becker muscular dystrophy, Emily-Dorpes muscular dystrophy, limb musculoskeletal dystrophy, congenital muscular dystrophy, triophile muscular dystrophy, distal muscular dystrophy, facial scapulohumeral muscular dystrophy, and myotonic dystrophy Etc. are known.
  • Dystrophin abnormality refers to various diseases caused by a defective or dysfunctional dystrophin protein due to a dystrophin gene mutation. These include Duchenne muscular dystrophy, Becker muscular dystrophy, and dystrophin gene-related dilated cardiomyopathy. Skeletal myopathy is often the main symptom, but there are cases where skeletal muscle symptoms are not seen. It may be accompanied by hyper-CKemia, myoglobinuria, dilated cardiomyopathy, cognitive dysfunction, etc.
  • Duchenne muscular dystrophy is the most common disease in children with muscular dystrophy, with a prevalence of 4-5 per 100,000 population. It is caused mainly by progressive muscle atrophy and dysfunction of the dystrophin gene on the X chromosome due to mutation. In Duchenne muscular dystrophy, more than half of the patients have single or multiple exon defects. The dystrophin gene mutation causes a shift in the protein reading frame, a stop codon appears along the way, and the dystrophin protein is not synthesized, leading to a series of symptoms.
  • repairable dystrophin protein refers to dystrophin protein whose expression has been restored as a result of genome editing.
  • it refers to a dystrophin protein retaining the N-terminal actin binding domain and the C-terminal high cysteine domain whose expression has been restored by using genome editing with respect to a dystrophin gene having a frameshift mutation or nonsense mutation.
  • a frame shift mutation is generated due to exon duplication, if one of the overlapping exons is skipped by genome editing, expression of a repairable dystrophin protein having 100% homology with a healthy type may be restored.
  • the repairable dystrophin protein particularly refers to a human dystrophin protein in which the exon 45 is skipped in the human dystrophin gene from which the exon 44 has been deleted, and translated from mRNA in which the exon 43 and the exon 46 are linked. Besides this, for example, in human dystrophin gene deleted in exons 12-44, 18-44, 46-47, 46-48, 46-49, 46-51, 46-53 or 46-55, respectively.
  • the human dystrophin protein produced by skipping a predetermined exon is also included in the repairable dystrophin protein, but is not limited thereto.
  • the repairable dystrophin protein has been produced by using the composition of the present invention can be confirmed, for example, by detecting mRNA encoding the repairable dystrophin protein in cells by PCR. it can. Alternatively, Western blotting can be performed using an antibody that recognizes dystrophin protein to confirm from the molecular weight of dystrophin protein.
  • composition of the present invention can, in one embodiment, be used in a method of producing a target locus modified cell, comprising the step of contacting the cell with the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention comprises the steps of: (1) contacting the composition of the present invention with a fertilized egg, an embryonic stem cell or an oocyte of a non-human mammal, (2) a target locus Selecting the modified fertilized egg, embryonic stem cell or oocyte, and (3) implanting the selected fertilized egg, embryonic stem cell or oocyte into a non-human mammalian female animal It can be used in a method for producing a non-human mammal in which a target locus has been modified, including.
  • the cells to be contacted with the composition of the present invention can be, for example, pluripotent stem cells such as iPS cells, germ cells such as sperm stem cells and primordial germ cells, in addition to the above cells .
  • Selection in step (2) may be performed by a general screening method in a CRISPR system using a drug resistance gene, or may be performed by PCR and sequence confirmation.
  • the drug resistant gene expression unit is included in a knockin or knockout vector, and after the drug resistant gene is expressed in a fertilized egg or the like in which knockin or knockout has occurred to a target locus by the CRISPR system, cell population By treating with a drug, it is possible to select a fertilized egg or the like whose target locus has been altered.
  • composition used in the various methods, medicaments, and embodiments according to the present invention as described above are as described above, for example, a guide RNA etc. contained in the composition, an RNA-inducible nuclease etc.
  • RNA-inducible nuclease etc.
  • the details and preferred embodiments of the cells and target loci are the same as in the invention relating to the method using the composition, medicine, use and the like.
  • the medicament of the present invention is preferably an injection such as intravenous injection, intraarterial injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, etc. If delivery can be made, it is also possible to make it the dosage form adapted to it. As injections, intravenous injection or intramuscular injection is preferred.
  • the medicament of the present invention can optionally contain a pharmaceutically acceptable substance, such as water for injection when prepared as an injection, a solvent, an additive and the like.
  • a pharmaceutically acceptable substance such as water for injection when prepared as an injection, a solvent, an additive and the like.
  • the amount or concentration of the active ingredient in the medicament of the present invention is a dosage form, administration route, dose per dose, so that an effective amount of the active ingredient for the desired prophylactic or therapeutic effect can be delivered to the target cells. It can adjust suitably, considering the administration frequency etc. in a fixed period.
  • the administration route is preferably intravenous (systemic) administration or intramuscular administration.
  • treatment refers to altering a gene at a target locus in a certain percentage of cells in a living body (in a tissue or in an organ) of a subject who has already developed a disease to cause the disease. It refers to repairing the base sequence of a certain gene.
  • prevention can be a cause of disease by altering a gene at a target locus in a certain percentage of cells in a living body (in a tissue or in an organ) of a subject who has not yet developed a disease or condition. It refers to repairing the base sequence of a gene.
  • Examples of the abnormality in the base sequence of the gene causing the above-mentioned disease include gene mutations involved in the disease (for example, deletion of exon 44, which is found in some patients with Duchenne muscular dystrophy).
  • deletion of exon 44 which is found in some patients with Duchenne muscular dystrophy.
  • production of repairable dystrophin protein is induced (sometimes called dystrophin protein recovery), As a result, the disease can be treated and prevented.
  • Symptoms of muscular dystrophy include, but are not limited to, muscle weakness, muscle atrophy, loss of exercise capacity, gait disorder, myocardial disease and the like. Treatment of muscular dystrophy includes the amelioration of these symptoms, and the delay in onset or progression.
  • the therapeutic effect of muscular dystrophy can be evaluated by determining whether it affects the onset, progression or symptoms of muscular dystrophy. More specifically, for example, the therapeutic effect of muscular dystrophy is measured by measuring muscle weight, muscle cross-sectional area, tension of isolated skeletal muscle, muscle force (eg, grip strength), exercise ability (eg, treadmill ability), etc. It can be confirmed.
  • Root temperature in the following examples usually indicates about 10 ° C to about 35 ° C.
  • the ratio shown in the mixed solvent indicates the volume ratio unless otherwise specified.
  • 1 H NMR was measured by Fourier transform NMR.
  • ACD / SpecManager (trade name) software etc. were used for the analysis of 1 H NMR.
  • a very mild peak such as a hydroxyl group or an amino group is not described.
  • MS was measured by LC / MS and MALDI / TOF MS.
  • ESI method APCI method or MALDI method was used.
  • CHCA was used as a matrix. Data described actual value (found).
  • molecular ion peaks are observed, but sometimes as fragment ions.
  • a molecular ion peak in free form, a cationic species, an anionic species or a fragment ion peak is usually observed.
  • MS mass spectrum M: molar concentration N: normality CDCl 3: deuterated chloroform DMSO-d 6: deuterated dimethyl sulfoxide 1 H NMR: proton nuclear magnetic resonance LC / MS: liquid chromatograph mass spectrometer ESI: electrospray ionization, electrospray ionization APCI: atmospheric pressure chemical ionization, atmospheric pressure chemical ionization MALDI: Matrix-assisted laser desorption / ionization, Marixix Assisted laser desorption ionization TOFMS: Time-of-flight mass spectrometry, time-of-flight mass spectrometry CHCA: ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid DMF: N, N-dimethylformamide THF: tetrahydrofuran DMAP: 4-dimethylaminopyridine TBAF: tetrabutylammonium fluoride
  • nucleotide sequences of MmRosa26 sgRNA SEQ ID NO: 9
  • HsDMDEx 45 # 1 sgRNA and HsDMDEx 45 # 23 sgRNA respectively corresponding to SEQ ID NOs: 1 and 2 used in the following Examples are as follows: .
  • the obtained lipid solution and nucleic acid solution are mixed at room temperature by NanoAssemblr (Precision NanoSystems) at a flow rate ratio of 2.7 mL / min: 5.3 mL / min, and a dispersion containing lipid particles encapsulating a nucleic acid Obtained.
  • the resulting dispersion was dialyzed against water at 4 ° C. for 1 hour and PBS against PBS at 4 ° C. for 18 hours using Slyde-A-Lyzer (fractional molecular weight of 20 k, Thermo scientific).
  • MmRosa26 sgRNA (Gene Design, see Table 1 above) was dissolved in 10 mM 2-MES solution pH 5.5 to obtain a 0.15 mg / mL nucleic acid solution.
  • the obtained lipid solution and nucleic acid solution are mixed at room temperature by NanoAssemblr (Precision NanoSystems) at a flow rate ratio of 2.7 mL / min: 5.3 mL / min, and a dispersion containing lipid particles encapsulating a nucleic acid Obtained.
  • the resulting dispersion was dialyzed against water at 4 ° C. for 1 hour and PBS against PBS at 4 ° C. for 18 hours using Slyde-A-Lyzer (fractional molecular weight of 20 k, Thermo scientific).
  • Genomic DNA is extracted and purified from frozen muscle tissue using QIAamp Fast DNA Tissue Kit (Qiagen), and PCR (Forward primer; SEQ ID NO: 10, Reverse primer; SEQ ID NO: 11) is performed using PrimeSTAR GXL DNA polymerase (TAKARA)
  • the PCR product was purified with QIAquick PCR purification kit (QIAGEN), treated with T7 Endonuclease I (NEB), and analyzed using Agilent 4200 TapeStation (Agilent). The results are shown in FIG. SEQ ID NO: 10 5'- CTCCGAGGCGGATCACAAGCAATAATAACCTGTAG-3 '
  • SEQ ID NO: 11 5'- TGCAAGCACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAG-3 '
  • Example 2 DNA mutagenic activity using HsDMDEx 45 # 1 sgRNA in human DMD exon 45 knock in-mouse Dmd exon 44 knockout mouse, exon skipping effect and repair type dystrophin protein expression effect
  • HsDMDEx 45 # 1 sgRNA (Gene Design, see Table 1 above) was dissolved in 10 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) solution pH 5.5 to obtain a 0.15 mg / mL nucleic acid solution.
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid
  • the obtained lipid solution and nucleic acid solution are mixed at room temperature by NanoAssemblr (Precision NanoSystems) at a flow rate ratio of 2.7 mL / min: 5.3 mL / min, and a dispersion containing lipid particles encapsulating a nucleic acid Obtained.
  • the resulting dispersion was dialyzed against water at 4 ° C. for 1 hour and PBS against PBS at 4 ° C. for 18 hours using Slyde-A-Lyzer (fractional molecular weight of 20 k, Thermo scientific).
  • the ES cell line was microinjected into tetraploid blastocysts of ICR mice to obtain chimeric mice.
  • Female human DMD exon 45 heteroknockin mice were obtained by in vitro fertilization between chimeric mice and female C57BL / 6J mice.
  • SEQ ID NO: 12 5'- atgaatgtgcctacatatgg -3 ' SEQ ID NO: 13 5'- catagcatgcatttggcttc-3 ' SEQ ID NO: 14 5'-gaatgaggtagtgttgtagg -3 ' SEQ ID NO: 15 5'- gcaggaaatcatcttatagc-3 ' SEQ ID NO: 16 5'- gagcaagctgggttagaacaaaggtctgtcgatgggaatg aggtagtgtaggtag caggaaatagtgtggtttaggtctccccctctctgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt
  • PCR products were purified with QIAquick PCR purification kit (QIAGEN), re-annealed, treated with T7 Endonuclease I (NEB), electrophoresed using Agilent 4200 TapeStation (Agilent), and analyzed with the attached software.
  • the mutation introduction efficiency was determined by the following equation (Equation 1) using the obtained numerical values.
  • SEQ ID NO: 17 5'- CAAGTTTAAAATAGCAGAAAACCACTAACTAGCCA-3 '
  • SEQ ID NO: 18 5'- CTGACACATAAAAGGTGTCTTTCTGTCTGTCTCTC-3 '
  • Gapdh detection Sample buffer (Bio-Rad) containing a reducing agent (Thermo) was added to the supernatant adjusted to 0.02 ⁇ g / ⁇ L, and treated at 98 ° C. for 10 minutes. 0.2 ⁇ g / 10 ⁇ L of the reduced and heat-treated sample solution was added to a TGX ANY KD gel (Bio-Rad) and run at 200 V for 30 minutes. After the electrophoresis, the membrane was transferred to a PVDF membrane using Trasblot turbo system (Bio-Rad).
  • a reducing agent Thermo
  • the transferred PVDF membrane was blocked with iBind Solution (Thermo) for 5 minutes and subsequently HRP-labeled with anti-GAPDH antibody (1: 2000, Cell Signaling) diluted with dilution solution (TOYOBO) using iBind system (Themo) Blotting was performed with anti-rabbit IgG antibody (1: 5000, GE). After blotting, the PVDF membrane was washed with distilled water, immersed in ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE) for about 5 minutes, and detected with ChemiDoc (Bio-Rad).
  • GE ECL Prime Western Blotting Detection Reagent
  • Dystrophin detection Sample buffer (Thermo) containing a reducing agent (Thermo) was added to the supernatant adjusted to 3 ⁇ g / ⁇ L, and treated at 70 ° C. for 10 minutes. 30 ⁇ g / 10 ⁇ L of the reduced and heat-treated sample solution was added to 3-8% Tris-Acetate gel (Thermo), and electrophoresed at 150 V for about 90 minutes. After the electrophoresis, the membrane was transferred to a PVDF membrane using Trasblot turbo system (Bio-Rad).
  • Gapdh and dystrophin detected by ChemiDoc were analyzed by Image Lab software (Bio-Rad), and the relative expression level was calculated as repaired dystrophin / Gapdh. The above results are shown in FIG. Remarkable dystrophin expression was confirmed in the LNP administration group compared to the PBS administration group.
  • the medium was changed to alpha Minimal Essential Medium (SIGMA) medium containing 5% KSR and 1 ⁇ g / mL doxycycline, and cultured for 3 days.
  • the medium was reduced to 700 ⁇ L and a mixture of Cas9 mRNA-LNP (1,3 or 10 ⁇ g / well as mRNA) and HsDMDEx 45 # 1 sgRNA-LNP (1,3,10 ⁇ g / well as sgRNA) was added.
  • 1.3 mL of medium alpha Minimal Essential Medium, 5% KSR, 1 ⁇ g / mL doxycycline
  • the purified DNA fragments were reannealed, treated with T7 Endonuclease I (NEB), electrophoresed using an Agilent 4200 TapeStation (Agilent), and analyzed with the attached software.
  • the calculation formula of the mutagenesis efficiency is the same as in [2-4] (see the above equation 1). The results are shown in FIG.
  • TAKARA PrimeSTAR GXL DNA polymerase
  • the resulting PCR products were purified by QIAquick PCR purification kit (Qiagen), electrophoresed using an Agilent 4200 TapeStation, and analyzed with the attached software.
  • exon skipping efficiency is the same as in [2-5] (see the above equation 2).
  • the results are shown in FIG. SEQ ID NO: 21 5'- CTACAGGAAGCTCTCTCCCA -3 '
  • HsDMDEx 45 # 23 sgRNA-LNP Preparation of HsDMDEx 45 # 23 sgRNA-LNP
  • HsDMDEx 45 # 1 sgRNA HsDMDEx 45 # 1 sgRNA in Example 4, see Table 1
  • HsDMDEx45 # 23 sgRNA-LNP is similarly prepared except that “HsDmdEx45 # 23 sgRNA” (see “HsDMDEx45 # 23 sgRNA” in Table 1 above) is used instead, and the nucleic acid concentration, inner ring ratio, particle diameter And PDI were measured. The measurement results are shown in Table 5.
  • Gapdh detection To a cell lysate prepared to 0.083 ⁇ g / ⁇ L, Sample buffer (Bio-Rad) containing a reducing agent (Thermo) was added, and treated at 98 ° C. for 10 minutes. 1 ⁇ g / 12 ⁇ L of the reduced / heat-treated sample solution was added to 10% mini-protean TGX precast gel (Bio-Rad), and electrophoresed at 150 V for 40 minutes. After the electrophoresis, the membrane was transferred to a PVDF membrane using Trasblot turbo system (Bio-Rad).
  • Sample buffer Bio-Rad
  • a reducing agent Thermo
  • the transferred PVDF membrane was blocked with iBind Solution (Thermo) for 5 minutes and subsequently HRP-labeled with anti-GAPDH antibody (1: 1000, Cell Signaling) diluted with dilution solution (TOYOBO) using iBind system (Themo) Blotting was performed with anti-rabbit IgG antibody (1: 1000, GE). After blotting, the PVDF membrane was washed with distilled water, immersed in ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE) for about 5 minutes, and detected with ChemiDoc (Bio-Rad).
  • GE ECL Prime Western Blotting Detection Reagent
  • Dystrophin detection Sample buffer (Thermo) containing a reducing agent (Thermo) was added to the supernatant adjusted to 0.58 ⁇ g / ⁇ L, and treated at 70 ° C. for 10 minutes. 7 ⁇ g / 12 ⁇ L of the reduced / heat-treated sample solution was added to a 3-8% Tris-Acetate gel (Thermo), and was run at 150 V for about 90 minutes. After the electrophoresis, the membrane was transferred to a PVDF membrane using Trasblot turbo system (Bio-Rad).
  • GAPDH and dystrophin detected by ChemiDoc are analyzed by Image Lab (Bio-Rad), and the expression level of repairable dystrophin is corrected by GAPDH, and relative expression is made with 100% of dystrophin expression level in human iPS cells from healthy subjects The amount was calculated. The above results are shown in FIG.
  • the obtained lipid solution and nucleic acid solution are mixed at room temperature by NanoAssemblr (Precision NanoSystems) at a flow rate ratio of 2.7 mL / min: 5.3 mL / min, and a dispersion containing lipid particles encapsulating a nucleic acid Obtained.
  • the resulting dispersion was dialyzed against water at 4 ° C. for 1 hour and PBS against PBS at 4 ° C. for 18 hours using Slyde-A-Lyzer (fractional molecular weight of 20 k, Thermo scientific).
  • MmRosa26 sgRNA (Gene Design, see Table 1 above) was dissolved in 10 mM 2-MES solution pH 5.5 to obtain a 0.15 mg / mL nucleic acid solution.
  • the obtained lipid solution and nucleic acid solution are mixed at room temperature by NanoAssemblr (Precision NanoSystems) at a flow rate ratio of 2.7 mL / min: 5.3 mL / min, and a dispersion containing lipid particles encapsulating a nucleic acid Obtained.
  • the resulting dispersion was dialyzed against water at 4 ° C. for 1 hour and PBS against PBS at 4 ° C. for 18 hours using Slyde-A-Lyzer (fractional molecular weight of 20 k, Thermo scientific).
  • LNP From a tail vein of a 5-week-old male C57BL / 6J mouse, LNP in which 50 ⁇ g of mRosa26 sgRNA and 50 ⁇ g of SpCas9 mRNA were encapsulated was administered. After 7 days, after euthanasia by decapsidation bleeding under 3.5% isoflurane anesthesia, gastrocnemius muscle, tibialis anterior muscle, quadriceps femoris muscle, diaphragm and heart were collected and rapidly frozen with liquid nitrogen.
  • Genomic DNA of frozen tissue is extracted and purified using QIAamp Fast DNA Tissue Kit (Qiagen), and Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs Japan) and the primer set (Forward primer: said SEQ ID NO: 17, Reverse primer) shown below : It amplified using said sequence number 18).
  • the PCR product was purified with QIAquick 96 PCR BioRobot kit (QIAGEN), treated with T7 Endonuclease I (NEB), electrophoresed using an Agilent 4200 TapeStation (Agilent), and analyzed with the attached software.
  • the mutation introduction efficiency was determined by the above equation (see equation 1) using the obtained numerical values.
  • the obtained lipid solution and nucleic acid solution are mixed at room temperature by NanoAssemblr (Precision NanoSystems) at a flow rate ratio of 2.7 mL / min: 5.3 mL / min, and a dispersion containing lipid particles encapsulating a nucleic acid Obtained.
  • the resulting dispersion was dialyzed against water at 4 ° C. for 1 hour and PBS against PBS at 4 ° C. for 18 hours using Slyde-A-Lyzer (fractional molecular weight of 20 k, Thermo scientific).
  • the obtained lipid solution and nucleic acid solution are mixed at room temperature by NanoAssemblr (Precision NanoSystems) at a flow rate ratio of 2.7 mL / min: 5.3 mL / min, and a dispersion containing lipid particles encapsulating a nucleic acid Obtained.
  • the resulting dispersion was dialyzed against water at 4 ° C. for 1 hour and PBS against PBS at 4 ° C. for 18 hours using Slyde-A-Lyzer (fractional molecular weight of 20 k, Thermo scientific).
  • RNA Chloroform (WAKO) was added, and after mixing and centrifugation, a water bath containing RNA was separated and collected, and total RNA was extracted and purified using RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Total RNA is reverse transcribed using the High Capacity RNA-to-cDNA kit (Thermo), followed by Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs Japan) and the primer set (Forward primer: above SEQ ID NO: 19, Reverse) shown below. primer: It amplified using said sequence number 20). The RT-PCR product was purified by QIAquick PCR purification kit (QIAGEN), electrophoresed using Agilent 4200 TapeStation (Agilent), and analyzed by the attached software. The exon skipping efficiency was determined by the above equation (see Equation 2) using the obtained numerical values.
  • the compounds, lipid particles and compositions of the present invention make it possible to efficiently introduce gRNA and the like used in the CRISPR system, RNA-inducible nuclease and the like to various cells, tissues and organs.
  • the compounds, lipid particles and compositions of the invention are available as DDS technology in CRISPR systems.
  • the compounds, lipid particles and compositions of the present invention can be used as agents for preventing and treating various diseases such as muscular dystrophy and as research reagents.

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Abstract

本発明は、細胞における高い遺伝子改変効率の実現が可能な遺伝子改変ツールを送達するためのデリバリー手法を提供する。本発明に係る組成物は、１）式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、２）構造脂質、ならびに３）ガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸を含む、細胞中の標的遺伝子座における遺伝子改変を誘導するための組成物である。式（Ｉ）中、ｎは、２～５の整数を、Ｒは、直鎖状Ｃ１－５アルキル基、直鎖状Ｃ７－１１アルケニル基又は直鎖状Ｃ１１アルカジエニル基を、波線は、それぞれ独立して、シス型またはトランス型の結合を示す。

Description

標的遺伝子改変用組成物
　本発明は、活性成分としてＣＲＩＳＰＲシステムに用いられる物質を細胞内に導入することを可能とする組成物に関する。さらに本発明は、そのような組成物を用いて細胞中の標的遺伝子座における遺伝子改変を誘導する方法、例えば筋細胞のジストロフィン遺伝子を改変することにより筋ジストロフィーを予防または治療する方法に関する。
［発明の背景］
　近年、ゲノム編集手段、例えばＣＲＩＳＰＲ（Clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats）システムを利用して、様々な細胞中で遺伝子改変を行うための研究開発が進められている。しかしながら、注射等による生体への投与によって、目的とする細胞中に、ＣＲＩＳＰＲシステムで必要とされるｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）やＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９等）をコードする遺伝子などの遺伝子改変ツールを送達し、遺伝子改変を行うことについては報告が少なく、例えば筋細胞における高い遺伝子改変効率の実現が可能な遺伝子改変ツールを送達するためのデリバリー手法の開発が望まれている。ＣＲＩＳＰＲシステムとしては、クラス１とクラス２が知られており、クラス１の中ではタイプＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶが、クラス２の中ではタイプＩＩ、タイプＶ、およびタイプＶＩ知られている。遺伝子改変を行うにあたって、ＤＮＡに結合して切断するクラス２タイプＩＩのＣａｓ９が広く用いられているが、同じくＤＮＡを結合・切断するクラス２タイプＶのＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）やＣ２ｃ１（Ｃａｓ１２ｂ）なども利用されている。また、ＲＮＡに結合して切断するクラス２タイプＶＩのＣａｓ１３a（Ｃ２ｃ２）やＣａｓ１３ｂなども報告されている。
　細胞へのデリバリー手段の一つとして、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の核酸を内封することのできる脂質ナノ粒子（ＬＮＰ：lipid nanoparticle）が知られている。例えば肝細胞に対して、ＬＮＰによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの遺伝子改変ツールを送達することを記載した先行技術文献としては次のようなものが挙げられる。
　非特許文献１には、Ｃ１２－２００（脂質様分子）、コレステロール、Ｃ１４ＰＥＧ２０００（ポリエチレングリコール脂質）、ＤＯＰＥ（1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）及びアラキドン酸を用いて作製されたＬＮＰで、ＳｐＣａｓ９（Streptococcus pyogenes由来のCas 9）のｍＲＮＡを、ＡＡＶベクターでｇＲＮＡ及び相同組み換え修復（ＨＤＲ：Homology-directed repair）テンプレートを、それぞれＦａｈｍｕｔ／ｍｕｔマウスに静注することで、肝臓におけるＦａｈ＋細胞の割合が増加したことが記載されている。
　特許文献１には、ｇＲＮＡ、カチオン性脂質及び非カチオン性脂質を含む脂質粒子が記載されている。カチオン性脂質としては、１,２-ジリノレイルオキシ-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）などが例示されている。実施例では、Ｃａｓ９のｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含むＬＮＰをマウスに静注することで、肝細胞のＰｃｓｋ９遺伝子及びＨＢＶ　ＲＴ遺伝子においてｉｎｄｅｌが認められたことが記載されている。
　非特許文献２には、ｃＫＫ－Ｅ１２（リジンベースのジペプチドからの誘導体である脂質様分子）、コレステロール、Ｃ１４ＰＥＧ２０００及びＤＯＰＥを用いて作製されたＬＮＰを用いて、ＳｐＣａｓ９のｍＲＮＡ及び修飾ｓｇＲＮＡをマウスに静注することで、肝細胞のＰｃｓｋ９遺伝子、Ｆａｈ遺伝子及びＲｏｓａ２６遺伝子においてｉｎｄｅｌが認められたことが記載されている。
　一方、ＬＮＰ以外の手段によって、筋細胞等に対してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの遺伝子改変ツールを送達することを記載した先行技術文献としては次のようなものが挙げられる。
　特許文献２には、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するためにマウスジストロフィン遺伝子（Ｄｍｄ）の欠損を修正することを目的として、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードする遺伝子のウイルスベクター（例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））を用いて、筋細胞等へ送達することが記載されている。実施例では、Ｄｍｄのエクソン２３にナンセンス変異（ストップコドン）が生じているｍｄｘマウスに対して、当該エクソンをスキップするためのｓｇＲＮＡおよびｓｐＣａｓ９遺伝子を載せたベクターを含む組換えＡＡＶを注射により投与し、筋繊維および心筋細胞の一部においてジストロフィン陽性になったことが記載されている。
　特許文献３にも、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードする遺伝子等を筋細胞等に送達することにより、Ｄｍｄ等の遺伝子を修正することができると記載されている。実施例（実施例９、１１等）では、患者から採取した筋肉始原細胞集団に対して（生体外で）、Ｄｍｄのエクソン５１をスキップするためのｓｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９遺伝子を載せた発現プラスミドをエレクトロポレーションにより導入した後、その細胞集団を免疫不全マウスに移植して、当該マウスの体内でジストロフィンタンパクを発現できたことが記載されている。
　非特許文献３には、ｇＲＮＡ及びＳａＣａｓ９のｍＲＮＡもしくはＳｐＣａｓ９のｍＲＮＡをＡＡＶによりｍｄｘマウス（筋ジストロフィーモデル）に静注又は筋肉内投与し、心筋及び骨格筋においてエクソン２３のｄｅｌｅｔｉｏｎが認められたことが記載されている。
ＷＯ２０１６／１９７１３３号パンフレット ＷＯ２０１６／０２５４６９号パンフレット ＷＯ２０１４／１９７７４８号パンフレット
Yin et al., Nat.Biotech., 34 (2016) p329-333 Yin et al., Nat. Biotech., 35 (2017) p1179-1187 Tabebordbar et al., Science, 351 (2016) p407-411
　本発明の目的は、種々の細胞における高い遺伝子改変効率の実現が可能な遺伝子改変ツールを送達するためのデリバリー手法を提供することにある。
　本発明者らが上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、下記の式で示される化合物（カチオン性脂質の一種）またはその塩と他の構造脂質とにより形成される脂質粒子を用いることにより、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）や、Ｃａｓ９に代表されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼタンパク質またはこれをコードする配列を含む核酸などを、種々の細胞中に効率的に送達することができ、上記課題を解決可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は少なくとも以下の発明に関する。
［１］
　１）式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式（Ｉ）中、
　ｎは、２～５の整数を、
　Ｒは、直鎖状Ｃ１－５アルキル基、直鎖状Ｃ７－１１アルケニル基又は直鎖状Ｃ１１アルカジエニル基を、
　波線は、それぞれ独立して、シス型またはトランス型の結合を示す。］
で表される化合物又はその塩、
　２）構造脂質、並びに、
　３）ガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸を含む、細胞中の標的遺伝子座における遺伝子改変を誘導するための組成物。
［２］
　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９であり；
　ガイドＲＮＡが、
　（ａ）キメラＲＮＡ、又は
　（ｂ）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む２以上のＲＮＡ
である、項１記載の組成物。
［２ａ］
　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣｐｆ１である、項１記載の組成物。
［３］
　Ｃａｓ９が化膿性レンサ球菌由来Ｃａｓ９である、項１または項２記載の組成物。
［４］
　前記ガイドＲＮＡが２種類以上のガイドＲＮＡである、項１から項３のいずれかに記載の組成物。
［５］
　細胞が筋細胞である、項１から項４のいずれかに記載の組成物。
［６］
　標的遺伝子座が、ジストロフィン遺伝子のヌクレオチド配列を含む、項１から項５のいずれかに記載の組成物。
［７］
　ガイドＲＮＡが、
（１）配列番号１もしくは配列番号２で示される核酸配列を含むキメラＲＮＡ、又は
（２）(i) 配列番号３もしくは配列番号４で示される核酸配列を含むｃｒＲＮＡ、および
　　　(ii)配列番号７もしくは配列番号８で示される核酸配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ
である、項１から項６のいずれかに記載の組成物。
［８］
　項１記載の組成物と細胞とを接触させる工程を含む、細胞中の標的遺伝子座を改変する方法。
［９］
　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９であり；
　ガイドＲＮＡが、
　（ａ）キメラＲＮＡ、又は
　（ｂ）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む２以上のＲＮＡ
である、項８記載の方法。
［９ａ］
　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣｐｆ１である、項８記載の方法。
［１０］
　Ｃａｓ９が化膿性レンサ球菌由来Ｃａｓ９である、項８または項９記載の方法。
［１１］
　細胞が筋細胞である、項８から項１０のいずれかに記載の方法。
［１２］
　標的遺伝子座が、ジストロフィン遺伝子のヌクレオチド配列を含む、項８から項１１のいずれかに記載の方法。
［１３］
　ガイドＲＮＡが、
（１）配列番号１もしくは配列番号２で示される核酸配列を含むキメラＲＮＡ、又は
（２）(i) 配列番号３もしくは配列番号４で示される核酸配列を含むｃｒＲＮＡ、および
　　　(ii)配列番号７もしくは配列番号８で示される核酸配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ
である、項８から項１２のいずれかに記載の方法。
［１４］
　項８から項１３のいずれかに記載の方法によって得られる標的遺伝子座が改変された細胞。
［１５］
　項６記載の組成物を含む、医薬。
［１６］
　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９であり；
　ガイドＲＮＡが、
　（ａ）キメラＲＮＡ、又は
　（ｂ）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む２以上のＲＮＡ
である、項１５記載の医薬。
［１６ａ］
　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣｐｆ１である、項１５記載の医薬。
［１７］
　Ｃａｓ９が化膿性レンサ球菌由来Ｃａｓ９である、項１５または項１６記載の医薬。
［１８］
　ガイドＲＮＡが、
（１）配列番号１もしくは配列番号２で示される核酸配列を含むキメラＲＮＡ、又は
（２）(i) 配列番号３もしくは配列番号４で示される核酸配列を含むｃｒＲＮＡ、および
　　　(ii)配列番号７もしくは配列番号８で示される核酸配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ
である、項１５から項１７のいずれかに記載の医薬。
［１９］
　筋ジストロフィーの予防・治療薬である、項１５から項１８のいずれかに記載の医薬。
［２０］
　修復型ジストロフィンタンパク産生薬である、項１５から項１９のいずれかに記載の医薬。
［２１］
　哺乳動物に対して項６または項７記載の組成物の有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における筋ジストロフィーの予防・治療方法。
［２１ａ］
　前記投与が静脈内投与である、項２１記載の予防・治療方法。
［２１ｂ］
　前記投与が筋肉内投与である、項２１記載の予防・治療方法。
［２２］
　哺乳動物に対して項６または項７記載の組成物の有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における修復型ジストロフィンタンパク産生方法。
［２３］
　筋ジストロフィーの予防・治療剤を製造するための、項６または項７記載の組成物の使用。
［２４］
　筋ジストロフィーの予防・治療に使用するための、項６または項７記載の組成物。
［２５］
　項１から項７のいずれかに記載の組成物と細胞とを接触させる工程を含む、標的遺伝子座が改変された細胞の製造方法。
［２６］
　（１）項１から項７のいずれかに記載の組成物と非ヒト哺乳動物の受精卵、胚性幹細胞もしくは卵母細胞とを接触させる工程、
　（２）標的遺伝子座が改変された前記受精卵、胚性幹細胞もしくは卵母細胞を選択する工程、及び
　（３）前記選択された受精卵、胚性幹細胞もしくは卵母細胞を非ヒト哺乳動物の雌性動物に移植する工程
を含む、標的遺伝子座が改変された非ヒト哺乳動物の作製方法。
［２７］
　１）式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式（Ｉ）中、
　ｎは、２～５の整数を、
　Ｒは、直鎖状Ｃ１－５アルキル基、直鎖状Ｃ７－１１アルケニル基又は直鎖状Ｃ１１アルカジエニル基を、
　波線は、それぞれ独立して、シス型またはトランス型の結合を示す。］
で表される化合物又はその塩、および
　２）構造脂質
を含む脂質粒子分散液と、
　３）ガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸
を含む水溶液とを混合する工程を含む、
細胞中の標的遺伝子座における遺伝子改変を誘導するための組成物の製造方法。
［２８］
　前記ガイドＲＮＡが２種類以上のガイドＲＮＡである、項２７記載の製造方法。
　なお、本明細書において、「式（Ｉ）で表される化合物」を「化合物（Ｉ）」と記載することがある。「式（Ｉ）で表される化合物又はその塩」を「本発明の化合物」と呼ぶことがある。「式（Ｉ）で表される化合物又はその塩（本発明の化合物）を含有する脂質粒子」を「本発明の脂質粒子」と呼ぶことがある。また、「ガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸」を「本発明の活性成分」と呼ぶことがある。「ガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ」を「ｇＲＮＡ等」と呼ぶことがあり、「ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸」を「ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ等」と呼ぶことがある。本発明の化合物、構造脂質、ｇＲＮＡ等およびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ等を含有する組成物を「本発明の組成物」と呼ぶことがある。
　本発明の脂質粒子の形状は特に限定されず、例えば、本発明の化合物などが球形を構成するように集合した複合体、特定の形状を構成せずに集合した複合体、溶媒に溶解した複合体、分散媒中に均一もしくは不均一に分散した複合体などを含む。
　本発明により、活性成分としてＣＲＩＳＰＲシステムに用いられるｇＲＮＡ等、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ等を、種々の細胞、組織または臓器に対して導入することが可能となる。
図１は、実施例１の［１－３］「Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＭｍＲｏｓａ２６ｓｇＲＮＡを用いたＤＮＡ変異導入効率評価」の結果を示す。［Ａ］ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡの濃度ごとの、電気泳動図およびその濃度から算出された変異（ｉｎｄｅｌ）導入効率。［Ｂ］ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡの濃度と変異導入効率の関係を示すグラフ。縦軸は変異（ｉｎｄｅｌ）導入効率（％）を示し、横軸はｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡの濃度を示す。 図２は、実施例２の［２－４］「骨格筋におけるＤＮＡ変異導入効率評価」についての、電気泳動図およびその濃度から算出された変異（ｉｎｄｅｌ）導入効率の結果を示す。 図３は、実施例２の［２－５］「骨格筋におけるエクソンスキッピング効率評価」についての、電気泳動図およびその濃度から算出されたエクソンスキッピング効率の結果を示す。 図４は、実施例２の［２－６］「骨格筋におけるジストロフィンタンパク回復の評価」についての、ウェスタンブロッティングおよびその濃度から算出されたジストロフィンタンパクの発現量（ジストロフィン／Ｇａｐｄｈの相対値）の結果を示す。 図５は、実施例３の［３－４］「ヒトｉＰＳ細胞由来筋芽細胞におけるＤＮＡ変異導入効率評価」についての、電気泳動図およびその濃度から算出された変異（ｉｎｄｅｌ）導入効率の結果を示す。 図６は、実施例３の［３－５］「ヒトｉＰＳ細胞由来筋芽細胞におけるエクソンスキッピング効率評価」についての、電気泳動図およびその濃度から算出されたエクソンスキッピング効率の結果を示す。 図７は、実施例４の［４－５］「ヒトｉＰＳ細胞由来筋芽細胞におけるエクソンスキッピング効率評価」についての、電気泳動図およびその濃度から算出されたエクソンスキッピング効率の結果を示す。 図８は、実施例４の［４－６］「ヒトｉＰＳ細胞由来筋芽細胞におけるジストロフィンタンパク回復の評価」についての、ウェスタンブロッティングおよびその濃度から算出されたジストロフィンタンパクの発現量（ジストロフィン／ＧＡＰＤＨの相対値）の結果を示す。 図９は、実施例５「ＬＮＰ静脈内投与時の各種組織におけるＤＮＡ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ評価」における変異導入効率の結果を示す。 図１０は、実施例６「Ｄｕａｌ　ｓｇＲＮＡｓを用いた骨格筋におけるｅｘｏｎ　ｓｋｉｐｐｉｎｇ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ評価」におけるエクソンスキッピング効率の結果を示す。
　なお、図４および８のなかで示されるジストロフィンタンパクは、いずれも修復型ジストロフィンタンパク（エクソン４３とエクソン４６とが連結したｍＲＮＡから翻訳されるヒトジストロフィンタンパク）を示す。
　（発明の詳細な説明）
　以下、本明細書中で用いられる各置換基の定義について詳述する。特記しない限り各置換基は以下の定義を有する。
　本明細書中、「直鎖状Ｃ１－５アルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルが挙げられる。
　本明細書中、「直鎖状Ｃ７－１１アルケニル基」としては、例えば、１－ヘプテニル、２－ヘプテニル、３－ヘプテニル、４－ヘプテニル、５－ヘプテニル、６－ヘプテニル、１－オクテニル、２－オクテニル、３－オクテニル、４－オクテニル、５－オクテニル、６－オクテニル、７－オクテニル、１－ノネニル、２－ノネニル、３－ノネニル、４－ノネニル、５－ノネニル、６－ノネニル、７－ノネニル、８－ノネニル、１－デセニル、２－デセニル、３－デセニル、４－デセニル、５－デセニル、６－デセニル、７－デセニル、８－デセニル、９－デセニル、１－ウンデセニル、２－ウンデセニル、３－ウンデセニル、４－ウンデセニル、５－ウンデセニル、６－ウンデセニル、７－ウンデセニル、８－ウンデセニル、９－ウンデセニル、１０－ウンデセニルが挙げられる。これらの直鎖状Ｃ７－１１アルケニル基は炭素－炭素二重結合を１つ含むためシス型およびトランス型の構造を取り得るが、どちらの構造であってもよい。
　本明細書中、「直鎖状Ｃ１１アルカジエニル基」としては、例えば、１，３－ウンデカジエニル、１，４－ウンデカジエニル、１，５－ウンデカジエニル、１，６－ウンデカジエニル、１，７－ウンデカジエニル、１，８－ウンデカジエニル、１，９－ウンデカジエニル、１，１０－ウンデカジエニル、２，４－ウンデカジエニル、２，５－ウンデカジエニル、２，６－ウンデカジエニル、２，７－ウンデカジエニル、２，８－ウンデカジエニル、２，９－ウンデカジエニル、２，１０－ウンデカジエニル、３，５－ウンデカジエニル、３，６－ウンデカジエニル、３，７－ウンデカジエニル、３，８－ウンデカジエニル、３，９－ウンデカジエニル、３，１０－ウンデカジエニル、４，６－ウンデカジエニル、４，７－ウンデカジエニル、４，８－ウンデカジエニル、４，９－ウンデカジエニル、４，１０－ウンデカジエニル、５，７－ウンデカジエニル、５，８－ウンデカジエニル、５，９－ウンデカジエニル、５，１０－ウンデカジエニル、６，８－ウンデカジエニル、６，９－ウンデカジエニル、６，１０－ウンデカジエニル、７，９－ウンデカジエニル、７，１０－ウンデカジエニル、８，１０－ウンデカジエニルが挙げられる。これらの直鎖状Ｃ１１アルカジエニル基は炭素－炭素二重結合を２つ含むため、それぞれにおいて互いに独立してシス型およびトランス型の構造を取り得るが、それぞれどちらの構造であってもよい。
　式（Ｉ）におけるｎおよび波線の好ましい例は次の通りである。
　ｎは、好ましくは３～５の整数であり、より好ましくは３である。
　波線は、好ましくは両方ともシス型の結合である。
　化合物（Ｉ）の好適な具体例は次の通りである。
　化合物（Ａ）：ｎが３～５の整数であり、Ｒがシス型の直鎖状Ｃ７－１１アルケニル基であり、波線が両方ともシス型となる結合である化合物。
　化合物（Ｂ）：ｎが４であり、Ｒが、２つの炭素－炭素二重結合の両方においてシス型の、直鎖状Ｃ１１アルカジエニル基であり、波線が両方ともシス型の結合である化合物。
　化合物（Ｃ）：ｎが２または３であり、Ｒが直鎖状Ｃ１－５アルキル基であり、波線が両方ともシス型の結合である化合物。
　化合物（Ｉ）のより好適な具体例は次の通りである。
　化合物（Ａ１）：ｎが３～５の整数であり、Ｒがシス型の５－ヘプテニル、７－ノネニルまたは９－ウンデセニルであり、波線が両方ともシス型となる結合である化合物。
　化合物（Ｂ１）：ｎが４であり、Ｒが、２つの炭素－炭素二重結合の両方においてシス型の、２，５－ウンデカジエニルであり、波線が両方ともシス型の結合である化合物。
　化合物（Ｃ１）：ｎが２または３であり、Ｒがメチル、プロピル、またはペンチルであり、波線が両方ともシス型の結合である化合物。
　化合物（Ｉ）のさらに好適な具体例は、3-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)-2,2-ビス(((9Z,9’Z)-テトラデカ-9-エノイルオキシ)メチル)プロピル(9Z)-テトラデカ-9-エノアートである。
　化合物（Ｉ）の塩としては、薬理学的に許容される塩が好ましく、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩が挙げられる。
　無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、アンモニウム塩が挙げられる。好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩であり、より好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩である。
　有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン]、tert－ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ,Ｎ－ジベンジルエチレンジアミンとの塩が挙げられる。
　無機酸との塩の好適な例としては、フッ化水素酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸との塩が挙げられる。好ましくは、塩酸との塩、リン酸との塩である。
　有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p－トルエンスルホン酸との塩が挙げられる。
　塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンとの塩が挙げられる。
　酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸との塩が挙げられる。
　本発明の典型的な実施形態において、本発明の化合物は構造脂質とともに、脂質粒子を形成している。この脂質粒子は、本発明の組成物において、ガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸を内封している。
　構造脂質は、本発明の化合物と混合して混合脂質成分を調製した後、脂質粒子を形成することができるものであれば特に限定されるものではない。そのような構造脂質としては、例えば、
　ステロール類（例えば、コレステロール、コレステロールエステル、コレステロールヘミコハク酸など）；
　リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレノイルホスファチジルコリン、ＭＣ－１０１０（ＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）、ＭＣ－２０２０（ＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）、ＭＣ－４０４０（ＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）など）、ホスファチジルセリン（例えば、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリンなど）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルエタノールアミンなど）、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸など）；および
　ポリエチレングリコール脂質（ＰＥＧ脂質）（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡ、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｃｕｎｊｕｇａｔｅ、ＰＥＧ－Ｃｅｒ、ＰＥＧ－ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ、２ＫＰＥＧ－ＣＭＧ、ＧＭ－０２０（ＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）、ＧＳ－０２０（ＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）、ＧＳ－０５０（ＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）など）
からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いることができる。本発明では、構造脂質として、ステロール類（特に、コレステロール）、リン脂質（特に、ホスファチジルコリン）およびポリエチレングリコール脂質の３種全てを用いることが好ましい。
　本発明の組成物における、本発明の化合物と構造脂質との割合は、目的に応じて適宜調節することができる。例えば、本発明の組成物において、本発明の化合物および構造脂質を含有する混合脂質成分によって脂質粒子が形成されている場合、本発明の化合物１モルに対して、構造脂質は通常０．００８～４モルの割合であり、好ましくは０．４～１．５モルの割合である。また、別の規定の仕方をすれば、混合脂質成分中、本発明の化合物は通常１～４モル、ステロール類は通常０～３モル、リン脂質は通常０～２モル、ポリエチレングリコール脂質は通常０～１モルの比率である。本発明の化合物と他の脂質成分とを混合して用いる場合のより好ましい態様は、本発明の化合物１～１．５モル、ステロール類０～１．２５モル、リン脂質０～０．５モルおよびポリエチレングリコール脂質０～０．１２５モルの比率である。
　以下、本発明の活性成分について説明する。
　本発明では活性成分として、細胞中の標的遺伝子座における遺伝子改変を誘導するための物質、具体的には、ＣＲＩＳＰＲシステムに対応した、ガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸を用いる。また、遺伝子改変のためＣＲＩＳＰＲシステムに対応した物質についての基本的な事項は周知であり、様々な応用的な事項も公知になっており、本発明に対してもそれらの周知または公知の事項を適用することができる（例えば、前掲した先行技術文献参照）。当業者であれば、目的に応じて、標的遺伝子座やＣＲＩＳＰＲシステムの各要素について、適切なものを設計、選択、製造することが可能である。
　細胞および標的遺伝子座は、遺伝子改変の目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されるものではないが、典型的には、遺伝子疾患に関与しており、遺伝子治療の対象となり得る細胞および遺伝子座である。
　本発明の組成物は、多数の種類の細胞、組織または臓器に活性成分を導入するために使用することができる。本発明を適用することにできる細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、牌細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓Ｂ細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞（例、骨格筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、筋衛星細胞、平滑筋細胞）、脂肪細胞、血球細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、白血球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、巨核球、造血幹細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、卵細胞、精細胞、またはこれら細胞に分化誘導可能な前駆細胞、幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を含む）、始原生殖細胞、卵母細胞、受精卵が挙げられる。また、本発明を適用することができる組織または臓器としては、上記の細胞が存在するあらゆる組織もしくは臓器、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、牌臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、胎盤、子宮、骨、関節及び筋肉等が挙げられる。これら細胞、組織または臓器は、癌化した癌細胞や癌組織等であってもよい。
　本発明の好ましい一実施形態において、細胞は筋細胞（例、心筋細胞、骨格筋細胞、筋衛星細胞）、線維芽細胞、間葉系幹細胞、血球細胞またはｉＰＳ細胞であり、より好ましくは筋細胞（とりわけ、骨格筋細胞または筋衛星細胞）が好ましい。筋細胞としては、例えば、ヒト（患者もしくは健常者）またはその他の哺乳動物（例えば非ヒト霊長類（カニクイザル、アカゲザル、チンパンジー等）、ウシ、ブタ、マウス、ラット等の疾患モデル動物）から採取された筋細胞、生体（例：ヒト生体内）の筋細胞、筋細胞株、および幹細胞（例、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）から分化誘導された筋細胞が挙げられる。
　本発明の好ましい一実施形態において、標的遺伝子座はジストロフィン遺伝子のヌクレオチド配列を含むものである。
　ジストロフィン遺伝子は、Ｘ染色体上に存在する、２２０万塩基を超える巨大な遺伝子である。転写開始点の違いにより、様々なアイソフォームが存在し、全身で発現するＤｐ７１、末端神経細胞で発現するＤｐ１１６、脳や腎臓で発現するＤｐ１４０、網膜で発現するＤｐ２６０、プルキンエ神経細胞で発現するＤｐ４１７ｐ、脳で発現するＤｐ４２７ｂ、そして骨格筋で発現するＤｐ４２７ｍなどが知られている。この中でも、Ｄｐ４２７ｍアイソフォームから産生されるジストロフィンタンパクは、主に筋細胞内に発現するタンパク質であり、Ｎ末端側に存在するアクチン結合ドメインで細胞骨格アクチンと結合し、Ｃ末端側に存在する高システインドメインによってジストログリカン複合体とも結合しアクチンと共に細胞骨格を構成している。Ｄｐ４２７ｍアイソフォームのジストロフィン遺伝子は７９個のエクソンにより構成されている。
　デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者の場合、ジストロフィン遺伝子のいずれかのエクソンの欠損または重複変異を持つことにより、あるいはエクソン中の塩基の点変異（ナンセンス変異）または挿入欠損変異（フレームシフト変異）によって、機能性のジストロフィンタンパクはほとんど発現していない（ウェスタンブロット法による検出で健常人の３％以下のタンパク質量）。一方で、デュシェンヌ型筋ジストロフィーよりも比較的軽症なベッカー型筋ジストロフィーの患者の場合、エクソンの欠失や塩基の点変異が存在してもストップコドンが途中に生じていない場合には、正常なジストロフィンタンパクよりアミノ酸配列が短い、または一部のアミノ酸が置換されたジストロフィンタンパクを発現している。
　ジストロフィン遺伝子の変異としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびベッカー型筋ジストロフィーにおいて、単一または複数のエクソンの欠失が半分以上を占める。特に欠失が多く見られる部位として、エクソン４４とエクソン５５の間が知られている。ジストロフィン遺伝子の欠損エクソンの部位に応じて、例えば既報の論文等（例えば、ｖａｎ　Ｄｅｕｔｅｋｏｍ　ＪＣ，　ｖａｎ　Ｏｍｍｅｎ　ＧＪ．，　Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ．　２００３）を参照することによって、どのエクソンを対象としてエクソンスキッピングを行えば適切な修復型ジストロフィンを発現させることができるか確認することができる。また、ゲノム編集を用いた修復型ジストロフィンの発現方法としては、エクソンスキッピング以外でも、ジストロフィン遺伝子中に微小欠損または挿入を導入してリーディングフレームを調節する方法、または欠損しているエクソンを相同組換え等により挿入することによっても実施可能である。
　上記のようなジストロフィン遺伝子に異常が起きている場合、（i）１つまたは２つ以上のエクソンをｍＲＮＡに組み込まない（スキップする）ことにより、フレームシフトが起きないようにその前後のエクソン同士を連結させる、（ii）１つまたは２つ以上の塩基を挿入または欠失させることにより、フレームシフトを修正する、（iii）欠損したエクソンをノックインする、などのいずれかの操作によりその異常を修正することができる。上記（i）または（ii）の場合、正常なジストロフィンタンパクよりもアミノ酸配列が短いもしくは長い、または一部のアミノ酸が置換されたジストロフィンタンパクが産生される。また、上記（ii）または（iii）によって、正常なジストロフィンタンパクを産生することもできる。このようなジストロフィン遺伝子の修正により、筋ジストロフィー等の疾患を予防または治療することが可能となる。
　ヒトのジストロフィン遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから、入手可能である（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1756）。
　ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが連結された１本のＲＮＡの形態、すなわちキメラＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡなどと呼ばれることもある）であってもよいし、連結されていないそれぞれ１本ずつのＲＮＡ（２本のＲＮＡの組み合わせ、またはそれ以上の本数のＲＮＡの組み合わせ）の形態であってもよい。本発明の組成物は、このようなガイドＲＮＡを、ＲＮＡそのものの形態で含んでいてもよいし、ガイドＲＮＡをコードする配列を含むＤＮＡ（発現プラスミドなど）の形態で含んでいてもよい。
　ガイドＲＮＡは、１つの塩基配列を標的とする形態（１本のｓｇＲＮＡ、または１組のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）であってもよいし、２つ以上の塩基配列を標的とする形態（２本以上のｓｇＲＮＡ、または２組以上のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）であってもよい。本明細書において、標的とする塩基配列ごとに、ガイドＲＮＡの「種類」と記載することがある。従って、本明細書において、２つ以上の塩基配列を標的とする形態におけるガイドＲＮＡを「２種類以上のガイドＲＮＡ」と記載することがある。ガイドＲＮＡは、２種類または２種類以上であることが好ましい。
　２種類以上のガイドＲＮＡを用いる場合、これらのガイドＲＮＡが標的とする塩基配列間の距離は特に限定されないが、２つのガイドＲＮＡの標的配列は重ならない事が好ましい。また、２つのガイドＲＮＡの標的配列は１塩基以上、離れていることが好ましい。
　２種類のガイドＲＮＡを用いる場合、これらの２種類のガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲシステムにより生じるＤＮＡ切断箇所が、遺伝子改変を誘導する細胞中の標的遺伝子座または標的遺伝子座上の特定の塩基配列を包含することが好ましい。このとき、塩基配列を包含するとは、当該塩基配列の上流と下流にＤＮＡ切断箇所が存在することを意味する。
　２種類のガイドＲＮＡを用いる場合、２種類のガイドＲＮＡの標的配列としては特に限定されないが、たとえば、配列番号３および配列番号４の標的認識配列がハイブリダイズする塩基配列とすることができる。
　本発明のｃｒＲＮＡは、細胞中の標的遺伝子座中の特定の塩基配列（本明細書中、「標的配列」と称することがある）にハイブリダイズする、１８～２０塩基程度の核酸配列（本明細書中、「標的認識配列」と称することがある）を含む。標的認識配列としては、配列番号３または配列番号４で示される核酸配列が好ましい。本発明の好ましい一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３または配列番号４で示される核酸配列を含む。また、本発明の好ましい一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号５または配列番号６で示される核酸配列を含む。標的配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムにより認識される短い配列（ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ））と隣接する。ＰＡＭの配列および長さの条件は、使用されるヌクレアーゼの種類に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的には、標的配列に隣接する２～５塩基対配列である。
　本発明の好ましい一実施形態において、ガイドＲＮＡは、配列番号１または配列番号２で示される核酸配列を含むキメラＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。
　本発明の好ましい一実施形態において、ガイドＲＮＡは、（i）配列番号３もしくは配列番号４で示される核酸配列を含むｃｒＲＮＡ、および（ii）配列番号７もしくは配列番号８で示される核酸配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡの組み合わせである。
　　配列番号１：実施例「ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１」対応ｓｇＲＮＡ全配列
　5'- U(M)^G(M)^G(M)^UAUCUUACAGGAACUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGG(M)^U(M)^G(M)^C -3'
　　配列番号２：実施例「ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃２３」対応ｓｇＲＮＡ全配列
　5'- A(M)^G(M)^C(M)^UGUCAGACAGAAAAAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGG(M)^U(M)^G(M)^C -3'
　　配列番号３：配列番号１の標的認識配列
　5'- U(M)^G(M)^G(M)^UAUCUUACAGGAACUCC -3'
　　配列番号４：配列番号２の標的認識配列
　5'- A(M)^G(M)^C(M)^UGUCAGACAGAAAAAAG -3'
　　配列番号５：配列番号１のｃｒＲＮＡ配列
　5'- U(M)^G(M)^G(M)^UAUCUUACAGGAACUCCGUUUUAGAGCUA -3'
　　配列番号６：配列番号２のｃｒＲＮＡ配列
　5'- A(M)^G(M)^C(M)^UGUCAGACAGAAAAAAGGUUUUAGAGCUA -3'
　　配列番号７：配列番号１のｔｒａｃｒＲＮＡ配列
　5'- UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGG(M)^U(M)^G(M)^C -3'
　　配列番号８：配列番号２のｔｒａｃｒＲＮＡ配列
　5'- UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGG(M)^U(M)^G(M)^C -3'
　配列番号１～８において、「（Ｍ）」が右隣に示されているリボースは、天然の（修飾されていない）リボースであってもよいし、２’－Ｏ－メチルリボースまたはその他の修飾リボースであってもよいが、好ましくは２’－Ｏ－メチルリボースである。
　また、配列番号１～８において「＾」で表されている、２’－Ｏ－メチルリボース同士の結合または２’－Ｏ－メチルリボースとリボースとの結合は、リン酸ジエステル結合であってもよいし、ホスホロチオエート結合であってもよいが、好ましくはホスホロチオエート結合である。
　本発明の標的認識配列は、上記の配列番号３および４のいずれかで表される核酸配列と実質的に同一の配列を有する。また、本発明のｃｒＲＮＡおよびキメラＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、標的認識配列以外の配列において、上記の配列番号１、２、５および６のいずれかで表される核酸配列と実質的に同一の配列を有する。また、本発明のｔｒａｃｒＲＮＡは、上記の配列番号７および８のいずれかで表される核酸配列と実質的に同一の配列を有する。ここで、「実質的に同一の配列」は、少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列を意味する。従って、本発明の標的認識配列、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、キメラＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、上記のようにそれぞれに対応する配列番号で示される配列と、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有しうる。配列同一性は、好ましくは少なくとも８５％または９０％、より好ましくは少なくとも９５％または９７％、特に好ましくは少なくとも９９％である。
　「配列同一性」という用語は、２つの遺伝子配列を当該塩基対の一致が最大となるように整列させたときに、２つの配列間で一致する塩基対の割合（％）を意味する。
　配列同一性は、当業者に公知の任意の方法で決定することができる。例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓらによる多重整列プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（Ｇｅｎｅ ７３，１，２３７－２４４，１９８８）により決定することができる。Ｃｌｕｓｔａｌプログラムは、例えば欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ））のインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
　本発明で使用されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとしては、例えばＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが挙げられる。
　ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つのヌクレアーゼドメイン及びｇＲＮＡと相互作用する少なくとも１つのドメインを含む。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡによってゲノムの標的部位に誘導される。
　ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、クラスタ化調節的散在型短パリンドローム反復配列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ　ｓｈｏｒｔ　ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ－関連（Ｃａｓ）システムに由来しうる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、クラス１の中のタイプＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、あるいはクラス２の中のタイプＩＩ、タイプＶ、およびタイプＶＩシステムとすることができる。適当なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又は、ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ（又は、Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（又は、Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１３ａ１（又は、Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ａ２、Ｃａｓ１３ｂ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（又は、ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又は、ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又は、ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又は、ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３，Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕ１９６６が含まれる。
　一態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、クラス２タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来である。特定の態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質に由来する。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性レンサ球菌（ストレプトコッカス・ピオゲネス）、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス属、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス属、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム・ロセウム、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス、バチルス・シュードマイコイデス、バチルス・セレニティレドセンス、イグジォバクテリウム・シビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ラクトバチラス・デルブリッキー、ラクトバチルス・サリヴァリゥス、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、マイクロシーラ・マリナ、バークホルデリア細菌、ポラロモナス・ナフタレニボランス、ポラロモナス種、クロコスファエラ・ワストニイ（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ　ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノセイス属、ミクロシスティス・アエルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス属、アセトハロビウム・アラバチカム、アモニフェクス・デジェンシー（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ　ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルジセルロシルプトル・ベクシ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ　ｂｅｃｓｃｉｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリー（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ 　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）カンジダ・デスルフォルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ　Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、クロストリジウム・ボツリヌス、クロストリジウム・ディフィシル、フィネゴルディア・マグナ、ナトラナエロビウス・テルモフィルスム（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｍ）、ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム、アシディチオバチルス・カルダス、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス、アロクロマチウム・ビノスム、マリノバクター属、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ　ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワッソニ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｃｕｓ　ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス、クテドノバクテル・ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガタム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｂｉｕｍ　ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ・バリアビリス、ノジュラリア・スプミゲナ、ノストック属、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ属、リングビア属、ミクロコレス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ　ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オシラトリア属、ペトロトガ・モビリス、サーモシホ・アフリカヌス、又はアカリオクロリス・マリーナに由来していてよい。
　一態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、クラス２タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１システム由来である。特定の態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１タンパク質に由来する。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、に由来していてよい。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、修飾型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、又は、野生型もしくは修飾型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のフラグメントでありうる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性及び／又は特異性を増大し、酵素活性を変更し、あるいはタンパク質の別の特性を変更するために修飾されていてよい。
　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼであってよい。ここで、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼとは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて必須のタンパク質成分を指し、ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡと複合体を形成した場合に、活性を有するエンドヌクレアーゼ又はニッカーゼを意味する。ニッカーゼは、一方のＤＮＡ鎖のみにニック（ｎｉｃｋ）を入れるＤＮＡ切断酵素をいう。一般的に、Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮａｓｅ）ドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含み得る。ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインは、ＤＮＡ中に二本鎖の切断を行うために、一本鎖を切断するのに協働する（Jinek et al., Science, 337: 816－821）。ある態様において、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、１つの機能的ヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様またはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか）のみを含むように修飾されていてよい。例えば、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、ヌクレアーゼドメインの１つが、それがもはや機能しない（すなわち、ヌクレアーゼ活性が存在しない）ように欠失または変異するように修飾されていてよい。ヌクレアーゼドメインの１つが不活性である態様において、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、二本鎖核酸にニックを導入することができるが、二本鎖ＤＮＡを切断することはできない。例えば、ＲｕｖＣ様ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの変換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９由来のタンパク質をニッカーゼに変換する。同様に、ＨＮＨドメインにおけるヒスチジンからアラニンへの変換（Ｈ８４０ＡまたはＨ８３９Ａ）は、Ｃａｓ９由来のタンパク質をニッカーゼに変換する。各ヌクレアーゼドメインは、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ仲介性突然変異誘発法、および全遺伝子合成、ならびに当技術分野で公知の他の方法のような周知の方法を用いて修飾され得る。
　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼには、特にストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ.）又はスタフィロコッカス属菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｎｏｖｉｃｉｄａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼが用いられうる。このうち、由来元としては、ストレプトコッカス属菌においては、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）が好ましく、スタフィロコッカス属菌においては、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が好ましい。化膿性レンサ球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ又はＣａｓ９ニッカーゼは、ＰＡＭ配列としてＮＧＧまたはＮＡＧトリヌクレオチドを認識する。
　本発明の組成物は、このようなＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを、タンパク質の形態で含んでいてもよいし、そのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸（ｍＲＮＡ、または発現プラスミドのようなＤＮＡなど）の形態で含んでいてもよい。
　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９が好ましい。本発明の好ましい一実施形態において、Ｃａｓ９は、化膿性レンサ球菌（化膿性レンサ球菌）（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である。Ｃａｓ９としては様々な細菌または古細菌に由来するものが知られており、本発明ではＳｐＣａｓ９以外にも、例えば黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）など、所望のヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９を用いることができる。
　本発明の組成物における、本発明の化合物および構造脂質（またはそれらによって形成される脂質粒子）に対する本発明の活性成分の割合は、目的および活性成分の種類に応じて適宜調節することができる。例えば、本発明の組成物において、本発明の化合物および構造脂質を含有する混合脂質成分によって脂質粒子が形成されていて、本発明の活性成分としてＲＮＡがその脂質粒子に内封されている場合、脂質粒子の質量（つまり本発明の化合物および構造脂質の合計質量）に対して、本発明の活性成分は通常１～２０質量％、好ましくは２～１０質量％の割合である。
　「ＲＮＡ」（リボ核酸）、「ＤＮＡ」（デオキシリボ核酸）および「核酸」は、天然のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのみを含むものであってもよいし、必要に応じてそれらに加えて、ヌクレアーゼ耐性の向上、安定化、相補性核酸とのアフィニティーの向上、細胞透過性の向上等のために、これらの分子の構造の一部を修飾したヌクレオチド類似体を含むものであってもよい。ヌクレオチド類似体としては、例えば、糖部修飾ヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－プロピルリボース、２’－Ｏ－メトキシエトキシリボース、２’－Ｏ－メトキシエチルリボース、２’－Ｏ－［２－（グアニジウム）エチル］リボース、２’－Ｏ－フルオロリボースなど）；架橋構造型人工核酸（ＢＮＡ）（ロックド人工核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋構造型人工核酸（ＥＮＡ）など）；リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド（リン酸ジエステル結合のホスホロチオエート結合への置換体、Ｎ３’－Ｐ５’ホスホアミデート結合への置換体など）が挙げられる。また、核酸は、５’－ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、蛍光色素付加誘導体、ビオチン付加誘導体などであってもよい。「ＲＮＡ」、「ＤＮＡ」および「核酸」は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。
　本発明の一実施形態において、ガイドＲＮＡの少なくとも一部は、前記ヌクレオチド類似体とすることが好ましい。ヌクレオチド類似体としては、糖部修飾ヌクレオチドおよびリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドが好ましく、より具体的には２’－Ｏ－メチルリボースおよびリン酸ジエステル結合のホスホロチオエート結合への置換体が好ましい。ガイドＲＮＡにおいて、少なくとも配列の３’および５’の両末端の一塩基ずつがヌクレオチド類似体であることが好ましく、少なくとも配列の３’および５’の両末端の二塩基ずつまたは三塩基ずつがヌクレオチド類似体であることがより好ましい。
　ガイドＲＮＡが、キメラＲＮＡである場合には、少なくともその配列の３’および５’の両末端一塩基ずつをヌクレオチド類似体とすることが好ましく、連結されていないそれぞれ１本ずつのＲＮＡ（２本のＲＮＡの組み合わせ）またはそれ以上の本数のＲＮＡの形態である場合には、少なくともそれぞれのＲＮＡの配列の３’および５’の両末端の一塩基ずつをヌクレオチド類似体とすることが好ましい（例えば、ｃｒＲＮＡの３’および５’の両末端、および、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’および５’の両末端をヌクレオチド類似体とすることが好ましい）。
　ガイドＲＮＡ等およびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ等をどちらも発現プラスミド等の遺伝子構築物の形態とする場合、ガイドＲＮＡをコードする配列およびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼタンパク質をコードする配列の両方が一つの遺伝子構築物に含まれていてもよいし、それらの配列が別々の遺伝子構築物に含まれていてもよい。また、遺伝子構築物は、必要に応じて、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、薬剤選択遺伝子、レポーター遺伝子等の配列を含んでいてもよい。
　本発明の組成物は、（i）ガイドＲＮＡ等（ガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ）だけを含み、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ等（ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸）は含まない実施形態、（ii）ガイドＲＮＡ等は含まず、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ等だけを含む実施形態、（iii）ガイドＲＮＡ等とＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ等の両方を含む実施形態、のいずれであってもよい。ガイドＲＮＡ等を含む場合、そのガイドＲＮＡは１種類でもよく、２種類または２種類以上であってもよい。本発明の組成物の一態様においては、２種類または２種類以上のガイドＲＮＡであることが好ましい。
　本発明において、組成物中の脂質粒子は、ＣＲＩＳＰＲシステムに必要な複数の要素のうち１種類だけを内封していてもよいし、複数の種類（例えば、ｇＲＮＡとＣａｓ９のｍＲＮＡ）を内封していてもよい。脂質粒子が複数の要素を内封する場合は、例えば、その製造時に各要素を適切な濃度（比率）で含有する水溶液を用いるようにすればよい。
　本発明の組成物は、１種類の要素を内封する脂質粒子を複数種類含んでいてもよい。例えば、ｇＲＮＡのみを内封する脂質粒子と、Ｃａｓ９のｍＲＮＡを内封する脂質粒子が、組成物中で混合されていてもよい。１種類の要素を内封する脂質粒子を複数種混合する場合は、遺伝子の改変効率などを考慮しながら、各要素が適切な濃度（比率）となるようにすればよい。
　本発明の一実施形態において、ｇＲＮＡ等を内封する脂質粒子と、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ等を内封する脂質粒子は、同一の組成物（混合溶液）によって、または別々の組成物によって、細胞に添加される。
　本発明の一実施形態において、ｇＲＮＡ等とＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ等の両方を内封する脂質粒子を含む本発明の組成物が、細胞に添加される。
　本発明の化合物、脂質粒子および組成物は、安定かつ低毒性で安全に使用することができる。本発明の組成物を生体内で用いる場合、ないし医薬として用いる場合、投与対象（ヒトまたは非ヒト哺乳動物。好ましくはヒト。）に対して、本発明の組成物中の活性成分の有効量が標的とする細胞に送達されるように、該組成物を投与すればよい。
　本発明の組成物を生体外で用いる場合、ないし試薬として用いる場合、培地に添加するなどして、培養されている細胞に本発明の組成物（特にそこに含まれる、活性成分を内封する脂質粒子）を接触させることにより、活性成分の有効量が細胞内に移行するようにすればよい。
　本発明の組成物中の活性成分（ガイドＲＮＡ等およびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ等）の濃度は、組成物の用途に応じて適宜調節することができ、特に限定されるものではない。例えば、本発明の組成物を生体外で用いる場合は、高濃度で活性成分を含有する組成物として保管しておき、適切な濃度になるよう適切な溶媒で希釈した組成物を調製して、または培地等に添加して、使用できるようにしてもよい。例えば、本発明の活性成分を内封した脂質粒子が添加された培地（培養液）も、本発明の組成物の一実施形態であり、その培地中の脂質粒子に内封された活性成分の濃度も適宜調節することができる。
　以下、本発明の化合物の製造方法について説明する。
　以下の製造方法における各工程で用いられた原料や試薬、ならびに得られた化合物は、それぞれ塩を形成していてもよい。このような塩としては、例えば、前述の本発明の化合物における塩と同様のものが挙げられる。
　各工程で得られた化合物が遊離化合物である場合には、公知の方法により、目的とする塩に変換することができる。逆に各工程で得られた化合物が塩である場合には、公知の方法により、遊離体または目的とする他の種類の塩に変換することができる。
　各工程で得られた化合物は反応液のままか、または粗生成物として得た後に、次反応に用いることもできる、あるいは、各工程で得られた化合物を、常法に従って、反応混合物から濃縮、晶出、再結晶、蒸留、溶媒抽出、分溜、クロマトグラフィーなどの分離手段により単離および／または精製することができる。
　各工程の原料や試薬の化合物が市販されている場合には、市販品をそのまま用いることができる。
　各工程の反応において、反応時間は、用いる試薬や溶媒により異なり得るが、特に記載の無い場合、通常１分～４８時間、好ましくは１０分～８時間である。
　各工程の反応において、反応温度は、用いる試薬や溶媒により異なり得るが、特に記載が無い場合、通常－７８℃～３００℃、好ましくは－７８℃～１５０℃である。
　各工程の反応において、圧力は、用いる試薬や溶媒により異なり得るが、特に記載が無い場合、通常１気圧～２０気圧、好ましくは１気圧～３気圧である。
　各工程の反応において、例えば、Ｂｉｏｔａｇｅ社製ＩｎｉｔｉａｔｏｒなどのＭｉｃｒｏｗａｖｅ合成装置を用いることがある。反応温度は、用いる試薬や溶媒により異なり得るが、特に記載がない場合、通常室温～３００℃、好ましくは室温～２５０℃、より好ましくは５０℃～２５０℃である。反応時間は、用いる試薬や溶媒により異なり得るが、特に記載の無い場合、通常１分～４８時間、好ましくは１分～８時間である。
　各工程の反応において、試薬は、特に記載が無い場合、基質に対して０．５当量～２０当量、好ましくは０．８当量～５当量が用いられる。試薬を触媒として使用する場合、試薬は基質に対して０．００１当量～１当量、好ましくは０．０１当量～０．２当量が用いられる。試薬が反応溶媒を兼ねる場合、試薬は溶媒量が用いられる。
　各工程の反応において、特に記載が無い場合、これらの反応は、無溶媒、あるいは適当な溶媒に溶解または懸濁して行われる。溶媒の具体例としては、実施例に記載されている溶媒、あるいは以下が挙げられる。
　アルコール類：メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、２－メトキシエタノールなど；
　エーテル類：ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジフェニルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタンなど；
　芳香族炭化水素類：クロロベンゼン、トルエン、キシレンなど；
　飽和炭化水素類：シクロヘキサン、ヘキサン、ヘプタンなど；
　アミド類：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドンなど；
　ハロゲン化炭化水素類：ジクロロメタン、四塩化炭素など；
　ニトリル類：アセトニトリルなど；
　スルホキシド類：ジメチルスルホキシドなど；
　芳香族有機塩基類：ピリジンなど；
　酸無水物類：無水酢酸など；
　有機酸類：ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸など；
　無機酸類：塩酸、硫酸など；
　エステル類：酢酸エチル、酢酸イソプロピルエステルなど；
　ケトン類：アセトン、メチルエチルケトンなど；
　水。
　上記溶媒は、二種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。
　各工程の反応において塩基を用いる場合、例えば、以下に示す塩基、あるいは実施例に記載されている塩基が用いられる。
　無機塩基類：水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウムなど；
　塩基性塩類：炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウムなど；
　有機塩基類：トリエチルアミン、ジエチルアミン、ピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン、イミダゾール、ピペリジンなど；
　金属アルコキシド類：ナトリウムエトキシド、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシドなど；
アルカリ金属水素化物類：水素化ナトリウムなど；
金属アミド類：ナトリウムアミド、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムヘキサメチルジシラジドなど；
　有機リチウム類：ｎ－ブチルリチウム、ｓｅｃ－ブチルリチウムなど。
　各工程の反応において酸または酸性触媒を用いる場合、例えば、以下に示す酸や酸性触媒、あるいは実施例に記載されている酸や酸性触媒が用いられる。
　無機酸類：塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、リン酸など；
　有機酸類：酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、１０－カンファースルホン酸など；
　ルイス酸：三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体、ヨウ化亜鉛、無水塩化アルミニウム、無水塩化亜鉛、無水塩化鉄など。
　各工程の反応は、特に記載の無い限り、公知の方法、例えば、第５版実験化学講座、１３巻～１９巻（日本化学会編）；新実験化学講座、１４巻～１５巻（日本化学会編）；精密有機化学　改定第２版（Ｌ．　Ｆ．　Ｔｉｅｔｚｅ，Ｔｈ．　Ｅｉｃｈｅｒ、南江堂）；改訂　有機人名反応　そのしくみとポイント（東郷秀雄著、講談社）；ＯＲＧＡＮＩＣ　ＳＹＮＴＨＥＳＥＳ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ　Ｖｏｌｕｍｅ　Ｉ～ＶＩＩ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　ＳｏｎｓＩｎｃ）；Ｍｏｄｅｒｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ｊｉｅ　Ｊａｃｋ　Ｌｉ著、ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ出版）；Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ＩＩＩ、Ｖｏｌ．１～Ｖｏｌ．１４（エルゼビア・ジャパン株式会社）；人名反応に学ぶ有機合成戦略（富岡清監訳、化学同人発行）；コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ（ＶＣＨ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．）１９８９年刊などに記載された方法、あるいは実施例に記載された方法に準じて行われる。
　各工程において、官能基の保護または脱保護反応は、公知の方法、例えば、Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社２００７年刊「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　４ｔｈＥｄ．」（Ｔｈｅｏｄｏｒａ　Ｗ．　Ｇｒｅｅｎｅ，　Ｐｅｔｅｒ　Ｇ．　Ｍ．　Ｗｕｔｓ著）；Ｔｈｉｅｍｅ社２００４年刊「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐｓ　３ｒｄＥｄ．」（Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ著）などに記載された方法、あるいは実施例に記載された方法に準じて行われる。
　アルコールなどの水酸基やフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、メトキシメチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ－メトキシベンジルエーテル、ｔ－ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ－ブチルジフェニルシリルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテルなどのエーテル型保護基；酢酸エステルなどのカルボン酸エステル型保護基；メタンスルホン酸エステルなどのスルホン酸エステル型保護基；ｔ－ブチルカルボネートなどの炭酸エステル型保護基などが挙げられる。
　アルデヒドのカルボニル基の保護基としては、例えば、ジメチルアセタールなどのアセタール型保護基；環状１，３－ジオキサンなどの環状アセタール型保護基などが挙げられる。
　ケトンのカルボニル基の保護基としては、例えば、ジメチルケタールなどのケタール型保護基；環状１，３－ジオキサンなどの環状ケタール型保護基；Ｏ－メチルオキシムなどのオキシム型保護基；Ｎ，Ｎ－ジメチルヒドラゾンなどのヒドラゾン型保護基などが挙げられる。
　カルボキシル基の保護基としては、例えば、メチルエステルなどのエステル型保護基；Ｎ，Ｎ－ジメチルアミドなどのアミド型保護基などが挙げられる。
　チオールの保護基としては、例えば、ベンジルチオエーテルなどのエーテル型保護基；チオ酢酸エステル、チオカルボネート、チオカルバメートなどのエステル型保護基などが挙げられる。
　アミノ基や、イミダゾール、ピロール、インドールなどの芳香族ヘテロ環の保護基としては、例えば、ベンジルカルバメートなどのカルバメート型保護基；アセトアミドなどのアミド型保護基；Ｎ－トリフェニルメチルアミンなどのアルキルアミン型保護基、メタンスルホンアミドなどのスルホンアミド型保護基などが挙げられる。
　保護基の除去は、公知の方法、例えば、酸、塩基、紫外光、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、Ｎ－メチルジチオカルバミン酸ナトリウム、テトラブチルアンモニウムフルオリド、酢酸パラジウム、トリアルキルシリルハライド（例えば、トリメチルシリルヨージド、トリメチルシリルブロミド）を使用する方法や還元法などを用いて行うことができる。
　各工程において、還元反応を行う場合、使用される還元剤としては、水素化アルミニウムリチウム、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム、水素化シアノホウ素ナトリウム、水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ－Ｈ）、水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリアセトキシホウ素テトラメチルアンモニウムなどの金属水素化物類；ボランテトラヒドロフラン錯体などのボラン類；ラネーニッケル；ラネーコバルト；水素；ギ酸などが挙げられる。例えば、水素またはギ酸存在下で、ラネーニッケルまたはラネーコバルトを用いることができる。炭素－炭素二重結合あるいは三重結合を還元する場合は、パラジウム－カーボンやＬｉｎｄｌａｒ触媒などの触媒を用いる方法がある。
　各工程において、酸化反応を行う場合、使用される酸化剤としては、ｍ－クロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）、過酸化水素、ｔ－ブチルヒドロペルオキシドなどの過酸類；過塩素酸テトラブチルアンモニウムなどの過塩素酸塩類；塩素酸ナトリウムなどの塩素酸塩類；亜塩素酸ナトリウムなどの亜塩素酸塩類；過ヨウ素酸ナトリウムなどの過ヨウ素酸類；ヨードシルベンゼンなどの高原子価ヨウ素試薬；二酸化マンガン、過マンガン酸カリウムなどのマンガンを有する試薬；四酢酸鉛などの鉛類；クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）、二クロム酸ピリジニウム（ＰＤＣ）、ジョーンズ試薬などのクロムを有する試薬；Ｎ－ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）などのハロゲン化合物類；酸素；オゾン；三酸化硫黄・ピリジン錯体；四酸化オスミウム；二酸化ゼレン；２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾキノン（ＤＤＱ）などが挙げられる。
　各工程において、ラジカル環化反応を行う場合、使用されるラジカル開始剤としては、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）などのアゾ化合物；４－４’－アゾビス－４－シアノペンタン酸（ＡＣＰＡ）などの水溶性ラジカル開始剤；空気あるいは酸素存在下でのトリエチルホウ素；過酸化ベンゾイルなどが挙げられる。また、使用されるラジカル反応試剤としては、トリブチルスタナン、トリストリメチルシリルシラン、１，１，２，２－テトラフェニルジシラン、ジフェニルシラン、ヨウ化サマリウムなどが挙げられる。
　各工程において、Ｗｉｔｔｉｇ反応を行う場合、使用されるＷｉｔｔｉｇ試薬としては、アルキリデンホスホラン類などが挙げられる。アルキリデンホスホラン類は、公知の方法、例えば、ホスホニウム塩と強塩基を反応させることで調製することができる。
　各工程において、Ｈｏｒｎｅｒ－Ｅｍｍｏｎｓ反応を行う場合、使用される試薬としては、ジメチルホスホノ酢酸メチル、ジエチルホスホノ酢酸エチルなどのホスホノ酢酸エステル類；アルカリ金属水素化物類、有機リチウム類などの塩基が挙げられる。
　各工程において、Ｆｒｉｅｄｅｌ－Ｃｒａｆｔｓ反応を行う場合、使用される試薬としては、ルイス酸と、酸クロリドあるいはアルキル化剤（例、ハロゲン化アルキル類、アルコール、オレフィン類など）が挙げられる。あるいは、ルイス酸の代わりに、有機酸や無機酸を用いることもでき、酸クロリドの代わりに、無水酢酸などの酸無水物を用いることもできる。
　各工程において、芳香族求核置換反応を行う場合、試薬としては、求核剤（例、アミン類、イミダゾールなど）と塩基（例、塩基性塩類、有機塩基類など）が用いられる。
　各工程において、カルボアニオンによる求核付加反応、カルボアニオンによる求核１，４－付加反応（Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応）、あるいはカルボアニオンによる求核置換反応を行う場合、カルボアニオンを発生するために用いる塩基としては、有機リチウム類、金属アルコキシド類、無機塩基類、有機塩基類などが挙げられる。
　各工程において、Ｇｒｉｇｎａｒｄ反応を行う場合、Ｇｒｉｇｎａｒｄ試薬としては、フェニルマグネシウムブロミドなどのアリールマグネシウムハライド類；メチルマグネシウムブロミド、イソプロピルマグネシウムブロミドなどのアルキルマグネシウムハライド類が挙げられる。Ｇｒｉｇｎａｒｄ試薬は、公知の方法、例えばエーテルあるいはテトラヒドロフランを溶媒として、ハロゲン化アルキルまたはハロゲン化アリールと、金属マグネシウムとを反応させることにより調製することができる。
　各工程において、Ｋｎｏｅｖｅｎａｇｅｌ縮合反応を行う場合、試薬としては、二つの電子求引基に挟まれた活性メチレン化合物（例、マロン酸、マロン酸ジエチル、マロノニトリルなど）および塩基（例、有機塩基類、金属アルコキシド類、無機塩基類）が用いられる。
　各工程において、Ｖｉｌｓｍｅｉｅｒ－Ｈａａｃｋ反応を行う場合、試薬としては、塩化ホスホリルとアミド誘導体（例、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドなど）が用いられる。
　各工程において、アルコール類、アルキルハライド類、スルホン酸エステル類のアジド化反応を行う場合、使用されるアジド化剤としては、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、トリメチルシリルアジド、アジ化ナトリウムなどが挙げられる。例えば、アルコール類をアジド化する場合、ジフェニルホスホリルアジドと１，８－ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）を用いる方法やトリメチルシリルアジドとルイス酸を用いる方法などがある。
　各工程において、還元的アミノ化反応を行う場合、使用される還元剤としては、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム、水素化シアノホウ素ナトリウム、水素、ギ酸などが挙げられる。基質がアミン化合物の場合は、使用されるカルボニル化合物としては、パラホルムアルデヒドの他、アセトアルデヒドなどのアルデヒド類、シクロヘキサノンなどのケトン類が挙げられる。基質がカルボニル化合物の場合は、使用されるアミン類としては、アンモニア、メチルアミンなどの１級アミン；ジメチルアミンなどの２級アミンなどが挙げられる。
　各工程において、光延反応を行う場合、試薬としては、アゾジカルボン酸エステル類（例、アゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ）、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）など）およびトリフェニルホスフィンが用いられる。
　各工程において、エステル化反応、アミド化反応、あるいはウレア化反応を行う場合、使用される試薬としては、酸クロリド、酸ブロミドなどのハロゲン化アシル体；酸無水物、活性エステル体、硫酸エステル体など活性化されたカルボン酸類が挙げられる。カルボン酸の活性化剤としては、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣＤ）などのカルボジイミド系縮合剤；４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロライド－ｎ－ハイドレート（ＤＭＴ－ＭＭ）などのトリアジン系縮合剤；１，１－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）などの炭酸エステル系縮合剤；ジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）；ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリスジメチルアミノホスホニウム塩（ＢＯＰ試薬）；ヨウ化２－クロロ－１－メチル－ピリジニウム（向山試薬）；塩化チオニル；クロロギ酸エチルなどのハロギ酸低級アルキル；Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）；硫酸；あるいはこれらの組み合わせなどが挙げられる。カルボジイミド系縮合剤を用いる場合、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの添加剤をさらに反応に加えてもよい。
　各工程において、カップリング反応を行う場合、使用される金属触媒としては、酢酸パラジウム（ＩＩ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）、ジクロロビス（トリエチルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）、塩化１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンパラジウム（ＩＩ）、酢酸パラジウム（ＩＩ）などのパラジウム化合物；テトラキス（トリフェニルホスフィン）ニッケル（０）などのニッケル化合物；塩化トリス（トリフェニルホスフィン）ロジウム（ＩＩＩ）などのロジウム化合物；コバルト化合物；酸化銅、ヨウ化銅（Ｉ）などの銅化合物；白金化合物などが挙げられる。さらに反応に塩基を加えてもよく、このような塩基としては、無機塩基類、塩基性塩類などが挙げられる。
　各工程において、チオカルボニル化反応を行う場合、チオカルボニル化剤としては、代表的には五硫化二リンが用いられるが、五硫化二リンの他に、２，４－ビス（４－メトキシフェニル）－１，３，２，４－ジチアジホスフェタン－２，４－ジスルフィド（Ｌｏｗｅｓｓｏｎ試薬）などの１，３，２，４－ジチアジホスフェタン－２，４－ジスルフィド構造を持つ試薬を用いてもよい。
　各工程において、Ｗｏｈｌ－Ｚｉｅｇｌｅｒ反応を行う場合、使用されるハロゲン化剤としては、Ｎ－ヨードコハク酸イミド、Ｎ－ブロモコハク酸イミド（ＮＢＳ）、Ｎ－クロロコハク酸イミド（ＮＣＳ）、臭素、塩化スルフリルなどが挙げられる。さらに、熱、光、過酸化ベンゾイル、アゾビスイソブチロニトリルなどのラジカル開始剤を反応に加えることで、反応を加速させることができる。
　各工程において、ヒドロキシ基のハロゲン化反応を行う場合、使用されるハロゲン化剤としては、ハロゲン化水素酸と無機酸の酸ハロゲン化物、具体的には、塩素化では、塩酸、塩化チオニル、オキシ塩化リンなど、臭素化では、４８％臭化水素酸などが挙げられる。また、トリフェニルホスフィンと四塩化炭素または四臭化炭素などとの作用により、アルコールからハロゲン化アルキル体を得る方法を用いてもよい。あるいは、アルコールをスルホン酸エステルに変換の後、臭化リチウム、塩化リチウムまたはヨウ化ナトリウムと反応させるような２段階の反応を経てハロゲン化アルキル体を合成する方法を用いてもよい。
　各工程において、Ａｒｂｕｚｏｖ反応を行う場合、使用される試薬としては、ブロモ酢酸エチルなどのハロゲン化アルキル類；トリエチルフォスファイトやトリ（イソプロピル）ホスファイトなどのホスファイト類が挙げられる。
　各工程において、スルホンエステル化反応を行う場合、使用されるスルホン化剤としては、メタンスルホニルクロリド、ｐ－トルエンスルホニルクロリド、メタンスルホン酸無水物、ｐ－トルエンスルホン酸無水物、トリフルオロメタンスルホン酸無水物などが挙げられる。
　各工程において、加水分解反応を行う場合、試薬としては、酸または塩基が用いられる。また、ｔ－ブチルエステルの酸加水分解反応を行う場合、副生するｔ－ブチルカチオンを還元的にトラップするためにギ酸やトリエチルシランなどを加えることがある。
　各工程において、脱水反応を行う場合、使用される脱水剤としては、硫酸、五酸化二リン、オキシ塩化リン、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、アルミナ、ポリリン酸などが挙げられる。
　化合物（Ｉ）は、例えば、以下の製法によって製造することができる。化合物（Ｉ）のうち、波線の両方がシス型となる結合である化合物、および、波線の一方または両方がトランス型となる結合である化合物のいずれも以下に示す製法と同様の製法で製造することができる。本発明では、特にエステル化の際に、目的とする化合物（Ｉ）の構造に応じた適切な原料を用いることにより、所望の構造の化合物（Ｉ）を合成することが可能である。また、化合物（Ｉ）の塩は、無機塩基、有機塩基、有機酸、塩基性または酸性アミノ酸との適切な混合により得ることができる。
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　以下、本発明の化合物を含有する脂質粒子、および当該脂質粒子とガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸を含有する組成物の製造方法について記載する。
　本発明の脂質粒子は、本発明の化合物（カチオン性脂質）を、その他の脂質成分と混合した後、脂質成分から脂質粒子を調製するための公知の方法により製造することができる。例えば、上記の（混合）脂質成分を有機溶媒に溶解し、得られる有機溶媒溶液を水もしくは緩衝液と混合すること（例えば、乳化法）により、脂質粒子分散液として製造することができる。上記混合は、微小流体混合システム（例えば、NanoAssemblr装置 (Precision NanoSystems社)）を用いて行うことができる。得られた脂質粒子は、脱塩もしくは透析および滅菌ろ過に付してもよい。また、必要に応じてｐＨ調整、浸透圧調整を行ってもよい。
　化合物（Ｉ）は、式（Ｉ）のｎ、Ｒおよび波線の定義の組み合わせによって、複数の構造を取り得る。脂質粒子の製造には、化合物（Ｉ）として、特定の構造を有する１種類の化合物を単独で使用してもよいし、構造の異なる複数の種類の化合物の混合物として使用してもよい。
　「他の脂質成分」としては、前述したような構造脂質、例えば、ステロール類、リン脂質、ポリエチレングリコール脂質が挙げられる。「他の脂質成分」は、例えば、本発明の化合物１モルに対して、０．００８～４モル用いられる。本発明の化合物は、他の脂質成分（特に、コレステロール、ホスファチジルコリンおよびポリエチレングリコール脂質）と混合して用いることが好ましい。本発明の化合物と他の脂質成分とを混合して用いる場合の好ましい態様は、本発明の化合物１～４モル、ステロール類０～３モル、リン脂質０～２モルおよびポリエチレングリコール脂質０～１モルの混合物である。本発明の化合物と他の脂質成分とを混合して用いる場合のより好ましい態様は、本発明の化合物１～１．５モル、ステロール類０～１．２５モル、リン脂質０～０．５モルおよびポリエチレングリコール脂質０～０．１２５モルの混合物である。
　前記した有機溶媒溶液中の本発明の化合物、あるいは本発明の化合物と他の脂質成分との混合物の濃度は、好ましくは０．５～１００ｍｇ／ｍＬである。
　有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、tert－ブタノール、アセトン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、またはこれらの混合物が挙げられる。有機溶媒は、０～２０％の水もしくは緩衝液を含有してもよい。
　緩衝液としては、酸性緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、２-モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、リン酸緩衝液）や、中性緩衝液（例えば、４－(２－ヒドロキシエチル)－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)）が挙げられる。
　微小流体混合システムを用いて混合を行う場合、有機溶媒溶液１容積部に対して水もしくは緩衝液１～５容積部を混合することが好ましい。また、該システムにおいて、混合液（有機溶媒溶液と水もしくは緩衝液との混合液）流速は、好ましくは０．１～１０ｍＬ／ｍｉｎであり、温度は、好ましくは１５～４５℃である。
　本発明の組成物は、脂質粒子または脂質粒子分散液を製造する際、水もしくは緩衝液に活性成分としての核酸（例えば、ガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸）を添加して含ませておくことにより、活性成分を含む脂質粒子分散液として製造することができる。活性成分は、水もしくは緩衝液における活性成分の濃度が０．０５～２．０ｍｇ／ｍＬとなるように添加することが好ましい。本明細書において、活性成分を含む水もしくは緩衝液を、「活性成分（ガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸）を含む水溶液」と記載することがある。
　活性成分として２種類または２種類以上のガイドＲＮＡを含む本発明の組成物を製造する場合、当該組成物の製造において、２種類または２種類以上のガイドＲＮＡを含む水溶液を用いることが好ましい。
　また、本発明の組成物は、脂質粒子または脂質粒子分散液と、活性成分またはその水溶液とを、公知の方法で混和することによっても、活性成分を含む脂質粒子分散液として製造することができる。脂質粒子分散液は、脂質粒子を適当な分散媒に分散させることにより調製することができる。また、活性成分の水溶液は、活性成分を適当な溶媒に溶解させることにより調製することができる。
　分散媒および溶媒を除いた本発明の組成物における本発明の化合物の含量は、好ましくは、４０～７０重量％である。
　分散媒および溶媒を除いた本発明の組成物における活性成分の含量は、好ましくは、１～２０重量％である。
　脂質粒子分散液または組成物を含む分散液の分散媒は、透析することで水または緩衝液に置換することができる。透析には、分画分子量１０～２０Ｋの限外ろ過膜を用い、４℃～室温にて実施する。繰り返し透析を行ってもよい。分散媒の置換には、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（ＴＦＦ）を使用してもよい。また、分散媒の置換後、必要に応じてｐＨ調整、浸透圧調整を行ってもよい。
　以下、本発明の化合物を含有する脂質粒子、および当該脂質粒子とガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸を含有する組成物の分析方法について記載する。
　（組成物中の）脂質粒子の粒子径は、公知の手段により測定することができる。例えば、ＮＩＢＳ（非接触後方散乱）技術に基づく粒子径測定装置、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、自己相関関数のキュムラント解析によりＺ平均粒子径として算出することができる。（組成物中の）脂質粒子の粒子径（平均粒子径）は、好ましくは１０～２００ｎｍである。
　本発明の組成物における活性成分としての核酸（具体的には、ガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸）の濃度および内封率は、公知の手段により測定することができる。例えば、Ｑｕａｎｔ－ｉＴＴＭ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて核酸を蛍光標識し、その蛍光強度を測定することによって濃度および内封率を求めることができる。組成物中の核酸の濃度は、濃度が既知の核酸水溶液から作成される標準曲線を用いて算出することができ、内封率は、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（脂質粒子を崩壊させるための界面活性剤）の添加の有無による蛍光強度の違いを元に算出することができる。なお、組成物中の濃度は、脂質粒子に内封されている核酸および内封されていない核酸の合計の濃度を指し、内封率は組成物中の核酸全体のうち脂質粒子に内封されているものの割合を指す。
　以下、本発明の組成物の用途について説明する。
　本発明の組成物は、一つの実施形態において、本発明の組成物と細胞とを接触させる工程を含む、細胞中の標的遺伝子座を改変する方法において使用することができる。このような方法によって、標的遺伝子座が改変された細胞が得られる。
　本発明の組成物は、一つの実施形態において、本発明の組成物を含む医薬を製造するために使用することができる。換言すれば、本発明の組成物は、医薬として調製するないし製剤化することができる。
　本発明の好ましい一実施形態において、医薬は、ジストロフィン異常症（例、筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー）、ジストロフィン遺伝子関連拡張型心筋症）の予防・治療薬、または修復型ジストロフィンタンパク産生薬である。換言すれば、本発明の好ましい一実施形態において、本発明の組成物は、その有効量を投与することにより、哺乳動物におけるジストロフィン異常症（例、筋ジストロフィー（例、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー、Ｂｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィー）、ジストロフィン遺伝子関連拡張型心筋症）を予防・治療する方法のため（特に、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーを予防・治療する方法のため）に、または修復型ジストロフィンタンパクを産生する方法のために、使用される。
　筋ジストロフィーとは、「骨格筋の変性、壊死を主病変とし、臨床的には進行性の筋力低下をみる遺伝性の疾患」と定義されている。筋ジストロフィーの中には、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー、Ｂｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィー、エミリ・ドレフェス型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、三好型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、そして筋強直性ジストロフィーなどが知られている。
　ジストロフィン異常症とは、ジストロフィン遺伝子変異が原因で、機能欠損型または機能異常型ジストロフィンタンパク質によって引き起こされる種々の疾患を指す。Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー、Ｂｅｃｋｅｒ型筋ジストロフィー、およびジストロフィン遺伝子関連拡張型心筋症、などが含まれる。骨格筋障害が主な症状である場合が多いが、骨格筋症状が見られないケースも存在する。高ＣＫ血症、ミオグロビン尿症、拡張型心筋症、認知機能障害、などを伴う場合もある。
　Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーは小児の筋ジストロフィーの中でもっとも患者数の多い疾患であり、有病率は人口１０万人当たり４～５名とされている。進行性の筋萎縮を主症状とし、Ｘ染色体上のジストロフィン遺伝子が変異により機能不全となることが原因である。Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーでは、半分以上の患者が単一、または複数のエクソンの欠損を持っている。ジストロフィン遺伝子変異によってタンパク質読み枠のずれが生じ、途中に終始コドンが現れ、ジストロフィンタンパク質が合成されなくなることで一連の症状が引き起こされる。
　本明細書において修復型ジストロフィンタンパクとは、ゲノム編集の結果、発現が回復したジストロフィンタンパクを指す。特に、フレームシフト変異またはナンセンス変異を持つジストロフィン遺伝子に対し、ゲノム編集を用いることにより発現が回復した、Ｎ末端のアクチン結合ドメインと、Ｃ末端の高システインドメインを保持したジストロフィンタンパクを指す。エクソン重複によりフレームシフト変異が生じている場合、ゲノム編集により当該重複エクソンの片方をスキップした場合、健常型と１００％相同性をもつ修復型ジストロフィンタンパクの発現を回復させる場合もあり得る。修復型ジストロフィンタンパクとしては、特に、エクソン４４を欠失したヒトジストロフィン遺伝子においてエクソン４５がスキップされ、エクソン４３とエクソン４６とが連結したｍＲＮＡから翻訳されるヒトジストロフィンタンパクを指す。この他にも、例えば、エクソン１２－４４、１８－４４、４６－４７、４６－４８、４６－４９、４６－５１、４６－５３、または４６－５５を欠失したヒトジストロフィン遺伝子において、それぞれ所定のエクソンをスキップすることにより産生されるヒトジストロフィンタンパクも修復型ジストロフィンタンパクに含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の組成物を使用することにより修復型ジストロフィンタンパクが産生されるようになったか否かは、例えば、細胞内における修復型ジストロフィンタンパクをコードするｍＲＮＡをＰＣＲにより検出することにより確認することができる。あるいは、ジストロフィンタンパク質を認識する抗体を用いてウェスタンブロット法を行い、ジストロフィンタンパク質の分子量から確認することもできる。
　本発明の組成物は、一つの実施形態において、本発明の組成物と細胞とを接触させる工程を含む、標的遺伝子座が改変された細胞の製造方法において使用することができる。
　本発明の組成物は、一つの実施形態において、（１）本発明の組成物と非ヒト哺乳動物の受精卵、胚性幹細胞もしくは卵母細胞とを接触させる工程、（２）標的遺伝子座が改変された前記受精卵、胚性幹細胞もしくは卵母細胞を選択する工程、及び（３）前記選択された受精卵、胚性幹細胞もしくは卵母細胞を非ヒト哺乳動物の雌性動物に移植する工程を含む、標的遺伝子座が改変された非ヒト哺乳動物の作製方法において使用することができる。
　工程（１）において、本発明の組成物と接触させる細胞は、上記の細胞の他に、例えば、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞、精子幹細胞および始原生殖細胞などの生殖細胞とすることができる。
　工程（２）における選択は、薬剤耐性遺伝子を利用したＣＲＩＳＰＲシステムにおける一般的なスクリーニング方法によって行ってもよいし、ＰＣＲおよびシーケンス確認により行ってもよい。例えば、ノックイン用またはノックアウト用のベクターに薬剤耐性遺伝子発現ユニットを含めておき、ＣＲＩＳＰＲシステムにより標的遺伝子座に対してノックインまたはノックアウトが起きた受精卵等において薬剤耐性遺伝子を発現させた後、細胞集団を薬剤処理することにより、標的遺伝子座が改変された受精卵等を選択することができる。
　上記のような本発明の各種の方法、医薬、使用に係る実施形態において使用される「組成物」の詳細は前述した通りであり、例えば組成物が含有するガイドＲＮＡ等、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ等、細胞、標的遺伝子座の詳細や好ましい実施形態は、その組成物を用いる方法、医薬、使用等に係る発明においても同様である。
　本発明の医薬は、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射などの注射剤とすることが好ましいが、他の経路によっても活性成分の有効量を目的の細胞に送達することができれば、それに適応した剤型とすることも可能である。注射剤としては、静脈内注射または筋肉内注射が好ましい。
　本発明の医薬は、本発明の組成物に加えて、製薬学的に許容できる物質、例えば注射剤として調製する場合は注射用水、溶媒、添加剤等を必要に応じて含むことができる。本発明の医薬における活性成分の量ないし濃度は、所望の予防または治療の効果にとって有効な量の活性成分が目的とする細胞に送達できるよう、剤型、投与経路、１回あたりの投与量、一定期間中の投与回数等を勘案しながら、適宜調整することができる。投与経路としては、静脈内（全身）投与または筋肉内投与が好ましい。
　本発明において「治療」するとは、すでに疾患が発症している対象の生体内（組織中または臓器中）の一定の割合の細胞中の標的遺伝子座における遺伝子を改変し、疾患の原因となっている遺伝子の塩基配列の異常を修復することを指す。また、「予防」するとは、まだ疾患または症状が発症していない対象の生体内（組織中または臓器中）の一定の割合の細胞中の標的遺伝子座における遺伝子を改変し、疾患の原因となり得る遺伝子の塩基配列を修復することを指す。
　上記疾患の原因となっている遺伝子の塩基配列の異常としては、例えば、疾患に関与するような遺伝子変異（例、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー患者の一部でみられる、エクソン４４の欠損）が挙げられる。ジストロフィンタンパクの産生がされないエクソン４４欠損型Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー患者に対し、本発明の組成物を投与することにより、修復型ジストロフィンタンパクの産生が誘導され（ジストロフィンタンパクの回復と呼ばれることがある）、その結果、当該疾患を治療・予防しうる。
　組織中または臓器中の遺伝子が改変された細胞の割合（遺伝子の改変効率）や、疾患の症状の回復、緩和、発生の遅延または防止、進行の抑制などの程度は、一律に規定されるものではない。
　筋ジストロフィーの症状としては、限定されるものではないが、筋力低下、筋萎縮、運動能力の低下、歩行障害、心筋疾患などが含まれる。筋ジストロフィーの治療はこれらの症状の改善、発症もしくは進行の遅延などが含まれる。
　筋ジストロフィーの発症、進行又は症状に影響を及ぼすか否かを判定することによって筋ジストロフィーの治療効果を評価することができる。より具体的には、例えば、対象の筋重量、筋断面積、単離骨格筋の張力、筋力（例えば握力）、運動能力（例えばトレッドミル能力）などを測定することによって、筋ジストロフィーの治療効果を確認することができる。
　本発明は、更に以下の実施例、試験例および製剤例によって詳しく説明されるが、これらは本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。
　以下の実施例中の「室温」は通常約１０℃ないし約３５℃を示す。混合溶媒において示した比は、特に断らない限り容量比を示す。％は、特に断らない限り重量％を示す。
　実施例のカラムクロマトグラフィーにおける溶出は、特に言及しない限り、ＴＬＣ（Ｔｈｉｎ　Ｌａｙｅｒ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，薄層クロマトグラフィー）による観察下に行った。ＴＬＣ観察においては、ＴＬＣプレートとしてメルク（Ｍｅｒｃｋ）社製の６０　Ｆ２５４を用い、展開溶媒として、カラムクロマトグラフィーで溶出溶媒として用いた溶媒を用いた。また、検出にはＵＶ検出器を採用し、必要に応じてＴＬＣ発色試薬を用いて観察した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいて、ＮＨと記載した場合はアミノプロピルシラン結合シリカゲルを、Ｄｉｏｌと記載した場合は３－（２，３－ジヒドロキシプロポキシ）プロピルシラン結合シリカゲルを用いた。分取ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）において、Ｃ１８と記載した場合はオクタデシル結合シリカゲルを用いた。溶出溶媒において示した比は、特に断らない限り容量比を示す。
　１Ｈ　ＮＭＲはフーリエ変換型ＮＭＲで測定した。１Ｈ　ＮＭＲの解析にはＡＣＤ／ＳｐｅｃＭａｎａｇｅｒ（商品名）ソフトウエアなどを用いた。水酸基やアミノ基などのプロトンピークが非常に緩やかなピークについては記載していないことがある。
　ＭＳは、ＬＣ／ＭＳおよびＭＡＬＤＩ／ＴＯＦＭＳにより測定した。イオン化法としては、ＥＳＩ法、ＡＰＣＩ法または、ＭＡＬＤＩ法を用いた。マトリックスとしてはＣＨＣＡを用いた。データは実測値（ｆｏｕｎｄ）を記載した。通常、分子イオンピークが観測されるがフラグメントイオンとして観測されることがある。塩の場合は、通常、フリー体の分子イオンピーク、カチオン種、アニオン種もしくはフラグメントイオンピークが観測される。
　以下の実施例においては下記の略号を使用する。
ＭＳ：マススペクトル
Ｍ：モル濃度
Ｎ：規定度
ＣＤＣｌ３：重クロロホルム
ＤＭＳＯ－ｄ６：重ジメチルスルホキシド
１Ｈ　ＮＭＲ：プロトン核磁気共鳴
ＬＣ／ＭＳ：液体クロマトグラフ質量分析計
ＥＳＩ：electrospray ionization、エレクトロスプレーイオン化
ＡＰＣＩ：atmospheric pressure chemical ionization、大気圧化学イオン化
ＭＡＬＤＩ：Matrix-assisted laser desorption/ionization、マ卜リックス支援レーザー脱離イオン化
ＴＯＦＭＳ：Time-of-flight mass spectrometry、飛行時間型質量分析
ＣＨＣＡ：α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸
ＤＭＦ：N,N-ジメチルホルムアミド
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＭＡＰ：４－ジメチルアミノビリジン
ＴＢＡＦ：テトラブチルアンモニウムフルオリド
　［合成例１］3-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)-2,2-ビス(((9Z)-テトラデカ-9-エノイルオキシ)メチル)プロピル(9Z)-テトラデカ-9-エノアート
　A)　2-(((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール
　2, 2-ビス(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール(5.45 g)、1H-イミダゾール(2.72 g)およびDMF(190 mL)の混合物に、tert-ブチルクロロジメチルシラン(3.01 g)のDMF(10 mL)溶液を室温で加えた。24時間撹拌後、反応混合物を減圧下濃縮した。残渣を酢酸エチルで希釈し、水で3回、飽和食塩水で1回洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ヘキサン）で精製して標題化合物(2.25 g)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δppm 0.08 (6H, s), 0.90 (9H, s), 2.53 (3H, t, J = 5.5 Hz), 3.66 (2H, s), 3.73 (6H, d, J = 5.5 Hz)
　B)　3-((tert-ブチル(ジメチル)シリル)オキシ)-2,2-ビス(((9Z)-テトラデカ-9-エノイルオキシ)メチル)プロピル (9Z)-テトラデカ-9-エノアート
　2-(((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール(258 mg)、(9Z)-テトラデカ-9-エン酸(769 mg) および DMAP (126 mg)のDMF(3 mL)溶液に1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(790 mg)を室温で加えた。18時間撹拌後、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水で2回、飽和食塩水で1回洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（NH、酢酸エチル/ヘキサン）で精製して標題化合物（860 mg)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δppm 0.03 (6H, s), 0.81-0.96 (18H, m), 1.18-1.41 (36H, m), 1.53-1.67 (6H,m), 1.91-2.10 (12H, m), 2.29 (6H, t, J = 7.6 Hz), 3.58 (2H, s), 4.08 (6H, s), 5.27-5.43 (6H, m)
　C)　3-ヒドロキシ-2,2-ビス(((9Z)-テトラデカ-9-エノイルオキシ)メチル)プロピル(9Z)-テトラデカ-9-エノアート
　3-((tert-ブチル(ジメチル)シリル)オキシ)-2,2-ビス(((9Z)-テトラデカ-9-エノイルオキシ)メチル)プロピル(9Z)-テトラデカ-9-エノアート(5.91 g)のTHF(120 mL)溶液に、TBAFのTHF溶液(1 M, 14.85 mL)と酢酸(4.91 mL)の混合物を室温で加えた。3日間撹拌後、反応混合物を減圧下濃縮した。残渣を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で1回、飽和食塩水で1回洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ヘキサン）で精製して標題化合物(4.96 g)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δppm 0.82-0.97 (9H, m), 1.16-1.42 (36H, m), 1.52-1.68 (6H, m), 1.90-2.12 (12H, m), 2.32 (6H, t, J = 7.6 Hz), 2.52 (1H, t, J = 7.0 Hz), 3.49 (2H, d, J = 7.0 Hz), 4.11 (6H, s), 5.26-5.42 (6H, m)
　D)　3-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)-2,2-ビス(((9Z)-テトラデカ-9-エノイルオキシ)メチル)プロピル(9Z)-テトラデカ-9-エノアート
　3-ヒドロキシ-2,2-ビス(((9Z)-テトラデカ-9-エノイルオキシ)メチル)プロピル(9Z)-テトラデカ-9-エノアート(4.96 g)、DMAP (796 mg)および4-(ジメチルアミノ)ブタン酸塩酸塩(2.19 g)のDMF(20 mL)溶液に1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(2.50 g)を室温で加えた。18時間撹拌後、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で1回、飽和食塩水で1回洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（NH、酢酸エチル/ヘキサン）で精製して標題化合物（5.31 g)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δppm 0.82-0.94 (9H, m), 1.20-1.42 (36H, m), 1.50-1.66 (6H, m), 1.69-1.83 (2H, m), 1.90-2.10 (12H, m), 2.20 (6H, s), 2.23-2.41 (10H, m), 4.11 (8H, s), 5.23-5.44 (6H, m)
　以下の実施例で用いたＭｍＲｏｓａ２６ ｓｇＲＮＡ（配列番号９）および２種類のＨｓＤＭＤＥｘ４５ ｓｇＲＮＡ（ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡおよびＨｓＤＭＤＥｘ４５＃２３ ｓｇＲＮＡ、それぞれ前記配列番号１および２に対応）の塩基配列は次の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　［実施例１］Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＭｍＲｏｓａ２６ ｓｇＲＮＡを用いたＤＮＡ変異導入効率評価
　［１－１］Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの調製
　脂質混合物（合成例１で得られたカチオン性脂質：ＤＰＰＣ：コレステロール：ＧＭ－０２０＝６０：１０．６：２８．７：０．７，モル比）を、９０％ ＥｔＯＨ，１０％ ＲＮａｓｅフリー水に溶解して６．９ｍｇ／ｍＬの脂質溶液を得た。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０ ｍＭ ２－ＭＥＳ溶液ｐＨ５．５に溶解して０．１５ ｍｇ／ｍＬの核酸溶液を得た。得られた脂質溶液および核酸溶液を、室温で、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）によって流速比２．７ ｍＬ／ｍｉｎ：５．３ ｍＬ／ｍｉｎで混合し、核酸を内封する脂質粒子を含む分散液を得た。得られた分散液は、Ｓｌｙｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（２０ｋの分画分子量、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、水に対して４℃で１時間、ＰＢＳに対して４℃で１８時間透析を行った。さらにＡｍｉｃｏｎ（３０ｋの分画分子量）を用いて遠心（３，０００×ｇ，４℃，一定体積に落ちるまで２０分を数回）し、限外ろ過による濃縮を行った。続いて、０．２ μｍのｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ（Ｉｗａｋｉ）を用いてフィルターろ過を行い、４℃に保存した。このようにして調製した分散液を「Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ」として後記試験で用いた。脂質粒子の粒子径および多分散指数（ＰＤＩ）はＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した。また、脂質粒子における核酸の濃度および内封率はＱｕａｎｔ－ｉＴＴＭ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。測定結果を表２に示す。
　［１－２］ＭｍＲｏｓａ２６
ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰの調製
　脂質混合物（合成例１で得られたたカチオン性脂質：ＤＰＰＣ：コレステロール：ＧＭ－０２０＝６０：１０．６：２８．７：０．７，モル比）を、９０％ ＥｔＯＨ，１０％ＲＮａｓｅフリー水に溶解して６．９ ｍｇ／ｍＬの脂質溶液を得た。ＭｍＲｏｓａ２６ ｓｇＲＮＡ（ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ、前記表１参照）を、１０ ｍＭ ２－ＭＥＳ溶液ｐＨ５．５に溶解して０．１５ ｍｇ／ｍＬの核酸溶液を得た。得られた脂質溶液および核酸溶液を、室温で、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）によって流速比２．７ ｍＬ／ｍｉｎ：５．３ ｍＬ／ｍｉｎで混合し、核酸を内封する脂質粒子を含む分散液を得た。得られた分散液は、Ｓｌｙｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（２０ｋの分画分子量、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、水に対して４℃で１時間、ＰＢＳに対して４℃で１８時間透析を行った。さらにＡｍｉｃｏｎ（３０ｋの分画分子量）を用いて遠心（３，０００×ｇ，４℃，一定体積に落ちるまで２０分を数回）し、限外ろ過による濃縮を行った。続いて、０．２ μｍのｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ（Ｉｗａｋｉ）を用いてフィルターろ過を行い、４℃に保存した。このようにして調製した分散液を「ＭｍＲｏｓａ２６ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰ」として後記試験で用いた。脂質粒子の粒子径および多分散指数（ＰＤＩ）はＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した。また、脂質粒子における核酸の濃度および内封率はＱｕａｎｔ－ｉＴＴＭ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。測定結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　［１－３］Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＭｍＲｏｓａ２６ ｓｇＲＮＡを用いたＤＮＡ変異導入効率評価
　９週齡の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア）の右下肢腓腹筋に、ＭｍＲｏｓａ２６ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの混合溶液（ｓｇＲＮＡおよびｍＲＮＡとしての投与量が共に０．０１、０．０３、０．１、０．３又は１ μｇ／マウスとなるよう、それぞれのＬＮＰ分散液を混合して調製したもの）、またはＰＢＳを投与した。投与４日後、３．５％イソフルラン麻酔下で断頭放血にて安楽死させた後、骨格筋を摘出し液体窒素で速やかに凍結させた。凍結筋組織からＱＩＡａｍｐ Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出精製し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲ（Forward primer;配列番号１０、Reverse primer;配列番号１１）を行った。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、Ｔ７ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）で処理後、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて解析した。結果を図１に示す。
　　配列番号１０
　5'- CTCCGAGGCGGATCACAAGCAATAATAACCTGTAG -3'
　　配列番号１１
　5'- TGCAAGCACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAGAG -3'
　［実施例２］ヒトＤＭＤエクソン４５ノックイン－マウスＤｍｄ エクソン４４ノックアウトマウスにおけるＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡを用いたＤＮＡ変異導入活性、エクソンスキッピング効果および修復型ジストロフィンタンパク発現効果
　［２－１］Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの調製
　実施例１の［１－１］に記載した手順で再度Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰを調製し、核酸濃度、内封率、粒子径およびＰＤＩを測定した。測定結果を表３に示す。
　［２－２］ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰの調製
　脂質混合物（合成例１で製造したカチオン性脂質：ＤＰＰＣ：コレステロール：ＧＭ－０２０＝６０：１０．６：２８．７：０．７，モル比）を、９０％ ＥｔＯＨ，１０％ ＲＮａｓｅフリー水に溶解して６．９ ｍｇ／ｍＬの脂質溶液を得た。ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡ（ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ、前記表１参照）を、１０ ｍＭ ２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）溶液ｐＨ５．５に溶解して０．１５ ｍｇ／ｍＬの核酸溶液を得た。得られた脂質溶液および核酸溶液を、室温で、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）によって流速比２．７ ｍＬ／ｍｉｎ：５．３ ｍＬ／ｍｉｎで混合し、核酸を内封する脂質粒子を含む分散液を得た。得られた分散液は、Ｓｌｙｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（２０ｋの分画分子量、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、水に対して４℃で１時間、ＰＢＳに対して４℃で１８時間透析を行った。さらにＡｍｉｃｏｎ（３０ｋの分画分子量）を用いて遠心（３，０００×ｇ，４℃，一定体積に落ちるまで２０分を数回）し、限外ろ過による濃縮を行った。続いて、０．２ μｍのｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ（Ｉｗａｋｉ）を用いてフィルターろ過を行い、４℃に保存した。このようにして調製した分散液を「ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰ」として後記試験で用いた。脂質粒子の粒子径および多分散指数（ＰＤＩ）はＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した。また、脂質粒子における核酸の濃度および内封率はＱｕａｎｔ－ｉＴＴＭ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。測定結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　［２－３］ヒトＤＭＤ エクソン ４５ノックイン－マウスＤｍｄ エクソン
４４ノックアウトマウスの作製方法
　１０ μｇのヒトＤＭＤ エクソン４５およびその５’側０．７ ｋｂ、３’側０．６ ｋｂを含む配列１．５ｋｂ、ＦＲＴ配列で挟まれたネオマイシン耐性遺伝子発現ユニットおよびマウスＤｍｄ イントロン ４４とイントロン ４５由来配列各１．５ ｋｂからなるノックインベクターを、２．５ μｇのｐＣＡＧ－Ｃａｓ９発現ベクターおよび２種類の２．５ μｇのｐＵ６－ｓｇＲＮＡ発現ベクター（ターゲット配列；配列番号１２および配列番号１３）とともに、５×１０５個のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、ＰＣＲおよびシーケンス確認により相同組み換え細胞株を選抜した。Ｆｌｐｅ（フリッパーゼ）処理によりネオマイシン耐性ユニットを除去した後、当該ＥＳ細胞株をＩＣＲマウスの４倍体胚盤胞に顕微注入し、キメラマウスを取得した。キメラマウスと雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの体外受精により雌性ヒトＤＭＤ エクソン４５ヘテロノックインマウスを取得した。続いて、雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと雌性ヒトＤＭＤ エクソン４５ヘテロノックインマウスの受精卵に１００ ｎｇ／μＬのＣａｓ９ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２種類のマウスＤｍｄ エクソン ４４ノックアウト用ｓｇＲＮＡ（ターゲット配列；配列番号１４および配列番号１５、株式会社ＦＡＳＭＡＣ）およびｓｓＯＤＮ ５０ ｎｇ／μＬ（配列番号１６、ユーロフィンジェノミクス株式会社）を顕微注入し、得られた雄性産仔について、ＰＣＲおよびシーケンス確認による遺伝子判定を行い、ヒトＤＭＤ エクソン４５ノックイン－マウスＤｍｄ エクソン４４ノックアウトマウスを選抜した。
　　配列番号１２
　5’- atgaatgtgcctacatatgg -3’
　　配列番号１３
　5’- catagcatgcatttggcttc -3’
　　配列番号１４
　5’- gaatgaggtagtgttgtagg -3’
　　配列番号１５
　5’- gcaggaaatcatcttatagc -3’
　　配列番号１６
　5’- gagcaagctgggttagaacaaaggtctgtcagagtcagcatgggaatgaggtagtgttgtagcaggaaatagtgtggtttaggtctctccccgccctctgtgtatgtgtgtgtgtgtgtt -3’
　［２－４］骨格筋におけるＤＮＡ 変異導入効率評価
　１２週齡の雄性ヒトＤＭＤ エクソン４５ノックイン－マウスＤｍｄ エクソン４４ノックアウトマウスの右下肢腓腹筋に、３ μｇのＨｓＤＭＤ Ｅｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡを内封したＬＮＰと３ μｇのＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡを内封したＬＮＰ（［２－１］のＣａｓ９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰと［２－２］のＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰの混合溶液）を、左下肢腓腹筋にはＰＢＳを、それぞれ６回／２週間投与した。初回投与から５６日後に、３．５％イソフルラン麻酔下で安楽死させた後、骨格筋を摘出し液体窒素で速やかに凍結させた。凍結筋組織を３％ ｐｒｏｔｅｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｇｉｍａ）と５ ｍＭ ＥＤＴＡ（ＷＡＫＯ）を含有したＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（ＷＡＫＯ）でホモジナイズ後、ＱＩＡａｍｐ Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出精製し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）と配列番号１７（Forward primer）および配列番号１８（Reverse primer）のｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔを用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、再アニーリングした後にＴ７ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）で処理し、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて電気泳動し、付属のソフトウェアーで解析した。得られた数値を用いて、変異導入効率を下記の計算式（数１）で求めた。
　　配列番号１７
　5’- CAAGTTTAAAATAGCAGAAAACCACTAACTAGCCA -3’
　　配列番号１８
　5’- CTGACACATAAAAGGTGTCTTTCTGTCTTGTATCC -3’
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　その結果、図２に示すように、ＰＢＳ投与に対してＬＮＰを投与した骨格筋では特異的なＤＮＡの切断が検出され、変異導入効率は５．８４±２．１５％（Ｍｅａｎ±ＳＤ）であった。
　［２－５］骨格筋におけるエクソンスキッピング効率評価
　ホモジネートの一部にＱＩＡｚｏｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）とクロロフォルム（ＷＡＫＯ）を添加し、混合・遠心後にＲＮＡを含む水槽を分離回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出精製した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて逆転写し、続けてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）と配列番号１９（Forward primer）および配列番号２０（Reverse primer）のｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｔを用いて増幅させた。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製後、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて電気泳動し、付属のソフトウェアーで解析した。得られた数値を用いてエクソンスキッピング効率（ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を下記の計算式（数２）で求めた。
　　配列番号１９
　5’- GGTGAAAGTACAGGAAGCCGT -3’
　　配列番号２０
　5’- TTAGCTGCTGCTCATCTCCAA -3’
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
　その結果、図３に示すように、ＰＢＳ投与に対してＬＮＰを投与した骨格筋ではｈｕｍａｎ Ｅｘｏｎ ４５がｓｋｉｐされた短いＰＣＲ産物が検出され、その効率は５．０７±２．５９％（Ｍｅａｎ±ＳＤ）であった。
　［２－６］骨格筋におけるジストロフィンタンパク回復の評価
　ホモジネートの一部を遠心し、上清を回収した。上清中の総タンパク質量をＰｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）で測定し、０．０２ μｇ／ｕＬ及び３ μｇ／ｕＬに調整した。
　Ｇａｐｄｈ検出：０．０２ μｇ／μＬに調整した上清に還元剤（Ｔｈｅｒｍｏ）を含有したＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を添加し、９８℃で１０分間処理した。０．２ μｇ／１０ μＬの還元・熱処理したサンプル液をＴＧＸ ＡＮＹ ＫＤゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に添加し、２００Ｖで３０分間泳動した。泳動終了後、Ｔｒａｓｂｌｏｔ ｔｕｒｂｏ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。転写したＰＶＤＦ膜をｉＢｉｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ）で５分間ブロッキングし、引き続きｉＢｉｎｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｍｏ）を用いて、希釈液（ＴＯＹＯＢＯ）で希釈した抗ＧＡＰＤＨ抗体（１：２０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とＨＲＰ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（１：５０００，ＧＥ）でブロッティングを行った。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ膜を蒸留水で洗浄し、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ）に約５分間浸し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で検出した。
　ジストロフィン検出：３ μｇ／μＬに調整した上清に還元剤（Ｔｈｅｒｍｏ）を含有したＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加し、７０℃で１０分間処理した。３０ μｇ／１０ μＬの還元・熱処理したサンプル液を３－８％ Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅゲル（Ｔｈｅｒｍｏ）に添加し、１５０Ｖで約９０分間電気泳動した。泳動終了後、Ｔｒａｓｂｌｏｔ ｔｕｒｂｏ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。転写したＰＶＤＦ膜をｉＢｉｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ）で５分間ブロッキングし、引き続きｉＢｉｎｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、希釈液（ＴＯＹＯＢＯ）で希釈した抗ジストロフィン抗体（１：２０００，ａｂｃａｍ）とＨＲＰ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（１：５０００，ＧＥ）でブロッティングを行った。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ膜を蒸留水で洗浄し、ＥＣＬ Ｓｅｌｅｃｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ）に約５分間浸し、Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で検出した。
　ＣｈｅｍｉＤｏｃで検出されたＧａｐｄｈ及びジストロフィンをＩｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で解析し、修復型ジストロフィン／Ｇａｐｄｈとして相対的な発現量を算出した。以上の結果を図４に示す。ＰＢＳ投与群に比べてＬＮＰ投与群では顕著なジストロフィンの発現が確認された。
　［実施例３］ヒトｉＰＳ細胞由来筋芽細胞におけるＨｓＤＭＤＥｘ４５ ｓｇＲＮＡを用いたＤＮＡ変異導入効率およびエクソンスキッピング効率（その１）
　［３－１］Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの調製
　実施例１の［１－１］に記載した手順で再度Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰを調製し、核酸濃度、内封率、粒子径およびＰＤＩを測定した。測定結果を表４に示す。
　［３－２］ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰの調製
　実施例２の［２－２］で作製したＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰを再び使用した。実施例２のときの測定結果を表４に再掲する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　［３－３］ヒトｉＰＳ細胞の筋分化とＬＮＰの導入
　Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ誘導型ＭｙｏＤ発現カセットを含むジストロフィンＥｘ ４５欠損ＤＭＤ患者由来のヒトｉＰＳ細胞を、１０ μＭ Ｙ－２７６３２を含むＡＫ０２Ｎ培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）に懸濁し、マトリゲルがコートされた６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種した。翌日、培地をＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）へと交換し、さらにその翌日に１ μｇ／ｍＬ　ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを含むＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ培地に交換することによりＭｙｏＤ遺伝子発現誘導を開始した。ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ添加から２４時間後、５％ ＫＳＲと１ μｇ／ｍＬ ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを含むａｌｐｈａ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ）培地に交換し、３日間培養した。培地を７００ μＬに減らし、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ（ｍＲＮＡとして１，３又は１０μｇ／ｗｅｌｌ）およびＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰ（ｓｇＲＮＡとして１，３，１０ μｇ／ｗｅｌｌ）の混合物を添加した。添加６時間後に、１．３ ｍＬの培地（ａｌｐｈａ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ，５％ ＫＳＲ，１μｇ／ｍＬ ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）を加えた。
　［３－４］ヒトｉＰＳ細胞由来筋芽細胞におけるＤＮＡ変異導入効率評価
　ＬＮＰの添加から７２時間後、細胞を回収し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出精製した。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いたＰＣＲ（Forward primer:前記配列番号１７, Reverse primer:前記配列番号１８)によって標的配列を含むゲノム領域を増幅し、得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。精製したＤＮＡ断片を再アニーリングした後にＴ７ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）で処理し、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて電気泳動し、付属のソフトウェアーで解析した。変異導入効率の計算式は［２－４］と同様である（前記数１参照）。結果を図５に示す。
　［３－５］ヒトｉＰＳ細胞由来筋芽細胞におけるエクソンスキッピング効率評価
　回収した細胞から、ＲＮＡ ｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出精製した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて逆転写し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲ（Forward primer:配列番号２１, Reverse primer:配列番号２２）を行った。得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを用いて電気泳動し、付属のソフトウェアーで解析した。エクソンスキッピング効率（ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）の計算式は［２－５］と同様である（前記数２参照）。結果を図６に示す。
　　配列番号２１
　5’- CTACAGGAAGCTCTCTCCCA -3’
　　配列番号２２
　5’- TGCTTCCTCCAACCATAAAACA -3’
　［実施例４］ヒトｉＰＳ細胞由来筋芽細胞におけるＨｓＤＭＤＥｘ４５ ｓｇＲＮＡを用いたゲノム編集効果およびエクソンスキッピング効率評価（その２）
　［４－１］Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの調製
　実施例１の［１－１］に記載した手順で再度Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰを調製し、核酸濃度、内封率、粒子径およびＰＤＩを測定した。測定結果を表５に示す。
　［４－２］ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰの調製
　実施例２の［２－２］で作製したＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰを再び使用した。実施例２のときの測定結果を表５に再掲する。
　［４－３］ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃２３ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰの調製
　実施例２の［２－２］に記載した手順において、「ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡ」（実施例４におけるＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡ、前記表１参照）の代わりに「ＨｓＤｍｄＥｘ４５＃２３ ｓｇＲＮＡ」（前記表１の「ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃２３ ｓｇＲＮＡ」参照）を用いたこと以外は同様にして、ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃２３ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰを調製し、核酸濃度、内封率、粒子径およびＰＤＩを測定した。測定結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　［４－４］ヒトｉＰＳ細胞の筋分化とＬＮＰの導入
　Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ誘導型ＭｙｏＤ発現カセットを含むジストロフィンＥｘ ４５欠損ＤＭＤ患者由来のヒトｉＰＳ細胞および健常人由来ヒトｉＰＳ細胞を、１０ μＭ Ｙ－２７６３２を含むＡＫ０２Ｎ培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）に懸濁し、マトリゲルがコートされた６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種した。翌日、培地をＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）へと交換し、さらにその翌日に１ μｇ／ｍＬ　ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを含む培地（Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍに交換することによりＭｙｏＤ遺伝子発現誘導を開始した。ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ添加から２４時間後、５％ ＫＳＲと１ μｇ／ｍＬ ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを含むａｌｐｈａ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ）培地に交換、３日間培養した。患者由来ヒトｉＰＳ細胞の培地を７００ μＬに減らし、ＬＮＰの混合物を添加した（下記表６参照）。添加６時間後に、１．３ ｍＬの培地（ａｌｐｈａ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ，５％ ＫＳＲ，１μｇ ／ｍＬ ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）を加えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　［４－５］ヒトｉＰＳ細胞由来筋芽細胞におけるエクソンスキッピング効率評価
　ＬＮＰ添加から７２時間後に、冷却されたＰＢＳで各ｗｅｌｌを２回洗浄後、セルスクレーパーで細胞を回収し、４ ℃ １５，０００ ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後、上清を取り除きＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒで細胞を溶解した。細胞溶解液の一部から、ＲＮＡ ｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出精製した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて逆転写し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲ (Forward primer:前記配列番号２１, Reverse primer:前記配列番号２２)を行った。得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを用いて電気泳動し、付属のソフトウェアーで解析した。エクソンスキッピング効率（ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）の計算式は［２－５］と同様である（前記数２参照）。結果を図７に示す。
　［４－６］ヒトｉＰＳ細胞由来筋芽細胞におけるジストロフィンタンパクの回復評価
　細胞溶解液の一部の総タンパク質量をＰｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）で測定し、０．０８３ μｇ／μＬ及び０．５８ μｇ／μＬに調製した。
　Ｇａｐｄｈ検出：０．０８３ μｇ／μＬに調製した細胞溶解液に還元剤（Ｔｈｅｒｍｏ）を含有したＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を添加し、９８℃で１０分間処理した。１ μｇ／１２ μＬの還元・熱処理したサンプル液を１０％ ミニプロティアンＴＧＸプレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に添加し、１５０Ｖで４０分間電気泳動した。泳動終了後、Ｔｒａｓｂｌｏｔ ｔｕｒｂｏ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。転写したＰＶＤＦ膜をｉＢｉｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ）で５分間ブロッキングし、引き続きｉＢｉｎｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｍｏ）を用いて、希釈液（ＴＯＹＯＢＯ）で希釈した抗ＧＡＰＤＨ抗体（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とＨＲＰ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（１：１０００，ＧＥ）でブロッティングを行った。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ膜を蒸留水で洗浄し、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ）に約５分間浸し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で検出した。
　ジストロフィン検出：０．５８ μｇ／μＬに調製した上清に還元剤（Ｔｈｅｒｍｏ）を含有したＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加し、７０℃で１０分間処理した。７ μｇ／１２ μＬの還元・熱処理したサンプル液を３－８％ Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅゲル（Ｔｈｅｒｍｏ）に添加し、１５０Ｖで約９０分間泳動した。泳動終了後、Ｔｒａｓｂｌｏｔ ｔｕｒｂｏ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。転写したＰＶＤＦ膜をｉＢｉｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ）で５分間ブロッキングし、引き続きｉＢｉｎｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、希釈液（ＴＯＹＯＢＯ）で希釈した抗ジストロフィン抗体（１：１０００，ａｂｃａｍ）とＨＲＰ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（１：１０００，ＧＥ）でブロッティングを行った。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ膜を蒸留水で洗浄し、ＥＣＬ Ｓｅｌｅｃｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ）に約５分間浸し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で検出した。
　ＣｈｅｍｉＤｏｃで検出されたＧＡＰＤＨ及びジストロフィンをＩｍａｇｅ Ｌａｂ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で解析して修復型ジストロフィンの発現量をＧＡＰＤＨで補正し、健常人由来ヒトｉＰＳ細胞におけるジストロフィン発現量を１００％として相対的な発現量を算出した。以上の結果を図８に示す。
　［実施例５］ＬＮＰ静脈内投与時の各種組織におけるＤＮＡ変異導入効率評価
　［５－１］Ｃａｓ９　ｍＲＮＡ－ＬＮＰの調製
　脂質混合物（合成例１で得られたカチオン性脂質：ＤＰＰＣ：コレステロール：ＧＭ－０２０＝６０：１０．６：２８．７：０．７，モル比）を、９０％ ＥｔＯＨ，１０％ ＲＮａｓｅフリー水に溶解して６．９　ｍｇ／ｍＬの脂質溶液を得た。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０ ｍＭ ２－ＭＥＳ溶液ｐＨ５．５に溶解して０．１５ ｍｇ／ｍＬの核酸溶液を得た。得られた脂質溶液および核酸溶液を、室温で、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）によって流速比２．７ ｍＬ／ｍｉｎ：５．３ ｍＬ／ｍｉｎで混合し、核酸を内封する脂質粒子を含む分散液を得た。得られた分散液は、Ｓｌｙｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（２０ｋの分画分子量、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、水に対して４℃で１時間、ＰＢＳに対して４℃で１８時間透析を行った。さらにＡｍｉｃｏｎ（３０ｋの分画分子量）を用いて遠心（３，０００×ｇ，４℃，一定体積に落ちるまで２０分を数回）し、限外ろ過による濃縮を行った。続いて、０．２ μｍのｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ（Ｉｗａｋｉ）を用いてフィルターろ過を行い、４℃に保存した。このようにして調製した分散液を「Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ」として後記試験で用いた。脂質粒子の粒子径および多分散指数（ＰＤＩ）はＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した。また、脂質粒子における核酸の濃度および内封率はＱｕａｎｔ－ｉＴＴＭ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。結果を表７に示す。
　［５－２］ＭｍＲｏｓａ２６ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰの調製
　脂質混合物（合成例１で得られたカチオン性脂質：ＤＰＰＣ：コレステロール：ＧＭ－０２０＝６０：１０．６：２８．７：０．７，モル比）を、９０％ ＥｔＯＨ，１０％ ＲＮａｓｅフリー水に溶解して６．９ ｍｇ／ｍＬの脂質溶液を得た。ＭｍＲｏｓａ２６ ｓｇＲＮＡ（ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ、前記表１参照）を、１０ ｍＭ ２－ＭＥＳ溶液ｐＨ５．５に溶解して０．１５ ｍｇ／ｍＬの核酸溶液を得た。得られた脂質溶液および核酸溶液を、室温で、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）によって流速比２．７ ｍＬ／ｍｉｎ：５．３ ｍＬ／ｍｉｎで混合し、核酸を内封する脂質粒子を含む分散液を得た。得られた分散液は、Ｓｌｙｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（２０ｋの分画分子量、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、水に対して４℃で１時間、ＰＢＳに対して４℃で１８時間透析を行った。さらにＡｍｉｃｏｎ（３０ｋの分画分子量）を用いて遠心（３，０００×ｇ，４℃，一定体積に落ちるまで２０分を数回）し、限外ろ過による濃縮を行った。続いて、０．２ μｍのｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ（Ｉｗａｋｉ）を用いてフィルターろ過を行い、４℃に保存した。このようにして調製した分散液を「ＭｍＲｏｓａ２６ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰ」として後記試験で用いた。脂質粒子の粒子径および多分散指数（ＰＤＩ）はＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した。また、脂質粒子における核酸の濃度および内封率はＱｕａｎｔ－ｉＴＴＭ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　５週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尾静脈から５０ μｇのｍＲｏｓａ２６ ｓｇＲＮＡと５０ μｇのＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡを内封したＬＮＰを投与した。７日後、３．５％イソフルラン麻酔下で断頭放血にて安楽死させた後、腓腹筋、前脛骨筋、大腿四頭筋、横隔膜、心臓、を採取し液体窒素で速やかに凍結させた。凍結組織のゲノムＤＮＡをＱＩＡａｍｐ Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出精製し、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ）と以下に示すｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ（Forward primer:前記配列番号１７, Reverse primer:前記配列番号１８）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ９６ ＰＣＲ ＢｉｏＲｏｂｏｔ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、Ｔ７ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）で処理後、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて電気泳動し、付属のソフトウェアーで解析した。得られた数値を用いて、変異導入効率を前記計算式（数１参照）で求めた。
　その結果、図９に示すように、ＰＢＳ投与に対してＬＮＰを投与した骨格筋では特異的に標的ＤＮＡへの変異導入が検出され、変位導入効率は腓腹筋で２．５０％、前脛骨筋で１．３２％、大腿四頭筋２．２７％、横隔膜１．５４％、心臓０．２２％、肝臓で１．８３であった。その他の採取した組織では変異導入は見られなかった。
　［実施例６］Ｄｕａｌ　ｓｇＲＮＡｓを用いた骨格筋におけるエクソンスキッピング効率評価
　［６－１］Ｃａｓ９　ｍＲＮＡ－ＬＮＰの調製
　脂質混合物（合成例１で得られたカチオン性脂質：ＤＰＰＣ：コレステロール：ＧＭ－０２０＝６０：１０．６：２８．７：０．７，モル比）を、９０％ ＥｔＯＨ，１０％ ＲＮａｓｅフリー水に溶解して６．９ｍｇ／ｍＬの脂質溶液を得た。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０ ｍＭ ２－ＭＥＳ溶液ｐＨ５．５に溶解して０．１５ ｍｇ／ｍＬの核酸溶液を得た。得られた脂質溶液および核酸溶液を、室温で、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）によって流速比２．７ ｍＬ／ｍｉｎ：５．３ ｍＬ／ｍｉｎで混合し、核酸を内封する脂質粒子を含む分散液を得た。得られた分散液は、Ｓｌｙｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（２０ｋの分画分子量、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、水に対して４℃で１時間、ＰＢＳに対して４℃で１８時間透析を行った。さらにＡｍｉｃｏｎ（３０ｋの分画分子量）を用いて遠心（３，０００×ｇ，４℃，一定体積に落ちるまで２０分を数回）し、限外ろ過による濃縮を行った。続いて、０．２ μｍのｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ（Ｉｗａｋｉ）を用いてフィルターろ過を行い、４℃に保存した。このようにして調製した分散液を「Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰ」として後記試験で用いた。脂質粒子の粒子径および多分散指数（ＰＤＩ）はＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した。また、脂質粒子における核酸の濃度および内封率はＱｕａｎｔ－ｉＴＴＭ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。結果を表８に示す。
　［６－２］ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１＋＃２３ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰの調製
　脂質混合物（合成例１で製造したカチオン性脂質：ＤＰＰＣ：コレステロール：ＧＭ－０２０＝６０：１０．６：２８．７：０．７，モル比）を、９０％ ＥｔＯＨ，１０％ ＲＮａｓｅフリー水に溶解して６．９ ｍｇ／ｍＬの脂質溶液を得た。ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１ ｓｇＲＮＡおよびＨｓＤＭＤＥｘ４５＃２３ ｓｇＲＮＡを、１０ ｍＭ ２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）溶液ｐＨ５．５に等量ずつ溶解して０．１５ ｍｇ／ｍＬの核酸溶液を得た。得られた脂質溶液および核酸溶液を、室温で、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）によって流速比２．７ ｍＬ／ｍｉｎ：５．３ ｍＬ／ｍｉｎで混合し、核酸を内封する脂質粒子を含む分散液を得た。得られた分散液は、Ｓｌｙｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（２０ｋの分画分子量、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、水に対して４℃で１時間、ＰＢＳに対して４℃で１８時間透析を行った。さらにＡｍｉｃｏｎ（３０ｋの分画分子量）を用いて遠心（３，０００×ｇ，４℃，一定体積に落ちるまで２０分を数回）し、限外ろ過による濃縮を行った。続いて、０．２ μｍのｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ（Ｉｗａｋｉ）を用いてフィルターろ過を行い、４℃に保存した。このようにして調製した分散液を「ＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１＋＃２３ ｓｇＲＮＡ－ＬＮＰ」として後記試験で用いた。脂質粒子の粒子径および多分散指数（ＰＤＩ）はＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した。また、脂質粒子における核酸の濃度および内封率はＱｕａｎｔ－ｉＴＴＭ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　６週齡の雄性ヒトＤＭＤ ｅｘｏｎ ４５ノックイン－マウスＤｍｄ ｅｘｏｎ ４４ノックアウトマウスの右下肢腓腹筋に３ μｇのＨｓＤＭＤＥｘ４５＃１＋＃２３及び３ μｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡを内封したＬＮＰを１日おきに４回投与した。初回投与から１４日後に、３．５％イソフルラン麻酔下で断頭放血にて安楽死させた後、骨格筋を摘出し液体窒素で速やかに凍結させた。凍結させた骨格筋にＱｉａｚｏｌ （ＱＩＡＧＥＮ）を添加しホモジネートした。クロロフォルム（ＷＡＫＯ）を添加し、混合・遠心後にＲＮＡを含む水槽を分離回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出精製した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて逆転写し、続けてＱ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ）と以下に示すｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ（Forward primer:前記配列番号１９, Reverse primer:前記配列番号２０）を用いて増幅させた。ＲＴ―ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製後、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて電気泳動し、付属のソフトウェアーで解析した。得られた数値を用いてｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙを前記計算式（数２参照）で求めた。
　その結果、図１０に示すように、ＰＢＳ投与に対してＬＮＰを投与した骨格筋ではｈｕｍａｎ Ｅｘｏｎ ４５がｓｋｉｐされた短いジストロフィン遺伝子の転写産物がＲＴ－ＰＣＲによって検出され、そのエクソンスキッピング効率は４７．９１±９．３２％（Ｍｅａｎ±ＳＤ）であった（ＰＢＳ対象：２．６３±０．６２％）。
　本発明の化合物、脂質粒子および組成物は、種々の細胞、組織および臓器に対し効率的に、ＣＲＩＳＰＲシステムに用いられるｇＲＮＡ等およびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ等を導入することを可能にする。したがって、本発明の化合物、脂質粒子および組成物は、ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるＤＤＳ技術として利用可能である。また、本発明の化合物、脂質粒子および組成物は、種々の疾患、例えば筋ジストロフィーの予防・治療薬として、また研究用試薬として利用可能である。

Claims (28)

  1. 　１）式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（Ｉ）中、
    　ｎは、２～５の整数を、
    　Ｒは、直鎖状Ｃ１－５アルキル基、直鎖状Ｃ７－１１アルケニル基又は直鎖状Ｃ１１アルカジエニル基を、
    　波線は、それぞれ独立して、シス型またはトランス型の結合を示す。］
    で表される化合物又はその塩、
    　２）構造脂質、並びに、
    　３）ガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸を含む、細胞中の標的遺伝子座における遺伝子改変を誘導するための組成物。
  2. 　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９であり；
    　ガイドＲＮＡが、
    　（ａ）キメラＲＮＡ、又は
    　（ｂ）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む２以上のＲＮＡ
    である、請求項１記載の組成物。
  3. 　Ｃａｓ９が化膿性レンサ球菌由来Ｃａｓ９である、請求項２記載の組成物。
  4. 　前記ガイドＲＮＡが２種類以上のガイドＲＮＡである、請求項１記載の組成物。
  5. 　細胞が筋細胞である、請求項１記載の組成物。
  6. 　標的遺伝子座が、ジストロフィン遺伝子のヌクレオチド配列を含む、請求項５記載の組成物。
  7. 　ガイドＲＮＡが、
    （１）配列番号１もしくは配列番号２で示される核酸配列を含むキメラＲＮＡ、又は
    （２）(i) 配列番号３もしくは配列番号４で示される核酸配列を含むｃｒＲＮＡ、および
    　　　(ii)配列番号７もしくは配列番号８で示される核酸配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ
    である、請求項５記載の組成物。
  8. 　請求項１記載の組成物と細胞とを接触させる工程を含む、細胞中の標的遺伝子座を改変する方法。
  9. 　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９であり；
    　ガイドＲＮＡが、
    　（ａ）キメラＲＮＡ、又は
    　（ｂ）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む２以上のＲＮＡ
    である、請求項８記載の方法。
  10. 　Ｃａｓ９が化膿性レンサ球菌由来Ｃａｓ９である、請求項９記載の方法。
  11. 　細胞が筋細胞である、請求項８記載の方法。
  12. 　標的遺伝子座が、ジストロフィン遺伝子のヌクレオチド配列を含む、請求項１１記載の方法。
  13. 　ガイドＲＮＡが、
    （１）配列番号１もしくは配列番号２で示される核酸配列を含むキメラＲＮＡ、又は
    （２）(i) 配列番号３もしくは配列番号４で示される核酸配列を含むｃｒＲＮＡ、および
    　　　(ii)配列番号７もしくは配列番号８で示される核酸配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ
    である、請求項１１記載の方法。
  14. 　請求項８記載の方法によって得られる標的遺伝子座が改変された細胞。
  15. 　請求項６記載の組成物を含む、医薬。
  16. 　ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣａｓ９であり；
    　ガイドＲＮＡが、
    　（ａ）キメラＲＮＡ、又は
    　（ｂ）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む２以上のＲＮＡ
    である、請求項１５記載の医薬。
  17. 　Ｃａｓ９が化膿性レンサ球菌由来Ｃａｓ９である、請求項１６記載の医薬。
  18. 　ガイドＲＮＡが、
    （１）配列番号１もしくは配列番号２で示される核酸配列を含むキメラＲＮＡ、又は
    （２）(i) 配列番号３もしくは配列番号４で示される核酸配列を含むｃｒＲＮＡ、および
    　　　(ii)配列番号７もしくは配列番号８で示される核酸配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ
    である、請求項１５記載の医薬。
  19. 　筋ジストロフィーの予防・治療薬である、請求項１５記載の医薬。
  20. 　修復型ジストロフィンタンパク産生薬である、請求項１５記載の医薬。
  21. 　哺乳動物に対して請求項６記載の組成物の有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における筋ジストロフィーの予防・治療方法。
  22. 　哺乳動物に対して請求項６記載の組成物の有効量を投与することを特徴とする、該哺乳動物における修復型ジストロフィンタンパク産生方法。
  23. 　筋ジストロフィーの予防・治療剤を製造するための、請求項６記載の組成物の使用。
  24. 　筋ジストロフィーの予防・治療に使用するための、請求項６記載の組成物。
  25. 　請求項１記載の組成物と細胞とを接触させる工程を含む、標的遺伝子座が改変された細胞の製造方法。
  26. 　（１）請求項１記載の組成物と非ヒト哺乳動物の受精卵、胚性幹細胞もしくは卵母細胞とを接触させる工程、
    　（２）標的遺伝子座が改変された前記受精卵、胚性幹細胞もしくは卵母細胞を選択する工程、及び
    　（３）前記選択された受精卵、胚性幹細胞もしくは卵母細胞を非ヒト哺乳動物の雌性動物に移植する工程
    を含む、標的遺伝子座が改変された非ヒト哺乳動物の作製方法。
  27. 　１）式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式（Ｉ）中、
    　ｎは、２～５の整数を、
    　Ｒは、直鎖状Ｃ１－５アルキル基、直鎖状Ｃ７－１１アルケニル基又は直鎖状Ｃ１１アルカジエニル基を、
    　波線は、それぞれ独立して、シス型またはトランス型の結合を示す。］
    で表される化合物又はその塩、および
    　２）構造脂質
    を含む脂質粒子分散液と、
    　３）ガイドＲＮＡもしくはこれをコードする配列を含むＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼもしくはこれをコードする配列を含む核酸
    を含む水溶液とを混合する工程を含む、
    細胞中の標的遺伝子座における遺伝子改変を誘導するための組成物の製造方法。
  28. 　前記ガイドＲＮＡが２種類以上のガイドＲＮＡである、請求項２７記載の製造方法。
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