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WO2019002625A1 - Procédé de production de progéniteurs érythroïdes - Google Patents

Procédé de production de progéniteurs érythroïdes Download PDF

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Publication number
WO2019002625A1
WO2019002625A1 PCT/EP2018/067833 EP2018067833W WO2019002625A1 WO 2019002625 A1 WO2019002625 A1 WO 2019002625A1 EP 2018067833 W EP2018067833 W EP 2018067833W WO 2019002625 A1 WO2019002625 A1 WO 2019002625A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture medium
stem cells
cells
hematopoietic stem
gene
Prior art date
Application number
PCT/EP2018/067833
Other languages
English (en)
Inventor
Laurence GUYONNEAU-HARMAND
Loïc GARCON
Frédéric AURADE
Nicolas REBERGUE
Frédéric RELAIX
Luc Douay
Original Assignee
Etablissement Francais Du Sang
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale)
Sorbonne Université
Université Paris-Est-Créteil Val De Marne
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Etablissement Francais Du Sang, INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), Sorbonne Université, Université Paris-Est-Créteil Val De Marne filed Critical Etablissement Francais Du Sang
Priority to AU2018293389A priority Critical patent/AU2018293389B2/en
Priority to US16/627,396 priority patent/US20200370015A1/en
Priority to EP18733656.5A priority patent/EP3645707A1/fr
Priority to CN201880044213.0A priority patent/CN111373029B/zh
Priority to JP2019572440A priority patent/JP7162625B2/ja
Priority to KR1020207002966A priority patent/KR102744512B1/ko
Priority to CA3067551A priority patent/CA3067551A1/fr
Publication of WO2019002625A1 publication Critical patent/WO2019002625A1/fr

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0641—Erythrocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
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    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/45—Artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Definitions

  • the present invention is in the field of medicine. It relates more particularly to new processes for the production of erythroid progenitors and red blood cells.
  • red blood cells that carry oxygen inside the body via the bloodstream. This transport is provided by hemoglobin, a specific red blood cell protein that is able to bind oxygen. When the red blood cells reach the tissues, the oxygen diffuses through the walls of the capillaries. The role of red blood cells is essential.
  • hematopoietic marrow In adults, the production of red blood cells or erythropoiesis takes place in the bone marrow called hematopoietic marrow, which is present in the flat bones and at the ends of the long bones.
  • multipotent stem cells called hematopoietic stem cells
  • hematopoietic stem cells successively differentiate into different types of erythroid progenitors (BFU-E, CFU-E, proerythroblasts, basophilic erythroblasts, polychromatophilic erythroblasts).
  • BFU-E erythroid progenitors
  • CFU-E proerythroblasts
  • basophilic erythroblasts basophilic erythroblasts
  • polychromatophilic erythroblasts polychromatophilic erythroblasts
  • Hematopoietic stem cell differentiation media for the in vitro production of red blood cells are known.
  • current methods have unacceptable defects for large-scale production such as a too fast orientation to a maturation in red blood cells, which considerably limits the production yield, or a differentiation in cells unable to perform the steps of Proper enucleation (Akimov S et al., 2005, Stem cells, 23 (9): 1423-1433, Hirose SI et al, 2013, Stem Cell Reports, 1 (6): 499-508, Huang X, 2013, Mol. Ther., 22 (2): 451-463).
  • other methods use co-cultures with feeder cells (Kurita R et al, 2013, PloS One, 8 (3): e59890), which is both complex to implement and expensive.
  • the invention described here aims, among others, to meet these needs.
  • the inventors have demonstrated that the culture of hematopoietic stem cells in a medium comprising dexamethasone, SMER28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28), and optionally DMOG (dimethyloxalylglycine), makes it possible not only to differentiate these stem cells into erythroid progenitors, but also to amplify this population of progenitors considerably while preserving their terminal differentiation capacity in red blood cells.
  • the erythroid progenitors thus obtained can be maintained in culture and amplified for more than 60 days without losing their ability to differentiate into enucleated mature cells, that is to say in red blood cells.
  • the present invention relates to an in vitro method for producing erythroid progenitors comprising contacting hematopoietic stem cells with a cell culture medium, preferably adapted to the requirements Hematopoietic stem cells and in particular adapted to the growth and / or differentiation of cells of the hematopoietic lineage, and comprising a glucocorticoid hormone and an inducer of autophagy.
  • the glucocorticoid hormone is selected from the group consisting of cortisone, hydrocortisone, prednisone, prednisolone, methylprednisolone, triamcinolone, paramethasone, betamethasone, dexamethasone, cortivazol, and derivatives and mixtures of these. More preferably, the glucocorticoid hormone is selected from the group consisting of prednisone, prednisolone and dexamethasone. Most preferably, the glucocorticoid hormone is dexamethasone.
  • the autophagic inducer is selected from the group consisting of SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28), SMER-10 and SMER-18, and a combination thereof. More preferably, the autophagic inducer is SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28).
  • the culture medium further comprises an activator of the HIF (Hypoxya Inducible Factor) pathway, preferably an inhibitor of prolyl hydroxylase, and more preferably DMOG (dimethyloxalylglycine).
  • HIF Hydrophila Inducible Factor
  • DMOG dimethyloxalylglycine
  • the hematopoietic stem cells are preferably obtained by differentiation of pluripotent stem cells, in particular embryonic stem cells (ES) or induced pluripotent stem cells (iPS), or are isolated from a patient's blood sample with or without mobilization, umbilical cord blood or placenta, or from a sample or bone marrow sample.
  • pluripotent stem cells in particular embryonic stem cells (ES) or induced pluripotent stem cells (iPS)
  • ES embryonic stem cells
  • iPS induced pluripotent stem cells
  • the hematopoietic stem cells are human hematopoietic stem cells.
  • the hematopoietic stem cells can be genetically modified, in particular to overexpress one or more genes selected from the group consisting of HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog), c-MYC, 1- MYC and MYB.
  • HTERT Human Telomerase Reverse Transcriptase
  • BMI1 B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog
  • c-MYC 1- MYC and MYB
  • the hematopoietic stem cells can be genetically modified to overexpress the HTERT gene or to overexpress the BMI1 gene. They can also be modified to overexpress the HTERT gene and the BMI1 gene.
  • the gene (s) selected from the group consisting of HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog), c-MYC, 1-MYC and MYB are preferably placed under the control of one or more inducible promoters.
  • hematopoietic stem cells may further be genetically modified to over-express:
  • Erythroid Network preferably LM02 (LIM domain only 2); and or
  • one or more genes of the EPO-R / JAK2 / STAT5 / BCL-XL pathway preferably BCL-XL (B-cell Lymphoma-extra large).
  • the hematopoietic stem cells are genetically modified to overexpress the BCL-XL gene or to overexpress the LM02 gene.
  • the gene (s) selected from the group consisting of the EPO-R / JAK2 / STAT5 / BCL-XL pathway genes are preferably placed under the control of one or more constitutive promoters.
  • the gene (s) selected from the group consisting of CEN (Core Erythroid Network) transcription factor genes are preferably placed under the control of one or more inducible promoters.
  • Hematopoietic stem cells can also be immortalized cells.
  • the cells are cultured in the culture medium of the invention for at least 20 days, more preferably for at least 40 days, most preferably for at least 60 days.
  • the invention further relates, in a second aspect, to the use of the cell culture medium according to the invention for the production and / or amplification of erythroid progenitors.
  • the invention relates to genetically modified hematopoietic stem cells as described above as well as the use of these hematopoietic stem cells for the in vitro production of erythroid progenitors and / or erythrocytes.
  • the invention provides an in vitro method for producing erythrocytes comprising:
  • the maturation of the erythroid progenitors is induced by culturing the erythroid progenitors in an erythrocyte differentiation medium.
  • the invention further relates, in another aspect, to a cell culture medium, preferably adapted to the growth and / or differentiation of cells of the hematopoietic lineage, and comprising a glucocorticoid hormone, preferably dexamethasone, and a autophagy inducer, preferably SMER-28, and optionally an activator of the HIF pathway, preferably DMOG.
  • a cell culture medium preferably adapted to the growth and / or differentiation of cells of the hematopoietic lineage, and comprising a glucocorticoid hormone, preferably dexamethasone, and a autophagy inducer, preferably SMER-28, and optionally an activator of the HIF pathway, preferably DMOG.
  • the medium comprises a glucocorticoid hormone at a concentration of between 0.01 mM and 0.1 mM, and / or an inducer of autophagy at a concentration of between 2 ⁇ and 30 ⁇ , and / or an activator of the HIF channel at a concentration between 75 ⁇ and 350 ⁇ .
  • the autophagic inducer is preferably selected from the group consisting of SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28), SMER-10 and SMER-18, and a combination thereof, and preferably more particularly preferred is SMER-28.
  • the glucocorticoid hormone is preferably selected from the group consisting of cortisone, hydrocortisone, prednisone, prednisolone, methylprednisolone, triamcinolone, paramethasone, betamethasone, dexamethasone, cortivazol, and derivatives and mixtures thereof. These, more preferably, are selected from the group consisting of prednisone, prednisolone and dexamethasone, and most preferably dexamethasone.
  • the HIF (Hypoxya Inducible Factor) activator is preferably an inhibitor of prolyl hydroxylase (PHIS), and even more preferably DMOG (dimethyloxalylglycine).
  • PHIS prolyl hydroxylase
  • DMOG dimethyloxalylglycine
  • the culture medium may further comprise (i) transferrin, (ii) insulin, (iii) heparin, and (iv) serum, plasma, serum pool, or platelet lysate, preferably platelet lysate, and optionally SCF (Stem Cell Factor), EPO and / or IL-3.
  • transferrin ii) insulin, (iii) heparin, and (iv) serum, plasma, serum pool, or platelet lysate, preferably platelet lysate, and optionally SCF (Stem Cell Factor), EPO and / or IL-3.
  • SCF Stem Cell Factor
  • the present invention also relates to the use of the cell culture medium according to the invention for producing and / or amplifying erythroid progenitors.
  • the invention further relates, in a fifth aspect, to a kit (or kit) for the production of erythroid progenitors and / or erythrocytes comprising: a culture medium according to the invention; and or
  • hematopoietic stem cells genetically modified according to the invention
  • a guide containing instructions for the use of such a kit optionally, a guide containing instructions for the use of such a kit.
  • the invention relates, in a sixth aspect, to the use of a kit (or kit) according to the invention for producing erythroid progenitors and / or erythrocytes.
  • Figure 1 Expression profile of surface markers CD117 and CD 235a to J14, according to the different culture protocols.
  • Figure 2 Expression profile of surface markers CD117 and CD 235a to J24 cells genetically modified to overexpress HTERT, BMI1 and LM02, according to the different culture protocols.
  • FIG. 3 Expression profile of surface markers CD117 and CD 235a at D24 of cells genetically modified to overexpress HTERT, BMI1 and BCL-XL, according to the different culture protocols.
  • the inventors have demonstrated that the culture of hematopoietic stem cells in a medium comprising an inducer of autophagy, namely SMER28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28) and a glucocorticoid hormone, namely dexamethasone, makes it possible to considerably increase the production of erythroid progenitors relative to a control culture medium in which only dexamethasone is added.
  • the erythroid progenitors thus obtained can be kept in culture and amplified for more than 60 days.
  • the inventors have also demonstrated that these erythroid progenitors are capable of effectively differentiating into red blood cells.
  • the present application relates to an in vitro method for producing erythroid progenitors comprising contacting hematopoietic stem cells with a culture medium comprising an autophagy inducer and a glucocorticoid hormone.
  • This method is intended to induce the differentiation of hematopoietic stem cells into erythroid progenitors and to allow the amplification, that is to say the multiplication, of this population of progenitors while retaining their capacity to differentiate later into globules. red.
  • the method according to the invention is therefore a process for producing and amplifying erythroid progenitors.
  • erythroid progenitors refers to progenitor cells obtained by hematopoietic stem cell differentiation during erythropoiesis. These progenitor cells are nucleated cells that have the ability to divide and subsequently differentiate into red blood cells by enucleation.
  • the erythroid progenitors are preferably selected from the BFU-E (Burst Forming Unit - E) which are characterized by the expression of markers CD117, CD34, CD41, CD71, and CXCR4, the CFU-E (Colony Forming Unit - E) which are characterized by the expression of markers CD117, CD34, CD36, and CD71, the proerythroblasts which are characterized by the expression of markers CD117, CD71, CD36, and CD235a, basophilic erythroblasts which are characterized by the expression of the markers CD117, CD71, CD36, CD235a and polychromatophilic erythroblasts which are characterized by the expression of markers CD36, CD71, CD 235a, and mixtures thereof.
  • BFU-E Breast Forming Unit - E
  • CFU-E Cold Forming Unit - E
  • hematopoietic stem cell refers to multipotent stem cells capable of differentiating into blood cells and immune cells such as white blood cells, red blood cells and platelets.
  • Hematopoietic stem cells express the CD45, CD133, and / or CD34 antigens.
  • the hematopoietic stem cells express the CD45 and CD34 antigens and, optionally, the CD133 antigen.
  • HSCs are human HSCs.
  • CSH can be obtained from different sources and according to methods well known to those skilled in the art.
  • they can be isolated from bone marrow, cytapheresis, whole blood or umbilical cord blood (or placental blood), for example using an immuno-magnetic system or a sorting system. the presence of specific membrane receptors (for example CD133, CD45 and / or CD34).
  • cytapheresis refers to apheresis sampling of HSCs in the blood.
  • Apheresis is a technique for taking certain blood components by extracorporeal circulation of the blood. The components to be removed are separated by centrifugation and extracted, while the non-collected components are reinjected into the donor or patient (therapeutic apheresis).
  • HSCs can also be obtained by differentiation of pluripotent stem cells, in particular embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells, preferably induced pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells in particular embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells, preferably induced pluripotent stem cells.
  • Techniques for differentiating pluripotent stem cells to CSH are well known to those skilled in the art.
  • Several protocols have been published, including the protocol by Lengerke C et al (2009, Ann NY Acad Sci, 1176: 219-27) consisting of a 17-day differentiation via an intermediate stage of embryoid bodies and through the combination of cytokines: SCF, Flt-3 ligand, IL-3, IL-6, G-CSF and BMP-4.
  • embryonic stem cell refers to cells derived from the internal cell mass of the blastocyst and which have the ability to lead to the formation of all tissues of the body (mesoderm, endoderm, ectoderm), including cells of the germ line. Pluripotency of embryonic stem cells can be assessed by the presence of markers such as OCT4 and NANOG transcription factors and surface markers such as SSEA3 / 4, Tra-1-60 and Tra-1-81. Embryonic stem cells can be obtained without destroying the embryo from which they are derived, for example using the technique described by Chung et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2 (2): 113-117).
  • the embryonic stem cells are non-human embryonic stem cells.
  • the embryonic stem cells used in the invention are human embryonic stem cells, preferably obtained without destruction of the embryo from which they are derived.
  • the embryos used are preferably supernumerary embryos obtained as part of a parental project after obtaining regulatory and ethical authorizations in accordance with the laws in force.
  • iPSC induced pluripotent stem cell
  • pluripotent stem cells obtained by genetic reprogramming of differentiated somatic cells, and having a morphology and potential for self-renewal and pluripotency in part similar to those of embryonic stem cells. These cells are particularly positive for pluripotency markers, in particular alkaline phosphatase staining and the expression of NANOG, SOX2, OCT4 and SSEA3 / 4 proteins.
  • CSH used in the process according to the invention may also be
  • the method according to the invention may comprise the genetic modification of HSCs in order to increase their capacity to engage in erythropoiesis and / or their amplification capacity.
  • Methods for genetically modifying these cells are well known to those skilled in the art and involve, for example, the introduction of transgenes into the genome of cells via retroviruses or lentiviruses or any other form of gene or protein transfer.
  • the amplification capacity of these CSH is improved by overexpressing one or more genes selected from the group consisting of HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog), c -MYC, 1-MYC and MYB.
  • HTERT Human Telomerase Reverse Transcriptase
  • BMI1 B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog
  • c -MYC, 1-MYC and MYB genes selected from the group consisting of HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog), c -MYC, 1-MYC and MYB.
  • HSCs are genetically modified to overexpress HTERT.
  • HSCs are genetically engineered to overexpress HTERT and one or more genes selected from the group consisting of BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog), c-MYC, 1-MYC and MYB.
  • HSCs are genetically modified to overexpress HTERT and / or BMI1, preferably HTERT and BMI1.
  • HSCs ability to engage in the erythropoiesis pathway can be enhanced by overexpressing one or more genes involved in the EPO-R / JAK2 / STAT5 / B CL-XL pathway and / or in the CEN pathway (Core Erythroid Network).
  • EPO-R / JAK2 / STAT5 / BLC-XL pathway refers to a cellular signaling pathway whose key proteins are the ⁇ (erythropoietin), JAK2 (Janus Kinase 2) receptor. , STAT5 (Signal transducer and activator of transcription 5) and BCL-XL (B-cell Lymphoma-extra large). EPO is essential for erythropoiesis, it promotes erythoid involvement and cell survival. The binding of ⁇ to its membrane receptor causes the dimerization of ⁇ -R which, thus activated, in turn induces JAK2 kinases.
  • JAK2 kinases then phosphorylate the tyrosine residues of the cytoplasmic tail of the EPO-R receptor. These phosphotyrosines allow interaction with SH2 domain-containing proteins (Src Homology 2), which results in the activation of different signaling pathways, the main one being the STAT5 transcription factor pathway. STAT5 is first dimerized then phosphorylated, which leads to its translocation into the nucleus where it activates the transcription of different genes including genes involved in cell proliferation and erythroid differentiation.
  • the HSCs are genetically modified to overexpress one or more genes of the EPO-R / JAK2 / STAT5P / BCL-XL pathway, preferably one or more genes selected from the group consisting of the EPO-R coding genes, JAK2, STAT5P, BCL-XL and BCL-2, and a combination thereof.
  • HSCs are genetically modified to overexpress a gene coding for BCL-XL.
  • CEN pathway refers to a group of transcription factors essential to establishing or maintaining erythrocyte identity.
  • the HSCs are genetically modified to overexpress one or more genes of the CEN pathway, preferably one or more genes selected from the group consisting of genes encoding GATAI (transcription factor belonging to the family of finger proteins zinc binding to the DNA sequence "GATA"), TAL1 (TAL BHLH Transcription Factor 1), KLF1 (Krueppel-like factor 1), LDB1 (LIM Domain Binding 1), LM02 (LIM domain only 2) and SCL (Stem Cell Leukemia), and a combination of these.
  • GATAI transcription factor belonging to the family of finger proteins zinc binding to the DNA sequence "GATA”
  • TAL1 TAL BHLH Transcription Factor 1
  • KLF1 Kereppel-like factor 1
  • LDB1 LIM Domain Binding 1
  • LM02 LIM domain only 2
  • SCL Ste Cell Leukemia
  • HSCs are genetically modified to overexpress a gene encoding LM02.
  • the HSCs used in the process according to the invention are genetically modified to overexpress:
  • one or more genes of the EPO-R / JAK2 / STAT5 / BCL-XL pathway preferably selected from the group consisting of EPO-R, JAK2, STAT5, BCL-XL and BCL-2 encoding genes, and combination thereof, and more preferably BCL-XL; and or
  • one or more genes of the ENC pathway preferably selected from the group consisting of the genes encoding GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LM02 and SCL, and a combination thereof, and more preferably LM02 .
  • the CSH used in the process according to the invention are genetically modified to overexpress:
  • one or more genes of the EPO-R / JAK2 / STAT5 / BCL-XL pathway preferably selected from the group consisting of EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL-XL and BCL-2 encoding genes, and combination thereof, and more preferably BCL-XL;
  • one or more genes of the ENC pathway preferably selected from the group consisting of the genes encoding GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LM02 and SCL, and a combination thereof, and more preferably LM02 .
  • HSCs are genetically modified to overexpress (i) the gene encoding HTERT, and optionally the gene encoding BMI1, and
  • HSCs can be genetically modified to overexpress the gene encoding HTERT and the gene encoding BCL-XL, and optionally the gene encoding BMI1.
  • HSCs are genetically modified to overexpress
  • HSCs can be genetically modified to overexpress
  • overexpression refers to the level of expression of a gene in a genetically modified cell that is greater than the level of expression of that same gene in the cell. not genetically modified. When the cell does not express the gene in question before the genetic modification but expresses it after modification, this term can be replaced by "expression”, “express” or “expressing”.
  • the overexpression of a gene in a CSH may be obtained by any technique known to those skilled in the art, in particular by introduction into the CSH of a nucleic acid comprising the gene or genes to be overexpressed, or of several nucleic acids each comprising a genes to overexpress.
  • the nucleic acid (s) can thus be arranged on the same construction or in separate constructions. They can be introduced into CSH by any method known to those skilled in the art, in particular by viral transduction, microinjection, transfection, electroporation and biolistics.
  • an expression cassette refers to an expression cassette or an expression vector.
  • the gene or genes to be overexpressed are operably linked to the sequences necessary for their expression. In particular, they may be under the control of a promoter allowing their expression in a CSH.
  • an expression cassette comprises, or consists of, a promoter for initiating transcription, one or more genes, and a transcription terminator.
  • operably linked indicates that the elements are combined so that the expression of the coding sequence is under the control of a transcriptional promoter.
  • the promoter sequence is placed upstream (5 ') of the gene or genes of interest. Spacer sequences may be present between the regulatory elements and the gene, provided that they do not prevent translation expression of the encoded protein.
  • the expression cassette may also comprise at least one enhancer activator sequence operably linked to the promoter.
  • An expression vector comprises one or more nucleic acids or expression cassettes as described. This expression vector can be used to transform a host cell and allow expression of nucleic acid of interest in said cell.
  • the vectors can be constructed by conventional molecular biology techniques well known to those skilled in the art.
  • the expression vector comprises regulatory elements allowing the expression of the nucleic acid of interest.
  • These elements may comprise, for example, transcription promoters, transcription activators, terminator sequences, initiation and termination codons. The methods for selecting these elements are well known to those skilled in the art.
  • the vector may be circular or linear, single- or double-stranded. It is advantageously chosen from plasmids, phages, phagemids, viruses, cosmids and artificial chromosomes.
  • the vector is a viral vector.
  • the gene (s) to be overexpressed may be placed under the control of constitutive or inducible promoters, identical or different, whether or not they are present on the same nucleic acid.
  • CSH can be transformed / transiently or stably transfected and the nucleic acid (s), cassette (s) or vector (s) can be contained in the cell as an episome or integrated into the CSH genome. They can be inserted into the genome of the eukaryotic cell into identical or distinct regions.
  • the genes of interest can be integrated into the genome of a cell by means of a knock-in technique using a targeted expression system, in particular the CRISPR-Cas9 system (see, for example, Platt et al., Cell.
  • This technique which makes it possible to insert a single copy of one or more genes of interest into the genome of the cell in a predetermined locus, is based on the transfection of one or more vectors allowing the coordinated expression of a a gene encoding the Cas9 nuclease and a gRNA ("guide" RNA) specific for the locus where the gene (s) are to be inserted.
  • Said gene or genes of interest or a cassette comprising said gene or genes of interest are inserted by means of the repair of the break generated by Cas9.
  • guide RNA or "gRNA” refers to an RNA molecule capable of interacting with Cas9 to guide it to a target chromosomal region.
  • Each gRNA can comprise two regions:
  • SDS region a first region at the 5 'end of the gRNA, which is complementary to the target chromosomal region and mimics the endogenous CRISPR system CRRR, and
  • a second region (commonly referred to as a "handle” region) at the 3 'end of the gRNA, which mimics the base-pairing interactions between the trans-activating crRNA and CRISPR endogenous and has a double-stranded rod and loop structure 3 'terminating in a substantially single-stranded sequence.
  • This second region is essential for gRNA binding to Cas9.
  • the gene of interest or the cassette comprising the gene (s) of interest is flanked by sequences homologous to the gRNA-targeted site of rupture, which allows the insertion of the gene or cassette in favor of the repair of the gene. breakage by homologous recombination.
  • promoters allowing constitutive expression include, but are not limited to, long alpha pEF1, pCMV and pCAG.
  • An inducible expression system that can be used in the present invention is the Tet-On system, based on the use of the tetracycline transactivator protein (tTA), which is created by fusing the TetR protein (repressor of the tetracycline) present in the bacterium Escherichia coli with the activating domain of the VP16 protein present in the herpes virus.
  • the rtTA protein is capable of binding to the DNA on a specific TetO operator sequence only if it is linked to a tetracycline.
  • Several repetitions of the TetO sequences are placed under the control of a promoter such as the long alpha EF1 promoter.
  • the TetO sequences coupled to the promoter are termed tetracycline response element (TRE) and respond to the binding of the tetracycline transactivator protein (tTA) by causing an increase in gene expression under the control of the promoter.
  • TRE tetracycline response element
  • genes When multiple genes are overexpressed, they may be under the control of a single promoter or promoters.
  • HSCs are genetically modified to overexpress one or more genes selected from the group consisting of genes encoding HTERT, BMI1, c-MYC, 1-MYC and MYB, and a combination thereof, preferably HTERT and / or BMI1, and more preferably HTERT and BMI1, and this or these genes are placed under the control of one or more inducible promoters.
  • the HSCs are genetically modified to overexpress one or more genes of the CEN pathway, preferably selected from the group consisting of genes encoding GATAI, TAL1, KLF1, LDB1, LM02 and SCL, and a combination of these, and more particularly preferably LM02, and this or these genes are placed under the control of one or more inducible promoters.
  • the HSCs are genetically modified to overexpress one or more genes of the EPO-R / JAK2 / STAT5 / BCL-XL pathway, preferably selected from the group consisting of the genes encoding EPO-R, JAK2, STAT5P , BCL-XL and BCL-2, and a combination thereof, and more preferably BCL-XL, and this or these genes are placed under the control of one or more constitutive promoters.
  • HSCs are genetically engineered to overexpress the gene encoding HTERT under the control of an inducible promoter and the gene encoding BCL-XL under the control of a constitutive promoter.
  • HSCs are genetically modified to overexpress the genes encoding HTERT, BMI1 and LM02 under the control of one or more inducible promoters.
  • the HSCs are genetically modified to overexpress the genes encoding HTERT and BMI1 under the control of one or more inducible promoters and the gene coding for BCL-XL under the control of a constitutive promoter.
  • HSCs as used in the method according to the invention may also be genetically modified to contain a suicide gene, for example the HSV-TK gene or the gene.
  • Casp9 under the control of an inducible promoter.
  • suicide gene refers to any gene whose expression results in the death of the dividing cell expressing it, in the presence or absence of an additional molecule (drug or otherwise). ), depending on the suicide gene considered.
  • the cell death of a cell expressing the HSV-TK gene or the Casp9 gene is obtained, respectively, by adding gancyclovir or AP1003.
  • the HSCs as used in the process according to the invention are immortalized HSCs. These immortalized cells may further be genetically modified as described above.
  • Immortalized HSCs can be obtained from an immortalized cell line established from malignant cells.
  • the immortalized HSCs are obtained from an immortalized cell line made from non-malignant cells, for example from iPS (Kurita et al., PLoS ONE, 2013, 8, e59890), from blood cells cord (Kurita et al., Huang, X. et al., Mol Ther 2014, 22, 451-463) of embryonic stem cells (Hirose, S. et al., Stem Cell Rep. 2013, 1, 499- 508), or CSH isolated from bone marrow, cytapheresis or total peripheral blood (Trakamsanga et al., 2017, Nature Communications, Vol.8, 14750).
  • iPS Kerta et al., PLoS ONE, 2013, 8, e59890
  • blood cells cord Kerta et al., Huang, X. et al., Mol Ther 2014, 22, 451-463
  • embryonic stem cells Hirose, S. et al., Stem Cell Rep. 2013, 1, 499-
  • CSH can be immortalized by any technique known to those skilled in the art, in particular by transduction with a lentiviral vector carrying the oncogene E6 and E7 of human papillomavirus type 16 (HPV16 E6 / E7) (Akimov et al., Stem Cells, 2005). Oct; 23 (9): 1423-1433; Trakamsanga et al. Supra).
  • the HSCs can be further transduced with a lentiviral vector carrying the gene encoding HTERT (Akimov et al., Supra).
  • the immortalized HSCs used in the process according to the invention contain a suicide gene allowing their elimination after induction of the maturation of erythroid progenitors into enucleated mature erythrocytes.
  • the method according to the invention comprises contacting the HSCs as described above with a glucocorticoid hormone and an inducer of autophagy, and more particularly with a culture medium adapted to the growth and / or differentiation of the cells of the hematopoietic lineage and comprising a glucocorticoid hormone and an inducer of autophagy.
  • Autophagy refers to the degradation of part of the cytoplasm of the cell by its own lysosomes.
  • Autophagy is a physiological process that helps to eliminate certain proteins (viral, malformed %) and damaged organelles. This process can also be involved in the elimination of intracellular pathogens. Several signaling pathways detect different types of cellular stress, ranging from nutrient deprivation to microbial invasion, and converge to regulate autophagy.
  • autophagy inducer refers to a molecule capable of inducing autophagy in a cell.
  • Autophagy inducers may be especially inhibitors of the mTOR pathway such as metformin, rapamycin, perifosine, éverolimus, resveratrol or tamoxifen, activators of the formation of autophagosomes such as the compound MG-132 (a 26S proteasome inhibitor), the SAHA compound (a Pan-Histone acetylase inhibitor), trichostatin A or valproic acid, or small molecules acting independently of the mTOR pathway such as SMER-28, SMER- 10 or S SE 18.
  • inhibitors of the mTOR pathway such as metformin, rapamycin, perifosine, éverolimus, resveratrol or tamoxifen
  • activators of the formation of autophagosomes such as the compound MG-132 (a 26S proteasome inhibitor), the SAHA compound (a Pan-Histone acetylase inhibitor), trichostatin A or valproic acid, or small molecules acting independently of the mTOR
  • the autophagy inducer is an inducer acting independently of the mTOR pathway, preferably selected from the group consisting of SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28), S-MER 10 and SMER 18, and a combination thereof.
  • the autophagic inducer is SMER-28.
  • the terms "glucocorticoid hormone”, “glucocorticoid”, “corticosteroid”, or “corticosteroid” are equivalent and may be used interchangeably. These terms refer to natural or synthetic steroid hormones having a pregnane nucleus and having an action on protein and carbohydrate metabolism.
  • the glucocorticoid hormone is selected from the group consisting of cortisone, hydrocortisone, prednisone, prednisolone, methylprednisolone, triamcinolone, paramethasone, betamethasone, dexamethasone, cortivazol, and the like. derivatives and mixtures thereof.
  • the glucocorticoid hormone is a synthetic hormone, preferably selected from the group consisting of prednisone, prednisolone, methylprednisolone, triamcinolone, paramethasone, betamethasone, dexamethasone, cortivazol, and derivatives and mixtures thereof.
  • the glucocorticoid hormone is selected from the group consisting of prednisolone, methylprednisolone, dexamethasone, and derivatives and mixtures thereof, preferably in the group consisting of prednisolone, methylprednisolone and dexamethasone.
  • the glucocorticoid hormone is dexamethasone.
  • the autophagy inducer is selected from the group consisting of SMER-28, SMER 10 and SMER 18, preferably SMER-28, and the glucocorticoid hormone is selected from the group consisting of prednisolone, methylprednisolone and dexamethasone, preferably is dexamethasone.
  • the autophagic inducer is SMER-28 and the glucocorticoid hormone is dexamethasone.
  • HSCs can also be brought into contact with an activator of the HIF pathway.
  • HIF pathway refers to the signaling pathway initiated by HIF (Hypoxia induced factor) which stimulates the secretion of ⁇ and thereby activates the EPO-R / JAK2 / STAT5 / B CL-XL pathway.
  • the activator of the HIF pathway according to the invention is an inhibitor of prolyl hydroxylase (PHIS).
  • prolyl hydroxylase PHIS
  • procollagen-proline dioxygenase procollagen-proline dioxygenase
  • Prolyl hydroxylase is an enzyme of hydroxylation of HIF on its prolyl residues. When hydroxylated, HIF is inhibited.
  • Specific inhibitors of prolyl hydroxylase are therefore molecules capable of inhibiting prolyl hydroxylase and thus activate the HIF pathway which will in turn activate the EPO-R / JAK2 / STAT5 / BCL-XL pathway.
  • the prolyl hydroxylase inhibitor is selected from the group consisting of DMOG (dimethyloxalylglycine), NOG (N-oxalylglycine), DFO (desferrioxamine), FG-4383, F-0041, FG-2216, FG-4592, S956711, EDHB (3,4-ethyl dihydroxybenzoate), TM6089, TM655, TM6008, 8-hydroxyquinoline, and derivatives thereof.
  • DMOG dimethyloxalylglycine
  • NOG N-oxalylglycine
  • DFO deferrioxamine
  • FG-4383 F-0041, FG-2216, FG-4592, S956711
  • EDHB 3,4-ethyl dihydroxybenzoate
  • TM6089 TM655, TM6008, 8-hydroxyquinoline, and derivatives thereof.
  • the activator of the HIF pathway is DMOG.
  • the CSH are cultured in a culture medium adapted to the growth and / or differentiation of cells of the hematopoietic line.
  • a culture medium adapted to the growth and / or differentiation of cells of the hematopoietic line.
  • Many culture media adapted to the nutritional requirements of CSH are known to those skilled in the art and commercially available, such as Stemspan's SFEM medium (Stemcell technologies) preferably supplemented with SCF (Stem Cell Factor), of ⁇ (erythropoietin), and lipids or the medium "StemMACS HSC Expansion Media XF, human” (Invitrogen).
  • the CSH are cultured at a concentration of between 200 and 10,000 cells / ml, preferably between 500 and 2000 cells / ml, and more preferably at about 1000 cells / ml.
  • the culture medium is preferably changed every 3 days so that the cells do not exceed a concentration of about 40,000 cells / ml.
  • CSH can be brought into contact with the glucocorticoid hormone and the autophagy inducer from the first day of culture or after several days of culture, for example after 10 to 15 days.
  • the HSCs are contacted simultaneously with the glucocorticoid hormone and the autophagy inducer.
  • HSCs can be first contacted with the glucocorticoid hormone and then with the autophagy inducer, or vice versa.
  • the addition of the second compound can take place, for example, a few hours after contacting the first compound
  • the HSCs are contacted simultaneously with the glucocorticoid hormone and the autophagy inducer. More preferably, the HSCs are contacted simultaneously with the glucocorticoid hormone and the autophagy inducer on the first day of culture.
  • the bringing into contact can be done by adding the glucocorticoid hormone and / or the autophagy inducer in the CSH culture medium or by placing the CSH in a culture medium comprising the glucocorticoid hormone and / or the autophagy inducer.
  • concentrations of the glucocorticoid hormone and the inducer of autophagy can be constant or vary throughout the culture or contacting.
  • the culture medium comprises the glucocorticoid hormone
  • it is present at a concentration of between 0.001 mM and 10 mM, preferably between 0.01 mM and 1 mM, more preferably between 0.01 mM. and 0.5 mM, and most preferably between 0.02 mM and 0.1 mM.
  • the culture medium when the culture medium comprises the glucocorticoid hormone, it is present at a concentration of approximately 0.1 mM.
  • the culture medium when the culture medium comprises the autophagy inducer, it is present in the culture medium at a concentration of between 0.1 ⁇ and 100 ⁇ , preferably between 0.5 ⁇ and 50 ⁇ , more preferably between 1 ⁇ and 30 ⁇ , and very particularly preferably between 2 ⁇ and 30 ⁇ .
  • the culture medium comprises the autophagy inducer
  • it when the culture medium comprises the autophagy inducer, it may be present in the culture medium at a concentration of between 10 ⁇ and 30 ⁇ .
  • the culture medium when the culture medium comprises the inducer of autophagy, it is present in the culture medium at a concentration of about 2 ⁇ .
  • the term "about” refers to a range of values of ⁇ 5% of the specified value, preferably ⁇ 2% of the specified value.
  • “about 20” includes the ⁇ 5% of 20, or 19 to 21.
  • the concentration of activator may be constant or vary throughout the culture or contacting.
  • the culture medium comprises an activator of the HIF pathway, preferably DMOG
  • it is present in the culture medium at a concentration of between 1 ⁇ and 1000 ⁇ , preferably between 10 ⁇ and 500 ⁇ . , more preferably between 50 ⁇ and 400 ⁇ , and very particularly preferably between 75 ⁇ and 350 ⁇ .
  • the HSCs are placed in the presence of a glucocorticoid hormone, preferably dexamethasone, and an autophagy inducer, preferably SMER28, after 10 to 15 days of culture.
  • a glucocorticoid hormone preferably dexamethasone
  • an autophagy inducer preferably SMER28
  • the concentration of the glucocorticoid hormone is between 0.01 mM and 0.5 mM, and more preferably between 0.02 mM and 0.1 mM and the concentration of the autophagy inducer is between 10 ⁇ and 30 ⁇ .
  • the HSCs are placed in the presence of a glucocorticoid hormone, preferably dexamethasone, and an autophagy inducer, preferably SMER28, from the first day of culture or before 10 days of treatment. culture.
  • a glucocorticoid hormone preferably dexamethasone
  • an autophagy inducer preferably SMER28
  • the concentration of the glucocorticoid hormone is between 0.01 mM and 0.5 mM, preferably about 0.1 mM
  • the concentration of the autophagy inducer is between 2 ⁇ and 30 ⁇ , preferably about 2 ⁇ .
  • HSCs are preferably maintained in a culture medium comprising a glucocorticoid hormone and an autophagy inducer, and optionally an activator of the HIF pathway, for at least 10 days. More particularly preferably, the CSH are maintained in a culture medium comprising a glucocorticoid hormone and an inducer of autophagy for at least 20, 30, 40, 50 or 60 days.
  • the cell culture comprises not only CSH but also erythroid progenitors.
  • the inventors have demonstrated that the use of a culture medium comprising a glucocorticoid hormone and an inducer of autophagy makes it possible to considerably increase the production of erythroid progenitors, which do not engage in the erythroid terminal differentiation pathway.
  • the CSH can be cultured in the culture medium comprising a glucocorticoid hormone and an inducer of autophagy for at least 60, 70, 80, 90 or 100 days.
  • the HSCs are cultured in the culture medium comprising a glucocorticoid hormone and an inducer of autophagy for a maximum of 70, 80, 90 or 100 days.
  • the culture time of HSCs and the time of contact with a glucocorticoid hormone and an inducer of autophagy, and optionally an activator of the HIF pathway can be easily defined by those skilled in the art by evaluating the proportion of erythroid progenitors. present in the cell population.
  • the HSCs are brought into contact with a glucocorticoid hormone and an autophagy inducer until a population comprising at least 90% of erythroid progenitors, preferably at least 95% of erythroid progenitors, more preferably at least 99% of erythroid progenitors.
  • the culture can be maintained until maturation markers appear in mature erythrocytes.
  • the culture is stopped when the cells are no longer amplified and / or less than 10% of them, preferably less than 5% of them express the CD117 membrane receptor.
  • the culture can be stopped when at least 90%, preferably at least 95% of the cells in culture have reached the stage of polychromatophilic erythroblast or are at a more advanced stage of differentiation.
  • the method may comprise alternating culture phases during which the culture medium comprises a glucocorticoid hormone and an inducer of autophagy, and optionally an activator of the pathway. HIF, and culture phases during which the culture medium does not include glucocorticoid hormone, inducer of autophagy, and / or activator of the HIF pathway.
  • the glucocorticoid hormone, the autophagy inducer and the HIF activator can be added or removed from the culture medium simultaneously or sequentially.
  • the method according to the invention may further comprise a step of recovering erythroid progenitors obtained. This step can be done by any technique known to those skilled in the art, in particular by centrifugation and removal of the culture medium.
  • the method of the invention may also comprise a cell sorting step, in particular a cell selection step based on the expression of the CD1 marker 17.
  • the CD1 17+ cells may be selected to prolong the amplification of the erythroid progenitors .
  • CD1 17 cells can be selected to produce red blood cells.
  • the method according to the invention may also comprise a washing step of the erythroid progenitors obtained / recovered.
  • This step can be done by any technique known to those skilled in the art, in particular by a succession of centrifugation and resuspension steps.
  • the invention also relates to a population of erythroid progenitors obtained by the method of the invention.
  • the invention also relates to the use of erythroid progenitors obtained by the process according to the invention for the production of erythrocytes.
  • red blood cell As used herein the terms “red blood cell”, “mature red blood cell”, “red blood cell”, “red blood cell” and “mature erythrocyte” are equivalent and may be used interchangeably.
  • erythrocyte refers to an enucleated cell presenting characteristic markers of erythrocyte maturation. In particular, they express glycophorin A (CD235a) but do not express the CD36 marker.
  • the present invention thus relates to an in vitro method for producing erythrocytes comprising:
  • the maturation of erythroid progenitors can be reflected in particular by the expression of erythrocyte maturation markers such as CD235a and by enucleation.
  • the method of the invention may also comprise a cell sorting step, in particular a step of selecting CD117- cells.
  • the maturation of the progenitors can be induced by any method known to those skilled in the art.
  • the maturation can in particular be induced by culturing the erythroid progenitors in an erythrocyte differentiation medium, for example a medium supplemented with erythropoietin and optionally with SMER28.
  • the maturation is induced by culturing the erythroid progenitors in a medium that does not include SCF (Stem Cell Factor) or dexamethasone, and supplemented with erythropoietin (about 2.5 IU / mL) and optionally with SMER28 ( about 2.5 ⁇ ).
  • the maturation is induced by placing the cells in a culture medium without serum.
  • the progenitor maturation is induced at high cell concentration, for example greater than 5,000,000 cells / ml of culture.
  • the method for producing erythrocytes according to the invention further comprises a step of eliminating the nucleated cells. This step makes it possible to obtain a homogeneous population comprising only mature erythrocytes.
  • this step of eliminating the nucleated cells can be carried out by induction of the expression of this suicide gene.
  • the process for producing erythrocytes may further comprise a step of recovering the erythrocytes obtained. This step can be done by any technique known to those skilled in the art, in particular by filtration, centrifugation and removal of the culture medium.
  • the method according to the invention may also comprise a washing step of the erythrocytes obtained / recovered.
  • This step can be done by any technique known to those skilled in the art, in particular by a succession of filtration steps, centrifugation and resuspension.
  • the present invention also relates to a population of erythrocytes obtained by the process of the invention.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising erythroid progenitors obtained according to the method of the invention and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the invention also relates to erythroid progenitors according to the invention, or a pharmaceutical composition comprising erythroid progenitors according to the invention, for use as a hematopoietic graft.
  • hematopoietic graft refers to a set of cells intended to be administered to the bone marrow of a subject and capable of producing erythrocytes.
  • the invention also relates to erythroid progenitors according to the invention, or a pharmaceutical composition comprising erythroid progenitors according to the invention, for use in the treatment of anemia.
  • anemia refers to an abnormality of the blood count characterized by an abnormally low level of healthy red blood cells and a decrease in circulating hemoglobin levels below normal values for the subject's age. .
  • anemia is generally characterized by a hemoglobin level of less than 13 g / dL for a man, less than 12 g / dL for a woman, less than 11 g / dL for a child and less than 14 g / dL for a newborn.
  • Anemias can have a variety of causes. Examples of anemias include, but are not limited to, anemia related to hemorrhage (e.g. bleeding caused by trauma or surgery), anemia induced by drug therapy (eg chemotherapy) or exposure to toxicants (eg lipolytic agents, oxidizing agents, lead, venoms or poisons), hemolytic anemia caused by an inherited abnormality of the erythrocyte membrane (eg hereditary spherocytosis, hereditary elliptocytosis or hereditary pyropoikilocytosis), haemolytic anemia caused by an acquired abnormality of the erythrocyte membrane (eg nocturnal paroxysmal haemoglobinuria or acanthocytosis, autoimmune haemolytic anemia (eg a transfusion ), anemia caused by an infectious agent (eg malaria, Babesia or Bartonella infection, trypanosomiasis, visceral leishmaniasis,
  • the invention further relates to a method of treating a patient suffering from anemia comprising administering to said patient a therapeutically effective amount of erythroid progenitors obtained by the method of the invention, or a pharmaceutical composition comprising erythroid progenitors obtained according to the invention.
  • the invention also relates to the use of erythroid progenitors obtained according to the invention, or a pharmaceutical composition comprising said progenitors for the preparation of a medicament, in particular a biological medicament, for the treatment of anemia.
  • biological drug refers to a drug whose active substance is produced from or is extracted from a biological source.
  • the erythroid progenitors are obtained from non-genetically modified CSH.
  • the terms “subject” and “patient” are equivalent and may be used interchangeably. These terms preferably make reference to an animal, in particular a mammal, most preferably a human, in particular, a fetus, a newborn, a child, a teenager, an adult or an elderly person.
  • fetus refers to a stage of intrauterine development of more than 8 weeks of pregnancy
  • newborn refers to a human being less than 12 months of age
  • the term “child” refers to a human being aged 1 to 12
  • the term “adult” refers to a human being aged 12 to 60
  • the term “elderly person” refers to a human being 60 years or older.
  • the patient is preferably a patient in transfusion failure, polytransfused, or having a rare blood group. According to one preferred mode, this patient suffers from anemia, in particular anemia related to sickle cell disease or thalassemic syndrome.
  • transfusion failure refers to an inefficient transfusion and / or inducing pathological complications in the patient.
  • Erythrocyte transfusion may be considered ineffective when, 24 hours after transfusion of red blood cell concentrates (RBCs), transfusion yield is less than 80%.
  • RBCs red blood cell concentrates
  • the erythrocyte transfusional yield (RTE) is calculated by the formula:
  • the amount of HB transfused minimum is 40g, the average found is 50g.
  • VST refers to the total blood volume.
  • transfusion alloimmunization The pathological complications associated with a transfusion failure may be the consequence of an immunizing transfusion (transfusion alloimmunization) which may be years later and compromise the future transfusion of the patient. Indeed, during a new transfusion, the previous immunization can either cause a direct hemolytic danger (if the antibodies are present in a sufficient capacity), or, most often, cause delayed hemolysis (if the antibodies are present at a weak title or even not detectable serologically during the new transfusion).
  • polytransfused refers to a patient who has undergone several blood transfusions and / or to a patient who has already had a blood transfusion and is to receive another.
  • rare blood group refers to a blood group whose frequency in the French and / or European and / or world population is less than 1/250 and / or a blood group whose patient can not be transfused with 0- blood. Rare bloods have supply difficulties.
  • the subject of the invention may be a non-human animal, preferably a pet or breeding animal, for example selected from the group consisting of dogs, cats, cattle, sheep, rabbits, pigs, goats, equines, rodents, non-human primates and poultry.
  • treatment refers to any action aimed at improving or eliminating symptoms, slowing the progression of the disease, stopping the progression of the disease or the disappearance of the disease.
  • This term refers more particularly to an increase in the level of healthy red blood cells and circulating hemoglobin, preferably to normal values for the age of the subject.
  • This term includes both preventive and curative treatment.
  • therapeutically effective amount refers to an amount sufficient to have an effect on at least one symptom of the pathology, and more particularly to increase the level of healthy red blood cells and circulating hemoglobin levels. in the treated subject.
  • compositions comprising erythrocytes or erythrocyte progenitors are equivalent and refer to any substance other than an active ingredient present in a pharmaceutical composition. Its addition is intended in particular to facilitate the conservation and administration of the cells, without modifying its properties.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle used for the formulation of compositions comprising erythrocytes or erythrocyte progenitors according to the invention may be, for example, selected from the group consisting of physiological saline, PBS solution supplemented with human serum albumin, and mixtures of these, or any other saline solution having an osmolarity adapted to the conservation of erythrocytes and / or progenitors and, preferably, that can be directly administered to the subject.
  • a SAGM Sesadenine Glucose Mannitol
  • a pharmaceutically acceptable carrier alone or in combination with the other pharmaceutically acceptable carriers listed above.
  • the administration of the progenitors, or grafting is carried out in the bone marrow of the patient or by intravenous injection.
  • the hematopoietic stem cells used to produce the erythroid progenitors are derived from a sample taken from a donor or derived from cells obtained from a donor and the erythroid progenitors are intended to be transplanted into a recipient patient.
  • the donor and the recipient may be the same individual (autologous transplant) or different individuals (allogeneic transplant).
  • the donor and the recipient are the same individual.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition or a medicament, in particular a biological medicament, comprising erythrocytes obtained according to the process of the invention and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the invention also relates to erythrocytes obtained by the method of the invention or a pharmaceutical composition comprising erythrocytes obtained according to the invention, for the transfusion of patients suffering from anemia, that is to say requiring an intake of erythrocytes .
  • the invention further relates to a method of treating a patient suffering from anemia, i.e. requiring erythrocyte intake, comprising administering a therapeutically effective amount of erythrocytes obtained by the method of the invention.
  • invention or a pharmaceutical composition comprising erythrocytes according to the invention.
  • the invention also relates to erythrocytes obtained by the process of the invention or a pharmaceutical composition comprising erythrocytes obtained according to the invention, for use in the treatment of anemia.
  • anemia is anemia related to sickle cell disease or thalassemic syndrome.
  • the patients are in transfusion failure, are polytransfused or have rare blood.
  • the erythrocytes to be administered or administered to the patient are obtained according to an in vitro process for the production of red blood cells comprising:
  • HSCs can be obtained from a sample of blood or bone marrow from the patient.
  • HSCs can be obtained from iPSCs obtained by genetic reprogramming of differentiated somatic cells obtained from the patient.
  • HSCs may optionally be genetically modified as previously described.
  • the present invention also relates to CSH genetically modified so as to overexpress:
  • one or more genes of the ENC pathway preferably selected from the group consisting of genes encoding GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LM02 and SCL, and a combination thereof, and more preferably LM02.
  • Embodiments relating to HSCs used in the process for producing erythroid progenitors are also contemplated in this aspect.
  • HSCs are genetically engineered to overexpress the gene encoding HTERT under the control of an inducible promoter and the gene encoding BCL-XL under the control of a constitutive promoter.
  • HSCs are genetically modified to overexpress the genes encoding HTERT, BMI1 and LM02 under the control of one or more inducible promoters.
  • the HSCs are genetically modified to overexpress the genes encoding HTERT and BMI1 under the control of one or more inducible promoters and the gene encoding BCL-XL under the control of a constitutive promoter.
  • Genetically modified HSCs may also contain a suicide gene as described above or be immortalized.
  • the present invention also relates to the use of genetically modified CSH according to the invention for the production, preferably in vitro, of erythroid progenitors and / or erythrocytes, in particular according to the methods of the invention described above.
  • the present invention relates to a cell culture medium adapted to the nutritional requirements of CSH, and in particular adapted to the growth and / or differentiation of the cells of the hematopoietic line, and comprising a glucocorticoid hormone and an inducer autophagy, and optionally an activator of the HIF pathway.
  • Embodiments relating to the medium comprising a glucocorticoid hormone and an autophagy inducer, and optionally an HIF activator, used in the process for producing erythroid progenitors are also contemplated in this aspect.
  • the glucocorticoid hormone and the autophagy inducer are as defined above with respect to the process according to the invention.
  • the glucocorticoid hormone is dexamethasone and / or the autophagy inducer is SMER28 and / or the HIF pathway enhancer is DMOG.
  • the base of the cell culture medium adapted to the growth and / or differentiation of the cells of the hematopoietic line may be any base known to those skilled in the art to meet the needs of HSCs and / or erythroid progenitors.
  • growth refers to the multiplication of cells.
  • the term "differentiation” refers to the acquisition by cultured cells of characteristics that were not present in the cells initially used to seed the medium. In this case, this term refers to the acquisition of characteristics of erythroid progenitors.
  • a medium adapted to the growth and / or differentiation of the cells of the hematopoietic line is thus a medium that allows the differentiation of CSH into erythroid progenitors as well as the multiplication of CSH and erythroid progenitors. This term should not be confused with "maturation” which defines here the process by which erythroid progenitors will become red blood cells and which involves the enucleation of cells.
  • the medium adapted to the growth and / or differentiation of the cells of the hematopoietic line therefore preferably does not contain any compound inducing this maturation.
  • the base of the cell culture medium may be an Iscove-modified Dulbecco's medium (IMDM medium) or an equivalent medium adapted to the nutritional requirements of CSH (eg Stemspan's SFEM medium (Stemcell technologies) or StemMACS HSC Expansion Media).
  • IMDM medium Iscove-modified Dulbecco's medium
  • CSH eg Stemspan's SFEM medium (Stemcell technologies) or StemMACS HSC Expansion Media
  • XF human, Invitrogen
  • SCF Stem Cell Factor
  • heparin heparin
  • IL-3 heparin
  • IL-3 heparin
  • ⁇ growth factors
  • serum plasma, platelet lysate and / or pool of serum.
  • Compounds added to the medium are preferably human compounds obtained by recombinant or purification techniques. The concentrations of these various compounds are readily determined by those skilled in the art based on the recommendations of the suppliers or the general knowledge
  • serum pool refers to a mixture of human AB plasmas (most often a mixture of more than 100 different plasmas) viro-attenuated. To do this, AB plasmas from transfusion centers are mixed, virus-attenuated and finally aliquoted. The serum pool can then be used fresh or kept frozen.
  • platelet lysate refers to a product rich in growth factors that is obtained as a result of the lysis of plaque concentrates.
  • platelet concentrates from transfusion centers can be mixed before being lysed.
  • lysis well known to those skilled in the art, in particular ultrasonic lysis, by the use of solvents and / or detergents, or by cryolysis.
  • the platelet concentrates are lysed by cryolysis.
  • Cryolysis consists of freeze / thaw cycles, usually two cycles, causing platelet disruption and plasma release of the growth factors they contain.
  • the lysis may be followed by centrifugation and / or filtration. Platelet lysate can then be used fresh or frozen.
  • the base of the medium according to the invention is an IMDM medium as defined above or an equivalent medium, supplemented with: transferrin, preferably human transferrin, at a concentration of between about 200 ⁇ g / ml and about 400 ⁇ g / ml, preferably between about 300 ⁇ g / ml and about 350 ⁇ g / ml, more preferably at a concentration of about 330 ⁇ g / mL; and or
  • insulin preferably human insulin, at a concentration of between approximately 1 ⁇ g / ml and approximately 50 ⁇ g / ml, preferably between approximately 5 ⁇ g / ml and approximately 20 ⁇ g / ml, more preferably at a concentration of approximately 10 ⁇ g / mL; and or
  • serum, plasma or pool of serum preferably human, at a concentration of from about 1% to about 10%, preferably from about 3% to about 7%, more preferably at a concentration of about 5%, and / or a platelet lysate, preferably of human origin, at a concentration of between about 0.05% and about 0.5%, preferably between about 0.1% and about 0.5%, more preferably at a concentration of about 0.3%; and or
  • heparin preferably human heparin, at a concentration of between about 0.5 U / ml and about 10 U / ml, preferably between about 1 U / ml and about 5 U / ml, more preferably at a concentration of about 3 U / mL.
  • the medium may also be supplemented with:
  • IL-3 preferably human IL-3, at a concentration of between about 1 ng / mL and about 20 ng / mL, preferably between about 3 ng / mL and about 7 ng / mL, more preferably at a concentration of about 5 ng / mL;
  • SCF preferably human, at a concentration of between about 10 ng / ml and about 200 ng / ml, preferably between about 50 ng / ml and about 150 ng / ml, more preferably at a concentration of about 100 ng / mL; and or
  • EPO preferably human at a concentration of between approximately 0.5
  • the base of the culture medium according to the invention is preferably an IMDM medium as defined above or an equivalent medium, and comprises transferrin, insulin, heparin, and serum, plasma, serum pool or platelet lysate, preferably transferrin, insulin, heparin and serum pool or platelet lysate, more preferably transferrin, insulin, heparin and platelet lysate.
  • transferrin, insulin, heparin, and serum plasma, serum pool or platelet lysate, preferably transferrin, insulin, heparin and serum pool or platelet lysate, more preferably transferrin, insulin, heparin and platelet lysate.
  • this medium further comprises IL-3,
  • SCF and ⁇ preferably at concentrations as described above.
  • the medium may comprise SCF and ⁇ , preferably at concentrations as described above.
  • the base of the medium according to the invention comprises:
  • transferrin preferably human transferrin, at a concentration of between 300 ⁇ g / mL and 350 ⁇ g / mL;
  • insulin preferably human insulin, at a concentration of between 5 ⁇ g / mL and 20 ⁇ g / mL;
  • serum, plasma or pool of serum preferably human, at a concentration of between 3% and 7%, and / or platelet lysate, preferably of human origin, at a concentration of between 0.1% and 0%, 5
  • heparin preferably human heparin, at a concentration of between 1 U / mL and 5 U / mL,
  • IL-3 preferably human IL-3, at a concentration of between 3 ng / mL and 7 ng / mL;
  • SCF preferably human, at a concentration of between 50 ng / mL and 150 ng / mL; and or
  • the medium according to the invention comprises, added to this base, (i) an inducer of autophagy, preferably SMER-28, (ii) a glucocorticoid hormone, preferably dexamethasone, and optionally (iii) an activator of the HIF channel, preferably DMOG.
  • an inducer of autophagy preferably SMER-28
  • a glucocorticoid hormone preferably dexamethasone
  • an activator of the HIF channel preferably DMOG.
  • the medium according to the invention comprises, added to this base:
  • a glucocorticoid hormone preferably dexamethasone
  • a concentration of between 0.001 mM and 10 mM preferably between 0.002 mM and 1 mM, more preferably between 0.005 mM and 0.5 mM, and very particularly preferably between 0.01 mM and 0.1 mM
  • an autophagy inducer preferably SMER-28, at a concentration of between 0.1 ⁇ and 100 ⁇ , preferably between 0.5 ⁇ and 50 ⁇ , more preferably between 1 ⁇ and 30 ⁇ , and very particularly preferably between 2 ⁇ and 30 ⁇ ; and
  • an activator of the HIF pathway preferably DMOG, at a concentration of between 1 ⁇ and 1000 ⁇ , preferably between 10 ⁇ and 500 ⁇ , more preferably between 50 ⁇ and 400 ⁇ , and more particularly preferred between 75 ⁇ ⁇ 350 ⁇ .
  • the medium according to the invention comprises between 0.005 mM and 0.5 mM of a glucocorticoid hormone, preferably dexamethasone, between 0.5 ⁇ and 50 ⁇ of an inducer of autophagy, preferably SMER-28, and optionally between 50 ⁇ and 400 ⁇ of an activator of the HIF pathway, preferably DMOG.
  • a glucocorticoid hormone preferably dexamethasone
  • an inducer of autophagy preferably SMER-28
  • an activator of the HIF pathway preferably DMOG.
  • the medium according to the invention comprises between 0.01 mM and 0.1 mM of a glucocorticoid hormone, preferably dexamethasone, between 2 ⁇ and 30 ⁇ of an inducer of autophagy , preferably SMER-28, and optionally between 75 ⁇ and 350 ⁇ of an activator of the HIF pathway, preferably DMOG.
  • a glucocorticoid hormone preferably dexamethasone
  • an inducer of autophagy preferably SMER-28
  • an activator of the HIF pathway preferably DMOG.
  • the medium according to the invention does not comprise serum of non-human origin (for example fetal calf serum), thrombopoietin, growth of vascular endothelium (VEGF), IL-6, BMP (morphogenetic bone protein), FLT3-ligand and / or hydrocortisone.
  • serum of non-human origin for example fetal calf serum
  • thrombopoietin growth of vascular endothelium (VEGF), IL-6, BMP (morphogenetic bone protein), FLT3-ligand and / or hydrocortisone.
  • VEGF vascular endothelium
  • BMP morphogenetic bone protein
  • FLT3-ligand / or hydrocortisone.
  • the present invention also relates to the use of the cell culture medium according to the invention and as described above for the production and / or amplification of erythroid progenitors and / or the production of erythrocytes, in particular according to the methods of the invention. the invention described above, and more particularly to stimulate the differentiation of HSCs into erythroid progenitors and / or to amplify erythroid progenitors.
  • the present invention further relates to a kit comprising:
  • kits for producing erythroid progenitors and / or erythrocytes, in particular according to the methods of the invention described above.
  • Example 1 Amplification of erythroid progenitors from CSH from cord blood and cytapheresis
  • IMDM medium Biochrom
  • transferrin 330 ⁇ g / mL
  • insulin 10 ⁇ g / mL
  • serum pool AB EPO
  • heparin 3 U / mL
  • IL-3 5 ng / ml
  • SCF 100 ng / ml
  • EPO 2 IU / ml
  • SCF 100 ng / ml
  • EPO 2 IU / ml
  • cells On day 0 cells were seeded at a concentration of 10,000 cells / ml, cells were diluted 1: 5 in fresh medium, cells were washed and cultured at 100,000 cells / ml. in new surroundings. The cells were diluted to 100,000 cells / ml and seeded in new medium. At day 14, the cells were reseeded at 300,000 cells / ml in new medium. At day 18 the cells were diluted to 0.5 million / ml. From D21 cells were systematically reset to 1 million / ml each day of maintenance (i.e. twice a week).
  • Protocol 1 From day 0 to day 1 cells are cultured in the basal medium. At Jl 1 the medium used is supplemented with 253.9 ⁇ of DMOG. On day 14, the medium used is supplemented with 333 ⁇ l of DMOG, 0.02 mm of DEX (dexamethasone) and 30 ⁇ l of SMER28. The medium used on D18 is completed by 0.09 mM DEX and 20.1 ⁇ l of SMER28. At D21, 0.10 mM of DEX and 24.5 ⁇ l of SMER28 were added to the medium used, that of J25 was supplemented with 0.10 mM of DEX and 17.4 ⁇ l of SMER28. Finally, from the 28 th day, the medium was systematically supplemented with 0.10 mM DEX and 13.8 ⁇ of SMER28.
  • Protocol 2 From D0 to the end of the culture, the medium is supplemented with 0.1 mM DEX and 2.27 ⁇ l of SMER28.
  • Protocol 3 From D0 to the end of the culture the medium is supplemented with 0.1 mM of
  • Protocol 4 this protocol is the control protocol, it was carried out with the basic medium without addition of factor.
  • Flow cytometry Flow cytometry:
  • a sample of 100,000 cells is removed and washed, the cells are then brought into contact with the CD235a and CD117 antibodies, according to the supplier's instructions. After 30 min at room temperature and in the dark, the cells are washed twice with PBS. The cells are then ready for cytometer analysis.
  • CD235a antibody specifically recognizes glycophorin A which signifies mature erythroid involvement
  • the CD1 17 antibody specifically recognizes the c-kit receptor (ie the Stem Cell Factor Receptor) which signals the immaturity, the strain and the capacity for self-renewal of the cells.
  • the c-kit receptor ie the Stem Cell Factor Receptor
  • the cells are diluted tenth in a trypan blue solution, which makes it possible to evaluate the cell mortality if necessary.
  • Protocols 1 and 2 allow exponential amplification of erythroblasts. The amplification obtained with protocols 1 and 2 is also much greater than that obtained with dexamethasone alone (see Table 1). It is also interesting to note that protocols 1 and 2 allow amplification of erythroid progenitors from CD34 + cells from cytapheresis or cord blood.
  • the C-KIT marker persists under these conditions much longer than under the control conditions (see Figure 1), this membrane marker signifies the youth of cells and their ability to proliferate.
  • the amplification can last up to 78 days.
  • Example 2 Amplification of Erythrofoid Progenitors from Engineered HSS from Cytopheresis Inducibly Over-expressing HTERT, BMI1 and Constitutively BCL-XL or Inductively Over-expressing HTERT, BMI1 and LM02
  • IMDM medium (Biochrom), supplemented with transferrin (330 ⁇ g / mL), insulin (10 ⁇ g / mL), serum AB pool (EFS) 5% and heparin (3 U / mL). From day 0 to day 7, the medium was supplemented with IL-3 (5 ng / ml), SCF (100 ng / ml) and EPO (2 IU / ml). From day 7 until the end of the amplification of the erythroblastic progenitors the medium was supplemented with SCF (100 ng / ml) and EPO (2 IU / ml).
  • CSH HSCs are obtained from cytapheresis after magnetic separation using CD34 + Miltenyi beads.
  • the cells were inoculated at a concentration of 100,000 cells / ml, for two successive infections with the lentiviral supernatant HTERT BMI1 and the retroviral supernatant BCL-XL or the lentiviral supernatant HTERT BMI1 and the lentiviral supernatant LM02; on day 3 the cells were washed 3 times and reseeded at a concentration of 10 000 cells / ml, the cells were diluted 1/5 in new medium. On day 7 cells were washed and cultured at 100,000 cells / ml in fresh medium. The cells were diluted to 100,000 cells / ml and seeded in new medium.
  • the cells were reseeded at 300,000 cells / ml in new medium.
  • the cells were diluted to 0.5 million / ml. From D21 cells were systematically reset to 1 million / ml each day of maintenance (ie twice a week).
  • Protocol 1 From day 0 to day 1 cells are cultured in the basal medium. At Jl 1 the medium used is supplemented with 253.9 ⁇ of DMOG. On day 14, the medium used is supplemented with 333 ⁇ l of DMOG, 0.02 mm of DEX (dexamethasone) and 30 ⁇ l of SMER28. The medium used on D18 is completed by 0.09 mM DEX and 20.1 ⁇ l of SMER28. At D21, 0.10 mM of DEX and 24.5 ⁇ l of SMER28 were added to the medium used, that of J25 was supplemented with 0.10 mM of DEX and 17.4 ⁇ l of SMER28. Finally, from the 28 th day the media was systematically supplemented with 0.10 mM DEX and 13.8 ⁇ of SMER28.
  • Protocol 2 From D0 to the end of the culture, the medium is supplemented with 0.1 mM DEX and 2.27 ⁇ l of SMER28.
  • Protocol 3 From D0 to the end of the culture the medium is supplemented with 0.1 mM of
  • Protocol 4 this protocol is the control protocol, it was carried out with the basic medium without addition of factor. Results
  • Protocols 1 and 2 allow exponential amplification of erythroblasts with both models of HSCs (see Table 2). The amplification obtained with Protocols 1 and 2 is also much greater than that obtained with dexamethasone alone.
  • CD34 + cells from cytapheresis acquire amplification capabilities superior to CD34 + cells derived from cord blood.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de production in vitro de progéniteurs érythroïdes comprenant la mise en contact de cellules souches hématopoïétiques, génétiquement modifiées ou non, avec un milieu de culture cellulaire défini comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie.

Description

Procédé de production de progéniteurs érythroïdes
La présente invention relève du domaine de la médecine. Elle se rapporte plus particulièrement à de nouveaux procédés de production de progéniteurs érythroïdes et de globules rouges.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
Le maintien d'un apport constant en dioxygène aux tissus est indispensable à la survie de nombreux êtres vivants, et en particulier des humains. Ce sont les globules rouges qui transportent le dioxygène au sein de l'organisme via la circulation sanguine. Ce transport est assuré par l'hémoglobine, une protéine spécifique des globules rouges qui est capable de fixer le dioxygène. Lorsque les globules rouges parviennent aux tissus, le dioxygène diffuse à travers les parois des capillaires. Le rôle des globules rouges est donc primordial.
La transfusion de globules rouges est nécessaire lors de situations d'urgences (hémorragie) ou pathologiques (maladies du sang, cancers, etc.). En 2016, plus de 100 millions de poches de sang ont été collectées dans le monde et ont été distribuées afin de répondre aux besoins transfusionnels. 50% de ces produits sont distribués dans les pays riches, qui ne représentent que 15% de la population globale. Si, dans les pays en voie de développement, les problématiques de transfusion sont liées à l'approvisionnement et à la sécurité transfusionnelle, dans les pays riches, ces problématiques sont mieux maîtrisées. Toutefois, les complications immunologiques liées à des transfusions chroniques (allo-immunisation) peuvent conduire à des impasses transfusionnelles mettant enjeu le devenir des patients.
A ce jour, les transfusions sanguines reposent exclusivement sur le sang issu de donneurs.
Chez l'adulte, la production de globules rouges ou érythropoïèse se déroule dans la moelle osseuse dite moelle hématopoïétique, qui est présente dans les os plats et aux extrémités des os longs. Dans la moelle osseuse, des cellules souches multipo tentes, appelées cellules souches hématopoïétiques se différencient successivement en différents types de progéniteurs érythroïdes (BFU-E, CFU-E, proérythroblastes, érythroblastes basophiles, érythroblaste polychromatophiles). Quand les érythroblastes quittent la moelle osseuse, ils perdent leur noyau pour devenir des réticulocytes puis des globules rouges matures.
Des milieux de différentiation des cellules souches hématopoïétiques permettant la production in vitro de globules rouges sont connus. Cependant, les procédés actuels présentent des défauts rédhibitoires pour une production à grande échelle tel qu'une orientation trop rapide vers une maturation en globules rouges, ce qui limite considérablement le rendement de production, ou encore une différenciation en cellules incapables de réaliser les étapes d'énucléation correctement (Akimov S et al, 2005, Stem cells, 23(9) : 1423-1433 ; Hirose SI et al, 2013, Stem Cell Reports, 1(6) : 499-508 ; Huang X, 2013, Mol. Ther., 22(2) : 451-463). Enfin, d'autres procédés recourent à des co- cultures avec des cellules nourricières (Kurita R et al, 2013, PloS One, 8(3) : e59890), ce qui est à la fois complexe à mettre en place et coûteux.
Il apparaît ainsi que le développement de nouveaux procédés permettant une production in vitro de globules rouges permettrait de répondre aux besoins d'approvisionnement, d'éviter des risques infectieux émergents, et d'éviter des complications immunologiques.
L'invention décrite ici vise, entre autres, à répondre à ces besoins.
RÉSUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont démontré que la culture de cellules souches hématopoïétiques dans un milieu comprenant de la dexaméthasone, du SMER28 (Small Molécule Enhancer of Rapamycin 28), et optionnellement du DMOG (diméthyloxalylglycine), permet non seulement de différencier ces cellules souches en progéniteurs érythroïdes, mais également d'amplifier considérablement cette population de progéniteurs tout en préservant leur capacité de différentiation terminale en globules rouges. Les progéniteurs érythroïdes ainsi obtenus peuvent être maintenus en culture et amplifiés pendant plus de 60 jours sans pour autant perdre leur capacité à se différencier en cellules matures énuclées, c'est-à-dire en globules rouges.
Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro de production de progéniteurs érythroïdes comprenant la mise en contact de cellules souches hématopoïétiques avec un milieu de culture cellulaire, de préférence adapté aux exigences nutritionnelles des cellules souches hématopoïétiques et en particulier adapté à la croissance et/ou différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique, et comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie.
De préférence, l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci. De manière plus particulièrement préférée, l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisone, la prednisolone et la dexaméthasone. De manière tout particulièrement préférée, l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone.
De préférence, l'inducteur d'autophagie est sélectionné dans le groupe constitué du SMER-28 (Small Molécule Enhancer of Rapamycin 28), SMER-10 et SMER-18, et d'une combinaison de ceux-ci. De manière plus particulièrement préférée, l'inducteur d'autophagie est le SMER-28 (Small Molécule Enhancer of Rapamycin 28).
Selon un mode de réalisation particulier, le milieu de culture comprend en outre un activateur de la voie HIF (Hypoxya Inductible Factor), de préférence un inhibiteur de la prolyl hydroxylase, et de manière encore préférée du DMOG (diméthyloxalylglycine).
Les cellules souches hématopoïétiques sont de préférence obtenues par différenciation de cellules souches pluripotentes, en particulier des cellules souches embryonnaires (ES) ou des cellules souches pluripotentes induites (iPS), ou sont isolées à partir d'un échantillon de sang de patient avec ou sans mobilisation, de sang de cordon ombilical ou de placenta, ou encore à partir d'un échantillon ou prélèvement de moelle osseuse. De préférence, les cellules souches hématopoïétiques sont des cellules souches hématopoïétiques humaines.
Les cellules souches hématopoïétiques peuvent être génétiquement modifiées, en particulier pour surexprimer un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué de HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion région 1 homolog), c-MYC, 1-MYC et MYB. De préférence, les cellules souches hématopoïétiques peuvent être génétiquement modifiées pour surexprimer le gène HTERT ou pour surexprimer le gène BMI1. Elles peuvent également être modifiées pour surexprimer le gène HTERT et le gène BMI1.
Le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué de HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion région 1 homolog), c-MYC, 1-MYC et MYB, sont de préférence placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.
Ces cellules souches hématopoïétiques peuvent en outre être génétiquement modifiées pour sur-exprimer :
- un ou plusieurs facteurs de transcription de la voie des CEN (Core
Erythroid Network), de préférence LM02 (LIM domain only 2) ; et/ou
un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence BCL-XL (B-cell Lymphoma-extra large).
De préférence, les cellules souches hématopoïétiques sont génétiquement modifiées pour surexprimer le gène BCL-XL ou pour surexprimer le gène LM02.
Le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes de la voie EPO- R/JAK2/STAT5/BCL-XL sont, de préférence, placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs constitutifs.
Le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes des facteurs de transcription de la voie des CEN (Core Erythroid Network) sont, de préférence, placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.
Les cellules souches hématopoïétiques peuvent également être des cellules immortalisées.
De préférence, les cellules sont cultivées dans le milieu de culture de l'invention pendant au moins 20 jours, de manière encore préférée pendant au moins 40 jours, de manière tout particulièrement préférée pendant au moins 60 jours.
L'invention concerne encore, dans un deuxième aspect, l'utilisation du milieu de culture cellulaire selon l'invention pour la production et/ou l'amplification de progéniteurs érythroïdes.
Dans un troisième aspect, l'invention concerne des cellules souches hématopoïétiques génétiquement modifiées telle que décrites précédemment ainsi que l'utilisation de ces cellules souches hématopoïétiques pour la production in vitro de progéniteurs érythroïdes et/ou d'érythrocytes.
L'invention concerne, dans un quatrième aspect, un procédé in vitro de production d'érythrocytes comprenant :
- la production de progéniteurs érythroïdes selon le procédé de l'invention ; et
- l'induction de la maturation des progéniteurs érythroïdes,
- et optionnellement, la récupération des érythrocytes obtenus. De préférence, la maturation des progéniteurs érythroïdes est induite par culture des progéniteurs érythroïdes dans un milieu de différenciation érythrocytaire.
L'invention concerne encore, dans un autre aspect, un milieu de culture cellulaire, de préférence adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique, et comprenant une hormone glucocorticoïde, de préférence de la dexaméthasone, et un inducteur d'autophagie, de préférence du SMER-28, et optionnellement un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG.
De préférence, le milieu comprend une hormone glucocorticoïde à une concentration comprise entre 0,01 mM et 0,1 mM, et/ou un inducteur d'autophagie à une concentration comprise entre 2 μΜ et 30 μΜ, et/ou un activateur de la voie HIF à une concentration comprise entre 75 μΜ et 350 μΜ.
L'inducteur d'autophagie est, de préférence, sélectionné dans le groupe constitué du SMER-28 (Small Molécule Enhancer of Rapamycin 28), SMER-10 et SMER-18, et d'une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée est le SMER- 28.
L'hormone glucocorticoïde est de préférence sélectionnée dans le groupe constitué de la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci, de manière plus particulièrement préférée est sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisone, la prednisolone et la dexaméthasone, et de manière tout particulièrement préférée est la dexaméthasone.
L' activateur de la voie HIF (Hypoxya Inductible Factor) est de préférence un inhibiteur de la prolyl hydroxylase (PHIS), et de manière encore plus préférée du DMOG (diméthyloxalylglycine).
Le milieu de culture peut comprendre en outre (i) de la transferrine, (ii) de l'insuline, (iii) de l'héparine, et (iv) du sérum, plasma, pool de sérum ou lysat plaquettaire, de préférence du lysat plaquettaire, et optionnellement du SCF (Stem Cell Factor), de l'EPO et/ou de l'IL-3.
La présente invention concerne également l'utilisation du milieu de culture cellulaire selon l'invention pour produire et/ou amplifier des progéniteurs érythroïdes.
L'invention concerne encore, dans un cinquième aspect, une trousse (ou kit) pour la production de progéniteurs érythroïdes et/ou d'érythrocytes comprenant : - un milieu de culture selon l'invention ; et/ou
- des cellules souches hématopoïétiques génétiquement modifiées selon l'invention
; et
- optionnellement, un guide contenant des instructions pour l'utilisation d'une telle trousse.
Enfin, l'invention concerne, dans un sixième aspect, l'utilisation d'une trousse (ou kit) selon l'invention pour produire des progéniteurs érythroïdes et/ou des érythrocytes.
DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1 : Profil d'expression des marqueurs de surfaces CD117 et CD 235a à J14, selon les différents protocoles de cultures. A : protocole 4 ; B : protocole 3 ; C : protocole 1 ; D : protocole 2.
Figure 2 : Profil d'expression des marqueurs de surfaces CD117 et CD 235a à J24 des cellules génétiquement modifiées pour surexprimer HTERT, BMI1 et LM02, selon les différents protocoles de cultures. A : protocole 4 ; B : protocole 1 ; C : protocole 2. Figure 3 : Profil d'expression des marqueurs de surfaces CD117 et CD 235a à J24 des cellules génétiquement modifiées pour surexprimer HTERT, BMI1 et BCL-XL, selon les différents protocoles de cultures. A : protocole 4 ; B : protocole 1 ; C : protocole 2.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont démontré que la culture de cellules souches hématopoïétiques dans un milieu comprenant un inducteur d'autophagie, à savoir du SMER28 (Small Molécule Enhancer of Rapamycin 28) et une hormone glucocorticoïde, à savoir de la dexaméthasone, permet d'augmenter considérablement la production de progéniteurs érythroïdes par rapport à un milieu de culture contrôle dans lequel seul de la dexaméthasone est ajoutée. Les progéniteurs érythroïdes ainsi obtenus peuvent être maintenus en culture et amplifiés pendant plus de 60 jours. Les inventeurs ont également démontré que ces progéniteurs érythroïdes sont capables de se différencier efficacement en globules rouges.
Ce procédé de culture in vitro a non seulement l'avantage d'être simple et économique, mais ouvre également la voie à une production industrielle à grande échelle de progéniteurs érythroïdes puis de globules rouges. Ceci pourrait permettre de réduire les risques de pénurie de sang ou d'impasse transfusionnelle, tout en offrant une sécurité optimale aux patients transfusés. Ainsi, selon un premier aspect, la présente demande concerne un procédé in vitro de production de progéniteurs érythroïdes comprenant la mise en contact de cellules souches hématopoïétiques avec un milieu de culture comprenant un inducteur d'autophagie et une hormone glucocorticoïde. Ce procédé a pour but d'induire la différenciation des cellules souches hématopoïétiques en progéniteurs érythroïdes et de permettre l'amplification, c'est-à-dire la multiplication, de cette population de progéniteurs tout en conservant leur capacité à se différencier ultérieurement en globules rouges. Le procédé selon l'invention est donc un procédé de production et d'amplification de progéniteurs érythroïdes.
Tel qu'utilisé ici, le terme de « progéniteurs érythroïdes » se réfère à des cellules progénitrices obtenues par différenciation de cellules souches hématopoïétiques au cours de l'érythropoïèse. Ces cellules progénitrices sont des cellules nucléées qui ont la capacité de se diviser et de se différencier ultérieurement en globules rouges par énucléation. Les progéniteurs érythroïdes sont de préférence sélectionnés parmi les BFU-E (Burst Forming Unit - E) qui se caractérisent par l'expression des marqueurs CD117, CD34, CD41, CD71 , et CXCR4, les CFU-E (Colony Forming Unit - E) qui se caractérisent par l'expression des marqueurs CD117, CD34, CD36, et CD71, les proérythroblastes qui se caractérisent par l'expression des marqueurs CD117, CD71, CD36, et CD235a, les érythroblastes basophiles qui se caractérisent par l'expression des marqueurs CD117, CD71 , CD36, CD235a et les érythroblastes polychromatophiles qui se caractérisent par l'expression des marqueurs CD36, CD71, CD 235a, et les mélanges de ceux-ci.
Tel qu'utilisé ici, le terme de « cellule souche hématopoïétique » ou « CSH » se réfère à des cellules souches multipotentes capables de se différencier en cellules sanguines et cellules immunitaires que sont les globules blancs, les globules rouges et les plaquettes. Les cellules souches hématopoïétiques expriment les antigènes CD45, CD133, et/ou CD34. De préférence, les cellules souches hématopoïétiques expriment les antigènes CD45 et CD34 et, optionnellement l'antigène CD 133.
Selon les modes de réalisation préférés, les CSH sont des CSH humaines. Ces CSH peuvent être obtenues à partir de différentes sources et selon des procédés bien connus de l'homme du métier. Elles peuvent notamment être isolées à partir de moelles osseuses, de cytaphérèses, de sang total ou encore de sang de cordon ombilical (ou de sang placentaire) par exemple à l'aide d'un système immuno-magnétique ou d'un système de tri sur la présence de récepteurs membranaires spécifiques (par exemple CD133, CD45 et/ou CD34).
Tel qu'utilisé ici, le terme de « cytaphérèse » se réfère au prélèvement par aphérèse des CSH dans le sang. L'aphérèse est une technique de prélèvement de certains composants sanguins par circulation extra-corporelle du sang. Les composants que l'on souhaite prélever sont séparés par centrifugation et extraits, tandis que les composants non prélevés sont réinjectés au donneur ou au patient (aphérèse thérapeutique).
Les CSH peuvent également être obtenues par différenciation de cellules souches pluripotentes, en particulier des cellules souches embryonnaires ou des cellules souches pluripotentes induites, de préférence des cellules souches pluripotentes induites. Les techniques pour différencier des cellules souches pluripotentes en CSH sont bien connues de l'homme du métier. Plusieurs protocoles ont été publiés, notamment le protocole de Lengerke C et al (2009, Ann N Y Acad Sci, 1176:219-27) consistant en une différenciation de 17 jours en passant par une étape intermédiaire de corps embryoïdes et grâce à la combinaison des cytokines suivantes: SCF, Flt-3 ligand, IL-3, IL-6, G-CSF et BMP-4.
Tel qu'utilisé ici, le terme de « cellule souche embryonnaire » se réfère à des cellules dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste et qui ont la capacité de conduire à la formation de tous les tissus de l'organisme (mésoderme, endoderme, ectoderme), y compris aux cellules de la lignée germinale. La pluripotence des cellules souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT4 et NANOG et des marqueurs de surface comme SSEA3/4, Tra-1-60 et Tra-1-81. Les cellules souches embryonnaires peuvent être obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont issues, par exemple à l'aide de la technique décrite par Chung et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2): 113-117). Dans un mode de réalisation particulier, et pour des raisons légales ou éthiques, les cellules souches embryonnaires sont des cellules souches embryonnaires non humaines. Dans un autre mode de réalisation particulier, les cellules souches embryonnaires utilisées dans l'invention sont des cellules souches embryonnaires humaines, de préférence obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont issues. Les embryons utilisés sont de préférence des embryons surnuméraires obtenus dans le cadre d'un projet parental après obtention des autorisations réglementaires et éthiques conformes aux lois en vigueur.
Tel qu'utilisé ici, le terme de « cellule souche pluripotente induite » (CSPi, ou iPS), se réfère à des cellules souches pluripotentes obtenues par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées, et présentant une morphologie et un potentiel d' autorenouvellement et de pluripotence en partie similaires à ceux des cellules souches embryonnaires. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, notamment la coloration à la phosphatase alcaline et l'expression des protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA3/4. Les procédés permettant l'obtention des cellules souches pluripotentes induites sont bien connus de l'homme du métier et sont notamment décrits dans les articles de Yu et al (Science, 2007, 318 (5858): 1917-1920), Takahashi et al (Cell, 2007, 131(5): 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101-106).
Les CSH utilisées dans le procédé selon l'invention peuvent également être des
CSH génétiquement modifiées afin d'augmenter leur capacité à s'engager dans l'érythropoïèse et/ou leur capacité d'amplification. Ainsi, selon certains modes de réalisation, le procédé selon l'invention, peut comprendre la modification génétique des CSH afin d'augmenter leur capacité à s'engager dans l'érythropoïèse et/ou leur capacité d'amplification. Les méthodes pour modifier génétiquement ces cellules sont bien connues de l'homme du métier et impliquent, par exemple, l'introduction de transgènes dans le génome des cellules via des rétrovirus ou des lentivirus ou toute autre forme de transfert de gènes ou de protéines.
Selon un mode de réalisation, la capacité d'amplification de ces CSH est améliorée en surexprimant un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué de HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion région 1 homolog), c-MYC, 1-MYC et MYB.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer HTERT.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer HTERT et un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué de BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion région 1 homolog), c-MYC, 1-MYC et MYB. Selon un mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer HTERT et/ou BMI1, de préférence HTERT et BMI1.
La capacité des CSH à s'engager dans la voie de l'érythropoïèse peut être améliorée en surexprimant un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie EPO- R/JAK2/STAT5/B CL-XL et/ou dans la voie des CEN (Core Erythroid Network).
Tel qu'utilisé ici, le terme « voie EPO-R/JAK2/STAT5/B CL-XL » se réfère à une voie de signalisation cellulaire dont les protéines clefs sont le récepteur à ΕΡΟ (érythropoïétine), JAK2 (Janus Kinase 2), STAT5 (Signal transducer and activator of transcription 5) et BCL-XL (B-cell Lymphoma-extra large). L'EPO est indispensable à l'érythropoïèse, elle favorise l'engagement érythoïde et la survie cellulaire. La liaison de ΕΡΟ à son récepteur membranaire provoque la dimérisation de ΓΕΡΟ-R qui, ainsi activé, induit à son tour les kinases JAK2. Les kinases JAK2 phosphorylent alors les résidus tyrosine de la queue cytoplasmique du récepteur EPO-R. Ces phosphotyrosines permettent l'interaction avec les protéines contenant un domaine SH2 (Src Homology 2), ce qui se traduit par l'activation de différentes voies de signalisation dont la principale est la voie du facteur de transcription STAT5. STAT5 est tout d'abord dimérisé puis phosphorylé, ce qui conduit à sa translocation dans le noyau où il active la transcription de différents gènes dont des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire et la différenciation érythroïde.
Selon un mode de réalisation, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5P/BCL-XL, de préférence un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL-XL et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer un gène codant pour BCL-XL.
Tel qu'utilisé ici, le terme « voie des CEN » se réfère à un groupe de facteurs de transcription essentiels à l'établissement ou au maintien de l'identité des érythrocytes.
Selon un mode de réalisation, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant GATAI (facteur de transcription appartenant à la famille des protéines à doigt de zinc se fixant sur la séquence ADN « GATA »), TAL1 (TAL BHLH Transcription Factor 1), KLF1 (Krueppel-like factor 1), LDBl (LIM Domain Binding 1), LM02 (LIM domain only 2) et SCL (Stem Cell Leukemia), et une combinaison de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer un gène codant LM02.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH utilisées dans le procédé selon l'invention sont génétiquement modifiées pour surexprimer :
(i) un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant HTERT, BMI1, c-MYC, 1-MYC et MYB, et une combinaison de ceux-ci, de préférence HTERT et/ou BMI1, et de manière plus particulièrement préférée HTERT et BMI1 ; et
(ii) un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2, STAT5, BCL-XL et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée BCL-XL ; et/ou
(iii) un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant GATAI, TALl, KLFl, LDBl, LM02 et SCL, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée LM02.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les CSH utilisées dans le procédé selon l'invention sont génétiquement modifiées pour surexprimer :
(i) un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant HTERT, BMI1, c-MYC, 1-MYC et MYB, et une combinaison de ceux-ci, de préférence HTERT et/ou BMI1, et de manière plus particulièrement préférée HTERT et BMI1 ; et
(ii) un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL- XL et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée BCL-XL ; et
(iii) un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant GATAI, TALl, KLFl, LDBl, LM02 et SCL, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée LM02.
Selon un mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer (i) le gène codant HTERT, et optionnellement le gène codant BMI1, et
(ii) le gène codant LM02 et/ou le gène codant BCL-XL, de préférence le gène codant BCL-XL.
En particulier, les CSH peuvent être génétiquement modifiées pour surexprimer le gène codant HTERT et le gène codant BCL-XL, et optionnellement le gène codant BMI1.
Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer
(i) les gènes codant HTERT et BMI1 , et
(ii) le gène codant LM02 et/ou le gène codant BCL-XL.
En particulier, les CSH peuvent être génétiquement modifiées pour surexprimer
(i) les gènes codant HTERT et BMI1 et le gène codant LM02, ou
(ii) les gènes codant HTERT et BMI1 et le gène codant BCL-XL.
Tel qu'utilisé ici, le terme « surexpression », « surexprimer » ou « surexprimant » se réfère au niveau d'expression d'un gène dans une cellule génétiquement modifiée qui est supérieur au niveau d'expression de ce même gène dans la cellule non génétiquement modifiée. Lorsque la cellule n'exprime pas le gène en question avant la modification génétique mais l'exprime après modification, ce terme peut être remplacé par « expression », « exprimer » ou « exprimant ».
La surexpression d'un gène dans une CSH peut être obtenue par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par introduction dans la CSH d'un acide nucléique comprenant le ou les gènes à surexprimer, ou de plusieurs acides nucléiques comprenant chacun un des gènes à surexprimer. Le ou les acides nucléiques peuvent ainsi être disposés sur la même construction ou dans des constructions distinctes. Ils peuvent être introduits dans la CSH par toute méthode connue par l'homme du métier, en particulier par transduction virale, microinjection, transfection, électroporation et biolistique.
Tel qu'utilisé ici, le terme « construction » se réfère à une cassette d'expression ou à un vecteur d'expression. Dans une cassette d'expression, le ou les gènes à surexprimer sont liés de manière opérationnelle aux séquences nécessaires à leur expression. Notamment, ils peuvent être sous le contrôle d'un promoteur permettant leur expression dans une CSH. De manière générale, une cassette d'expression comprend, ou consiste en, un promoteur permettant d'initier la transcription, un ou plusieurs gènes, et un terminateur de transcription. L'expression "lié de manière opérationnelle" indique que les éléments sont combinés de manière à ce que l'expression de la séquence codante soit sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel. Typiquement, la séquence du promoteur est placée en amont (5') du ou des gènes d'intérêt. Des séquences d'espacement peuvent être présentes, entre les éléments régulateurs et le gène, dès lors qu'elles n'empêchent pas l'expression par traduction de la protéine codée. La cassette d'expression peut également comprendre au moins une séquence activatrice « enhancer » liée de manière opérationnelle au promoteur.
Un vecteur d'expression comprend un ou plusieurs acides nucléiques ou cassettes d'expression tels que décrits. Ce vecteur d'expression peut être utilisé pour transformer une cellule hôte et permettre expression de acide nucléique d' intérêt dans ladite cellule. Les vecteurs peuvent être construits par des techniques classiques de biologie moléculaire, bien connues de l'homme du métier.
Avantageusement, le vecteur d'expression comprend des éléments régulateurs permettant l'expression de l'acide nucléique d'intérêt. Ces éléments peuvent comporter par exemple des promoteurs de transcription, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, des codons d'initiation et de terminaison. Les méthodes pour sélectionner ces éléments sont bien connues de l'homme du métier.
Le vecteur peut être circulaire ou linéaire, simple- ou double-brin. Il est avantageusement choisi parmi les plasmides, phages, phagemides, virus, cosmides et chromosomes artificiels. De manière préférée, le vecteur est un vecteur viral.
Le ou les gène(s) à surexprimer peuvent être placés sous le contrôle de promoteurs constitutifs ou inductibles, identiques ou différents, qu'ils soient ou non présents sur le même acide nucléique.
La CSH peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable et le ou les acides nucléiques, cassettes ou vecteurs peuvent être contenus dans la cellule sous forme d'épisome ou intégrés dans le génome de la CSH. Ils peuvent être insérés dans le génome de la cellule eucaryote en des régions identiques ou distinctes. Il existe de nombreuses techniques bien connues de l'homme du métier permettant l'expression stable ou transitoire de gènes d'intérêt. En particulier, les gènes d'intérêts peuvent être intégrés au génome d'une cellule grâce à une technique de knock-in utilisant un système d'expression ciblé, en particulier le système CRISPR-Cas9 (voir par exemple Platt et al. Cell. 2014 Oct 9; 159(2):440-55 ou encore Lo et al. Biotechniques. 2017 Apr 1; 62(4):165-174). Cette technique qui permet d'insérer une seule copie d'un ou de plusieurs gènes d'intérêt dans le génome de la cellule en un locus prédéterminé, repose sur la transfection d'un ou de plusieurs vecteurs permettant l'expression coordonnée d'un gène codant la nucléase Cas9 et d'un ARNg (ARN « guide ») spécifique du locus où le ou les gènes doivent être insérés. Ledit ou lesdits gènes d'intérêt ou une cassette comprenant ledit ou lesdits gènes d'intérêt sont insérés à la faveur de la réparation de la cassure générée par Cas9.
Tel qu'utilisé dans la présente demande, le terme « ARN guide » ou « ARNg » désigne une molécule d'ARN capable d'interagir avec Cas9 afin de la guider vers une région chromosomique cible.
Chaque ARNg peut comprendre deux régions :
- une première région (communément appelée région « SDS »), à l'extrémité 5' de l'ARNg, qui est complémentaire de la région chromosomique cible et qui imite l'ARNcr du système CRISPR endogène, et
- une seconde région (communément appelé région « handle »), à l'extrémité 3' de l'ARNg, qui mime les interactions d'appariement de bases entre l'ARNtracr (trans- activating crRNA) et l'ARNcr du système CRISPR endogène et présente une structure double brin en tige et boucle s 'achevant en 3' par une séquence essentiellement simple brin. Cette seconde région est essentielle à la fixation de l'ARNg à Cas9.
Le gène d'intérêt ou la cassette comprenant le ou les gènes d'intérêt est flanqué de séquences homologues du site de cassure ciblé par l'ARNg, ce qui permet l'insertion du gène ou de la cassette à la faveur de la réparation de la cassure par recombinaison homologue.
Des exemples de promoteurs permettant une expression constitutive comprennent, sans y être limités, pEFl alpha long, pCMV et pCAG.
Un système d'expression inductible pouvant être utilisé dans la présente invention est le système Tet-On, basé sur l'utilisation de la protéine transactivatrice de la tétracycline (tTA), qui est créée en fusionnant la protéine TetR (répresseur de la tétracycline) présente chez la bactérie Escherichia coli avec le domaine activateur de la protéine VP16 présente dans le virus de l'herpès. La protéine rtTA n'est capable de se lier à l'ADN sur une séquence opératrice TetO spécifique que si elle est liée à une tétracycline. Plusieurs répétitions des séquences TetO sont placées sous le contrôle d'un promoteur tel que le promoteur EF1 alpha long. Les séquences TetO couplées au promoteur sont appelées élément de réponse à la tétracycline (TRE) et répondent à la liaison de la protéine transactivatrice de la tétracycline (tTA) en causant une augmentation de l'expression du gène placé sous le contrôle du promoteur.
Lorsque plusieurs gènes sont surexprimés, ceux-ci peuvent être placés sous le contrôle d'un même promoteur ou de plusieurs promoteurs.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant HTERT, BMIl, c-MYC, 1-MYC et MYB, et une combinaison de ceux-ci, de préférence HTERT et/ou BMIl, et de manière plus particulièrement préférée HTERT et BMIl, et ce ou ces gènes sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant GATAI, TAL1, KLF1, LDB1, LM02 et SCL, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée LM02, et ce ou ces gènes sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL-XL et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée BCL-XL, et ce ou ces gènes sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs constitutifs.
Selon un mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer le gène codant HTERT sous le contrôle d'un promoteur inductible et le gène codant pour BCL-XL sous le contrôle d'un promoteur constitutif.
Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer les gènes codant HTERT, BMIl et LM02 sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles. Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer les gènes codant HTERT et BMI1 sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles et le gène codant pour BCL-XL sous le contrôle d'un promoteur constitutif.
De manière alternative, ou en complément des modifications génétiques décrites ci-dessus, les CSH telles qu'utilisées dans le procédé selon l'invention peuvent également être génétiquement modifiées afin de contenir un gène suicide, par exemple le gène HSV- TK ou le gène Casp9, sous le contrôle d'un promoteur inductible. Tel qu'utilisé ici, le terme de « gène suicide » se réfère à tout gène dont l'expression entraîne la mort de la cellule capable de division qui l'exprime, en présence ou en absence d'une molécule supplémentaires (médicament ou autres), selon le gène suicide considéré. A titre d'exemples, la mort cellulaire d'une cellule exprimant le gène HSV-TK ou le gène Casp9 est obtenue, respectivement, par ajout de gancyclovir ou d'AP1003.
Selon certains modes de réalisation, les CSH telles qu'utilisées dans le procédé selon l'invention sont des CSH immortalisées. Ces cellules immortalisées peuvent en outre être génétiquement modifiées tel que décrit ci-dessus.
Les CSH immortalisées peuvent être obtenues à partir d'une lignée cellulaire immortalisée établie à partir de cellules malignes.
De préférence, les CSH immortalisées sont obtenues à partir d'une lignée cellulaire immortalisée établie à partir de cellules non malignes, par exemple à partir d'iPS (Kurita et al. PLoS ONE, 2013, 8, e59890), de cellules de sang de cordon (Kurita et al. supra ; Huang, X. et al. Mol. Ther. 2014, 22, 451-463) de cellules souches embryonnaires (Hirose, S. et al. Stem Cell Rep. 2013, 1, 499-508), ou de CSH isolées à partir de la moelle osseuse, de cytaphérèses ou de sang périphérique total (Trakamsanga et al., 2017, Nature Communications, Vol. 8, 14750).
Les CSH peuvent être immortalisées par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par transduction avec un vecteur lentiviral portant les oncogènes E6 et E7 du papillomavirus humain de type 16 (HPV16 E6/E7) (Akimov et al. Stem Cells. 2005 Oct; 23(9): 1423-1433 ; Trakamsanga et al. supra). Optionnellement, les CSH peuvent être en outre transduites avec un vecteur lentiviral portant le gène codant HTERT (Akimov et al., supra). Selon un mode préféré, les CSH immortalisées utilisées dans le procédé selon l'invention contiennent un gène suicide permettant leur élimination après induction de la maturation des progéniteurs érythroïdes en érythrocytes matures énucléés. Le procédé selon l'invention comprend la mise en contact des CSH telles que décrites ci-dessus avec une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie, et plus particulièrement avec un milieu de culture adapté à la croissance et/ou différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique et comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie.
Tel qu'utilisé ici, les termes «autophagie », « autolyse » et « autophagocytose » sont équivalents et peuvent s'employer l'un pour l'autre. L'autophagie se réfère à une dégradation d'une partie du cytoplasme de la cellule par ses propres lysosomes.
L'autophagie est un processus physiologique qui contribue à éliminer certaines protéines (virales, mal conformées...) et les organelles endommagées. Ce processus peut également intervenir dans l'élimination de pathogènes intracellulaires. Plusieurs voies de signalisation détectent différents types de stress cellulaire, allant de la privation de nutriments à l'invasion microbienne, et convergent pour réguler l'autophagie. Tel qu'utilisé ici, le terme « inducteur d'autophagie » se réfère à une molécule capable d'induire l'autophagie dans une cellule.
Les inducteurs d'autophagie peuvent être notamment des inhibiteurs de la voie mTOR tels que la metformine, la rapamycine, la perifosine, l'éverolimus, le resvératrol ou le tamoxifène, des activateurs de la formation d'autophagosomes tels que le composé MG-132 (un inhibiteur du protéasome 26S), le composé SAHA (un inhibiteur de la Pan- Histone desacétylase), la trichostatine A ou l'acide valproïque, ou encore des petites molécules agissant indépendamment de la voie mTOR telles que SMER-28, SMER-10 ou S MER 18.
Selon un mode de réalisation particulier, l'inducteur d'autophagie est un inducteur agissant indépendamment de la voie mTOR, de préférence sélectionné dans le groupe constitué du SMER-28 (Small Molécule Enhancer of Rapamycin 28), du S MER 10 et du SMER 18, et d'une combinaison de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation préféré, l'inducteur d'autophagie est le SMER-28. Tel qu'utilisé ici les termes « hormone glucocorticoïde », « glucocorticoïde », « corticostéroïde », ou de « corticoïde » sont équivalents et peuvent être employés l'un pour l'autre. Ces termes se réfèrent à des hormones stéroïdiennes naturelles ou synthétiques ayant un noyau prégnane et présentant une action sur le métabolisme protidique et glucidique.
Selon un mode de réalisation, l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation particulier, l'hormone glucocorticoïde est une hormone synthétique, de préférence sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation préférée, l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisolone, la méthylprednisolone, la dexaméthasone, et les dérivés et mélanges de ceux-ci, de préférence dans le groupe constitué de la prednisolone, la méthylprednisolone et la dexaméthasone.
Selon un mode de réalisation tout particulièrement préféré, l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone.
Selon un mode de réalisation particulier, l'inducteur d'autophagie est sélectionné dans le groupe constitué du SMER-28, du SMER 10 et du SMER 18, de préférence est le SMER-28, et l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisolone, la méthylprednisolone et la dexaméthasone, de préférence est la dexaméthasone.
Selon un mode de réalisation tout particulier, l'inducteur d'autophagie est le SMER-28 et l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone.
Optionnellement, les CSH peuvent également être mises en contact avec un activateur de la voie HIF. Tel qu'utilisé ici, le terme « voie HIF » se réfère à la voie de signalisation initiée par HIF (Hypoxia induced factor) qui stimule la sécrétion de ΕΡΟ et active ainsi la voie EPO-R/JAK2/STAT5/B CL-XL. De préférence, l'activateur de la voie HIF selon l'invention est un inhibiteur de la prolyl hydroxylase (PHIS).
Tel qu'utilisé ici, les termes « prolyl hydroxylase (PHIS) » et « procollagène- proline dioxygénase » sont équivalents et peuvent être employés l'un pour l'autre. La prolyl hydroxylase est une enzyme d'hydroxylation de HIF sur ses résidus prolyls. Lorsqu'il est hydroxylé, HIF est inhibé. Les inhibiteurs spécifiques de la prolyl hydroxylase sont donc des molécules capables d'inhiber la prolyl hydroxylase et ainsi d'activer la voie HIF qui va à son tour activer la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL.
De préférence, l'inhibiteur de prolyl hydroxylase est sélectionné dans le groupe constitué du DMOG (diméthyloxalylglycine), du NOG (N-oxalylglycine), du DFO (desferrioxamine), du FG-4383, du F-0041, du FG-2216, du FG-4592, du S956711, de l'EDHB (ethyl-3,4 dihydroxy-benzoate), du TM6089, du TM655, du TM6008, du 8- hydroxyquinoline, et des dérivés de ceux-ci.
De manière tout particulièrement préférée, l'activateur de la voie HIF est le DMOG.
Lors de la mise en œuvre du procédé selon l'invention, les CSH sont mises en culture dans un milieu de culture adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique. De nombreux milieux de culture adaptés aux exigences nutritionnelles des CSH sont connus de l'homme du métier et disponibles dans le commerce, tels que le milieu SFEM de Stemspan (Stemcell technologies) de préférence complémenté avec du SCF (Stem Cell Factor), de ΕΡΟ (erythropoïétine), et des lipides ou le milieu « StemMACS HSC Expansion Media XF, human » (Invitrogen).
De préférence, les CSH sont mises en culture à une concentration comprise entre 200 et 10000 cellules/ml, de préférence entre 500 et 2000 cellules/ml, et de manière encore préférée à environ 1000 cellules/ml.
Le milieu de culture est de préférence changé tous les environ 3 jours de sorte que les cellules ne dépassent pas une concentration d'environ 4000000 cellules/ml. Les CSH peuvent être mises en contact avec l'hormone glucocorticoïde et l'inducteur d' autophagie dès le premier jour de culture ou après plusieurs jours de culture, par exemple après 10 à 15 jours. De préférence, les CSH sont mises en contact simultanément avec l'hormone glucocorticoïde et l'inducteur d' autophagie.
Alternativement, les CSH peuvent être tout d'abord mises en contact avec l'hormone glucocorticoïde puis avec l'inducteur d'autophagie, ou vice-versa. L'ajout du second composé peut avoir lieu, par exemple, quelques heures après la mise en contact avec le premier composé
De préférence, les CSH sont mises en contact simultanément avec l'hormone glucocorticoïde et l'inducteur d'autophagie. De manière plus particulièrement préférée, les CSH sont mises en contact simultanément avec l'hormone glucocorticoïde et 1 ' inducteur d ' autophagie dès le premier j our de culture.
La mise en contact peut se faire par ajout de l'hormone glucocorticoïde et/ou de l'inducteur d'autophagie dans le milieu de culture des CSH ou en plaçant les CSH dans un milieu de culture comprenant l'hormone glucocorticoïde et/ou l'inducteur d'autophagie.
Les concentrations de l'hormone glucocorticoïde et l'inducteur d'autophagie peuvent être constantes ou varier tout au long de la culture ou de la mise en contact.
De préférence, lorsque le milieu de culture comprend l'hormone glucocorticoïde, celle-ci est présente à une concentration comprise entre 0,001 mM et 10 mM, de préférence entre 0,01 mM et 1 mM, de manière encore préférée entre 0,01 mM et 0,5 mM, et de manière tout particulièrement préférée entre 0,02 mM et 0,1 mM.
Selon un mode de réalisation particulier, lorsque le milieu de culture comprend l'hormone glucocorticoïde, celle-ci est présente à une concentration d'environ 0,1 mM. De préférence, lorsque le milieu de culture comprend l'inducteur d'autophagie, celui-ci est présent dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 0, 1 μΜ et 100 μΜ, de préférence entre 0,5 μΜ et 50 μΜ, de manière encore préférée entre 1 μΜ et 30 μΜ, et de manière tout particulièrement préférée entre 2 μΜ et 30 μΜ. Alternativement, lorsque le milieu de culture comprend l'inducteur d'autophagie, celui - ci peut être présent dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 10 μΜ et 30 μΜ. Selon un mode de réalisation particulier, lorsque le milieu de culture comprend l'inducteur d' autophagie, celui-ci est présent dans le milieu de culture à une concentration d'environ 2 μΜ.
Tel qu'utilisé ici, le terme « environ » fait référence à une plage de valeurs de ± 5% de la valeur spécifiée, de préférence ± 2% de la valeur spécifiée. Par exemple, «environ 20» inclut les ± 5% de 20, ou de 19 à 21.
De la même manière, dans les modes de réalisation où les CSH sont mises en présence d'un activateur de la voie HIF, la concentration de activateur peut être constante ou varier tout au long de la culture ou de la mise en contact.
De préférence, lorsque le milieu de culture comprend un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG, celui-ci est présent dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 1 μΜ et 1000 μΜ, de préférence entre 10 μΜ et 500 μΜ, de manière encore préférée entre 50 μΜ et 400 μΜ, et de manière tout particulièrement préférée entre 75 μΜ et 350 μΜ.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont mises en présence d'une hormone glucocorticoïde, de préférence la dexaméthasone, et d'un inducteur d'autophagie, de préférence le SMER28, après 10 à 15 jours de culture. De préférence, selon ce mode de réalisation, la concentration de l'hormone glucocorticoïde est comprise entre 0,01 mM et 0,5 mM, et de manière plus particulièrement préférée entre 0,02 mM et 0,1 mM et la concentration de l'inducteur d'autophagie est comprise entre 10 μΜ et 30 μΜ.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les CSH sont mises en présence d'une hormone glucocorticoïde, de préférence la dexaméthasone, et d'un inducteur d'autophagie, de préférence le SMER28, dès le premier jour de culture ou avant 10 jours de culture. De préférence, selon ce mode de réalisation, la concentration de l'hormone glucocorticoïde est comprise entre 0,01 mM et 0,5 mM, de préférence environ 0,1 mM, et la concentration de l'inducteur d'autophagie est comprise entre 2 μΜ et 30 μΜ, de préférence environ 2 μΜ.
Les CSH sont de préférence maintenues dans un milieu de culture comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d' autophagie, et optionnellement un activateur de la voie HIF, durant au moins 10 jours. De manière plus particulièrement préférée, les CSH sont maintenues dans un milieu de culture comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie durant au moins 20, 30, 40, 50 ou 60 jours.
Il est entendu que, durant cette étape, la culture cellulaire comprend non seulement des CSH mais également des progéniteurs érythroïdes.
Les inventeurs ont démontré que l'utilisation d'un milieu de culture comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie permettait d'amplifier considérablement la production de progéniteurs érythroïdes, qui ne s'engagent pas dans la voie de différentiation érythroïde terminale. Ainsi, selon le procédé selon l'invention, les CSH peuvent être cultivées dans le milieu de culture comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie durant au moins 60, 70, 80, 90 ou 100 jours. De préférence, les CSH sont cultivées dans le milieu de culture comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie durant au maximum de 70, 80, 90 ou 100 jours.
La durée de culture des CSH et le temps de mise en contact avec une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie, et optionnellement un activateur de la voie HIF, peuvent être aisément définis par l'homme du métier en évaluant la proportion de progéniteurs érythroïdes présents dans la population cellulaire. De préférence, les CSH sont mises en contact avec une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie jusqu'à obtenir une population comprenant au moins 90 % de progéniteurs érythroïdes, de préférence au moins 95% de progéniteurs érythroïdes, de manière encore préférée au moins 99% de progéniteurs érythroïdes.
La culture peut être maintenue jusqu'à l'apparition de marqueurs de la maturation en érythrocytes matures. De préférence, la culture est stoppée lorsque les cellules ne s'amplifient plus et/ou que moins de 10% d'entre elles, de préférence moins de 5% d'entre-elles expriment le récepteur membranaire CD117. Alternativement, la culture peut être stoppée lorsqu'au moins 90 %, de préférence au moins 95% des cellules en culture ont atteint le stade d'érythroblaste polychromatophile ou sont à un stade de différenciation plus avancé. Selon certains modes de réalisation, le procédé peut comprendre l'alternance de phases de culture durant lesquelles le milieu de culture comprend une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie, et optionnellement un activateur de la voie HIF, et de phases de culture durant lesquelles le milieu de culture ne comprend pas d'hormone glucocorticoïde, d'inducteur d' autophagie, et/ou d'activateur de la voie HIF.
L'hormone glucocorticoïde, l'inducteur d'autophagie et l'activateur de la voie HIF, peuvent être ajoutés ou retirés du milieu de culture de façon simultanée ou séquentielle.
Les techniques pour modifier la composition d'un milieu de culture sont bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'ajout d'une molécule ou l'augmentation de sa concentration peut se faire directement dans le milieu de culture préexistant et le retrait d'une molécule ou la diminution de sa concentration peut se faire par centrifugation des cellules et resuspension dans un nouveau milieu de culture ou par dilution du milieu de culture.
Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une étape de récupération des progéniteurs érythroïdes obtenus. Cette étape peut se faire par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par centrifugation et élimination du milieu de culture. Le procédé de l'invention peut également comprendre une étape de tri cellulaire, en particulier une étape de sélection des cellules basée sur l'expression du marqueur CDl 17. Les cellules CDl 17+ peuvent être sélectionnées afin de prolonger l'amplification des progéniteurs érythroïdes. A l'inverse, les cellules CDl 17- peuvent être sélectionnées pour produire des globules rouges.
Le procédé selon l'invention peut également comprendre une étape de lavage des progéniteurs érythroïdes obtenus/récupérés. Cette étape peut se faire par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par une succession d'étapes de centrifugation et resuspension.
Selon un aspect particulier, l'invention concerne également une population de progéniteurs érythroïdes obtenus par le procédé de l'invention.
Selon un autre aspect, l'invention concerne également l'utilisation de progéniteurs érythroïdes obtenus par le procédé selon l'invention pour la production d'érythrocytes.
Tel qu'utilisés ici les termes « globule rouge », « globule rouge mature », « hématie », « érythrocyte » et « érythrocyte mature » sont équivalents et peuvent être employés l'un pour l'autre. Le terme de « érythrocyte » se réfère à une cellule énucléée présentant des marqueurs caractéristiques de la maturation érythrocytaire. Ils expriment notamment la glycophorine A (CD235a) mais n'expriment pas le marqueur CD36.
La présente invention concerne ainsi un procédé in vitro de production d'érythrocytes comprenant :
- la production de progéniteurs érythroïdes selon le procédé de l'invention décrit ci-dessus ; et
- l'induction de la maturation des progéniteurs érythroïdes.
Les modes de réalisation décrits ci-dessus pour le procédé de production de progéniteurs érythroïdes selon l'invention sont également envisagés dans cet aspect.
La maturation des progéniteurs érythroïdes peut se traduire notamment par l'expression des marqueurs de maturation érythrocytaire tels que CD235a et par l'énucléation.
Le procédé de l'invention peut également comprendre une étape de tri cellulaire, en particulier une étape de sélection des cellules CD117-.
La maturation des progéniteurs peut être induite par toute méthode connue de l'homme du métier. La maturation peut notamment être induite par culture des progéniteurs érythroïdes dans un milieu de différenciation érythrocytaire, par exemple un milieu supplémenté en érythropoïétine et optionnellement en SMER28. De préférence, la maturation est induite par culture des progéniteurs érythroïdes dans un milieu ne comprenant pas de SCF (Stem Cell Factor), ni de dexaméthasone, et supplémenté en érythropoïétine (environ 2,5 UI/mL) ainsi qu' optionnellement en SMER28 (environ 2,5μΜ). Alternativement, la maturation est induite en plaçant les cellules dans un milieu de culture sans sérum. De préférence, la maturation des progéniteurs est induite à concentration cellulaire élevée, par exemple supérieure à 5 000000 cellules/ml de culture.
Selon un mode de réalisation, le procédé de production d'érythrocytes selon l'invention comprend en outre une étape d'élimination des cellules nucléées. Cette étape permet d'obtenir une population homogène comprenant uniquement des érythrocytes matures.
Selon un mode de réalisation particulier dans lequel les CSH utilisées dans le procédé de production des progéniteurs érythroïdes selon l'invention comprennent un gène suicide inductible, cette étape d'élimination des cellules nucléées peut être réalisée par induction de l'expression de ce gène suicide. Le procédé de production d'érythrocytes peut en outre comprendre une étape de récupération des érythrocytes obtenus. Cette étape peut se faire par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par filtration, centrifugation et élimination du milieu de culture.
Le procédé selon l'invention peut également comprendre une étape de lavage des érythrocytes obtenus/récupérés. Cette étape peut se faire par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par une succession d'étapes de filtration, centrifugation et resuspension. Selon un autre aspect, la présente invention concerne également une population d'érythrocytes obtenus par le procédé de l'invention.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant des progéniteurs érythroïdes obtenus selon le procédé de l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne également des progéniteurs érythroïdes selon l'invention, ou une composition pharmaceutique comprenant des progéniteurs érythroïdes selon l'invention, pour une utilisation en tant que greffon hématopoïétique. Tel qu'utilisé ici, le terme « greffon hématopoïétique » se réfère à un ensemble de cellules destinées à être administrées au niveau de la moelle osseuse d'un sujet et capables de produire des érythrocytes.
L'invention concerne également des progéniteurs érythroïdes selon l'invention, ou une composition pharmaceutique comprenant des progéniteurs érythroïdes selon l'invention, pour une utilisation dans le traitement d'une anémie.
Tel qu'utilisé ici, le terme « anémie » se réfère à une anomalie de l'hémogramme caractérisée par un niveau anormalement bas de globules rouges sains et une diminution du taux d'hémoglobine circulante en deçà des valeurs normales pour l'âge du sujet. A titre indicatif, une anémie est généralement caractérisée par un taux d'hémoglobine inférieur à 13g/dL pour un homme, inférieur à 12g/dL pour une femme, inférieur à 11 g/dL pour un enfant et inférieur à 14 g/dL pour un nouveau-né.
Les anémies peuvent avoir des causes variées et multiples. Des exemples d'anémies incluent, mais ne sont pas limités à, une anémie liée à une hémorragie (par exemple une hémorragie causée par un traumatisme ou une opération chirurgicale), une anémie induite par un traitement médicamenteux (par exemple une chimiothérapie) ou une exposition à des toxiques (par exemple des agents lipolytiques, des agents oxydants, le plomb, des venins ou poisons), une anémie hémolytique causée par une anomalie héréditaire de la membrane érythrocytaire (par exemple une sphérocytose héréditaire, une elliptocytose héréditaire ou une pyropoïkilocytose héréditaire), une anémie hémolytique causée par une anomalie acquise de la membrane érythrocytaire (par exemple une hémoglobinurie paroxystique nocturne ou une acanthocytose, une anémie hémolytique auto immune (par exemple un accident transfusionnel), une anémie causée par un agent infectieux (par exemple le paludisme, une infection par Babesia ou Bartonella, une trypanosomiase, une leishmaniose viscérale, une septicémie ou une infection par le CMV), une anémie sidéroblastique héréditaire ou acquise, une anémie causée par une insuffisance médullaire (par exemple aplasies médullaires, carence en vitamine B12, myélodysplasies ou envahissement médullaire par une hémopathie maligne (leucémie, lymphome, métastase), ou encore une anémie liée à une drépanocytose ou un syndrome thalassémique. De préférence, l'anémie est liée à une drépanocytose ou à un syndrome thalassémique.
L'invention concerne encore une méthode de traitement d'un patient souffrant d'une anémie comprenant l'administration audit patient d'une quantité thérapeutiquement efficace de progéniteurs érythroïdes obtenus par le procédé de l'invention, ou d'une composition pharmaceutique comprenant des progéniteurs érythroïdes obtenus selon l'invention.
L'invention concerne également l'utilisation de progéniteurs érythroïdes obtenus selon l'invention, ou une composition pharmaceutique comprenant lesdits progéniteurs pour la préparation d'un médicament, en particulier un médicament biologique, destiné au traitement d'une anémie.
Tel qu'utilisé ici, le terme de « médicament biologique » se réfère à un médicament dont la substance active est produite à partir d'une source biologique ou en est extraite.
De préférence, dans cet aspect, les progéniteurs érythroïdes sont obtenus à partir de CSH non génétiquement modifiées.
Tel qu'utilisés ici, les termes « sujet » et « patient » sont équivalents et peuvent indifféremment être employés l'un pour l'autre. Ces termes font de préférence référence à un animal, en particulier un mammifère, de manière tout particulièrement préférée un humain, notamment, un fœtus, un nouveau-né, un enfant, un adolescent, un adulte ou une personne âgée. Tel qu'utilisé ici, le terme « fœtus » se réfère à un stade de développement intra-utérin de plus de 8 semaines de grossesse, le terme « nouveau-né » se réfère à un être humain âgé de moins de 12 mois, le terme «enfant » se réfère à un être humain âgé de 1 à 12 ans, le terme « adulte » se réfère à un être humain âgé de 12 à 60 ans et le terme « personne âgée » se réfère à un être humain âgé de 60 ans ou plus.
Le patient est de préférence un patient en échec de transfusion, polytransfusé, ou présentant un groupe sanguin rare. Selon un mode préféré, ce patient souffre d'une anémie, en particulier une anémie liée à une drépanocytose ou à un syndrome thalassémique.
Tel qu'utilisé ici, le terme « échec de transfusion » se réfère à une transfusion inefficace et/ou induisant des complications pathologiques chez le patient.
Une transfusion érythrocytaire peut être considérée comme inefficace lorsque, 24 heures après une transfusion de concentrés de globules rouges (CGR), le rendement transfusionnel est inférieur à 80%.
Le rendement transfusionnel érythrocytaire (RTE) est calculé par la formule :
(taux HB iprès transfusion) · (taux Hb avant transfusion)
RTE = : 1 100
quantité tf'HB transfusés / VST du patient
La quantité d'HB transfusée minimale est de 40g, la moyenne constatée est de 50g. VST désigne le volume sanguin total.
Les complications pathologiques associées à un échec transfusionnel peuvent être la conséquence d'une transfusion immunisante (allo immunisation transfusionnelle) qui peut se révéler des années après et compromettre l'avenir transfusionnel du patient. En effet, lors d'une nouvelle transfusion, l'immunisation antérieure peut soit provoquer un danger hémolytique direct (si les anticorps sont présents à un titre suffisant), soit, le plus souvent, provoquer une hémolyse retardée (si les anticorps sont présents à un titre faible ou même non décelable sérologiquement lors de la nouvelle transfusion).
Tel qu'utilisé ici, le terme « polytransfusé » se réfère à un patient ayant subi plusieurs transfusions sanguines et/ou à un patient ayant déjà eu une transfusion sanguine et devant en recevoir une autre.
Tel qu'utilisé ici, le terme « groupe sanguin rare » se réfère à un groupe sanguin dont la fréquence dans la population française et/ou européenne et/ou mondiale est inférieure à 1/250 et/ou à un groupe sanguin dont le patient qui le porte ne peut pas être transfusé par du sang 0-. Les sangs rares présentent des difficultés d'approvisionnement.
Dans le domaine des applications vétérinaires, le sujet de l'invention peut être un animal non-humain, de préférence un animal de compagnie ou d'élevage, par exemple sélectionné dans le groupe constitué des chiens, chats, bovins, ovins, lapins, porcs, caprins, équidés, rongeurs, primates non-humains et volailles.
Tel qu'utilisé ici, le terme « traitement » se réfère à tout acte visant une amélioration ou disparition des symptômes, un ralentissement de la progression de la maladie, un arrêt de l'évolution de la maladie ou une disparition de la maladie. Ce terme se réfère plus particulièrement à une augmentation du niveau de globules rouges sains et du taux d'hémoglobine circulante, de préférence pour atteindre des valeurs normales pour l'âge du sujet. Ce terme englobe aussi bien le traitement préventif que curatif. Le terme « quantité thérapeutiquement efficace » tel qu'utilisé ici, se réfère à une quantité suffisante pour avoir un effet sur au moins un symptôme de la pathologie, et plus particulièrement pour augmenter le niveau de globules rouges sains et du taux d'hémoglobine circulante chez le sujet traité.
Tel qu'utilisé ici, les termes « véhicule pharmaceutiquement acceptable » et « support pharmaceutiquement acceptable » sont équivalents et se réfèrent à toute substance autre qu'un principe actif présent dans une composition pharmaceutique. Son addition est notamment destinée à faciliter la conservation et l'administration des cellules, sans en modifier les propriétés. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable utilisé pour la formulation de compositions comprenant des érythrocytes ou des progéniteurs érythrocytaires selon l'invention peut être, par exemple, sélectionné dans le groupe constitué de sérum physiologique, de solution PBS additionné d'albumine sérique humaine, et des mélanges de ceux-ci, ou toute autre solution saline ayant une osmolarité adaptée à la conservation des érythrocytes et/ou des progéniteurs et, de préférence, pouvant être directement administrée au sujet. Pour la formulation de compositions comprenant des érythrocytes, un milieu SAGM (Saline Adénine Glucose Mannitol) peut également être utilisé comme véhicule pharmaceutiquement acceptable, seul ou en combinaison avec les autres véhicules pharmaceutiquement acceptable listés ci-dessus.
De préférence, l'administration des progéniteurs, ou greffe, est réalisée au niveau de la moelle osseuse du patient ou par injection intraveineuse. Selon un mode de réalisation préférée, les cellules souches hématopoïétiques utilisées pour produire les progéniteurs érythroïdes sont issues d'un prélèvement réalisé chez un donneur ou dérivent de cellules obtenues chez un donneur et les progéniteurs érythroïdes sont destinés à être transplantées chez un patient receveur. Le donneur et le receveur peuvent être le même individu (greffe autologue) ou des individus différents (greffe allogénique). De préférence, le donneur et le receveur sont le même individu.
Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique ou un médicament, en particulier un médicament biologique, comprenant des érythrocytes obtenus selon le procédé de l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne également des érythrocytes obtenus par le procédé de l'invention ou une composition pharmaceutique comprenant des érythrocytes obtenus selon l'invention, pour la transfusion de patients souffrant d'anémie, c'est-à-dire nécessitant un apport en érythrocytes.
L'invention concerne encore une méthode de traitement d'un patient souffrant d'anémie, c'est-à-dire nécessitant un apport en érythrocytes, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficaces d' érythrocytes obtenus par le procédé de l'invention, ou d'une composition pharmaceutique comprenant des érythrocytes selon l'invention.
L'invention concerne également des érythrocytes obtenus par le procédé de l'invention ou une composition pharmaceutique comprenant des érythrocytes obtenus selon l'invention, pour une utilisation dans le traitement d'une anémie.
De préférence l'anémie est une anémie liée à une drépanocytose ou à un syndrome thalassémique.
De préférence, les patients sont en échec de transfusion, sont des polytransfusés ou présentent un sang rare.
Dans le cadre d'une médecine personnalisée, les érythrocytes à administrer ou administrés au patient sont obtenus selon un procédé in vitro de production de globules rouges comprenant :
- l'obtention de CSH à partir d'un échantillon provenant dudit patient ;
- l'obtention de progéniteurs érythroïdes à partir desdites CSH selon le procédé de l'invention; et - l'obtention d'érythrocytes à partir desdits progéniteurs érythroïdes selon le procédé de l'invention.
Les CSH peuvent être obtenues à partir d'un échantillon de sang ou de moelle osseuse du patient. Alternativement, les CSH peuvent être obtenues à partir de CSPi obtenues par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées obtenues à partir du patient.
Les CSH peuvent optionnellement être génétiquement modifiées tel que décrit précédemment. Selon un autre aspect, la présente invention concerne en outre des CSH génétiquement modifiées afin de surexprimer :
(i) un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant HTERT, BMIl, c-MYC, 1-MYC et MYB, et une combinaison de ceux-ci, de préférence HTERT et/ou BMIl, et de manière plus particulièrement préférée HTERT et BMIl ; et (ii) un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL- XL et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée BCL-XL ; et/ou
(iii) un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant GATAI , TAL1 , KLF1 , LDB 1 , LM02 et SCL, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée LM02.
Les modes de réalisation concernant les CSH utilisées dans le procédé de production de progéniteurs érythroïdes sont également envisagées dans cet aspect.
Selon un mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer le gène codant HTERT sous le contrôle d'un promoteur inductible et le gène codant pour BCL-XL sous le contrôle d'un promoteur constitutif.
Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer les gènes codant HTERT, BMIl et LM02 sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.
Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer les gènes codant HTERT et BMIl sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles et le gène codant BCL-XL sous le contrôle d'un promoteur constitutif. Les CSH génétiquement modifiées peuvent également contenir un gène suicide tel que décrit précédemment ou être immortalisées.
La présente invention concerne également l'utilisation de CSH génétiquement modifiées selon l'invention pour la production, de préférence in vitro, de progéniteurs érythroïdes et/ou d'érythrocytes, notamment selon les procédés de l'invention décrits ci- dessus.
Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne un milieu de culture cellulaire adapté aux exigences nutritionnelles des CSH, et en particulier adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique, et comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d' autophagie, et optionnellement un activateur de la voie HIF.
Les modes de réalisation concernant le milieu comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d' autophagie, et optionnellement un activateur de la voie HIF, utilisé dans le procédé de production de progéniteurs érythroïdes sont également envisagées dans cet aspect.
L'hormone glucocorticoïde et l'inducteur d'autophagie sont tels que définis ci- dessus concernant le procédé selon l'invention. De préférence, l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone et/ou l'inducteur d'autophagie est le SMER28 et/ou l'activateur de la voie HIF est le DMOG.
La base du milieu de culture cellulaire adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique peut être toute base connue par l'homme du métier pour subvenir aux besoins des CSH et/ou progéniteurs érythroïdes.
Tel qu'utilisé ici, le terme « croissance » se réfère à la multiplication des cellules.
Le terme « différentiation » se réfère à l'acquisition par les cellules cultivées de caractéristiques qui n'étaient pas présentes dans les cellules initialement utilisées pour ensemencer le milieu. Dans le cas présent, ce terme se réfère à l'acquisition de caractéristiques des progéniteurs érythroïdes. Un milieu adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique est donc un milieu permettant la différentiation des CSH en progéniteurs érythroïdes ainsi que la multiplication des CSH et des progéniteurs érythroïdes. Ce terme ne doit pas être confondu avec la « maturation » qui définit ici le processus par lequel les progéniteurs érythroïdes vont devenir des globules rouges et qui implique notamment l'énucléation des cellules. Le milieu adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique ne contient donc, de préférence, aucun composé induisant cette maturation.
La base du milieu de culture cellulaire peut notamment être un milieu de Dulbecco modifié selon Iscove (milieu IMDM) ou un milieu équivalent adapté aux exigences nutritionnelles des CSH (par exemple le milieu SFEM de Stemspan (Stemcell technologies) ou le milieu StemMACS HSC Expansion Media XF, human, Invitrogen), complémenté avec de l'insuline, de la transferrine, du SCF (Stem Cell Factor), de l'héparine, de l'IL-3, de ΕΡΟ, des facteurs de croissance, et/ou du sérum, plasma, lysat plaquettaire et/ou pool de sérum. Les composés ajoutés au milieu sont de préférence des composés humains obtenus par des techniques recombinantes ou de purification. Les concentrations de ces différents composés sont aisément déterminées par l'homme du métier sur la base des recommandations des fournisseurs ou des connaissances générales du domaine.
Tel qu'utilisé ici, le terme de « pool de sérum » se réfère à un mélange de plasmas humains AB (le plus souvent un mélange de plus de 100 plasmas différents) viro-atténués. Pour ce faire, des plasmas AB provenant de centres de transfusion sont mélangés, viro- atténués et enfin aliquotés. Le pool de sérum peut alors être utilisé frais ou conservé congelé.
Tel qu'utilisé ici, le terme de « lysat plaquettaire » se réfère à un produit riche en facteurs de croissance qui est obtenu à la suite de la lyse de concentrés plaque ttaires. Pour ce faire, des concentrés plaquettaires provenant de centres de transfusion peuvent être mélangés avant d'être lysés. Il existe différentes méthodes de lyse bien connues de l'homme du métier, en particulier une lyse par ultrasons, par l'utilisation de solvants et/ou de détergents, ou encore par cryolyse. De préférence, les concentrés plaquettaires sont lysés par cryolyse. La cryolyse consiste en des cycles de congélation/décongélation, en général deux cycles, provoquant la rupture des plaquettes et le relargage dans le plasma des facteurs de croissance qu'elles contiennent. Optionnellement, la lyse peut être suivie d'une centrifugation et/ou d'une filtration. Le lysat plaquettaire peut alors être utilisé frais ou conservé congelé.
De préférence, la base du milieu selon l'invention est un milieu IMDM tel que défini ci-dessus ou un milieu équivalent, supplémenté en : transferrine, de préférence transferrine humain, à une concentration comprise entre environ 200 μg/mL et environ 400 μg/mL, de préférence entre environ 300 μg/mL et environ 350 μg/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 330 μg/mL ; et/ou
- insuline, de préférence insuline humain, à une concentration comprise entre environ 1 μg/mL et environ 50 μg/mL, de préférence entre environ 5 μg/mL et environ 20 μg/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 10 μg/mL ; et/ou
du sérum, plasma ou pool de sérum, de préférence humains, à une concentration comprise entre environ 1 % et environ 10 %, de préférence entre environ 3 % et environ 7 %, de manière encore préféré à une concentration d'environ 5%, et/ou un lysat plaquettaire, de préférence d'origine humaine, à une concentration comprise entre environ 0,05% et environ 0,5 %, de préférence entre environ 0,1 % et environ 0,5 %, de manière encore préféré à une concentration d'environ 0,3 %; et/ou
héparine, de préférence héparine humaine, à une concentration comprise entre environ 0,5 U/mL et environ 10 U/mL, de préférence entre environ 1 U/mL et environ 5 U/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 3 U/mL.
Optionnellement, en particulier pour un milieu de culture adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique, le milieu peut être également supplémenté en :
IL-3 , de préférence IL-3 humaine, à une concentration comprise entre environ 1 ng/mL et environ 20 ng/mL, de préférence entre environ 3 ng/mL et environ 7 ng/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 5 ng/mL ;
SCF, de préférence humain, à une concentration comprise entre environ 10 ng/mL et environ 200 ng/mL, de préférence entre environ 50 ng/mL et environ 150 ng/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 100 ng/mL ; et ou
- EPO, de préférence humaine, à une concentration comprise entre environ 0,5
IU/mL et environ 10 IU/mL, de préférence entre environ 1 IU/mL et environ 5 IU/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 2 IU/mL. Dans un mode de réalisation particulier, la base du milieu de culture selon l'invention est de préférence un milieu IMDM tel que défini ci-dessus ou un milieu équivalent, et comprend de la transferrine, de l'insuline, de l'héparine, et du sérum, plasma, pool de sérum ou lysat plaquettaire, de préférence la transferrine, de l'insuline, de l'héparine et du pool de sérum ou un lysat plaquettaire, de manière plus particulièrement préférée, de la transferrine, de l'insuline, de l'héparine et un lysat plaquettaire. Ces composés sont de préférence utilisés à des concentrations telles que décrites ci-dessus.
Dans un mode de réalisation préféré, ce milieu comprend en outre de l'IL-3, du
SCF et de ΕΡΟ, de préférence à des concentrations telles que décrites ci-dessus.
Alternativement, le milieu peut comprendre du SCF et de ΕΡΟ, de préférence à des concentrations telles que décrites ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulier, la base du milieu selon l'invention comprend :
de la transferrine, de préférence de la transferrine humain, à une concentration comprise entre 300 μg/mL et 350 μg/mL;
de l'insuline, de préférence de l'insuline humain, à une concentration comprise entre 5 μg/mL et 20 μg/mL ;
du sérum, plasma ou pool de sérum, de préférence humains, à une concentration comprise entre 3 % et 7 %, et/ou un lysat plaquettaire, de préférence d'origine humaine, à une concentration comprise entre 0,1 % et 0,5
%; et
de l'héparine, de préférence de l'héparine humaine, à une concentration comprise entre 1 U/mL et 5 U/mL,
et optionnellement,
de l'IL-3, de préférence de l'IL-3 humaine, à une concentration comprise entre 3 ng/mL et 7 ng/mL;
du SCF, de préférence humain, à une concentration comprise entre 50 ng/mL et 150 ng/mL ; et/ou
de ΕΡΟ, de préférence humaine, à une concentration comprise entre 1 IU/mL et 5 IU/mL. Le milieu selon l'invention comprend, ajouté à cette base, (i) un inducteur d' autophagie, de préférence du SMER-28, (ii) une hormone glucocorticoïde, de préférence de la dexaméthasone, et optionnellement (iii) un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG.
Selon un mode de réalisation particulier, le milieu selon l'invention comprend, ajouté à cette base:
une hormone glucocorticoïde, de préférence de la dexaméthasone, à une concentration comprise entre 0,001 mM et 10 mM, de préférence entre 0,002 mM et 1 mM, de manière encore préférée entre 0,005 mM et 0,5 mM, et de manière tout particulièrement préférée entre 0,01 mM et 0,1 mM ; et un inducteur d'autophagie, de préférence du SMER-28, à une concentration comprise entre 0,1 μΜ et 100 μΜ, de préférence entre 0,5 μΜ et 50 μΜ, de manière encore préférée entre 1 μΜ et 30 μΜ, et de manière tout particulièrement préférée entre 2 μΜ et 30 μΜ ; et
optionnellement, un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG, à une concentration comprise entre 1 μΜ et 1000 μΜ, de préférence entre 10 μΜ et 500 μΜ, de manière encore préférée entre 50 μΜ et 400 μΜ, et de manière tout particulièrement préférée entre 75 μΜ βί 350 μΜ.
Dans un mode de réalisation particulier, le milieu selon l'invention comprend entre 0,005 mM et 0,5 mM d'une hormone glucocorticoïde, de préférence de la dexaméthasone, entre 0,5 μΜ et 50 μΜ d'un inducteur d'autophagie, de préférence du SMER-28, et optionnellement entre 50 μΜ et 400 μΜ d'un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le milieu selon l'invention comprend entre 0,01 mM et 0,1 mM d'une hormone glucocorticoïde, de préférence de la dexaméthasone, entre 2 μΜ et 30 μΜ d'un inducteur d'autophagie, de préférence du SMER-28, et optionnellement entre 75 μΜ et 350 μΜ d'un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG.
De préférence, le milieu selon l'invention ne comprend pas de sérum d'origine non humaine (par exemple du sérum de veau fœtal), de thrombopoïétine, de facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), d'IL-6, de BMP (protéine osseuse morphogénétique), de FLT3-ligand et/ou d' hydrocortisone.
La présente invention concerne également l'utilisation du milieu de culture cellulaire selon l'invention et tel que décrit ci-dessus pour la production et/ou l'amplification de progéniteurs erythroïdes et/ou la production d'érythrocytes, notamment selon les procédés de l'invention décrits ci-dessus, et plus particulièrement pour stimuler la différentiation des CSH en progéniteurs érythroïdes et/ou pour amplifier des progéniteurs érythroïdes.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne encore une trousse comprenant :
un milieu de culture cellulaire selon l'invention; et/ou
des CSH génétiquement modifiées selon l'invention ou des constructions génétiques permettant d'obtenir les CSH génétiquement modifiées selon l'invention; et
optionnellement, un guide contenant des instructions pour l'utilisation d'une telle trousse. La présente invention concerne également l'utilisation d'une trousse selon l'invention pour produire des progéniteurs érythroïdes et/ou des érythrocytes, notamment selon les procédés de l'invention décrits ci-dessus.
Toutes les références citées dans cette demande, y compris les articles de journaux ou les résumés, les demandes de brevets publiées, les brevets délivrés ou tout autre référence, sont entièrement incorporées ici par référence, ce qui inclus tous les résultats, tables, figures et textes présentés dans ces références.
Bien qu'ayant des sens différents, les termes « comprenant », « ayant », « contenant » et « consistant en » peuvent être remplacés l'un par l'autre dans toute la description de l'invention.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif. EXEMPLES
Exemple 1 : Amplification de progéniteurs érythroïdes à partir de CSH issues de sang de cordon et de cytaphérèse
Matériels et méthodes Milieu utilisé : Milieu IMDM (Biochrom), supplémenté en transferrine (330 μg/mL), insuline (10 μg/mL), pool de sérum AB (EFS) 5% et héparine (3 U/mL). De J0 à J7, le milieu a été supplémenté en IL-3 (5 ng/mL), SCF (100 ng/mL) et EPO (2 IU/mL). A partir de J7 et jusqu'à la fin de l'amplification des progéniteurs érythroblastiques le milieu a été supplémenté en SCF (100 ng/mL) et EPO (2 IU/mL).
CSH :
Elles sont obtenues après une séparation magnétique grâce à des billes CD34+ selon le protocole fourni par Milenyi (cf. CD34 MicroBead Kit human de Miltenyi Biotec). Entretien des cellules :
A J0 les cellules ont été ensemencées à une concentration de 10 000 cellules/ml, à J4 les cellules ont été diluées au 1/5 dans du milieu neuf, à J7 les cellules ont été lavées et mises en culture à 100 000 cellules/ml dans du milieu neuf. A Jl 1 les cellules ont été diluées à 100 000 cellules/ml et ensemencées dans un milieu neuf. A J14 les cellules ont été réensemencées à 300 000 cellules/ml dans un milieu neuf. A J18 les cellules ont été diluées à 0,5 million/ml. A partir de J21 les cellules ont été systématiquement remises à 1 million/ml à chaque jour d'entretien (i.e. deux fois par semaine).
Protocoles de culture :
Protocole 1 : De J0 à Jl 1 les cellules sont cultivées dans le milieu de base. A Jl 1 le milieu utilisé est supplémenté avec 253,9 μΜ de DMOG. A J14 le milieu utilisé est additionné de 333 μΜ de DMOG, de 0,02 mM de DEX (dexaméthasone) et de 30 μΜ de SMER28. Le milieu utilisé à J18 est complété par 0,09 mM de DEX et 20,1 μΜ de SMER28. A J21, 0,10 mM de DEX et 24,5 μΜ de SMER28 ont été ajoutés au milieu utilisé, celui de J25 a été additionné de 0,10 mM de DEX et de 17,4 μΜ de SMER28. Enfin, à partir du 28ème jour, le milieu a été systématiquement supplémenté avec 0,10 mM de DEX et 13,8 μΜ de SMER28.
Protocole 2 : de J0 à la fin de la culture le milieu est complémenté par 0, 1 mM de DEX et 2,27μΜ de SMER28.
Protocole 3 : de J0 à la fin de la culture le milieu est complémenté par 0, 1 mM de
DEX.
Protocole 4 : ce protocole est le protocole contrôle, il a été réalisé avec le milieu de base sans addition de facteur. Cytométrie de flux :
Un échantillon de 100 000 cellules est prélevé et lavé, les cellules sont alors mises en présence des anticorps CD235a et CDl 17, selon les instructions du fournisseur. Après 30 min à température ambiante et dans le noir, les cellules sont lavées 2 fois avec du PBS. Les cellules sont alors prêtes pour être analysées au cytomètre.
L'anticorps CD235a reconnaît spécifiquement la glycophorin A qui signe l'engagement érythroïde mature ;
L'anticorps CDl 17 reconnaît spécifiquement le récepteur c-kit (ie le récepteur au Stem cell factor) qui signe l'immaturité, la souchitude et la capacité d'auto-renouvèlement des cellules
Comptage des cellules :
Les cellules sont diluées au dixième dans une solution de bleu trypan, ce qui permet d'évaluer la mortalité cellulaire si besoin.
Résultats
Figure imgf000039_0001
Tableau 1 : Comptage des cellules après culture selon différents protocoles Les protocoles 1 et 2 permettent une amplification exponentielle des érythroblastes. L'amplification obtenue avec les protocoles 1 et 2 est également largement supérieure à celle obtenue avec de la dexaméthasone seule (cf. tableau 1). Il est également intéressant de noter que les protocoles 1 et 2 permettent une amplification de progéniteurs érythroïdes à partir de cellules CD34+ issues de cytaphérèse ou de sang de cordon.
Le marqueur C-KIT perdure dans ces conditions beaucoup plus longtemps que dans les conditions contrôles (cf. figure 1), ce marqueur membranaire signe la jeunesse des cellules ainsi que leur capacité à proliférer.
Ces travaux ont ainsi permis de démontrer que la culture des cellules souches hématopoïétiques humaines dans un milieu de culture selon l'invention permet d'obtenir:
des cellules ayant un engagement érythroïde total ;
un enrichissement et une amplification exponentielle des progéniteurs érythroïdes.
En particulier, l'amplification peut durer jusqu'à 78 jours.
Exemple 2 : Amplification de progéniteurs érytrhoïdes à partir de CSH ingéniérées issues de cytaphérèse surexprimant de manière inductible HTERT, BMI1 et de manière constitutive BCL-XL ou surexprimant de manière inductible HTERT, BMI1 et LM02
Matériels et méthodes
Milieu utilisé : Milieu IMDM (Biochrom), supplémenté en transferrine (330 μg/mL), insuline (10 μg/mL), pool de sérum AB (EFS) 5% et héparine (3 U/mL). De J0 à J7, le milieu a été supplémenté en IL-3 (5 ng/mL), SCF (100 ng/mL) et EPO (2 IU/mL). A partir de J7 et jusqu'à la fin de l'amplification des progéniteurs érythroblastiques le milieu a été supplémenté en SCF (100 ng/mL) et EPO (2 IU/mL).
CSH Les CSH sont obtenues à partir de cytaphérèses après une séparation magnétique grâce à des billes CD34+ Miltenyi.
Entretien des cellules :
A J0 les cellules ont été ensemencées à une concentration de 100 000 cellules/ml, pour deux infections successives avec le surnageant lentiviral HTERT BMIl et le surnageant rétroviral BCL-XL ou le surnageant lentiviral HTERT BMIl et le surnageant lentiviral LM02; à J3 les cellules ont été lavées 3 fois et réensemencées à une concentration de 10 000 cellules/ml, à J4 les cellules ont été diluées au 1/5 dans du milieu neuf. A J7 les cellules ont été lavées et mises en culture à 100 000 cellules/ml dans du milieu neuf. A Jl 1 les cellules ont été diluées à 100 000 cellules/ml et ensemencées dans un milieu neuf. A J14 les cellules ont été réensemencées à 300 000 cellules/ml dans un milieu neuf. A J18 les cellules ont été diluées à à 0,5 million/ml. A partir de J21 les cellules ont été systématiquement remises à 1 million/ml à chaque jour d'entretien (ie deux fois par semaine).
Protocoles de culture :
Protocole 1 : De J0 à Jl 1 les cellules sont cultivées dans le milieu de base. A Jl 1 le milieu utilisé est supplémenté avec 253,9 μΜ de DMOG. A J14 le milieu utilisé est additionné de 333 μΜ de DMOG, de 0,02 mM de DEX (dexaméthasone) et de 30 μΜ de SMER28. Le milieu utilisé à J18 est complété par 0,09 mM de DEX et 20,1 μΜ de SMER28. A J21, 0,10 mM de DEX et 24,5 μΜ de SMER28 ont été ajoutés au milieu utilisé, celui de J25 a été additionné de 0,10 mM de DEX et 17,4 μΜ de SMER28. Enfin, à partir du 28ème jour le milieu a été systématiquement supplémenté avec 0,10 mM de DEX et 13,8 μΜ de SMER28.
Protocole 2 : de J0 à la fin de la culture le milieu est complémenté par 0, 1 mM de DEX et 2,27μΜ de SMER28.
Protocole 3 : de J0 à la fin de la culture le milieu est complémenté par 0, 1 mM de
DEX.
Protocole 4 : ce protocole est le protocole contrôle, il a été réalisé avec le milieu de base sans addition de facteur. Résultats
Figure imgf000042_0001
Les protocoles 1 et 2 permettent une amplification exponentielle des érythroblastes avec les deux modèles de CSH ingéniérées (cf. tableau 2). L'amplification obtenue avec les protocoles 1 et 2 est également largement supérieure à celle obtenue avec de la dexaméthasone seule.
Le marqueur C-KIT perdure dans ces conditions beaucoup plus longtemps que dans les contrôles, ce marqueur membranaire signe la jeunesse des cellules ainsi que leur capacité à proliférer (cf. figures 2 et 3). Le protocole 2 permet une amplification supérieure avec les deux types de CSH ingéniéries.
Ces amplifications sont remarquables car les cellules ingéniérées sont des CD34+ issues de cytaphérèse qui sont connues pour leur faible taux d'amplification (par rapport au CD34+ de sang de cordon).
Avec ces protocoles de cellules ingéniérées, des cellules CD34+ issues de cytaphérèse acquièrent des capacités d'amplification supérieures à des cellules CD34+ issues de sang de cordon.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé in vitro de production de progéniteurs érythroïdes comprenant la mise en contact de cellules souches hématopoïétiques avec un milieu de culture cellulaire comprenant un inducteur d' autophagie et une hormone glucocorticoïde.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'inducteur d' autophagie est sélectionné dans le groupe constitué du SMER-28 (Small Molécule Enhancer of Rapamycin 28), SMER-10 et SMER-18, et d'une combinaison de ceux-ci.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'inducteur d'autophagie est le SMER-28.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisone, la prednisolone et la dexaméthasone.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le milieu de culture comprend en outre un activateur de la voie HIF (Hypoxya Inductible Factor), de préférence un inhibiteur de la prolyl hydroxylase (PHIS), et de manière encore préférée du DMOG (diméthyloxalylglycine).
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont obtenues par différenciation de cellules souches pluripotentes, en particulier des cellules souches embryonnaires (ES) ou des cellules souches pluripotentes induites (iPS), ou sont isolées à partir d'un échantillon de sang de patient, de sang de cordon ombilical ou placentaire, ou encore à partir d'un échantillon de moelle osseuse.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont des cellules souches hématopoïétiques humaines.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont génétiquement modifiées pour surexprimer un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué de HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion région 1 homolog), c- MYC, 1-MYC et MYB.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont génétiquement modifiées pour surexprimer le gène HTERT.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont génétiquement modifiées pour surexprimer le gène BMIl.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont génétiquement modifiées pour surexprimer le gène HTERT et le gène BMI1.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué de HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion région 1 homolog), c-MYC, 1- MYC et MYB, sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont en outre génétiquement modifiées pour surexprimer :
- un ou plusieurs facteurs de transcription de la voie des CEN (Core Erythroid Network), de préférence LM02 (LIM domain only 2) ; et/ou
- un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence BCL-XL (B-cell Lymphoma-extra large).
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont en outre génétiquement modifiées pour surexprimer le gène BCL-XL.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 14 et 16, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont en outre génétiquement modifiées pour surexprimer le gène LM02.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, dans lequel le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes de la voie EPO- R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence BCL-XL, sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs constitutifs.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, dans lequel le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes des facteurs de transcription de la voie des CEN (Core Erythroid Network), de préférence LM02 (LIM domain only 2), sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont immortalisées et/ou comprennent un gène suicide.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, dans lequel le milieu de culture est un milieu adapté aux exigences nutritionnelles des cellules souches hématopoïétiques, en particulier adapté à la croissance et/ou la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, dans lequel les cellules sont cultivées dans ledit milieu de culture pendant au moins 20 jours, de préférence pendant au moins 40 jours, de manière encore préféré pendant au moins 60 jours.
23. Utilisation d'un milieu de culture cellulaire tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 21, pour la production et/ou l'amplification de progéniteurs érythroïdes.
24. Cellule souche hématopoïétique génétiquement modifiée telle que définie dans l'une quelconque des revendications 10 à 20.
25. Utilisation d'une cellule souche hématopoïétique selon la revendication 24 pour la production in vitro de progéniteurs érythroïdes et/ou d'érythrocytes.
26. Procédé in vitro de production d'érythrocytes comprenant :
- la production de progéniteurs érythroïdes selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 22 ; et
- l'induction de la maturation des progéniteurs érythroïdes,
- et optionnellement la récupération des érythrocytes obtenus.
27. Procédé selon la revendication 26, dans lequel la maturation des progéniteurs érythroïdes est induite par culture desdits progéniteurs dans un milieu de différenciation érythrocytaire.
28. Milieu de culture cellulaire adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique et comprenant une hormone glucocorticoïde, de préférence de la dexaméthasone, et un inducteur d'autophagie, de préférence du SMER- 28, et optionnellement un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG.
29. Milieu de culture cellulaire selon la revendication 28, comprenant - une hormone glucocorticoïde à une concentration comprise entre 0,01 mM et 0,1 mM, et/ou
- un inducteur d'autophagie à une concentration comprise entre 2 μΜ et 30 μΜ, et/ou
- un activateur de la voie HIF à une concentration comprise entre 75 μΜ et 350 μΜ.
30. Milieu de culture cellulaire selon la revendication 28 ou 29, dans lequel l'inducteur d'autophagie est sélectionné dans le groupe constitué du SMER-28 (Small Molécule Enhancer of Rapamycin 28), SMER-10 et SMER-18, et d'une combinaison de ceux-ci.
31. Milieu de culture cellulaire selon la revendication 28 ou 29, dans lequel l'inducteur d'autophagie est le SMER-28.
32. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 31, dans lequel l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci.
33. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 32, dans lequel l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisone, la prednisolone et la dexaméthasone.
34. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 33, dans lequel l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone.
35. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 34, dans lequel le milieu de culture comprend en outre un activateur de la voie HIF (Hypoxya
Inductible Factor), de préférence un inhibiteur de la prolyl hydroxylase (PHIS), et de manière encore préférée du DMOG (diméthyloxalylglycine).
36. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 35, comprenant en outre (i) de la transferrine, (ii) de l'insuline, (iii) de l'héparine, et (iv) du sérum, plasma, pool de sérum ou lysat plaquettaire, de préférence du lysat plaquettaire.
37. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 36, comprenant en outre du SCF (Stem Cell Factor) et de ΕΡΟ, de optionnellement de l'IL- 3.
38. Utilisation d'un milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 37 pour produire et/ou amplifier des progéniteurs érythroïdes.
39. Trousse pour la production de progéniteurs érythroïdes et/ou d'érythrocytes comprenant :
- un milieu de culture cellulaire tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, 21, et 28 à 37; et/ou
- des cellules souches hématopoïétiques génétiquement modifiées selon la revendication 24 ; et
- optionnellement, un guide contenant des instructions pour l'utilisation d'une telle trousse.
40. Utilisation d'une trousse selon la revendication 39 pour produire des progéniteurs érythroïdes et/ou des érythrocytes.
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