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WO2016207104A1 - Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-b7h3-antikörpern - Google Patents

Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-b7h3-antikörpern Download PDF

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WO2016207104A1
WO2016207104A1 PCT/EP2016/064158 EP2016064158W WO2016207104A1 WO 2016207104 A1 WO2016207104 A1 WO 2016207104A1 EP 2016064158 W EP2016064158 W EP 2016064158W WO 2016207104 A1 WO2016207104 A1 WO 2016207104A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
alkyl
cooh
seq
represented
bhc
Prior art date
Application number
PCT/EP2016/064158
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-Georg Lerchen
Anne-Sophie Rebstock
Yolanda Cancho Grande
Sven WITTROCK
Sandra Berndt
Uwe Gritzan
Jenny FITTING
Beatrix Stelte-Ludwig
Patrick Jones
Christoph Mahlert
Christian Votsmeier
Dorian SCHÖNFELD
Mark Trautwein
Ernst Weber
Nikolaus Pawlowski
Simone Greven
Julian Glück
Stefanie Hammer
Lisa Dietz
Stephan MÄRSCH
Original Assignee
Bayer Pharma Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Pharma Aktiengesellschaft filed Critical Bayer Pharma Aktiengesellschaft
Priority to US15/739,471 priority Critical patent/US11071788B2/en
Priority to CA2990411A priority patent/CA2990411A1/en
Priority to EP16733024.0A priority patent/EP3313522A1/de
Priority to JP2017565712A priority patent/JP6905941B2/ja
Priority to CN201680049039.XA priority patent/CN108025086A/zh
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • ADCs Antibody-drug conjugates
  • the invention relates to binder-drug conjugates (ADCs) of kinesin spindle protein inhibitors, to active metabolites of these ADCs, to methods of producing these ADCs, to the use of these ADCs for the treatment and / or prevention of diseases and to the use of these ADCs for the preparation of medicaments for the treatment and / or prevention of diseases, in particular hyperproliferative and / or angiogenic diseases such as, for example, cancer.
  • ADCs binder-drug conjugates
  • Such treatments may be monotherapy or in combination with other medicines or other therapeutic measures.
  • Cancers are the result of uncontrolled cell growth of various tissues. In many cases, the new cells invade existing tissues (invasive growth) or they metastasize to distant organs. Cancers occur in various organs and often have tissue-specific disease courses. Therefore, the term cancer as a generic term describes a large group of defined diseases of various organs, tissues and cell types.
  • early stage tumors may be removed by surgical and radiotherapeutic measures.
  • metastatic tumors can only be treated palliatively by chemotherapeutic agents.
  • the goal here is to achieve the optimal combination of improving the quality of life and extending the lifetime.
  • ADCs antibody drug conjugates
  • cytotoxic agent itself or another cytotoxic metabolite formed therefrom is released within the tumor cell, where it can exert its direct and selective action
  • damage to normal tissue could be kept to a significantly lower limit than conventional chemotherapy for cancer [see, eg, JM Lambert, Curr. Opin. Pharmacol., 5, 543-549 BHC 15 1 040-A
  • WO2012 / 171020 describes ADCs in which several toxophore molecules are linked to an antibody via a polymeric linker.
  • the substances SB 743921, SB 715992 (isospinesib), MK-0371, AZD8477, AZ3146 and ARRY-520 are mentioned in WO2012 / 171020 as potential toxophores.
  • Kinesin spindle protein inhibitors Kinesin spindle protein (KSP, also known as Eg5, HsEg5, KNSL1, or KJF11) is a kinesin-like motor protein that is essential for the function of the bipolar mitotic spindle. Inhibition of KSP leads to mitotic arrest and apoptosis for a prolonged period of time (Tao et al., Cancer Cell 2005 Jul 8 (1), 39-59).
  • KSP inhibitors After finding the first cell-derived KSP inhibitor, monastrol, KSP inhibitors have become established as a class of new chemotherapeutic agents (Mayer et al., Science 286: 971-974, 1999) and are the subject of a number of patent applications (eg, WO2006 / 044825 WO2006 / 002236, WO2005 / 051922, WO2006 / 060737, WO03 / 060064, WO03 / 040979, and WO03 / 049527).
  • KSP inhibitors since KSP is effective only in a short period of the mitosis phase, KSP inhibitors must be present in a sufficiently high concentration during this phase.
  • WO2014 / 151030 discloses ADCs with certain KSP inhibitors.
  • the invention provides conjugates of a glycosylated or aglycosylated-anti-B7H3 antibody with compounds of the following formula (I), wherein one or more of the compounds of the formula (I) is linked to the antibody via a linker L or are.
  • aglycosylated antibodies have no glycans at the conserved N-binding site in the CH2 domain of the Fc region and therefore do not bind to NK cells. Therefore, an aglycosylated antibody does not support NK cell-mediated cellular cytotoxicity.
  • the antibody is preferably a human, humanized or chimeric monoclonal antibody.
  • anti-B7H3 antibodies which specifically bind the human Ig4 and / or the human and / or murine Ig2 isoform of B7H3, in particular BHC 15 1 040-A the anti-B7H3 antibodies TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515, TPP-7611, TPP-8382, TPP-8564, TPP-8567, TPP- 8322, TPP-8565, TPP-8568, TPP-8748 and TPP-8750.
  • R 1 is H, -L- # 1, -MOD or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, where Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-NY'Y 2 or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) o-3Z '(for example - (CH 2 ) 0 - 3 Z'), or -CH ( CH 2 W) represents Z ', and Y 3 represents H or - (CH 2 ) 0 - 3 Z', where Z 'is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, -NH-CO-CH 2 -CH 2 - CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) i- 3 COOH; where represents WH or OH,
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with-NHCONH 2 , Ci- ⁇ alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R 2 represents H, -MOD, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 ) o- 3 Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2 , Ci- ⁇ alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched G_6 is alkyl;
  • R 4 H, L # 1, -SG lys - (CO) 0 . 1 represents -R 4 ', -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • SG j y g is a group cleavable by a lysosomal enzyme, in particular a group consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is an O-io-alkyl, Cs-io-aryl or Ce- ⁇ o- aralkyl-, Cs io-heteroalkyl, C 1-10 -alkyl-O-C6-io-aryl, Cs-io-heterocycloalkyl, heteroaryl, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, G-io-alkoxy, C6-io Aryloxy or C0-io-aralkoxy, C5-10-heteroaralkoxy, Ci-io-alkyl-O-Cö-io-aryloxy, Cs io-heterocycloalkoxy group which is one or more times with - NH 2 , -NH Alkyl, -N (alkyl)
  • Y 1 and Y 2 independently represent H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 represents H or - (CH 2 ) o- 3 Z', wherein Z 'is H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • Y 4 is linear or branched, optionally with -NHCONH 2 substituted, C1-5 alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched G_6 is alkyl;
  • R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR n - or -CHR n -CH 2 -, wherein R 11 is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, SH, halogen (especially F or Cl), C i alkyl, C i i- 4 alkyl, COO (Ci represents ⁇ haloalkyl, Ci- 4 alkoxy, hydroxyl-substituted C 4 alkyl), or OH;
  • A represents CO, SO, S0 2 , S0 2 NH or CNNH 2 ;
  • R 3 represents -L- # 1, -MOD, or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably -L- # 1 or a G-10-alkyl, C6 -10- aryl or C0-io-aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Ci-io-alkyl-0-C6-io-aryl or C5-10-heterocycloalkyl group, which with 1 -3 -OH Groups, 1-3 halogen atoms, 1 -3 halogenated alkyl groups (each having 1 -3 halogen atoms), 1 -3 O-alkyl groups, 1 -3 -SH groups, 1 -3 -S-alkyl groups, 1-3 - O-CO-alkyl groups, 1-3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups, 1 -3
  • alkyl is preferably G-io-alkyl
  • R 5 is H, NH 2 , NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 ) o- 3 Z is where Z is -H, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or - (CH 2 ) o- 3 Z', where Z 'is H, SO 3 H Represents NH 2 or COOH;
  • R 6 and R 7 independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C 1-10 -alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkynyl, hydroxyl, NO 2 , NH 2 , COOH or halogen (especially F, Cl, Br),
  • R 8 (optionally fluorinated) C-10-alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkynyl, (optionally fluorinated) C 1-4 -cycloalkyl or - (CH 2) o -2- (HZ 2 ) wherein HZ 2 is a 4 to 7 membered heterocycle having up to two heteroatoms selected from N, O and S, each of which may be substituted with -OH, CO 2 OH or NH 2;
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ;
  • R 1 , R 3 or R 4 represents -L- # 1 or (in the case of R 8 ), L represents the linker and # 1 represents the bond to the binder or derivative thereof, wherein MOD represents - (NR 10 ) n - (GI) o -G 2 -G 3 wherein R 10 represents H or C 1 -C 3 alkyl;
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • R y is H, phenyl, C 1 -C 1 g-alkyl, C 2 -C 1 g Alkenyl, or C2-C represents 1 g-alkynyl, each with
  • the conjugates according to the invention may have chemically labile linkers, enzymatically labile linkers or stable linkers. Particularly preferred are stable linkers and cleavable by a protease linker.
  • the invention further provides methods for preparing the conjugates of the invention as well as precursors and intermediates for the preparation.
  • the preparation of the conjugates according to the invention regularly comprises the following steps:
  • the attachment of the reactive group can also take place after the formation of an optionally protected KSP inhibitor-linker precursor conjugate.
  • succinimide-linked ADCs after conjugation according to Scheme 26 can be converted into the open-chain succinic acid amides which have a favorable stability profile.
  • conjugation of the linker precursor to a low molecular weight KSP inhibitor may be accomplished by substitution of a hydrogen atom on R 1 , R 3 or R 4 in formula (I) by the linker.
  • any functional groups present may also be present in protected form. Prior to the conjugation step, these protecting groups are removed by known methods of peptide chemistry.
  • the conjugation can be carried out chemically in various ways, as exemplified in Schemes 20 to 31 in the Examples.
  • the invention provides novel low molecular weight KSP inhibitors which are conjugated to an anti-B7H3 antibody.
  • KSP inhibitors or their antibody conjugates have the following general formula (II):
  • R 1 represents H, -L-BINDER, -MOD or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, where Z is -H, -NHY 3 , -
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , - (CH 2 CH 2 O) 3 - (CH 2 ) o-3Z '(for example,
  • Y 3 represents H or - (CH 2 ) 0 - 3 Z '
  • W represents H or OH
  • G_6 is alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR n - or
  • R 11 is -H, -NH 2 , -SO 3 H, -COOH, -SH, halogen (in particular F or Cl),
  • Z is halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-
  • OY 3 represents,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or - (CH 2 ) o- 3 Z', where Z 'is H, SO 3 H, NH 2 or COOH represents;
  • Y 4 represents linear or branched, optionally with NHCONH 2 substituted, G-6 alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched G-6 is alkyl;
  • R 4 H, -L-BINDER, -SG lys - (CO) 0 . 1 represents -R 4 ', -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • SG j y g is a group cleavable by a lysosomal enzyme, in particular a group consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is a G-io-alkyl, G-io-aryl or G-io-aralkyl-, G-io-heteroalkyl, Ci-io-alkyl-0-C6-io-aryl, G-io-heterocycloalkyl, heteroaryl, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, Ci-io-alkoxy, G -io-aryloxy or G-io-aralkoxy, G-io-heteroaralkoxy, G-io-alkyl-OG-io-aryloxy, G-10-heterocycloalkoxy group which is mono- or polysubstituted with - NH 2 , -NH-alkyl, -N (alkyl) 2
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2 ) 0 -3Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2, substituted C 1-6 alkyl or optionally -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched G-6 is alkyl;
  • R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR n - or -CHR n -CH 2 -, wherein R 11 is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, SH, halogen (especially F or Cl), C i alkyl, C i i- 4 alkyl, COO (G- represents ⁇ haloalkyl, Ci- 4 alkoxy, hydroxyl-substituted C 4 alkyl), or OH;
  • R 3 represents -L-BINDER, -MOD, or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably -L-BINDER or a G-10-alkyl, C 10 -o -Aryl or G-io-aralkyl, G-10-heteroalkyl, G-io-alkyl-OG-io-aryl or C 5-10 -heterocycloalkyl group which are substituted by 1 -3 -OH groups, 3 halogen atoms, 1 -3 halogenated BHC 15 1 040-A - 10 -
  • Alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms), 1-3 O-alkyl groups, 1-3-SH groups, 1-3-S-alkyl groups, 1-3 -O-CO-alkyl groups, 1-3 - O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -S (0) n -alkyl groups, 1-3 - S0 2 -NH-alkyl groups, 1-3 -NH-alkyl groups, 1-3 -N (alkyl) 2 groups, 1-3 -NH 2 groups or 1-3 - (CH 2 ) 0 - 3 Z groups, wherein Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , -NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 , with Y 1 and Y 2 independently of one another H, NH 2 , or -
  • alkyl is preferably G-10-alkyl
  • n 0, 1 or 2
  • R 5 is H, NH 2 , NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 ) 0 - 3
  • Z is where Z is -H, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 , where Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2) 0 - 3.
  • R 8 (optionally fluorinated) C-10-alkyl, (optionally fluorinated) C 2 _io-alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 -io-alkynyl, (optionally fluorinated) C 4 -o-cycloalkyl or - (CH 2 ) o- 2 - (HZ 2 ) wherein HZ 2 represents a 4 to 7 membered heterocycle containing up to two heteroatoms selected from N, O and S (preferably oxetane), each of which groups being substituted with -OH, C0 2 H or NH 2 may be substituted;
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; wherein L is a linker and BINDER is an (aglycosylated) anti-B7H3 antibody, wherein the binder may optionally be bound to a plurality of drug molecules, wherein a member of R 1 is R 3 , and R 4 is -L-Binder;
  • R 6 and R 7 are independently H, cyano, (optionally fluorinated) C1-10- alkyl, (optionally fluorinated) C2-10- alkenyl, (optionally fluorinated) C2 -io-alkynyl, hydroxy, N0 2, NH 2 , COOH or halogen (especially F, Cl, Br), wherein -MOD represents - (NR 10 ) n - (GI) o -G 2 -G 3 wherein R 10 represents H or GC 3 alkyl;
  • n 0 or 1;
  • BHC 15 1 040-A - 11 - o is 0 or 1;
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • R y is H, phenyl, Ci-Ci-alkyl, C2-C1 g Alkenyl, or C2-C1 represents g-alkynyl, each with
  • FIG. 1 Internalization behavior of specific B7H3 antibodies in the human renal cancer cell line A498.
  • the invention provides conjugates of an anti-B7H3 antibody as well as aglycosylated and / or humanized variants thereof with one or more drug molecules, wherein the drug molecule is a kinesin spindle protein inhibitor (KSP inhibitor) linked to the antibody via a linker L.
  • KSP inhibitor kinesin spindle protein inhibitor
  • the conjugate according to the invention can be represented by the general formula
  • n where BINDER stands for the anti-B7H3 antibody, L for the linker, KSP for the KSP inhibitor, and n for a number from 1 to 50, preferably 1.2 to 20 and particularly preferably 2 to 8.
  • n is an average of the number of KSP inhibitor-linker conjugates per BINDER.
  • KSP-L preferably has the above-mentioned formula (I).
  • the linker is linked to various amino acids of the antibody. Particularly preferred is a bond to different cysteine residues of the binder.
  • the antibody is preferably a human, humanized or chimeric anti-B 7H3 monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • anti-B7H3 antibodies which specifically bind the human 4Ig isoform, in particular the human anti-B7H3 antibodies TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515.
  • the anti-B 7H3 antibody or the antigen-binding fragment is aglycosylated.
  • antibodies which can be used according to the invention antibodies which can be used according to the invention, KSP inhibitors which can be used according to the invention and linkers which can be used according to the invention are described which can be used without restriction in combination.
  • the binders which are in each case described as being preferred or particularly preferred can be used in combination with the KSP inhibitors respectively shown as being preferred or particularly preferred, if appropriate in combination with the linkers respectively shown as being preferred or particularly preferred.
  • substituted means that one or more hydrogens on the designated atom or group are replaced by a selection from the group indicated, provided that the normal valence of the designated atom has not been exceeded under the present circumstances Combinations of substituents and / or variables are permitted.
  • optionally substituted means that the number of substituents may be the same or different from 0. Unless otherwise indicated, optionally substituted groups may be substituted by as many optional substituents as may be substituted by replacement of a hydrogen by a non-hydrogen substituent. Typically, the number of optional substituents (if present) may be 1, 2, 3, 4 or 5, more preferably 1, 2 or 3.
  • the term "one or more times", for example, in the definition of the substituents of the compounds of the general formulas of the present invention, means "1, 2, 3, 4 or 5, preferably 1, 2, 3 or 4, more preferably 1, 2 or 3, most preferably 1 or 2 ".
  • radicals are substituted in the compounds according to the invention, the radicals can, unless stated otherwise, be monosubstituted or polysubstituted.
  • the meanings of all residues that occur multiple times are independent of each other. Substitution by one, two or three identical or different substituents is preferred. Substitution by a substituent is particularly preferred.
  • Alkyl is a linear or branched, saturated, monovalent hydrocarbon radical having 1 to 10 carbon atoms (G-Go-alkyl), generally 1 to 6 (GG-alkyl), preferably 1 to 4 (G-G-alkyl), and particularly preferably 1 to 3 carbon atoms (GG-alkyl).
  • Particularly preferred is a methyl, ethyl, propyl, isopropyl and tert-butyl radical.
  • Sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted.
  • R x is -H, C 1 -C 3 -alkyl or phenyl.
  • Alkenyl is a straight-chain or branched monovalent hydrocarbon chain having one or two double bonds and 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms (C 2 -C 10 alkenyl), in particular 2 or 3 carbon atoms (C2 -C 3 alkenyl), it being understood that when the alkenyl group contains more than one double bond, the double bonds may be isolated from each other or conjugated with each other.
  • the alkenyl group is, for example, an ethenyl (or vinyl), prop-2-en-1-yl (or “allyl”), prop-1-en-1-yl, but 3-enyl, but-2-enyl, but-1-enyl, pent-4-enyl, pent-3-enyl, pent-2-enyl, pent-1-enyl, hexane 5-enyl, hex-4-enyl, hex-3-enyl, hex-2-enyl, hex-1-enyl, prop-1-en-2-yl (or "isopropenyl") )
  • the group is vinyl or allyl.
  • Alkynyl represents a straight-chain or branched monovalent hydrocarbon chain having one triple bond and having 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms (C 2 -C 10 -alkynyl), in particular 2 or 3 carbon atoms (C 2 -C 3 ) alkynyl).
  • the C 2 -C 6 alkynyl group is, for example, an ethynyl, prop-1-ynyl, prop-2-ynyl (or propargyl), but-1-ynyl, but-2-one inyl, but-3-ynyl, pent-1-ynyl, pent-2-ynyl, pent-3-ynyl, pent-4-ynyl, hex-1-ynyl, hex-2-ynyl , Hex-3-ynyl, hex-4-ynyl, hex-5-ynyl, 1-methylprop-2-ynyl, 2-methylbut-3-ynyl, 1-methylbut-3-ynyl, 1-methylbut-2-ynyl, 3-methylbut-1-ynyl, 1-ethylprop-2-ynyl,
  • alkynyl group is ethynyl, prop-1-ynyl or prop-2-ynyl.
  • Cycloalkyl is a saturated monovalent mono- or bicyclic hydrocarbon radical having 3-12 carbon atoms (C 3 -C 2 -cycloalkyl).
  • a mono cvclis is more likely to be carbon which is first free for a monovalent one
  • Hydrocarbon radical having generally 3 to 10 (C 3 -Cio-cycloalkyl), preferably 3 to 8 (C 3 -C 8 -cycloalkyl), and particularly preferably 3 to 7 (C 3 -C 7 -cycloalkyl) carbon atoms.
  • C 3 -Cio-cycloalkyl preferably 3 to 8 (C 3 -C 8 -cycloalkyl), and particularly preferably 3 to 7 (C 3 -C 7 -cycloalkyl) carbon atoms.
  • a monocyclic hydrocarbon radical mention may be made:
  • cyclopropyl cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and
  • hydrocarbon radical of a hydrocarbon radical having usually 3 to 12 carbon atoms C3-Ci2 cycloalkyl
  • a fusion of two saturated ring systems is to be understood, commonly shared by two directly adjacent atoms.
  • bicyclic hydrocarbon radical bicyclo [2.2.0] hexyl, bicyclo [3.3.0] octyl, bicyclo [4.4.0] decyl, bicyclo [5.4.0] undecyl, bicyclo [3.2.
  • Heterocycloalkyl is a non-aromatic mono- or bicyclic ring system having one, two, three or four heteroatoms, which may be the same or different. As heteroatoms nitrogen atoms, oxygen atoms or sulfur atoms can occur.
  • a monocyclic ring system according to the present invention may have 3 to 8, preferably 4 to 7, more preferably 5 or 6 ring atoms.
  • heterocycloalkyl having 4 ring atoms examples and preferred for a heterocycloalkyl having 4 ring atoms are:
  • heterocycloalkyl having 7 ring atoms examples and preferred for a heterocycloalkyl having 7 ring atoms are:
  • Azepanyl, oxepanyl, 1,3-diazepanyl, 1, 4-diazepanyl is azepanyl, oxepanyl, 1,3-diazepanyl, 1, 4-diazepanyl.
  • heterocycloalkyl having 8 ring atoms examples and preferred for a heterocycloalkyl having 8 ring atoms are:
  • Oxocanyl, azocanyl
  • saturated heterocyclyl radicals having up to two heteroatoms from the series O, N and S are preferred.
  • a bicyclic ring system having one, two, three or four heteroatoms, which may be the same or different, may according to the present invention have from 6 to 12, preferably 6 to 10 ring atoms, with one, two, three or four carbon atoms against the same or different heteroatoms from the series O, N and S can be exchanged.
  • Examples include: azabicyclo [3.3.0] octyl, azabicyclo [4.3.0] nonyl,
  • Aryl is a monovalent, mono- or bicyclic, aromatic carbon ring system consisting of carbon atoms. Examples are naphthyl and phenyl; preferred is phenyl or a phenyl radical.
  • C 10 -alkyl-aralkyl represents a monocyclic aromatic aryl, exemplified by phenyl, to which a G-C 4 -alkyl group is attached.
  • An exemplary C 10 -o-aralkyl group is benzyl.
  • Heteroaryl means a monovalent monocyclic, bicyclic or tricyclic aromatic ring system having 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 or 14 ring atoms (a "5- to 14-membered heteroaryl" group), especially 5, 6, 9 or 10 ring atoms, which contains at least one ring heteroatom and optionally one, two or three further ring heteroatoms from the group consisting of N, O and S and which is bonded via a ring carbon atom or optionally (if it allows the valency) via a ring nitrogen atom.
  • the heteroaryl group may be a 5-membered heteroaryl group such as thienyl, furyl, pyrrolyl, oxazolyl, thiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, isoxazolyl, isothiazolyl, oxadiazolyl, triazolyl, thiadiazolyl or tetrazolyl; or a 6-membered heteroaryl group such as pyridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl or triazinyl; or a tricyclic heteroaryl group such as carbazolyl, acridinyl or phenazinyl; or a 9-membered heteroaryl group such as benzofuranyl, benzothienyl, benzoxazolyl, benzisoxazolyl, benzimidazolyl, benzothiazolyl, benzotriazolyl, indazolyl, ind
  • heteroaryl radicals include all possible isomeric forms thereof, e.g. Tautomers and positional isomers with respect to
  • pyridinyl includes pyridin-2-yl, pyridin-3-yl and pyridin-4-yl; or the term thienyl includes thien-2-yl and thien-3-yl.
  • C5-io-heteroaryl in the context of the invention represents a mono- or bicyclic, aromatic ring system having one, two, three or four heteroatoms, which may be identical or different.
  • the bond valency may be at any aromatic carbon atom or at a nitrogen atom.
  • a monocyclic heteroaryl group according to the present invention has 5 or 6 ring atoms. Preference is given to those heteroaryl radicals having one or two heteroatoms. Particularly preferred are one or two nitrogen atoms.
  • heteroaryl radicals having 5 ring atoms include the rings:
  • Heteroaryl radicals having 6 ring atoms include, for example, the rings:
  • a bicyclic heteroaryl group according to the present invention has 9 or 10 ring atoms.
  • heteroaryl radicals having 9 ring atoms include the rings:
  • Benzothienyl Benzimidazolyl, benzoxazolyl, azocinyl, indolizinyl, purinyl, indolinyl.
  • Heteroaryl radicals with 10 ring atoms include, for example, the rings:
  • Sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted, BHC 15 1 040-A - 20 -
  • Sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted.
  • R x is -H, C 1 -C 3 -alkyl or phenyl.
  • Halogen or halogen atom in the context of the invention is fluorine (-F), chlorine (-C1), bromine (-Br), or iodine (-1).
  • Fluoroalkyl, fluoroalkenyl and fluoroalkynyl mean that the alkyl, alkenyl and alkynyl may be substituted one or more times by fluorine.
  • the conjugation of the KSP inhibitor to the antibody can be accomplished chemically in a variety of ways, as exemplified in Schemes 20 to 31 in the Examples.
  • it is possible to optionally modify the low molecular weight KSP inhibitor for conjugation to the linker e.g. by introducing protecting groups or leaving groups for easier substitution (so that in the reaction this leaving group is substituted by the linker and not an H atom).
  • the KSP inhibitor-linker molecule thus obtained (wherein the linker has a reactive group for coupling to the binder) can then be reacted with the binder to obtain a binding conjugate of the invention.
  • This procedure is exemplarily illustrated in the experimental part by means of a large number of examples.
  • R 1 is H, -L- # 1, -MOD or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, where Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-NY'Y 2 or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) o-3Z '(for example - (CH 2 ) 0 - 3 Z'), or -CH (CH 3 ) 2 2 W) represent Z ', and Y 3 represents H or - (CH 2 ) 0 - 3 Z', where Z 'is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, -NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) i_ 3 COOH; where represents WH or OH,
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with-NHCONH 2 , G_6 alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R 2 represents H, -MOD, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 ) 0 - 3 Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2 , Ci-6 alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched G_6 is alkyl;
  • -SG lys - (CO) 0 . 1 represents -R 4 ', -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • SG j y g represents a group cleavable by a lysosomal enzyme, in particular a group consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is a G-io-alkyl, Cs-io-aryl or C ⁇ -IO aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Ci-io-alkyl-0-C6-io-aryl, Cs-io-heterocycloalkyl, heteroaryl, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, Ci-io-alkoxy, Cö -io-aryloxy or C10-aroalkoxy, C 5-10 heteroaralkoxy, C 1-10 -alkyl-O-C0-io-aryloxy, C 1-10 -heterocycloalkoxy group which is mono- or polysubstituted with --NH 2 , -NH-alkyl, -N (alkyl) 2
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 ) 0 - 3 Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2, substituted C 1-6 alkyl or optionally -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched C1-6 is alkyl;
  • BHC 15 1 040-A - 22 - or R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) represent -CH 2 -CHR 11 - or -CHR n -CH 2 -, wherein R 11 is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, SH , halogen (especially F or Cl), C i alkyl, haloalkyl, Ci- 4 alkoxy, hydroxyl-substituted G 4 alkyl, COO (CI-4 alkyl) or OH;
  • A represents CO, SO, SO 2 , SO 2 NH or CNNH 2 ;
  • R 3 represents -L- # 1, -MOD or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably a C 1-10 -alkyl, C 6-10 aryl or Ce- 10-aralkyl, C5-io-heteroalkyl, Ci-io-alkyl-O-Cö-io-aryl or Cs-io-heterocycloalkyl group, which with 1 -3 -OH groups, 1 -3 halogen atoms , 1 -3 halogenated alkyl groups (each having 1 -3 halogen atoms), 1 -3 O-alkyl groups, 1 -3 -SH groups, 1-3 -S-alkyl groups, 1 -3 -
  • 0-CO-alkyl groups 1 -3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1 -3 -NH-CO-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-NH-alkyl groups, 1 -3 -S ( 0) n -alkyl groups, 1 -3 -SO 2 -NH-alkyl groups, 1-3 -NH-alkyl groups, 1 -3 -N (alkyl) 2 groups, 1 -3 -NH ((CH 2 CH 2 0) 1 .2oH) groups, 1 -3 -NH 2 groups or
  • R 5 is H, -MOD, NH 2 , NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 ) 0 3 represents Z, where Z is -H, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2, or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or - (CH 2 ) o- 3 Z', where Z 'is H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • R 6 and R 7 independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C 10 -alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkynyl, hydroxyl, NO 2, NH 2, COOH or Halogen (especially F, Cl, Br) represent,
  • R 8 (optionally fluorinated) C-10-alkyl, (optionally fluorinated) C 2 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 -alkynyl, (optionally fluorinated) C 4 -iodo-cycloalkyl or - ( CH 2 ) o- 2 - (HZ 2 ), wherein HZ 2 represents a 4- to 7-membered heterocycle having up to two heteroatoms selected from N, O and S (preferably oxetane), each of these groups being substituted with -OH, CO 2 H or NH 2 may be substituted; wherein one of the substituents R 1 , R 3 and R 4 represents -L- # 1, BHC 15 1 040-A - 23 -
  • L is the linker and # 1 is the bond to the antibody
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2
  • -MOD - represents (NR 10 ) n - (GI) o -G 2 -G 3 wherein R 10 represents H or C 1 -C 3 alkyl
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • R y is H, phenyl, Ci-Ci-alkyl, C2-C1 g Alkenyl, or C2-C1 represents g-alkynyl, each with
  • NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid), -CO-, or -CR x N-O- (where Rx H, C 1 -C 3 -alkyl or phenyl), wherein the hydrocarbon chain including the side chains, if present, with -NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or Sulfonic acid may be substituted, wherein G3 is -H or COOH, and wherein the group -MOD preferably has at least one group -COOH; and their salts, solvates, salts of solvates and epimers.
  • one of the substituents R 1 or R 3 -L represents # 1 in this embodiment it is particularly preferred if R 4 is H or -SG j y S -. (CO) O_i-R 4 ', where SG jys and R 4 ' have the same meaning as above.
  • R 1 When R 1 is not H, the carbon atom to which R 1 binds is a stereocenter which may be in the L and / or D configuration, preferably in the L configuration.
  • R 2 is not H
  • the carbon atom to which R 2 binds is a stereocenter which may be in the L and / or D configuration.
  • R 1 is H, -L- # 1, or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, wherein Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-NY'Y 2 , or Represents -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) o-3Z '(for example - (CH 2 ) 0 - 3 Z'), or -CH ( CH 2 W) represents Z ', and Y 3 represents H or - (CH 2 ) 0 - 3 Z', where Z 'is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, -NH-CO-CH 2 -CH 2 - CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) i_ 3 COOH; wherein represents WH or OH;
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with-NHCONH 2 , Ci- ⁇ alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl.
  • R 2 and R 4 are independently H
  • -SG lys - (CO) 0 . 1 represents -R 4 ', -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • SG j y g is a group cleavable by a lysosomal enzyme, in particular a group consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is a G-io-alkyl, Cs-io-aryl or Ce- ⁇ o- aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Ci-io-alkyl-0-C6-io-aryl, Cs-io-heterocycloalkyl, heteroaryl, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, G-io-alkoxy, C6 -io-aryloxy or C6-io-aralkoxy, C5-10-heteroaralkoxy, Ci-io-alkyl-O-Cö-io-aryloxy, Cs io-heterocycloalkoxy group, each one or more times with - NH 2 , -NH-alkyl, -N (al
  • R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 11 - or -CHR 11 - CH 2 -, wherein R 11 is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, SH, halogen (especially F or Cl), G 4 alkyl, C1-4 haloalkyl, G 4 represents alkoxy, hydroxyl-substituted G 4 alkyl, COO (C w alkyl), or OH; or R 2 is H, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) o- 3 Z and R 4 is -L- # 1 wherein Z is - H, halo, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 represents -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2, or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or - (CH 2 ) 0 - 3 Z', where Z 'is H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • Y 4 is independently linear or branched, optionally substituted with -NHCONH2, C 1-6 alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl, wherein Y 4 linear or branched, optionally substituted with -NHCONH 2 , C 1-6 represents alkyl or optionally substituted aryl with NH2 or benzyl and Y is H 5 or -CO-CHY 6 -NH 2, where Y represents 6 linear or branched alkyl G_6;
  • A represents CO, SO, SO 2 , SO 2 NH or CNNH 2 ;
  • R 3 represents an optionally substituted alkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably -L-# 1 or a G-10-alkyl, cyclo-aryl or cyclo-aralkyl-, C 5-10 heteroalkyl, C 1-10 -alkyl-O-C0 -10-aryl or C 1-10 -heterocycloalkyl groups which have 1-3 -OH groups, 1-3 halogen atoms, 1-3 halogenated alkyl groups ( each having 1-3 halogen atoms) ,, 1-3 O-alkyl groups, 1-3 -SH groups, 1-3 -S-alkyl groups, 1-3 -O-CO-alkyl groups, 1-3 -O -CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -S
  • alkyl is preferably G- 10- alkyl
  • R 5 is H, F, NH 2 , NO 2 , halogen, SH or - (CH 2 ) o- 3 Z, where Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY ' Y 2 represents or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 ) o- 3 Z ', and Y 3 is H or - (CH 2 ) o-3Z', where Z 'is H, SO 3 H, NH 2 or COOH; BHC 15 1 040-A - 26 -
  • R 6 and R 7 independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C 1-10 -alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkynyl, hydroxyl or halogen,
  • R 8 represents (optionally fluorinated) G-10-alkyl, (optionally fluorinated) C 4 -o cyclo-cyclo or optionally substituted oxetane;
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; and their salts, solvates, salts of solvates and epimers.
  • one of the substituents R 1 , R 3 or R 4 represents -L- # 1, where L is the linker and # 1 is the binding to the antibody is. That is, in the case of the conjugates, one of the substituents R 1 , R 3 or R 4 represents -L- # 1, wherein -L- # 1 represents the binding to the antibody.
  • one of the substituents R 1 or R 3 -L represents # l in this embodiment it is particularly preferred if R 4 is H or -SG j y S -.
  • the binder is preferably a human, humanized or chimeric monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • anti-B7H3 antibodies which specifically bind the human Ig4 and / or the human and / or murine Ig2 isoform of B7H3, in particular the anti-B7H3 antibodies TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515.
  • the anti-B7H3 antibody is present in aglycosylation.
  • the group -L- # 3 may also be present in the compound, where L is the linker and # 3 is the reactive group for binding to antibodies.
  • Compounds with -L- # 3 are reactive compounds that react with the antibody.
  • # 3 is preferably a group that reacts with an amino or thiol group to form a covalent bond, preferably with the cysteine residue in a protein.
  • the cysteine residue in a protein can BHC 15 1040-A-27 naturally present in the protein, can be introduced by biochemical methods or can preferably be generated by prior reduction of disulfides of the binder.
  • CO carbonyl
  • R 1 is preferably -L- # l, H, -COOH, -CONHNH2, - (CH 2 ) i- 3 NH 2 , -CONZ "(CH 2 ) i- 3 NH 2 and - CONZ" CH 2 COOH, where Z is H or NH 2 .
  • R 2 and R 4 are preferably H or R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 11 - or -CHR n -CH 2 -, wherein R 11 is H or F.
  • R 4 is -L- # 1, where -L- # 1 is a cleavable linker, preferably an intracellular enzymatically cleavable linker.
  • R 3 is preferably -L- # l or a C 1-10 -alkyl, optionally with -OH, O-alkyl, SH, S-alkyl, O-CO-alkyl, O-CO-NH-alkyl , NH-CO-alkyl, NH-CO-NH-alkyl, S (0) n -alkyl, S0 2 -NH-alkyl, NH-alkyl, N (alkyl) 2 , or NH 2 may be substituted (wherein alkyl is preferably C1-3 alkyl).
  • R 5 is preferably H or F.
  • R 6 and R 7 are independently of each other preferably H, (optionally fluorinated) ⁇ -3-alkyl, (optionally fluorinated) C 2 ⁇ -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 -4-alkynyl, hydroxy or halogen.
  • R 8 is preferably a branched ⁇ -5-alkyl group, in particular a group of the formula - C (CH 3 ) 2 - (CH 2 ) o- 2- R y , wherein R y is -H, -OH, C0 2 H, or NH 2 , or a (optionally fluorinated) C 5-7 -cycloalkyl Particularly preferred is a group of the formula -C (CH 3 ) 3 or a cyclohexyl group.
  • R 9 is preferably H or F.
  • A is CO (carbonyl);
  • R 1 is H, -L- # 1, -COOH, -CONHNH 2 , - (CH 2 ) i- 3 NH 2 , -CONZ "(CH 2 ) i- 3 NH 2 and -CONZ" CH 2 COOH, wherein Z is H or NH 2 ;
  • R 2 and R 4 are H, or R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR n - or -CHR n -CH 2 -, wherein R 11 represents H; or R 4 is -L- # 1 and R 2 is H; BHC 15 1 040-A - 28 -
  • R 3 is particularly preferably substituted by -OH, O-alkyl, SH, S-alkyl, O-CO-alkyl, O-CO-NH-alkyl, NH-CO-alkyl, NH-CO-NH-alkyl, S (0 ) n -alkyl, S0 2 -NH-alkyl, NH-alkyl, N (alkyl) 2 , or NH 2 may be substituted (wherein alkyl is preferably C1-3 alkyl);
  • R 5 is H or F
  • R 6 and R 7 independently represent H, (optionally fluorinated) Ci-3-alkyl, (optionally fluorinated) C 2 -4 alkenyl, (optionally fluorinated) C2 -4 alkynyl, hydroxy or halogen;
  • R 8 is a branched C 1-5 alkyl group or cyclohexyl
  • R 9 is H or F.
  • R 1 represents -L- # 1, COOH or H
  • R 2 and R 4 are H or R 2 and R 4 are together (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR n - or -CHR n -CH 2 -, where R 11 is H, or R 4 -L- # l is and R 2 is H;
  • A represents CO
  • R represents 5 or H
  • R 6 and R 7 independently of one another are H, G- 3- alkyl or halogen, in particular that R 6 and R 7 represent F;
  • R 8 is C 1-4 alkyl (preferably tert-butyl) or cyclohexyl; and or
  • R 9 represents H. BHC 15 1 040-A - 29 -
  • R 1 represents -L- # 1, COOH or H
  • R 2 and R 4 are H or R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 11 - or -CHR n -CH 2 -, where R 11 is H,
  • A represents CO
  • R 5 represents H
  • R 6 and R 7 independently of one another are H, G- 3- alkyl or halogen, in particular that R 6 and R 7 represent F;
  • R 8 is C 1-4 -alkyl (preferably tert-butyl).
  • R 9 represents H.
  • R 1 is H, -L-Binder, -MOD or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, where Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2, - (CH 2 CH 2 O) 0-3 - (CH 2) 0 - 3.
  • Z'), or - Z is CH (CH 2 W) 'represent, and Y 3 is H or - (CH 2) 0 - 3.
  • Z' group wherein Z 'is H, NH 2, S0 3 H, - COOH, -NH-CO-CH 2 - CH 2 is -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) i- 3 COOH; where represents WH or OH, BHC 15 1040-A - wherein Y 4 is linear or branched, optionally substituted with-NHCONH2, Ci- ⁇ alkyl or optionally -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R 2 is H, -MOD, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) o- 3 Z, wherein Y 4 is linear or branched, optionally substituted with-NHCONH 2 , Ci- ⁇ alkyl or optionally with -NH 2 represents substituted aryl or benzyl and Y 5 represents H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 represents linear or branched Ci- ⁇ alkyl,
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2 ) 0 -3Z ', and Y 3 is H or -
  • SG j y S is a group cleavable by lysosomal enzymes, in particular a group consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is a C 0 -alkyl, C 5-10 -aryl or -glyo-aralkyl-, C 5- 10- heteroalkyl, G-io-alkyl-OG-io-aryl, G-10-heterocycloalkyl, heteroaryl, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, Ci-10-alkoxy, G-io-aryloxy - or C6-io-aralkoxy, G-10-heteroaralkoxy, G-io-alkyl-0-C6-io-aryloxy, G-10-heterocycloalkoxy group, one or more times with -NH 2 , -NH - alkyl, -N (alkyl) 2 , NH-CO-alkyl, N (alkyl
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2 ) 0 -3Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2, substituted C 1-6 alkyl or optionally -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , where Y 6 linear or branched G_6 is alkyl;
  • R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR n - or -CHR n -CH 2 -, wherein R 11 is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, SH, halogen (especially F or Cl), G ⁇ alkyl, G- 4 haloalkyl, G-4Alkoxy, hydroxyl-substituted G ⁇ alkyl, COO (C 1-4 alkyl) or OH;
  • A represents CO, SO, S0 2 , S0 2 NH or CNNH 2 ;
  • R 3 is -L-Binder, -MOD, or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably -L-BINDER or a G-10-alkyl-, BHC 15 1 040-A - 31 -
  • C 10 -o-aryl or C 10 -o-aralkyl C 1-10 -heteroalkyl, C 1-10 -alkyl-O-C0 -10-aryl or C 5-10 -heterocycloalkyl groups which are substituted by 1-3 -OH Groups, 1-3 halogen atoms, 1-3 halogenated alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms), 1-3 O-alkyl groups, 1-3-SH groups, 1-3 -alkyl groups, 1-3 O-CO-alkyl groups, 1-3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -S ( 0) n -alkyl groups, 1-3 -SO 2 -NH-alkyl groups, 1-3 -NH-alkyl groups, 1-3 -N (alkyl) 2 groups, 1-3 -NH 2 groups or 1-3
  • alkyl is preferably G- 10- alkyl
  • R 5 is H, NH 2 , NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 ) 0 - 3 Z is where Z is -H, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 , where Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 represents H or - (CH 2 ) 0 - 3 Z', wherein Z 'represents H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • R 6 and R 7 are each independently H, cyano, (optionally fluorinated) C O-alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 -io-alkynyl, hydroxy, N0 2 , NH 2 , COOH or halogen (especially F, Cl, Br),
  • R 8 (optionally fluorinated) C- 10- alkyl, (optionally fluorinated) C 2 _io-alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 -io-alkynyl, (optionally fluorinated) C 4 -o-cycloalkyl or (CH 2) from 0 - 2 - (HZ 2), wherein HZ 2 4 to 7-membered heterocycle having up to two heteroatoms selected from N, O and S is, where each of these groups with OH, C0 2 H or NH 2 may be substituted;
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; wherein -MOD - (NR 10 ) n - (GI) o -G2-G3, wherein
  • R 10 is H or GC 3 alkyl
  • n 0 or 1
  • o is 0 or 1; and BHC 15 1 040-A - 32 -
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid), -CO-, or -CR x N-O- (where Rx H, C C 1 -C 3 -alkyl or phenyl), wherein the hydrocarbon chain including the side chains, if present, with -NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or Sulfonic acid may be substituted, G3 is -H or -COOH, and wherein the group - MOD preferably has at least one group -COOH; and their salts, solvates, salts of solvates and epimers.
  • R 1 , R 3 and R 4 may be L-linkers wherein L is a linker and BINDER is the antibody is, where the antibody may be bound to multiple drug molecules.
  • R 1 represents -L-BINDER, H, or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, where Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-NY'Y 2 , or - CO-OY 3 represents,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2, - (CH 2 CH 2 O) 0 - 3 - (CH 2) 0 3 Z 'Z, or -CH (CH 2 W)', and Y 3 is H or - (CH 2) 0 - 'group, wherein Z' Z 3 H, NH 2, S0 3 H, COOH, -NH-CO-CH 2 - CH 2 -CH (NH 2) COOH or - (CO-NH- CHY 4 ) i_ 3 represents COOH; wherein represents WH or OH; BHC 15 1 040-A - 33 - wherein Y 4 is linear or branched, optionally substituted with -NHCONH 2 , Ci- ⁇ alkyl or optionally -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R 2 and R 4 are independently H, -SG lys - (CO) -R i 0. 4 ', -CO-CHY 4 5 or -NHY - 3 represent Z, or R 2 and R 4 - (CH 2) 0 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR n - or - CHR n -CH 2 -, or R 2 represents H, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, and R 4 -L- # 1 where R 11 is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, SH, halogen (especially F or Cl), G 4 alkyl, G 4 haloalkyl, C 1-4 alkoxy, hydroxyl-substituted cis 4 represents alkyl, COO (C 1-4 -alkyl) or OH; wherein SG j y S is a group cleavable by lysosomal
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2 ) 0 -3Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by-NHCONH 2 , G_6 alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched G_6 alkyl represents;
  • A represents CO, SO, S0 2 , S0 2 NH or CNNH 2 ;
  • R 3 represents -L-BINDER or an optionally substituted alkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably -L-BINDER or a G- 10 -alkyl, C 10 -ol-aryl or C 10 -ol -Aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Ci-io-alkyl-O-Cö-io-aryl or Cs-io-heterocycloalkyl group, which with 1 -3 -OH groups, 1 -3 halogen atoms, 1 - 3 halogenated alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms), 1-3 O-alkyl groups, 1-3 -SH groups, 1-3 -S-alkyl groups, 1 -3 - O-CO-alkyl groups, 1 -3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1 -3 -NH-CO-alkyl groups, 1-3 -
  • alkyl is preferably G-10-alkyl
  • R 5 is H, F, NH 2 , NO 2 , halogen, SH or - (CH 2 ) o- 3 Z, where Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , -NHY 3 , -CO-NY ' Y 2 represents or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2, or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or - (CH 2 ) o- 3 Z', where Z 'is H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • L is a linker and BINDER is a binder or derivative thereof, it being possible for the binder to be bound to a plurality of active substance molecules,
  • R 6 and R 7 independently of one another represent H, cyano, (optionally fluorinated) C 0-alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 -io-alkynyl, hydroxyl or halogen,
  • R 8 represents (optionally fluorinated) G-10-alkyl, (optionally fluorinated) C 4 -o cyclo-cyclo or optionally substituted oxetane;
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; and their salts, solvates, salts of solvates and epimers.
  • a CO B represents a single bond, -O-CH 2 - or -CH 2 -O-, and R 20 represents NH 2 , F, CF 3 , or CH 3 , and n represents 0, 1, or 2.
  • R 1 , R 3 , R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 have the same meaning as in formula (II) or (IIa), wherein A is preferably CO and R 3 is -CH 2 OH, -CH 2 represents OCH 3 , CH (CH 3 ) OH or CH (CH 3 ) OCH 3 .
  • R 3, R 6, R 7, R 8 and R 9 have the same meaning as in formula (II) or (IIa), wherein A is preferably CO and R 3 is -CH 2 -S X - (CH 2) ⁇ M-CHY 5 -COOH, where x is 0 or 1, and Y 5 represents H or NHY 6 , wherein Y 6 represents H or -COCH 3 .
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 6 , R 7 , R 8 and R 9 have the same meaning as in formula (II) or (IIa), and R! Represents L-BINDER.
  • R 1 or R 3 particularly preferably represent -MOD.
  • Formula (Ilj) has: BHC 15 1 040-A - 37 -
  • R 3 represents -L- # 1
  • A represents CO
  • R 6 , R 7 , R 8 and R 9 have the same meaning as in formula (I)
  • R 1 represents -L- # 1
  • A is CO and R 3 is -CH 2 OH -;
  • R 3 , R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 have the same meaning as in formula (I).
  • Z represents Cl or Br
  • R 1 is - (CH 2 ) o- 3 Z, where Z is COOH or -CO-NY'Y 2 , where Y 2 - (CH 2 CH 2 O) 0 - 3 -
  • (CH 2 ) 0 3 Z 'and Y 1 represents H, NH 2 , or - (CH 2 CH 2 O) 0 - 3 - (CH 2 ) 0 3 Z';
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents - (CH 2 CH 2 O) 3 -CH 2 CH 2 Z 'and Z represents -COOH;
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z 'and Z' represents - (CONHCHY 4 ) 2 COOH;
  • Y 1 is H
  • Y 2 is -CH 2 CH 2 Z '
  • Z' is - (CONHCHY 4 ) 2 COOH and one Y 4 is z-propyl and the other is - (CH 2 ) 3 -NHCONH 2 ;
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z ', Z' - (CONHCHY 4 ) 2 COOH and one Y 4 represents -CH 3 and the other represents - (CH 2 ) 3 -NHCONH 2 ;
  • Y 4 represents linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2 , 0_6 alkyl; at least one member of Y 4 is selected from z-propyl or -CH 3 .
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z '
  • Z' represents -CONHCHY 4 COOH and optionally Y 4 with
  • -NH 2 represents substituted aryl or benzyl
  • Y 4 represents aminobenzyl
  • R 2 is - (CH 2 ) 0 - 3 Z and Z is -SY 3 ;
  • R 4 is -CO-CHY 4 -NHY 5 and Y 5 is H;
  • R 4 is -CO-CHY 4 -NHY 5 and Y 5 is -CO-CHY 6 -NH 2 ;
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with -NHCONH 2 Ci-6 alkyl.
  • R 1 , R 2 or R 3 in formula (I) or (II) represents -MOD
  • R 3 -MOD and R 1 or R 4 -L- # l or -L-BINDER represents wherein -MOD - (NR 10) N - (Gl) represents o-G2-G3, wherein
  • R 10 is H or C 1 -C 3 -alkyl
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • the group -MOD has a (preferably terminal) -COOH group, for example in a betaine group.
  • the group -MOD has the formula -CH 2 -S x - (CH 2 ) o-4 -CHY 5 -COOH, where x is 0 or 1, and Y 5 is H or NHY 6 , where Y 6 is H or - COCH 3 represents.
  • R 1 represents -L-BINDER, H, or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, wherein Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-NY'Y 2 , or -CO Represents -OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) O 3 Z 'or - CH (CH 2 W) Z', and Y 3 is H or - (CH 2) 0 - 'group, wherein Z' Z 3 H, NH 2, S0 3 H, COOH, - NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH (NH 2) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) i_ 3 represents COOH;
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with -NHCONH 2 , G_6 alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R 2 and R 4 independently of one another H, -SG lys - (CO) 0 . 1 -R 4 ', -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, or R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR n - or - CHR n -CH 2 - represent wherein R 1 1 is H, NH 2, S0 3 H, COOH, SH, halo (especially F or Cl), alkyl IA, IA haloalkyl, C ⁇ A alkoxy, hydroxyl-substituted Ci- 4 alkyl, COO (C w alkyl) or OH; BHC 15 1 040-A - 40 - wherein SG j y S is a group cleavable by lysosomal enzymes, in particular a group consisting of a di- or tripeptide, R 4 'is a G
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2 ) 0 -3Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2, substituted C 1-6 alkyl or optionally -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched C1-6 is alkyl;
  • A represents CO, SO, S0 2 , S0 2 NH or CNNH 2 ;
  • R 3 -L-BESiDER an optionally substituted alkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, or -CH 2 -S x - (CH 2 ) 0 -4 -CHY 5 -COOH, where x is 0 or 1 and Y 5 is H or NHY 6 , where Y 6 is H or -COCH 3 .
  • alkyl is preferably G-10-alkyl
  • R 5 is H, F, NH 2 , NO 2 , halogen, SH or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, where Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , -NHY 3 , -CO-NY 'Represents Y 2 , or -CO-OY 3 , BHC 15 1 040-A - 41 - wherein Y 1 and Y 2 independently of one another represent H, NH 2 , or - (CH 2 ) o- 3 Z ', and Y 3 H or - (CH 2 ) o- 3 Z' where Z 'is H, SO 3 H, NH 2 or COOH; where L is a linker and BINDER is the antibody, where the binder may possibly be bound to several active substance molecules,
  • R 6 and R 7 independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C 1-10 -alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkynyl, hydroxyl or halogen,
  • R 8 represents (optionally fluorinated) C 1-10 -alkyl, (optionally fluorinated) C 1-4 -cycloalkyl or optionally substituted oxetane;
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; and their salts, solvates, salts of solvates and epimers.
  • Z represents Cl or Br
  • R 1 - (CH 2) o- 3 Z group wherein Z represents -CO-NY'Y 2, wherein Y 2 - (CH 2 CH 2 O) 0 - 3 - (CH 2) 3 0 Z 'and Y 1 H, NH 2 , or - (CH 2 CH 2 O) 0 - 3 - (CH 2 ) 0 3 Z ';
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents - (CH 2 CH 2 O) 3 -CH 2 CH 2 Z 'and Z represents -COOH;
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z 'and Z' represents - (CONHCHY 4 ) 2 COOH;
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z '
  • Z' represents - (CONHCHY 4 ) 2 COOH and represents one representative of Y 4 isopropyl and the other represents - (CH 2 ) 3 -NHCONH 2 ;
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z '
  • Z' represents - (CONHCHY 4 ) 2 COOH and represents one representative of Y 4 - CH 3 and the other represents - (CH 2 ) 3 -NHCONH 2 ;
  • Y 4 is C 1-5 alkyl, linear or branched, optionally substituted with -NHCONH 2 ; at least one member of Y 4 is selected from z-propyl or -CH 3 .
  • Y 1 is H, Y 2 is -CH 2 CH 2 Z ', Z' is -CONHCHY 4 COOH and Y 4 is optionally aryl or benzyl substituted with -NH 2 ;
  • Y 4 represents an aminobenzyl
  • R 2 is - (CH 2 ) o- 3 Z and Z is -SY 3 ;
  • R 4 is -CO-CHY 4 -NHY 5 and Y 5 is H;
  • R 4 is -CO-CHY 4 -NHY 5 and Y 5 is -CO-CHY 6 -NH 2 ;
  • Y 4 represents linear or branched C 1-6 alkyl optionally substituted with -NHCONH 2 .
  • R 1 is H, -L- # 1 or -L-BINDER, -MOD or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, where Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, CO-NY'Y 2 , or represents -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) o-3Z '(for example - (CH 2 ) 0 - 3 Z'), or -CH ( CH 2 W) represents Z ', and Y 3 represents H or - (CH 2 ) 0 - 3 Z', where Z 'is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, -NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH ( NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) i_ 3 COOH; where represents WH or OH,
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with-NHCONH 2 , G_6 alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R 2 represents H, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 ) 0 - 3 Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is independently linear or branched, optionally substituted with -NHCONH 2 , C i- ⁇ alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y is 6 linear or branched Ci-6 alkyl;
  • R 4 represents H or -L- # 1 and -L-BINDER, respectively (wherein -L- # 1 and -L-BINDER, respectively, is an enzymatically cleavable linker leading to the conversion of R 4 to H);
  • A represents CO, SO, S0 2 , S0 2 NH or CNNH 2 ;
  • R 3 represents -L-l or -L-BINDER, -MOD or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably a Ci-io-alkyl, C6 -io-aryl or C0-io-aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Ci-io-alkyl-O-C0-io-aryl or C5-10-heterocycloalkyl group, with 1-3 -OH Groups, 1-3 halogen atoms, 1-3 halogenated alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms), 1-3 O-alkyl groups, 1-3-SH groups, 1-3 -alkyl groups, 1-3 O-CO-alkyl groups, 1-3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups
  • R 5 is H, -MOD, NH 2 , NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 ) 0 - 3 represents Z, where Z is -H, -OY 3, -SY 3, halogen, NHY 3, -CO-NY'Y 2, or -CO-OY represents 3,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 ) 0 -3Z ', and Y 3 is H or - (CH 2 ) 0 - 3 Z', where Z 'is H, S0 3 H Represents NH 2 or COOH;
  • R 6 and R 7 are independently H, cyano, (optionally fluorinated) Ci-io alkyl, (optionally fluorinated) C2-10- alkenyl, (optionally fluorinated) C2 -io-alkynyl, hydroxy, N0 2, NH 2 , COOH or halogen (especially F, Cl, Br),
  • R 8 (optionally fluorinated) C- 10- alkyl, (optionally fluorinated) C 2 _io-alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 -io-alkynyl, or (optionally fluorinated) C 4 -o-cycloalkyl; where one of the substituents R 1 and R 3 represents -L- # 1 or -L-BINDER, respectively,
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; wherein -MOD - (NR 10 ) n - (GI) o -G2-G3, wherein
  • R 10 is H or C 1 -C 3 -alkyl
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • R y is H, phenyl, C 1 -C 4 -alkyl, C 2 -C 10 -alkyl, Alkenyl, or C2-C ⁇ o-Alkmyl, each with
  • R 1 is H, -L- # 1 or -L-BINDER, -MOD or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, where Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, CO-NY'Y 2 , or represents -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2, - (CH 2 CH 2 0) 0 3- (CH 2) o- 3 Z '(for example, - (CH 2) 0 - 3 Z'), or - Z is CH (CH 2 W) 'represent, and Y 3 is H or - (CH 2) 0 - 3.
  • Z' group wherein Z 'is H, NH 2, S0 3 H, COOH, -NH-CO-CH 2 -CH 2 represents -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) i_ 3 COOH; where represents WH or OH,
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with-NHCONH 2 , G_6 alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R 2 represents H, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 ) 0 - 3 Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2 , Ci-6 alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched G_6 is alkyl;
  • R 4 represents H
  • A represents CO, SO, S0 2 , S0 2 NH or CNNH 2 ;
  • R 3 represents -L-1-L or -L-BINDER, -MOD or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably a G-io-alkyl, C6 -io-aryl or coco-aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Ci-io-alkyl-0-C6 io-aryl or C5-10-heterocycloalkyl group having 1-3 -OH groups, 1-3 halogen atoms, 1-3 halogenated alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms), 1-3 O-alkyl groups, 1-3 -SH groups, 1-3 -alkyl groups, 1-3 -O- CO-alkyl groups, 1-3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups,
  • Groups 1-3 -NH-alkyl groups, 1-3 -N (alkyl) 2 groups, 1-3 NH ((CH 2 CH 2 0). 1 2 OH) groups, 1-3 NH 2 groups, or 1-3 - (CH 2 ) 0 - 3 Z groups, wherein Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , -NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 , Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2, or - (CH 2) 0 - 3.
  • Z ' represents, and Y 3 H, - (CH 2) o- 3 -CH (NHCOCH 3) Z' - ( CH 2 ) o- 3 -CH (NH 2 ) Z ', or - (CH 2 ) 0 - 3 Z', where Z 'is H, SO 3 H, NH 2 or COOH may be substituted (where "alkyl "preferably C is O-alkyl);
  • R 5 is H, -MOD, NH 2 , NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 ) 0 - 3 represents Z, where Z is -H, -OY 3, -SY 3, halogen, NHY 3, -CO-NY'Y 2, or -CO-OY represents 3,
  • Y 3 is H or - (CH 2) o- 3 Z' 3 Z - wherein Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2, or - (CH 2) 0 group, wherein Z 'is H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • R 6 and R 7 are independently H or halogen (especially F, Cl, Br);
  • R 8 represents (optionally fluorinated) C 1-10 alkyl; where one of the substituents R 1 and R 3 represents -L- # 1 or -L-BINDER, respectively,
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; wherein -MOD -CH 2 -S x - (CH 2) 0-4 -COOH -CHY 5, wherein x is 0 or 1, and Y 5 represents H or NHY 6, wherein Y6 is H or -COCH 3, and their salts, solvates and salts of solvates.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 have the abovementioned meanings (as indicated, for example, for formula (I) or (II)):
  • R 1 and R 5 are H or -L- # 1;
  • R 2 and R 4 are H or R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 - CHR 11 - or -CHR n -CH 2 -, where R 11 is H; and
  • R 3 is CH 2 OH, CH (CH 3 ) OH or -L- # 1, wherein one of the substituents R 1 and R 3 represents -L- # 1.
  • R 1 is H or COOH
  • R 2 and R 5 represent H
  • R 4 represents -L- # 1
  • R 3 is CH 2 OH, or CH (CH 3 ) OH, wherein -L- # 1 is an enzymatically cleavable linker which results in the conversion of R 4 into H.
  • linkers fall into the group of in vivo cleavable linkers and into the group of in vivo stable linkers (see L. Ducry and B. Stump, Bioconjugate Chem. 21_, 5-13 (2010)).
  • the in vivo cleavable linkers have an in vivo BHC 15 1 040-A - 50 -, which in turn can be distinguished between chemically in vivo cleavable and enzymatically in vivo cleavable groups.
  • “Chemically in vivo cleavable” or “enzymatically in vivo cleavable” means that the linkers or groups in the bloodstream are stable and only on or in the target cell by the changed there chemical or enzymatic environment (lower pH; Glutathione concentration, presence of lysosomal enzymes such as cathepsin or plasmin, or glycosidases such as ⁇ -glucuronidases) to cleave so as to release the low molecular weight KSP inhibitor or a derivative thereof.
  • the chemically in vivo cleavable groups are in particular disulfide, hydrazone, acetal and aminal; the enzymatically in vivo cleavable groups, in particular those which are cleavable by lysosomal enzymes, are in particular 2-8-oligopeptide group, in particular a tri- or dipeptide group or glycosides.
  • Peptide cleavage sites are disclosed in Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, and Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341-3346 and Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626. These include, for example, valine-alanine, valine-lysine, valine-citrulline, alanine-lysine and phenylalanine-lysine (optionally with additional amide group).
  • the in vivo stable linkers are characterized by a high stability (less than 5% metabolites after 24 hours in plasma) and do not have the above-mentioned chemically or enzymatically cleavable groups in vivo.
  • the linker -L- preferably has one of the following basic structures (i) to (iv):
  • the coupling may be to a tyrosine residue, glutamine residue or an unnatural amino acid of the antibody.
  • the unnatural amino acids may include, for example, aldehyde or keto groups (such as formyl glycine) or azide or alkyne groups (see Lan & Chin, Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806 ).
  • BHC 15 1 040-A - 51 -
  • the administration of a conjugate according to the invention having a linker basic structure (iii) and coupling of the linker to a cysteine or lysine residue of the antibody leads by metabolization to cysteine or lysine derivatives of the following formulas:
  • each LI is bound to the low molecular weight KSP inhibitor, for example a compound of formula (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (IIca), (Ild), (He), ( Iii), (III) or (IV).
  • linker basic structure (i) when bound to the position R4, in particular when m 0.
  • L2 is preferably derived from a group reactive with the sulfhydryl group of the cysteine.
  • groups include haloacetyls, maleimides, aziridines, acryloyls, arylating compounds, vinylsulfones, pyridyl disulfides, TNB-thiols and disulfide reducing agents.
  • These groups typically react electrophilically with the sulfhydryl bond to form a sulfide (e.g., thioether) or disulfide bridge. Preference is given to stable sulfide bridges.
  • L2 is preferable
  • # 'de denotes the point of attachment to the sulfur atom of the antibody
  • # 2 denotes the point of attachment to the group L 1
  • R 2 represents COOH, COOR, COR, CONHR, CONR 2 (each R is Cl-3-alkyl), CONH 2, preferably COOH.
  • L2 is:
  • the bonds to a cysteine residue of the antibody are preferably more than 80%, more preferably more than 90% (in each case based on the total number of links of the linker to the antibody), particularly preferably in one of the two structures of the formula A3 or A4 ago.
  • the structures of the formula A3 or A4 are generally present together, preferably in a ratio of 60:40 to 40:60, based on the number of bonds to the antibody. The remaining bonds are then in the structure
  • LI is preferably represented by the formula
  • R 10 is H, NH 2 or C 1 -C 3 alkyl; BHC 15 1 040-A 54
  • G represents -NHCO-, -CONH- or ⁇ /; (R i U is preferably not NH 2 , though
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, SO2, -NRY-,
  • NRYCO- -C (NH) NRy-, -CONRY-, -NRYNRY-, -SO 2 NRYNRY-, -CONRYNRY-, (wherein R y is H, phenyl, C 1 -C 1 alkyl, C 2 -C 1 g alkenyl, or C2-C1 represents g-alkynyl, each with
  • hydrocarbon chain including the side chains, if present, may be substituted by -NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid.
  • G2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO 2 NHNH-, -CONHNH- and a 5 to 1 O-membered, aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, or -SO- may be interrupted (preferably
  • OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted.
  • G 2 is preferably a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which are mono- or polysubstituted by one or more of the groups BHC 15 1 040-A - 55 -
  • hydrocarbon chain including the side chains if present, with -NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted.
  • Rx is H, Ci-C3-alkyl or phenyl.
  • # 1 is the binding to the KSP inhibitor and ffi is the binding to the coupling group to the antibody (e.g., L2).
  • a straight-chain or branched hydrocarbon chain of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups generally comprises an .alpha.,. Omega.-divalent alkyl radical having the respectively indicated number of carbon atoms. Examples which may be mentioned by way of example and are preferably: methylene, ethane-1,2-diyl (1,2-ethylene), propane-1,3-diyl (1,3-propylene), butane-1,4-diyl (1,4-diyl).
  • Butylene pentane-l, 5-diyl (1,5-pentylene), hexane-l, 6-diyl (1,6-hexylene), heptane-l, 7-diyl (1,7-hexylene), octane l, 8-diyl (1,8-octylene), nonane-l, 9-diyl (1,9-nonylene), decane-l, 10-diyl (1,10-decylene).
  • alkylene groups in the hydrocarbon chain can also be branched, ie one or more H atoms of the abovementioned linear alkylene groups can optionally be substituted by C 1-10 -alkyl groups and thus form side chains.
  • the hydrocarbon chain can furthermore contain cyclic alkylene groups (cycloalkanediyl), for example 1,4-cyclohexanediyl or 1,3-cyclopentanediyl. These cyclic groups can BHC 15 1040-A - 56 - unsaturated.
  • aromatic groups may be present in the hydrocarbon group, for example phenylene.
  • one or more H atoms may optionally be substituted by C 1-10 -alkyl groups. It is thus formed a hydrocarbon chain, which is optionally branched. This hydrocarbon chain has a total of 0 to 100 carbon atoms, preferably 1 to 50, particularly preferably 2 to 25 carbon atoms.
  • the side chains may be mono- or polysubstituted, identically or differently, by -NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid.
  • the hydrocarbon chain can be mono- or polysubstituted, identically or differently, by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, S0 2 , -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe- , -NHNH-, -SO 2 NHNH-, -CONHNH- and a 5 to 1 O-membered, aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, -SO- or -SO 2 - be interrupted.
  • the linker corresponds to the following formula:
  • m is 0 or 1; BHC 15 1 040-A - 58 -
  • ⁇ represents the binding to the drug molecule
  • ⁇ represents the binding to the binder peptide or protein
  • LI has the formula -NR! Eat-up, where
  • R n represents H or NH 2 ;
  • B represents - [(CH 2 ) x - (X 4 ) y ] w - (CH 2 ) z -,
  • Linker L preferred according to the invention has the following formula:
  • # 3 represents the binding to the drug molecule
  • # 4 represents binding to the binder peptide or protein
  • R 1 1 represents H or NH 2 ;
  • B represents - [(CH 2 ) x - (X 4 ) y ] w - (CH 2 ) z -,
  • X 4 is -O-, -CONH-, -NHCO- or represents.
  • linkers are particularly preferred in conjugates of the formula (I) or (II) in which the linker attaches to R4 by substitution of an H atom on Rl or in conjunction with a cleavable linker SGI, i. R1-L- # 1 represents or R4 -SG1-L- # 1, where # 1 represents the binding to the antibody.
  • the bonds to a cysteine residue of the antibody are preferably more than 80%, particularly preferably more than 90% (in each case based on the total number of linker bonds to the antibody), particularly preferably in one of the two structures of the formula A5 or A6 before:
  • # 'de denotes the point of attachment to the sulfur atom of the antibody
  • # 2 denotes the point of attachment to the group L 1
  • R 22 is COOH, COOR, COR, CONR 2 , CONHR (where R is Cl-3-alkyl), CONH 2 , preferably COOH.
  • the structures of the formula A5 or A6 are generally present together, preferably in a ratio of 60:40 to 40:60, based on the number of bonds to the antibody. The remaining bonds are then in the structure
  • linker -L- attached to a cysteine side chain or cysteine residue have the following formula:
  • ⁇ represents the binding to the drug molecule
  • ⁇ represents the binding to the binder peptide or protein
  • n 0, 1, 2, or 3;
  • n 0, 1 or 2;
  • p is 0 to 20;
  • o 0 or 1
  • G3 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, SO 2, -NH -, -CO-, -NHCO-, - CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO 2 NHNH-, -CONHNH- and a 3 to 10-membered (preferably 5 to 10-membered), aromatic or non-aromatic heterocycle of up to 4 Heteroatoms selected from N, O and S, -SO- or -S02- may be interrupted, wherein the side chains, if present, with -NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 , sulfonamide, sulfone , Sulfoxide or sulf
  • n 1;
  • n 0;
  • o 0 or 1
  • s, t, v and w are each independently 0 to 20, and u is 0 or 1.
  • Preferred groups LI in the above formula ⁇ - (CO) m-L1-L2- ⁇ are the following, wherein each r independently of one another is a number from 0 to 20, preferably from 0 to 15, particularly preferably from 1 to 20, in particular preferably from 2 to 10:
  • linkers LI indicated in these lines are linked to a linker L2 which is selected from:
  • the bonds to a cysteine residue of the binder are preferably more than 80%, more preferably more than 90% (in each case based on the total number of bonds of the linker to the binder), particularly preferably in one of the two structures of the formula A7 or A8 before.
  • the structures of the formula A7 or A8 are generally present together, preferably in a ratio of 60:40 to 40:60, based on the number of bonds to the binder. The remaining bonds are then in the structure
  • conjugates with corresponding linkers have the following structures, where XI is CH, X 2 C, and X 3 is N, and L 1 has the abovementioned meaning, L 2 and L 3 have the same meaning as LI, AK 1 for an (aglycosylated) anti-B 7 H 3 - Antibody bound via a cysteine residue and n is a number from 1 to 10.
  • AK1 is a human, humanized or chimeric monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • AK1 is an anti-B7H3 antibody which specifically binds the human Ig4 and / or the human and / or murine Ig2 isoform of B7H3, in particular one of the anti-B7H3 antibodies TPP-6497, TTP-6499, TPP -6501, TPP-6502, TPP-6515 ..
  • the anti-B7H3 antibody or the antigen-binding fragment is aglycosylated.
  • the linker When the linker is attached to a lysine side chain or a lysine residue, it preferably has the following formula:
  • ⁇ represents the binding to the drug molecule
  • ⁇ represents the binding to the binder peptide or protein
  • x 0 or 1
  • SG is a cleavable group, preferably a 2-8 oligopeptide, especially, preferably a dipeptide,
  • L4 represents a single bond or a group - (CO) y -G4-, wherein y represents 0 or 1, and G4 represents a straight or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms from arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, SO 2 , -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH- , -SO 2 NHNH-, -CONHNH- and a 5- to 10-membered aromatic or non-aromatic heterocycle may be interrupted with up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, -SO- or -SO 2 - (preferably
  • linkers to a lysine residue are given in Table B below.
  • the preferred coupling site (R'-R 5 ) is further specified.
  • the example numbers are given, in which find appropriate linker application.
  • conjugates with corresponding linkers have the following structures, wherein XI is CH, X2 C, and X3 N, and L4 have the meanings given above, AK2 is an antibody which is bonded via a lysine residue, and n is a number of 1 to 10 is. Preferred as AK2 is a human, humanized or chimeric monoclonal, anti-B7H3 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • anti-B7H3 antibodies which specifically bind the human Ig4 and / or the human and / or murine Ig2 isoform of B7H3, in particular the anti-B7H3 antibodies TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515.
  • the anti-B 7H3 antibody or the antigen-binding fragment is aglycosylated.
  • SGI or SG is particularly preferred
  • X is H, a G-io-alkyl group which may be optionally substituted with -NHCONH 2 , -COOH, -OH, NH 2 , -NH-CNH 2 , or sulfonic acid.
  • these groups LI can be exchanged by one of the groups LI given for the above formula ⁇ - (CO) m-Ll-L2- ⁇ .
  • L2 is a succinic acid amide or derived therefrom, this amide can be partially or completely pre-purified in the form of the hydrolyzed open-chain succinamide, as described above.
  • conjugates having the basic structure (i) have the following structure, wherein XI is CH, X2C, and X3 is N, L4 has the same meaning as LI, AK1 is an anti-B7H3 antibody linked via a cysteine residue is, and n is a number from 1 to 10.
  • the antibody is preferably an aglycosylated human, humanized or chimeric anti-B 7H3 monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • an anti-B 7H3 antibody which specifically binds the human 4Ig isoform, in particular one of the anti-B7H3 antibodies TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP-6502 and TPP-6515In another preferred Embodiment, the anti-B7H3 antibody or the antigen-binding fragment is aglycosylated.
  • the conjugates according to the invention are prepared by initially providing the low molecular weight KSP inhibitor with a linker. The intermediate thus obtained is then reacted with the binder (preferably antibody).
  • cysteine residue For coupling to a cysteine residue it is preferred to use one of the following compounds with the cysteine-containing binder, e.g. an antibody that may have been partially reduced, implemented:
  • R represents -H or -COOH
  • K is linear or branched, optionally substituted with G-C ⁇ alkoxy or -OH substituted G-Ce alkyl, and
  • XI CH, X2 C, and X3 is N, SGI, LI, L2, L3 and L4 have the same meaning as described above.
  • the tert-butyl group may be replaced by cyclohexyl.
  • the compound may be used, for example, in the form of its trifluoroacetic acid salt.
  • the antibody is preferably used in 2 to 12-fold molar excess over the binder.
  • lysine residue For the coupling to a lysine residue, one of the following compounds is preferably reacted with the lysine-containing binder such as an antibody: BHC 15 1 040-A - 135 -
  • This reaction can be carried out at pH 7.5 to 9, preferably at pH 8, at a temperature of 25 ° C to 37 ° C, e.g. by stirring.
  • the preferred stirring time is 8 to 30 hours.
  • X 1 represents CH, X 2 C, and X 3 represents N)
  • SG 1 and L 1 have the same meaning as described above
  • L 2, L 3, and L 4 have the same meaning as L I
  • R and K have the same meaning as described above.
  • AK1 is a cysteine residue-linked anti-B7H3 antibody or antigen-binding fragment thereof
  • AK2 is a lysine-linked anti-B7H3 antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • AK1 and AK2 is an anti-B7H3 antibody that specifically binds the human 41g isoform, particularly one of the anti-B7H3 antibodies TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP-6502, and TPP-6515.
  • the antibodies or antigen-binding fragments are present in an aglycosylated manner.
  • the anti-B7H3 antibody is preferably a human, humanized or chimeric monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof. Particularly preferred are anti-B7H3 antibodies or antigen-binding fragments which specifically bind the human Ig4 and / or the human and / or murine Ig2 isoform of B7H3, in particular the anti-B7H3 antibody TPP-6497, TTP-6499 , TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515
  • the antibodies or antigen-binding fragments are aglycosylated. In this case, aglycosyl or aglycosylated antibodies have no glycans at the conserved N binding site in the CH2 domain of the Fc region.
  • the conjugation of the toxophore to the antibody is preferably via one or more sulfur atoms of cysteine residues of the antibody and / or via one or more NH groups of lysine residues of the antibody.
  • the antibody can be linked via a linkage with the linker.
  • the linkage of the antibody can be effected by means of a heteroatom of the binder.
  • Heteroatoms of the invention which can be used for linking are sulfur (in a BHC 15 1 040-A - 144 -
  • Embodiment via a sulfhydryl group of the antibody oxygen (according to the invention by means of a carboxyl or hydroxyl group of the antibody) and nitrogen (in one embodiment via a primary or secondary amine group or amide group of the antibody).
  • These heteroatoms may be present in the natural antibody or introduced by chemical or molecular biological methods.
  • the linkage of the antibody with the toxophore has only a small influence on the binding activity of the antibody to the target molecule. In a preferred embodiment, the linkage has no influence on the binding activity of the antibody to the target molecule.
  • an immunoglobulin molecule preferably comprises a molecule having four polypeptide chains, two heavy chains (H chains) and two light chains (L chains), which are typically linked by disulfide bridges.
  • Each heavy chain comprises a heavy chain variable domain (abbreviated VH) and heavy chain constant domain.
  • the heavy chain constant domain may include three domains CHI, CH2 and CH3.
  • Each light chain comprises a variable domain (abbreviated VL) and a constant domain.
  • the constant domain of the light chain comprises a domain (abbreviated to CL).
  • the VH and VL domains can be further subdivided into regions of hypervariability, also called complementarity determining regions (abbreviated to CDR) and regions of lower sequence variability (FR).
  • CDR complementarity determining regions
  • FR regions of lower sequence variability
  • Each VH and VL region typically consists of three CDRs and up to four FRs.
  • An antibody can be obtained from any suitable species, e.g. Rabbit, llama, camel, mouse, or rat. In one embodiment, the antibody is of human or murine origin.
  • An antibody can e.g. be humane, humanized or chimeric.
  • monoclonal antibody refers to antibodies obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, ie, individual antibodies of the population are identical except for naturally occurring mutations which can occur in small numbers.Monoclonal antibodies recognize with high specificity a single antigenic binding site The term monoclonal antibody does not refer to a particular manufacturing process.
  • intact antibody refers to antibodies comprising both an antigen-binding domain and the light and heavy chain constant domain BHC 15 1 040-A - 145 -
  • Domain may be a naturally occurring domain, or a variant thereof where multiple amino acid positions have been altered.
  • modified intact antibody refers to intact antibodies that have been fused to another non-antibody polypeptide or protein via their amino terminus or carboxy-terminus via a covalent bond (eg, a peptide linkage) modified to introduce reactive cysteines at defined sites to facilitate coupling to a toxophore (see Junutula et al., Nat Biotechnol., 2008 Aug; 26 (8): 925-32).
  • a covalent bond eg, a peptide linkage
  • human antibody refers to antibodies that can be obtained from a human or are synthetic human antibodies
  • a "synthetic” human antibody is an antibody that is available in part or in full as a whole from synthetic sequences in silico that are based on the Analysis of human antibody sequences.
  • a human antibody can e.g. be encoded by a nucleic acid isolated from a library of antibody sequences of human origin. An example of such antibodies is in Söderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18: 853-856.
  • humanized or “chimeric” antibody describes antibodies consisting of a non-human and a human sequence portion. In these antibodies, part of the sequences of the human immunoglobulin (recipient) is replaced by sequence portions of a non-human immunoglobulin (donor).
  • the donor is a murine immunoglobulin in many cases.
  • amino acids of the CDR of the recipient are replaced with amino acids of the donor. Sometimes amino acids of the framework are replaced by corresponding amino acids of the donor.
  • the humanized antibody contains amino acids that were not contained in either the recipient or the donor and that were inserted during optimization of the antibody.
  • the variable domains of the donor immunoglobulin are fused to the constant regions of a human antibody.
  • complementarity determining region refers to those amino acids of a variable antibody domain necessary for binding to the antigen.
  • Each variable region typically has three CDR regions, referred to as CDR1, CDR2 and CDR3.
  • Each CDR region may comprise amino acids as defined by Kabat and / or amino acids of a hypervariable loop defined by Chotia.
  • the Kabat definition includes, for example, the region of approximately amino acid position 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) and 89-97 (CDR3) of the variable light chain and 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2). and 95-102 (CDR3) variable heavy chain BHC 15 1 040-A - 146 -
  • Chotia includes, for example, the region of approximately amino acid position 26-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) and 91-96 (CDR3) of the variable light chain and 26-32 (CDR1), 53-55 (CDR2). and 96-101 (CDR3) of the variable heavy chain Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)).
  • CDR1 amino acid position 26-32
  • CDR2 50-52
  • CDR3 91-96
  • CDR3 variable light chain
  • CDR2 53-55
  • CDR3 96-101
  • a CDR may comprise amino acids from a CDR region as defined by Kabat and Chotia.
  • antibodies can be divided into different classes. There are five major classes of intact antibodies: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, several of which can be broken down into other subclasses. (Isotypes), e.g. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2.
  • the heavy chain constant domain corresponding to the different classes are referred to as [alpha / a], [delta / ⁇ ], [epsilon / ⁇ ], [gamma / ⁇ ] and [my / ⁇ ]. Both the three-dimensional structure and the subunit structure of antibodies are known.
  • the antigen binding domain typically comprises one or more hypervariable regions of a ⁇ , eg the CDR, CDR2 and / or CDR3 region
  • the antigen binding domain comprises at least amino acids 4 to 103 of the variable light chain and amino acids 5 to 109 of the variable heavy chain, more preferably amino acids 3 to 107 of the variable light chain Chain and 4 to 11 of the variable heavy chain, particularly preferred are the complete variable light and heavy chains, so amino acid 1 - 109 of the VL and 1 to 1 13 of the VH (numbering according to WO97 / 08320).
  • “Functional fragments” or “antigen-binding of the invention include, but are not limited to, Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv fragments, diabodies, single domain antibodies (DAbs), linearae ⁇ , single chains ⁇ (single-chain Fv, abbreviated scFv); and multispecific, such as bi- and tri-specific, ⁇ , formed from CA K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Other ⁇ as “multi-specific” or “multi-functional” are those with identical binding sites.
  • Multispecific ⁇ can BHC 151040-A - 147 - be specific for different epitopes of an antigen or be specific for epitopes of more than one antigen (see eg WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt , et al., 1991, J. Immunol., 147: 60 69; U.S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,7 14,68 1; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; or Kostelny et al., 1992, J. Immunol 148: 1547 1553).
  • An F (ab 'or Fab) molecule can be designed to reduce or completely prevent the number of intermolecular disulfide interactions that occur between the Chi and CL domains.
  • Epitopic determinants refers to protein determinants that can specifically bind to an immunoglobulin or T cell receptor Epitopic determinants usually consist of chemically active surface groups of molecules such as amino acids or sugar side chains, or combinations thereof, and typically have specific 3-dimensional structural properties such as also specific charge characteristics.
  • “Functional fragments” or “antigen-binding antibody fragments” may be fused to another non-antibody polypeptide or protein via their amino-terminus or carboxy-terminus via a covalent bond (e.g., a peptide linkage). Furthermore, antibodies and antigen-binding fragments can be modified to introduce reactive cysteines at defined sites to facilitate coupling to a toxophore (see Junutula et al., Nat Biotechnol., 2008 Aug; 26 (8): 925-32) ).
  • Polyclonal antibodies can be prepared by methods known to those of ordinary skill in the art.
  • Monoclonal antibodies can be prepared by methods known to those of ordinary skill in the art (Köhler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).
  • Humanized human monoclonal antibodies can be prepared by methods known to those of ordinary skill in the art (Olsson et al., Meth Enzymol., 92, 3-16 and Cabilly et al., US 4,816,567 or Boss et al., US 4,816,397).
  • Antibodies of the invention may be obtained from recombinant antibody libraries consisting, for example, of the amino acid sequences of a variety of antibodies generated from a large number of healthy volunteers. Antibodies can also be made by known recombinant DNA technology. The nucleic acid sequence of an antibody can be obtained by routine sequencing, or is available from publicly available databases. BHC 15 1 040-A - 148 -
  • an “isolated” antibody or binder has been purified from other components of the cell Contaminating components of a cell that may interfere with a diagnostic or therapeutic use are, for example, enzymes, hormones, or other peptidic or non-peptidic components of a cell an antibody or binder that has been purified to more than 95% by weight of the antibody or binder (determined, for example, by Lowry method, UV-Vis spectroscopy, or by SDS capillary gel electrophoresis) and an antibody which has been purified to such an extent at least fifteen amino acids of the amino terminus or an internal amino acid sequence can be determined or purified to homogeneity, the homogeneity being determined by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions (the detection can be determined by Coomassie blue staining or preferably by silver staining)
  • ei Antibodies are usually produced by one or more purification steps.
  • specific binding refers to an antibody or binder that binds to a predetermined antigen / target molecule. Specific binding of an antibody or binder typically describes an antibody or binding with an affinity of at least 10 "7 M (as a Kd value thus preferably those with smaller Kd values as IQ"'7 M).
  • the antibody has at least two-fold higher affinity for the predetermined antigen / target molecule than for a non-specific antigen / target molecule (eg, bovine serum albumin, or casein) that is not the predetermined antigen / target molecule or a closely related antigen / target molecule
  • the antibodies preferably have an affinity of at least 10.sup.- 7 M (as Kd value, thus preferably those having smaller Kd values than 10.sup.- 7 M), preferably of at least 10.sup.- 8 M, more preferably in the range of 10 " ⁇ M to 10 " ⁇ M.
  • the Kd values can be determined by, for example, surface plasmon resonance spectroscopy.
  • the antibody-drug conjugates of the invention also have affinities in these areas.
  • the affinity preferably is not significantly affected (in general, the affinity is less than an order of magnitude reduced, eg a maximum of 10 "8 M to 10 -7 M).
  • the antibodies used according to the invention are furthermore preferably characterized by a high selectivity.
  • a high selectivity is present when the antibody according to the invention has an affinity to the target protein which is better by at least a factor 2, preferably factor 5 or especially preferred factor 10 than at an independent other antigen, eg human serum albumin (the affinity can be determined eg by surface plasmon resonance spectroscopy) , BHC 15 1 040-A - 149 -
  • the antibodies used according to the invention are preferably cross-reactive.
  • the antibody used according to the invention binds not only the human target protein but also binds the species target protein in the species used for the studies .
  • the antibody used according to the invention is, in addition to the human target protein, cross-reactive to the target protein of at least one other species.
  • species of the family rodents, dogs and non-human primates are preferably used.
  • Preferred rodent species are mouse and rat.
  • Preferred non-human primates are rhesus monkeys, chimpanzees and long-tailed macaques.
  • the antibody used according to the invention is cross-reactive with the target protein of at least one other species selected from the group of species consisting of mouse, rat and long-tailed macaque (Macaca fascicularis).
  • the target protein of at least one other species selected from the group of species consisting of mouse, rat and long-tailed macaque (Macaca fascicularis).
  • antibodies used according to the invention which, in addition to the human target protein, are at least cross-reactive with the mouse target protein.
  • the target molecule against which the binder e.g. an antibody or antigen-binding fragment thereof, a cancer target molecule.
  • cancer target molecule describes a target molecule that is more abundant on one or more types of cancer cells than non-cancerous cells of the same tissue type
  • the cancer targeting molecule is selectively present on one or more cancer cell types compared to non-cancerous cells of the same tissue type wherein selectively describes at least two-fold accumulation on cancer cells compared to non-cancer cells of the same tissue type (a "selective cancer target molecule”).
  • selective cancer target molecule allows the selective therapy of cancer cells with the conjugates of the invention.
  • Antibodies that bind cancer targeting molecules can be prepared by those of ordinary skill in the art by known methods such as chemical synthesis or recombinant expression. Cancer target binders can be purchased commercially or can be prepared by one of ordinary skill in the art by known methods such as chemical synthesis or recombinant expression. Other methods of producing antibodies or antigenic BHC 15 1040-A-150 binding antibody fragments are described in WO 2007/070538 (see page 22 "Antibodies").
  • phage display libraries eg Morphosys HuCAL Gold
  • Antigen-binding antibody fragments can be used (see WO 2007/070538, page 24 et seq., and AK Example 1 on page 70, AK Example 2 on page 72.)
  • Other methods of producing antibodies using DNA libraries from B cells are described on page 26 (WO 2007/070538)
  • Methods for humanizing antibodies are described on pages 30-32 of WO2007070538 and in detail in Queen, et al., Pro. Natl. Acad.
  • Harlow et al. (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (19881, Paul [Ed.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); and Harlow, et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998).)
  • Those skilled in the art are familiar with the corresponding vectors, promoters and signal peptides necessary for the expression of a protein / antibody.
  • the antibodies of the invention are glycosylated or aglycosylated, i. in the latter case, they have no glycans at the conserved N-binding site in the CH2 domain of the Fc region.
  • an anti-B7H3 antibody or an antigen-binding fragment thereof is used, preferably TPP6497, 6499, 6501, 6502, 6515 or derived therefrom BHC 15 1 040-A - 151 -
  • the invention relates to conjugates with antibodies, antigen-binding antibody fragments thereof or variants thereof which have the following properties: binding to human B7H3, i. no binding to human B7H2 or human B7H4; Effectively and specifically killing B7H3-expressing tumor cells in vitro and in vivo.
  • the antibodies of the invention bind to epitopes which are particularly suitable for internalization after binding.
  • the antibodies of the invention are characterized by a low immunogenicity in human use, by as far as possible approaching the amino acid sequence of the antibodies to human germ line sequences.
  • a fully human antibody phage library (Biolnvent n-CoDeR Fab lambda library) was used to screen B7H3-specific human monoclonal antibodies of the present invention by protein panning (Hoogenboom HR, Nat Biotechnol 2005; 23 (3): 1105-16) with murine B7H3 as an immobilized target protein.
  • the antigens were desalted, following the instructions of the supplier, with about a two-fold molar excess of biotin-LC-NHS (Pierce, Cat No 21347) and Zeba desalination columns (Pierce, Cat No. 89889). Washed magnetic beads (Dynabeads) overnight with 800nM biotinylated protein at 4 degrees Celsius and then blocked for 1 hour at 4 degrees Celsius with blocking buffer (PBS with 3% Meadow Powder, 0.05% Tween-20).
  • the blocked Fab phage library was added to blocked TPP2202-loaded beads (Dynabeads streptavidin M280 - Invitrogen 112-06D) and incubated for 5 minutes at room temperature. This depletion step was repeated four times. The depleted Fab phage library was added to blocked beads loaded with TPP3762 and incubated for 60 minutes at room temperature.
  • TPP-3762 became -specific binders resuspended in PBS and used for amplification directly with for infection of the Escherichia coli strain TG1.
  • TPP-3762 Concentration of TPP-3762 reduced to 400nM to increase the selection pressure for high-affinity binders.
  • a second and third round of selection were performed on human B7H3-expressing cell lines.
  • the human renal carcinoma cell line A498 (ATCC, HTB-44) and the human adenocarcinoma cell line MCF-7 (ATCC, HTB-22) was used with lxlO 7 cells in the second and third round as selection antigen.
  • the cells were supplemented in 80% (v / v) RPMI 1640 GlutaMAX-I medium (Life Technologies, Cat. No. 61870-010) supplemented with 20% (v / v) fetal bovine serum (FBS, Life Technologies, Cat.
  • the cells were resuspended in 15 ml prewarmed PBS and incubated for 15 minutes at 37 degrees Celsius to allow internalization.
  • the cell membrane-bound Fab phage were removed by incubation with 1 ml of 76 mM citric acid.
  • the cells were washed again and centrifuged as above.
  • the internalized Fab phages were recovered by incubating the cell pellet with 1 ml lysis buffer (100 mM triethylamine) for 10 minutes and neutralizing in 0.5 ml IM Tris-HCl, pH 7.5.
  • the lysate fractions were amplified by infection of TG1 cells.
  • the resulting phage were sequenced and corresponding DNA sequences were cloned into a mammalian IgG expression vector and expressed as full-length IgGs.
  • these constructs were transiently expressed in mammalian cells as described by Tom et al., Chapter 12 in Methods Express: Expression Systems, edited by Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007.
  • the antibodies were purified by protein A chromatography and characterized its binding to human B7H3 and human B7H2 and B7H4 by Elisa as described in AK Example 1.
  • TPP 6497, TPP6499, TPP6501, TPP6502 and TPP6515 showed attractive binding properties.
  • TPP-6497 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 9 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 10.
  • TPP-6499 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 19 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 20.
  • TPP-6501 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 29 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 30.
  • TPP-6502 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 39 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 40.
  • TPP-6515 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 49 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 50.
  • TPP-6497 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 5.
  • TPP-6499 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 11 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 15.
  • TPP-6501 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 21 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 25.
  • TPP-6502 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 31 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 35.
  • TPP-6515 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 41 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 45.
  • TPP-7611 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 5.
  • TPP-8382 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 55 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 57.
  • TPP-8564 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 55 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 57.
  • TPP-8567 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 55 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 57.
  • TPP-8322 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 63 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 35.
  • TPP-8565 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 63 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 35.
  • TPP-8568 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 63 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 35.
  • TPP-8748 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 63 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 68.
  • TPP-8750 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 63 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 68.
  • Preferred embodiments of the anti-B7H3 antibody for coupling with linkers and / or toxophores according to the invention are the following antibodies:
  • SEQ ID NO: 52 represents the amino acid sequence of the extracellular domain of the human B7H3 polypeptide.
  • An antibody which binds to B7H3 or an antigen-binding fragment thereof comprising: a variable heavy chain comprising the variable heavy chain CDR1 sequence as represented by SEQ ID NO: 2, the heavy chain CDR2 variable sequence, such as represented by SEQ ID NO: 3 and the heavy chain variable CDR3 sequence as represented by SEQ ID NO: 4 and a variable light chain comprising the variable CDR1 light chain sequence represented by SEQ ID NO: 6, the variable CDR2 A light chain sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a light chain variable CDR3 sequence represented by SEQ ID NO: 8, or a variable heavy chain comprising the variable CDR1 heavy chain sequence represented by SEQ ID NO Figure 12, the heavy chain CDR2 variable sequence as represented by SEQ ID NO: 13 and the heavy chain CDR3 variable sequence as represented by SEQ ID NO: 14 and a variable light chain send the variable CDR1 light chain variable sequence represented by SEQ ID NO: 16, the light chain variable CDR2 sequence represented by SEQ ID NO: 17, and the light chain variable CDR3 sequence represented by S
  • the antibody according to embodiment 4 or an antigen-binding fragment thereof comprising: a heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 1 and a light chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 5 or a heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 11 and a light chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 15 or a heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 21, as well as a light chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 25 or a heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 31 and a light chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 35, or a heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 41, and a light chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 45, or a heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 55, as well as a light chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 57.
  • the antibody according to any one of the preceding embodiments or an antigen-binding fragment thereof comprising: a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 9, and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 10 or a sequence of the heavy chain A chain as represented by SEQ ID NO: 19, and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 20 or a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 29, and a light chain sequence such as represented by SEQ ID NO: 30 or a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 39, and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 40, or BHC 151040-A - 158 - a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 49, and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 50, or a heavy chain sequence represented by SEQ ID NO: 59 and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 60 or a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 61 and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO:
  • the anti-B7H3 antibody is a humanized variant of one of the antibodies TPP-6497, TPP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515, TPP - 7611, TPP-8382, TPP-8564, TPP-8567, TPP-8322, TPP-8565, TPP-8568, TPP-8748 and TPP-8750.
  • the antibody according to any one of the preceding embodiments or an antigen-binding fragment thereof comprising: a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 9 containing at least one amino acid substitution selected from a group containing the substitutions R30S, S50A, V51I , A58T, L59Y, T97A, R98K and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 10 containing at least one amino acid substitution selected from a group containing the substitutions P33T, G51S, S53N, N54Q, S77T, BHC 15 1 040-A - 159 -
  • a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 39 containing at least one amino acid substitution selected from a group containing the T31 S, G33A, H35S, T97A, R98K, L113T substitutions and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 40 containing at least one amino acid substitution selected from a group containing the substitutions G25S, P33Y, P33T, N35Y, G51R, S53N, K54Q, Q90A, S91A, Y92W, S94D, W99V, G103E, K106E, or a sequence heavy chain as represented by SEQ ID NO: 49, which contains at least one amino acid substitution selected from a group containing the substitutions G33A, H35S, V40A, T57S, L104Y, L104W, Y107S, as well as BHC 15 1040-A - 160 - a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 50 containing at least one amino acid substitution selected from a group containing the substitution
  • the antibody according to one of the preceding embodiments comprising: The antigen-binding fragment according to one of the preceding embodiments or an antigen-binding fragment of an antibody according to one of the preceding embodiments which contains an scFv, Fab, Fab 'fragment or an F (ab) 2 fragment is.
  • the antibody or antigen-binding fragment according to any one of the preceding embodiments which is a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the anti-B7H3 antibodies TPP-6497, TPP-6499, TPP-6501, TPP-6502 and TPP-6515.
  • the subject of the present invention accordingly also comprises humanized variants of the anti-B7H3 antibodies according to the invention, with the amino acid substitutions listed below, where P33T represents a substitution of P by T at amino acid position 33 of the respective chain of the antibody, G51S a substitution of G by S at position 51 of the respective chain of the respective antibody, etc.
  • TPP-6499 light chain G25S, Y26S, V29I, G31S, N33Y, N33T, N35Y, G51R,
  • the present invention also includes all suitable isotopic variants of the compounds of the invention.
  • An isotopic variant of a compound according to the invention is understood to mean a compound in which at least one atom within the compound according to the invention is exchanged for another atom of the same atomic number but with a different atomic mass than the atomic mass that usually or predominantly occurs in nature.
  • isotopes which can be incorporated into a compound of the invention are those of hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur, fluorine, chlorine, bromine and iodine, such as 2 H (deuterium), 3 H (tritium), 13 C, 14 C, 15 N, O, 18 O, 32 P, 33 P, 33 S, 34 S, 35 S, 36 S, 18 F, 36 C, 82 Br, 123 I, 124 I, 129 I, and 131 I.
  • isotopic variants of a compound of the invention such as, in particular, those in which one or more radioactive isotopes are incorporated, may be useful, for example, for the study of the mechanism of action or distribution of active ingredient in the body; Due to the comparatively easy production and detectability, compounds labeled with 3 H or 14 C isotopes are particularly suitable for this purpose.
  • isotopes such as deuterium may result in certain therapeutic benefits as a result of greater metabolic stability of the compound, such as prolonging the body's half-life or reducing the required effective dose;
  • Such modifications of the compounds of the invention may therefore optionally also constitute a preferred embodiment of the present invention.
  • Isotopic variants of the compounds according to the invention can be prepared by the processes known to the person skilled in the art, for example by the methods described below and by the methods described below.
  • BHC 15 1 040-A - 162 - Examples reproduced by appropriate isotopic modifications of the respective reagents and / or starting compounds are used.
  • Salts used in the context of the present invention are physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention. Also included are salts which are themselves unsuitable for pharmaceutical applications but can be used, for example, for the isolation or purification of the compounds of the invention.
  • Physiologically acceptable salts of the compounds of the invention include acid addition salts of mineral acids, carboxylic acids and sulfonic acids, e.g. Salts of hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, naphthalenedisulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, lactic acid, tartaric acid, malic acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid and benzoic acid.
  • salts of hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, naphthalenedisulfonic acid acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid
  • Physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention also include salts of customary bases, such as, by way of example and by way of preference, alkali metal salts (for example sodium and potassium salts), alkaline earth salts (for example calcium and magnesium salts) and ammonium salts derived from ammonia or organic amines having 1 to 16 carbon atoms, for example and preferably, ethylamine, diethylamine, triethylamine, ethyldiisopropylamine, monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, dimethylaminoethanol, procaine, dibenzylamine, N-methylpiperidine, N-methylmorpholine, arginine, lysine and 1,2-ethylenediamine.
  • customary bases such as, by way of example and by way of preference, alkali metal salts (for example sodium and potassium salts), alkaline earth salts (for example calcium and magnesium salts) and ammonium salt
  • Solvates in the context of the invention are those forms of the compounds according to the invention which form a complex in the solid or liquid state by coordination with solvent molecules. Hydrates are a special form of solvates that coordinate with water. As solvates, hydrates are preferred in the context of the present invention.
  • the present invention also includes prodrugs of the compounds of the invention.
  • prodrugs refers to compounds which themselves may be biologically active or inactive, but are converted during their residence time in the body to compounds of the invention (for example metabolically or hydrolytically).
  • KSP-L- is a compound of the following formula (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (Ile) (III), (IIj), (Ilk) or the following formula (Iii)
  • the binder is an anti-B7H3 antibody, which may be aglycosylated, or an antigen-binding fragment thereof.
  • Anti-B7H3 antibodies which specifically bind the human Ig4 and / or the human and / or murine Ig2 isoform of B7H3, in particular the anti-B7H3 antibodies TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, are particularly preferred , TPP-6502, TPP-6515 .., where n is a number from 1 to 10:
  • A is CO (carbonyl);
  • R 1 -L- # 1 H, -COOH, -CONHNH 2, - (CH 2 ) i- 3 NH 2 , -CONZ "(CH 2 ) i- 3 NH 2 and -CONZ" CH 2 COOH, wherein Z "H or NH 2 ;
  • R 2 and R 4 are H, or R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) are -CEh-CHR 11 - or -CHR n -CH 2 -, wherein R 11 is H; BHC 15 1 040-A - 164 -
  • R 5 is H or F
  • R 6 and R 7 are independently H, (optionally fluorinated) G-3-alkyl, (optionally fluorinated) C 2 _4 alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 -4 alkynyl, hydroxy or halogen;
  • R 8 is a branched C 1-5 alkyl group
  • R 9 is H or F, wherein one of the substituents R 1 and R 3 represents -L- # 1, and
  • L represents the linker and # 1 represents the binding to the antibody, as well as salts, solvates and salts of the solvates of the ADC.
  • the linker is preferably a linker
  • n 0 or 1
  • ⁇ represents the binding to KSP
  • ⁇ represents the binding to the antibody
  • R 10 is H, NH 2 or C 1 -C 3 alkyl; Gl -NHCO- or represents;
  • n 0 or 1
  • 0 is 0 or 1
  • G2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO 2 NHNH-, -CONHNH- and a 3 to
  • - N N-CO- selected from N, O and S, or -SO- may be interrupted (preferably ⁇ /), the side chains, if present, with -NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH -CNNH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted.
  • # 1 is the binding to the KSP inhibitor and ffi is the binding to the coupling group to the antibody (e.g., L2).
  • KSP-L- is a compound of the following formula (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (Ild), (Ile) , (Ilf), (Iii), (Ilj), (Ilk) or the following formula (Il'g) or the following formula (Ilg), the binder is in a preferred embodiment aglycosylated anti-B7H3 antibody, and n is a number from 1 to 10:
  • R 1 -L- # 1 H, -COOH, -CONHNH 2, - (CH 2 ) i- 3 NH 2 , -CONZ "(CH 2 ) i- 3 NH 2 and -CONZ" CH 2 COOH, wherein Z "H or NH 2 ;
  • R 2 and R 4 are H, or R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) represent -CH 2 -CHR n - or -CHR n -CH 2 -, wherein R 11 represents H;
  • R 3 -L- # l or a Ci-10-alkyl optionally with -OH, O-alkyl, SH, S-alkyl, O-CO-alkyl, O-CO-NH-alkyl, NH-CO -Alkyl, NH-CO-NH-alkyl, S (0) n -alkyl, S0 2 -NH-alkyl, NH-alkyl, N (alkyl) 2 , or NH 2 may be substituted (wherein alkyl is preferably C 1 -3 Alkyl);
  • R 5 is H or F
  • R 6 and R 7 are independently H, (optionally fluorinated) G-3-alkyl, (optionally fluorinated) C 2 _4 alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 -4 alkynyl, hydroxy or halogen;
  • R 8 is a branched C 1-5 alkyl group
  • R 9 is H or F, wherein one of the substituents R 1 and R 3 represents -L- # 1, and
  • L represents the linker and # 1 represents the binding to the antibody
  • n 0 or 1
  • ⁇ represents the binding to KSP
  • ⁇ ⁇ represents the binding to the antibody
  • # 'de denotes the site of attachment to the sulfur atom of the antibody
  • # 2 denotes the site of attachment to the group L 1
  • LI represents the formula
  • R 10 is H, NH 2 or C 1 -C 3 alkyl
  • G represents -NHCO- or ⁇ /;
  • BHC 15 1 040-A - 168 - n is 0 or 1;
  • 0 is 0 or 1
  • G2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO 2 NHNH-, -CONHNH- and a 3 to
  • aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, or -SO- may be interrupted (preferably where the side chains, if present, may be substituted with -NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-CNNEh, sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid,
  • # 1 is the binding to the KSP inhibitor and ffi is the binding to the coupling group to the antibody (e.g., L2),
  • KSP-L- is a compound of the following formula (II), (IIa), (IIb), (IIc), (Ild), (Ile), (IIIf), (IIg), (III), (IIj), (Ilk) or the following formula (IIh)
  • the binder is a aglycosylated anti-B7H3 antibody in a preferred embodiment, and n is a number from 1 to 10:
  • A is CO (carbonyl); R 1 -L- # 1 is;
  • R 2 and R 4 are H, or R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) represent -CH 2 -CHR n - or -CHR n -CH 2 -, wherein R 11 represents H;

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Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft neue Binder-Wirkstoff-Konjugate (ADCs), wirksame Metabolite dieser ADCs, Verfahren zur Herstellung dieser ADCs, die Verwendung dieser ADCs zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser ADCs zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkrankungen. Solche Behandlungen können als Monotherapie oder auch in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder weiteren therapeutischen Maßnahmen erfolgen.

Description

Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) von KSP-Inhibitoren mit anti-B7H3-Antikörpern
Einleitung und Stand der Technik
Die Erfindung betrifft Binder-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) von Kinesin Spindel Protein- Inhibitoren, wirksamer Metabolite dieser ADCs, Verfahren zur Herstellung dieser ADCs, die Verwendung dieser ADCs zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser ADCs zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkrankungen. Solche Behandlungen können als Monotherapie oder auch in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder weiteren therapeutischen Maßnahmen erfolgen.
Krebserkrankungen sind die Folge unkontrollierten Zellwachstums verschiedenster Gewebe. In vielen Fällen dringen die neuen Zellen in bestehende Gewebe ein (invasives Wachstum), oder sie metastasieren in entfernte Organe. Krebserkrankungen treten in verschiedensten Organen auf und haben oft gewebespezifische Krankheitsverläufe. Daher beschreibt die Bezeichnung Krebserkrankung als Oberbegriff eine große Gruppe definierter Erkrankungen verschiedener Organe, Gewebe und Zelltypen.
Tumore früher Stadien lassen sich gegebenenfalls durch chirurgische und radiotherapeutische Maßnahmen entfernen. Metastasierte Tumore können im Regelfall durch Chemotherapeutika nur palliativ therapiert werden. Ziel hierbei ist, die optimale Kombination aus einer Verbesserung der Lebensqualität und der Verlängerung der Lebenszeit zu erreichen.
Konjugate von Binderproteinen mit einem oder mehreren Wirkstoffmolekülen sind bekannt, insbesondere in Form sogannter „antibody drug conjugates" (ADCs), in welchen ein internalisierender, gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen gerichteter Antikörper auf kovalente Weise über eine Verknüpfungseinheit ("linker") mit einem cytotoxisch wirkenden Agens verbunden ist. Nach Einschleusung des ADCs in die Tumorzelle und anschließender Spaltung des Konjugats wird dann innerhalb der Tumorzelle entweder das cytotoxische Agens selbst oder ein anderer daraus gebildeter cytotoxisch wirksamer Metabolit freigesetzt, und kann dort seine Wirkung direkt und selektiv entfalten. Auf diesem Wege könnte die Schädigung von normalem Gewebe im Vergleich zu einer konventionellen Chemotherapie der Krebs er krankung in signifikant engeren Grenzen gehalten werden [siehe z.B. J. M. Lambert, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 543-549 BHC 15 1 040-A
(2005); A. M. Wu und P. D. Senter, Nat. Biotechnol. 23, 1137-1146 (2005); P. D. Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 235-244 (2009); L. Ducry und B. Stump, Bioconjugate Chem. 21, 5-13 (2010)]. So beschreibt WO2012/171020 ADCs, bei denen mehrere Toxophormoleküle über einen polymeren Linker an einen Antikörper verknüpft ist. Als mögliche Toxophore werden in WO2012/171020 unter anderem die Substanzen SB 743921, SB 715992 (Ispinesib), MK-0371, AZD8477, AZ3146 und ARRY-520 erwähnt.
Die zuletzt genannten Substanzen sind sogenannte Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren. Kinesin Spindel Protein (KSP, auch bekannt als Eg5, HsEg5, KNSL1 oder KJF11) ist ein Kinesin-ähnliches Motorprotein, welches für die Funktion der bipolaren mitotischen Spindel essentiell ist. Die Inhibierung von KSP führt zum mitotischen Stillstand und über einen längeren Zeitraum zur Apoptose (Tao et al., Cancer Cell 2005 Jul 8(1), 39-59). Nach dem Auffinden des ersten zellgängigen KSP-Inhibitors, Monastrol, haben sich KSP-Inhibitoren als eine Klasse neuer Chemotherapeutika etabliert (Mayer et al., Science 286: 971-974, 1999) und sind Gegenstand einer Reihe von Patentanmeldungen (z.B. WO2006/044825; WO2006/002236; WO2005/051922; WO2006/060737; WO03/060064; WO03/040979; und WO03/049527). Da KSP jedoch nur in einem kurzen Zeitraum der Mitosephase seine Wirkung entfaltet, müssen KSP-Inhibitoren in ausreichend hoher Konzentration während dieser Phase vorliegen. WO2014/151030 offenbart ADCs mit bestimmten KSP-Inhibitoren.
Zusammenfassung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Substanzen bereitzustellen, die nach Verabreichung in relativ geringer Konzentration eine apoptotische Wirkung zeigen und damit für die Krebstherapie nützlich sein können.
Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die Erfindung Konjugate eines glycosylierten oder aglycosylierten-anti-B7H3-Antikörpers mit Verbindungen der folgenden Formel (I) bereit, wobei eine oder mehrere der Verbindungen der Formel (I) mit dem Antikörper über einen Linker L verbunden ist bzw. sind. Dabei weisen aglycosylierte Antikörper keine Glycane an der konservierten N-Bindungsstelle in der CH2 -Domäne der Fc-Region auf und binden daher nicht an NK-Zellen. Ein aglycosylierter Antikörper unterstützt daher nicht eine NK-Zell-vermittelte zelluläre Zytotoxizität. Der Antikörper ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper. Besonders bevorzugt sind anti-B7H3 -Antikörper, die spezifisch die humane Ig4- und/oder die humane und/oder murine Ig2 -Isoform von B7H3 binden, insbesondere BHC 15 1 040-A die anti-B7H3-Antikörper TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515, TPP-7611, TPP-8382, TPP-8564, TPP-8567, TPP-8322, TPP-8565, TPP-8568, TPP-8748 und TPP-8750.
BHC 15 1 040-A
Formel (I):
Figure imgf000005_0001
(I) wobei
R1 H, -L-#l, -MOD oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z'(z.B. -(CH2)0-3Z'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, NH2, S03H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i-3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-β Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 H, -MOD, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2y3Z' darstellt, wobei Z' H, S03H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-β Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6 -NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes G_6 Alkyl darstellt;
R4 H,L #1, -SGlys-(CO)0.1-R4', -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
wobei SGjyg eine durch ein lysosomales Enzym spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine O-io-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-ιο- Aralkyl-, Cs io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6 io-Aryl-, Cs io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, G-io-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy- oder Cö-io-Aralkoxy-, C5-10- Heteroaralkoxy-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryloxy-, Cs io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-CO Alkyl, -S03H, -S02NH2, -S02-N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, -CON(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine BHC 15 1 040-A
Gruppe -Ox-(CH2CH20)y-R4 darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise G-12-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2- CH2-NH2 darstellt), wobei nach Spaltung eine primäre Amingruppe vorliegt (entsprechend R4 = H); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes, C1-5 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes G_6 Alkyl darstellt;
oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRn- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), Ci Alkyl, C i^ Haloalkyl, Ci-4Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes C i-4 Alkyl, COO(Ci-4 Alkyl) oder OH darstellt;
A CO, SO, S02, S02NH oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-#l, -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-#l oder eine G-10-Alkyl-, C6-10- Aryl- oder Cö-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl- oder C5-10- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1 -3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1 -3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1 -3 Halogenatome aufweisen), 1 -3 O-Alkyl Gruppen, 1 -3 -SH Gruppen, 1 -3 -S- Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -S(0)n- Alkyl Gruppen, 1-3 -S02-NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1 -3 -NH2 Gruppen oder 1 -3 -(CH2)0- 3Z Gruppen, n für 0, 1 oder 2 steht, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NY'Y2, oder - CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z ' darstellen, und Y3 H, -(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt G-io-Alkyl bedeutet);
R5 H, NH2, N02, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
darstellt, BHC 15 1 040-A - 6 -
R6 und R7 unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, Hydroxy, NO2, NH2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) G-10-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, (ggf. fluoriertes) C4 io-Cycloalkyl oder-(CH2)o-2-(HZ2) darstellt, wobei HZ2 ein 4 bis 7-gliedriger Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darstellt, wobei jede dieser Gruppen mit -OH, CO2H oder NH2 substituiert sein kann;
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt;
wobei einer der Substituenten R1 , R3 oder R4 -L-#l darstellt bzw. (im Falle von R8) aufweist, L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Binder bzw. Derivat hiervon steht, wobei -MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei R10 H oder Ci-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R10 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, SO2, -NRY-, -NRYCO-, CONRY-, -NRYNRY-, -S02NRYNRy-, -CONRYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, C 1 -C 1 g-Alkyl, C2-C 1 g-Alkenyl, oder C2-C 1 g-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CRx=N-0- (wobei Rx H, C 1 -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Gruppe - MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere. BHC 15 1 040-A - 7 -
Die erfindungsgemäßen Konjugate können chemisch labile Linker, enzymatisch labile Linker oder stabile Linker aufweisen. Besonders bevorzugt sind stabile Linker und durch eine Protease spaltbare Linker.
Die Erfindung stellt ferner bereit Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate sowie Vorstufen und Intermediate zur Herstellung.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate umfasst regelmäßig die folgenden Schritte:
Herstellen einer ggf. Schutzgruppen tragenden Linkervorstufe mit einer reaktiven Gruppe, die an den Antikörper koppeln kann;
Konjugieren der Linkervorstufe an das ggf. Schutzgruppen tragende Derivat eines KSP-Inhibitors der Formel (I) , wobei in diesen Formeln eine Bindung an einen Linker noch nicht vorliegt), wobei ein ggf. Schutzgruppen tragendes reaktives KSP-Inhibitor-Linker-Konjugat erhalten wird;
Abspaltung der ggf. vorhandenen Schutzgruppen im KSP-Inhibitor-Linker-Konjugat und
Konjugieren des Antikörpers an das KSP-Inhibitor-Linker-Konjugat, wobei das erfindungsgemäße
Figure imgf000008_0001
erhalten wird.
Die Anknüpfung der reaktiven Gruppe kann auch nach Aufbau einer ggf. geschützt vorliegenden KSP-Inhibitor-Linkervorstufe Konjugats erfolgen.
In Abhängigkeit vom Linker können Succinimid-verknüfte ADCs nach der Konjugation nach Schema 26 in die offenkettigenen Bernsteinsäureamide überführt werden, die ein vorteilhaftes Stabilitätsprofil aufweisen.
Wie oben erläutert, kann das Konjugieren der Linkervorstufe an einen niedermolekularen KSP- Inhibitor durch Substitution eines Wasserstoffatoms an R1 , R3 oder R4 in Formel (I) durch den Linker erfolgen. In den Syntheseschritten vor der Konjugation können ggf. vorhandene funktionelle Gruppen auch in geschützter Form vorliegen. Vor dem Konjugations schritt werden diese Schutzgruppen nach bekannten Methoden der Peptidchemie entfernt. Die Konjugation kann chemisch auf verschiedenen Wegen erfolgen, wie in den Schemata 20 bis 31 in den Beispielen exemplarisch dargelegt. Es ist insbesondere möglich, den niedermolekularen KSP-Inhibitor für die Konjugation an den Linker ggf. zu modifizieren, z.B. durch Einführen von Schutzgruppen oder Abgangsgruppen zur einfacheren Substituierung. BHC 15 1 040-A - 8 -
Insbesondere stellt die Erfindung neue niedermolekulare KSP-Inhibitoren bereit, die an einen anti- B7H3 -Antikörper konjugiert werden. Diese KSP-Inhibitoren bzw. ihre Antikörper-Konjugate weisen die folgende allgemeine Formel (II) auf:
Figure imgf000009_0001
(Π) wobei
R1 H, -L-BINDER, -MOD oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -
OY3, -SY3, Halogen, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei
Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z' (z.B. -
(CH2)o-3Z'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen,
Y3 H oder -(CH2)0-3Z' darstellt,
Z' H, NH2, S03H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH
oder -(CO-NH-CHY4)i_3COOH darstellt;
W H oder OH darstellt,
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 substituiertes, G_6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 H, -MOD, -C(=0)-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
oder
R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRn- oder
-CHRn-CH2- darstellen,
wobei
R11 -H, -NH2, -SO3H, -COOH, -SH, Halogen (insbesondere F oder Cl),
CM Alkyl,
Figure imgf000009_0002
Haloalkyl, G-4Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes Ci-4 Alkyl, COO(G-4 Alkyl) oder -OH darstellt; BHC 15 1 040-A 9
Z Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-
OY3 darstellt,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, G-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6 -NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes G-6 Alkyl darstellt;
R4 H, -L-BINDER, -SGlys-(CO)0.1-R4', -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
wobei SGjyg eine durch ein lysosomales Enzym spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine G-io-Alkyl-, G-io-Aryl- oder G-io- Aralkyl-, G-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, G-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-io-Alkoxy-, G-io-Aryloxy- oder G-io-Aralkoxy-, G-io- Heteroaralkoxy-, G-io-Alkyl-O-G-io-Aryloxy-, G-10-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-CO Alkyl, -SO3H, -S02NH2, -S02-N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, -CON(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox-(CH2CH20)y-R4 darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise CM2-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2- CH2-NH2 darstellt), wobei nach Spaltung eine primäre Amingruppe vorliegt (entsprechend R4 =
H); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z ' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6 -NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes G-6 Alkyl darstellt;
oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRn- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), Ci Alkyl, C i^ Haloalkyl, Ci-4Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes C i-4 Alkyl, COO(G-4 Alkyl) oder OH darstellt;
A -C(=0)-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -S(=0)2-NH oder -CNNH2- darstellt;
R3 -L-BINDER, -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine G- 10-Alkyl-, Cö-io-Aryl- oder G-io-Aralkyl-, G-10-Heteroalkyl-, G-io-Alkyl-O-G-io-Aryl- oder C5-10- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1 -3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1 -3 halogenierten BHC 15 1 040-A - 10 -
Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S- Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)n- Alkyl Gruppen, 1-3 -S02-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2)0- 3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H, -(CH2)o-3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, S03H, NH2 oder COOH darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt G-10-Alkyl bedeutet);
n für 0, 1 oder 2 steht,
R5 H, NH2, N02, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder - (CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z' darstellen, und Y3 H oder - (CH2y3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt.
R8 (ggf. fluoriertes) G-10-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2_io-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, (ggf. fluoriertes) C4-io-Cycloalkyl oder -(CH2)o-2-(HZ2) darstellt, wobei HZ2 ein 4 bis 7-gliedriger Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darstellt (vorzugsweise Oxetan), wobei jede dieser Gruppen mit -OH, C02H oder NH2 substituiert sein kann;
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; wobei L für einen Linker steht und BINDER für einen (aglycosylierten) anti-B7H3 -Antikörper steht, wobei der Binder ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann, wobei ein Vertreter von R1 R3, und R4 -L-Binder darstellt;
R6 und R7 unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) C1-10- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, Hydroxy, N02, NH2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen, wobei -MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei R10 H oder G-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R10 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist; BHC 15 1 040-A - 11 - o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, S02, -NRY-, -NRYCO-, CONRY-, -NRYNRY-, -SC^NRYNRY-, -CONRYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, Ci -Ci g-Alkyl, C2-C1 g-Alkenyl, oder C2-C1 g-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, Ci -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Beschreibung der Figuren
Figur 1 : Internalisierungsverhalten spezifischer B7H3 Antikörper in der humanen Nierenkrebs- Zellline A498.
Dargestellt ist der kinetische Verlauf der Intemalisierung von fluoreszenzmarkierten B7H3- Antikörpern über 24 Stunden. Zur Detektion Target-unabhängiger Intemalisierung wurde eine fluoreszenmarkierte Isotyp-Kontrolle parallel verwendet. Detaillierte Versuchsbedingungen sind unter C-2b beschrieben (x-Achse: Zeit in Stunden; y-Achse: Granula-Anzahl pro Zelle).
Figur 2 : Sequenzprotokoll
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt Konjugate eines anti-B7H3 -Antikörpers sowie aglycosylierte und/oder humanisierte Varianten hiervon mit einem oder mehreren Wirkstoffmolekülen bereit, wobei das Wirkstoffmolekül ein Kinesin Spindel Protein-Inhibitor (KSP-Inhibitor) ist, das mit dem Antikörper über einen Linker L verbunden ist. BHC 15 1 040-A - 12 -
Das erfindungsgemäße Konjugat kann durch die allgemeine Formel
BINDER¬ L—KS P
n dargestellt werden, wobei BINDER für den anti-B7H3 -Antikörper, L für den Linker, KSP für den KSP-Inhibitor, und n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht. Hierbei ist n ein Mittelwert der Anzahl an KSP-Inhibitor-Linker-Konjugate pro BINDER. KSP-L weist vorzugsweise die oben aufgeführte Formel (I) auf. Weiterhin ist es bevorzugt, dass der Linker an verschiedene Aminosäuren des Antikörpers gebunden ist. Besonders bevorzugt ist eine Bindung an unterschiedliche Cysteinreste des Binders. Der Antikörper ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler anti-B 7H3 -Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. Besonders bevorzugt sind anti-B7H3 -Antikörper, die spezifisch die humane 4Ig-Isoform binden, insbesondere die humanen anti-B7H3 -Antikörper TPP- 6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt der anti-B 7H3 -Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment aglycosyliert vor.
Im Folgenden werden erfindungsgemäß verwendbare Antikörper, erfindungsgemäß verwendbare KSP-Inhibitoren sowie erfindungsgemäß verwendbare Linker beschrieben, die ohne Einschränkung in Kombination verwendet werden können. Insbesondere können die jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Binder in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten KSP-Inhibitoren, ggf. in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Linkern verwendet werden.
KSP-Inhibitoren und deren Binderkonjugate
Definitionen
Der Begriff„substituiert" bedeutet, dass ein oder mehrere Wasserstoffe an dem bezeichneten Atom bzw. der bezeichneten Gruppe durch eine Auswahl aus der angegebenen Gruppe ersetzt ist/sind, mit der Maßgabe, dass die normale Wertigkeit des bezeichneten Atoms unter den vorliegenden Umständen nicht überschritten wird. Kombinationen von Substituenten und/oder Variablen sind zulässig. BHC 15 1 040-A - 13 -
Der Begriff„gegebenenfalls substituiert" bedeutet, dass die Anzahl an Substituenten gleich oder verschieden von Null sein kann. Wenn nicht anders angegeben, können gegebenenfalls substituierte Gruppen durch so viele fakultative Substituenten substituiert sein, wie sich durch Ersetzen eines Wasserstoffatoms durch einen Nicht-Wasserstoff-Substituenten an einem beliebigen verfügbaren Kohlenstoff- oder Stickstoff- oder Schwefelatom unterbringen lassen. Normalerweise kann die Anzahl an fakultativen Substituenten (falls vorhanden) 1, 2, 3, 4 oder 5, insbesondere von 1 , 2 oder 3 sein.
So, wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "ein- oder mehrfach", zum Beispiel in der Definition der Substituenten der Verbindungen der allgemeinen Formeln der vorliegenden Erfindung, "1, 2, 3, 4 oder 5, bevorzugt 1, 2, 3 oder 4, besonders bevorzugt 1, 2 oder 3, ganz besonders bevorzugt 1 oder 2".
Sind Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen substituiert, so können die Reste, wenn nicht anders angegeben, ein- oder mehrfach substituiert sein. Im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung sind die Bedeutungen aller Reste, die mehrfach auftreten, unabhängig voneinander. Eine Substitution durch einen, zwei oder drei gleiche oder verschiedene Substituenten ist bevorzugt. Die Substitution durch einen Substituenten ist besonders bevorzugt.
Alkyl
Alkyl steht für einen linearen oder verzweigten, gesättigten, monovalenten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (G-Go- Alkyl), in der Regel 1 bis 6 (G-G-Alkyl), bevorzugt 1 bis 4 (G- G- Alkyl), und besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen (G-G-Alkyl).
Beispielhaft und bevorzugt seien genannt:
Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, iso-Propyl-, iso-Butyl-, sec-Butyl, tert-Butyl-, iso-Pentyl-, 2-Methylbutyl-, 1 -Methylbutyl-, 1 -Ethylpropyl-, 1 ,2-Dimethylpropyl, neo-Pentyl-, 1,1-Dimethylpropyl-, 4-Methylpentyl-, 3-Methylpentyl-, 2-Methylpentyl-, 1 -Methylpentyl-, 2-Ethylbutyl-, 1 -Ethylbutyl-, 3,3-Dimethylbutyl-, 2,2-Dimethylbutyl-, 1,1-Dimethylbutyl-, 2,3-Dimethylbutyl-, 1,3-Dimethylbutyl- und 1 ,2-Dimethylbutyl-.
Besonders bevorzugt ist ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl- und tert-Butylrest.
Heteroalkyl
Heteroalkyl steht für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -C(=0)-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRY-, -NRyC(=0)-, -C(=0)-NRy-, -NRYNRy-, -S(=0)2-NRYNRy-, BHC 15 1 040-A - 14 -
-C(=0)-NR NR -, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann, und wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -C(=0)-OH, -OH, -NH2,
-NH-C(=NNH2)-, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
Hierbei steht Ry jeweils für -H, Phenyl-, Ci -Ci g-Alkyl-, C2-C1 g-Alkenyl- oder C2-C1 g-Alkinyl-, die wiederum jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -C(=0)-OH, -OH, -NH2, -NH-C(=NNH2)-,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Hierbei steht Rx für -H, C1 -C3-Alkyl- oder Phenyl-.
Alkenyl
Alkenyl steht für eine geradkettige oder verzweigte einwertige Kohlenwasserstoffkette mit einer oder zwei Doppelbindungen und 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Kohlenstoffatomen (C2-C 10- Alkenyl), insbesondere 2 oder 3 Kohlenstoffatomen (C2-C3 -Alkenyl), wobei es sich versteht, dass, wenn die Alkenylgruppe mehr als eine Doppelbindung enthält, die Doppelbindungen isoliert voneinander oder miteinander konjugiert sein können. Bei der Alkenylgruppe handelt es sich zum Beispiel um eine Ethenyl- (bzw. Vinyl-), Prop-2-en-l-yl- (bzw.„Allyl-"), Prop-l-en-l-yl-, But-3-enyl-, But-2-enyl-, But-l-enyl-, Pent-4-enyl-, Pent-3-enyl-, Pent-2-enyl-, Pent-l-enyl-, Hex-5-enyl-, Hex-4-enyl-, Hex-3-enyl-, Hex-2-enyl-, Hex-l-enyl-, Prop-l-en-2-yl- (bzw.„Isopropenyl-"),
2- Methylprop-2-enyl-, 1 -Methylprop-2-enyl-, 2-Methylprop-l-enyl-, 1-Methylprop-l-enyl-,
3- Methylbut-3-enyl-, 2-Methylbut-3-enyl-, l-Methylbut-3-enyl-, 3-Methylbut-2-enyl-,
2- Methylbut-2-enyl-, l-Methylbut-2-enyl-, 3-Methylbut-l-enyl-, 2-Methylbut-l-enyl-,
1-Methylbut-l-enyl-, l-, l-Dimethylprop-2-enyl-, 1-Ethylprop-l-enyl-, 1 -Propylvinyl-,
1 -Isopropylvinyl-, 4-Methylpent-4-enyl-, 3-Methylpent-4-enyl-, 2-Methylpent-4-enyl-, l-Methylpent-4-enyl-, 4-Methylpent-3-enyl-, 3-Methylpent-3-enyl-, 2-Methylpent-3-enyl-, l-Methylpent-3-enyl-, 4-Methylpent-2-enyl-, 3-Methylpent-2-enyl-, 2-Methylpent-2-enyl-, 1 -Methylpent-2-enyl-, 4-Methylpent-l-enyl-, 3-Methylpent-l-enyl-, 2-Methylpent-l-enyl-, 1-Methylpent-l-enyl-, 3-Ethylbut-3-enyl-, 2-Ethylbut-3-enyl-, l-Ethylbut-3-enyl-,
3- Ethylbut-2-enyl-, 2-Ethylbut-2-enyl-, 1 -Ethylbut-2-enyl-, 3-Ethylbut-l-enyl-, 2-Ethylbut-l-enyl-, 1-Ethylbut-l-enyl-, 2-Propylprop-2-enyl-, 1 -Propylprop-2-enyl-, 2-Isopropylprop-2-enyl-,
1 -Isopropylprop-2-enyl-, 2-Propylprop-l-enyl-, 1-Propylprop-l-enyl-, 2-Isopropylprop-l-enyl-, 1 -Isopropylprop- 1 -enyl-, 3 ,3-Dimethylprop- 1 -enyl-, 1 -( 1 , 1 -Dimethylethyl)ethenyl-,
Buta-l,3-dienyl-, Penta-l,4-dienyl- oder Hexa-l-5-dienylgruppe. Insbesondere handelt es sich bei der Gruppe um Vinyl oder Allyl. BHC 15 1 040-A - 15 -
Alkinyl
Alkinyl steht für eine geradkettige oder verzweigte einwertige Kohlenwasserstoffkette mit einer Dreifachbindung und mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Kohlenstoffatomen (C2-Cio-Alkinyl), insbesondere 2 oder 3 Kohlenstoffatomen (C2-C3-Alkinyl). Bei der C2-C6-Alkinylgruppe handelt es sich zum Beispiel um eine Ethinyl-, Prop-l-inyl-, Prop-2-inyl- (bzw. Propargyl-), But-l-inyl-, But-2-inyl-, But-3-inyl-, Pent-l-inyl-, Pent-2-inyl-, Pent-3-inyl-, Pent-4-inyl-, Hex-l-inyl-, Hex-2-inyl-, Hex-3-inyl-, Hex-4-inyl-, Hex-5-inyl-, l-Methylprop-2-inyl-, 2-Methylbut-3-inyl-, l-Methylbut-3-inyl-, 1 -Methylbut-2-inyl-, 3-Methylbut-l-inyl-, l-Ethylprop-2-inyl-,
3-Methylpent-4-inyl-, 2-Methylpent-4-inyl-, 1 -Methylpent-4-inyl-, 2-Methylpent-3-inyl-, l-Methylpent-3-inyl-, 4-Methylpent-2-inyl-, 1 -Methylpent-2-inyl-, 4-Methylpent-l-inyl-, 3-Methylpent-l-inyl-, 2-Ethylbut-3-inyl-, l-Ethylbut-3-inyl-, 1 -Ethylbut-2-inyl-,
1 -Propylprop-2-inyl-, 1 -Isopropylprop-2-inyl-, 2,2-Dimethylbut-3 -inyl-, 1 , 1 -Dimethylbut-3 -inyl-, l ,l-Dimethylbut-2-inyl- oder 3,3-Dimethylbut-l-inylgruppe. Insbesondere handelt es sich bei der Alkinylgruppe um Ethinyl, Prop-l-inyl oder Prop-2-inyl.
BHC 15 1 040-A - 16 -
Cvcloalkyl
Cycloalkyl steht für einen gesättigten einwertigen mono- oder bicyclischen Kohlenwasserstoffrest mit 3-12 Kohlenstoffatomen (C3-Ci2-Cycloalkyl).
Hierbei steht ein mono cvclis eher Kohlen was s erstof fre st für einen monovalenten
Kohlenwasserstoffrest mit in der Regel 3 bis 10 (C3-Cio-Cycloalkyl), bevorzugt 3 bis 8 (C3-C8-Cycloalkyl), und besonders bevorzugt 3 bis 7 (C3-C7-Cycloalkyl) Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und bevorzugt für einen monoeyclischen Kohlenwasserstoffrest seien genannt:
Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Cycloheptyl- und Cyclooctyl-.
Besonders bevorzugt ist ein Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cylopentyl-, Cyclohexyl- und
Cycloheptyl-.
Hierbei steht ein bicvchscher Kohlenwasserstoffrest für einen Kohlenwasserstoffrest mit in der Regel 3 bis 12 Kohlenstoffatomen (C3-Ci2-Cycloalkyl), wobei hierbei eine Fusion aus zwei gesättigten Ringsystemen zu verstehen ist, die sich gemeinsam zwei direkt benachbarte Atome teilen. Beispielhaft und bevorzugt für einen bicyclischen Kohlenwasserstoffrest seien genannt: Bicyclo[2.2.0]hexyl-, Bicyclo[3.3.0]octyl-, Bicyclo[4.4.0]decyl-, Bicyclo[5.4.0]undecyl-, Bicyclo[3.2.0]heptyl-, Bicyclo[4.2.0]octyl-, Bicyclo[5.2.0]nonyl-, Bicyclo[6.2.0]decyl-, Bicyclo[4.3.0]nonyl-, Bicyclo[5.3.0]decyl-, Bicyclo[6.3.0]undecyl- und Bicyclo[5.4.0]undecyl-,
Heterocvcloalkyl
Heterocycloalkyl steht für ein nicht aromatisches mono- oder bicyclisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatomen, die gleich oder verschieden sein können. Als Heteroatome können Stickstoffatome, Sauerstoffatome oder Schwefelatome vorkommen.
Ein monocvclisches Ringsystem gemäß der vorliegenden Erfindung kann 3 bis 8, bevorzugt 4 bis 7, besonders bevorzugt 5 oder 6 Ringatome aufweisen.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 3 Ringatomen seien genannt:
Aziridinyl-.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 4 Ringatomen seien genannt:
Azetidinyl-, Oxetanyl-. BHC 15 1 040-A - 17 -
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 5 Ringatomen seien genannt:
Pyrrolidinyl-, Imidazolidinyl- , Pyrazolidinyl-, Pyrrolinyl-, Dioxolanyl- und Tetrahydrofuranyl-.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 6 Ringatomen seien genannt:
Piperidinyl-, Piperazinyl-, Morpholinyl-, Dioxanyl-, Tetrahydropyranyl- und Thiomorpholinyl-.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 7 Ringatomen seien genannt:
Azepanyl-, Oxepanyl-, 1,3-Diazepanyl-, 1 ,4-Diazepanyl-.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 8 Ringatomen seien genannt:
Oxocanyl-, Azocanyl-.
Unter monocvclischem Heterocycloalkyl sind 4 bis 7-gliedrige, gesättigte Heterocyclylreste mit bis zu zwei Heteroatomen aus der Reihe O, N und S bevorzugt.
Besonders bevorzugt sind Morpholinyl-, Piperidinyl-, Pyrrolidinyl- und Tetrahydrofuranyl-.
Ein bicyclisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatomen, die gleich oder verschieden sein können, können gemäß der vorliegenden Erfindung 6 bis 12, bevorzugt 6 bis 10 Ringatome aufweisen, wobei ein, zwei, drei oder vier Kohlenstoffatome gegen gleiche oder verschiedene Heteroatome aus der Reihe O, N und S ausgetauscht sein können.
Beispielhaft seien genannt: Azabicyclo[3.3.0]octyl-, Azabicyclo[4.3.0]nonyl-,
Diazabicyclo[4.3.0]nonyl-, Oxazabicyclo[4.3.0]nonyl-, Thiazabicyclo[4.3.0]nonyl- oder
Azabicyclo[4.4.0]decyl- sowie aus weiteren möglichen Kombinationen gemäß Definition abgeleitete Reste.
Besonders bevorzugt ist Perhydrocyclopenta[c]pyrrolyl-, Perhydrofuro[3,2-c]pyridinyl-,
Perhydropyrrolo[l,2-a]pyrazinyl-, Perhydropyrrolo[3,4-c]pyrrolyl- und 3,4-Methylenedioxyphenyl.
Aryl
Aryl bedeutet ein monovalentes, mono- oder bicyclisches, aus Kohlenstoffatomen bestehendes aromatisches Ringsystem. Beispiele sind Naphthyl- und Phenyl-; bevorzugt ist Phenyl- beziehungsweise ein Phenylrest. BHC 15 1 040-A - 18 -
C(i-Cin-Aralkyl
Cö-io-Aralkyl- steht im Rahmen der Erfindung für ein monocyclisches aromatisches Aryl, bespielhaft Phenyl, an das eine G-C4-Alkylgruppe gebunden ist.
Eine beispielhafte Cö-io-Aralkyl-Gruppe ist Benzyl.
Heteroaryl
Heteroaryl bedeutet ein einwertiges monocyclisches, bicyclisches oder tricyclisches aromatisches Ringsystem mit 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 oder 14 Ringatomen (eine„5- bis 14- gliedrige Heteroaryl"gruppe), insbesondere 5, 6, 9 oder 10 Ringatomen, zu verstehen, das mindestens ein Ringheteroatom und gegebenenfalls ein, zwei oder drei weitere Ringheteroatome aus der Gruppe N, O und S enthält und das über ein Ringkohlenstoffatom oder gegebenenfalls (wenn es die Wertigkeit erlaubt) über ein Ringstickstoffatom gebunden ist.
Bei der Heteroarylgruppe kann es sich um eine 5-gliedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, Oxadiazolyl, Triazolyl, Thiadiazolyl oder Tetrazolyl; oder eine 6-gliedrige Heteroarylgrupoe wie zum Beispiel Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl oder Triazinyl; oder eine tricyclische Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Carbazolyl, Acridinyl oder Phenazinyl; oder eine 9-gliedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Benzofuranyl, Benzothienyl, Benzoxazolyl, Benzisoxazolyl, Benzimidazolyl, Benzothiazolyl, Benzotriazolyl, Indazolyl, Indolyl, Isoindolyl, Indolizinyl oder Purinyl; oder eine 10-gliedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Chinolinyl, Chinazolinyl, Isochinolinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, Chinoxalinyl oder Pteridinyl handeln.
Im Allgemeinen, und wenn nicht anders erwähnt, schließen die Heteroarylreste alle möglichen isomeren Formen davon ein, z. B. Tautomere und Positionsisomere in Bezug auf den
Anbindungspunkt zum Rest des Moleküls. Somit schließt, als erläuterndes, nicht einschließendes Beispiel, der Begriff Pyridinyl Pyridin-2-yl, Pyridin-3-yl und Pyridin-4-yl ein; oder der Begriff Thienyl schließt Thien-2-yl und Thien-3-yl ein.
C5-Cio-Heteroaryl
C5-io-Heteroaryl steht im Rahmen der Erfindung für ein mono-oder bicyclisches, aromatisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatome, die gleich oder verschieden sein können. BHC 15 1 040-A - 19 -
Als Heteroatome können vorkommen: N, O, S, S(=0) und/ oder S(=0)2. Die Bindungsvalenz kann sich an einem beliebigen aromatischen Kohlenstoffatom oder an einem Stickstoffatom befinden.
Ein monocyclischer Heteroarylrest gemäß der vorliegenden Erfindung hat 5 oder 6 Ringatome. Bevorzugt sind solche Heteroarylreste mit ein oder zwei Heteroatomen. Besonders bevorzugt sind hierbei ein oder zwei Stickstoffatome.
Heteroarylreste mit 5 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
Thienyl, Thiazolyl, Furyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, Oxadiazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl und Thiadiazolyl.
Heteroarylreste mit 6 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl und Triazinyl.
Ein bicyclischer Heteroarylrest gemäß der vorliegenden Erfindung hat 9 oder 10 Ringatome.
Heteroarylreste mit 9 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
Phthalidyl, Thiophthalidyl, Indolyl, Isoindolyl, Indazolyl, Benzothiazolyl, Benzofuryl,
Benzothienyl, Benzimidazolyl, Benzoxazolyl, Azocinyl, Indolizinyl, Purinyl, Indolinyl.
Heteroarylreste mit 10 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
Isochinolinyl, Chinolinyl, Chinolizinyl, Chinazolinyl, Chinoxalinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, 1 ,7- und 1 ,8-Naphthyridinyl, Pteridinyl, Chromanyl.
Heteroalkoxy
Heteroalkoxy steht für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die über -O- an den Rest des Moleküls gebunden ist und die weiterhin einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -C(=0)-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NRy-,
-NRyC(=0)-, -C(=0)-NRy-, -NRWRy-, -S(=0)2-NRyNRy-, -C(=0)-NRyNRy-, -CRx=N-0- unterbrochen sein kann, und wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -C(=0)-OH, -OH, -NH2, -NH-C(=NNH2)-, Sulfonamid,
Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, BHC 15 1 040-A - 20 -
Hierbei steht Ry jeweils für -H, Phenyl-, Ci -Ci g-Alkyl-, C2-C1 g-Alkenyl- oder C2-C1 g-Alkinyl-, die wiederum jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -C(=0)-OH, -OH, -NH2, -NH-C(=NNH2)-,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Hierbei steht Rx für -H, C1 -C3-Alkyl- oder Phenyl-.
Halogen beziehungsweise Halogenatom steht im Rahmen der Erfindung für Fluor (-F), Chlor (-C1), Brom (-Br), oder Iod (-1).
Fluor-Alkyl, Fluor-Alkenyl und Fluor-Alkinyl bedeutet, dass das Alkyl, Alkenyl und Alkinyl ein oder mehrfach durch Fluor substituiert sein kann.
Die Konjugation des KSP-Inhibitors an den Antikörper kann chemisch auf verschiedenen Wegen erfolgen, wie in den Schemata 20 bis 31 in den Beispielen exemplarisch dargelegt. Es ist insbesondere möglich, den niedermolekularen KSP-Inhibitor für die Konjugation an den Linker ggf. zu modifizieren, z.B. durch Einführen von Schutzgruppen oder Abgangsgruppen zur einfacheren Substituierung (so dass in der Reaktion diese Abgangsgruppe durch den Linker substituiert wird, und nicht ein H-Atom). Das so erhaltene KSP-Inhibitor - Linker - Molekül (wobei der Linker eine reaktive Gruppe zur Ankopplung an den Binder aufweist) kann dann mit dem Binder umgesetzt werden, um ein erfindungsgemäßes Binderkonjugat zu erhalten. Diese Vorgehensweise ist im experimentellen Teil anhand einer Vielzahl von Beispielen exemplarisch veranschaulicht.
Andere besonders bevorzugte Verbindungen weisen die folgende Formel (I) oder (Ia) auf:
Formel (I):
Figure imgf000021_0001
(I) wobei BHC 15 1 040-A - 21 -
R1 H, -L-#l, -MOD oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z'(z.B. -(CH2)0-3Z'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, NH2, S03H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i_3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, G_6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 H, -MOD, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2y3Z' darstellt, wobei Z' H, S03H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6 -NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes G_6 Alkyl darstellt;
R4 H, L #1,
-SGlys-(CO)0.1-R4', -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
wobei SGjyg eine durch ein lysosomales Enzym spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine G-io-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder CÖ-IO- Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-io-Alkoxy-, Cö-io-Aryloxy- oder Cö-io-Aralkoxy-, C5- 10- Heteroaralkoxy-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryloxy-, Cs io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-CO Alkyl, -S03H, -S02NH2, -S02-N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, -CON(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox-(CH2CH20)y-R4 darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise Ci-i2-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2- CH2-NH2 darstellt);
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2y3Z' darstellt, wobei Z' H, S03H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6 -NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl darstellt; BHC 15 1 040-A - 22 - oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR11- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), Ci Alkyl, Haloalkyl, Ci-4Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes G-4 Alkyl, COO(Ci-4 Alkyl) oder OH darstellt;
A CO, SO, SO2, SO2NH oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-#l, -MOD oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt eine Ci- 10-Alkyl-, C6-io-Aryl- oder Ce- 10-Aralkyl-, C5-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1 -3 -OH Gruppen, 1 -3 Halogenatomen, 1 -3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1 -3 Halogenatome aufweisen), 1 -3 O-Alkyl Gruppen, 1 -3 -SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1 -3 -
0- CO-Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -S(0)n- Alkyl Gruppen, 1 -3 -S02-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1 -3 -NH((CH2CH20)1.2oH)-Gruppen, 1 -3 -NH2 Gruppen oder
1 - 3 -(CH2)o-3Z Gruppen, wobei n für 0, 1 oder 2 steht, Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H, -(CH2)o-3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt, substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt C O- Alkyl bedeutet);
R5 H, -MOD, NH2, NO2, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
R6 und R7 unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) CMO- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, Hydroxy, NO2, NH2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) G-10-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, (ggf. fluoriertes) C4-io-Cycloalkyl oder -(CH2)o-2-(HZ2) darstellt, wobei HZ2 ein 4 bis 7-gliedriger Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darstellt (vorzugsweise Oxetan), wobei jede dieser Gruppen mit -OH, CO2H oder NH2 substituiert sein kann; wobei einer der Substituenten R1 , R3 und R4-L-#l darstellt, BHC 15 1 040-A - 23 -
L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper steht, R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; wobei -MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei R10 H oder Ci-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R10 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, S02, -NRY-, -NRYCO-, CONRY-, -NRYNRY-, -SC^NRYNRY-, -CONRYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, Ci -Ci g-Alkyl, C2-C1 g-Alkenyl, oder C2-C1 g-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CRx=N-0- (wobei Rx H, C 1 -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, wobei G3 -H oder COOH darstellt, und wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Formel (I) stellt einer der Substituenten R1 oder R3 -L- #1 dar. In dieser Ausführungsform ist es besonders bevorzugt, wenn R4 H oder -SGjyS-(CO)o_i-R4' darstellt, wobei SGjys und R4'dieselbe Bedeutung haben wie oben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Formel (I) stellt der Substituenten R4-L-#l dar, wobei der Linker ein Linker ist, der am Stickstoffatom, das an R4 bindet, spaltbar ist, so dass nach Spaltung eine primäre Amingruppe vorliegt (entsprechend R4 = H). Entsprechende spaltbare Gruppen werden unten näher beschrieben.
Wenn R1 nicht H darstellt, ist das Kohlenstoffatom, an das R1 bindet, ein Stereozentrum, welches in der L- und/oder D-Konfiguration vorliegen kann, vorzugsweise in der L— Konfiguration. BHC 15 1 040-A - 24 -
Wenn R2 nicht H darstellt, ist das Kohlenstoffatom, an das R2 bindet, ein Stereozentrum, welches in der L- und/oder D-Konfiguration vorliegen kann.
Formel (Ia):
Figure imgf000025_0001
(Ia) wobei
R1 H, -L-#l, oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z' (z.B. -(CH2)0-3Z'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, NH2, S03H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i_3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-β Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt.
R2 und R4 unabhängig voneinander H,
-SGlys-(CO)0.1-R4', -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellen,
wobei SGjyg eine durch ein lysosomales Enzym spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4' eine G-io-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-ιο- Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, G-io-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy- oder Cö-io-Aralkoxy-, C5-10- Heteroaralkoxy-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryloxy-, Cs io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die jeweils ein oder mehrfach mit - NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-COAlkyl, -S03H, - S02NH2, -S02-N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, -CON(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox-(CH2CH20)y-R4 darstellt (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 BHC 15 1 040-A - 25 - darstellt, und R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise Ci-12-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder - CH2-CH2-NH2 darstellt);
, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR11- oder -CHR11- CH2- darstellen, wobei R11 H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), G-4 Alkyl, C1-4 Haloalkyl, G-4 Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes G-4 Alkyl, COO(Cw Alkyl) oder OH darstellt; oder R2 H, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)o-3Z darstellt und R4 -L-#l darstellt, wobei Z - H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 unabhängig voneinander lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, C 1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt, wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, C 1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes G_6 Alkyl darstellt;
A CO, SO, SO2, SO2NH oder CNNH2 darstellt;
R3 eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-#l oder eine G-10-Alkyl-, Cö-io-Aryl- oder Cö-io-Aralkyl-, C5-10- Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen),, 1-3 O- Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)n- Alkyl Gruppen, 1-3 -S02-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 - N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2)o-3Z Gruppen, wobei n für 0, 1 oder 2 steht, Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H, -(CH2)o-3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2V3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt G-10-Alkyl bedeutet);
R5 H, F, NH2, NO2, Halogen, SH oder -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt; BHC 15 1 040-A - 26 -
R6 und R7 unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) G-10-Alkyl, (ggf fluoriertes) C4-io-Cycloalkyl oder optional substituiertes Oxetan darstellt; und
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Durch Substitution eines H-Atoms an R1, R3 oder R4 kann in einer dem Durchschnittsfachmann bekannten Weise eine Verbindung der Formel (I) oder (Ia), in der keiner der Substituenten R1, R3 und R4 -L-#l darstellt, mit einem Linker verbunden werden. Hierdurch werden Konjugate der Formel (I) oder (Ia) erhalten, wobei einer der Substituenten R1, R3 oder R4 -L-#l darstellt, L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper steht. Wenn der KSP-Inhibitor nach Formel (I) oder (Ia) mit einem Antikörper konjugiert ist, stellt einer der Substituenten R1, R3 oder R4 also -L-#l dar, wobei L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper steht. D.h. im Falle der Konjugate stellt einer der Substituenten R1, R3 oder R4 -L-#l dar, wobei -L-#l die Bindung an den Antikörper darstellt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Formel (I) oder (Ia) stellt einer der Substituenten R1 oder R3 -L-#l dar. In dieser Ausführungsform ist es besonders bevorzugt, wenn R4 H oder -SGjyS-(CO)o_i-R4' darstellt, wobei SGjys und R4'dieselbe Bedeutung haben wie oben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Formel (I) stellt der Substituenten R4-L-#l dar, wobei der Linker ein Linker ist, der am Stickstoffatom, das an R4 bindet, spaltbar ist, so dass nach Spaltung eine primäre Amingruppe vorliegt (entsprechend R4 = H). Entsprechende spaltbare Gruppen werden unten näher beschrieben. Der Binder ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper oder ein Antigen -bindendes Fragment hiervon. Besonders bevorzugt sind anti-B7H3 -Antikörper, die spezifisch die humane Ig4- und/oder die humane und/oder murine Ig2 -Isoform von B7H3 binden, insbesondere die anti-B7H3 -Antikörper TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515. In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform liegt der anti-B7H3 -Antikörper aglycosyliert vor.
Anstelle von -L-#l kann auch die Gruppe -L-#3 in der Verbindung vorhanden sein, wobei L für den Linker steht und #3 für die reaktive Gruppe zur Bindung an Antikörper steht. Verbindungen mit -L-#3 sind reaktive Verbindungen, die mit dem Antikörper reagieren. #3 ist vorzugsweise eine Gruppe, die mit einer Amino- oder Thiolgruppe unter Bildung einer kovalenten Bindung reagiert, vorzugsweise mit dem Cysteinrest in einem Protein. Der Cysteinrest in einem Protein kann BHC 15 1 040-A - 27 - natürlich im Protein vorliegen, durch biochemische Methoden eingebracht werden oder vorzugsweise durch vorherige Reduktion von Disulfiden des Binders generiert werden kann.
Als A ist CO (carbonyl) bevorzugt.
Als R1 ist bevorzugt -L-#l, H, -COOH, -CONHNH2, -(CH2)i-3NH2, -CONZ"(CH2)i-3 NH2 und - CONZ"CH2COOH, wobei Z" H oder NH2.
Als R2 und R4 sind bevorzugt H oder R2 und R4 stellen gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR11- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H oder F darstellt. Als R4 ist zudem -L-#l bevorzugt, wobei -L-#l ein spaltbarer Linker ist, vorzugsweise ein intrazellulär enzymatisch spaltbarer Linker.
Als R3 ist bevorzugt -L-#l oder eine C 1-10- Alkyl-, die ggf. mit -OH, O-Alkyl, SH, S-Alkyl, O-CO- Alkyl, O-CO-NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH-Alkyl, S(0)n-Alkyl, S02-NH-Alkyl, NH- Alkyl, N(Alkyl)2, oder NH2 substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet).
Als R5 ist bevorzugt H oder F.
Als R6 und R7 sind unabhängig voneinander bevorzugt H, (ggf. fluoriertes) Ο-3-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2^-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen.
Als R8 ist bevorzugt eine verzweigte Ο-5-Alkyl-Gruppe, insbesondere eine Gruppe der Formel - C(CH3)2-(CH2)o-2 -Ry, wobei Ry -H, -OH, C02H, oder NH2, oder eine (ggf. fluoriertes) C5-7- Cycloalkyl Besonders bevorzugt ist eine Gruppe der Formel -C(CH3)3 oder eine Cyclohexylgruppe.
Als R9 ist bevorzugt H oder F.
Insbesondere bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I) oder (Ia), in der
A CO (carbonyl) ist;
R1 H, -L-#l , -COOH, -CONHNH2, -(CH2)i-3NH2, -CONZ"(CH2)i-3 NH2 und -CONZ"CH2COOH ist, wobei Z" H oder NH2;
R2 und R4 H ist, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRn- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H darstellt; oder R4 -L-#l ist und R2 H ist; BHC 15 1 040-A - 28 -
R3 -L-#l oder eine Phenylgruppe, die ein oder mehrfach mit Halogen (insbesondere F) oder ggf. fluoriertes C1 .3 Alkyl substituiert sein kann, oder eine ggf. fluorierte G-10-Alkylgruppe darstellt, die ggf. mit -OY4, -SY4, -O-CO-Y4, -O-CO-NH-Y4, NH-CO-Y4, -NH-CO-NH-Y4, S(0)n- Y4(wobei n 0, 1 oder 2 darstellt), -SO2-NH-Y4, NH-Y4, oder N(Y4)2, substituiert sein kann, wobei Y4 H, Phenyl (ggf. ein oder mehrfach mit Halogen (insbesondere F) oder ggf. fluoriertes C 1 .3 Alkyl substituiert), oder Alkyl (wobei die Alkylgruppe mit -OH, -COOH, und/oder -NHCO-C1-3- Alkyl substituiert sein kann, und wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet) darstellt;
wobei insbesondere bevorzugt R3mit -OH, O-Alkyl, SH, S-Alkyl, O-CO-Alkyl, O-CO-NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH-Alkyl, S(0)n-Alkyl, S02-NH-Alkyl, NH-Alkyl, N(Alkyl)2, oder NH2 substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet);
R5 H oder F ist;
R6 und R7 unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) Ci-3-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;
R8 eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe oder Cyclohexyl ist; und
R9 H oder F ist.
Weiterhin sind bevorzugt (allein oder in Kombination), wenn R1 -L-#l, COOH oder H darstellt,
R2 und R4 H sind oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRn- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H darstellt, oder R4 -L-#l ist und R2 H ist;
A CO darstellt,
R3 -(CH2)OH, -CH(CH3)OH, -CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3, -CH(CH3)OCH3, eine Phenylgruppe, die mit 1-3 Halogenatomen, 1-3 Aminogruppen oder 1-3 Alkylgruppen (die ggf. halogeniert sein können, substituiert sein kann, oder -L-#l darstellt,
R5 oder H darstellt,
R6 und R7 unabhängig voneinander H, G-3-Alkyl oder Halogen darstellen, insbesondere dass R6 und R7 F darstellen;
R8 C 1-4- Alkyl (vorzugsweise tert-butyl) oder Cyclohexyl darstellt; und/ oder
R9 H darstellt. BHC 15 1 040-A - 29 -
Zudem ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn
R1 -L-#l, COOH oder H darstellt,
R2 und R4 H oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR11- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H darstellt,
A CO darstellt,
R3 -(CH2)OH, -CH(CH3)OH, -CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3, -CH(CH3)OCH3, eine Phenylgruppe, die mit 1-3 Halogenatomen, 1-3 Aminogruppen oder 1-3 Alkylgruppen (die ggf. halogeniert sein können, substituiert sein kann, oder -L-#l darstellt,
R5 H darstellt,
R6 und R7 unabhängig voneinander H, G-3-Alkyl oder Halogen darstellen, insbesondere dass R6 und R7 F darstellen;
R8 Ci-4-Alkyl (vorzugsweise tert-butyl) darstellt; und
R9 H darstellt.
Andere besonders bevorzugte Verbindungen weisen die folgende Formel (II) oder (IIa) auf:
Formel (II):
Figure imgf000030_0001
wobei
R1 H, -L-Binder, -MOD oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(z.B. -(CH2)0-3Z'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, NH2, S03H, - COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i-3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt, BHC 15 1 040-A - 30 - wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-β Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 H, -MOD, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-β Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes Ci-β Alkyl darstellt,
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z ' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, S03H, NH2 oder COOH darstellt;
R4 H, -L-Binder,
-SGlys-(CO)0.i -R4', -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
wobei SGjyS eine durch lysosomale Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine C O- Alkyl-, C 5-10- Aryl- oder G io-Aralkyl-, C5-10- Heteroalkyl-, G-io-Alkyl-O-G-io-Aryl-, G-10-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, G-io-Aryloxy- oder C6-io-Aralkoxy-, G-10-Heteroaralkoxy-, G- io-Alkyl-0-C6-io-Aryloxy-, G-10-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit -NH2, -NH- Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-COAlkyl, -SO3H, -S02NH2, -S02-N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, -CON(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox-(CH2CH20)y- R^ darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise C 2-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2-CH2-NH2 darstellt); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z ' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6 -NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes G_6 Alkyl darstellt;
oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRn- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), G^ Alkyl, G- 4Haloalkyl, G-4Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes G^ Alkyl, COO(C 1-4 Alkyl) oder OH darstellt;
A CO, SO, S02, S02NH oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-Binder, -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine G-10-Alkyl-, BHC 15 1 040-A - 31 -
Cö-io-Aryl- oder Cö-io-Aralkyl-, Cs io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryl- oder C5-10- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S- Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)n- Alkyl Gruppen, 1-3 -S02-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2)o- 3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H, -(CH2)o-3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt G-10-Alkyl bedeutet);
R5 H, NH2, N02, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder - (CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
R6 und R7 unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) C O- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, Hydroxy, N02, NH2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) G-10-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2_io-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, (ggf. fluoriertes) C4-io-Cycloalkyl oder-(CH2)0-2-(HZ2) darstellt, wobei HZ2 ein 4 bis 7-gliedriger Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darstellt, wobei jede dieser Gruppen mit -OH, C02H oder NH2 substituiert sein kann darstellt;
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; wobei -MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei
R10 H oder G-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R10 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und BHC 15 1 040-A - 32 -
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, S02, -NRY-, -NRYCO-, CONRy-, -NRyNRy-, -S02NRyNRy-, -CONRyNRy-, (wobei Ry H, Phenyl, Ci -Ci Q-Alkyl, C2-Cio-Alkenyl, oder C2-C^o-Alkmyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CRx=N-0- (wobei Rx H, C ^-C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Gruppe - MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Im Falle von Binderkonjugaten der KSP-Inhibitoren der Formel (II) kann maximal ein Vertreter von R1 , R3 und R4 (alternativ zu einer der oben angegebenen Bedeutungen) -L-Binder darstellen, wobei L für einen Linker steht und BINDER für den Antikörper steht, wobei der Antikörper ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann.
Formel (IIa):
Figure imgf000033_0001
wobei
R1 -L-BINDER, H, oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0 3Z', oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, NH2, S03H, COOH, -NH-CO-CH2- CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i_3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt; BHC 15 1 040-A - 33 - wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-β Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 und R4 unabhängig voneinander H, -SGlys-(CO)0.i -R4', -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellen, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRn- oder - CHRn-CH2- darstellen, oder R2 H, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt und R4 -L-#l darstellt, wobei R11 H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), G-4 Alkyl, G-4 Haloalkyl, Ci-4 Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes Ci-4 Alkyl, COO(Ci-4 Alkyl) oder OH darstellt; wobei SGjyS eine durch lysosomale Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine C O- Alkyl-, C 5-10- Aryl- oder Cö-io-Aralkyl-, C5-10- Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, G-10-Alkoxy-, Cö-io-Aryloxy- oder Cö-io-Aralkoxy-, Cs-io-Heteroaralkoxy-, G_ io-Alkyl-0-C6-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe darstellt, die ein oder mehrfach mit - NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-COAlkyl, -SO3H, -S02NH2, -S02- N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, -CON(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox-(CH2CH20)y-R4 darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise Ci-i2-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2-CH2- NH2darstellt); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z ' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, G_6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6 -NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes G_6 Alkyl darstellt;
A CO, SO, S02, S02NH oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-BINDER oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine G-10- Alkyl-, Cö-io-Aryl- oder Cö-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1 -3 -OH Gruppen, 1 -3 Halogenatomen, 1 -3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen),, 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1 -3 - O-CO-Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -S(0)n- Alkyl Gruppen, 1 -3 -S02-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1 -3 -NH2 Gruppen oder 1 -3 -(CH2)0-3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig BHC 15 1 040-A - 34 - voneinander H, NEh, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H, -(CH2)o-3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2V3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt G-10-Alkyl bedeutet);
R5 H, F, NH2, NO2, Halogen, SH oder -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, - NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei L für einen Linker steht und BINDER für Binder bzw. Derivat hiervon steht, wobei der Binder ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann,
R6 und R7 unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) C O- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) G-10-Alkyl, (ggf fluoriertes) C4-io-Cycloalkyl oder optional substituiertes Oxetan darstellt; und
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Weiterhin sind erfindungsgemäß bevorzugt folgende Κ8Ρ-ΙηηΜίθΓ6η-ΑηίίΚφ6Γ-Κοη^3ίε:
Formel (IIb):
Figure imgf000035_0001
BHC 15 1 040-A - 35 - wobei R1, R2, R4, R5, R6, R7, R8 und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, A CO darstellt, B eine Einfachbindung, -0-CH2- oder -CH2-0- darstellt, und R20 NH2, F, CF3, oder CH3, und n 0, 1, oder 2 darstellt.
Formel (IIc):
Figure imgf000036_0001
wobei A, R1, R3, R6, R7, R8, und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, wobei A vorzugsweise CO und R3 -CH2OH, -CH2OCH3, CH(CH3)OH oder CH(CH3)OCH3 darstellt.
Formel (Ild):
Figure imgf000036_0002
wobei A, R3, R6, R7, R8 und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, wobei A vorzugsweise CO und R3 -CH2-SX-(CH2)<M-CHY5-COOH auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3 darstellt.
Formel (He): BHC 15 1 040-A - 36 -
Figure imgf000037_0001
wobei A, R2,R3, R4, R6, R7, R8 und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, und R! -L-BINDER darstellt.
Formel (Iii):
Figure imgf000037_0002
wobei A, R1, R2, R3, R6, R7, R8 und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, und R^ -L-BINDER darstellt, vorzugsweise einen enzymatisch spaltbaren Binder, so dass nach Spaltung R^ =H. R1 oder R3 stellen besonders bevorzugt -MOD dar.
Formel (Ilj) aufweist: BHC 15 1 040-A - 37 -
Figure imgf000038_0001
wobei
R3 -L-#l darstellt;
A CO darstellt; und
R6, R7, R8 und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) aufweisen
Formel (Ilk):
Figure imgf000038_0002
(Ilk) wobei
R1 -L-#l darstellt;
A CO und R3 -CH2OH - darstellt;
R3, R6, R7, R8, und R9die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) aufweisen.
Weiterhin sind bevorzugt in den Verbindungen der Formeln (II), (IIa), (IIb), (IIc), (Ild), (Ile), (Iii), (Ilj) und (Ilk) (allein oder in Kombination), wenn:
Z Cl oder Br darstellt; BHC 15 1 040-A - 38 -
R1 -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Z COOH oder -CO-NY'Y2 darstellt, wobei Y2 -(CH2CH2O)0-3-
(CH2)0 3Z' und Y1 H, NH2, oder -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0 3Z'darstellt;
Y1 H darstellt, Y2 -(CH2CH20)3-CH2CH2Z' darstellt und Z' -COOH darstellt;
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt und Z' -(CONHCHY4)2COOH stellt;
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -(CONHCHY4)2COOH stellt und eine Y4 z-propyl darstellt und der andere ein -(CH2)3-NHCONH2 darstellt ;
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -(CONHCHY4)2COOH stellt und eine Y4 -CH3 darstellt und der andere ein -(CH2)3-NHCONH2 darstellt ;
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes, 0_6 Alkyl darstellt; mindestens ein Vertreter von Y4 ausgewählt wird aus z-propyl oder -CH3.
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -CONHCHY4COOH darstellt und Y4 gegebenenfalls mit
-NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
Y4 Aminobenzyl darstellt;
R2 -(CH2)0-3Z darstellt und Z -SY3 darstellt;
R4 -CO-CHY4-NHY5 darstellt und Y5 H darstellt;
R4 -CO-CHY4-NHY5 darstellt und Y5-CO-CHY6-NH2 darstellt; oder
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls substituiertes mit -NHCONH2 Ci-6 Alkyl darstellt.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn R1, R2 oder R3 in Formel (I) oder (II) -MOD darstellt,
Besonders bevorzugt stellt R3 -MOD und R1 oder R4-L-#l bzw. -L-BINDER dar, wobei -MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei
R10 H oder Ci-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R10 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, S02, -NRY-, -NRYCO-, CONRY-, -NRYNRY-, -S02NRYNRy-, -CONRYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, Ci -Ci g-Alkyl, C2-C1 g-Alkenyl, oder C2-C1 g-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CRx=N-0- (wobei Rx H, C 1 -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern BHC 15 1 040-A - 39 - vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, wobei G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist;
Besonders bevorzugt weist die Gruppe -MOD eine (vorzugsweise terminale) -COOH-Gruppe auf, z.B. in einer Betaingruppe. Vorzugsweise weist die Gruppe -MOD die Formel -CH2-Sx-(CH2)o-4- CHY5-COOH auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3 darstellt.
Andere besonders bevorzugte Verbindungen weisen die folgende Formel (III) auf:
Figure imgf000040_0001
wobei
Rl -L-BINDER, H, oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2CH20)o-3-(CH2)0 3Z' oder - CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, NH2, S03H, COOH, - NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i_3COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes, G_6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 und R4 unabhängig voneinander H, -SGlys-(CO)0.1 -R4', -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellen, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRn- oder - CHRn-CH2- darstellen, wobei R1 1 H, NH2, S03H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), IA Alkyl, IA Haloalkyl, C \A Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes Ci-4 Alkyl, COO(Cw Alkyl) oder OH darstellt; BHC 15 1 040-A - 40 - wobei SGjyS eine durch lysosomale Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine G-io-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Cö-io-Aralkyl-, C5-10- Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, Cö-io-Aryloxy- oder Cö-io-Aralkoxy-, Cs-io-Heteroaralkoxy-, G_ io-Alkyl-0-C6-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, - NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-COAlkyl, -SO3H, -SO2NH2, -S02-N(Alkyl)2, - COOH, -CONH2, -CON(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox- (CH2CH20)y-R4" darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R4" - H, -Alkyl (vorzugsweise G-12-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2-CH2-NH2 darstellt); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z ' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6 -NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl darstellt;
A CO, SO, S02, S02NH oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-BESiDER, eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe, oder-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH darstellt, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3. darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine G-io-Alkyl-, C6-io-Aryl- oder C6-io-Aralkyl-, Cs io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryl- oder C5- 10-Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen),, 1-3 O- Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 - NH-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)n- Alkyl Gruppen, 1-3 -S02- NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1- 3 -(CH2)o-3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z ' darstellen, und Y3 H, -(CH2)o-3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)0-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt G-10-Alkyl bedeutet);
R5 H, F, NH2, N02, Halogen, SH oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, - NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, BHC 15 1 040-A - 41 - wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt; wobei L für einen Linker steht und BINDER für den Antikörper steht, wobei der Binder ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann,
R6 und R7 unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) Ci-10-Alkyl, (ggf fluoriertes) C4 io-Cycloalkyl oder optional substituiertes Oxetan darstellt; und
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Weiterhin sind bevorzugt (allein oder in Kombination), wenn in Formel (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (Ild), (He), (Iii), (Ilj), (Ilk) oder (III):
Z Cl oder Br darstellt;
R1 -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -CO-NY'Y2 darstellt, wobei Y2 -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0 3Z' und Y1 H, NH2, oder -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0 3Z'darstellt;
Y1 H darstellt, Y2 -(CH2CH20)3-CH2CH2Z' darstellt und Z' -COOH darstellt;
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt und Z' -(CONHCHY4)2COOH stellt;
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -(CONHCHY4)2COOH stellt und ein Vertreter von Y4 i- propyl darstellt und der andere -(CH2)3-NHCONH2 darstellt ;
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -(CONHCHY4)2COOH stellt und ein Vertreter vonY4 - CH3 darstellt und der andere -(CH2)3-NHCONH2 darstellt ;
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes, C 1-5 Alkyl darstellt; mindestens ein Vertreter von Y4 ausgewählt wird aus z-propyl or -CH3.
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -CONHCHY4COOH darstellt und Y4 gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
Y4 eine Aminobenzyl darstellt;
R2 -(CH2)o-3Z darstellt und Z -SY3 darstellt;
R4 -CO-CHY4-NHY5 darstellt und Y5 H darstellt;
R4 -CO-CHY4-NHY5 darstellt und Y5-CO-CHY6-NH2 darstellt; und/oder
Y4 lineares oder verzweigtes gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes C 1-6 Alkyl darstellt. BHC 15 1 040-A - 42 -
Weiterhin sind bevorzugt Verbindungen der Formel (I), (Ia), (II), (IIa) oder (III),
wobei
R1 H, -L-#l bzw. -L-BINDER, -MOD oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z'(z.B. -(CH2)0-3Z'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, NH2, SO3H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i_3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, G_6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 H, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, S03H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 unabhängig voneinander lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, C i-β Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5H oder -CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes Ci-6 Alkyl darstellt;
R4 H oder -L-#l bzw. -L-BINDER darstellt (wobei -L-#l bzw. -L-BINDER ein enzymatisch spaltbarer Linker ist, der zur Umwandlung von R4 zu H führt);
A CO, SO, S02, S02NH oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-#l bzw. -L-BINDER, -MOD oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt eine Ci-io-Alkyl-, C6-io-Aryl- oder Cö-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryl- oder C5-10- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S- Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)n- Alkyl Gruppen, 1-3 -S02-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH((CH2CH20)1.2oH)-Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2)0-3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z' darstellen, und Y3 H, -(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)0-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, S03H, NH2 oder COOH darstellt, substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt C1-10- Alkyl bedeutet); BHC 15 1 040-A - 43 -
R5 H, -MOD, NH2, N02, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z ' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, S03H, NH2 oder COOH darstellt;
R6 und R7 unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, Hydroxy, N02, NH2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) G-10-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2_io-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, oder (ggf. fluoriertes) C4-io-Cycloalkyl; wobei einer der Substituenten R1 und R3-L-#l bzw. -L-BINDER darstellt,
L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper und BINDER für den Antikörper steht,
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; wobei -MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei
R10 H oder Ci-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R10 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, S02, -NRY-, -NRYCO-, CONRY-, -NRYNRY-, -S02NRYNRy-, -CONRYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, C^-C^ o-Alkyl, C2-Ci o-Alkenyl, oder C2-C^ o-Alkmyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CRx=N-0- (wobei Rx H, C^-C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern BHC 15 1 040-A - 44 - vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, wobei G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Weiterhin sind bevorzugt Verbindungen der Formel Formel (I), (Ia), (II), (IIa) oder (III), in denen
R1 H, -L-#l bzw. -L-BINDER, -MOD oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH20)0-3-(CH2)o-3Z'(z.B. -(CH2)0-3Z'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, NH2, S03H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i_3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, G_6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 H, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2y3Z' darstellt, wobei Z' H, S03H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes G_6 Alkyl darstellt;
R4 H darstellt,
A CO, SO, S02, S02NH oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-#l bzw. -L-BINDER, -MOD oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt eine G-io-Alkyl-, C6-io-Aryl- oder Cö-io-Aralkyl-, Cs io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6 io-Aryl- oder C5-10- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S- Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)n- Alkyl Gruppen, 1-3 -S02-NH-Alkyl BHC 15 1 040-A - 45 -
Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH((CH2CH20)1.2oH)-Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2)0-3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z' darstellen, und Y3 H, -(CH2)o-3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt, substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt C O- Alkyl bedeutet);
R5 H, -MOD, NH2, N02, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)0-3Z' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
R6 und R7 unabhängig voneinander H oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen;
R8 (ggf. fluoriertes) C 1-10- Alkyl darstellt; wobei einer der Substituenten R1 und R3-L-#l bzw. -L-BINDER darstellt,
L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper und BINDER für den Antikörper steht,
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; wobei -MOD -CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3 darstellt, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.
Weiterhin sind die folgenden Verbindungen bevorzugt, die ggf. gemeinsam mit einer Säure wie z.B. Trifluoressigsäure vorliegen können. Diese Verbindungen können über die Positionen entsprechend den Positionen R1 , R3 und R4über einen Linker an den Antikörper gebunden werden (wobei ein Wasserstoffatom durch den Linker substituiert wird):
N-(3-Aminopropyl)-N-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropy 1 } -2 -hydroxyac etamid;
(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino] -N-methylbutanamid( 1 :1); BHC 15 1 040-A - 46 -
Ν-(3-ΑηιίηορΓοργ1)-Ν-{(18)-1-[1-06ηζγ1-4-(2,5-(ϋΑυο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2γ1]-2,2- dimethylpropyl } acetamid;
N-(3-Aminopropyl)-N-{(l S)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropy 1 } -2 -hydroxyac etamid;
S-(l-{2-[(N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } -b eta-alanyl)amino] ethyl } -2, 5-dioxopyrrolidin-3 -yl)- L-cystein;
S-(l-{2-[(N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (glycoloyl)amino]butanoyl } -b eta-alanyl)amino] ethyl } -2, 5-dioxopyrrolidin-3 -yl)- L-cystein;
8-[1-(2-{[2-({(28)-2-Αηιίηο-4-[{(^)-1-[1 ^6ηζ 1-4-(2,5^ίηυοφ1ΐ6η 1)-1Η-ρ π·ο1-2- 1]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } amino)ethyl] amino } -2-oxoethyl)-2,5 -dioxopyrrolidin- 3-yl]-L-cystein;
N- [ 19-(3 (R/S)- { [(2R)-2-Amino-2-carboxyethyl]sulfanyl} -2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yl)- 17-oxo-
4,7,10,13-tetraoxa-16-azanonadecan-l-oyl]-R/S-{2-[(3-aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}homocystein;
S-{(3R/S)-l-[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl}-L-cystein;
S-[(3R/S)-l-(2-{[6-({2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-
2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)hexanoyl]amino}ethyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl]-
L-cystein;
8-{1-[2-({[(1^38)-3-({(28)-2-Αηιίηο-4-[{(^)-1-[1 ^6ηζ 1-4-(2,5^ίηυοφ1ΐ6η 1)-1Η-ρ π·ο1-2- 1]-
2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)cyclopentyl]carbonyl}amino)ethyl]-2,5- dioxopyrrolidin-3-yl}-L-cystein;
8-(2-{[2-({(28)-2-Αηιίηο-4-[{(^)-1-[1^6ηζ 1-4-(2,5^ίηυοφ1ΐ6η 1)-1Η-ρ π·ο1-2- 1]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } amino)ethyl] amino } -2-oxoethyl)-L-cystein;
N6-(N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl)-N2-{N-[6-(3-{[(2R)-2-amino-2- carboxy ethyl] sulfanyl } -2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yl)hexanoyl] -L- valyl-L-alanyl } -L-lysin;
N-[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]-L-glutamin;
N6-(N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } -b eta-alanyl)-L-ly sin; BHC 15 1 040-A - 47 -
N-(3-Aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -0εηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -3 ,3 ,3 -trifluorpropanamid;
N-(3-Aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-4-fluorbenzamid;
N-(3-Aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropy 1 } ac etamid;
N-(3-Aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-4-(trifluoromethyl)benzamid;
(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butansäure;
(2S)-2-amino-N-(2-aminoethyl)-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanamid;
4-[(2-{[2-({(28)-2-Αηιίηο-4-[{(^)-1-[1^6ηζ 1-4-(2,5^ίηυοφ1ΐ6η 1)-1Η-ρ π·ο1-2- 1]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]amino}-2-oxoethyl)amino]-3-{[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl] sulfanyl } -4 -oxobutansäure;
4-[(2-{[2-({(28)-2-Αηιίηο-4-[{(^)-1-[1^6ηζ 1-4-(2,5^ίηυοφ1ΐ6η 1)-1Η-ρ π·ο1-2- 1]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]amino}-2-oxoethyl)amino]-2-{[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl] sulfanyl } -4 -oxobutansäure;
N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanin;
N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } -L-s erin;
N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-L-alanin;
N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}glycin;
N-(3-aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difuu^henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropy 1 } -4 -methylb enzamid; BHC 15 1 040-A - 48 -
N-(3-aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-4-(methylsulfanyl)benzamid;
(2S)-N-(3 -aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difuu^henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2-hydroxypropanamid;
N-(3-aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2-(methylsulfanyl)acetamid;
(2S)-N-(3 -aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [4-benzyl- 1 -(2,5-difuu^henyl)- 1 H-pyrazol-3 -yl] -2,2- dimethylpropyl}-2-hydroxypropanamid;
Methyl-4-[(3 -aminopropyl) {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluc^rienyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino] -4-oxobutanoat;
4- [(3-Aminopropyl){(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino] -4-oxobutansäure;
(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-Amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-2,5-dioxopyrrolidin-l-yl]-2-[({2-[(3- aminopropyl) {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl]-2,2- dimethylpropyl} amino] -2-oxoethyl} sulfanyl)methyl]-4,20-dioxo-7, 10, 13 , 16-tetraoxa-3, 19- diazadocosan- 1 -säure;
N-Acetyl-S-{2-[(3-aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-L-cystein;
N-Acetyl-S-[2-([3 -(L-alanylamino)propyl] {(1 R)-l -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-l H-pyrrol-2 - yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)-2-oxoethyl]-L-cystein;
(2S)-N-(3 -aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difuu^henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } tetrahydrofuran-2-carboxamid;
3- ({2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)propansäure;
5- {2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}homocystein;
4- amino-N-(3-aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difliK^henyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl]-2,2- dimethylpropyljbenzamid;
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } amino)-2 -carboxyethyl] amino } -2-oxoethyl)amino] -3 - { [(2R)-2-amino-2-carboxyethyl]sulfanyl} -4-oxobutansäure;
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } amino)-2 -carboxyethyl] amino } -2-oxoethyl)amino] -2- {[(2R)-2-amino-2-carboxyethyl]sulfanyl} -4-oxobutansäure. BHC 15 1 040-A - 49 -
Erfmdungsgemäß besonders bevorzugt sind die folgenden Verbindungen der Formeln IV, wobei R1, R2, R3, R4 und R5 die oben genannten Bedeutungen (wie z.B. für Formel (I) oder (II) angegeben) haben:
Figure imgf000050_0001
Formel IV
Besonders bevorzugt sind die Verbindungen der Formeln IV, wobei R1 und R5 H oder -L-#l darstellen; R2 und R4 H oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2- CHR11- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H darstellt; und R3 CH2OH, CH(CH3)OH oder - L-#l darstellt, wobei einer der Substituenten R1, und R3 -L-#l darstellt. Zudem sind besonders bevorzugt die Verbindungen der Formeln IV, wobei R1 H oder COOH darstellt; R2 und R5 H darstellen; R4 -L-#l darstellt; und R3 CH2OH, oder CH(CH3)OH darstellt, wobei-L-#l ein enzymatisch spaltbarer Linker ist, der zur Umwandlung von R4zu H führt darstellt.
Linker
Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Binder wie z.B. Antikörper bekannt (siehe z.B. K. Lang and J. W. Chin. Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806, M. Rashidian et al. Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1277-1294). Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation der KSP-Inhibitoren an einen Antikörper über ein oder mehrere Schwefelatome von Cystein-Resten des Antikörpers, die entweder als freie Thiole bereits vorliegen oder durch Reduktion von Disulfidbrücken generiert werden, und/oder über eine oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, den KSP-Inhibitor an den Antikörper über Tyrosinreste, über Glutaminreste, über Reste unnatürlicher Aminosäuren, über freie Carboxylgruppen oder über Zuckerreste des Antikörpers zu binden. Zur Kopplung werden sogenannte Linker verwendet. Linker lassen sich in die Gruppe der in vivo spaltbaren Linker und in die Gruppe der in vivo stabilen Linker unterteilen (siehe L. Ducry und B. Stump, Bioconjugate Chem. 21_, 5-13 (2010)). Die in vivo spaltbaren Linker weisen eine in vivo BHC 15 1 040-A - 50 - spaltbare Gruppe auf, wobei wiederum zwischen chemisch in vivo spaltbaren und enzymatisch in vivo spaltbaren Gruppen unterschieden werden kann. „Chemisch in vivo spaltbar" bzw. „enzymatisch in vivo spaltbar" bedeutet, dass die Linker bzw. Gruppen im Blutkreislauf stabil sind und erst an bzw. in der Zielzelle durch die dort veränderte chemische bzw. enzymatische Umgebung (niedrigerer pH-Wert; erhöhte Glutathion-Konzentration; Vorliegen lysosomaler Enzyme wie Cathepsin oder Plasmin, oder Glyosidasen wie beispielsweise ß-Glucuronidasen) sich spalten, um so den niedermolekularen KSP-Inhibitor oder ein Derivat davon freizusetzen. Die chemisch in vivo spaltbaren Gruppen sind insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; die enzymatisch in vivo spaltbaren Gruppen, insbesondere solche, die durch lysosomale Enzyme spaltbar sind, sind insbesondere 2-8-Oligopeptidgruppe, insbesondere eine Tri- oder Dipeptidgruppe oder Glycoside. Peptidspaltstellen sind in Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, sowie Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341 -3346 sowie Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626 offenbart. Hierzu gehören z.B. Valin- Alanin, Valin-Lysin, Valin-Citrullin, Alanin-Lysin und Phenylalanin-Lysin (ggf. mit zusätzlicher Amidgruppe).
Die in vivo stabilen Linker zeichnen sich durch eine hohe Stabilität aus (weniger als 5 % Metabolite nach 24 Stunden in Plasma) und weisen die oben genannten chemisch oder enzymatisch in vivo spaltbaren Gruppen nicht auf.
Der Linker -L- weist vorzugsweise eine der folgenden Grundstrukturen (i) bis (iv) auf:
(i) -(C=0)m-SG1 -Ll -L2-
(ii) -(C=0)m -Ll -SG-Ll-L2-
(iii) -(C=0)m -Ll -L2-
(iv) -(C=0)m -Ll -SG-L2 wobei m 0 oder 1 ist; SG eine (chemisch oder enzymatisch) in vivo spaltbare Gruppe (insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit einer Protease spaltbare 2-8- Oligopeptidgruppe) ist, SGI eine Oligopeptidgruppe oder vorzugsweise eine Dipeptidgruppe ist, LI unabhängig voneinander für in vivo stabile organische Gruppen stehen, und L2 für eine Kopplungsgruppe an den Binder oder eine Einfachbindung steht. Die Kopplung erfolgt hierbei vorzugsweise an einen Cysteinrest oder einen Lysinrest des Antikörpers. Alternativ kann die Kopplung an einen Tyrosinrest, Glutaminrest oder an eine unnatürliche Aminosäure des Antikörpers erfolgen. Die unnatürlichen Aminosäuren können beispielsweise Aldehyd- oder Ketogruppen (wie z.B. Formylglycin) oder Azid- oder Alkingruppen enthalten (siehe hierzu Lan & Chin, Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chem.Rev. 2014, 114, 4764-4806). BHC 15 1 040-A - 51 -
Erfindungsgemäß bevorzugt ist insbesondere die Linker-Grundstruktur (iii). Die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Konjugats mit einer Linker-Grundstruktur (iii) und Kopplung des Linkers an einen Cystein- oder Lysinrest des Antikörpers führt durch Metabolisierung zu Cystein- bzw. Lysinderivaten der folgenden Formeln:
Figure imgf000052_0001
wobei LI jeweils an den niedermolekularen KSP-Inhibitor gebunden ist, z.B. einer Verbindung der Formel (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (Ilca), (Ild), (He) , (Iii), (III) oder (IV).
Erfindungsgemäß bevorzugt sind auch die Linker-Grundstrukturen (ii) and (iv), insbesondere bei Anbindung an die Position Rl, insbesondere wenn die Gruppe LI eine der folgenden Strukturen aufweist:
(a) -NH-(CH2)o-4-(CHCH3)o-4-CHY5-CO-Y7 , wobei Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder - COCH3 darstellt, und Y7 eine Einfachbindung oder -NH -(CH2)o-4 -CHNH2-CO- darstellt, so dass nach der Spaltung die entsprechende Struktur -NH-(CH2)o-4-(CHCH3)o-4-CHY5-COOH bzw. -NH- (CH2)o-4-(CHCH3)o-4-CHY5-CO-NH -(CH2)o-4 -CHNH2-COOH erhalten wird.
(b) -CH2-Sx-(CH2V-CHY5-CO- auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3 darstellt, so dass nach der Spaltung die entsprechende Struktur -CH2-SX- (CH2)o-4-CHY5-COOH erhalten wird.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch die Linker-Grundstruktur(i) bei Anbindung an die Position R4, insbesondere wenn m=0.
Wenn der Linker an eine Cystein-Seitenkette bzw. einen Cysteinrest gebunden ist, leitet sich L2 vorzugsweise von einer mit der Sulfhydryl-Gruppe des Cysteins reaktiven Gruppe ab. Hierzu zählen Haloacetyle, Maleimide, Aziridine, Acryloyle, Arylierende Verbindungen, Vinylsulfone, Pyridyldisulfide, TNB-thiole and Disulfid-reduzierende Mittel. Diese Gruppen reagieren in der Regel elektrophil mit der Sulfhydryl-Bindung unter Bildung einer Sulfid (z.B. Thioether)- oder Disulfid-Brücke. Bevorzugt sind stabile Sulfidbrücken. L2 ist vorzugsweise
Figure imgf000052_0002
BHC 15 1 040-A - 52 -
Figure imgf000053_0001
wobei
#' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und
R22 COOH, COOR, COR, CONHR, CONR2 (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CONH2, vorzugsweise COOH darstellt.
Besonders bevorzugt als L2 ist:
Figure imgf000053_0002
Formel A3 bzw. BHC 15 1 040-A - 53 -
Figure imgf000054_0001
Formel A4 wobei #' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der dem Wirkstoff kennzeichnet, x 1 oder 2 darstellt, und COOH, COOR, COR, CONR2, CONHR (mit R jeweils Cl -3-Alkyl), CONH2, vorzugsweise COOH darstellt. Bevorzugt ist es, wenn x=l und R^2 COOH darstellt.
In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A3 oder A4 vor. Hierbei liegen die Strukturen der Formel A3 oder A4 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
Figure imgf000054_0002
vor.
Erfindungsgemäß wird LI vorzugsweise durch die Formel
#l-(NR10)n-(Gl)o-G2-#2
dargestellt, wobei
R10 H, NH2 oder Ci-C3-Alkyl darstellt; BHC 15 1 040-A 54
— N N-CO— , n
Gl -NHCO- , -CONH- oder \ / darstellt; (Ri U ist vorzugsweie nicht NH2, wenn
— N N-CO—
Gl NHCO oder \ / ).
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO2, -NRY-, -
NRYCO-, -C(NH)NRy-, -CONRY-, -NRYNRY-, -S02NRYNRy-, -CONRYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, C1 -C1 g-Alkyl, C2-C1 g-Alkenyl, oder C2-C1 g-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, Ci -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) und/oder einen 3 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise Λ
— N N-CO—
\ / ), wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH- und einen 5 bis 1 Ogliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, oder -SO- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
ΓΛ
— N N-CO—
\ / ), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -
OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
G2 ist vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen - BHC 15 1 040-A - 55 -
O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, Ci -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) und einen 3 bis 10-gliedriger, z.B. 5 bis lOgliedriger aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
Figure imgf000056_0001
), wobei Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Weitere unterbrechende Gruppen in G2 sind vorzugsweise
Figure imgf000056_0002
wobei Rx H, Ci -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt.
Hierbei ist #1 die Bindung zum KSP-Inhibitor und ffi die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper (z.B. L2).
Eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen umfasst in der Regel einen α,ω-divalenten Alkylrest mit der jeweils angegebenen Zahl von Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methylen, Ethan-l,2-diyl (1,2-Ethylen), Propan-1,3- diyl (1,3-Propylen), Butan- 1,4-diyl (1,4-Butylen), Pentan-l,5-diyl (1,5-Pentylen), Hexan-l,6-diyl (1,6-Hexylen), Heptan-l,7-diyl (1,7-Hexylen), Octan-l,8-diyl (1,8-Octylen), Nonan-l,9-diyl (1,9- Nonylen), Decan-l,10-diyl (1,10-Decylen). Die Alkylengruppen in der Kohlenwasserstoffkette können jedoch auch verzweigt sein, d.h. ein oder mehrere H-Atome der oben genannten linearen Alkylengruppen können ggf. durch Cl-10-Alkylgruppen substituiert sein und so Seitenketten bilden. Die Kohlenwasserstoffkette kann weiterhin cyclische Alkylengruppen (Cycloalkandiyl) enthalten, z.B. 1 ,4-Cyclohexandiyl oder 1,3-Cyclopentandiyl. Diese cyclischen Gruppen können BHC 15 1 040-A - 56 - ungesättigt sein. Insbesondere können in der Kohlenwasserstoffgruppe aromatische Gruppen (Arylengruppen) vorliegen, z.B. Phenylen. Auch in den cyclischen Alkylengruppen und den Arylengruppen können wiederum in oder mehrere H-Atome ggf. durch Cl-10-Alkylgruppen substituiert sein. Es wird so eine Kohlenwasserstoffkette gebildet, die ggf. verzweigt ist. Diese Kohlenwasserstoffkette weist insgesamt 0 bis 100 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 50, besonders bevorzugt 2 bis 25 Kohlenstoffatome auf.
Die Seitenketten können, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden substituiert sein.
Die Kohlenwasserstoffkette kann einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, - SO2NHNH-, -CONHNH- und einen 5 bis 1 Ogliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -SO2- unterbrochen sein.
Weitere unterbrechende Gruppen in G2 sind vorzugsweise
BHC 15 1 040-A 57
Figure imgf000058_0001
Vorzugsweise entspricht der Linker der folgenden Formel:
§-(CO)m-Ll-L2-§§ wobei
m 0 oder 1 ist; BHC 15 1 040-A - 58 -
§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
§§ die Bindung an das Binderpeptid oder -protein darstellt, und
LI und L2 die oben genannten Bedeutungen aufweisen.
Besonders bevorzugt weist LI die Formel -NR! Iß- auf, wobei
Rn H oder NH2 darstellt;
B -[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z- darstellt,
w = 0 bis 20 ist;
x = 0 bis 5 ist;
x = 0 bis 5 ist;
y = 0 oder 1 ist;
z = 0 bis 5 ist; und
Figure imgf000059_0001
darstellt.
Erfindungsgemäß bevorzugte Linker L weisen die folgende Formel auf:
Figure imgf000059_0002
wobei
#3 die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt,
#4 die Bindung an das Binderpeptid oder -protein darstellt,
R1 1 H oder NH2 darstellt;
B -[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z- darstellt,
w = 0 bis 20 ist;
x = 0 bis 5 ist;
y = 0 oder 1 ist;
z = 1 bis 5 ist; und BHC 15 1 040-A 59
X4 -O-, -CONH-, -NHCO- oder
Figure imgf000060_0001
darstellt.
Die oben genannten Linker werden insbesondere bevorzugt in Konjugaten der Formel (I) oder (II), in denen der Linker durch Substitution eines H-Atoms an Rl oder in Verbindung mit einem spaltbaren Linker SGI an R4 ankoppelt, d.h. Rl-L-#1 darstellt oder R4 -SG1-L-#1, wobei #1 die Bindung an den Antikörper darstellt.
Weiterhin sind die folgenden Linker erfindungsgemäß bevorzugt: In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A5 oder A6 vor:
Figure imgf000060_0002
Formel A5
Figure imgf000060_0003
Formel A6 wobei
#' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und
R22 COOH, COOR, COR, CONR2, CONHR (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CONH2, vorzugsweise COOH darstellt. BHC 15 1 040-A - 60 -
Hierbei liegen die Strukturen der Formel A5 oder A6 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
Figure imgf000061_0001
vor.
Andere Linker -L-, die an eine Cystein-Seitenkette bzw. Cysteinrest gebunden sind, weisen die folgende Formel auf:
Figure imgf000061_0002
wobei
§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
§§ die Bindung an das Binderpeptid oder -protein darstellt,
m 0, 1, 2, oder 3 ist;
n 0, 1 oder 2 ist;
p 0 bis 20 beträgt; und
L3
Figure imgf000061_0003
wobei
o 0 oder 1 ist;
und BHC 15 1 040-A - 61 -
G3 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, - CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH- und einen 3 bis lOgliedriger (vorzugsweise 5 bis lOgliedriger), aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann, wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Bevorzugt ist in der obigen Formel
m 1 ist;
p 0 ist;
n 0 ist;
und L3
G3-
0 darstellt;
wobei
o 0 oder 1 ist; und
G3 -(CH2CH20)s(CH2)t(CONH)u CH2CH20)v(CH2)„- darstellt, wobei
s, t, v und w jeweils unabhängig voneinander 0 bis 20 betragen, und u 0 oder 1 beträgt.
Bevorzugte Gruppen LI in der obigen Formel §-(CO)m-Ll-L2-§§ sind die folgenden, wobei r jeweils unabhängig voneinander eine Zahl von 0 bis 20, vorzugsweise von 0 bis 15, besonders bevorzugt von 1 bis 20, insbesondere bevorzugt von 2 bis 10 aufweist:
Figure imgf000062_0001
BHC 151040-A -62-
Figure imgf000063_0001
BHC 151040-A -63 -
Figure imgf000064_0001
BHC 151040-A -64-
Figure imgf000065_0001
BHC 151040-A -65-
Figure imgf000066_0001
BHC 151040-A -66-
Figure imgf000067_0001
BHC 151040-A -67-
Figure imgf000068_0001
BHC 151040-A -68-
Figure imgf000069_0001
BHC 151040-A -69-
Figure imgf000070_0001
BHC 151040-A -70-
Figure imgf000071_0001
BHC 151040-A -71 -
Figure imgf000072_0001
BHC 151040-A -72-
Figure imgf000073_0001
BHC 151040-A -73 -
Figure imgf000074_0001
BHC 15 1 040-A 74
Figure imgf000075_0001
BHC 15 1 040-A - 75 -
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000076_0002
Figure imgf000076_0003
Figure imgf000076_0004
Weitere Beispiele für LI sind in Tabelle C angegeben, in denen diese Gruppe in einem Kasten hervorgehoben ist. BHC 15 1 040-A - 76 -
In den folgenden Tabellen A und A' sind Beispiele für einen Linkerteil LI angegeben. In der Tabelle ist weiterhin angegeben, mit welcher Gruppe L2 diese Beispiele für LI vorzugsweise kombiniert werden, sowie die bevorzugte Ankopplungsstelle (R1 oder R3 oder R4) sowie der bevorzugte Wert für m, also ob vor LI eine Carbonylgruppe vorliegt oder nicht (vgl. §-(CO)m-Ll- L2-§§). Diese Linker werden vorzugsweise an einen Cysteinrest gekoppelt. Wenn L2 ein Bernsteinsäureimid ist bzw. sich hiervon ableitet, kann dieses Imid ganz oder teilweise auch in Form des hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäureamids vorliegen, wie oben beschrieben. In Abhängigkeit von LI kann diese Hydrolyse zu offenkettigen Bernsteinsäureamiden mehr oder weniger stark oder gar nicht ausgeprägt sein.
Figure imgf000077_0001
BHC 151040-A -77-
Figure imgf000078_0001
BHC 151040-A -78-
Figure imgf000079_0001
BHC 151040-A -79-
Figure imgf000080_0001
BHC 151040-A -80-
Figure imgf000081_0001
BHC 15 1 040-A - 81 -
Figure imgf000082_0001
BHC 15 1 040-A - 82 -
**Besonders bevorzugt werden die in diesen Zeilen angegebenen Linker LI mit einem Linker L2 verknüpft, der ausgewählt ist aus:
Figure imgf000083_0001
Formel A7
und/oder
Figure imgf000083_0002
Formel A8 vor, wobei #' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, R^2 vorzugsweise COOH darstellt. In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Binders vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Binder), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A7 oder A8 vor. Hierbei liegen die Strukturen der Formel A7 oder A8 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Binder. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
Figure imgf000083_0003
BHC 15 1 040-A 83 vor.
Figure imgf000084_0001
BHC 151040-A -84-
Figure imgf000085_0001
BHC 15 1 040-A - 85 -
Figure imgf000086_0001
BHC 151040-A -86-
Figure imgf000087_0001
BHC 151040-A -87-
Figure imgf000088_0001
BHC 15 1 040-A - 88 -
Figure imgf000089_0001
BHC 151040-A -89-
Figure imgf000090_0001
BHC 151040-A -90-
Figure imgf000091_0001
BHC 151040-A -91 -
Figure imgf000092_0001
BHC 151040-A -92-
Figure imgf000093_0001
BHC 151040-A -93 -
Figure imgf000094_0001
BHC 151040-A -94-
Figure imgf000095_0001
BHC 151040-A -95-
Figure imgf000096_0001
BHC 151040-A -96-
Figure imgf000097_0001
BHC 151040-A -97-
Figure imgf000098_0001
BHC 151040-A -98-
Figure imgf000099_0001
BHC 151040-A -99-
Figure imgf000100_0001
BHC 151040-A - 100-
Figure imgf000101_0001
Figure imgf000102_0001
BHC 15 1 040-A - 102 -
Figure imgf000103_0001
BHC 15 1 040-A - 103 -
Figure imgf000104_0001
BHC 15 1 040-A - 104 -
Figure imgf000105_0001
BHC 15 1 040-A - 105 -
Figure imgf000106_0001
BHC 15 1 040-A - 106 -
Figure imgf000107_0001
BHC 15 1 040-A - 107 -
Figure imgf000108_0001
BHC 15 1 040-A - 108 -
Figure imgf000109_0001
BHC 15 1 040-A - 109 -
Figure imgf000110_0001
BHC 15 1 040-A - 110 -
Subst m LI L2
Figure imgf000111_0001
und
Figure imgf000111_0002
Siehe
Anmerkung 1
Figure imgf000111_0003
und
Figure imgf000111_0004
Siehe
Anmerkung *** BHC 15 1 040-A - 111 -
Figure imgf000112_0001
BHC 15 1 040-A - 112 -
Figure imgf000113_0001
BHC 15 1 040-A - 113 -
Figure imgf000114_0002
**: Siehe Anmerkung ** zu Tabelle A.
***: Bei Vorhandensein dieser Struktur L2 kann zugleich eine Struktur L2 der folgenden Formel vorliegen:
Figure imgf000114_0001
Beispiele für Konjugate mit entsprechenden Linkern weisen folgende Strukturen auf, wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, und LI die oben angegebenen Bedeutung aufweist, L2 und L3 dieselbe Bedeutung wie LI hat, AKl für einen (aglycosyherten) anti-B7H3 -Antikörper steht, der über einen Cysteinrest gebunden ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist. Bevorzugt ist AKl ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. Besonders bevorzugt ist AKl ein anti-B7H3 -Antikörper, der spezifisch die humane Ig4- und/oder die humane und/oder murine Ig2 -Isoform von B7H3 bindet, insbesondere einer der anti-B7H3-Antikörper TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515.. In einer BHC 15 1 040-A - 114 - weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt der anti-B7H3 -Antikörper oder das Antigen -bindende Fragment aglycosyliert vor.
Figure imgf000115_0001
BHC 15 1 040-A - 115 -
Wenn der Linker an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest gebunden ist, weist er vorzugsweise die folgende Formel aufweist:
-§-(SG)x-L4-CO-§§, wobei
§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
§§ die Bindung an das Binderpeptid oder -protein darstellt,
x 0 oder 1 darstellt,
SG eine spaltbare Gruppe, vorzugsweise ein 2-8 Oligopeptid, besonders, bevorzugt ein Dipeptid darstellt,
und
L4 eine Einfachbindung oder eine Gruppe -(CO)y-G4- darstellt, wobei y 0 oder 1 darstellt, und G4 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigte und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO2, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH- und einen 5 bis 10- gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
Figure imgf000116_0002
), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -
NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können. BHC 15 1 040-A - 116 -
In der folgenden Tabelle B sind Beispiele für Linker an einen Lysinrest angegeben. In der Tabelle ist weiterhin die bevorzugte Ankopplungsstelle (R'-R5) angegeben. In der ersten Spalte sind weiterhin die Beispielnummern angegeben, in denen entsprechende Linker Anwendung finden.
Tabelle B: Lysin-Linker
-§-(SG)x-L4-CO-§§,
Figure imgf000117_0002
Beispiele für Konjugate mit entsprechenden Linkern weisen folgende Strukturen auf, wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, und L4 die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, AK2 für einen Antikörper steht, der über einen Lysinrest gebunden ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist. Bevorzugt als AK2 ist ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler, anti-B7H3- Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. Besonders bevorzugt sind anti-B7H3- Antikörper, die spezifisch die humane Ig4- und/oder die humane und/oder murine Ig2-Isoform von B7H3 binden, insbesondere die anti-B7H3-Antikörper TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP- 6502, TPP-6515. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt der anti-B 7H3 -Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment aglycosyliert vor.
Figure imgf000117_0001
BHC 15 1 040-A - 117 -
Figure imgf000118_0001
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt die Grundstruktur (i), (ii), oder (iv), wobei SGI bzw. SG eine durch eine Protease spaltbare Gruppe darstellt, und L I und L2 die oben aufgeführten Bedeutungen aufweisen. Besonders bevorzugt sind die folgenden Gruppen:
-Val-Ala-CONH- (hierdurch Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Alanin) -NH-Val-Lys-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin)
-NH-Val-Cit-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Citrullin) -NH-Phe-Lys-CONH (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin)
-NH-Ala-Lys-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin)
-NH-Ala-Cit-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Citrullin)
SGI bzw. SG ist besonders bevorzugt
Figure imgf000118_0002
oder BHC 15 1 040-A - 118 -
Figure imgf000119_0001
bzw.
Figure imgf000119_0002
wobei X H, eine G-io-Alkylgruppe ist, die gegebenenfalls mit -NHCONH2, -COOH, -OH, NH2, - NH-CN H2, oder Sulfonsäure substituiert sein kann.
In der folgenden Tabelle C sind Beispiele für einen Linkerteil -SGI -LI- bzw. -Ll-SG-Ll- angegeben, wobei SGI bzw. SG eine durch eine Protease spaltbare Gruppe ist. In der Tabelle C ist weiterhin angegeben, mit welcher Gruppe L2 diese Beispiele für -SGI -LI- bzw. -Ll-SG-Ll- vorzugsweise kombiniert werden, sowie die bevorzugte Ankopplungsstelle (R'-R5) sowie der bevorzugte Wert für m, also ob vor LI eine Carbonylgruppe vorliegt oder nicht (vgl. §-(CO)m-Ll- L2-§§). Diese Linker werden vorzugsweise an einen Cysteinrest gekoppelt. Die LI -Gruppe ist in einem Kasten hervorgehoben. Diese Gruppen LI können jedoch durch eine der Gruppe LI, die für die obige Formel §-(CO)m-Ll-L2-§§ angegeben ist, ausgetauscht werden. Wenn L2 ein Bernsteinsäureamid ist bzw. sich hiervon ableitet, kann dieses Amid ganz oder teilweise auch in Form des hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäureamids vorleigen, wie oben beschrieben.
Tabelle C
Sub m -SG1-L1- bzw. -Ll-SG-Ll- L2
st. BHC 151040-A - 119-
Figure imgf000120_0001
BHC 15 1 040-A - 120 -
Figure imgf000121_0001
BHC 15 1 040-A - 121 -
Figure imgf000122_0001
BHC 15 1 040-A - 122 -
Figure imgf000123_0001
BHC 15 1 040-A - 123 -
Figure imgf000124_0001
BHC 15 1 040-A - 124 -
Figure imgf000125_0001
BHC 15 1 040-A - 125 -
Figure imgf000126_0001
BHC 15 1 040-A - 126 -
Figure imgf000127_0001
BHC 15 1 040-A - 127 -
Figure imgf000128_0001
BHC 15 1 040-A 128
Figure imgf000129_0001
Beispiele für Konjugate mit der Grundstruktur (i) weisen die folgende Struktur auf, wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt,, L4 dieselbe Bedeutung wie LI hat, AK1 für einen anti-B7H3- Antikörper steht, der über einen Cysteinrest gebunden ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist. Der Antikörper ist vorzugsweise ein aglycosylierter humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler anti-B 7H3 -Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. Besonders bevorzugt ist ein anti-B 7H3 -Antikörper, der spezifisch die humane 4Ig-Isoform bindet, insbesondere einer der anti-B7H3 -Antikörper TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501 , TPP-6502 und TPP-6515In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt der anti-B7H3 -Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment aglycosyliert vor. BHC 15 1 040-A - 129 -
Figure imgf000130_0001
BHC 15 1 040-A - 130 -
KSP-Inhibitor - Linker-Intermediate und Herstellung der Konjugate
Die erfindungsgemäßen Konjugate werden hergestellt, in dem zunächst der niedermolekulare KSP- Inhibitor mit einem Linker versehen wird. Da so erhaltene Intermediat wird dann mit dem Binder (vorzugsweise Antikörper) umgesetzt.
Für die Kopplung an einen Cysteinrest wird vorzugsweise eine der folgenden Verbindungen mit dem Cystein-haltigen Binder wie z.B. einem Antikörper, der dazu ggf. partiell reduziert wurde, umgesetzt:
Figure imgf000131_0001
BHC 15 1 040-A - 131 -
Figure imgf000132_0001
BHC 15 1 040-A - 132 -
Figure imgf000133_0001
BHC 15 1 040-A - 133 -
Figure imgf000134_0001
BHC 15 1 040-A - 134 -
Figure imgf000135_0001
TFA
wobei R -H oder -COOH darstellt,
wobei K lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit G-CÖ Alkoxy oder -OH substituiertes G- Ce Alkyl darstellt, und
wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, SGI, LI, L2, L3 und L4 die gleiche Bedeutung haben wie oben beschrieben.
In jeder der obigen Verbindungen wie auch den folgenden Verbindungen kann die tert.-butyl- Gruppe durch Cyclohexyl ersetzt sein.
Die Verbindung kann z.B in Form ihres Trifluoressigsäuresalzes verwendet werden. Zur Reaktion mit dem Binder wie z.B. dem Antikörper wird die Verbindung vorzugsweise in 2 bis 12 fachem molaren Überschuss gegenüber dem Binder verwendet.
Für die Kopplung an einen Lysinrest wird vorzugsweise eine der folgenden Verbindungen mit dem Lysin-haltigen Binder wie z.B. einem Antikörper umgesetzt: BHC 15 1 040-A - 135 -
Figure imgf000136_0001
wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt,, und L4 die gleiche Bedeutung wie LI hat, und LI die gleiche Bedeutung hat wie oben beschrieben,
Für ein an einen Cysteinrest ankoppelndes Intermediat können die Reaktionen wie folgt veranschaulicht werden: BHC 15 1 040-A - 136 -
Figure imgf000137_0001
Die anderen Intermediate und andere Antikörper können entsprechend umgesetzt werden.
Für ein an einen Lysinrest ankoppelndes Intermediat kann die Reaktion wie folgt veranschaulicht werden:
Figure imgf000137_0002
BHC 151040-A -137- Erfmdungsgemäß werden so die folgenden Konjugate erhalten:
Figure imgf000138_0001
BHC 15 1 040-A - 138 -
Figure imgf000139_0001
BHC 15 1 040-A 139
Figure imgf000140_0001
BHC 15 1 040-A - 140 -
Figure imgf000141_0001
BHC 15 1 040-A - 141 -
Figure imgf000142_0001
BHC 15 1 040-A - 142 -
Figure imgf000143_0001
Figure imgf000143_0002
BHC 15 1 040-A - 143 -
Diese Umsetzung (Ringöffhung) kann bei pH 7.5 bis 9, vorzugsweise bei pH 8, bei einer Temperatur von 25 ° C bis 37 °C erfolgen, z.B. durch Rühren. Die bevorzugte Rührzeit beträgt 8 bis 30 Stunden.
In den obigen Formeln stellen XI CH, X2 C, und X3 N dar,), SGI und LI die gleiche Bedeutung haben wie oben beschrieben, und L2, L3 und L4 die gleiche Bedeutung wie LI ; R und K die gleiche Bedeutung haben wie oben beschrieben. AKl ist ein über einen Cysteinrest gekoppelter anti-B7H3 -Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon, und AK2 ist ein über einen Lysinrest gekoppelter anti-B7H3 -Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. Besonders bevorzugt ist AKl und AK2 ein anti-B7H3 -Antikörper, der spezifisch die humane 41g- Isoform bindet, insbesondere einer der anti-B7H3 -Antikörper TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP-6502 und TPP-6515.. In einer weiteren bevorzugten Aus führungs form liegen die Antikörper oder Antigen-bindenden Fragmente aglycosyliert vor.
A n ti-B 7H3-A n tik rperkonjugate
Der anti-B7H3 -Antikörper ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. Besonders bevorzugt sind anti-B7H3 -Antikörper oder Antigen-bindende Fragmente, die spezifisch die humane Ig4- und/oder die humane und/oder murine Ig2 -Isoform von B7H3 binden, insbesondere die anti-B7H3- Antikörper TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegen die Antikörper oder Antigen-bindenden Fragmente aglycosyliert vor. Dabei weisen aglycosyl bzw. aglycosylierte Antikörper keine Glycane an der konservierten N- Bindungsstelle in der CH2-Domäne der Fc-Region auf.
Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Antikörper bekannt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation der Toxophore an den Antikörper über ein oder mehrere Schwefelatome von Cystein-Resten des Antikörpers und/oder über ein oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, das Toxophor an den Antikörper über freie Carboxylgruppen oder über Zuckerreste des Antikörpers zu binden.
Der Antikörper kann über eine Bindung mit dem Linker verknüpft werden. Die Verknüpfung des Antikörper kann mittels eines Heteroatoms des Binders erfolgen. Erfindungsgemäße Heteroatome des Antikörper, die zur Verknüpfung verwendet werden können, sind Schwefel (in einer BHC 15 1 040-A - 144 -
Ausführungsform via einer Sulfhydrylgruppe des Antikörper), Sauerstoff (erfindungsgemäß mittels einer Carboxyl oder Hydroxylgruppe des Antikörper) und Stickstoff (in einer Ausführungsform via einer primären oder sekundären Amingruppe oder Amidgruppe des Antikörper). Diese Heteroatome können im natürlichen Antikörper vorhanden sein oder durch chemische oder molekularbiologische Methoden eingeführt werden. Erfindungsgemäß hat die Verknüpfung des Antikörper mit dem Toxophor nur einen geringen Einfluß auf die Bindeaktivität des Antikörper zum Zielmolekül. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Verknüpfung keinen Einfluß auf die Bindeaktivität des Antikörper zum Zielmolekül.
Der Begriff "Antikörper" wird gemäß der vorliegenden Erfindung in seinem breitesten Sinne verstanden und umfasst Immunglobulinmoleküle, beispielsweise intakte oder modifizierte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper oder multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper). Ein Immunglobulinmolekül umfasst bevorzugt ein Molekül mit vier Polypeptidketten, zwei schwere Ketten (H Ketten) und zwei leichte Ketten (L Ketten), welche typischerweise durch Disulfidbrücken verknüpft sind. Jede schwere Kette umfasst eine variable Domäne der schweren Kette (abgekürzt VH) und konstante Domäne der schweren Kette. Die konstante Domäne der schweren Kette kann beispielsweise drei Domänen CHI, CH2 und CH3 umfassen. Jede leichte Kette umfasst eine variable Domäne (abgekürzt VL) und eine konstante Domäne. Die konstante Domäne der leichten Kette umfasst eine Domäne (abgekürzt CL). Die VH und VL Domänen können weiter unterteilt werden in Regionen mit Hypervariabilität, auch Komplementaritäts-bestimmende Regionen genannt („complementarity determining region", abgekürzt CDR) und Regionen mit geringerer Sequenzvariabilität („framework region", abgekürzt FR). Jede VH und VL Region setzt sich typischerweise aus drei CDRs und bis zu vier FRs zusammen. Beispielsweise vom Aminoterminus zum Carboxyterminus in der folgenden Reihenfolge FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Ein Antikörper kann aus jeder dafür geeeigneten Spezies erhalten werden z.B. Kaninchen, Lama, Kamel, Maus, oder Ratte. In einer Ausführungsform ist der Antikörper humanen oder murinen Ursprungs. Ein Antikörper kann z.B. human, humanisiert oder chimär sein.
Der Begriff „monoklonaler" Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einer Population substantiell homogener Antikörper erhalten wurde, d.h. individuelle Antikörper der Population sind bis auf natürlich auftretende Mutationen, welche in geringfügiger Anzahl auftreten können, identisch. Monoklonale Antikörper erkennen mit hoher Spezifität eine einzige antigene Bindestelle. Der Begriff monoklonaler Antikörper bezieht sich nicht auf ein bestimmtes Herstellungsverfahren.
Der Begriff„intakter" Antikörper bezieht sich auf Antikörper, die sowohl eine Antigen-bindende Domäne als auch die konstante Domäne der leichten und schweren Kette umfassen. Die konstante BHC 15 1 040-A - 145 -
Domäne kann eine natürlich vorkommende Domäne sein, oder eine Variante davon, bei der mehrere Aminosäurepositionen verändert wurden.
Der Begriff „modifizierter intakter" Antikörper bezieht sich auf intakte Antikörper, die mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoterminus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüpfung) fusioniert wurden. Des Weiteren können Antikörper dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug;26(8):925-32).
Der Begriff „humaner" Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einem Menschen erhalten werden können oder synthetische humane Antikörper sind. Ein „synthetischer" humaner Antikörper ist ein Antikörper, der in Teilen oder schweren als ganzes von synthetischen Sequenzen in silico erhältlich ist, die auf der Analyse humaner Antikörpersequenzen basieren. Ein humaner Antikörper kann z.B. durch eine Nukleinsäure kodiert sein, die aus einer Bibliothek von Antikörpersequenzen, die humanen Ursprungs sind, isoliert wurde. Ein Beispiel solcher Antikörper ist in Söderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856 zu finden.
Der Begriff „humanisierter" oder„chimärer" Antikörper beschreibt Antikörper, die aus einem nicht-humanen und einem humanen Sequenzanteil bestehen. Bei diesen Antikörpern wird ein Teil der Sequenzen des humanen Immunoglobulins (Rezipient) durch Sequenzanteile eines nichthumanen Immunoglobulins (Donor) ersetzt. Der Donor ist in vielen Fällen ein murines Immunoglobulin. Bei humanisierten Antikörpern werden Aminosäuren der CDR des Rezipienten durch Aminosäuren des Donors ersetzt. Manchmal werden auch noch Aminosäuren des Frameworks durch korrespondierende Aminosäuren des Donors ersetzt. In machen Fällen enthält der humanisierte Antikörper Aminosäuren, die weder im Rezipient noch im Donor enthalten waren und die während der Optimierung des Antikörpers eingefügt wurden. Bei chimären Antikörpern werden die variablen Domänen des Donor-Immunoglobulins mit den konstanten Regionen eines humanen Antikörpers fusioniert.
Der Begriff Komplementaritäts-bestimmende Region (CDR) wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf diejenigen Aminosäuren einer variablen Antikörperdomäne, die für die Bindung an das Antigen notwendig sind. Jede variable Region hat typischerweise drei CDR Regionen, welche als CDR1, CDR2 und CDR3 bezeichnet werden. Jede CDR Region kann Aminosäuren nach der Definition von Kabat und/oder Aminosäuren eines Hypervariablen Loops definiert nach Chotia umfassen. Die Definition nach Kabat umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 24 - 34 (CDR1), 50 - 56 (CDR2) und 89 - 97 (CDR3) der variablen leichten Kette und 31 - 35 (CDR1), 50 - 65 (CDR2) und 95 - 102 (CDR3) der variablen schweren Kette BHC 15 1 040-A - 146 -
(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Die Definition nach Chotia umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 26 - 32 (CDR1), 50 - 52 (CDR2) und 91 - 96 (CDR3) der variablen leichetn Kette und 26 - 32 (CDR1), 53 - 55 (CDR2) und 96 - 101 (CDR3) der variablen schweren Kette Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)). In manchen Fällen kann eine CDR Aminosäuren aus einer CDR Region definiert nach Kabat und Chotia umfassen.
Abhängig von der Aminosäure-Sequenz der konstanten Domäne der schweren Kette können Antikörper in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Es gibt fünf Hauptklassen von intakten Antikörpern: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, wobei mehrere davon in weitere Unterklassen aufgegliedert werden können. (Isotypen), z.B. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl und IgA2. Die konstante Domäne der schweren Kette, die zu den unterschiedlichen Klassen korrespondieren, werden als [alpha/a], [delta/δ], [epsilon/ε], [gamma/γ] und [my/μ] bezeichnet. Sowohl die dreidimensionale Struktur als auch die Untereinheitenstruktur von Antikörpern sind bekannt.
Der Begriff „funktionales Fragment" oder „antigen-bindendes Antikörperfragment" eines
Figure imgf000147_0001
ist definiert als ein Fragment eines
(z.B. die variable Domänen eines IgG), welches die Antigen-Bindedomänen des
Figure imgf000147_0002
noch umfasst. Die „Antigen-Bindedomäne" eines ΑηΐίΜφβΓβ umfasst typischerweise eine oder mehrere Hypervariable Regionen eines ΑηΐίΚφβΓβ, z.B. die CDR, CDR2 und/oder CDR3 Region. Allerdings kann auch die„Framework" oder die„Gerüst" Region eines ΑηΐίΚφβΓβ zur Bindung des ΑηΐίΚφβΓβ an das Antigen eine Rolle spielen. Die Framework Region bildet das Gerüst für die CDRs. Vorzugsweise umfasst die Antigen- Bindedomäne mindestens die Aminosäuren 4 bis 103 der variablen leichten Kette und Aminosäure 5 bis 109 der variablen schweren Kette, bevorzugter die Aminosäure 3 bis 107 der variablen leichten Kette und 4 bis 1 11 der variablen schweren Kette, besonders bevorzugt sind die kompletten variablen leichten und schweren Ketten , also Aminosäure 1 - 109 der VL und 1 bis 1 13 der VH (Nummerierung nach WO97/08320).
„Funktionale Fragmente" oder„antigen-bindende
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der Erfindung umfassen nicht abschliessend Fab, Fab', F(ab')2 und Fv Fragmente, Diabodies, Single Domain Antibodies (DAbs), linerae ΑηΐίΚφβΓ, Einzelketten ΑηΐίΜφβΓ (single-chain Fv, abgekürzt scFv); und multispezifische, wie z.B. bi- und tri-spezifische, ΑηΐίΜφβΓ, gebildet aus
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C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Andere ΑηΐίΜφβΓ als„multi-spezifische" oder „multi-funktionale" sind solche mit identischen Bindestellen. Multispezifische ΑηηΜφεΓ können BHC 15 1 040-A - 147 - spezifisch für unterschiedliche Epitope eines Antigens sein oder spezifisch für Epitope von mehr als einem Antigen sein (siehe z.B. WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147:60 69; U. S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,7 14,68 1 ; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,8 19; oder Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553). Ein F(ab' oder Fab Molekül kann so konstruiert werden, dass die Zahl der intermolekularen Disulfidinteraktionen, die zwischen den Chi und den CL Domänen stattfindet, reduziert oder oder komplett verhindert werden kann.
„Epitope" bezeichnen Proteindeterminanten, die eine spezifische Bindung mit einem Immunglobulin oder T-Zell-Rezeptoren eingehen können. Epitopische Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, oder Kombinationen hiervon, und weisen normalerweise spezifische 3- dimensionale Struktureigenschaften wie auch spezifische Ladungseigenschaften auf.
„Funktionale Fragmente" oder „antigen-bindende Antikörperfragmente" können mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoterminus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüpfung) fusioniert werden. Des Weiteren können Antikörper und antigen-bindende Fragmente dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32).
Polyklonale Antikörper können durch für den Durchs chnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden. Monoklonale Antiköper können durch für den Durchs chnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Humane bzw. humanisierte monoklonale Antiköper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Olsson et al., Meth Enzymol. 92, 3-16 bzw. Cabilly et al US 4,816,567 oder Boss et al US 4,816,397).
Der Durchs chnittsfachmann kennt vielfältige Methoden, um humane Antikörper und deren Fragmente herzustellen, wie beispielsweise mittels transgener Mäuse (N Lonberg und D Huszar, Int Rev Immunol. 1995; 13(l):65-93) oder Phage Display Technologien (Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8). Antikörper der Erfindung können aus rekombinanten Antikörperbibliotheken erhalten werden, die z.B. auf den Aminosäuresequenzen einer Vielzahl von Antikörpern besteht, die aus einer großen Anzahl gesunder Freiwilliger erstellt wurden. Antikörper können auch mittels bekannter rekombinanter DNS-Technologien hergestellt werden. Die Nukleinsäuresequenz eines Antikörpers kann durch Routinesequenzierung erhalten werden, oder ist aus öffentlich zugänglichen Datenbanken erhältlich. BHC 15 1 040-A - 148 -
Ein„isolierter" Antikörper oder Binder wurde von anderen Bestandteilen der Zelle gereinigt. Kontaminierende Bestandteile einer Zelle, welche mit einer diagnostischen oder therapeutischen Verwendung interferieren können, sind z.B. Enzyme, Hormone, oder andere peptidische- oder nicht-peptidische Bestandteile einer Zelle. Bevorzugt ist ein Antikörper oder Binder, der zu mehr als 95 Gew-% bezogen auf den Antikörper bzw. Binder aufgereinigt wurde (bestimmt durch z.B. Lowry Verfahren, UV- Vis Spektroskopie oder durch SDS-Kapillargelelektrophorese). Ausserdem ein Antikörper, der soweit aufgereinigt wurde, dass mindestens 15 Aminosäuren des Aminoterminus oder einer internen Aminosäuresequenz bestimmt werden können, oder zur Homogenität aufgereinigt wurde, wobei die Homogenität bestimmt wird durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen (die Detektion kann mittels Coomassie Blau Anfärbung oder bevorzugt durch Silberfärbung bestimmt werden). Jedoch wird ein Antikörper normalerweise durch einen oder mehrere Reinigungsschritte hergestellt.
Der Begriff„spezifische Bindung" oder„bindet spezifisch" bezieht sich auf einen Antikörper oder Binder, der an ein vorbestimmtes Antigen/Zielmolekül bindet. Spezifische Bindung eines Antikörpers oder Binders beschreibt typischerweise einen Antikörper bzw. Binder mit einer Affinität von mindestens 10"7 M (als Kd-Wert also vorzugsweise solche mit kleineren Kd- Werten als IQ"'7 M). wobei der Antikörper bzw. Binder eine mindestens zweifach höhere Affinität zum vorbestimmten Antigen/Zielmolekül als zu einem nicht-spezifischen Antigen/Zielmolekül hat (z.B. Rinder Serumalbumin, oder Casein), welches nicht das vorbestimmte Antigen/Zielmolekül oder ein eng verwandtes Antigen/Zielmolekül ist. Die Antikörper weisen vorzugsweise eine Affinität von mindestens 10"'7 M (als Kd-Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd- Werten als 10"'7 M), vorzugsweise von mindestens 10~8 M, besonders bevorzugt in dem Bereich von 10"^ M bis 10"^ M auf. Die Kd-Werte können durch z.B. Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper- Wirkstoff-Konjugate weisen ebenfalls Affinitäten in diesen Bereichen auf. Durch die Konjugation der Wirkstoffe wird die Affinität vorzugsweise nicht wesentlich beeinflusst (in der Regel wird die Affinität weniger als eine Größenordnung verringert, also z.B. maximal von 10"8 M auf 10-7 M).
Die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper zeichnen sich weiterhin vorzugsweise durch eine hohe Selektivität aus. Eine hohe Selektivität liegt vor, wenn der erfindungsgemäße Antikörper eine mindestens um den Faktor 2, bevorzugt Faktor 5 oder insbesondere bevorzugt Faktor 10 bessere Affinität am Zielprotein aufweiset als an einem unabhängigen anderen Antigen, z.B. humanem Serumalbumin (die Affinität kann z.B. durch Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestimmt werden). BHC 15 1 040-A - 149 -
Zudem sind die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper vorzugsweise kreuzreaktiv. Um präklinische Studien, z.B. toxikologische oder Wirksamkeitsstudien (z.B. in Xenograft-Mäusen), zu erleichtern und besser interpretieren zu können, ist es von Vorteil, wenn der erfindungsgemäß verwendete Antikörper nicht nur das humane Zielprotein bindet, sondern auch in der für die Studien verwendeten Spezies das Spezies -Zielprotein bindet. In einer Aus führungs form ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies. Für toxikologische und Wirksamkeitsstudien werden bevorzugt Spezien der Familien Nager, Hunde und nicht-humane Primaten, verwendet. Bevorzugte Nager Spezien sind Maus und Ratte. Bevorzugte nicht-humane Primaten sind Rhesusaffen, Schimpansen und Längs chwanzmakaken.
In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies ausgewählt aus der Gruppe von Spezien bestehend aus Maus, Ratte und Langschwanzmakak (Macaca fascicularis). Insbesondere bevorzugt sind erfindungsgemäß verwendete Antikörper, die zusätzlich zum humanen Zielprotein mindestens kreuzreaktiv zum Maus-Zielprotein sind. Bevorzugt sind kreuzreaktive Antikörper, deren Affinität zum Zielprotein der weiteren nicht-humanen Spezies sich nicht um mehr als den Faktor 50, insbesondere nicht mehr als den Faktor zehn von der Affinität zum humanen Zielprotein unterscheidet.
Gegen ein Krebs-Zielmolekül gerichtete Antikörper
Bevorzugt ist das Zielmolekül, gegen das der Binder, z.B. ein Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon, gerichtet ist, ein Krebs-Zielmolekül. Der Begriff„Krebs-Zielmolekül" beschreibt ein Zielmolekül, welches auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nichtKrebszellen des gleichen Gewebetypus vermehrt vorhanden ist. Bevorzugt ist das Krebs- Zielmolekül auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus selektiv vorhanden, wobei selektiv eine mindestens zweifache Anreicherung auf Krebszellen im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus beschreibt (ein „selektives Krebs-Zielmolekül"). Die Verwendung von Krebs-Zielmolekülen erlaubt die selektive Therapie von Krebszellen mit den erfindungsgemäßen Konjugaten.
Besonders bevorzugt ist hierbei das extrazelluläre Krebs-Zielmolekül B7H3 (SEQ ID NO: 52).
Antikörper, die Krebs-Zielmoleküle binden, können vom Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder rekombinante Expression. Binder für Krebs-Zielmoleküle können kommerziell erworben werden oder können durch den Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder rekombinante Expression. Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder antigen- BHC 15 1 040-A - 150 - bindenden Antikörperfragmenten sind in WO 2007/070538 beschrieben (siehe Seite 22 „Antibodies"). Der Fachmann kennt Verfahren wie sogenannte Phage-Display Bibliotheken (z.B. Morphosys HuCAL Gold) erstellt und zur Auffindung von Antikörpern oder antigen-bindenden Antikörperfragmenten verwendet werden können (siehe WO 2007/070538, Seite 24 ff und AK- Beispiel 1 auf Seite 70, AK-Beispiel 2 auf Seite 72). Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörper, die DNA Bibliotheken aus B-Zellen verwenden, sind zum Beispiel auf Seite 26 (WO 2007/070538) beschrieben. Verfahren zur Humanisierung von Antikörpern sind auf Seite 30-32 von WO2007070538 und im Detail in Queen, et al.,.Pros. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029- 10033,1989 oder in WO 90/0786 beschrieben. Des Weiteren sind dem Fachmann Verfahren zur rekombinanten Expression von Proteinen im allgemeinen und im speziellen von Antikörpern bekannt (siehe z.B. in Berger and Kimrnel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Molecular Biolony, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Harlow et al., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (19881, Paul [Ed.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); and Harlow, et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Der Fachmann kennt die entsprechenden Vektoren, Promotoren und Signalpeptide die zur Expression eines Proteins/Antikörpers notwendig sind. Gebräuchliche Verfahren sind auch in WO 2007/070538 auf den Seiten 41 - 45 beschrieben. Verfahren zur Herstellung eines IgGl- Antikörpers sind z.B. in WO 2007/070538 in Beispiel 6 auf Seite 74 ff beschrieben. Verfahren, mit denen die Internalisierung eines Antikörpers nach Bindung an sein Antigen bestimmt werden kann, sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. in WO 2007/070538 auf Seite 80 beschrieben. Der Fachmann kann die in WO 2007/070538 beschriebenen Verfahren, die zur Herstellung von Carboanhydrase IX (Mn)-Antikörpern verwendet wurden, anlog zur Herstellung für Antikörper mit anderer Zielmolekülspezifität verwenden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind glycosyliert oder aglycosyliert, d.h. sie weisen in letzterem Fall keine Glycane an der konservierten N-Bindungsstelle in der CH2 -Domäne der Fc-Region auf.
Anti-B7H3-Antikörper
Erfindungsgemäß wird ein anti-B7H3-Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon verwendet, vorzugsweise TPP6497, 6499, 6501, 6502, 6515 oder von diesen abgeleitete BHC 15 1 040-A - 151 -
Antikörper. Darüber hinaus sind dem Fachmann Antikörper, die an B7H3 binden bekannt, siehe z.B. US6965018 oder EP2121008 . Die Erfindung betrifft insbesondere Konjugate mit Antikörpern, antigenbindende Antikörperfragmente davon oder Varianten davon, die folgende Eigenschaften aufweisen: Bindung an humanes B7H3, d.h. keine Bindung an humanes B7H2 oder humanes B7H4; effektives und spezifische Abtöten von B7H3 exprimierenden Tumorzellen in vitro und in vivo. Die erfindungsgemäßen Antikörper binden an Epitope, welche besonders für die Internalisierung nach erfolgter Bindung geeignet sind. Gleichzeitig zeichnen sich die erfindungsgemäßen Antikörper durch eine niedrige Immunogenität bei der Anwendung im Menschen aus, durch eine möglichst weite Annäherung der Aminosäuresequenz der Antikörper an menschliche Keimbahnsequenzen.
Erzeugung von anti-B7H3 Antikörpern
Eine voll humane Antikörper Phagen Bank (Biolnvent n-CoDeR Fab lambda library) wurde benutzt um B7H3 -spezifische humane monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung durch Protein panning (Hoogenboom H.R., Nat Biotechnol 2005;23(3): 1105-16) mit murinem B7H3 als immobilisiertem Zielprotein zu isolieren.
Table 1 : Liste der eingesetzten Antigene
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Die Antigene wurden de Anleitung des Anbieters folgend mit einem ungefähr zweifachen molaren Überschuss an biotin-LC-NHS (Pierce; Cat. No. 21347) und mit Zeba Entsalzungssäulen (Pierce; Cat. No. 89889) entsalzt. Gewaschene magnetische beads (Dynabeads) über Nacht mit 800nM biotinyliertem Protein bei 4 Grad Celsius inkubiert und anschliessend für eine Stunde bei 4 Grad Celsius mit blocking buffer (PBS mit 3% Michpulver, 0.05% Tween-20) geblockt. Zur Depletion unspezifischer Binder wurde die geblockte Fab-Phagen Bank zu geblockten mit TPP2202 beladenen beads (Dynabeads streptavidin M280 - Invitrogen 112-06D) gegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dieser Depletierungsschritt wurde vier Mal wiederholt. Die depletierte Fab-Phagen Bank wurde zu geblocktten, mit TPP3762 beladenen beads gegeben und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach stringentem Waschen (3 x in blocking buffer und 9 x in PBS (150 mM NaCl; 8 mM Na2HP04; 1.5 mM KH2P04; pH = 7.4-7.6) mit 0.05% Tween-20) wurden TPP-3762-spezifische Binder in PBS resuspendiert und zur Amplifikation direkt mit zur Infektion des Escherichia coli Stammes TG1 verwendet. In der zweiten Selektionsrunde wurde sie BHC 15 1 040-A - 152 -
Konzentration von TPP-3762 auf 400nM gesenkt um den Selektionsdruck für hochaffme Binder zu erhöhen. Alternativ wurden eine zweite und dritte Selektionsrunde auf humanen B7H3- exprimierenden Zellinien durchgeführt. Die humane Nierenkarzinom Zelllinie A498 (ATCC, HTB- 44) und die humane Adenokarzinom Zelllinie MCF-7 (ATCC, HTB-22) wurde mit lxlO7 Zellen in der zweiten und dritten Runde als Selektionsantigen eingesetzt. Die Zellen wurden in 80% (v/v) RPMI 1640 GlutaMAX-I medium (Life Technologies, Cat. No.61870-010) supplementiert mit 20% (v/v) fötalem Rinderserum (FBS, Life Technologies, Cat. No. 10091-148) bei 37 Grad Celsius, 5%> CO2 kultiviert und alle 3-4 Tage mit einem Verhältnis von 1 :5 passagiert. Die Zellen wurde drei Mal mit 10ml eiskaltem PBS gewaschen und für zwei Stunden mit PBS, 2%> Milchpulver geblockt. Die Fab Phagen Partikel aus der ersten Selektionsrunde wurden zu den geblockten Zellen gegeben und für eine Stunde bei 4 Grad Celsius auf einer rotierenden Plattform inkubiert. Zellen und gebundene Phagen wurden für 2 Minuten bei lOOOx g zentrifugiert. NichtBinder und unspezifische Binder wurden mit je fünf alternierenden kurzen und langen (5 Minuten) Waschschritten mit vorgekühltem PBS abgewaschen. Danach wurden die Zellen in 15ml vorgewärmtem PBS resuspendiert und für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert um Internalisierung zu erlauben. Die Zellmembran-gebundenen Fab-Phagen wurde durch Inkubation mit 1ml 76mM Zitronensäure entfernt.Die Zellen wurden erneut gewaschen und wie oben zentrifugiert. Die internalisierten Fab Phagen wurden durch Inkubation des Zellpellets mit 1ml Lysepuffer (lOOmM Triethylamin) für 10 Minuten und Neutralisierung in 0.5ml IM Tris-HCl, pH 7,5 gewonnen. Die Lysatfraktionen wurden durch Infektion von TG1 Zellen amplifiziert. Die so erhaltenen Phagen wurden sequenziert und entsprechende DNA Sequenzen wurden in einen Säuger-IgG-Expressionsvektor kloniert und als Volllängen-IgGs exprimiert. Diese Konstrukte wurden zum Beispiel transient in Säugerzellen exprimiert, wie von Tom et al., Kapitel 12 in Methods Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 beschrieben. Die Antikörper wurden durch Protein-A-Chomatographie gereinigt und seine Bindung an humanes B7H3 sowie humanes B7H2 und B7H4 mittels Elisa charakterisiert, wie in AK-Beispiel 1 beschrieben. Insbesondere TPP 6497, TPP6499, TPP6501, TPP6502 und TPP6515 zeigten attraktive Bindungseigenschaften. Weiterhin wurde die Wirksamkeit von Wirkstoffkonjugaten mit diesen Antikörpern in vitro und in vivo getestet wie in AK-Beispiel C-1 und C-2 beschrieben. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen dieser Antikörper mit häufig auftretenden menschlichen Keimbahnsequenzen identifizierte weiterhin eine Reihe von Aminosäuresubstitutionen, die die Antikörpersequenzen noch weiter an menschliche Keimbahnsequenzen annähern würden. BHC 15 1 040-A 153
Besondere Ausführungsformen von anti-B7H3-Antik rpern
In dieser Anmeldung wird auf die folgenden bevorzugten Antikörper Bezug genommen, wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt: TPP-6497, TPP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515, TPP-7611, TPP-8382, TPP-8564, TPP-8567, TPP-8322, TPP-8565, TPP-8568, TPP-8748 und TPP-8750.
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TPP-6497 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 9 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 10.
TPP-6499 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 19 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 20.
TPP-6501 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 29 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 30.
TPP-6502 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 39 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 40.
TPP-6515 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 49 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 50. BHC 15 1 040-A - 154 -
TPP-6497 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 1 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 5.
TPP-6499 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 11 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 15.
TPP-6501 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 21 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 25.
TPP-6502 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 31 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 35.
TPP-6515 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 41 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 45.
TPP-7611 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 1 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 5.
TPP-8382 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 55 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 57.
TPP-8564 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 55 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 57.
TPP-8567 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 55 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 57.
TPP-8322 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 63 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 35.
TPP-8565 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 63 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 35.
TPP-8568 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 63 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 35.
TPP-8748 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 63 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 68.
TPP-8750 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 63 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 68. BHC 15 1 040-A - 155 -
Bevorzugte Ausführungsformen des anti-B7H3 -Antikörpers zur Kopplung mit erfindungsgemäßen Linkern und / oder Toxophoren sind die folgenden Antikörper:
1. Ein anti-B7H3 -Antikörper oder antigenbindendes Fragment hiervon, welcher an ein Polypeptid wie dargestellt durch SEQ ID NO: 52 bindet, wobei der Antikörper bevorzugt aglycosyliert ist. SEQ ID NO:52 repräsentiert die Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne des humanen B7H3 Polypeptids.
2. Ein Antikörper, welcher an B7H3 bindet oder ein antigenbindendes Fragment hiervon, umfassend: eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 3 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 7 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 8, oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 13 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 18, oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 28, oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 34 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 37 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 38, oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 42, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 43 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 44 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 46, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 47 und die variable CDR3 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 48, oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 56 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 58 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 8.
Der Antikörper gemäß Ausführungsform 4 oder ein antigenbindendes Fragment davon, umfassend: eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:l , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:5 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 11 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 15 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:21 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:25 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:31 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:35, oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:41 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:45, oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:55 sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:57.
Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen oder ein antigenbindendes Fragment davon, umfassend: eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:9 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:20 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:29 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:30 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:39 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:40, oder BHC 15 1 040-A - 158 - eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:49 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:50, oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:59 sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:60, oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:61 sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:60, oder. eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:62 sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:60.
5. Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, oder ein antigenbindendes Fragment davon, wobei der anti-B7H3 -Antikörper eine humanisierte Variante eines der Antikörper TPP-6497, TPP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515, TPP- 7611, TPP-8382, TPP-8564, TPP-8567, TPP-8322, TPP-8565, TPP-8568, TPP-8748 und TPP- 8750 ist.
6. Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, oder ein antigenbindendes Fragment davon, wobei der anti- B7H3 -Antikörper einer der Antikörper TPP-8382, TPP-8564 und TPP-8567 ist.
7. Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen oder ein antigenbindendes Fragment davon, umfassend: eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:9, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen R30S, S50A, V51I, A58T, L59Y, T97A, R98K sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen P33T, G51 S, S53N, N54Q, S77T, BHC 15 1 040-A - 159 -
R80Q, S81A, Q90A, S91A, F92W, F92Y, S94D, K97N, K97S, K98G, K105Q, oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen R30S, D31 S, F32Y, Y33A, N35S, I37V, S50A, S50Y, A53G, A53S, K56G, K56S, Y57S, Y57T, P114S, P114Y sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 20, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen G25S, Y26S, V29I, G31S, N33Y, N33T, N35Y, G51R, S53N, N54Q, S77T, R80Q, S81A, Q90A, S91A, Y92W, S94D, K106Q, oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:29, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen G33A, H35S, N101Y, L103Y, L103N, L113T sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:30, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen R31S, I33Y, I33T, N35Y, S52N, Q90A, T91A, G93D, T94D, G95S, W96L, V97S, F98G, K103Q. eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:39, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen T31 S, G33A, H35S, T97A, R98K, L113T sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:40, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen G25S, P33Y, P33T, N35Y, G51R, S53N, K54Q, Q90A, S91A, Y92W, S94D, W99V, G103E, K106E, oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:49, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen G33A, H35S, V40A, T57S, L104Y, L104W, Y107S sowie BHC 15 1 040-A - 160 - eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:50, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen T33Y, N35Y, D53N, L56P, L57S, Q90A, S91A, Y92W, S94D, W99V, G103E, K106E.
8. Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, der ein IgG Antikörper ist.
9. Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, umfassend: Das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen oder ein antigenbindendes Fragment eines Antikörpers gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, das ein scFv-, Fab-, Fab ' -Fragment oder ein F(ab )2-Fragment ist.
10. Der Antikörper oder das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, der ein monoklonaler Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon ist.
11. Der Antikörper oder das antigenbindende Fragment gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, der ein humaner, humanisierter oder chimärer Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment ist.
Besonders bevorzugt sind die anti-B7H3 -Antikörper TPP-6497, TPP-6499, TPP-6501, TPP-6502 und TPP-6515. Der Gegenstand der vorliegeneden Erfindung umfasst demnach ebenfalls humanisierte Varianten der erfindungsgemäßen anti-B7H3 -Antikörper, mit den im Folgenden aufgelisteten Aminosäuresubstitutionen, wobei P33T eine Substitution von P durch T an Aminosäure-Position 33 der jeweiligen Kette des Antikörpers bedeutet, G51S eine Substitution von G durch S an Position 51 der jeweiligen Kette des jeweiligen Antikörpers, etc.
Anti-B7H3- Lokalisierung der Aminosäuresubstitutionen
Antikörper Substitution
TPP-6497 leichte Kette P33T, G51S, S53N, N54Q, S77T, 80Q, S81A, Q90A,
S91A, F92W, F92Y, S94D, K97N, K97S, K98G, K105Q schwere Kette R30S, S50A, V51I, A58T, L59Y, T97A, R98K
TPP-6499 leichte Kette G25S, Y26S, V29I, G31S, N33Y, N33T, N35Y, G51R,
S53N, N54Q, S77T, R80Q, S81A, Q90A, S91A, Y92W, S94D, K106Q
schwere Kette R30S, D31S, F32Y, Y33A, N35S, 137V, S50A, S50Y, BHC 15 1 040-A - 161 -
A53G, A53S, K56G, K56S, Y57S, Y57T, P114S, P114Y
TPP-6501 leichte Kette 31S, I33Y, I33T, N35Y, S52N, Q90A, T91A, G93D,
T94D, G95S, W96L, V97S, F98G, K103Q
schwere Kette G33A, H35S, N101Y, L103Y, L103N, L113T
TPP-6502 leichte Kette G25S, P33Y, P33T, N35Y, G51R, S53N, K54 Q90A,
S91A, Y92W, S94D, W99V, G103E, K106E
schwere Kette T31S, G33A, H35S, T97A, R98K, L113T
TPP-6515 leichte Kette T33Y, N35Y, D53N, L56P, L57S, Q90A, S91A, Y92W,
S94D, W99V, G103E, K106E
schwere Kette G33A, H35S, V40A, T57S, L104Y, L104W, Y107S
Isotope, Salze, Solvate, isotopische Varianten
Die vorliegende Erfindung umfasst auch alle geeigneten isotopischen Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen. Unter einer isotopischen Variante einer erfindungsgemäßen Verbindung wird hierbei eine Verbindung verstanden, in welcher mindestens ein Atom innerhalb der erfindungsgemäßen Verbindung gegen ein anderes Atom der gleichen Ordnungszahl, jedoch mit einer anderen Atommasse als der gewöhnlich oder überwiegend in der Natur vorkommenden Atommasse ausgetauscht ist. Beispiele für Isotope, die in eine erfindungsgemäße Verbindung inkorporiert werden können, sind solche von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor, Chlor, Brom und Iod, wie 2H (Deuterium), 3H (Tritium), 13C, 14C, 15N, O, 180, 32P, 33P, 33S, 34S, 35S, 36S, 18F, 36C1, 82Br, 123I, 124I, 129I und 131I. Bestimmte isotopische Varianten einer erfindungsgemäßen Verbindung, wie insbesondere solche, bei denen ein oder mehrere radioaktive Isotope inkorporiert sind, können von Nutzen sein beispielsweise für die Untersuchung des Wirkmechanismus oder der Wirkstoff-Verteilung im Körper; aufgrund der vergleichsweise leichten Herstell- und Detektierbarkeit sind hierfür insbesondere mit 3H- oder 14C- Isotopen markierte Verbindungen geeignet. Darüber hinaus kann der Einbau von Isotopen, wie beispielsweise von Deuterium, zu bestimmten therapeutischen Vorteilen als Folge einer größeren metabolischen Stabilität der Verbindung führen, wie beispielsweise eine Verlängerung der Halbwertszeit im Körper oder eine Reduktion der erforderlichen Wirkdosis; solche Modifikationen der erfindungsgemäßen Verbindungen können daher gegebenenfalls auch eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellen. Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen können nach den dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, so beispielsweise nach den weiter unten beschriebenen Methoden und den bei den Ausführungs- BHC 15 1 040-A - 162 - beispielen wiedergegebenen Vorschriften, indem entsprechende isotopische Modifikationen der jeweiligen Reagenzien und/oder Ausgangsverbindungen eingesetzt werden.
Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfon- säure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressig- säure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methyl- piperidin, N-Methylmorpholin, Arginin, Lysin und 1 ,2-Ethylendiamin.
Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen. Der Begriff "Prodrugs" bezeichnet hierbei Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper zu erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden (beispielsweise metabolisch oder hydrolytisch).
Besondere Ausführungsformen
Die folgenden Ausführungsformen sind besonders bevorzugt: BHC 15 1 040-A - 163 -
Ausführungsform A:
Ein ADC der Formel
BINDER-H.— KSP
n wobei KSP-L- eine Verbindung der folgenden Formel (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (Ild), (Ile) (Iii), (Ilj), (Ilk) oder der folgenden Formel (Iii) ist, der Binder ein anti-B7H3 -Antikörper ist, der aglycosyhert sein kann, oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon,. Besonders bevorzugt sind hierbei anti-B7H3 -Antikörper, die spezifisch die humane Ig4- und/oder die humane und/oder murine Ig2 -Isoform von B7H3 binden, insbesondere die anti-B7H3 -Antikörper TPP-6497, TTP- 6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515..,wobei n eine Zahl von 1 bis 10 ist:
Formel (Iii):
Figure imgf000164_0001
(Ilf) wobei
A CO (carbonyl) ist;
R1 -L-#l, H, -COOH, -CONHNH2, -(CH2)i-3NH2, -CONZ"(CH2)i-3 NH2 und -CONZ"CH2COOH ist, wobei Z" H oder NH2;
R2 und R4 H ist, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CEh-CHR11- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H darstellt; BHC 15 1 040-A - 164 -
R3 -L-#l oder eine C 1-1 O-Alkyl-, die ggf. mit -OH, O-Alkyl, SH, S-Alkyl, O-CO-Alkyl, O-CO- NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH-Alkyl, S(0)n-Alkyl, S02-NH-Alkyl, NH-Alkyl, N(Alkyl)2, oder NH2 substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet) ist;
R5 H oder F ist;
R6 und R7 unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) G-3-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2_4-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;
R8 eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe ist; und
R9 H oder F ist, wobei einer der Substituenten R1 und R3-L-#l darstellt, und
-L-den Linker und #1 die Bindung zum Antikörper darstellt, sowie Salze, Solvate und Salze der Solvate des ADCs.
Der Linker ist vorzugsweise ein Linker
§-(CO)m-Ll-L2-§§
wobei
m 0 oder 1 ist;
§ die Bindung an KSP darstellt und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt, und
Figure imgf000165_0001
Figure imgf000165_0002
BHC 15 1 040-A - 165 - darstellt, wobei die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet,
#2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und LI durch die Formel
#1-(NR10)n-(Gl)o-G2-#2
dargestellt wird,
wobei
R10 H, NH2 oder Cl-C3-Alkyl darstellt; Gl -NHCO- oder
Figure imgf000166_0001
darstellt;
n 0 oder 1 ist;
0 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH- und einen 3 bis
1 Ogliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen
— N N-CO— ausgewählt aus N, O und S, oder -SO- unterbrochen sein kann (vorzugsweise \ / ), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Hierbei ist #1 die Bindung zum KSP-Inhibitor und ffi die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper (z.B. L2).
Ausführungsform B:
Ein ADC der Formel
BINDER-H.— KSP BHC 15 1 040-A - 166 - wobei KSP-L- eine Verbindung der folgenden Formel (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (Ild), (Ile), (Ilf), (Iii), (Ilj), (Ilk) oder der folgenden Formel (Il'g) oder der folgenden Formel (Ilg)ist, der Binder ein in einer bevorzugten Ausführungsform aglycosylierter anti-B7H3 -Antikörper ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist:
Formel (Hg):
Figure imgf000167_0001
(Hg) wobei
A -C(=0)- ist;
R1 -L-#l, H, -COOH, -CONHNH2, -(CH2)i-3NH2, -CONZ"(CH2)i-3 NH2 und -CONZ"CH2COOH ist, wobei Z" H oder NH2;
R2 und R4 H ist, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRn- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H darstellt;
R3 -L-#l oder eine Ci-10-Alkyl-, die ggf. mit -OH, O-Alkyl, SH, S-Alkyl, O-CO-Alkyl, O-CO- NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH-Alkyl, S(0)n-Alkyl, S02-NH-Alkyl, NH-Alkyl, N(Alkyl)2, oder NH2 substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet) ist;
R5 H oder F ist;
R6 und R7 unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) G-3-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2_4-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;
R8 eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe ist; und BHC 15 1 040-A - 167 -
R9 H oder F ist, wobei einer der Substituenten R1 und R3-L-#l darstellt, und
-L-den Linker und #1 die Bindung zum Antikörper darstellt,
wobei -L- dargestellt wird durch
§-(CO)m-Ll-L2- wobei
m 0 oder 1 ist;
§ die Bindung an KSP darstellt und
§ § die Bindung an den Antikörper darstellt, und
Figure imgf000168_0001
Figure imgf000168_0002
darstellt, wobei
#' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und LI durch die Formel
#1-(NR10)n-(Ol)o-O2-#2
dargestellt wird,
wobei
R10 H, NH2 oder Cl-C3-Alkyl darstellt;
— N N-CO—
Gl -NHCO- oder \ / darstellt; BHC 15 1 040-A - 168 - n 0 oder 1 ist;
0 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH- und einen 3 bis
1 Ogliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, oder -SO- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
Figure imgf000169_0001
), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNEh, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
#1 die Bindung zum KSP-Inhibitor und ffi die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper ist (z.B. L2),
sowie Salze, Solvate und Salze der Solvate des ADCs.
Ausführungsform C:
Ein ADC der Formel
BINDER-H.— KSP
wobei KSP-L- eine Verbindung der folgenden Formel (II), (IIa), (IIb), (IIc), (Ild), (Ile), (Ilf), (Ilg), (Iii), (Ilj), (Ilk) oder der folgenden Formel (Ilh)ist, der Binder ein in einer bevorzugten Ausführungsform aglycosylierter anti-B7H3 -Antikörper ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist:
Formel (Ilh):
Figure imgf000169_0002
BHC 15 1 040-A - 169 -
(Ilh) wobei
A CO (carbonyl) ist; R1 -L-#l ist,;
R2 und R4 H ist, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRn- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R11 H darstellt;
R3 eine Ci-io-Alkyl-, die ggf. mit -OH, O-Alkyl, SH, S-Alkyl, O-CO-Alkyl, O-CO-NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH-Alkyl, S(0)n-Alkyl, S02-NH-Alkyl, NH-Alkyl, N(Alkyl)2, oder NH2 substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1 Alkyl bedeutet), oder -MOD ist;
wobei -MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei
R10 H oder Ci-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R10 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, S02, -NRY-, -NRYCO-, CONRy-, -NRyNRy-, -S02NRyNRy-, -CONRyNRy-, (wobei Ry H, Phenyl, C -C g-Alkyl, C2-C1 g-Alkenyl, oder C2-C1 g-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, C1 -C3 -Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist;
R5 H oder F ist; BHC 15 1 040-A - 170 -
R6 und R7 unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) Ci-3-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;
R8 eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe ist; und R9 H oder F ist, wobei -L-den Linker und #1 die Bindung zum Antikörper darstellt,
wobei -L- dargestellt wird durch
§-(CO)m-Ll -L2-§§
wobei
m 0 oder 1 ist;
§ die Bindung an KSP darstellt und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt, und
Figure imgf000171_0001
Figure imgf000171_0002
darstellt, wobei
# die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet,
#2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und LI durch die Formel
# 1 -(NR 1 °)n-(G 1 )0 -G2-#2
dargestellt wird,
wobei BHC 15 1 040-A - 171 -
R10 H, NH2 oder Cl-C3-Alkyl darstellt;
— N N-CO—
Gl -NHCO- oder \ / darstellt;
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, Ci -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) und einen 3 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -
S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
Figure imgf000172_0001
), wobei Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-
CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
#1 die Bindung zum KSP-Inhibitor und ffi die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper ist
(z.B. L2),
sowie Salze, Solvate, Salze der Solvate sowie Epimere des ADCs.
Ausfuhrungsform D:
Die Erfindung stellt auch Binder- Wirkstoff-Konjugate der folgenden allgemeinen Formel bereit:
Figure imgf000172_0002
wobei BINDER für den bevorzugt(aglycosylierten) anti-B7H3-Antikörper , L für den Linker, WS für den Wirkstoff, vorzugsweise einen KSP-Inhibitor, wie z.B. ein erfindungsgemäßer KSP- Inhibitor einer der Formeln (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (Ild), (He), (Iii), (Hg), (Ilh) oder (Iii) ist, m für eine Zahl von 1 bis 2, vorzugsweise 1 , und n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1 ,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht, wobei L eine der folgenden Strukturen aufweist. Hierbei BHC 15 1 040-A - 172 - ist m die Zahl der Wirkstoffmoleküle pro Linker und n ein Mittelwert der Anzahl an Wirkstoff- Linker-Konjugaten pro BINDER. Die Summe aller WS, die in einem Konjugatmolekül vorliegen, ist also das Produkt von m und n.
WS ist ein Wirkstoff, der in Tieren, bevorzugt Menschen, eine lokale oder systemische Wirkung therapeutische Wirkung zeigt. Diese Wirkstoffe haben in der Regel ein Molekulargewicht von unter 5 kDa, bevorzugt unter 1.5 kDa. Bevorzugte Wirkstoffe sind Vinca-Alkaloide, Auristatine, Tubulysine, Duocarmycine, Kinase-Inhibitoren, MEK-Inhibitoren und KSP-Inhibitoren.
Hierbei steht L für eine der folgenden Formeln A3 oder A4
Figure imgf000173_0001
Formel A4 wobei #' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der dem Wirkstoff kennzeichnet, x 1 oder 2 darstellt, und R^2 COOH, COOR, COR (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CONH2, Br, vorzugsweise COOH darstellt,.
LI weist dieselbe Bedeutung wie oben auf. Vorzugsweise wird -Ll-#2 durch die folgende Formel dargestellt:
#3-(NR10)n-(Gl)o-G2-#2
dargestellt, wobei BHC 15 1 040-A - 173 -
#3 die Verknüpfungsstelle mit dem Stickstoffatom kennzeichnet
R10 H, NH2 oder Ci-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NHCO- -CONH- oder
Figure imgf000174_0001
darstellt; (wobei wenn Gl NHCO oder
\ / darstellt, Rl 0 nicht NH2 ist),
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO2, -NR -, -
NRYCO-, -C(NH)NRy-, -CONRY-, -NRYNRY-, -S02NRYNRy-, -CONRYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, C -C g-Alkyl, C2-C1 g-Alkenyl, oder C2-C1 g-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, Ci -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) und/oder einen 3 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
— N r N-CO—
), wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Weitere unterbrechende Gruppen in G2 sind vorzugsweise
BHC 15 1 040-A 174
Figure imgf000175_0001
wobei Rx H, Ci -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt.
In dem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers liegen vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 %, besonders bevorzugt (bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper) in einer der beiden Strukturen der Formel A3 oder A4 vor.
Die Konjugate mit den Linkern der Formel A3 bzw. A4 können durch Kupplung der Antikörper an die entsprechenden Bromderivate der folgenden Formeln A3' bzw. A4' erhalten werden:
Figure imgf000175_0002
Formel A3 '
Figure imgf000175_0003
Formel A4' BHC 15 1 040-A - 175 -
Diese Bromderivate der Formel A3' bzw. A4' können durch Reaktion von HOOCCH2CHBrCOOR22 bzw. HOOCCHBrCH2COOR22 mit einer Amingruppe des Binders erhalten werden, wie in den folgenden Schemata 30 bis 32 beispielhaft veranschaulicht.
Schema 30:
Figure imgf000176_0001
[a): 2-Brom-l-ethylpyridinium-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.]
BHC 15 1 040-A 176
Figure imgf000177_0001
[a): 2-Brom-l-ethylpyridinium-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.]
Ausführungsform E:
Die Erfindung stellt auch Binder- Wirkstoff der folgenden allgemeinen Formel bereit:
BINDER- WS
m
n wobei BINDER für den bevorzugt aglycosylierten anti-B7H3 -Antikörper , L für den Linker, WS für den Wirkstoff, vorzugsweise einen KSP-Inhibitor, wie z.B. ein erfindungsgemäßer KSP- Inhibitor einer der Formeln (I), (Ia), (II), oder (IIa), m für eine Zahl von 1 bis 2, vorzugsweise 1 , und n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht, wobei L eine der folgenden Strukturen aufweist. Hierbei ist m die Zahl der Wirkstoffmoleküle pro Linker und n ein Mittelwert der Anzahl an Wirkstoff-Linker-Konjugaten pro BINDER. Die Summe aller WS, die in einem Konjugatmolekül vorliegen, ist also das Produkt von m und n.
Hierbei steht L für: BHC 15 1 040-A 177
Figure imgf000178_0001
Formel A wobei #' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, #2 die
Verknüpfungsstelle mit der dem Wirkstoff kennzeichnet, und R22 COOH, COOR, COR (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CONH2, Br, vorzugsweise COOH darstellt, darstellt. Die Verknüpfung mit dem Schwefelatom des Binders kann somit eine der folgenden Strukturen aufweisen:
Figure imgf000178_0002
Formel AI
Figure imgf000178_0003
Formel A2
Bei Wirkstoff-Antikörper-Konjugaten, die mehr als ein Wirkstoffmolekül WS pro Wirkstoff- Antikörper -Konjugat enthalten, können beide Strukturen gemäß den Formeln AI und/oder A2 in einem Wirkstoff- Antikörper -Konjugat vorliegen. Da es sich bei den erfindungsgemäßen Wirkstoff- Antikörper -Konjugaten um eine Mischung unterschiedlicher Wirkstoff- Antikörper - BHC 15 1 040-A - 178 -
Konjugate handeln kann, ist es auch möglich, dass in dieser Mischung Wirkstoff- Antikörper - Konjugate sowohl mit der Formel AI oder Formel A2 als auch mit der Formel AI und A2 enthalten sind.
L5 ist eine Gruppe ausgewählt aus -(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)0-(X)p-(CH2)q-, wobei m, n, o, p und q unabhängig voneinander die folgenden Werte aufweisen: m=0-10; n=0 oder 1 ; o=0-10; p=0 oder 1 ; und q=0-10, wobei m+n+o=l-15, vorzugsweise 1-6 ist. X stellt einen 5- oder 6-gliedrigen, aromatischen oder nicht-aromatischen Hetero- oder Homocyclus dar, vorzugsweise -C R^- oder -
CgHi Q- . R stellt eine Säuregruppe, vorzugsweise -COOH oder SO3H dar. -CONH-, -OCONH-, -NHCO-, -NHCOO-:
Figure imgf000179_0001
L7 ist eine Einfachbindung oder eine Gruppe ausgewählt aus einer geradkettige oder verzweigten Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 (vorzugsweise 1 bis 10) Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO2, -NRY-, -
NRYCO-, -C(NH)NRy-, -CONRY-, -NRYNRY-, -SC^NRYNRY-, -CONRYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, C1 -C1 g-Alkyl, C2-C1 g-Alkenyl, oder C2-C1 g-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, Ci -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) und/oder einen 3 bis 10-gliedriger, vorzugsweise 5 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder - S02- unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon,
Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
L5 ist bevorzugt eine Gruppe -(CH2)m-(CHRs)n-(OCH2CH2)0-(X)p-(CH2)q-, wobei m=l -3, n=0, o=0-7, p=0, und q=0 oder 1 darstellt. Besonders bevorzugt ist eine Gruppe -(CH2)m-(CHRS)n- (OCH2CH2)0-(X)p-(CH2)q-, wobei m=l oder 2, n=0, o=0 oder 1 , p=0, und q=0 oder 1 darstellt.
L6 ist bevorzugt eine Gruppe ausgewählt aus -CONH- und -NHCO-, BHC 15 1 040-A - 179 -
L7 ist bevorzugt eine Einfachbindung oder -[(CH2)x-(X4)y]
wobei
w = 0 bis 20 ist;
x = 0 bis 5 ist;
y = 0 oder 1 ist;
z = 1 bis 5 ist; und
CONH—
-CONH-, -NHCO- oder darstellt.
Besonders bevorzugt ist L7 eine Einfachbindung oder eine Gruppe -[(CH2)x-NHCO-)], wobei x = 1 bis 5 ist.
Besonders bevorzugt stellt -L5-L6-L7- -(CH2)m-(CHRs)n-(OCH2CH2)0-(X)p-(CH2)q-NHCO-
[(CH2)x-NHCO-)] dar, wobei m=l oder 2, n=0, o=0 oder 1, p=0, und q=0 oder 1, und x=l-5 darstellt.
Es ist jedoch auch möglich, dass diese beiden Strukturen gemeinsam in dem erfindungsgemäßen Konjugat vorliegen.
Diese Antikörper -Wirkstoff-Konjugate können erfindungsgemäß aus den Verbindungen der Formel
BINDER- WS
Figure imgf000180_0001
wobei L die folgende Formel A' aufweist, hergestellt werden:
Figure imgf000180_0002
BHC 15 1 040-A 180
Formel A'
Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung von A' zu A durch Rühren in einem pH-Puffer mit einem pH- Wert von 7.5 bis 8.5, vorzugsweise 8, bei einer Temperatur unterhalb 37°C, vorzugsweise 10 bis 25 °C, über einen Zeitraum von bis zu 40 Stunden, vorzugsweise 1 bis 15 Stunden.
Ausführungsform I:
Ein Antikörper-Konjugat der Formel
Figure imgf000181_0001
wobei
R2, R4 und R5H darstellen;
R3 -CH20H darstellt;
Rl -LI -L2-BINDER darstellt, wobei
LI
Figure imgf000181_0002
darstellt, wobei #2 die Verknüfung mit der L2 darstellt, und #1 die Verknüfung mit die andere Verknüpfung darstellt; und L2 eine oder beide der folgenden Strukturen der Formeln A5 und A6 darstellt: BHC 15 1 040-A 181
Figure imgf000182_0001
Formel A5
Figure imgf000182_0002
Formel A6 wobei
#' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und
R22 COOH, COOR, COR, CONHR (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CONH2, vorzugsweise COOH darstellt.
In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der er findungs gemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A5 oder A6 vor:
Hierbei liegen die Strukturen der Formel A5 oder A6 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
Figure imgf000182_0003
BHC 15 1 040-A - 182 -
vor.
Der Antikörper ist vorzugsweise ein anti-B7H3 -Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon, der spezifisch die humane Ig4- und/oder die humane und/oder murine Ig2 -Isoform von B7H3 bindet, insbesondere die anti-B7H3-Antikörper TPP-6497, TTP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515. In einer bevorzugten Aus führungs form liegt der anti-B 7H3 -Antikörper aglycosyliert vor.
Spezielle Ausführungsformen
Es werden Antikörper-Konjugate gemäß einer der folgenden Formeln bereitgestellt, wobei n eine Zahl von 1 bis 20 ist und AK bzw. AK2 einen Antikörper darstellen. AK stellt einen über Cystein verknüpften Antikörper, AK2 einen über Lysin verknüpften Antikörper dar.
Der Antikörper (AK oder AK2) ist vorzugsweise ein anti-B7H3-Antikörper oder ein Antigen- bindendes Fragment hiervon, der spezifisch die humane Ig4- und/oder die humane und/oder murine Ig2-Isoform von B7H3 bindet, insbesondere die anti-B7H3 -Antikörper TPP-6497, TTP-6499, TPP- 6501, TPP-6502, TPP-6515, TPP-7611, TPP-8382, TPP-8564, TPP-8567, TPP-8322, TPP-8565, TPP-8568, TPP-8748 und TPP-8750. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt der anti-B7H3- Antikörper aglycosyliert vor.
Figure imgf000183_0001
BHC 15 1 040-A - 183 -
Figure imgf000184_0001
BHC 15 1 040-A - 184 -
Figure imgf000185_0001
BHC 15 1 040-A - 185 -
Figure imgf000186_0001
BHC 151040-A - 186-
Figure imgf000187_0001
BHC 151040-A - 187-
Figure imgf000188_0001
BHC 15 1 040-A - 188 -
Figure imgf000189_0001
BHC 151040-A - 189-
Figure imgf000190_0001
BHC 15 1 040-A - 190 -
Figure imgf000191_0001
BHC 15 1 040-A - 191 -
Figure imgf000192_0001
BHC 15 1 040-A - 192 -
Figure imgf000193_0001
BHC 15 1 040-A - 193 -
Figure imgf000194_0001
BHC 15 1 040-A - 194 -
Figure imgf000195_0001
Figure imgf000195_0002
BHC 15 1 040-A - 195 -
Figure imgf000196_0001
BHC 15 1 040-A - 196 - Weitere Koniusate
Weitere Konjugate können eine der folgenden Formeln aufweisen:
Figure imgf000197_0001
Figure imgf000198_0001
Figure imgf000199_0001
BHC 15 1 040-A - 199 -
Figure imgf000200_0001
BHC 15 1 040-A 200
Figure imgf000201_0001
wobei
A 1 einen über Cystein verknüpften und
AK2 einen über Lysin verknüpften Antikörper darstellt, welcher an B7H3 bindet und eine chimäre oder humanisierte Variante des Antikörpers TPP-6497 ist,
n eine Zahl von 1 bis 20 darstellt; und
Li eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 30
Kohlenstoffatomen, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -C(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, Cyclopentyl, Piperidinyl, Phenyl unterbrochen sein kann,
wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit -COOH, oder -NH2 substituiert sein kann,
sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Hierbei steht der Linker Li vorzugsweise für die Gruppe BHC 15 1 040-A - 201 -
§-NH-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)6-§§;
§-NH-(CH2)2-0-(CH2)2-§§;
§ -NH-CH(COOH)-(CH2)4-§ §
§-NH-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH-(CH2)2-C(=0)-0-(CH2)2-§§;
§ -NH-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-§ § ;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)3-NH-C(=0)-CH2-§§;
§ -NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-§ § ;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH(CH3)-§§;
§ -NH-(CH2)2-0-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§ -NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§ -NH-CH(COOH)-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§ -NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§ -NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-(CH2)2-§ § ;
§ -NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH(C2H4COOH)-§ § ;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-((CH2)2-0)3-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)2-S(=0)2-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)3-NH-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§ -NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH(CH2COOH)-§ § ;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH(C2H4COOH)-NH-C(=0)-CH2-§§;
§ -NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH2-§§;
§ -NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH(CH2OH)-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§-NH-CH[C(=0)-NH-(CH2)2-0)4-(CH2)2COOH]-CH2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§ -NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-§§;
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-
C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH -C(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH- C(=0)-(CH2)5-§§; BHC 15 1 040-A - 202 -
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)- CH[(CH2)3-NH-C(=0)-NH2]-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH- C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=0)- CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH- C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH-CH(CH3)-C(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)- CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)- NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH[(CH2)3-NH-C(=0)-NH2]-NH-C(=0)- CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
O
§-NH / \ C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH "O-- C(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH[(CH2)3-NH-C(=0)-NH2]-NH- C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-NH / oA C(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH[(CH2)3-NH-C(=0)-NH2]-NH-C(=0)- CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-NH / oC(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH- C(=0)-(CH2)5-§§;
§ -NH-(CH2) 2-C(=0)-NH-CH(isoC3H7)-C(=0)-NH-CH [(CH2)3-NH-C(=0)-NH2] -C(=0)-0
C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)2-C(=0)-NH- C3H7)-C(=0)-NH-CH(CH3)-C(=0)-0 / C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)
§-NH-CH(COOH)-CH2-N
Figure imgf000203_0001
§§;
5-NH-(CH2)2-C(=0)-NH-CH(CH3)-C(=0)-NH-CH[(CH2)3-NH-C(=0)-NH2]-C(=0)-NH J
5§;
\ -(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-§ § ;
5-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
\ -CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-§ § ; BHC 15 1 040-A - 203 -
§-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-CH2-§§;
§ -CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§ - -NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-§ § ; (=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-
Figure imgf000204_0001
§ -CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-§ § ;
§-CH2-S-(CH2)5-C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
§ -CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§ -CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)5-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH5-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(NH2)-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)4 -(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)2-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)8-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-CH(C2H4COOH)-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=0)-(CH2)2-COOH]-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-CH3]-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=0)-(CH2)2-COOH]-C(=0)-NH-(CH2)2-S(=0)2-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-
§§;
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=0)-(CH2)2-COOH]-C(=0)-NH-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§; §-CH2-S-CH2CH[C(=0)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§; BHC 15 1 040-A - 204 -
§-CH2-S-CH2CH[C(=0)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-
§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-(CH2)2CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH- C(=0)-CH2-§§
§-CH2-S-CH2CH[C(=0)-NH-((CH2)2-0)4-(CH2)2-COOH]-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH- C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-CH[(CH2)2-COOH]-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-
C(=0)-(CH2)2-§§,
oder
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH2-S-CH2CH(COOH)- NH-C(=0)- CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§ §, steht,
wobei
§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
§ § die Bindung an den Antikörper darstellt und
1S0C3H7 einen isoPropyl-Rest darstellt,
sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Therapeutische Verwendung
Zu den hyperproliferativen Erkrankungen, zu deren Behandlung die erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt werden können, zählt insbesondere die Gruppe der Krebs- und Tumorerkrankungen. Hierunter werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere die folgenden Erkrankungen verstanden, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein: Brustkarzinome und Brust- tumore (Mammakarzinome einschließlich ductaler und lobulärer Formen, auch in situ), Atemwegs- tumore (kleinzelliges und nicht-kleinzelliges Karzinom, Bronchialkarzinome), Hirntumore (z.B. des Hirnstamms und des Hypothalamus, Astrocytoma, Ependymoma, Glioblastoma, Gliome, Medulloblastoma, Meningiome sowie neuro-ektodermale und pineale Tumore), Tumore der Verdauungsorgane (Speiseröhren-, Magen-, Gallenblasen-, Dünndarm-, Dickdarm-, Rektum- und Analkarzinome), Lebertumore (u.a. hepatozelluläres Karzinom, Cholangiokarzinom und gemischt- hepatozelluläres Cholangiokarzinom), Tumore des Kopf- und Halsbereiches (Larynx-, Hypo- pharynx-, Nasopharynx-, Oropharynx-, Lippen- und Mundhöhlenkarzinome, orale Melanome), Hauttumore (Basaliome, Spinaliome, Plattenepithelkarzinome, Kaposi-Sarkom, maligne Mela- BHC 15 1 040-A - 205 - nome, nicht-melanomartiger Hautkrebs, Merkelzell-Hautkrebs, Mastzelltumore), Tumore des Stütz- und Bindegewebes (u.a. Weichteilsarkome, Osteosarkome, maligne fibröse Histiozytome, Chondrosarkome, Fibrosarkome, Hämangiosarkome, Leiomyosarkome, Liposarkome, Lymphosarkome und Rhabdomyosarkome), Tumore der Augen (u.a. intraokuläres Melanom und Retino- blastom), Tumore der endokrinen und exokrinen Drüsen (z.B. der thyroiden und parathyroiden Drüsen, Bauchspeicheldrüsen- und Speicheldrüsenkarzinome, Adenokarzinome), Tumore des Harntrakts (Blasen-, Penis-, Nieren-, Nierenbecken- und Harnleitertumore) sowie Tumore der reproduktiven Organe (Endometrium-, Zervix-, Ovarial-, Vaginal-, Vulva- und Uteruskarzinome der Frau sowie Prostata- und Hodenkarzinome des Mannes). Dazu gehören auch proliferative Erkrankungen des Blutes, des Lymphsystems und des Rückenmarks, in solider Form und als zirkulierende Zellen, wie Leukämien, Lymphome und myeloproliferative Erkrankungen, z.B. akute myeloide, akute lymphoblastische, chronisch-lymphozytische, chronisch-myelogene und Haarzell- Leukämie, sowie AIDS-korrelierte Lymphome, Hodgkin-Lymphome, Non-Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zell-Lymphome, Burkitt-Lymphome und Lymphome im zentralen Nervensystem.
Diese gut charakterisierten Krankheiten des Menschen können mit vergleichbarer Ätiologie auch in anderen Säugetieren vorkommen und dort ebenfalls mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Die Behandlung der zuvor genannten Krebserkrankungen mittels der erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst sowohl eine Behandlung der soliden Tumore als auch eine Behandlung meta- stasierter oder zirkulierender Formen hiervon.
Der Begriff "Behandlung" oder "behandeln" wird im Rahmen dieser Erfindung konventionell verwendet und bedeutet die Versorgung, Pflege und Betreuung eines Patienten mit dem Ziel, eine Krankheit oder gesundheitliche Abweichung zu bekämpfen, zu verringern, abzuschwächen oder zu erleichtern und die Lebensbedingungen zu verbessern, die durch diese Krankheit beeinträchtigt werden, wie beispielsweise bei einer Krebserkrankung.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen. BHC 15 1 040-A - 206 -
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfindungsgemäßen Verbindungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschten und inakzeptablen Nebenwirkungen führt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prävention der zuvor genannten Erkrankungen.
Beispielsweise können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit bekannten anti-hyperproliferativen, zytostatischen oder zytotoxischen Substanzen zur Behandlung von Krebs erkrankun- gen kombiniert werden. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft genannt:
1311-chTNT, Abarelix, Abirateron, Aclarubicin, Ado-Trastuzumab Emtansin, Afatinib,
Aflibercept, Aldesleukin, Alemtuzumab, Alendronsäure, Alitretinoin, Altretamin, Amifostine, Aminoglutethimid, Hexyl-5-Aminolevulinat, Amrubicin, Amsacrin, Anastrozol, Ancestim, Anethole dithiolethione, Angiotensin II, Antithrombin III, Aprepitant, Arcitumomab, Arglabin, Arsentrioxid, Asparaginase, Axitinib, Azacitidin, Belotecan, Bendamustin, Belinostat,
Bevacizumab, Bexaroten, Bicalutamid, Bisantren, Bleomycin, Bortezomib, Buserelin, Bosutinib, Brentuximab Vedotin, Busulfan, Cabazitaxel, Cabozantinib, Calciumfolinat, Calciumlevofolinat, Capecitabin, Capromab, Carboplatin, Carfilzomib, Carmofur, Carmustin, Catumaxomab,
Celecoxib, Celmoleukin, Ceritinib, Cetuximab, Chlorambucil, Chlormadinon, Chlormethin, Cidofovir, Cinacalcet, Cisplatin, Cladribin, Clodronsäure, Clofarabin, Copanlisib, Crisantaspase, Crizotinib, Cyclophosphamid, Cyproteron, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin, Dabrafenib, Dasatinib, Daunorubicin, Decitabin, Degarelix, Denileukin-Diftitox, Denosumab, Depreotid, Deslorelin, Dexrazoxane, Dibrospidiumchlorid, Dianhydrogalactitol, Diclofenac, Docetaxel, Dolasetron, Doxifluridin, Doxorubicin, Doxorubicin + Estron, Dronabinol, Edrecolomab, Elliptiniumacetat, Endostatin, Enocitabin, Enzalutamid, Epirubicin, Epitiostanol, Epoetin-alfa, Epoetin-beta, Epoetin-zeta, Eptaplatin, Eribulin, Erlotinib, Esomeprazol, Estramustin, Etoposid, Everolimus, Exemestan, Fadrozol, Fentanyl, Fluoxymesteron, Floxuridin, Fludarabin, Fluoruracil, Flutamid, Folinsäure, Formestan, Fosaprepitant, Fotemustin, Fulvestrant, Gadobutrol, Gadoteridol, BHC 15 1 040-A - 207 -
Gadotersäure-Megluminsalz, Gadoversetamid, Gadoxetsäure Dinatriumsalz (Gd-EOB-DTPA Dinatriumsalz), Galliumnitrat, Ganirelix, Gefitinib, Gemcitabin, Gemtuzumab, Glucarpidase, Glutoxim, Goserelin, Granisetron, Granulocyten Kolonie stimulierender Factor (G-CSF),
Granulocyten Macrophagen Kolonie stimulierender Factor (GM-CSF), Histamindihydrochlorid, Histrelin, Hydroxycarbamid, I-125-Seeds, Ibandronsäure, Ibritumomab-Tiuxetan, Ibrutinib, Idarubicin, Ifosfamid, Imatinib, Imiquimod, Improsulfan, Indisetron, Incadronic acid,
Ingenolmebutat, Interferon-alfa, Interferon-beta, Interferon-gamma, Iobitridol, Iobenguane (1231), Iomeprol, Ipilimumab, Irinotecan, Itraconazole, Ixabepilon, Lanreotid, Lansoprazole, Lapatinib, Lasocholine, Lenalidomid, Lentinan, Letrozol, Leuprorelin, Levamisol, Levonorgestrel,
Levothyroxin-Natrium, Lipegfilgrastim, Lisurid, Lobaplatin, Lomustin, Lonidamin, Masoprocol, Medroxyprogesteron, Megestrol, Melarsoprol, Melphalan, Mepitiostan, Mercaptopurin, Mesna, Methadon, Methotrexat, Methoxsalen, Methylaminolevulinat, Methylprednisolon,
Methyltestosteron, Metirosin, Mifamurtid, Miltefosin, Miriplatin, Mitobronitol, Mitoguazon, Mitolactol, Mitomycin, Mitotan, Mitoxantron, Mogamulizumab, Molgramostim, Mopidamol, Mo hinhydro chlorid, Morphinsulfat, Nabilon, Nabiximols, Nafarelin, Naloxon + Pentazocin, Naltrexon, Nartograstim, Nedaplatin, Nelarabin, Neridronsäure, Nivolumabpentetreotid, Nilotinib, Nilutamid, Nimorazol, Nimotuzumab, Nimustin, Nitracrin, Nivolumab, Obinutuzumab, Octreotid, Ofatumumab, Omacetaxin-Mepesuccinat, Omeprazol, Ondansetron, Orgotein, Orilotimod, Oxaliplatin, Oxycodon, Oxymetholon, Ozogamicin, p53-Gentherapie, Paclitaxel, Palladium- 103- Seed, Palonosetron, Pamidronsäure, Panitumumab, Pantoprazol, Pazopanib, Pegaspargase, Pembrolizumab, Peg-interferon-alfa-2b, Pemetrexed, Pentostatin, Peplomycin, Perflubutane, Perfosfamid, Pertuzumab, Picibanil, Pilocarpin, Pirarubicin, Pixantron, Plerixafor, Plicamycin, Poliglusam, Polyestradiolphosphat, Polyvinylpyrrolidone + Natriumhyaluronat, Polysaccharid-K, Pomalidomid, Ponatinib, Porfimer-Natrium, Pralatrexat, Prednimustin, Prednison, Procarbazin, Procodazole, Propranolol, Quinagolid, Rabeprazol, Racotumomab, Radium-223-chlorid, Radotinib, Raloxifen, Raltitrexed, Ramosetron, Ramucirumab, Ranimustin, Rasburicase, Razoxan,
Refametinib, Regorafenib, Risedronsäure, Rhenium-186 Etidronat, Rituximab, Romidepsin, Romurtid, Roniciclib , Samarium (153Sm) lexidronam, Satumomab, Secretin, Sipuleucel-T, Sizofiran, Sobuzoxan, Natriumglycididazol, Sorafenib, Stanozolol, Streptozocin, Sunitinib, Talaporfin, Tamibaroten, Tamoxifen, Tapentadol, Tasonermin, Teceleukin, Technetium (99mTc) Nofetumomab Merpentan, 99mTc-HYNIC-[Tyr3]-octreotid, Tegafur, Tegafur + Gimeracil + Oteracil, Temoporfm, Temozolomid, Temsirolimus, Teniposid, Testosteron, Tetrofosmin, Thalidomid, Thiotepa, Thymalfasin, Thyrotropin alfa, Tioguanin, Tocilizumab, Topotecan, Toremifen, Tositumomab, Trabectedin, Tramadol, Trastuzumab, Treosulfan, Tretinoin, Trifluridine + Tipiracil, Trametinib, Trilostan, Triptorelin, Trofosfamid, Thrombopoietin, Ubenimex, BHC 15 1 040-A - 208 -
Valrubicin, Vandetanib, Vapreotid, Valatinib , Vemurafenib, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinflunin, Vinorelbin, Vismodegib, Vorinostat, Yttrium-90-Glasmikrokugeln, Zinostatin, Zinostatin-Stimalamer, Zoledronsäure, Zorubicin.
Darüber hinaus können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung beispielsweise mit Bindern kombiniert werden, die beispielhaft an die folgenden Targets binden können: OX-40, CD137/4- 1BB, DR3, ID01/ID02, LAG-3, CD40.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.
Generell können mit der Kombination von Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit anderen, zytostatisch oder zytotoxisch wirksamen Agenzien folgende Ziele verfolgt werden: eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, bei der Reduktion seiner Größe oder sogar bei seiner völligen Eliminierung im Vergleich zu einer Behandlung mit einem einzelnen Wirkstoff; die Möglichkeit, die verwendeten Chemotherapeutika in geringerer Dosierung als bei der Monotherapie einzusetzen; die Möglichkeit einer verträglicheren Therapie mit weniger Nebeneffekten im Vergleich zur Einzelgabe; die Möglichkeit zur Behandlung eines breiteren Spektrums von Tumorerkrankungen; das Erreichen einer höheren Ansprechrate auf die Therapie; eine längere Überlebenszeit der Patienten im Vergleich zur heutigen Standardtherapie.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken. BHC 15 1 040-A - 209 -
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie beispielsweise, parenteral, möglicherweise inhalativ oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Κεβθφίίοηββοΐιτίίίεβ geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. . intramuskulär, subkutan, intrakutan, perkutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen oder Lyophilisaten. Bevorzugt ist die parenterale Applikation, insbesondere die intravenöse Applikation.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 1 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 0.5 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Erfindung ist nicht auf die Beispiele beschränkt.
Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen. BHC 15 1 040-A - 210 -
Wenn bei Versuchsbeschreibungen keine Angaben bzgl. einer Temperatur gemacht werden, bei der die Reaktion durchgefürht wird, ist von Raumtemperatur auszugehen.
Synthesewege:
Exemplarisch für die Ausführungsbeispiele sind in folgenden Schemata beispielhafte Synthesewege zu den Ausführungsbeispielen dargestellt:
Figure imgf000211_0001
Figure imgf000211_0002
Figure imgf000212_0001
[a): beispielsweise Natriumtriacetoxyborhydrid, Essigsäure, DCM, RT; b) beispielsweise Acetoxyacetylchlorid, NEt3, DCM, RT; c) beispielsweise LiOH, THF/Wasser, RT; d) beispielsweise H2, Pd-C, EtOH, RT; e) beispielsweise Teoc-OSu, NEt3, Dioxan, RT; f) beispielsweise Fmoc-Cl, Diisopropylethylamin, Dioxan/Wasser 2:1, RT] BHC 15 1 040-A 212
Figure imgf000213_0001
[a): beispielsweise Benzylbromid, CS2CO3, DMF, RT; b) beispielsweise Pd(dppf)2Cl2, DMF, Na2C03, 85 °C; c) beispielsweise L1AIH4, THF, 0 °C; Mn02, DCM, RT; d) beispielsweise Ti(iOPr)4, THF, RT; e) beispielsweise tBuLi, THF, -78 °C; MeOH, NH4C1; f) beispielsweise HCl/1, 4-Dioxan]
Figure imgf000213_0002
Schema 26: Synthese von Cvstein-verknüpften ADCs über hydrolysierte Bernsteinsäureamide
Dieses Verfahren wurde insbesondere bei ADCs mit LI = CH2 oder LI = CH-CH3 oder mit LI = Phenyl angewendet um diese ADCs in die offenkettigen Verknüpfungs formen zu überführen. BHC 151040-A -213 -
Figure imgf000214_0001
BHC 15 1 040-A - 214 -
[a): Natriumtriacetoxyborhydrid, Essigsäure, DCM, RT; b) Acetoxyacetylchlorid, Diisopropylethylamin, DCM, RT; c) LiOH, MeOH, RT; d) Trifluoressigsäure-l-(2-aminoethyl)- lH-pyrrol-2,5-dion (1 :1) HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT; e) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA.]
Figure imgf000215_0001
[a): HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA.]
BHC 15 1 040-A 215
Schema 29: Synthese von ADFC Precursor Molekülen
Figure imgf000216_0001
[a): Natriumtriacetoxyborhydrid, Essigsäure, DCM, RT; b) Acetoxyacetylchlorid, Triethylamin, DCM, RT; c) LiOH, MeOH, RT; d) Trifluoressigsäure-l-(2-aminoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion (1 : 1) HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT; e) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA.]
Schema 30: Synthese von ADCs
Figure imgf000216_0002
BHC 15 1 040-A - 216 -
[a): 2-Brom-l-ethylpyridinium-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.] hema 31 : Synthese von ADCs
Figure imgf000217_0001
[a): 2-Brom-l-ethylpyridinium-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.]
Schema 32: Synthese von Intermediaten
Figure imgf000217_0002
[a) beispielsweise Dimethylzink, CyhexylMgCl, , THF, -78 °C; NH4C1; b) beispielsweise HCl/1, 4- Dioxan] BHC 15 1 040-A - 217 Schema 33: Synthese von ADC Precursor Molekülen
Figure imgf000218_0001
[a): Natriumtriacetoxyborhydrid, Essigsäure, DCM, RT; b) Acetoxyacetylchlorid, Triethylamin, DCM, RT; c) L-Csytein, NaHCC , DBU, isopropanol/Wasser , RT; d) 3-Sulfanylpropansäure, K2CÜ3,RT; e) Linker, HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT; f) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA.]
Schema 34: Synthese von Lysin-verknüpften ADCs
Figure imgf000218_0002
Figure imgf000219_0001
A. Beispiele
Abkürzungen und Akronyme:
A431NS humane Tumorzelllinie
A549 humane Tumorzelllinie
A498 humane Tumorzelllinie
ABCB1 ATP-binding cassette sub-family B member 1 (Synonym für P-gp und MDR1)
abs. Absolut
Ac Acetyl
ACN Acetonitril
aq. wässrig, wässrige Lösung
ATP Adenosintriphosphat
BCRP Brustkrebs-Resistenz-Protein, ein Efflux-Transporter
BEP 2-Brom- 1 -ethylpyridinium-Tetrafluoroborat
Boc tert.-Butoxycarbonyl
br. breit (bei NMR)
Bsp. Beispiel
ca. circa, ungefähr
CI chemische Ionisation (bei MS)
d Dublett (bei NMR)
d Tag(e)
DC Dünnschichtchromatographie BHC 15 1 040-A - 219 -
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)
dd Dublett von Dublett (bei NMR)
DMAP 4-NN-Dimethylaminopyridin
DME 1 ,2-Dimethoxyethan
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium (standardisiertes Nährmedium für die Zellkultur)
DMF A^N-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DPBS, D-PBS, PBS Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salz-Lösung
PBS = DPBS = D-PBS, pH7,4, Fa. Sigma, No D8537
Zusammensetzung:
0,2 g KCl
0,2 g KH2PO4 (anhyd)
8,0 g NaCl
1 ,15 g Na2HP04 (anhyd)
ad 1 1 mit H2O auffüllen
dt Dublett von Triplett (bei NMR)
DTT DL-Dithiothreitol
d. Th. der Theorie (bei chemischer Ausbeute)
EDC A^'-(3-Dimethylaminopropyl)-A^-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid EGFR Epidermal growth factor receptor = Epidermaler Wachstumsfaktor
Rezeptor
EI Elektronenstoß-Ionisation (bei MS)
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
eq. Äquivalent(e)
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)
ESI-MicroTofq ESI- MicroTofq (Name des Massenspektrometer mit Tof = Time Of
Flight und q = Quadrupol)
FCS fötales Kälberserum
Fmoc (9i7-Fluoren-9 -ylmethoxy)carbonyl
ges. gesättigt
GTP Guanosin-5'-triphosphat
h Stunde(n)
HATU 0-(7-Azabenzotriazol- 1 -y\)-N,N,N', N'-tetramethyluronium- hexafluorophosphat BHC 15 1 040-A - 220 -
HCT-116 HumaneTumorzelllinie
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-l -ethansulfonsäure
HOAc Essigsäure
HOAt l-Hydroxy-7-azabenzotriazol
HOBt 1 -Hydro xy- 17 -benzotriazol-Hydrat
HOSu N-Hydroxysuccinimid
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
HT29 humane Tumorzelllinie
IC so halbmaximale Inhibitionskonzentration
i.m. intramuskulär, Applikation in den Muskel
i.v. intravenös, Applikation in die Vene
konz. konzentriert
LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie
LLC-PK1 -Zellen Lewis lung Carcinoma pork kidney cell line
L-MDR Human MDR1 transfizierte LLC-PK1 Zellen
m Multiplett (bei NMR)
Me Methyl
MDR1 Multidrug resistence protein 1
MeCN Acetonitril
min Minute(n)
MS Massenspektrometrie
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-27 -tetrazoliumbromid
NCI-H292 humane Tumorzelllinie
NCI-H520 humane Tumorzelllinie
NMM N-Methylmorpholin
NMP N-Methyl-2-pyrrolidinon
NMR Kernresonanzspektrometrie
NMRI Mausstamm, Herkunft aus dem Naval Medical Research Institute
(NMRI)
Nude Mäuse Nacktmäuse (Versuchstiere)
NSCLC Non small cell lung Cancer (Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom)
PBS Phosphat-gepufferte Salz-Lösung
Pd/C Palladium auf Aktivkohle
P-gp P-Glycoprotein, ein Transporterprotein
PNGaseF Enzym zur Zuckerabspaltung BHC 15 1 040-A - 221 - quant. quantitativ (bei Ausbeute)
quart Quartett (bei NMR)
quint Quintett (bei NMR)
Rf Retentionsindex (bei DC)
RT Raumtemperatur
Rt Retentionszeit (bei HPLC)
s Singulett (bei NMR)
s.c. subcutan, Applikation unter die Haut
SCC-4 Humane Tumorzelllinie
SCC-9 Humane Tumorzelllinie
SCID Mäuse Versuchsmäuse mit einem schweren kombinierten Immundefekt
(severe combined immunodeficiency)
t Triplett (bei NMR)
TBAF Tetra-n-butylammoniumfluorid
TEMPO (2,2,6, 6-Tetramethyl-piperidin- 1 -yl)oxyl
tert. tertiär
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran
T3P® 2,4,6-Tripropyl-l ,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinan-2,4,6-trioxid
UV Ultraviolett-Spektrometrie
v/v Volumen zu Volumen-Verhältnis (einer Lösung)
Z Benzyloxycarbonyl
786-0 humane Tumorzelllinie
HPLC- und LC-MS-Methoden:
Methode 1 (LC-MS):
Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A -> 1.2 min 5% A -> 2.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.40 mL/min; UV-Detektion: 208 - 400 nm. BHC 15 1 040-A - 222 -
Methode 2 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity I-CLASS; Säule: Waters, BEH300, 2.1 x 150 mm, C18 1.7 μιη; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01% Ameisensäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B -> 1.5 min 2% B -> 8.5 min 95% B 10.0 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.50 mL/min; UV-Detektion: 220 nm
Methode 3 (LC-MS):
Instrument MS: Waters (Micromass) QM; Instrument HPLC: Agilent 1100 Serie; Säule : Agient ZORBAX Extend-C18 3.0x50mm 3.5-Micron; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01 mol Ammoniumcarbonat, Eluent B: 1 1 Acetonitril; Gradient: 0.0 min 98%o A— >■ 0.2min 98%o A— >■ 3.0 min 5% A— > 4.5 min 5% A ; Ofen: 40°C; Fluss: 1.75 mL/min; UV-Detektion: 210 nm
Methode 4 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity I-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μιη; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01% Ameisensäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B -> 0.3 min 10% B -> 1.7 min 95% B 2.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1.20 mL/min; UV-Detektion: 210 nm
Methode 5 (LC-MS):
Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 mL 99%oige Ameisensäure , Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 95% A -> 6.0 min 5% A -> 7.5 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.35 mL/min; UV-Detektion: 210 - 400 nm.
Methode 6 (LC-MS):
Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo Hypersil GOLD 1.9 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 mL 50%oige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 mL 50%>ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 97% A — »■ 0.5 min 97% A— »■ 3.2 min 5% A 4.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.3 mL/min; UV-Detektion: 210 nm. BHC 15 1 040-A - 223 -
Methode 7 (LC-MS):
Instrument: Agilent MS Quad 6150;HPLC: Agilent 1290; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A -> 0.3 min 90% A -> 1.7 min 5% A ^ 3.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 1,20 mL/min; UV-Detektion: 205 - 305 nm.
Methode 8 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity I-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μιη; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01% Ameisensäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B -> 2.0 min 2% B -> 13.0 min 90% B 15.0 min 90% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1.20 ml/min; UV-Detektion: 210 nm
Methode 9: LC-MS-Prep Reinigungsmethode für die Beispiele 181-191 (Methode LIND-LC-MS- Prep)
Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Waters X-Bridge C18, 19 mm x 50 mm, 5 μητ, Eluent A: Wasser + 0.05%o Ammoniak, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm). bzw.:
Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Phenomenex Luna 5μ C18(2) 100A, AXIA Tech. 50 x 21.2 mm, Eluent A: Wasser + 0.05%o Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm).
Methode 10: LC-MS-Analytik-Methode für die Beispiele 181-191 (LIND SQD SB AQ)
Instrument MS: Waters SQD; Instrument HPLC: Waters UPLC; Säule: Zorbax SB-Aq (Agilent), 50 mm x 2.1 mm, 1.8 μιη; Eluent A: Wasser + 0.025%o Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) + 0.025% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 98%A - 0.9 min 25%A - 1.0 min 5%A - 1.4 min 5%A - 1.41 min 98%A - 1.5 min 98%A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.600 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 nm. BHC 15 1 040-A 224
Methode 11 (HPLC):
Gerät: HP1100 Serie
Säule: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50-4,6mm, Best- Nr.1.51450.0001, Vorsäule Chromolith Guard Cartridge Kit, RP-18e, 5-4,6mm, Best. -Nr. 1.51470.0001
Gradient: Flow 5mL/ Min
Injection Volume 5μ1
Solvent A: HCL04 (70%ig) in Wasser (4mL/ 1)
Solvent B: Acetonitril
Start 20% B
0.50 Min 20% B
3.00 Min 90% B
3.50 Min 90% B
3.51 Min 20% B
4.00 Min 20% B
Säulentemperatur: 40°C
Wellenlänge: 210nm
Methode 12 (LC-MS)
Gerätetyp MS: Thermo Scientific FT-MS; Gerätetyp UHPLC+: Thermo Scientific UltiMate 3000; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 75 mm, C18 1.8 μιη; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01%o Ameisensäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B 2.5 min 95% B 3.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.90 ml/min; UV-Detektion: 210 nm/ Optimum Integration Path 210-300 nm
Methode 13: (LC-MS )
Instrument MS: Waters (Micromass) Quattro Micro; Instrument Waters UPLC Acquity; Säule : Waters BEH C18 1.7 μ 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01 mol Ammoniumformiat, Eluent B: 1 1 Acetonitril; Gradient: 0.0 min 95% A ^ 0.1 min 95% A 2.0 min 15% A 2.5 min 15% A^ 2.51 min 10% A 3.0 min 10% A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.5 ml/min; UV-Detektion: 210 nm
Für alle Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden nicht explizit beschrieben ist, gilt, dass sie von allgemein zugänglichen Quellen kommerziell bezogen wurden. Für alle übrigen Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden ebenfalls nicht beschrieben ist und die nicht kommerziell erhältlich waren oder von Quellen bezogen wurden, die nicht allgemein zugänglich sind, ist ein Verweis auf die veröffentlichte Literatur angegeben, in der ihre Herstellung beschrieben ist. BHC 15 1 040-A - 225 -
Methode 14: (LC-MS):
Gerätetyp MS: ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL; Gerätetyp HPLC: Agilent 1200SL; Säule: Agilent, POROSHELL 120, 3 x 150 mm, SB - Cl 8 2.7 μιη; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.1% Trifluoressigsäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.1% Trifluoressigsäure; Gradient: 0.0 min 2%> B— > 0.3 min 2% B 5.0 min 95% B ^ 10.0 min 95% B; Ofen: 40°C; Fluss: 0.75 ml/min; UV- Detektion: 210 nm
Für alle Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden nicht explizit beschrieben ist, gilt, dass sie von allgemein zugänglichen Quellen kommerziell bezogen wurden. Für alle übrigen Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden ebenfalls nicht beschrieben ist und die nicht kommerziell erhältlich waren oder von Quellen bezogen wurden, die nicht allgemein zugänglich sind, ist ein Verweis auf die veröffentlichte Literatur angegeben, in der ihre Herstellung beschrieben ist.
BHC 15 1 040-A - 226 -
Ausgangsverbindungen und Intermediate:
Intermediat C2 tert-Butyl-(2 S)-4-( { ( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4 -(2,5 -difluorphenyl)- 1 H-imidazol-2-yl] -2,2- dimethylpropyl} amino)-2- [(tert-butoxycarbonyl)amino]butanoat
Figure imgf000227_0001
4.22 g (14.5 mmol) tert-Butyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-homoserinat wurden in 180 mL Dichlormethan gelöst und dann mit 3.5 mL Pyridin sowie mit 9.2 g (21.7 mmol) 1,1,1-Triacetoxy- llambda5,2-benziodoxol-3(lH)-on versetzt. Der Ansatz wurde 1 h bei RT gerührt, anschließend mit 500 mL Dichlormethan verdünnt und zweimal mit 10%-iger Natriumtiosulfatlösung und dann nacheinander zweimal mit 5%-iger Zitronensäure und zweimal mit 10%-iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in DCM aufgenommen und mit einer Mischung aus Diethylether und n-Pentan versetzt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat anschließend einggengt und aus Acetonitril/Wasser lyophilisiert. Es wurden 3.7 g (93%) tert-Butyl-(2S)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-oxobutanoat erhalten, die ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt wurden. (Rf-Wert: 0.5 (DCM/Methanol 95/5).
3.5 g (9.85 mmol) von Intermediat Cl wurden in 160 mL DCM gelöst und mit 3.13 g (14.77 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie mit 0.7 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 3.23 g (11.85 mmol) tert-Butyl-(2S)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-oxobutanoat zugegeben und der Ansatz weitere 30 min bei RT gerührt. Dann wurde das Lösunsgmittel im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Acetonitril/Wasser aufgenommen. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert und getrocknet und man erhielt 5.46 g (84%) der Titelverbindung.
HPLC (Methode 11): Rt = 2.5 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.13 min; MS (ESIpos): m/z = 613 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 227 -
Intermediat Cll
R/S-( 11 - {(1 R)-l -[ 1 -Β6ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ρνπ·ο1-2-γ1]-2,2-ά™6 1ρΓοργ1}-2,2- dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13- l)-homocystein-trifluoressigsäure(l
Figure imgf000228_0001
990.0 mg (2.79 mmol) (lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropan-l -amin wurden in 15.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 828.8 mg (3.91 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid und 129.9 mg (3.21 mmol) Essigsäure versetzt und 5 min bei RT grührt. Es wurden 698.1 mg (3.21 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-oxopropyl)carbamat (Intermediat L58) gelöst in 15.0 mL Dichlormethan zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase je zweimal mit ges. Natriumcarbonat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol 100:2) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.25 g (73 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[3-({(lR)-l- [l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)propyl]carbamat. LC-MS (Methode 1): Rt = 1.09 min; MS (ESIpos): m/z = 556 (M+H)+.
400.0 mg (0.65 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[3-({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)propyl]carbamat wurden mit 151.4 mg (1.5 mmol) Triethylamin und mit 161.6 mg (1.43 mmol) Chloracetylchlorid versetzt. Die Reaktionsmischung BHC 15 1 040-A - 228 - wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase dreimal mit Wasser und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Es wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 3:1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 254.4 mg (57 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-{3-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]propyl}carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.49 min; MS (ESIneg): m/z = 676 (M+HCOO )\
117.4 mg (0.19 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-{3-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]propyl}carbamat wurde in 10.0 mL Isopropanol gelöst und mit 928.4 μΕ IM NaOH und 50.2 mg (0.37 mmol) DL-Homocystein versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 4.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 75.3 mg (48 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.24 min; MS (ESIpos): m/z = 731 (M+H)+.
'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.40 (m, 1H), 0.75-0.91 (m, 11H), 1.30 (m, 1H), 1.99-2.23 (m, 2H), 2.63-2.88 (m, 4H), 3.18-3.61 (m, 5H), 3.79-4.10 (m, 3H), 4.89 (d, 1H), 4.89 (d, 1H), 5.16 (d, 1H), 5.56 (s, 1H), 6.82 (m, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.97 (m, 1H), 7.13-7.38 (m, 6H), 7.49 (s, 1H), 7.63 (m, 1H), 8.26 (s, 3H).
BHC 15 1 040-A - 229 -
Intermediat C12
R/S-[(8S)-11 - {(1 R)-l -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -8- carboxy-2,2-dimeth l-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl]homocystein
Figure imgf000230_0001
Die Synthese erfolgte in Analogie zur Synthese von Intermediat Cl 1 mit
Methyl-(2S)-4-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoat (Intermediat L57) und Intermediat C52 als Edukten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.18 min; MS (ESIpos): m/z = 775 (M+H)+. Intermediat C52
( 1 R)- 1 - [ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluor henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropan- 1 -amin
Figure imgf000230_0002
10.00 g (49.01 mmol) Methyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylat wurden in 100.0 mL DMF vorgelegt und mit 20.76 g (63.72 mmol) Cäsiumcarbonat und 9.22 g (53.91 mmol) Benzylbromid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei RT. Die Reaktionsmischung wurde zwischen Wasser und Ethylacetat verteilt und die wässrige Phase mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten BHC 15 1 040-A - 230 - organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Ansatz wurde mit 90.0 g Methyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylat wiederholt.
Die Reinigung der vereinigten beiden Ansätze erfolgte mittles präp. RP-HPLC (Säule: Daiso
300x100; 10μ, Fluss: 250 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 125.15 g (87 % d. Th.) der
Verbindung Methyl- 1 -benzyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.18 min; MS (ESIpos): m/z = 295 [M+H]+.
Unter Argon wurden 4.80 g (16.32 mmol) Methyl- l-benzyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylat in DMF vorgelegt und mit 3.61 g (22.85 mmol) (2,5-Difluorphenyl)boronsäure und 19.20 mL ges. Natriumcarbonat-Lösung und 1.33 g (1.63 mmol) [l,l'-Bis-(diphenylphosphino)-ferrocen]- dichloφalladium(II):Dichlormethan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 85 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über Celite filtriert und der Filterkuchen mit Ethylacetat gewaschen. Die organische Phase wurde mit Wasser extahiert und dann mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 100:3) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.60 g (67 % d. Th.) der Verbindung Methyl- l-benzyl-4- (2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-carboxylat.
LC-MS (Methode 7): Rt = 1.59 min; MS (ESIpos): m/z = 328 [M+H]+.
3.60 g (11.00 mmol) Methyl- l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-carboxylat wurden in 90.0 mL THF vorgelegt und bei 0 °C mit 1.04 g (27.50 mmol) Lithiumaluminiumhydrid (2.4 M in THF) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 0 °C gerührt. Es wurde bei 0 °C ges. Kaliumnatriumtartrat-Lösung zugegeben und die Reaktionsmischung mit Ethylacetat versetzt. Die organische Phase wurde dreimal mit ges. Kaliumnatriumtartrat-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in 30.0 mL Dichlormethan gelöst. Es wurden 3.38 g (32.99 mmol) Mangan(IV)oxid zugegeben und 48 h bei RT gerührt. Es wurden nochmals 2.20 g (21.47 mmol) Mangan(IV)oxid zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über Celite filtriert und der Filterkuchen mit Dichlormethan gewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand 2.80 g (l-Benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-carbaldehyd) wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 7): Rt = 1.48 min; MS (ESIpos): m/z = 298 [M+H]+. BHC 15 1 040-A - 231 -
28.21 g (94.88 mmol) 1-Βεηζγ1-4-(2,5-(1ίί1υοφ1ΐ6ηγ1)-1Η- νπ·ο1-2-οαΛα1(ΐ6ΐιγ(1 wurden zusammen mit 23.00 g (189.77 mmol) (R)-2-Methylpropan-2-sulfmamid in 403.0 mL absol. THF vorgelegt und mit 67.42 g (237.21 mmol) Titan(IV)isopropylat versetzt und über Nacht bei RT gerührt. Es wurden 500.0 mL ges. NaCl-Lösung und 1000.0 mL Ethylacetat zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Es wurde über Kieselgur filtriert und das Filtrat zweimal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die org. Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 1500+340 g SNAP, Fluss 200 mL/min, Ethylacetat/Cyclohexan 1 :10).
LC-MS (Methode 7): Rt = 1.63 min; MS (ESIpos): m/z = 401 [M+H]+.
25.00 g (62.42 mmol) (R)-N-{(E/Z)-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]methylen}-2- methylpropan-2-sulfmamid wurden in absol. THF unter Argon vorgelegt und auf -78 °C abgekühlt. Dann wurden 12.00 g (187.27 mmol) tert.-Butyllithium (1.7 M Lösung in Pentan) bei -78 °C zugegeben und 3 h bei dieser Temperatur gerührt. Dann wurden bei -78 °C 71.4 mL Methanol und 214.3 mL ges. Ammoniumchlorid-Lösung nacheinander zugegeben und die Reaktionsmischung wurde auf RT kommen lassen und 1 h bei RT gerührt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (R)-N-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2-methylpropan-2-sulfinamid wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 6): Rt = 2.97 min; MS (ESIpos): m/z = 459 [M+H]+.
28.00 g (61.05 mmol) (R)-N-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2-methylpropan-2-sulfinamid wurden in 186.7 mL 1,4-Dioxan vorgelegt und dann mit 45.8 mL HCl in 1 ,4-Dioxan-Lösung (4.0 M) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei RT gerührt und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Kinetix 100x30; Fluss: 60 mL/min, MeCN/Wasser). Das Acetonitril wurde im Vakuum verdampft und der wässrige Rückstand wurde mit Dichlormethan versetzt. Die organische Phase wurde mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 16.2 g (75 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 6): Rt = 2.10 min; MS (ESIpos): m/z = 338 [M-NH2]+, 709 [2M+H]+.
'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 0.87 (s, 9H), 1.53 (s, 2H), 3.59 (s, 1H), 5.24 (d, 2H), 6.56 (s, 1H), 6.94 (m, 1H), 7.10 (d, 2H), 7.20 (m, 1H), 7.26 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.46 (m, 1H). BHC 15 1 040-A - 232 -
Intermediat C53
(2SH-[{(lR)-l-[l-BeiizyM-(2,5-diflu<^henyl) H^yrrol-2-yl]-2
dimethylpropyl}(glycoloyl)amino -2-{[(9H-fluoren-9^
Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl-(2S)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-4-oxobutanoat in Analogie zu Intermediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat wie in Intermediat C27 beschrieben acyliert und schließlich mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergruppen durchgeführt. Das so erhaltene Intermediat wurde in Ethanol gelöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert. Die entschützte Verbindung wurde in Dioxan/Wasser 2:1 aufgenommen und mit 9H-Fluoren-9-ylmethylchlorocarbonat in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin wurde im letzten Schritt die Fmoc-Schutzgruppe eingeführt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.37 min; MS (ESIpos): m/z = 734 (M-H)\
BHC 15 1 040-A - 233 -
Intermediat C54
Ν-[(28)-4-[{(1Κ) -[1-Βεηζγ1-4-(2,5-ώηυο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ρνπ·ο1-2-γ1]-2,2-ά™6 1ρΓοργ1} (glycoloyl)amino]-2-{[(9H-fl ren-9-ylmethoxy)carbonyl]amino}butanoyl]-beta-alanin
Figure imgf000234_0001
Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl-N-[(2S)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-4- oxobutanoyl]-beta-alaninat in Analogie zu Intermediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat wie in Intermediat C27 beschrieben acyliert. Das so erhaltene Intermediat wurde in Methanol gelöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert. Anschließend wurde mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der Estergruppe durchgeführt. Die entschützte Verbindung wurde in Dioxan/Wasser 2:1 aufgenommen und mit 9H-Fluoren-9- ylmethylchlorocarbonat in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin wurde im letzten Schritt die Fmoc-Schutzgruppe eingeführt. Es wurden 48 mg der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.38 min; MS (ESIpos): m/z = 807 (M+H)
BHC 15 1 040-A - 234 -
Intermediat C58
(2S)-4-[{(lR) -[l-Benzyl-4-(2,5-difluo^
amino]-2-({[2-(trimethylsilyl ethoxy]carbonyl}amino)butansäure
Figure imgf000235_0001
Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl-(2S)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-4-oxobutanoat in Analogie zu Intermediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat wie in Intermediat C27 beschrieben acyliert und schließlich mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergruppen durchgeführt. Das so erhaltene Intermediat wurde in Ethanol gelöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert.
500 mg (0.886 mmol) von diesem vollständig entschützten Intermediat wurden in 60 ml Dioxan aufgenommen und mit 253 mg (0.975 mmol) l-({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy) pyrrolidin-2,5-dion sowie 198 μΐ^ Triethylamin versetzt. Nach 24 h Rühren bei RT wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Einengen im Vakuum und Trocknen im Hochvakuum wurden 312 mg (50% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 4.61 min; MS (ESIpos): m/z = 658 (M+H)\ BHC 15 1 040-A - 235 -
Intermediat C59
(2SM-({(lR)-l-[l-BeiizyM-(2,5-diflro^
methoxypropanoyl]amino)-2-{ -fluoren-9-ylmeth^
Figure imgf000236_0001
Zunächst wurde die sekundäre Aminogruppe von Benzyl-(2S)-4-({(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino} butanoat mit (2S)-2-Methoxypropanoylchlorid (Zwischenstufe aus Intermediat C53) in Gegenwart von Triethylamin wie in Intermediat C53 beschrieben acyliert. Das erhaltene Intermediat wurde in Ethanol aufgenommen, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert. Die entschützte Verbindung wurde in Dioxan/Wasser 2:1 aufgenommen und mit 9H-Fluoren-9-ylmethylchlorocarbonat in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin wurde im letzten Schritt die Fmoc-Schutzgruppe eingeführt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.39 min; MS (ESIpos): m/z = 764 (M-H)\
BHC 15 1 040-A - 236 -
Intermediat C60
(2SM-({(lR)-l-[l-BeiizyM-(2,5-rtflu^
methoxypropanoyl]amino)-2-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy^
Figure imgf000237_0001
Die Synthese erfolgte in Analogie zu Intermediat C53.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.41 min; MS (ESIpos): m/z = 750 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 237 -
Intermediat C61
N-[(2SH-[{(lR)-l-[l-Beiizyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pynol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-2-({[2-(trim
alanin
Figure imgf000238_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 60 mg (0.091 mmol) Intermediat C58 mit ß- Alaninmethylester und anschließender Esterspaltung mit 2m Lithiumhydroxidlösung hergestellt. Es wurden 67mg (61% d.Th.) der Titelverbindung über 2 Stufen erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.29 min; MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 238 -
Intermediat C62
N-[(2SH-[{(lR)-l-[l-BeiizyM-(2,5-difluorphenyl)-lH-pynol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-2-({[2-(trm
alanin
Figure imgf000239_0001
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat C61 aus Intermediat C58 und Methyl-D- alaninat hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.32 min; MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 239 -
Intermediat C64
Trifluoressigsäure—2 -(trimethylsilyl)ethyl- { (2 S)- 1 - [(2-aminoethyl)amino] -4-[{(lR)-l-[l -benzyl-4- (2,5-difluoφhenyl)-lH- yrrol-2-yl]-2,2-dimethyl ro yl}(glycoloyl)amino]-l-oxobutan-2- yljcarbamat (1 :1)
Figure imgf000240_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C58 in Analogie zu Intermediat C63 hergestellt.
HPLC (Methode 11): Rt = 2.4 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.01 min; MS (ESIpos): m/z = 700 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 240 -
Intermediat C65
(88)-8-{2-[{(1Κ)-ι -[1-Β6ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2-ά™6 1ρΓοργ1} (glycoloyl)amino]eth l} -2,2-dimethyl-6, 11 -dioxo-5-oxa-7, 10-diaza-2-silatetradecan-l 4-säure
Figure imgf000241_0001
215 mg (0.59 mmol) von Intermediat L66 wurden in 25 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 377 mg (0.89 mmol) Dess-Martin Periodinan und 144 μΐ. (1.78 mmol) Pyridin versetzt. Man rührte 30 min bei RT. Anschließend wurde der Ansatz mit 300 ml Dichlormethan verdünnt und die organische Phase je zweimal mit 10%iger Na2S203-Lösung, 10%iger Citronensäure-Lösung und ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum abgedampft. Man erhielt 305 mg des Aldehyds, der ohne weitere Reinigung umgesetzt wurde.
175 mg (0.49 mmol) von Intermediat C52 wurden in 50 ml Dichlormethan gelöst und mit 147mg (0.69 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie 32.5 μΐ^ Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 214 mg (0.593 mmol) vom oben beschriebenen Aldehyd hinzugegeben und der Ansatz über Nacht bei RT gerührt. Dabei ist anstelle erwarteten Produktes 2-(Trimethylsilyl)ethyl- [(2S)-4-( {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} amino)- 1 - (2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)butan-2-yl]carbamat entstanden. Da auch dieses Imid sich weiter zur Titelverbindung umsetzen lassen sollte, wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Imid- enthaltenden Fraktionen wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. So wurden 195 mg (58%) des oben benannten Imids erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 3.32 min; MS (ESIpos): m/z = 667 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 241 -
65 mg (97.5 μιηοΐ) dieses Imids wurden in 15 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 367 μL· (3.4 mmol) Acetoxyacetylchlorid sowie 595 μΐ^ NN-Diisopropylethylamin versetzt. Nach 30 min Rühren bei RT wurde der Ansatz ohne Erwärmung im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und nach Abdampfen der Lösungsmittel und Trocknung im Hochvakuum verblieben 28 mg (37% d. Th.) (8S)-l l -{(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-8-[(2,5- dioxopyrrolidin-l -yl)methyl]-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl- acetat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.44 min; MS (ESIpos): m/z = 767 (M+H)+.
28 mg (37 μιηοΐ) von diesem Intermediat wurden in 3 mL Methanol gelöst und mit 548 μΐ^ einer 2M Lithiumhydroxidlösung versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit Trifluoressigsäure auf pH 4 gebracht und dann eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Abdampfen des Lösungsmittels und Trocknung des Rückstandes im Hochvakuum wurden 26 mg (96%o d. Th.) der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.33 min; MS (ESIpos): m/z = 743 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 242 -
Intermediat C66
2-(Trimethylsilyl)ethyl-[(2S)-4-[{(lR)-l-[^
dimethylpropyl} lycoloyl)amino]-l-{[2-(glycylamino)ethyl]amino}-l-oxobutan-2-
Figure imgf000243_0001
Zuächst wurde aus N-[(benzyloxy)carbonyl]glycin und tert-Butyl (2-aminoethyl)carbamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie (HATU-Kupplung und Boc-Spaltung) Trifluoressigsäure - benzyl- {2-[(2-aminoethyl)amino]-2-oxoethyl} carbamat (1 :1) hergestellt.
13 mg (0.036 mmol) von diesem Intermediat sowie 25 mg (0.033 mmol) von Intermediat C58 wurden in 3 mL DMF aufgenommen und mit 19 mg (0.05 mmol) HATU und 17 μΐ Ν,Ν- Diisopropylethylamin versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 17.8 mg (60% d. Th.) der Zwischenstufe erhalten. LC-MS (Methode 1): Rt = 1.36 min; MS (ESIpos): m/z = 891 (M+H)+.
17 mg (0.019 mmol) dieser Zwischenstufe wurden in 10 ml Ethanol gelöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 2 h hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert, die Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 9 mg (62% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.03 min; MS (ESIpos): m/z = 757 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 243 -
Intermediat C67
9H-Fluoren-9-ylmethyl-[3-( {(1 R)-l -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl amino)propyl] carbamat
Figure imgf000244_0001
605.3 mg (1.71 mmol) (lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropan-l -amin (Intermediat C52) wurden in 10.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 506.7 mg (2.39 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid und 117.9 mg (1.96 mmol) Essigsäure versetzt und 5 min bei RT grührt. Es wurden 580.0 mg (1.96 mmol) 9H-Fluoren-9-ylmethyl-(3- oxopropyl)carbamat (Intermediat L70) gelöst in 10.0 mL Dichlormethan zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase je zweimal mit ges. Natriumcarbonat-Lösung und ges. NaCl- Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 3:1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 514.7 mg (46 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): Rt = 1.10 min; MS (ESIpos): m/z = 634 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 244 -
Intermediat C69
11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl- 6, 12-dioxo-5-oxa- 14-thia-7 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure
Figure imgf000245_0001
117.0 mg (0.19 mmol) (2-(Τήηΐ6 ΐ8ί1γ1)6 1-{3-[{(^)-1-[1-06ηζγ1-4-(2,5-(ϋΑυο 1ΐ6ηγ1)-1Η- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]propyl}carbamat (Intermediat C70) und 21.6 mg (0.20 mmol) 3-Sulfanylpropansäure wurden in 3.0 mL Methanol vorgelegt und mit 89.5 mg (0.65 mmol) Kaliumcarbonat versetzt und 4 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt. Man erhielt 106.1 mg (73 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.42 min; MS (ESIneg): m/z = 700 (M-H)\
BHC 15 1 040-A - 245 -
Intermediat C70
(2-(Trimethylsilyl)ethyl-{3-[{(lR)-l-^
dimethylpropyl} (chloracetyl)amino]propyl} carbamat
Figure imgf000246_0001
908.1 mg (1.63 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[3-({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)propyl]carbamat (siehe Synthese Intermediat Cl l) und 545.6 mg (5.39 mmol) Triethylamin wurden in 10.0 mL Dichlormethan vorgelegt und auf 0 °C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurden 590.5 mg (5.23 mmol) Chloracetylchlorid zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde je dreimal mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. Ammoniumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 673.8 mg (65 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.53 min; MS (ESIneg): m/z = 676 (M+HCOO )\
BHC 15 1 040-A - 246 -
Intermediat C71
S^l l-{(lR) -[l-Ber^l-4-(2,5-difluo^henyl) H-pyrrol-2-yl]-2,2-dime lpro^
6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cystein-trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000247_0001
536.6 mg (4.43 mmol) L-Cystein wurden in 2.5 mL Wasser zusammen mit 531.5 mg (6.33 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 400.0 mg (0.63 mmol) (2- (Trimethylsilyl)ethyl- {3 -[ {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]propyl}carbamat (Intermediat C70) gelöst in 25.0 mL iso- Propanol und 1.16 g (7.59 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 449.5 mg (86 %> d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.20 min; MS (ESIpos): m/z = 717 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 247 -
Intermediat C72
(9S)-9- { [ {( 1 R)- 1 - [ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl) amino]methyl} -2,2-dimeth l-6, 1 1 -dioxo-5-oxa-7, 10-diaza-2-silatetradecan-l 4-säure
Figure imgf000248_0001
90 mg (0.212 mmol) von Intermediat L72 wurden in 6 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 86 μL (1.06 mmol) Pyridin sowie 135 mg (0.318 mmol) Dess-Martin Periodinan versetzt. Man rührte 30 min bei RT. Anschließend wurde der Ansatz mit 30 ml Dichlormethan verdünnt und die organische Phase zweimal mit 10%iger Na2S203-Lösung und einmal mit 5%iger Citronensäure-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum abgedampft. Der so erhaltene Aldehyd wurde ohne weitere Reinigung umgesetzt.
63 mg (0.177 mmol) von Intermediat C52 wurden in 15 ml Dichlormethan gelöst und mit 52.4 mg (0.247 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie 20.2 μΐ. Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 89.6 mg (0.212 mmol) vom oben beschriebenen Aldehyd hinzugegeben und der Ansatz 20 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand aus Acetonitril/Wasser lyophilisiert. So wurden 71 mg (53% d. Th. Über 2 Stufen) Benzyl-(9R)-9-[( {(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)methyl]-2,2-dimethyl-6,l l -dioxo-5- oxa-7, 10-diaza-2-silatetradecan- 14-oat erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.21 min; MS (ESIpos): m/z = 761 (M+H)+.
70 mg (92 μιηοΐ) dieses Intermediats wurden in 15 ml Dichlormethan aufgenommen, auf 10°C abgekühlt und mit 54 μΐ. Triethylamin sowie mit 25.5 μΣ, (0.23 mmol) Acetoxyacetylchlorid BHC 15 1 040-A - 248 - versetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurden nochmals gleiche Mengen an Säurechlorid und Triethylamin zugegeben und nach einer weiteren Stunde Rühren bei RT erneut. Der Ansatz wurde anschließend für weitere 30 min bei RT gerührt und dann im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und nach Abdampfen der Lösungsmittel und Lyophilisation des Rückstandes aus Acetonitril/Wasser verblieben 46.5 mg (59% d. Th.) des acylierten Intermediats.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.53 min; MS (ESIpos): m/z = 861 (M+H)+.
46 mg (53 μιηοΐ) von diesem Intermediat wurden in 5 mL Methanol gelöst und mit 2.7 mL einer 2M Lithiumhydroxidlösung versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit Essigsäure auf pH 3-4 gebracht und dann mit 15 ml Wasser verdünnt. Die wäßrige Phase wurde mit Ethylacetat extrahiert und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde aus Acetronitril Wasser lyophilisiert und nach Trocknung des Rückstandes im Hochvakuum wurden 37 mg (90% d. Th.) der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.32 min; MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H)+.
Intermediat C73
S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl- 6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N- [3 -(trimethylsilyl)propanoyl]-L-cystein
Figure imgf000249_0001
BHC 15 1 040-A - 249 -
619 mg (0.86 mmol) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pynol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cystein- trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) wurden in 8.8 ml Dichlormethan vorgelegt und mit 87 mg (0.86 mmol) Triethylamin und 224 mg (0.86 mmol) N-[2-(Trimethylsilyl)-ethoxycarbonyloxy]- pyrrolidin-2,5-dion versetzt. Nach lh wurden 45 mg (0.17 mmol) N-[2-(Trimethylsilyl)- ethoxycarbonyloxy]-pyrrolidin-2,5-dion zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und dann wurde die organische Phase zweimal mit Wasser und einer gesättigten Natriumhydrogenkarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 602 mg (71%, Reinheit 87%o) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.58 min; MS (ESIpos): m/z = 861 (M+H)+. Intermediat C74
Trifluoressigsäure — 2-(trimethylsilyl)ethyl-3-amino-N-[(2S)-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-D-alaninat (1 :1)
Figure imgf000250_0001
75mg (0.114 mmol) von Intermediat C58 wurden in 12.5 ml DMF aufgenommen und mit 78 mg (0.171 mmol) von Intermediat L75 in Gegenwart von 65 mg (0.11 mmol) HATU und 79 μΐ, Ν,Ν- Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurde das Intermediat BHC 15 1 040-A - 250 - in 20 ml Ethanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfütriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produkt durch präparative HPLC gereinigt. Nach Lyophilisation aus Acetonitril/Wasser 1 : 1 wurden 63 mg (64% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 1): Rt = 1.16 min; MS (EIpos): m/z = 844 [M+H]+.
Intermediat C75
Methyl-(2S)-4-[(acetoxyacetyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino] -2-( { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)butanoat
Figure imgf000251_0001
4.3 g (12.2 mmol) von Intermediat C52 wurden in 525 mL DCM gelöst und mit 3.63 g (17.12 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie mit 8.4 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 3.23 g (11.85 mmol) Methyl-(2S)-4-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)butanoat (hergestellt aus (3S)-3-Amino-4-methoxy-4-oxobutansäure nach klassischen Methoden) gelöst in 175 mL DCM zugegeben und der Ansatz weitere 45 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit DCM verdünnt und zweimal mit 100 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und dann mit gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC aufgereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Einengen und Trocknen des Rückstandes im Hochvakuum erhielt man 4.6 g (6184% d. Th.) des Intermediats.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.97 min; MS (ESIpos): m/z = 614.32 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 251 -
200 mg (0.33 mmol) dieses Intermediats wurden in 10 mL DCM gelöst und dann mit 105 μL· Triethylamin sowie mit 77 μΐ^ (0.717 mmol) Acetoxyacetylchlorid versetzt. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und dann mit gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend eingeengt. Es wurden 213 mg (75%) der Titelverbindung als beiger Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 714 (M+H)+.
Intermediat C76
N- [(Benzyloxy)carbonyl] -L-valyl-N- {( 1 S)-3 - [ {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-l-carboxypropyl}-L-alaninamid
Figure imgf000252_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C75 nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt (Spaltung der Teoc-Schutzgruppe mit Zinkchlorid, Acylierung mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und Esterspaltung mit Lithiumhydroxid in THF/Wasser).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.23 min; MS (ESIpos): m/z = 818 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 252 -
Intermediat C77
S^l l-{(lR) -[l-Ber^l-4-(2,5-difluo^henyl) H-pyrrol-2-yl]-2,2-dime lpro^
6, 12-dioxo- -oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-(4-tert-butoxy-4-oxobutanoyl)-L-cystein
Figure imgf000253_0001
4- tert-Butoxy-4-oxobutansäure (8.39 mg, 48.1 μιηοΐ) wurde in 1.0 mL DMF vorgelegt, mit 7.37 mg (48.1 μιηοΐ) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat, 15.5 mg ((48.1 μιηοΐ) (Benzotriazol-1- yloxy)bisdimethylaminomethyliumfluoroborat und 8.60 μΐ (48.1 μmol) Ν,Ν- Diisopropylethylamin versetzt und 10 Minuten bei RT gerührt. 40.0 mg (0.048 mmol) S-(l 1-{(1R)- l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-
5- oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) wurden in 1.0 mL DMF vorgelegt, mit 25.4 μΐ (141.9 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt, zum Ansatz gegeben und 4 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 35.0 mg (83 %> d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.76 min; MS (ESIpos): m/z = 873 [M+H]+
BHC 15 1 040-A - 253 -
Intermediat C78
11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl- 6, 12-dioxo-5-oxa-7 11 -diaza-2-silapentadecan- 15-säure
Figure imgf000254_0001
197 mg (0.354 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[3-({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)propyl]carbamat (siehe Synthese Intermediat Cl l) wurden in 5.0 mL Dichlormethan vorgelegt und auf 40°C erhitzt. Bei dieser Temperatur wurden 240 μΐ (3.0 mmol) Pyridin und 220 μΐ (1.8 mmol) Methyl-4-chlor-4-oxobutanoat zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Dann wurden 240 μΐ (3.0 mmol) Pyridin und 220 μΐ (1.8 mmol) Methyl-4-chlor-4- oxobutanoat zugegeben und 1 hbei RT gerührt. Dann wurden 240 μΐ (3.0 mmol) Pyridin und 220 μΐ (1.8 mmol) Methyl-4-chlor-4-oxobutanoat zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde je dreimal mit 5%iger KHSCvLösung extrahiert. Die organische Phase wurde mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 74.1 mg (31 % d. Th.) Methyl- 11-{(1R)-1-[1- benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 7,11 -diaza-2-silapentadecan-l 5-oat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.49 min; MS (ESIpos): m/z = 670 [M+H]+
78.3 mg (117 μιηοΐ) Methyl-l l-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silapentadecan-15-oat wurden in 4.0 mL THF vorgelegt, mit 800 μΐ Methanol, 160 μΐ Wasser und 230 μΐ (230 μιηοΐ) wässriger LiOH- Lösung (IM) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, BHC 15 1 040-A - 254 -
MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 64.8 mg (85 %> d. Th.) der Titel Verbindung. LC-MS (Methode 12): Rt = 2.61 min; MS (ESIneg): m/z = 654 [M-H]"
Intermediat C79
Trifluoressigsäure 2-(trimethylsilyl)ethyl-3 -amino-N-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2- silaheptadecan- 17- l)-D-alaninat (1 :1)
Figure imgf000255_0001
57.4 mg (81.8 μιηοΐ) 1 l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pynol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermediat C69) wurden in 5.7 mL DMF vorgelegt, mit 74.0 mg (164 μιηοΐ) Trifluoressigsäure 2- (trimethylsilyl)ethyl-3-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-D-alaninat (1 :1) (Intermediat L75), 43 μΐ (250 μmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 62.2 mg (164 μιηοΐ) HATU versetzt und 1 h bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 %> TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 52.4 mg (63 %> d. Th.) der Verbindung 2- (Trimethylsilyl)ethyl-N-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12,17-trioxo-5-oxa-14-thia-7,l l-diaza-2-silaheptadecan-17-yl)-3- { [(benzyloxy)carbonyl]amino} -D-alaninat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.64 min; MS (ESIpos): m/z = 1022 [M]+ BHC 15 1 040-A - 255 -
Unter Argon wurden 6.23 mg (27.7 μιηοΐ) Palladium(II)acetat: in 3.0 ml Dichloromethan vorgelegt, mit 12 μΐ^ (83 μιηοΐ) Triethylamin und 89 μΐ^ (550 μmol) Triethylsilan versetzt und 5 Minuten, gerührt. Dann wurden 56.7 mg (55.5 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N-(l 1- {(1 )-1 -[1 - benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5- oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-3- { [(benzyloxy)carbonyl]amino} -D-alaninat in 3.0 mL Dichloromethan zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Der Ansatz wurde bis fast zur Trockene eingeengt, mit Acetonitril/Wasser versetzt, filtriert und mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 37.4 mg (67 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 12): ): Rt = 2.15 min; MS (ESIpos): m/z = 888 [M+H]+ Intermediat C80
S-(l l-{(lR) -[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl- 6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N- [ 15-(glycylamino)-4,7, 10,13- tetraoxapentadec -l-oyl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000256_0001
Unter Argon, wurden 43.4 mg (95.1 μιηοΐ) l-({N-[(Benzyloxy)carbonyl]glycyl}amino)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-säure (Intermediat L90) in 2.5 ml DMF vorgelegt, mit 14.6 mg (95.1 μιηοΐ) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat, 30.5 mg (95.1 μιηοΐ) (Benzotriazol-1 - yloxy)bisdimethylaminomethyliumfluoroborat und 16.5 μΐ (95.1 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt und 10 min gerührt. 79.0 mg (95.1 μιηοΐ) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13- BHC 15 1 040-A - 256 - yl)-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) wurden in 2.5 ml DMF gelöst mit 49.5μ1 (285.3 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt und zum Ansatz gegeben. Die Reactionmischung wurde 2 h bei RT gerührt und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 44.2 mg (40 % d. Th.) der Verbindung S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl- 6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N- [ 15-( {N- [(benzyloxy)carbonyl]glycyl}amino)-4,7,10,13-tetraoxapentadecan-l-oyl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.57 min; MS (ESIpos): m/z = 1156 [M+H]+
60.2 mg (52.1 μιηοΐ) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-[ 15 -( {N- [(benzyloxy)carbonyl]glycyl}amino)-4,7,10,13-tetraoxapentadecan-l-oyl]-L-cystein wurden in 3.0 mL Ethanol suspendiert und mit 6.0 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) versetzt und bei RT 1 h lang mit Wasserstoff unter Normaldruck hydriert. Zweimal wurden 6.0 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) versetzt und bei RT 1 h lang mit Wasserstoff unter Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Reaktionsmischung im Vakuum vom Lösemittel befreit und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 29.4 mg (50 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 5): Rt = 3.77 min; MS (ESIpos): m/z = 1021 [M+H]+ Intermediat C81
(R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluor - 1 -cyclohexylmethanamin
Figure imgf000257_0001
Eine Lösung von 3.12 ml (6.24 mmol) Dimethylzink in Toluol (2.0 M) unter Argon bei -78 °C wurde mit 18.7 ml (37.45 mmol) Cyclohexylmagnesiumchlorid in Diethylether (2M) versetzt und BHC 15 1 040-A - 257 - die Mischung wurde 30 Minuten bei -78 °C gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 5.0 g (12.48 mmol) (R)-N-{(E/Z)-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- yrrol-2-yl]methylen}-2- methylpropan-2-sulfinamid in THF bei -78 °C zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei dieser Temperatur gerührt und dann 4 h bei RT. Dann wurden bei -78 °C mL ges. Ammoniumchlorid-Lösung zugegeben und die Reaktionsmischung wurde auf RT kommen lassen. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Ethylacetat/Cyclohexan 25:75). Man erhielt 1.59 g (26% d. Th.) der Zwischenstufe erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.76 min; MS (ESIneg): m/z = 483 [M-H]"
264.0 mg (0.54 mmol) dieser Zwischenstufe wurden in 0.5 mL 1,4-Dioxan unter Argon vorgelegt und dann mit 1.36 mL HCl in 1,4-Dioxan-Lösung (4.0 M) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan versetzt und mit einer wäs.lM Natriumhydroxid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Methanol/Dichlornethan 98:2). Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst und mit einer Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 148 mg (72% d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 13): Rt = 2.07 min; MS (ESIpos): m/z = 364 [M-NH2]+
BHC 15 1 040-A - 258 -
Intermediat C82
2-(Trime lsilyl)e l-(3-{[(R)-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2- yl](cyclohexyl)methyl]amino}propyl)carbamat
Figure imgf000259_0001
Eine Lösung von 503.0 mg (1.32 mmol) l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-l- cyclohexylmethanamin (Intermediat C81) in 1.4 ml Dichlormethan unter Argon wurde mit 392.2 mg (1.85 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid und 91.29 mg (1.52 mmol) Essigsaüre versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 574.6 (2.38 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-oxopropyl)carbamat in Dichlormethan hinzugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach Zugabe von 143 mg (0.66 mmol) 2- (Trimethylsilyl)ethyl-(3-oxopropyl)carbamat wurde die Mischung noch 2 h weiter gerührt. Das Reaktionsmgemisch wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde je zweimal mit ges. Natriumcarbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt g (50% d. Th.) der Titelverbindung. Man erhielt 488 g (63 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.89 min; MS (ESIpos): m/z = 582 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 259 -
Intermediat C83
2-(Trime lsilyl)e l-(3-{[(R)-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2- yl](cyclohexyl)methyl](chloracetyl)amino}propyl)carbamat
Figure imgf000260_0001
Zur eine Lösung von 487.9 mg (0.84 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-{[(R)-[l-benzyl-4-(2,5- difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl](cyclohexyl)methyl]amino}propyl)carbamat (Intermediat C82) in 8.40 ml Dichlormethan mit Mol Sieb 4 Ä wurden 280.0 mg (2.77 mmol) Triethylamin und 397.8 mg (3.52 mmol) Chloracetylchlorid zugegeben und das Reakionsgemisch wurde 6 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. Ammoniumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 470 mg (85 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.88 min; MS (ESIpos): m/z = 680 (M+Na)+.
BHC 15 1 040-A - 260 -
Intermediat C84
S-{l l-[(R)-[l-Ber^l-4-(2,5-difluo^hen^^
6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl} -L-cystein
Figure imgf000261_0001
322.1 mg (2.66 mmol) L-Cystein wurden in 0.19 mL Wasser zusammen mit 319.0 mg (3.80 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 250.0 mg (0.38 mmol) 2- (Trimethylsilyl)ethyl-(3 - { [(R)-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2- yl](cyclohexyl)methyl](chloracetyl)amino}propyl)carbamat (Intermediat C83) gelöst in 1.90 mL z'so-Propanol und 693.8 mg (4.56 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 276 mg (97 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.34 min; MS (ESIpos): m/z = 744 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 261 -
Intermediat C85
S-{l l-[(R)-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo^henyl) H-pyrrol-2-yl](cyclohexyl)me l]-2,2-dim^ 6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl}-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)hexanoyl] -L-cy stein
Figure imgf000262_0001
Zu einer Mischung von 100 mg (0.13 mmol) S-{ 1 l-[(R)-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl](cyclohexyl)methyl]-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl}- L-cystein (1 :1) (Intermediat C84) und 41.5 mg ( 0.13 mmol) l-{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]- 6-oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion in 4.0 ml DMF wurden 34.8 mg ( 0.27 mmol) N,N- diisopropylethylamin hinzugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei RT gerührt. Die Mischung wurde ohne Aufarbeitung mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 88 mg (70% d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.71 min; MS (ESIpos): m/z = 936 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 262 -
Intermediat C86 l l-[(R)-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo^heny^^
dioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure
Figure imgf000263_0001
Eine Mischung von 220.0 mg (0.33 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-{[(R)-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl] (cy clohexyl)methyl] (chloracetyl)amino } propyl)carbamat
(Intermediat C83) und 39.02 mg (0.37 mmol) 3-Sulfanylpropansäure in 7.45 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 161.65 mg (1.17 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriummsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 201 mg (83 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.72 min; MS (ESIneg): m/z = 726 (M-H)\
BHC 15 1 040-A - 263 -
Intermediat C87
2-(Trimethylsilyl)ethyl-{13-[(R^
yl](cyclohexyl)methyl]-l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^
triazahexadecan- 16-yl } carbamat
Figure imgf000264_0001
Zu einer Lösung von 100 mg (0.14 mmol) l l-[(R)-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2- yl](cyclohexyl)methyl]-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l l-diaza-2-silaheptadecan-17- säure (Intermediat C87) in 1.37 ml DMF wurden 54.18 mg (0.28 mmol) N-(2-Aminoethyl)-2-
(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetamid (Intermediat LI), 71.01 mg (0.50 mmol) N,N- diisopropylethylamin, 104.46 mg (0.27 mmol) HATU und 0.23 ml (0.14 mmol) l-Hydoxy-7-
Azabenzotriazole 0.5 M in DMF hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 5 h bei RT gerührt.
Die Mischung wurde ohne weitere Aufarbeitung mittels wurde mittels präparative HPLC gereinigt.
Man erhielt 41 mg (33 % d. Th ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.61 min; MS (ESIpos): m/z = 907 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 264 -
Intermediat C88 iert-Butyl-3 -[( {(1 R)-l -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino)methyl]pyrrolidin^ (1
Mischung aus Stereoisomeren
Figure imgf000265_0001
Eine Lösung von 2.04 g (5.75 mmol) (lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropan-l -amin in 51 ml Dichlormethan wurde mit 1.71 g (8.05 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid und 0.40 g (6.61 mmol) Essigsaüre versetzt und die Reaktionsgemisch wurde 5 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 1.32 g (6.61 mmol) tert- Butyl-3-formylpyrrolidin-l-carboxylat in 20 ml Dichlormethan hinzugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde je zweimal mit ges. Natriumcarbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.86 g (50% d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.99 min; MS (ESIpos): m/z = 538 (M+H-CF3C02H)+. BHC 15 1 040-A Intermediat C89 iert-Butyl-3- {[ {(1R)-1 -[1 -06ηζγ1-4-(2,5-(1ίΑυο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} (chloracetyl)amino]methyl}pyrrolidin- 1 -carboxylat
Figure imgf000266_0001
Eine Lösung von 2.89 g (4.19 mmol, 80 Reinheit) von tert-Butyl-3-[({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl] -2,2-dimethylpropyl } amino)methyl]pyrrolidin- 1 -carboxylat (Intermediat C90) in 42 ml Dichlormethan mit Molsieb 4 Ä wurde mit 1.36 g (13.42 mmol) Triethylamin und 2.13 g (18.87 mmol) Chloracetylchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei RT 5 h gerührt. Die Mischung wurde einrotiert und der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 449 mg (17 % d. Th.) von Isomere 1 und 442 mg (17 % d. Th) von Isomere 2 der Titelverbindung.
Isomer 1 LC-MS (Methode 12): Rt = 2.74 min; MS (ESIpos): m/z = 636 (M+NH4 +)+. Isomer 2 LC-MS (Methode 12): Rt = 2.78 min; MS (ESIpos): m/z = 636 (M+NH4 +)+. BHC 15 1 040-A - 266 -
Intermediat C90
S-[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo^
butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-L-cystein (Isomer 1)
Figure imgf000267_0001
357.3 mg (0.58 mmol) L-Cystein wurden in 2.3 mL Wasser zusammen mit 488.7 mg (4.07 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 357.0 mg (0.58 mmol tert-Butyl-3-{[{(lR)-l - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2- dimethylpropyl } (chloracetyl)amino]methyl } Pyrrolidin- 1 -carboxylat (Isomer 1 )
(Intermediat C91, Isomer 1) in 23.0 mL z'so-Propanol gelöst und 1.06 g (6.98 mmol) 1,8- Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 255.0 mg (62 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.09 min; MS (ESIpos): m/z = 699 (M+H) BHC 15 1 040-A - 267 -
Intermediat C91
S-[2^{(lR) -[l-Benzyl-4^2,5-difluo^he^^
butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-L-cystein (Isomer 2)
Figure imgf000268_0001
453.5 mg (3.74 mmol) L-Cystein wurden in 2.1 mL Wasser zusammen mit 449.2 mg (5.35 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 3287.4 mg (0.54) mmol tert-Butyl-3-{[{(lR)- 1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]methyl}pyrrolidin-l-carboxylat (Intermediat C91, Isomer 2) in 21.1 mL zso-Propanol gelöst und 0.98 g (6.42 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 221.0 mg (59 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.12 min; MS (ESIpos): m/z = 699 (M+H) BHC 15 1 040-A Intermediat C92
S-[2^{(lR) -[l-Benzyl-4^2,5-difluo^he^
butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoeth^
pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-cy stein (Isomer 1)
Figure imgf000269_0001
Eine Mischung von 50 mg ( 0.07 mmol) S-[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[l-(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-L- cystein (Intermediat C92) und 22.06 mg (0.07 mmol) l-{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-6- oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion in 3.3 ml DMF wurde mit 18.49 mg (0.14 mmol) N,N- Diisopropylethylamin versetzt und das Reaktionsgemisch wurde bei RT 45 Minuten gerührt. Die Mischung wurde ohne Aufarbeitung mittels mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 65 mg (100 % d. Th, 71 % Reinheit) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.31 min; MS (ESIpos): m/z = 892 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 269 -
Intermediat C93
S-[2^{(lR) -[l-Benzyl-4^2,5-difluo^he^
butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoeth^
pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-cy stein (Isomer 2)
Figure imgf000270_0001
Eine Mischung von 50.0 mg ( 0.07 mmol) S-[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[l-(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2- oxoethyl]-L-cystein (Intermediat C93) und 22.06 mg (0.07 mmol) l-{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l - yl)oxy]-6-oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion in 3.0 ml DMF wurde mit 18.49 mg (0.14 mmol) N,N- Diisopropylethylamin versetzt und das Reaktionsgemisch wurde bei RT 90 Minuten gerührt. Die Mischung wurde ohne Aufarbeitung mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 63 mg (98 % d. Th, 73 % Reinheit)der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 892 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 270 -
Intermediat C94
S-[2^{(lR) -[l-Benzyl-4^2,5-difluo^he^
butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoeth^
l-yl)acetyl]-L-cystein (Isomer 1)
Figure imgf000271_0001
Eine Mischung von (50.0 mg, 0.07 mmol) S-[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[(3R)-l-(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2- oxoethyl]-L-cystein (Intermediat C92) und 18.0 mg (0.07 mmol) -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l- yl)oxy]-2-oxoethyl}-lH-pyrrol-2,5-dion in 3.3 ml DMF wurde mit 18.5 mg (0.14 mmol) N,N- Diisopropylethylamin versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit ges. NEUCl-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Man erhielt 57 mg (81 % d. Th, 85 % Reinheit) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.96 min; MS (ESIpos): m/z = 836 (M+H) BHC 15 1 040-A - 271 -
Intermediat C95
3 - { [2-( {( 1 R)- 1 - [ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} { [ 1 -(tert- butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]sulfanyl}propansäure (Isomer 1)
Figure imgf000272_0001
Eine Mischung von 384.0 mg (0.62 mmol) tert-Butyl-3-{[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]methyl}pyrrolidin-l-carboxylat
(Intermediat C91, Isomer 1) und 73.0 mg (0.69 mmol) 3-Sulfanylpropansäure in 14 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 302.5 mg (2.19 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 358.0 mg (84 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.33 min; MS (ESIpos): m/z = 684 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 272 -
Intermediat C96
3 - { [2-( {( 1 R)- 1 - [ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} { [ 1 -(tert- butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]sulfanyl}propansäure (Isomer 2)
Figure imgf000273_0001
Eine Mischung von 287.0 mg (0.45 mmol) tert-Butyl-3-{[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]methyl}pyrrolidin-l-carboxylat
(Intermediat C91, Isomer 2) und 54.6 mg (0.51 mmol) 3-Sulfanylpropansäure in 14 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 226.0 mg (1.64 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 318.7 mg (88 % d. Th., 88 % Reinheit) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.36 min; MS (ESIpos): m/z = 684 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 273 -
Intermediat C97 tert-Butyl-3 - [2- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} - 14-
(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-3,8,13-trioxo-5^
1 -carboxylat (Isomer 2)
Figure imgf000274_0001
Zu einer Lösung von 25.0 mg (0.04 mmol) von 3-{[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} { [ 1 -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3 -yl]methyl} amino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propansäure (Intermediat C102) in 2.81 ml DMF unter Argon wurden 14.17 mg (0.11 mmol) Ν,Ν-diisoprylethylamin und 27.80 mg (0.07 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 22.75 mg (0.07 mmol) N-(2-Aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetamid -ethan (1 :1) Trifluoressigsäure (Intermediat LI) in 1.4 ml DMF und 5 mg (0.04 mmol) N,N- diisopropylethylamin hinzugegeben und das Gemisch wurde ü.N bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 318.7 mg (88 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 5): Rt = 4.39 min; MS (ESIpos): m/z = 863 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 274 -
Intermediat C98 tert-Butyl-3-[2- {(1R) -[1 -benzyl-4-(2,5^
(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-y^
carboxylat (Isomer 2)
Figure imgf000275_0001
Zu einer Lösung von 25.0 mg (0.04 mmol) von 3-{[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} { [ 1 -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3 -yl]methyl} amino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propansäure (Intermediat C102) in 2.81 ml DMF unter Argon wurden 14.17 mg (0.11 mmol) Ν,Ν-diisoprylethylamin und 27.80 mg (0.07 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 37.30 mg (0.07 mmol) N-(2-Aminoethyl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanamid -ethan (1 :1) Trifluoressigsäure in 1.4 ml DMF und 5 mg (0.04 mmol) N,N-diisopropylethylamin hinzugegeben und das Gemisch wurde ÜN bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Man erhielt 318.7 mg (88 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 5): Rt = 4.54 min; MS (ESIpos): m/z = 919 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 275 -
Intermediat C99 tert-Butyl-3 - [2- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -24- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-1 -yl)-3,8, 19-trioxo-l 2, 15-dioxa-5-thia-2,9, 18-triazatetracos-l- yl]pyrrolidin-l-carboxylat (Isomer 2)
Figure imgf000276_0001
Zu einer Lösung von 25.0 mg (0.04 mmol) von 3-{[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} { [ 1 -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3 -yl]methyl} amino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propansäure (Intermediat C102) in 2.81 ml DMF unter Argon wurden 14.17 mg (0.11 mmol) Ν,Ν-diisoprylethylamin und 27.80 mg (0.07 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 35.05 mg (0.07 mmol) N-{2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl}-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)hexanamid -ethan (l :l)Trifluoressigsäure (Intermediat L82) in 1.4 ml DMF und 5 mg (0.04 mmol) Ν,Ν-diisopropylethylamin hinzugegeben und das Gemisch wurde ÜN bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 25 mg (36 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 4.52 min; MS (ESIpos): m/z = 1007 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 276 -
Intermediat C100
2-(Trimethylsilyl)ethyl-{(2S)-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-l-[(2-{[(2R)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)propanoyl] amino } ethyl)amino] - 1 -oxobutan-2-yl} carbamat
Figure imgf000277_0001
Zu einer Lösung von 45 mg (0.068 mmol) (2S)-4-[{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino) butansäure (Intermediat C58) in 5.8 ml DMF wurden 22.2 mg (0.068 mmol) (2R)-N-(2- aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)propanamid (1 :1) Trifluoressigsäure zugegeben. Nach 30 Minuten Rühren bei RT die Mischung wurde mit 39 mg (0.10 mmol) HATU und 36 mg (0.27 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei RT gerührt. Das Gemisch wurde ohne Aufarbeitung mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 7 mg (12 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.41 min; MS (ESIpos): m/z 851 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 277 -
Intermediat C101
Trifluoressigsäure -methyl-(2S)-4-[(acetoxyacetyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhι pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-aminobutanoat (1 :1)
Figure imgf000278_0001
4.3 g (12.2 mmol) von Intermediat C52 wurden in 525 mL DCM gelöst und mit 3.63 g (17.12 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie mit 8.4 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 3.23 g (11.85 mmol) Methyl-(2S)-4-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)butanoat (hergestellt aus (3S)-3-Amino-4-methoxy-4-oxobutansäure nach klassischen Methoden) gelöst in 175 mL DCM zugegeben und der Ansatz weitere 45 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit DCM verdünnt und zweimal mit 100 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und dann mit gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC aufgereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Einengen und Trocknen des Rückstandes im Hochvakuum erhielt man 4.6 g (61% d. Th.) des Intermediats.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.97 min; MS (ESIpos): m/z = 614.32 (M+H)+.
2.06 g (3.36 mmol) von diesem Intermediat wurden in 76 mL DCM vorgelegt und mit 0.81 mL (7.17 mmol) 2-Chlor-2-oxoethylacetat in Gegenwart von 2.1 ml Triethylamin acyliert. Nach 20 h Rühren bei RT wurden weitere 0.36 mL 2-Chlor-2-oxoethylacetat und 0.94 ml Triethylamin zugegeben und der Ansatz weitere 15 min bei RT gerührt. Anschließend wurde mit 500 mL Ethylacetat verdünnt und nacheinander zweimal mit 300 mL 5%-iger Zitronensäure, zweimal mit 300 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und einmal mit 100 mL gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt, dann über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Nach Trocknung im Hochvakuum wurden 2.17 g (79%o d. Th.) des geschützten Intermediats erhalten. BHC 15 1 040-A - 278 -
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.48 min; MS (ESIpos): m/z = 714 (M+H)+.
321 mg (0.342 mmol) von diesem Intermediat wurde in 7 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 279.5 mg (2.05 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 599 mg (2.05 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure und 2 mL einer 0.1 %igen Trifluoressigsäurelösung in Wasser hinzugegeben und der Ansatz anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 60 mg (26% d.Th.) der Titelverbindung erhalten, die noch einen Teil der de-acetylierten Verbindung enthielt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.91 min und 0.95 min; MS (ESIpos): m/z = 528 und 570 (M+H)
Intermediat C102
(2S)-4-[{(lR)-l -[l -Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}
(glycoloyl)amino]-2- {[(benzyloxy)carbonyl]amino}butansäure
Figure imgf000279_0001
Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl-(2S)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-4-oxobutanoat in Analogie zu Intermediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat acyliert und schließlich mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergruppen durchgeführt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.31 min; MS (ESIpos): m/z = 646 (M-H)\ BHC 15 1 040-A - 279 -
Intermediat C103
2-(Trimethylsilyl)ethyl-N-[2-({(2S)-2-amm^^
pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]-N2-{[2-(trimeth^ ethoxy] c
Figure imgf000280_0001
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von 151 mg (0.23 mmol) Intermediat C102 mit 128 mg (0.234 mmol) Intermediat L98 in DMF in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin hergestellt. Anschließend wurde die Z-Schutzgruppe durch 30-minütige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt, wobei die Titelverbindung erhalten wurde.
Ausb.: 30% d. Th. über 2 Stufen
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.14 min; MS (ESIpos): m/z = 929 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 280 -
Intermediat C104
2-(ΤήΜ6 ΐ8ί1γ1)6 1-(3Κ,4Κ)-3-[({(1Κ)-1-[1 -06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethyl ro yl}amino)methy -4-fluoφyrrolidin-l-carboxylat
Figure imgf000281_0001
Eine Lösung von 2.24 g (6.31 mmol) (lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropan-l -amin in 56.0 ml Dichlormethan mit Mol Sieb 4 Ä wurde mit 1.87 g (8.84 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid versetz, und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 2.20 g (7.58 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3R,4S)-3-fluor-4- formylpyrrolidin-l-carboxylat (Ref: WO 2014/151030A1) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 3.5 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurdemittels präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 1.39 g (24 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.15 min; MS (ESIpos): m/z = 600 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 281 -
Intermediat C105
2-(ΤήΜ6 18ί1γ1)6 1-(3Κ,4Κ)-3-{[{(1Κ) -[1-06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethyl ro yl}(chloracetyl)amino]methyl}-4-fluo yrrolidin-l-carboxylat
Figure imgf000282_0001
Zur eine Lösung von 692.8 mg (0.88 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3R,4R)-3-[({(lR)-l-[l- benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- yrrol-2-yl]-2,2-dimethyl ro yl}amino)methyl]-4- fhu^yrrolidin-l-carboxylat (Intermediat C104) in 8.7 ml Dichlormethan mit Mol Sieb 4 Ä wurden 295.0 mg (2.91 mmol) Triethylamin und 418.9 mg (3.71 mmol) Chloracetylchlorid zugegeben und das Reakionsgemisch wurde 2.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung und ges. Ammoniumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde nochmal in 8.7 ml Dichlormethan mit Mol Sieb 4 Ä wurden 295.0 mg (2.91 mmol) Triethylamin und 418.9 mg (3.71 mmol) Chloracetylchlorid zugegeben und das Reakionsgemisch wurde 3 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. Ammoniumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 691 mg (74 % d. Th., 64% Reinheit) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.78 min; MS (ESIpos): m/z = 676 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 282 -
Intermediat C106
3-{[2-({(1Κ)-1-[1-Β6ηζγ1-4-(2,5-ώΑυο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2-ά™6 1ρΓοργ1} {[(3Κ,4Κ)-4- f uor- 1 - { [2-(trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl}pyrrolidin-3 -yl]methyl} amino)-2- oxoethyl] sulfanyl } propansäur
Figure imgf000283_0001
Eine Mischung von 691.0 mg (0.65 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3R,4R)-3- {[ {(lR)-l- [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (chloracetyl)amino]methyl} -4-fluorpyrrolidin- 1 -carboxylat (Intermediat C105) und 76.3 mg (0.72 mmol) 3-Sulfanylpropansäure in 15 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 316 mg (2.29 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 502 mg (67 % d. Th., 65% Reinheit) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R = 1.48 min; MS (ESIneg): m/z = 744 (M-H)\ BHC 15 1 040-A - 283 -
Intermediat C107
S-[2-( {(1 R)-l -[ 1 -Β6ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2-ά™6 1ρΓοργ1} { [(3R,4R)-4- fluor- 1 - { [2-(trimethylsilyl)ethoxy] carto
Figure imgf000284_0001
203.6 mg (1.68 mmol) L-Cystein wurden in 0.95 mL Wasser zusammen mit 201.7 mg (2.40 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 170.0 mg (0.24 mmol 2- (Trimethylsilyl)ethyl-(3R,4R)-3 - { [ {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]methyl}-4-fluo yrrolidin-l-carboxylat (Intermediat 105) gelöst in 9.5 mL z'so-Propanol und 438.5 mg (2.40 mmol) und l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 152 mg (83 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.26 min; MS (ESIpos): m/z = 762 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 284 -
Intermediat C115
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH- yrrol-2-yl]-2,2-dimethyl ro yl} {[(2- carboxyethyl)sulfanyl]acetyl}amino)propyl]-L-alaninamid
Figure imgf000285_0001
11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl- 6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l l-diaza-2-silaheptadecan-17-säure (200 mg, 285 μιηοΐ) (Intermediat C69) wurde in 10 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (233 mg, 1.71 mmol) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch zweimal mit Zinkchlorid (233 mg, 1.71 mmol) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (1.50 g, 5.13 mmol) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 162 mg (85 % d. Th.) der Verbindung 3-({2-[(3- Aminopropyl) {(1 R)-l -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)propansäure -trifluoressigsäure (1 :1).
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.94 min; MS (ESIneg): m/z = 556 [M-H]"
3-({2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)propansäure -trifluoressigsäure (1 :1) (80.0 mg, 119 μιηοΐ) wurde in 5.0 ml DMF gelöst und mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alaninat (69.4 mg, 82 % Reinheit, 119 μιηοΐ) (Intermediat L88) und N,N-Diisopropylethylamin (41 μΐ, 240 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2h30 bei RT gerührt und mit Wasser (0.1%TFA) versetzt. Der Ansatz wurde aufkonzentriert und BHC 15 1 040-A - 285 - direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 82.2 mg (75 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.17 min; MS (ESIpos): m/z = 921 [M+H]+
Intermediat C116
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} [({3-[(2-carboxyethyl)amino]-3- oxopropyl } sulfanyl)acetyl] amino)propyl] -L-alaninamid
Figure imgf000286_0001
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-({(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[(2- carboxyethyl)sulfanyl]acetyl}amino)propyl]-L-alaninamid (56.7 mg, 61.6 μιηοΐ) (Intermediat C115) und tert-Butyl-beta-alaninathydrochlorid (1 :1) (13.4 mg, 73.9 μιηοΐ) in 3.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (28.1 mg, 73.9 μιηοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (32 μΐ, 180 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und dann direkt mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 41.4 mg (64 % d. Th.) der Verbindung N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl- N-( 14- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl- 4,8,13 -trioxo-3 -oxa- 11 -thia-7, 14-diazaheptadecan- 17-yl)-L-alaninamid.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.28 min; MS (ESIpos): m/z = 1048 [M+H]+
N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-N-( 14- {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-4,8,13-trioxo-3-oxa-l l-thia- BHC 15 1 040-A - 286 -
7,14-diazaheptadecan-17-yl)-L-alaninamid (39.3 mg, 37.5 μιηοΐ) wurde in 2.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (30.7 mg, 225 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (30.7 mg, 225 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsaeure (131 mg, 450 μιηοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 30 mg (81 % d. Th.) der titel Verbindung,
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.12 min; MS (ESIpos): m/z = 992 [M+H]+
Intermediat LI
Trifluoressigsäure-N-(2-aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetamid( 1 : 1 )
Figure imgf000287_0001
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)essigsäure und tert-Butyl-(2-aminoethyl) carbamat hergestellt.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.19 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.17 min; MS (ESIpos): m/z = 198 (M+H)+. Intermediat L2
Trifluoressigsäure-rel-(lR,2S)-2-amino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)ethyl] cyclopentancarboxamid( 1 :1)
Figure imgf000287_0002
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 50 mg (0.214 mmol) von kommerziell erhältlicher cis- 2-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]-l-cyclopentancarbonsäure mit 60 mg (0.235 mmol) von ebenso BHC 15 1 040-A - 287 - kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure— l -(2-aminoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion(l : l) durch Kupplung mit EDC/HOBT und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 36 mg (38% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt = 0.2 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.17 min; MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)+. Intermediat L3
Trifluoressigsäure-(l S,2R)-2-amino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)ethyl] cyclopentancarboxamid( 1 : 1)
Figure imgf000288_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 50 mg (0.214 mmol) von kommerziell erhältlicher (l S,2R)-2-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure mit 72 mg (0.283 mmol) von ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure— l-(2-aminoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion(l : l) durch Kupplung mit EDC/HOBT und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 13 mg (16% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt = 0.2 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.2 min; MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)+. Intermediat L4
Trifluoressigsäure-N-(2-aminoethyl)-4-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)cy clohexancarboxamid( 1 : 1)
Figure imgf000288_0002
BHC 15 1 040-A - 288 -
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlichem 1 - [(4- { [(2,5 -Dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxy] carbonyl } cy clohexyl)methyl] - 1 H-pyrrol-2,5 - dion und tert-Butyl-(2-aminoethyl) carbamat hergestellt.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.26 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.25 min; MS (ESIpos): m/z = 280 (M+H)+. Intermediat L5
Trifluoressigsäure-N- [4-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)phenyl] -beta-alaninamid( 1 :1)
Figure imgf000289_0001
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlichem l-(4-Aminophenyl)-lH-pyrrol-2,5-dion und N-(tert-Butoxycarbonyl)-beta-alanin hergestellt.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.22 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.22 min; MS (ESIpos): m/z = 260 (M+H)+. Intermediat L6
Trifluoressigsäure-tert-butyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L- alanyl-L-lysinat
Figure imgf000289_0002
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von kommerziell erhältlicher 6-(2,5-Dioxo- 2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexansäure mit dem nach klassischen Methoden der Peptidchemie BHC 15 1 040-A - 289 - hergestellten partiell geschützten Peptid tert-Butyl-L-valyl-L-alanyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L- lysinat in Gegenwart von EDC/HOBT hergestellt. Anschließend erfolgte die Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch Rühren in 5%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT, wobei in 37%iger Ausbeute die Titelverbindung erhalten wurde.
HPLC (Methode 1 1): Rt = 1.29 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.62 min; MS (ESIpos): m/z = 566 (M+H)+. Intermediat L7
Trifluoressigsäure— beta-alanyl-L-valyl-N5-carbamoyl-N-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)phenyl]-L-ornithinamid(l : 1)
Figure imgf000290_0001
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von kommerziell erhältlichem l-(4-Aminophenyl)-lH-pyrrol-2,5-dion durch sequentielle Kupplung mit N2-(tert-Butoxycarbonyl)-N5-carbamoyl-L-ornithin in Gegenwart von HATU, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l -yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-valinat, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l -yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-beta-alaninat und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 32 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt = 0.31 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.47 min; MS (ESIpos): m/z = 516 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 290 -
Intermediat L8
Trifluoressigsäure— L-alanyl-N5-carbamoyl-N- [4-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)phenyl]- L-ornithinamid( 1 :1)
Figure imgf000291_0001
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von kommerziell erhältlichem l-(4-Aminophenyl)-lH-pyrrol-2,5-dion durch sequentielle Kupplung mit N2-(tert-Butoxycarbonyl)-N5-carbamoyl-L-ornithin in Gegenwart von HATU, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-alaninat und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 171 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.23 min;
LC-MS (Methode 7): Rt = 0.3 min; MS (ESIpos): m/z = 417 (M+H)+. Intermediat L9
Trifluoressigsäure— beta-alanyl-L-valyl-N5-carbamoyl-N-[4-(2-methoxy-2-oxoethyl)phenyl]-L- ornithinamid(
Figure imgf000291_0002
Die Titelverbindung in Analogie zu Intermediat L7 ausgehend von kommerziell erhältlichem Methyl-(4-aminophenyl)acetat hergestellt. Es wurden 320 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.45 min; BHC 15 1 040-A - 291 -
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.48 min; MS (ESIpos): m/z = 493 (M+H)+. Intermediat L10
N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-L-alanyl-rel-N6- { [( 1 R,2S)-2- aminocyclopentyl]carbonyl}-L-lysin-trifluoressigsäure(l :2)
Figure imgf000292_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat L6 durch Kupplung mit cis-2-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]-l-cyclopentancarbonsäure mit EDC/HOBT und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 12 mg (52% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt = 1.45 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.73 min; MS (ESIpos): m/z = 677 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 292 -
Intermediat LH
N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-L-alanyl-N6- { [( 1 S,2R)-2- aminocyclopentyl]carbonyl}-L-lysin-trifluoressigsäure(l :2)
Figure imgf000293_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat L6 durch Kupplung mit (l S,2R)-2-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure mit EDC/HOBT und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 11 mg (39% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten. HPLC (Methode 11): Rt = 1.45 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.74 min; MS (ESIpos): m/z = 677 (M+H)+.
Intermediat L12
Trifluoressigsäure- 1 - [2-(2-aminoethoxy)ethyl] - 1 H-pyrrol-2,5-dion( 1 :1)
Figure imgf000293_0002
Zu 228 mg (1.12 mmol) tert-Butyl-[2-(2-aminoethoxy)ethyl]carbamat gelöst in 7 mL Dioxan/Wasser 1 :1 gelöst wurden 381 mg (2.46 mmol) Methyl-2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1-carboxylat gegeben. Dann wurden 1.2 mL einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat Lösung zugesetzt und der Ansatz bei RT gerührt. Nach insgesamt 5-tägigem Rühren bei 2 weiteren Zugaben von gleichen Mengen der Natriumhydrogencarbonat Lösung wurde der Ansatz durch BHC 15 1 040-A - 293 -
Ansäuern mit Trifluoressigsäure, Einrotieren und Reinigung des Rückstandes durch präparative HPLC aufgearbeitet. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand aus Acetonitril/Wasser 1 : 1 lyophilisiert.
Der Rückstand wurde in 3 mL Dichlormethan aufgenommen und mit 1 mL Trifluoressigsäure versetzt. Nach 15 min Rühren bei RT wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand aus Acetonitril/Wasser 1 : 1 lyophilisiert. So wurden 70 mg (67% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung als harziger Rückstand erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.2 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.18 min; MS (ESIpos): m/z = 185 (M+H)+. Intermediat L13
Trifluoressigsäure- ert-butyl-N2-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-lysinat(l :l)
Figure imgf000294_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)essigsäure mit tert-Butyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysinathydrochlorid(l :l) in Gegenwart von EDC/HOBT und anschließender schonender Abspaltung der tert-Butoxycarbonyl Schutzgruppe in Analogie zu Intermediat L6 hergestellt.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.42 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.43 min; MS (ESIpos): m/z = 340 (M+H)+. Intermediat L14
Trifluoressigsäure— 1 - [2-(4-aminopiperazin- 1 -yl)-2-oxoethyl]- 1 H-pyrrol-2,5-dion( 1 : 1 )
Figure imgf000294_0002
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat L2 über 2 Stufen aus tert-Butyl-piperazin-1- ylcarbamat und (2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)essigsäure hergestellt. BHC 15 1 040-A - 294 -
HPLC (Methode 11): Rt = 0.2 min;
LC-MS (Methode 3): Rt = 0.25 min; MS (ESIpos): m/z = 239 (M+H)+. Intermediat L15
Trifluoressigsäiu-e--N-(2-aminoethyl)-3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)ethoxy] ethoxy } ethoxy)propanamid( 1 :1)
Figure imgf000295_0001
2.93 g (10.58 mmol) tert-Butyl-3-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethoxy}propanoat wurden in 100 mL Dioxan/Wasser 1 :1 gelöst und mit 3.28 g (21.15 mmol) Methyl-2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l-carboxylat sowie einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 6-7 versetzt. Die Lösung wurde 30 min bei RT gerührt und anschließend wurde das 1 ,4-Dioxan im Vakuum abgedampft. Dann wurden 200 mL Wasser zugegeben und die Mischung dreimal mit jeweils 300 mL Ethylacetat ausgeschüttelt. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Nach Einengen wurde tert-Butyl-3-(2-{2- [2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)ethoxy]ethoxy}ethoxy)propanoat als braunes Öl erhalten, das anschließend im Hochvakuum getrocknet wurde.
HPLC (Methode 11): Rt = 1.5 min;
LC-MS (Methode 3): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 375 (M+NH4)+.
Dieses Intermediat wurde nach Standardverfahren (Entschützung mit TFA, Kupplung mit tert- Butyl-(2-aminoethyl)carbamat und erneute Entschützung mit TFA) in die Titelverbindung überführt.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.2 min;
LC-MS (Methode 3): Rt = 0.25 min; MS (ESIpos): m/z = 344 (M+H) BHC 15 1 040-A - 295 -
Intermediat L16
N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-N5-carbamoyl-L-ornithin
Figure imgf000296_0001
Zu einer Lösung von 266 mg (1.33 mmol) L-Valyl-N5-carbamoyl-L-ornithin in 24 mL DMF wurden 535 mg (1.73 mmol) von kommerziell erhältlichem l-{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]- 6-oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion sowie 930 mL NN-Diisopropylethylamin hinzugegeben. Der Ansatz wurde 24 h im Ultraschallbad behandelt und anschließend im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Der verbliebene Rückstand wurde mittels präparativer HPCL gereinigt und nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Trocknung des Rückstandes im Hochvakuum verblieben 337 mg (50% d.Th.) der Titelverbindung.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.4 min;
LC-MS (Methode 3): Rt = 0.58 min; MS (ESIpos): m/z = 468 (M+H)+.
Intermediat L17
Trifluoressigsäure--tert-butyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N5- carbamoyl-L-ornithyl-L-lysinat( 1 :1)
Figure imgf000296_0002
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von 172 mg (0.37 mmol) Intermediat LI 6 und 125 mg (0.37 mmol) tert-Butyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysinat hydrochlorid(l :l) in BHC 15 1 040-A - 296 -
Gegenwart von EDC/HOBT und NN-Diisopropylethylamin und anschließende Entschützung der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 2h Rühren in 10%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt. Nach Gefriertrocknung aus Acetonitril/ Wasser wurden 194 mg (49% d.Th.) der Titelverbindung über 2 Stufen erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt = 1.1 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.58 min; MS (ESIpos): m/z = 652 (M+H)+. Intermediat L18
Trifluoressigsäure— beta-alanyl-L-alanyl-N5-carbamoyl-N-[4-(2-methoxy-2-oxoethyl)phenyl]-L- ornithinamid( 1 :1)
Figure imgf000297_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Methyl-(4-aminophenyl)acetat analog Intermediat L7 sequentiell nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Anknüpfung von N2-(tert- Butoxycarbonyl)-N5-carbamoyl-L-ornithin in Gegenwart von HATU, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-alaninat, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-beta-alaninat und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 330 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.29 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.41 min; MS (ESIpos): m/z = 465 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 297 -
Intermediat L19
Trifluoressigsäiu-e--L-alanyl-N5-carbamoyl-N-(4-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino}phenyl)-L-ornithinamid(l : 1 )
Figure imgf000298_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 1,4 Phenylendiamin sequentiell nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. Im ersten Schritt wurden 942 mg (8.72 mmol) 1,4 Phenylendiamin mit 0.8 g (2.9 mmol) N2-(tert-Butoxycarbonyl)-N5-carbamoyl-L-ornithin in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropylethylamin monoacyliert. Im zweiten Schritt wurde in analoger Weise die zweite anilinische Aminogruppe mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropylethylamin acyliert. Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-alaninat und erneute Entschützung mit TFA führten dann in 3 weiteren Syntheseschritten zur Titelverbindung, von der auf diesem Weg 148 mg erhalten wurden.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.21 min; MS (ESIpos): m/z = 474 (M+H)+. LC-MS (Methode 4): Rt = 0.2 min; MS (ESIpos): m/z = 474 (M+H)+.
Intermediat L20
Trifluoressigsäure-L-valyl-N5-carbamoyl-N-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)phenyl]-L- ornithinamid( 1 :1)
Figure imgf000298_0002
BHC 15 1 040-A - 298 -
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie analog zu Intermediat L8 ausgehend von kommerziell erhältlichem l-(4-Aminophenyl)-lH-pyrrol-2,5-dion durch sequentielle Kupplung mit N2-(tert-Butoxycarbonyl)-N5-carbamoyl-L-ornithin in Gegenwart von HATU, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)- L-valinat und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 171 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.28 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.39 min; MS (ESIpos): m/z = 445 (M+H)+. Intermediat L21
L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-N-[4-(2-methoxy-2-oxoethyl)phenyl]-L-lysinamid
Figure imgf000299_0001
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von kommerziell erhältlichem 0.42 g (2.56 mmol) Methyl-(4-aminophenyl)acetat durch sequentielle Kupplung mit N6-(tert-Butoxycarbonyl)-N2-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-lysin in Gegenwart von HATU, und NN-Diisopropylethylamin, Entschützung mit Piperidin, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-valinat in Gegenwart von NN-Diisopropyl- ethylamin und anschließende hydrogenolytische Abspaltung der Benzyloxycarbonylschutzgruppe über 10%-Palladium- Aktivkohle. Es wurden 360 mg (32% d.Th. über 4 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt = 1.5 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.73 min; MS (ESIpos): m/z = 493 (M+H) BHC 15 1 040-A - 299 -
Intermediat L22
Trifluoressigsäure— N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-valyl-N-{4-[(2S)-2- methoxy-3 -oxopropyl]phenyl } -N5-carbamoyl-L-ornithinamid( 1 :1)
Figure imgf000300_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von N-(tert-Butoxycarbonyl)-4-nitro-L-phenylalanin sequentiell nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. 2.5 g (8.06 mmol) von diesem Edukt wurde im ersten Schritt zunächst in das Caesiumsalz und dann mit lodmethan in DMF in den Methylester überführt.
Hydrogenolytisch wurde dann in Methanol über 10% Palladium- Aktivkohle die Nitrogruppe in eine Aminogruppe überführt.
Die so generierte Aminogruppe wurde dann mit N5-Carbamoyl-N2-[(9H-fluoren-9- ylmethoxy)carbonyl]-L-ornithin in DMF in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropylethylamin acyliert. Im nächsten Schritt wurde die Fmoc-Gruppe mit Piperidin in DMF abgespalten.
Anschließend erfolgte in DMF die Kupplung mit N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-valin in Gegenwart von l-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid, 1 -Hydro xy-lH- benzotriazol-Hydrat und NN-Diisopropylethylamin und schließlich die Abspaltung der tert- Butoxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure.
HPLC (Methode 11): Rt = 1.6 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.77 min; MS (ESIpos): m/z = 673 (M+H)+. Intermediat L23
Trifluoressigsäure-N- [2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)ethyl] -beta-alaninamid( 1 :1)
Figure imgf000300_0002
BHC 15 1 040-A - 300 -
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure— 1-(2- aminoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion(l :l) durch Kupplung mit N-(tert-Butoxycarbonyl)-beta-alanin in Gegenwart von EDCI/HOBT und NN-Diisopropylethylamin und anschließende Entschützung mit Trifluoressigsäure hergestellt.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.19 min.
Intermediat L24
Trifluoressigsäure- 1 -amino-N- [2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)ethyl]
cy clopropancarboxamid( 1 :1)
Figure imgf000301_0001
114 mg (0.67 mmol) von kommerziell erhältlicher l-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]cyclopropan carbonsäure wurden in 25 mL DCM gelöst und mit 110 mg (0.623 mmol) von kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure— 1 -(2 -aminoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion(l :l) sowie mit 395 μΐ NN- Diisopropylethylamin versetzt und auf -10°C abgekühlt. Dann wurden 217 mg (0.793 mmol) 2- Brom-l-ethylpyridiniumtetrafluoroborat zugegeben und der Ansatz 2 h bei RT gerührt. Anschließend wurde mit Ethylacetat verdünnt und nacheinander mit 10%-iger Zitronensäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung un gesättigter Natriumchloridlösubng ausgeschüttelt, dann über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Nach Trocknung im Hochvakuum wurden 152 mg des geschützten Intermediats erhalten.
Diese wurden anschließend in 10 mL DCM aufgenommen und mit 1 mL Trifluoressigsäure entschützt. Nach Lyophilisation aus Acetonitril/Wasser wurden 158 mg (71% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.19 min.
LC-MS (Methode 3): Rt = 0.98 min; MS (ESIpos): m/z = 224 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 301 -
Intermediat L25
N- [31 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-29-oxo-4,7, 10,13,16,19,22,25-octaoxa-28- azahentriacontan- 1 -oyl] -L-valyl-L-alanin
Figure imgf000302_0001
31.4 mg (0.17 mmol) Valyl-L-alanin wurden in 3.0 mL DMF gelöst und mit 115.0 mg (0.17 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-N-{27-[(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-27-oxo- 3,6,9,12,15, 18,21,24-octaoxaheptacos-l -yl}propanamid und mit 33.7 mg (0.0.33 mmol) Triethylamin versetzt. Es wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 74.1 mg (58 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.61 min; MS (ESIpos): m/z = 763 [M+H]+.
Intermediat L26
L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin
Figure imgf000302_0002
BHC 15 1 040-A - 302 -
600.0 mg (1.58 mmol) N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 25.0 mL Wasser/Ethanol/THF (1 :1 :0.5) suspendiert und mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 5 h hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Lösemittel im Vakuum verdampft. Die erhaltene Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.42 min; MS (ESIpos): m/z = 247 [M+H]+.
180 mg (0.73 mmol) N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 5.0 mL DMF gelöst und mit 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin versetzt. Dann wurden 254.6 mg (0.73 mmol) 2,5-Dioxopyrrolidin- l-yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-valinat und 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionslösung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 294.1 mg (76 % d. Th.) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L- lysin.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.97 min; MS (ESIpos): m/z = 480 [M+H]+.
272.2 mg (0.57 mmol) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 20.0 mL Ethylacetat/Ethanol/THF (1 :1 :1) vorgelegt und mit 27.2 mg Palladium auf Aktivkohle versetzt. Man hydrierte mit Wasserstoff bei RT unter Normaldruck 5 h. Es wurde mit Hilfe von Celite(R) abfiltriert und der Filterkuchen mit
Ethylacetat/Ethanol/THF (1 :1 :1) nachgewaschen. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Titelverbindung (182 mg, 72 % d. Th.) wurde in der nächsten Reaktionsstufe ohne weitere Reinigung eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.53 min; MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H]+.
BHC 15 1 040-A - 303 -
Intermediat L27
N- [31 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-29-oxo-4,7, 10,13,16,19,22,25-octaoxa-28- azahentriacontan- 1 -oyl] -L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin
Figure imgf000304_0001
30 mg (0.07 mmol) L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin (Intermediat L26)
und 46.1 mg (0.07 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-N-{27-[(2,5-dioxopyrrolidin- l-yl)oxy]-27-oxo-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxaheptacos-l-yl}propanamid wurden in 1.5 mL DMF vorgelegt und mit 6.8 mg (0.07 mmol) 4-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionslösung rührte bei RT über Nacht. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 55.6 mg (90 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.77 min; MS (ESIpos): m/z = 920 [M+H]+.
BHC 15 1 040-A - 304 -
Intermediat L28 tert-Butyl-3 -formyl-4-( { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)pyrrolidin- 1 -carboxylat
Figure imgf000305_0001
461.7 mg (1.15 mmol) l-tert-Butyl-3-ethyl-4-({[2-
(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)pyrrolidin-l,3-dicarboxylat (Diese Verbindung wurde gemäß Literaturvorschrift WO 2006/066896 hergestellt) wurden in 5.0 mL absol. Dichlormethan vorgelegt und auf -78 °C abgekühlt. Dann wurde langsam 326.2 mg (2.29 mmol) Diisobutylaluminiumhydrid-Lösung (1 M in THF) zugetropft und 2 h bei -78 °C gerührt (Dünnschichtchromatographische Kontrolle (Petrolether/Ethylacetat = 3:1). Es wurden 1.3 g (4.59 mmol) Kaliumnatriumtartrat gelöst in 60 mL Wasser zugetropft und die Reaktionsmischung auf RT kommen gelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die wässrige Phase dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 629.0 mg der Titelverbindung als Rohprodukt, welches ohne weitere Reinigung sofort in der nächsten Reaktionsstufe eingesetzt wurde.
BHC 15 1 040-A - 305 -
Intermediat L29 tert-Butyl-3-formyl-4-[({[2-(trimethylsilyl)em^
Mischung aus Diastereomeren.
Figure imgf000306_0001
807.1 mg (2.34 mmol) tert-Butyl-3-({[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)-4- (hydroxymethyl)pyrrolidin-l-carboxylat (Die Herstellung erfolgte gemäß der Literaturvorschrift WO 2006/100036) wurden in 8.0 mL Dichlormethan vorgelegt und 236.4 mg (2.34 mmol) Triethylamin zugegeben. Bei 0 °C wurden 267.6 mg (2.34 mmol) Methansulfonsäurechlorid zugetropft und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Es erfolgte eine weitere Zugabe von 133.8 mg (1.17 mmol) Methansulfonsäurechlorid und 118.2 mg (1.17 mmol) Triethylamin. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase je einmal mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung, 5%iger Kaliumhydrogensulfat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 50 g SNAP, Fluss 66 mL/min, Cyclohexan/Ethylacetat). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 402.0 mg (41 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-3-({[tert- butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)-4-{[(methylsulfonyl)oxy]methyl}pyrrolidin-l-carboxylat LC-MS (Methode 1): Rt = 1.38 min; MS (ESIpos): m/z = 424 [M+H]+.
400.0 mg (0.94 mmol) tert-Butyl-3-({[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)-4- {[(methylsulfonyl)oxy]methyl}pyrrolidin-l-carboxylat wurden in 5.0 mL DMF vorgelegt und mit 98.2 mg (1.51 mmol) Natriumazid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 h bei 40 °C gerührt. BHC 15 1 040-A - 306 -
Dann wurden nochmals 30.7 mg (0.47 mmol) Natriumazid zugegeben und weitere 10 h bei 40 °C gerührt. Es wurde Ethylacetat zugegeben und die organsiche Phase mehrmals mit Wasser gewaschen. Nach der Trocknung der organischen Phase über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 309.5 mg (89 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-3-(azidomethyl)-4-({[tert- butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)pyrrolidin-l-carboxylat. Die Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.50 min; MS (ESIpos): m/z = 371 [M+H]+.
250 mg (0.68 mmol) tert-Butyl-3-(azidomethyl)-4-({[tert- butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)pyrrolidin-l-carboxylat wurden in 10.0 mL Ethylacetat/Ethanol (1 :1) gelöst und mit 25.0 mg Palladium auf Aktivkohle (10%) versetzt. Man hydrierte mit Wasserstoff bei RT unter Normaldruck 8 h. Die Reaktion wurde über Celite^' filtiert und der Filterkuchen intensiv mit Ethylacetat gewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 226.2 mg (82 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-3 -(aminomethyl)-4-( { [tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)pyrrolidin- 1 -carboxylat. Die Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 345 [M+H]+.
715.0 mg (2.08 mmol) tert-Butyl-3-(aminomethyl)-4-({[tert- butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)pyrrolidin-l -carboxylat wurden in 15.0 mL THF gelöst und mit 2.28 mL (2.28 mmol) TBAF-Lösung (IM in THF) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei RT über Nacht gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand (1.54 g) ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.41 min; MS (ESIpos): m/z = 231 [M+H]+.
1.54 g (4.88 mmol) tert-Butyl-3-(aminomethyl)-4-(hydroxymethyl)pyrro lidin- 1 -carboxylat wurden in 1,4-Dioxan vorgelegt mit 541.8 mg (4.88 mmol) Calciumchlorid (wasserfrei) und 488.6 mg (4.88 mmol) Calciumcarbonat versetzt und kräftig gerührt. Dann wurden 592.8 mg (5.86 mmol) Triethylamin und 1.52 g (5.86 mmol) l -({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidin-2,5- dion zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Es wurden 644.9 mg (10.7 mmol) HOAc und Ethylacetat zugegeben. Die organische Phase wurde zweimal mit Wasser und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lsöemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand mittels Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol = 100:1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und BHC 15 1 040-A - 307 - der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 346.9 mg (19 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-3 -(hydroxymethyl)-4 - [( { [2 -(trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl } amino)methyl]pyrrolidin- 1 - carboxylat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.08 min; MS (ESIpos): m/z = 375 [M+H]+.
804.0 mg (2.15 mmol) tert-Butyl-3-(hydroxymethyl)-4-[({[2-
(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)methyl]pyrrolidin-l -carboxylat wurden in 20.0 mL Chloroform und 20.0 mL 0.05 N Kaliumcarbonat/0.05 N Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 : 1) vorgelegt. Dann wurden 59.7 mg (0.22 mmol) Tetra-n-butylammoniumchlorid, 429.9 mg (3.22 mmol) N-Chlorsuccinimid und 33.5 mg (0.22 mmol) TEMPO zugegeben und die Reaktionsmischung kräftig über Nacht bei RT gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt und im Vakuum vom Lösemittel befreit. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Lausfmittel: Cyclohexan/Ethylacetat = 3:1) gereinigt. Man erhielt 517.0 mg (46 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): Rt = 1.13 min; MS (ESIpos): m/z = 373 [M+H]+.
Intermediat L30 tert-Butyl-3-({[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)-4-formylpyrrolidin-l -carboxylat
Mischung aus Stereoisomeren
Figure imgf000308_0001
250.0 mg (0.72 mmol) tert-Butyl-3-({[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)-4- (hydroxymethyl)pyrrolidin-l -carboxylat (Die Verbindung wurde gemäß der Literaturvorschrift WO2006/100036 hergestellt.) wurde in 12.5 mL Dichlormethan/DMSO (4:1) vorgelegt und mit 219.6 mg (2.17 mmol) Triethylamin versetzt. Bei 2 °C wurde 345.5 mg (2.17 mmol) Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex portionsweise zugegeben und 3 h bei 2 °C gerührt. Es wurden nochmals 345.5 mg (2.17 mmol) Schwefeltrioxid- Pyridin-Komplex portionsweise zugegeben und BHC 15 1 040-A - 308 -
17 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde zwischen Dichlormethan und Wasser verteilt. Die wässrige Phase wurde dreimal mit Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen einmal mit Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt (Dünnschichtchromatographie: Petrolether/Ethylacetat 7:3).
Intermediat L31
Di-tert-butyl- { [(tert-butoxycarbonyl)amino]methyl}malonat
Figure imgf000309_0001
Zu 600 mL Wasser wurden 57.2 g (488.27 mmol) tert-Butylcarbamat, 51.2 mL (683.57 mmol) einer 37%-igen Lösung von Formaldehyd in Wasser und 25.9 g (244.13 mmol) Natriumcarbonat addiert. Das Gemisch wurde erwärmt, bis eine Lösung entstand und dann bei RT für 16 h gerührt. Die entstandene Suspension wurde mit 500 mL Dichlormethan extrahiert, die organische Phase abgetrennt, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Es wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet, wobei ein kristalliner Feststoff anfällt. Der Rückstand wurde in 1000 mL absoluten THF aufgenommen und bei RT ein Gemisch aus 322 mL (3.414 mol) Essigsäureanhydrid und 138 mL (1.707 mol) Pyridin zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde bei RT für 16 h gerührt und anschließend am Rotationsverdampfer eingenegt, wobei das Wasserbad Raumtemperatur hatte. Der Rückstand wurde in Diethylether aufgenommen und drei mal mit einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung sowie ein mal mit einer gesättigten Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand 2 d im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in 2000 mL absolutem THF aufgenommen und unter Eiskühlung mit 456 mL (456.52 mmol) einer 1 M Lösung von Kalium-tert-butanolat in THF versetzt. Es wurde 20 Min. bei 0°C gerührt und anschließend BHC 15 1 040-A - 309 -
100.8 g (456.52 mmol) Di-tert-butylmalonat gelöst in 200 mL absolutem THF zugetropft. Es wurde 48 h bei RT gerührt und anschließend Wasser addiert. Das Reaktionsgemisch wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und in 500 mL Essigsäureethylester aufgenommen. Das Gemisch wurde mit 500 mL Wasser und 100 mL einer gesättigten Natriumchlorid-Lösung gewaschen und die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mittels Filtration über Kieselgel (Eluent: Cylohexan/Essigsäureethylester, Gradient = 30:1 —► 5:1) gereinigt. Es wurden 37.07 g (22% d. Th.) der Zielverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 6): Rt = 2.87 min; MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H]+.
Intermediat L32 tert-Butyl-[3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)propyl]carbamat
Figure imgf000310_0001
37.0 g (107.11 mmol) Di-tert-butyl-(acetoxymethyl)malonat wurden in 1000 mL absolutem THF gelöst und unter Eiskühlung mit 535.5 mL (1071.10 mmol) einer 2 M Lösung von Lithiumborhydrid in THF tropfenweise versetzt. Es wurden 19.3 mL (1071.10 mmol) Wasser zugetropft und 4.5 h bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in 1500 mL Essigsäureethylester aufgenommen und mit 100 mL Wasser versetzt und 30 Min. unter Wasserkühlung gerührt (leicht exotherm). Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase zwei mal mit 500 mL Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 20.7 g (94% d. Th.) der Zeilverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 6): Rt = 1.49 min; MS (EIpos): m/z = 106 [M-C5H802] BHC 15 1 040-A - 310 -
Intermediat L33 tert-Butyl- [3 - { [tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy } -2-(hydroxymethyl)propyl]carbamat
Figure imgf000311_0001
20.00 g (97 A4 mmol) tert-Butyl-[3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)propyl]carbamat wurden in 1000 mL absolutem Dichlormethan gelöst und bei RT mit 6.63 g (91 A4 mmol) Imidazol sowie 16.16 g (107.18 mmol) tert-Butyl(chlor)dimethylsilan versetzt. Es wurde 16 h bei RT gerührt und das Reaktionsgemisch mit halbkonzentrierter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Essigsäureethylester extrahiert und die vereinigten oranischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 28.50 g (92% d. Th.) der Zielverbindung erhalten.
'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 0.02 (s, 6H), 0.86 (s, 9H), 1.37 (s, 9H), 1.58-1.73 (m, 1H), 2.91 (q, 2H), 3.33-3.36 [m, (2H, verdeckt)], 3.53-3.58 (m, 2H), 6.65-6.72 (m, 1H).
Intermediat L34 tert-Butyl-(3 - { [tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy } -2-formylpropyl)carbamat
Figure imgf000311_0002
BHC 15 1 040-A - 31 1 -
12.65 g ( 39.591 mmol) tert-Butyl-[3-{[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy} -2-(hydroxymethyl)pro- pyl]carbamat wurden in 200 mL Dichlormethan gelöst und bei RT mit und mit 19.31 g (45.53 mmol) Dess-Martin-Periodinan gelöst in 150 mL Dichlormethan tropfenweise versetzt. Das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 250 mL einer halbkonzentrierten Natriumhydrogencarbonat-Lösung sowie mit 250 mL einer 10%-igen Natriumthiosulfat-Lösung versetzt, und für 20 Min. gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 300 mL Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 1 1.35 g ( 90% d. Th.) der Zielverbindung erhalten.
'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 0.02 (s, 6H), 0.84(s, 9H), 1.36 (s, 9H), 1.48-1.51 (m, 1H), 3.08-3.32 [m, (1H, verdeckt)], 3.50-3.58 (m, 2H), 3.81 -3.91 (m, 1H), 6.71 (t, 1H), 9.60 (d, 1H).
Intermediat L35 tert-Butyl-(3 -oxopropyl)carbamat
Figure imgf000312_0001
Die Titelverbindung wurde nach literaturbekannten Verfahren hergestellt (z.B. Jean Bastide et al. J. Med. Chem. 2003, 46(16), 3536-3545).
BHC 15 1 040-A - 312 - Intermediat L36
N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N5-carbamoyl-L-ornithin
Figure imgf000313_0001
100 mg (0.57 mmol) N5-Carbamoyl-L-ornithin wurden in 4.0 mL DMF aufgenommen und mit 0.08 mL (0.57 mmol) Triethylamin versetzt. Dann wurden 199.0 mg (0.57 mmol) 2,5- Dioxopyrrolidin-l-yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-valin und 0.08 mL (0.57 mmol) Triethylamin zugesetzt. Es wurde 48 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP- HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser mit 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 75.7 mg (33 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.69 min; MS (ESIpos): m/z = 409 [M+H]+.
Intermediat L37
L-Valyl-N5 -carbamoyl-L-
Figure imgf000313_0002
BHC 15 1 040-A - 313 -
75.7 mg (0.19 mmol) von Intermediat L36 wurden in 25 mL Wasser/Ethanol/THF suspendiert und mit 7.5 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) versetzt und bei RT 4.5 h lang mit Wasserstoff unter Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Reaktionsmischung im Vakuum vom Lösemittel befreit und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt. Man erhielt 64.9 mg (93 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 6): Rt = 0.25 min; MS (ESIpos): m/z = 275 [M+H]+.
Intermediat L38
N- [31 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-29-oxo-4,7, 10,13,16,19,22,25-octaoxa-28- azahentriacontan- 1 -oyl] -L-valyl-N5-carbamoyl-L-ornithin
Figure imgf000314_0001
38.3 mg (0.14 mmol) von Intermediat L37 wurden in 3.0 mL DMF vorgelegt und mit 96.4 mg (0.14 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-N- {27-[(2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxy]- 27-oxo-3,6,9,12,15, 18,21,24-octaoxaheptacos-l-yl}propanamid und mit 39.0 μΐ^ (0.28 mmol) Triethylamin versetzt. Es wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend mit 16.0 μΐ^ (0.28 mmol) HOAc versetzt und direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 58.9 mg (45 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.61 min; MS (ESIpos): m/z = 849 [M+H]+. BHC 15 1 040-A - 314 -
Intermediat L39
2-(Trimethylsilyl)ethyl-(2-sulfanylethyl)carbamat
Figure imgf000315_0001
300 mg (2.64 mmol) 2-Aminoethanthiolhydrochlorid (1 :1) wurden in 3.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 668.0 mg (6.60 mmol)Triethylamin mit 719.1 mg (2.77 mmol) l-({[2- (Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidin-2,5-dion versetzt. Es wurde 2 Tage bei RT gerührt. (Dünnschichtchromatographische Kontrolle: Dichlormethan/Methanol = 100:1.5) Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde zweimal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Einsatz der Verbindung ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe.
Intermediat L40
N- [31 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-29-oxo-4,7, 10,13,16,19,22,25-octaoxa-28- azahentriacontan- 1 -oyl] -L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin
Figure imgf000315_0002
BHC 15 1 040-A - 315 -
600 mg (1.58 mmol) N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 25.0 mL Wasser/Ethanol/THF (1 :1 :0.5) mittels Palladium auf Kohle (10 %) bei RT unter Normaldruck mit Wasserstoff hydriert. Die Verbindung N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysin wird ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.99 min; MS (ESIpos): m/z = 247 [M+H]+.
180.0 (0.73 mmol) N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 5.0 mL DMF gelöst und mit 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin versetzt. Es wurden 254.6 mg (0.73 mmol) 2,5-Dioxopyrrolidin-l- yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-valinat und 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 294.1 mg (76 % d. Th.) der Verbindung N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert- butoxycarbonyl)-L-lysin.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.97 min; MS (ESIpos): m/z = 480 [M+H]+.
272.2 mg (0.57 mmol) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 20 mL Ethylacetat/Ethanol/THF (1 :1 :1) gelöst und mit 27.2 mg Palladium auf Aktivkohle versetzt und unter Normaldruck und bei RT mit Wasserstoff hydriert. Es wurde über Celite(R) filtriert und der Filterkuchen intensiv mit Ethylacetat/Ethanol/THF (1 :1 :1) gewaschen. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 182.0 mg (72 % d. Th.) der Verbindung L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.53 min; MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H]+.
30.0 mg (0.07 mmol) L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin und 46.1 mg (0.07 mmol) 3-(2,5- Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-N-{27-[(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-27-oxo- 3,6,9,12,15, 18,21,24-octaoxaheptacos-l -yl}propanamid wurden in 1.5 mL DMF gelöst und mit 6.8 mg (0.07 mmol) 4-Methylmorpholin versetzt. Dir Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 55.6 mg (90 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.77 min; MS (ESIpos): m/z = 920 [M+H]+. BHC 15 1 040-A - 316 -
Intermediat L41
N- [ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo-4,7, 10, 13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 - oyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin
Figure imgf000317_0001
600 mg (1.58 mmol) N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 25.0 mL Wasser/Ethanol/THF (1 :1 :0.5) mittels Palladium auf Kohle (10 %) bei RT unter Normaldruck mit Wasserstoff hydriert. Die Verbindung N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysin wird ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.99 min; MS (ESIpos): m/z = 247 [M+H]+.
180.0 (0.73 mmol) N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 5.0 mL DMF gelöst und mit 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin versetzt. Es wurden 254.6 mg (0.73 mmol) 2,5-Dioxopyrrolidin-l- yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-valinat und 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum BHC 15 1 040-A - 317 - getrocknet. Man erhielt 294.1 mg (76 % d. Th.) der Verbindung N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl- N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.97 min; MS (ESIpos): m/z = 480 [M+H]+.
272.2 mg (0.57 mmol) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 20.0 mL Ethylacetat/Ethanol/THF (1 :1 :1) gelöst und mit 27.2 mg Palladium auf Aktivkohle versetzt und unter Normaldruck und bei RT mit Wasserstoff hydriert. Es wurde über Celite(R) filtriert und der Filterkuchen intensiv mit Ethylacetat/Ethanol/THF (1 :1 :1) gewaschen. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 182.0 mg (72 % d. Th.) der Verbindung L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.53 min; MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H]+.
30.0 mg (0.07 mmol) L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin und 34.3 mg (0.07 mmol) 3-(2,5- Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-N-{15-[(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-l 5-oxo-3,6,9,12- tetraoxapentadec-l-yl}propanamid wurden in 1.5 mL DMF gelöst und mit 6.8 mg (0.07 mmol) 4- Methylmorpholin versetzt. Dir Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 40.6 mg (82 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): Rt = 0.73 min; MS (ESIpos): m/z = 744 [M+H]+.
BHC 15 1 040-A - 318 - Intermediat L42
N- [ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo-4,7, 10, 13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 - oyl] -L- valyl-N5 -carbamoyl-L-ornithin
Figure imgf000319_0001
50.0 mg (0.18 mmol) L-Valyl-N5-carbamoyl-L-ornithin (Intermediat L37) wurden in DMF vorgelegt und mit 93.6 mg (0.18 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-N-{15-[(2,5- dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadec-l-yl}propanamid und 36.9 mg (0.37 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung rührte bei RT über Nacht. Es wurden 21.9 mg (0.37 mmol) HOAc hinzugefügt und die Reaktionsmischung direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 20.6 mg (14 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.55 min; MS (ESIpos): m/z = 673 [M+H]+.
Intermediat L43
N-[67-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-65-oxo-
4,7,10,13, 16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-icosaoxa-64-azaheptahexacontan-l- oyl] -L-valyl-N5 -carbamoyl-L-ornithin BHC 15 1 040-A - 319 -
Figure imgf000320_0001
11.3 mg (0.04 mmol) L-Valyl-N5-carbamoyl-L-ornithin (Intermediat L37) wurden in DMF vorgelegt und mit 50.0 mg (0.04 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-N-{63-[(2,5- dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-63-oxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60- icosaoxatrihexacont-l-yl}propanamid und 8.3 mg (0.08 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung rührte bei RT über Nacht. Es wurden 4.9 mg (0.08 mmol) HOAc hinzugefügt und die Reaktionsmischung direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 15.8 mg (20 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 4): Rt = 0.94 min; MS (ESIpos): m/z = 1377 [M+H]+.
Intermediat L44
N-[19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-l 7-oxo-4,7, 10,13-tetraoxa-l 6-azanonadecan-l- oyl] -L- valyl-L-alanin
Figure imgf000320_0002
BHC 15 1 040-A - 320 -
73.3 mg (0.39 mmol) L-Valyl-L-alanin wurden in 7.0 mL DMF gelöst und mit 200.0 mg (0.39 mmol) 3 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-1 -yl)-N- { 15-[(2,5-dioxopyrrolidin-l -yl)oxy]- 15-oxo- 3,6,9,12-tetraoxapentadec-l-yl}propanamid und 78.8 mg (0.78 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei RT über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 103.3 mg (45 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.58 min; MS (ESIpos): m/z = 587 [M+H]+.
Intermediat L45 tert-Butyl-(2S)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-oxobutanoat
Figure imgf000321_0001
2.00 g (7.26 mmol) tert-Butyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-homoserinat wurden in 90 ml Dichlormethan gelöst und dann mit 1.76 ml Pyridin sowie mit 4.62 g (10.90 mmol) 1,1,1- Triacetoxy-llambda5,2-benziodoxol-3(lH)-on (Dess-Martin-Periodinan) versetzt. Der Ansatz wurde 2 h bei RT gerührt, anschließend mit 200 ml Dichlormethan verdünnt und zweimal mit 10%- iger Natriumtiosulfat-Lösung und dann nacheinander zweimal mit 5%-iger Zitronensäure und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit 100 ml Diethylether und Cyclohecan (v/v=l :l) versetzt, etwas eingeengt, wobei ein weißer Niederschlag ausfiel. Dieser wurde abgesaugt. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet, wobei 1.74 g (88% d. Th.) der Zielverbindung als hellgelbes Öl erhalten wurden.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 274 [M+H]+. BHC 15 1 040-A - 321 -
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 1.38 (s, 18H), 2.64-2.81 (m, 2H), 4.31-4.36 (m, 1H), 7.23 (d, 1H), 9.59 (s, 1H).
Intermediat L46
Trifluoressigsäure--tert-butyl-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro
Figure imgf000322_0001
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von 200 mg (0.79 mmol) Trifluoressigsäure- -l-(2-aminoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion(l :l) mit 263 mg (0.87 mmol) (4S)-5-tert-Butoxy-4-[(tert- butoxycarbonyl)amino]-5-oxopentansäure-trifluoressigsäure(l :l) in Gegenwart von EDC/HOBT und NN-Diisopropylethylamin und anschließende Entschützung der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch lh Rühren in 10%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt. Nach Gefriertrocknung aus Acetonitril/ Wasser wurden 85 mg (20% d.Th.) der Titelverbindung über 2 Stufen erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.37 min; MS (ESIpos): m/z = 326 [M+H]+. Intermediat L47
Trifluoressigsäure— beta-alanyl-L-alanyl-N5-carbamoyl-N-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)phenyl]-L-ornithinamid(l : 1)
Figure imgf000322_0002
BHC 15 1 040-A - 322 -
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von Intermediat L8 mit 2,5-Dioxopyrrolidin- (tert-butoxycarbonyl)-beta-alaninat und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 3): Rt = 1.36 min; MS (ESIpos): m/z = 488 (M+H)
Intermediat L48
Trifluoressigsäure-(lR,2S)-2-amino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)ethyl] cyclopentancarboxamid( 1 :1)
Figure imgf000323_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (1R, 2S)-2-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure in Analogie zu Intermediat L2 hergestellt.
LC-MS (Methode 3): Rt = 1.22 min; MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)+. Intermediat L49
Trifluoressigsäure— tert-b l
Figure imgf000323_0002
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von kommerziell erhältlichem
Bromessigsäureanhydrid mit dem nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellten partiell geschützten Peptid tert-Butyl-L-valyl-L-alanyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysinat in BHC 15 1 040-A - 323 -
Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin in Dichlormethan hergestellt. Anschließend erfolgte die Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch Rühren in 10%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT, wobei in 49%-iger Ausbeute über 2 Stufen die Titelverbindung erhalten wurde.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.09 min; MS (ESIpos): m/z = 593 und 595 (M+H)+. Intermediat L50
Trifluoressigsäure-(l S,3R)-3-amino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)ethyl] cyclopentancarboxamid( 1 :1)
Figure imgf000324_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (lS,3R)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure-l-(2-aminoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion(l :l) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.2 min;
LC-MS (Methode 3): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)+. Intermediat L51
Trifluoressigsäure-( 1 R,3R)-3 -amino-N- [2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)ethyl] cyclopentancarboxamid( 1 :1) BHC 15 1 040-A - 324 -
Figure imgf000325_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (lR,3R)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure-l-(2-aminoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion(l :l) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 3): Rt = 0.98 min; MS (ESIpos): m/z = 250 (M-H)\
Intermediat L52
Trifluoressigsäure— N-(2-aminoethyl)-2-bromacetamid (1 :1)
Figure imgf000325_0002
420 mg (2.62 mmol) tert-Butyl-(2-aminoethyl)carbamat wurden in 50 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 817 mg (3.15 mmol) Bromessigsäureanhydrid sowie 913 μΐ (5.24 mmol) NN-Diisopropylethylamin versetzt. Der Ansatz wurde 1 h bei RT gerührt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde duch präparative HPLC gereinigt.
Es wurden 577 mg der geschützten Zwischenstufe erhalten, die anschließend in 50 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 10 ml Trifluoressigsäure versetzt wurde. Nach 1 h Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus Acentonitril/Wasser lyophilisert. So wurden 705 mg (65% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 3): Rt = 0.34 min; MS (ESIpos): m/z = 181 und 183 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 325 -
Intermediat L53
Trifluoressigsäure-( 1 S,3 S)-3-amino-N- [2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)ethyl] cyclopentancar 1 :1)
Figure imgf000326_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (l S,3S)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure-1 -(2 -aminoethyl)-l H-pyrrol -2,5-dion(l :l) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.19 min;
LC-MS (Methode 3): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 250 (M-H)\ Intermediat L54
Trifluoressigsäure-( 1 R,3 S)-3 -amino-N- [2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)ethyl] cyclopentancarboxamid( 1 :1)
Figure imgf000326_0002
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (lR,3S)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem BHC 15 1 040-A 326
Trifluoressigsäure--l-(2-aminoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion(l :l) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 3): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)+. Intermediat L55
Trifluoressigsäure-tert-butyl-N6-D-alanyl-N2-{N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)hexanoyl] -L-valyl-L-alanyl } -L-lysinat (1 :1)
Figure imgf000327_0001
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von Intermediat L6 mit N-(tert- Butoxycarbonyl)-D-alanin in Gegenwart von HATU und anschließender Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 90 minütiges Rühren in 5%iger
Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt.
HPLC (Methode 11): Rt = 1.35 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.67 min; MS (ESIpos): m/z = 637 (M+H)+.
Intermediat L56
Trifluoressigsäure -tert-butyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)hexanoyl]-L-valyl-L- alanyl-N6- { [( 1 R,3 S)-3 -aminocyclopentyl] carbonyl} -L-lysinat (1 :1) BHC 15 1 040-A 327
Figure imgf000328_0001
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von Intermediat L6 mit (lR,3S)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure in Gegenwart von HATU und anschließender Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 15 minütiges Rühren in 25%-iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt.
HPLC (Methode 11): Rt = 1.4 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.7 min; MS (ESIpos): m/z = 677 (M+H)+. Intermediat L57
Methyl-(2S)-4-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoat
Figure imgf000328_0002
500.0 mg (2.72 mmol) L-Asparaginsäuremethylester Hydrochlorid und 706.3 mg (2.72 mmol) 2- (Trimethylsilyl)ethyl-2,5-dioxopyrrolidin-l-carboxylat wurden in 5.0 mL 1,4-Dioxan vorgelegt und mit 826.8 mg (8.17 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 583.9 mg (74 % d. Th.) der Verbindung (3S)-4-Methoxy-4-oxo-3-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino) butansäure.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (ESIneg): m/z = 290 (M-H)\ BHC 15 1 040-A - 328 -
592.9 mg (3S)-4-Methoxy-4-oxo-3-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butansäure wurden in 10.0 mL 1 ,2-Dimethoxyethan vorgelegt und auf -15 °C abgekühlt und mit 205.8 mg (2.04 mmol) 4-Methylmorpholin und 277.9 mg (2.04 mmol) Isobutylchlorformiat versetzt. Der Niederschlag wird nach 15 min abgesaugt und zweimal mit je 10.0 mL 1 ,2-Dimethoxyethan gewaschen. Das Filtrat wird auf -10 °C abgekühlt und mit 115.5 mg (3.05 mmol) Natriumborhydrid gelöst in 10 mL Wasser unter starkem Rühren versetzt. Die Phasen werden getrennt und die organische Phase je einmal mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 515.9 mg (91 % d. Th.) der Verbindung Methyl-N- { [2-(trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl} -L-homoserinat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 278 (M+H)+.
554.9 mg (2.00 mmol) Methyl-N- {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L-homoserinat wurden in 30.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 1.27 g (3.0 mmol) Dess-Martin periodinan und 474.7 mg (6.00 mmol) Pyridin versetzt. Man rührte über Nacht bei RT. Nach 4 h wurde der Ansatz mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase je dreimal mit 10%iger Na2S203-Lösung, 10%iger Citronensäure-Lösung und ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Man erhielt 565.7 mg (97 % d. Th.) der Titelverbindung.
'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.91 (m, 2H), 2.70-2.79 (m, 1H), 2.88 (dd, 1H), 3.63 (s, 3H), 4.04 (m, 2H), 4.55 (m, 1H), 7.54 (d, 1H), 9.60 (t, 1H).
Intermediat L58
2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-oxopropyl)carbamat
Figure imgf000329_0001
BHC 15 1 040-A - 329 -
434.4 mg (5.78 mmol) 3-Amino-l-propanol und 1.50 g (5.78 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-2,5- dioxopyrrolidin-l-carboxylat wurden in 10.0 mL Dichlormethan gelöst und mit 585.3 mg (5.78 mmol) Triethylamin versetzt und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase mit Wasser und ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-hydroxypropyl)carbamat (996.4 mg, 79 % d. Th.) wurde im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
807.0 mg (3.68 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-hydroxypropyl)carbamat wurden in 15.0 mL Chloroform und 15.0 mL 0.05 N Kaliumcarbonat/0.05 N Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 : 1) vorgelegt. Dann wurden 102.2 mg (0.37 mmol) Tetra-n-butylammoniumchlorid, 736.9 mg (5.52 mmol) N-Chlorsuccinimid und 57.5 mg (0.37 mmol) TEMPO zugegeben und die Reaktionsmischung kräftig über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt (890.3 mg).
Intermediat L59
Trifluoressigsäure- 1 - {2- [2-(2-aminoethoxy)ethoxy] ethyl} - 1 H-pyrrol-2,5-dion( 1 : 1 )
Figure imgf000330_0001
300.0 mg (0.91 mmol) tert-Butyl-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)ethoxy]ethoxy}ethyl)carbamat wurden in Dichlormethan vorgelegt und mit 4.2 g (36.54 mmol) TFA versetzt und 1 h bei RT gerührt (DC -Kontrolle: Dichlormethan/Methanol 10: 1). Die flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand viermal mit Dichlormethan kodestilliert. Der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.19 min; MS (ESIpos): m/z = 229 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 330 -
Intermediat L60
6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoylchlorid
Figure imgf000331_0001
200.0 mg (0.95 mmol) 6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexansäure wurden in 4.0 mL Dichlormethan gelöst und mit 338.0 mg (2.84 mmol) Thionylchlorid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei RT gerührt und dann mit 1 Tropfen DMF vesetzt. Es wurde nochmal 1 h gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und es wurde dreimal mit Dichlormethan kodestilliert. Das Rohprodukt wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
Intermediat L61
Trifluoressigsäure -2-(trimethylsilyl)ethyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]- L-valyl-L-alanyl-L-lysinat (1 :1)
Figure imgf000331_0002
Zunächst wurde ausgehend von N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2-(Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP, Hydrogenolyse, Kupplung mit N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und erneute Hydrogenolyse) das Tripeptidderivat 2-Trimethylsilyl)ethyl-L- valyl-L-alanyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysinat hergestellt. Die Titelverbindung wurde durch Kupplung dieses partiell geschützten Peptidderivats mit kommerziell erhältlicher 6-(2,5-Dioxo-2,5- dihydro-lH-pyrrol-l -yl)hexansäure in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropylethylamin hergestellt. Anschließend erfolgte die Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden BHC 15 1 040-A - 331 -
Bedingungen durch 2.5 stündiges Rühren in 5%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT unter Erhalt der Esterschutzgruppe. Nach Aufarbeitung und Reinigung durch präparative HPLC wurden 438 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt = 1.69 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.78 min; MS (ESIpos): m/z = 610 (M+H)
Intermediat L62
Trifluoressigsäure -2-(trimethylsilyl)ethyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)h
L-valyl-N5-carbamoyl-L-ornithyl-L-lysinat (1 :1)
Figure imgf000332_0001
Zunächst wurde ausgehend von N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin nach klassischen Methoden der Peptidchemie 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L- lysinat hergestellt. 148 mg (0.43 mmol) von diesem Intermediat wurden dann in Gegenwart von 195 mg (0.51 mmol) HATU und 149 μΐ^ NN-Diisopropylethylamin mit 200 mg (0.43 mmol) von Intermediat LI 6 gekuppelt. Nach Einengen und Reinigung des Rückstandes mittels präparativer HPLC wurde das geschützte Intermediat in 20 mL DCM aufgenommen und durch Zugabe von 2 mL Trifluoressigsäure und 1 h Rühren bei RT die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgruppe abgelöst. Nach Einengen und Lyophilisation des Rückstandes aus Acetonitril/Wasser wurden 254 mg (63% d. Th. über 2 Stufen) erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt = 1.51 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.68 min; MS (ESIpos): m/z = 696 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 332 -
Intermediat L63
(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]amino}-3- methylbutanoyl]amino }propanoyl]amino } -5-oxo-5 -[2-(trimethylsilyl)ethoxy]pentansäure
Figure imgf000333_0001
Zunächst wurde ausgehend von (2S)-5-(Benzyloxy)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-5- oxopentansäure nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP, Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure, Kupplung mit N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und Hydrogenolyse in Methanol über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle) das Tripeptidderivat (4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-Amino-3-methylbutanoyl]amino}propanoyl]amino}-5- oxo-5-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]pentansäure hergestellt. Die Titelverbindung wurde durch Kupplung dieses partiell geschützten Peptidderivats mit kommerziell erhältlichem l -{6-[(2,5- Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-6-oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion hergestellt. Nach Aufarbeitung und Reinigung durch präparative HPLC wurden 601 mg der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.96 min; MS (ESIpos): m/z = 611 (M+H)+.
Intermediat L64
(4S)-4-{[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]amino}-5-oxo-5-[2-(trimethylsilyl)ethoxy] pentansäure
Figure imgf000333_0002
BHC 15 1 040-A - 333 -
Die Titelverbindung wurde ausgehend von (2S)-5-(Benzyloxy)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-5- oxopentansäure nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP, Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure, hydrogenolytische Spaltung des Benzylesters in Methanol über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle und Kupplung mit l-{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-2-oxoethyl}- lH-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin) hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 385 (M+H)+.
Intermediat L65
Trifluoressigsäure— 2-(trimethylsilyl)ethyl-3 - { [(benzyloxy)carbonyl]amino } -L-alaninat (1 :1)
Figure imgf000334_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 3-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-N-(tert- butoxycarbonyl)-L-alanin nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure hergestellt. Man erhielt 373 mg (79 % d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.72 min; MS (ESIpos): m/z = 339 (M+H)
Intermediat L66
Methyl-(8S)-8-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-6,l l-dioxo-5-oxa-7,10-diaza-2-silatetradecan-14-oat
Figure imgf000334_0002
OH BHC 15 1 040-A - 334 -
1000 mg (2.84 mmol) (3S)-3-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-4-[(tert-butoxycarbonyl)amino] butansäure wurden in 10.0 mL 1 ,2-Dimethoxyethan vorgelegt und mit 344.4 mg (3.4 mmol) 4- Methylmorpholin und 504 mg (3.69 mmol) Isobutylchlorformiat versetzt. Nach 10min Rühren bei RT wurde der Ansatz auf 5°C abgekühlt und portionsweise mit 161 mg (4.26 mmol) Natriumborhydrid gelöst in 3 mL Wasser unter starkem Rühren versetzt. Nach 1 h erfolgte nochmals eine Zugabe der gleichen Menge an Natriumborhydrid und der Ansatz wurde anschließend langsam auf RT erwärmt. Es wurden 170 ml Wasser zugegeben und der Ansatz dann viermal mit jeweils 200 ml Ethylacetat extrahiert. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase einmal mit Citronensäure und anschließend mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 760 mg (78 % d. Th.) der Verbindung Benzyl-tert-butyl-[(2S)-4-hydroxybutan-l,2-diyl]biscarbamat. LC-MS (Methode 1): Rt = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 339 (M+H)+.
760 mg (2.16 mmol) von diesem Intermediat wurden in 13 ml Chlorwasserstoff/Dioxan gelöst 20 min bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz auf 5 ml aufkonzentriert und mit Diethylether versetzt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und aus Acetonitril/Wasser 1 : 1 lyophilisiert.
Das so erhaltene Produkt wurde in 132 ml DMF gelöst und mit 345.5 mg (2.35 mmol) 4-Methoxy- 4-oxobutansäure, 970 mg (2.55 mmol) HATU und 1025 μΐ NN-Diisopropylethylamin versetzt. Die Mischung wurde 5 min bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der verbliebene Rückstand mittels präparativer HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Acetonitril im Vakuum abgedampft. Die verbleibende wässrige Phase wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert und die organische Phase anschließend einggengt und im Hochvakuum getrocknet.
Das so erhaltene Zwischenprodukt wurde in Methanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h lang bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.
247 mg von dieser entschützten Verbindung wurden in 20 ml DMF aufgenommen und mit 352 mg (1.36 mmol) l-({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidin-2,5-dion sowie 592 μΕ NN- Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde lh bei RT gerührt, anschließend eingeengt und der Rückstand mittles präparativer HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt über diese 5 Reaktions schritte in einer 21%-igen Gesamtausbeute 218 mg der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.74 min; MS (ESIpos): m/z = 363 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 335 -
Intermediat L67
Trifluoressigsäure— 2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)ethyl-beta-alaninat (1 :1)
Figure imgf000336_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 50 mg (0.354 mmol) von kommerziell erhältlichem 1- (2-Hydroxyethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion durch Kupplung mit 134 mg (0.71 mmol) N-(tert- Butoxycarbonyl)-beta-alanin in 10 ml Dichlormethan in Gegenwart von 1.5 Equivalenten EDCI und 0.1 Equivalent 4-N N-Dimethylaminopyridin und anschließende Entschützung mit Trifluoressigsäure hergestellt.
Ausbeute: 56 mg (48% d. Th. über 2 Stufen)
LC-MS (Methode 3): Rt = 1.15 min; MS (ESIpos): m/z = 213 (M+H)+. Intermediat L68
Trifluoressigsäure-N-(2-aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)propanamid( 1 :1)
Figure imgf000336_0002
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat LI nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)propansäure und tert-Butyl-(2-aminoethyl) carbamat hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.17 min; MS (ESIpos): m/z = 212 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 336 -
Intermediat L69
Trifluoressigsäiu-e--l-[(benzyloxy)carbonyl]piperidin-4-yl-L-valyl-N5-carbamoyl-L-omithm (1 :1)
Figure imgf000337_0001
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlichem Benzyl-4-hydroxypiperidin-l-carboxylat durch Veresterung mit N2-(tert- Butoxycarbonyl)-N5-carbamoyl-L-ornithin mittels EDCI/DMAP, anschließende Boc-Spaltung mit TFA, dann folgende Kupplung mit N-[(tert.-Butoxy)carbonyl]-L-valin in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropylethylamin und schließlich erneute Boc-Abspaltung mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.62 min; MS (ESIpos): m/z = 492 (M+H)+.
Intermediat L70
9H-Fluoren-9-ylmethyl-(3-oxopropyl)carbamat
Figure imgf000337_0002
1000.0 mg (3.36 mmol) 9H-Fluoren-9-ylmethyl-(3-hydroxypropyl)carbamat wurden in 15.0 mL Chloroform und 15.0 mL 0.05 N Kaliumcarbonat/0.05 N Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 : 1) BHC 15 1 040-A - 337 - vorgelegt. Dann wurden 93.5 mg (0.34 mmol) Tetra-n-butylammoniumchlorid, 673.6 mg (5.04 mmol) N-Chlorsuccinimid und 52.5 mg (0.34 mmol) TEMPO zugegeben und die Reaktionsmischung kräftig über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet und mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 3:1-1 :1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 589.4 mg (58 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 6): Rt = 2.15 min; MS (ESIpos): m/z = 296 (M-H)+. Intermediat L71 tert-Butyl-[4-(chlorcarbonyl)phenyl]carbamat
Figure imgf000338_0001
100.0 mg (0.42 mmol) 4-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]benzoesäure wurden in 2.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 64.2 mg (0.51 mmol) Oxalsäuredichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte bei RT 30 min (DC-Kontrolle: Dichlormethan/Methanol). Dann wurden nochmals 192.6 mg (1.53 mmol) Oxalsäuredichlorid und 1 Tropfen DMF zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand mehrmals mit Dichlormethan kodestilliert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
Intermediat L72
Benzyl-(9S)-9-(hydroxymethyl)-2,2-dimethyl-6,l l-dioxo-5-oxa-7,10-diaza-2-silatetradecan-14-oat
Figure imgf000338_0002
BHC 15 1 040-A - 338 -
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem Benzyl-tert-butyl-[(2S)-3- hydroxypropan-l,2-diyl]biscarbamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe, anschließende Kupplung mit 4-(Benzyloxy)-4- oxobutansäure in Gegenwart von EDCI/HOBT, dann Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit TFA und schließlich durch Umsetzung mit l -({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidin-2,5- dion in Gegenwart von Triethylamin hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.94 min; MS (ESIpos): m/z = 425 [M+H]+.
Intermediat L73
N-(2-aminoethyl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanamide
Figure imgf000339_0001
Zu einer Lösung von 300 mg (1.87 mmol) tert-butyl (2-aminoethyl)carbamate in 20 ml Dimethylformamid wurden 395.5 mg (1.87 mmol) 6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)hexansäure, 1.21 g ( 9.36 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 854.3 mg (2.25 mmol) HATU zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 5 Minuten bei Rt gerührt. Nach Einengen der Mischung wurde der Rückstand in DCM aufgenommen und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit Brine gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und eingeengt. Man erhielt 408 mg (33%, Reinheit 53%) der Titelverbindung, die ohne weitere Reinigung eingesetzt wurden.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.75 min; MS (ESIpos): m/z = 354 (M+H)+.
Zu einer Lösung von tert-butyl (2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)hexanoyl]amino}ethyl)carbamate (408 mg, 0.365 mmol) in 7 ml dichlormethan wurde 1 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 0.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde zweimal mit Dichlormethan kodestilliert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 384 mg (94 %>, Reinheit 57%o) der Titelverbindung. BHC 15 1 040-A - 339 -
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.26 min; MS (ESIpos): m/z = 254 (M+H)+.
Intermediat L74
3-[2-[2- -[2-[[2-(2,5-dioxopyrrol-l-yl)acetyl]amino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propansäure
Figure imgf000340_0001
107 mg (0.335 mmol) tert-butyl 3-[2-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate und 93 mg (0.369 mmol) (2,5-dioxopyrrolidin-l-yl) 2-(2,5-dioxopyrrol-l-yl)acetate wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.074 mL (0.671 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.048 mL (0.838 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 133 mg (86%, Reinheit 100%) tert-butyl 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-dioxopyrrol-l- yl)acetyl] amino] ethoxy] ethoxy ] ethoxy ] ethoxy Jpropanoate.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.82 min; MS (ESIpos): m/z = 459 (M+H)+.
Zu einer Lösung von tert-butyl 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-dioxopyrrol-l- yl)acetyl]amino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate (130 mg, 0.284 mmol) in 5 ml dichlormethan wurde 0.5 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 102 mg (90%, Reinheit 100%) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.52 min; MS (ESIpos): m/z = 402 (M+H)+. Intermediat L75
Trifluoressigsäure— 2-(trimethylsilyl)ethyl-3-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-D-alaninat (1 :1) BHC 15 1 040-A - 340 -
Figure imgf000341_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 3-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-N-(tert- butoxycarbonyl)-D-alanin nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure hergestellt. Man erhielt 405 mg (58 % d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): Rt = 0.75 min; MS (ESIpos): m/z = 339 (M+H)+.
Intermediat L76
(2S)-2-Brom-4-oxo-4-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]butansäure
Figure imgf000341_0002
Zunächst wurde ein geeignet geschütztes Asparaginsäurederivat ausgehend von (3S)-4- (Benzyloxy)-3-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-4-oxobutansäure nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2-(Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP und hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe und des Benzylesters hergestellt.
470 mg (1.8 mmol) der so erhaltenen (2S)-2-Amino-4-oxo-4-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]butansäure wurden in 10 ml Wasser suspendiert und mit 1.8 mL einer 1 molaren Salzsäure sowie 0.5 ml konzentrierter Schwefelsäure und anschließend mit 863 mg (7.25 mmol Kaliumbromid versetzt. Dann wurden bei 10°C über einen Zeitraum von 30 min eine Lösung aus 150 mg (2.175 mmol) Natriumnitrit in 1 ml Wasser zugetropft und der Ansatz 2 h bei 10-15°C gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit 50 mL Ethylacetat ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Abdampfen des Lösungsmittels und Reinigung durch präparative HPLC wurden 260 mg (48% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.03 min; MS (ESIneg): m/z = 295 und 297 (M-H)\ BHC 15 1 040-A - 341 -
Ή-NMR (400 MHz, CDC13): δ [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.95 (t, 2H), 2.94 und 3.2 (2dd, 2H), 4.18 (t, 2H), 4.57 (t, 1H).
Intermediat L77
Trifluoressigsäure— N-[2-(2-aminoethoxy)ethyl]-2-bromacetamid (1 :1)
Figure imgf000342_0001
Zunächst wurden 418 mg (2.05 mmol) tert-Butyl-[2-(2-aminoethoxy)ethyl]carbamat mit 638 mg (2.46 mmol) Bromessigsäureanhydrid umgesetzt und anschließend die Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure entfernt. Man erhielt 551 mg (63 % d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode ): Rt = 0.32 min; MS (ESIpos): m/z = 227 und 225 (M+H)+. Intermediat L78
N- [(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl]-beta-alanin
Figure imgf000342_0002
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l-yl)essigsäure durch Kupplung mit tert-Butyl-beta-alaninathydrochlorid (1 :1) in Gegenwart von EDCI/HOBt und NN-Diisopropylethylamin und anschließende Entschützung mit Trifluoressigsäure hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.32 min; MS (ESIpos): m/z = 227 (M+H)+. Intermediat L79
N- [6-(2,5 -Dioxo-2,5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -b eta-alanin BHC 15 1 040-A - 342 -
Figure imgf000343_0001
64.8 mg (0.357 mmol) iert-Butyl-beta-alaninathydrochlorid (1 :1) und 100 mg (0.324 mmol) l-{6- [(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-6-oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion wurden in 4 ml Dimethylformamid gelöst und mit 65.6 mg (0.649 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.048 mL (0.838 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 84.5 mg (77%, Reinheit 100%) iert-Butyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-beta- alaninat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.78 min; MS (ESIpos): m/z = 339 (M+H)+.
Zu einer Lösung von iert-Butyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-beta- alaninat (82.8 mg, 0.244 mmol) in 8 ml dichlormethan wurde 1.62 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 62.7 mg (87%, Reinheit 95%o) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.75 min; MS (ESIpos): m/z = 283 (M+H)+.
Intermediat L80
2-(Trimethylsilyl)ethyl-3-[( 15 -amino-4,7, 10, 13 -tetraoxapentadecan- 1 -oyl)amino] -N-(tert- butoxycarbonyl)-D-alaninat BHC 15 1 040-A - 343 -
Figure imgf000344_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem 3-{[(Benzyloxy)carbonyl] amino}-N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alanin— N-cyclohexylcyclohexanamin (1 :1) nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Freisetzung aus dem Salz und Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP, hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe, Kupplung mit kommerziell erhältlicher 3-Oxo-l-phenyl-2,7,10,13,16-pentaoxa-4-azanonadecan- 19-säure in Gegenwart von HATU und N, N-Diisopropylethylamin und erneute hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe) hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.70 min; MS (ESIpos): m/z = 552 (M+H)+. Intermediat L81
Trifluoressigsäure -benzyl-{2-[(2-aminoethyl)sulfonyl]ethyl}carbamat (1 :1)
Figure imgf000344_0002
250 mg (1.11 mmol) 2,2'-Sulfonyldiethanamin wurden mit 92.3 mg (0.37 mmol) 1- {[(Benzyloxy)carbonyl] oxy}pyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von N, N-Diisopropylethylamin in DMF gekuppelt. Nach anschließender HPLC Reinigung wurden 70 mg (47% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
C-MS (Methode 12): Rt = 0.64 min; MS (ESIpos): m/z = 257.11 (M+H) BHC 15 1 040-A - 344 -
Intermediat L82
Trifluoressigsäure N-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)hexanamid (1 :1)
Figure imgf000345_0001
88.6 mg (0.357 mmol) N-Boc-2,2'-(ethylenedioxy)diethylamine und 100 mg (0.324 mmol) N- Succinimidyl 6-maleimidohexanoate wurden in 4.0 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.071 mL (0.650 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.048 mL (0.838 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 75 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 127 mg (81% d. Th) tert-Butyl-{2-[2-(2-{[6-(2,5-dioxo-2,5- dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]amino } ethoxy)ethoxy] ethyl } carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.78 min; MS (ESIpos): m/z = 442 (M+H)+.
Zu einer Lösung von 123 mg (225 μιηοΐ) tert-Butyl-{2-[2-(2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l-yl)hexanoyl]amino}ethoxy)ethoxy]ethyl}carbamat in 7.5 ml dichlormethan wurde 2.0 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 111 mg (100%o d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.31 min; MS (ESIpos): m/z = 342 (M+H)+.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 1.17 (m, 2H), 1.47 (m, 4H), 2.04 (m, 2H), 2.98 (m, 2H), 3.19 (m, 2H), 3.39 (m, 4H), 3,56 (m, 6H), 7.01 (s, 2H), 7.72 (bs, 3H), 7.80 (m, 1H).
Intermediat L83
Trifluoressigsäure N- {2- [2-(2-aminoethoxy)ethoxy] ethyl} -2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)acetamid (1 :1) BHC 15 1 040-A - 345 -
Figure imgf000346_0001
200 mg (0.805 mmol) tert-Butyl-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl}carbamat, 150 mg (0.966 mmol) (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)essigsäure und 560 μΐ (3.2 mmol) N,N- Diisopropylethylamin wurden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und mit 459 mg (1,21 mmol) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei RT gerührt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand in Dichloromethan gelöst. Die organische Phase wurde zweimal mit 5%iger Citronensäure-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 25 g SNAP, Dischloromethan:Methanol 98:2). Man erhielt 276 mg (89 % d. Th) tert-Butyl- {2-[2-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-1 - yl)acetyl] amino } ethoxy)ethoxy] ethyl } carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.67 min; MS (ESIpos): m/z = 386 (M+H)+.
Zu einer Lösung von tert-Butyl-{2-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetyl]amino}ethoxy)ethoxy]ethyl}carbamat (275 mg, 714 μιηοΐ) in 15 ml dichlormethan wurde 4 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 281 mg (99% d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.17 min; MS (ESIpos): m/z = 286 (M+H)+.
Intermediat L84
Trifluoressigsäure N-(14-amino-3,6,9,12-tetraoxatetradec-l-yl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -yl)hexanami
Figure imgf000346_0002
200 mg (0.594 mmol) tert-Butyl-(14-amino-3,6,9,12-tetraoxatetradec-l-yl)carbamat und 202 mg (0.654 mmol) l-{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-6-oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion wurden in 4.0 BHC 15 1 040-A - 346 - ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.130 mL (1.2 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.085 ml (1.5 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 275 mg (73% d. Th) tert-Butyl-[21 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 16-oxo-3 ,6,9, 12-tetraoxa- 15- azahenicos-l-yl]carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.81 min; MS (ESIpos): m/z = 530 (M+H)+.
Zu einer Lösung von tert-Butyl-[21-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-16-oxo-3,6,9,12- tetraoxa-15-azahenicos-l-yl]carbamat (268 mg, 505 μιηοΐ) in 5.0 ml dichlormethan wurde 780 μΐ (10 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 266 mg (97% d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.46 min; MS (ESIpos): m/z = 430 (M+H)+.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 1.17 (m, 2H), 1.47 (m, 4H), 2.03 (m, 2H), 2.99 (m, 2H), 3.18 (m, 2H), 3.38 (m, 4H), 3,52 (m, 8H), 3,58 (m, 6H), 7.01 (s, 2H), 7.73 (bs, 3H), 7.80 (m, 1H).
Intermediat L85
Trifluoressigsäure N-(14-amino-3,6,9,12-tetraoxatetradec-l-yl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -yl)acetamid (1 :1)
Figure imgf000347_0001
200 mg (0.594 mmol) tert-Butyl-(14-amino-3,6,9,12-tetraoxatetradec-l-yl)carbamat, 111 mg (0.713 mmol) (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)essigsäure und 410 μΐ (2.4 mmol) N,N- Diisopropylethylamin wurden in 6 ml Dimethylformamid gelöst und mit 339 mg (0.892 mmol) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt und direkt mittles präp. RP- HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man BHC 15 1 040-A - 347 - erhielt 130 mg (43% d: Th) tert-Butyl-[17-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-16-oxo-
3 ,6,9, 12-tetraoxa- 15-azaheptadec- 1 -yl] carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.71 min; MS (ESIpos): m/z = 474 (M+H)+.
Zu einer Lösung tert-Butyl-[17-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-16-oxo-3,6,9,12-tetraoxa- 15 -azaheptadec-l-yl] carbamat (126 mg, 267 μιηοΐ) in 4.0 ml Dichlormethan wurde 410 μΐ (5.3 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 124 mg (95% d: Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 13): Rt = 0.74 min; MS (ESIpos): m/z = 374 (M+H)+.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 2.99 (m, 2H), 3.22 (m, 2H), 3.41 (m, 2H), 3,53 (m, 8H), 3,58 (m, 6H), 4.02 (s, 2H), 7.09 (s, 2H), 7.73 (bs, 3H), 8.21 (m, 1H).
Intermediat L86
N- [(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-
Figure imgf000348_0001
100 mg (0.531 mmol) L-Valyl-L-alanin und 134 mg (0.531 mmol) l-{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l - yl)oxy]-2-oxoethyl}-lH-pyrrol-2,5-dion wurden in 3 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.150 mL (1.1 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 8 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 71.5 mg (41 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): Rt = 0.42 min; MS (ESIpos): m/z = 326 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 348 -
Intermediat L87
3 -[2-(2- { [(2,5-Dioxo-2,5-dihyd 1 -yl)acetyl]amino} ethoxy)ethoxy]propansäure
Figure imgf000349_0001
250 mg (1.07 mmol) tert-Butyl-3-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]propanoat, 151 mg (0.974 mmol) 2- (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetic acid, 224 mg (1.46 mmol) 1-Hydroxy-lH- benzotriazol Hydrat und 224 mg (1.17 mmol) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimidhydrochlorid wurden in 5.0 ml Dimethylformamid gelöst. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylacetat versetzt, zweimal mit 5%iger Citronensäure-Lösung und mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung extrartiert. Die organische Phase wurde zweimal mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen,, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde über die präp. RP- HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 267 mg (64% d: Th) tert-Butyl-3-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetyl]amino}ethoxy)ethoxy]propanoat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.73 min; MS (ESIpos): m/z = 371 (M+H)+.
Zu einer Lösung von tert-Butyl-3-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetyl]amino}ethoxy)ethoxy]propanoat (263 mg, 710 μιηοΐ) in 10 ml dichlormethan wurde 1.1 ml (14 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 240 mg (94% d: Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 0.57 min; MS (ESIpos): m/z = 315 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 349 -
Intermediat L88
2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L- alaninat
Figure imgf000350_0001
150 mg (0.797 mmol) L-Valyl-L-alanin und 246 mg (0.797 mmol) l-{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l - yl)oxy]-6-oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion wurden in 4.0 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.220 mL (1.6 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 302 mg (97 % d. Th.) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5- dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-L-alanin.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.02 min; MS (ESIpos): m/z = 382 (M+H)+.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 0.82 (dd, 6H), 1.17 (m, 2H), 1.27 (d, 3H), 1.48 (m, 4H), 1.94 (m, 1H), 2.13 (m, 2H), 3.38 (t, 2H), 4.17 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 7.75 (d, 1H), 8.19 (d, 1H).
130 mg (0.531 mmol) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanin wurden in 6.5 ml Dichloromethan gelöst und mit 58.8 mg (0.511 mmol) l-Hydroxypyrrolidin-2,5- dion und 78.4 mg (0.409 mmol) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid versetzt. 58.8 mg (0.511 mmol) l-Hydroxypyrrolidin-2,5-dion und 78.4 mg (0.409 mmol) l-(3- Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid wurden nocheinmal zugegeben. Der Ansatz wurde mit Dichloromethan versetzt une dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 172 mg (87 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 12): Rt = 1.28 min; MS (ESIpos): m/z = 479 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 350 -
Intermediat L89 l-Benzyl-5-[2-(trimethylsilyl)ethyl]-L-glutamathydrochlorid (1 :1)
Figure imgf000351_0001
Cl
H
1.00 g (2.96 mmol) (4S)-5-(Benzyloxy)-4-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-5-oxopentansäure wurden in 13.0 ml THF vorgelegt und mit 510 μΐ (3.6 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethanol und 109 mg (889 μιηοΐ)
4-Dimethylaminopyridin versetzt. Die Reactionmischung wurde auf 0°C gekühlt und mit 682 mg (3.56 mmol) N-Ethyl-N'-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid hydrochlorid versetzt. Die Reactionmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand in Ethylacetat gelöst. Die organische Phase wurde zweimal mit 0.1N HCl-Lösung und ges. Natriumchlorid-Lösunggewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 25 g SNAP, Cyclohexan:Ethylacetat 80:20). Man erhielt 649 mg (50 % d. Th) der Verbindung l-Benzyl-5-[2-(trimethylsilyl)ethyl]-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-glutamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 4.6 min; MS (ESIpos): m/z = 438 (M+H)+.
649 mg (1.48 mmol) l-Benzyl-5-[2-(trimethylsilyl)ethyl]-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-glutamat wurden in 7.0 ml Dioxan gelöst und unter Eisbadkühlung wurden 14 ml (59 mmol) 4N HCl in Dioxan dazugegeben. Die Reactionmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet und mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 25 g SNAP, Dischloromethan:Methanol 90:10). Man erhielt 320 mg (57 % d. Th) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.79 min; MS (ESIpos): m/z = 338 (M+H)+.
Intermediat L90 l-({N-[(Benzyloxy)carbonyl]glycyl}amino)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-säure
OH
Figure imgf000351_0002
BHC 15 1 040-A - 351 -
118 mg (566 μιηοΐ) N-[(Benzyloxy)carbonyl]glycin wurden in 5.0 ml DMF vorgelegt, mit 200 mg (622 μιηοΐ) tert-Butyl-l-amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oat, 130 mg (849 μιηοΐ) 1- Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat und 130 mg (679 μιηοΐ) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimidhydrochlorid versetzt und 1 h bei RT gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylacetat versetzt, zweimal mit 5%iger Citronensäure-Lösung und mit ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung extrartiert. Die organische Phase wurde zweimal mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen und. über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 274 mg (95% d: Th) tert-Butyl-l-({N- [(benzyloxy)carbonyl]glycyl}amino)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oat.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.69 min; MS (ESIpos): m/z = 513 (M+H)+.
Zu einer Lösung von 274 mg (535 μmol)tert-Butyl-l-({N-[(benzyloxy)carbonyl]glycyl}amino)- 3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oat in 5.0 ml dichlormethan wurde 820 μΐ (11 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.. Man erhielt 262 mg (100% d: Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.12 min; MS (ESIpos): m/z = 457 (M+H)+. Intermediat L91
Trifluoressigsäure— 2-(trimethylsilyl)ethyl-l -{[3-amino-N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alanyl]amino}- 3 ,6,9, 12-tetraoxapentadecan- 15-oat (1 :1)
Figure imgf000352_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher 3-Oxo-l-phenyl-2,7,10,13,16- pentaoxa-4-azanonadecan-19-säure nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit BHC 15 1 040-A - 352 -
2-Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP, hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe, Kupplung mit kommerziell erhältlichem N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl]amino}-D -alanin und Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe) hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.74 min; MS (ESIpos): m/z = 552 (M+H)+.
Intermediat L92
N- [(Benzyloxy)carbonyl] -L-alanyl-L-alanyl-L-alpha-asparagin
Figure imgf000353_0001
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch HATU-Kupplung in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin von kommerziell erhältlichen N-[(Benzyloxy) carbonyl]-L-alanyl-L-alanin mit tert-Butyl-L-asparaginat und anschließender Entschützung der Carboxygruppe mit Trifluoressigsäure hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.5 min; MS (ESIpos): m/z = 409 (M+H)+.
Intermediat L93
N-Acetyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alpha-asparagin
Figure imgf000353_0002
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch HATU-Kupplung in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin von kommerziell erhältlichen N-[(Benzyloxy) carbonyl]-L-alanyl-L-alanin mit tert-Butyl-L-asparaginat, anschließender Abspaltung der Z- BHC 15 1 040-A - 353 -
Schutzgruppe durch Hydrierung in DCM-Methanol über 10% Palladium auf Aktivkohle, dann folgender Acetylierung mit Essigsäure in DMF in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin und schließlich Entschützung der Carboxygruppe mit Trifluoressigsäure hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.16 min; MS (ESIpos): m/z = 317 (M+H)+.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 1.19 (2d, 6H), 1.82 (s, 3H), 2.5 (m, 2H), 4.26 (m, 2H), 4.48 (q, 1H), 6.9 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 8.0 (m, 3H), 12.54 (s, 1H).
Intermediat L94
N-{4-Oxo-4-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]butanoyl}-L-alanyl-L-alanyl-L-alpha-asparagin
Figure imgf000354_0001
Zunächst wurde 4-Oxo-4-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]butansäure durch Umsetzung von 4- (Benzyloxy)-4-oxobutansäure mit 2-(Trimethylsilyl)ethanol in Gegenwart von EDCI/DMAP in DCM und anschließender hydrogenolytischen Spaltung des Benzylesters hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 217 (M-H)\
Weiterhin wurde Trifluoressigsäure — 4-nitrobenzyl-L-alanyl-L-alanyl-L-asparaginat (1 :1) durch Kupplung von N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-alanyl-L-alanin mit 4-Nitrobenzyl-L-asparaginat hydrobromid (1 :1) in DMF in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung der Aminogruppe mit Trifluoressigsäure in DCM hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.43 min; MS (ESIpos): m/z = 410 (M+H)+.
Die Titelverbindung wurde dann durch Kupplung dieser beiden Intermediate in DMF in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung des p-Nitro- benzylesters durch Hydrierung in DCM-Methanol 1 :9 über 10% Palladium auf Aktivkohle hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.79 min; MS (ESIpos): m/z = 475 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 354 -
Intermediat L95
Lzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin
Figure imgf000355_0001
Dieses Intermediat wurde ausgehend von N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valin und tert-Butyl-L- alaninathydrochlorid (1 :1) mit klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 323.16 (M+H)+. Intermediat L96
N-Acetyl-L-valyl-N5-carbamoyl-L-ornithinamid
Figure imgf000355_0002
Dieses Intermediat wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt beginnend mit der Kupplung von 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-valinat mit N5- Carbamoyl-L-ornithin, dann folgender hydrogenolytischer Abspaltlung der Z-Schutzgruppe über 10% Palladium/ Aktivkohle in Ethanol und schließlich durch Umsetzung des erhaltenen Dipeptids mit 1 -Acetoxypyrrolidin-2,5-dion.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.25 min; MS (ESIpos): m/z = 317 (M+H) BHC 15 1 040-A - 355 -
Intermediat L97
1 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2-oxo-6,9, 12, 15, 18,21 ,24,27-octaoxa-3 -azatriacontan- 30-säure
Figure imgf000356_0001
Tert-Butyl-l-amino-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxaheptacosan-27-oat (100 mg, 201 μιηοΐ) wurde in 1.0 ml DMF vorgelegt und mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- l-yl)essigsäure (46.8 mg, 301 μιηοΐ), 1-Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat (76.9 mg, 502 μιηοΐ) und l-(3-Dimethylaminopropyl)- 3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (77.0 mg, 402 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit Ethylacetat versetzt. Die organische Phase wurde zweimal mit 5%iger Citronensäure-Lösung, mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und dann mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 19.1 mg (13% d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2-oxo- 6,9, 12, 15, 18,21 ,24,27-octaoxa-3 -azatriacontan-30-oat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 635 [M+H]+
Zu einer Lösung von tert-Butyl-l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2-oxo- 6, 9,12,15, 18,21,24,27-octaoxa-3-azatriacontan-30-oat (19.1 mg, 30.1 μιηοΐ) in 1.0 ml DCM wurde TFA (62 μΐ, 600 μιηοΐ) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 10.8 mg (46 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.55 min; MS (ESIneg): m/z = 577 [M-H]\ BHC 15 1 040-A 356 Intermediat L98
2,2-Dimethylpropansäure--2-(trimethylsilyl)ethyl-N-(^^
ethoxy] carbonyl } -L-glutaminat (1 :1)
Figure imgf000357_0001
Zunächst wurde (4S)-5-tert-Butoxy-4-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-5-oxopentansäure in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropylethylamin mit Benzyl-(2-aminoethyl)carbamat gekuppelt. Anschließend wurden mittels Trifluoressigsäure in DCM die Boc-Schutzgruppe sowie der tert.-Butylester abgespalten. Dann wurde zunächst die Aminogruppe durch Umsetzung mit 1- ({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidin-2,5-dion in DMF/Wasser in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin und anschließend die Carboxygruppe durch Umsetzung mit 2- (Trimethylsilyl)ethanol in DCM in Gegenwart von EDCI /DMAP erneut geschützt. Im letzten Schritt erfolgte die Entschützung der terminalen Aminogruppe mittels Hydrogenolyse über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Normaldruck. Nach Abfiltrieren des Katalysators, Einengen, Reinigung durch präparative HPLC und Gefriertrocknung des Rückstandes aus Acetonitril/Wasser wurde die Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.82 min; MS (ESIpos): m/z = 434 (M+H)+.
Intermediat L99
Trifluoressigsäure -2-(trimethylsilyl)ethyl-N- [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl] -L- valyl-L-alanyl-beta-alanyl-L-lysinat (1 :1)
Figure imgf000357_0002
BHC 15 1 040-A - 357 -
Zunächst wurde ausgehend von N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin nach klassischen Methoden der Peptidchemie 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L- lysinat hergestellt. Dieses Intermediat wurde dann in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropyl- ethylamin mit dem nach Standardmethoden hergestellten Tripeptidbaustein N-[(Benzyloxy) carbonyl]-L-valyl-L-alanyl-beta-alanin gekuppelt. Die Z-Schutzgruppe wurde anschließend durch Hydrogenolyse in Methanol entfernt und das erhaltene Intermediat mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l-yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamm gekuppelt. Im letzten Schritt erfolgte die Entschützung der Seitenkettenaminogruppe unter schonenden Bedingungen durch lh Rühren in 10%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT. Nach Einengen und Gefriertrocknung aus Acetonitril/Wasser wurde die Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.64 min; MS (ESIpos): m/z = 625 (M+H)+.
Intermediat LIPO
3-[5-(2-{[(2,5-Dioxo-2,5-dihvdro-lH-pyrrol-l-yl)acetyllaminolethvn-l,2,4-oxadiazol-3- yllpropansäure
Figure imgf000358_0001
Zu einer Lösung von Methyl-3-cyanpropanoat Lösung (500 mg, 4.42 mmol) in 40 ml Ethanol was added 461 mg (6.60 mmol) Hydroxylaminehydrochlorid und 1341.86 mg (13.26 mmol) Triethylamin. Das Reaktionsgemisch wurde bei 50 °C 3h gerührt. Das Gemischt wurde eingeengt und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und anschließend mit Wasser und Brine gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Man erhielt 400 mg (62% d. Th) der Titelverbindung.
Zu einer Lösung von Methyl-(4E)-4-{[N-(tert-butoxycarbonyl)-beta-alanyl]amino}-4- (hydroxyimino)butanoat (4.85 g, 33.19 mmol) in 120.0 ml ml Dioxan wurde 6.91 g (36.50 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)-beta-alanin und 8.22 g (39.82 mmol) 1,3-Dicycloxexylcarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 3h gerührt. Das Gemisch wurde BHC 15 1 040-A - 358 - eingeengt und der Rückstand wurde in Wasser gelöst und mit Ethylacetat extrahiert. Die organisch Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeent. Der Rückstand wurde mittels Flash- Chromatographie. Man erhielt 6.0 g (57% d.Th) der Titelverbindung.
Eine Lösung von Methyl-(4E)-4-{[N-(tert-butoxycarbonyl)-beta-alanyl]amino}-4- (hydroxyimino)butanoat ( 6.0g, 18.91 mmol) in 100 ml DMF wurde 5h bei 120 °C gerührt. Das Gemisch wurde mit Wasser versetzt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 4 g (71% d. Th.) der Titel Verbindung.
Zur eine Lösung von 3-(5-{2-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]ethyl}-l,2,4-oxadiazol-3- yl)propansäure ( 2.0 g, 7.01 mmol) in 30 ml Dichlormethan wurden 2.96 g (25.96 mmol) Trifluoressigsäure zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde lh bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Wasser versetzt und extrahiert mit Dichlormethan. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde ohne weitere reinigung eingesetzt. Man erhielt 1.50 g (72%o d. Th.) der Titel Verbindung.
Zur eine Lösung von 3-[5-(2-Aminoethyl)-l,2,4-oxadiazol-3-yl]propansäure ( 1.5 g, 5.01 mmol) in 25 ml DMF wurden 1.30 g (5.52 mmol) l-[2-(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)-2-oxoethyl]-lH-pyrrol- 2,5-dion und 1.52 g (15.04 mmol) Triethylmin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde lh bei rt gerührt. Das Gemisch wurde mit Wasser versetzt und extrahiert mit Dichlormethan. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 774 m g (47%o d. Th.) der Titel Verbindung.
'H-NMR (300 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 2.67 (t, 2H), 2.91 (t, 2H), 3.03 (t, 2H), 3.46 (q, 2H), 4.28 (s, 2H), 7.01 (s, 2H), 8.37 (t, 1H), 12.28 (bs, 1H).
Intermediat L123
T ert-Butyl- [ 1 -fluor-4-oxobutan-2 - l] carbamat
Figure imgf000359_0001
Unter Argon wurde Ethyl-3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-fluorbutanoat (150 mg, 602 μιηοΐ) (Synth. Com., 1985, 15(5), 377) in 12.0 ml DCM vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde auf - 78°C abgekühlt, mit Diisobutylaluminiumhydrid IM in Toluol (1.2 ml, 1.0 M, 1.2 mmol) versetzt und 2 Stunde nachgerührt. Der Ansatz wurde vorsichtig mit Methanol gequencht, 10min. nachgerührt und mit Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde dreimal mit ges. BHC 15 1 040-A - 359 -
Kaliumnatriumtartrat-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 86.1 mg (67 % d. Th.) der Titel Verbindung.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.37 (s, 9H), 2.58 (m, 2H), 4.18 (m, 1H), 4.31 (dd, 2H), 7.05 (d, 1H), 9.60 (s, 1H)
Intermediat L124
T ert-Butyl-N- { (2R)-2-amino-3 -oxo-3 - [2-(trimethylsilyl)ethoxy Jpropyl } -N2-(tert-butoxycarbonyl)- L-asparaginat
Figure imgf000360_0001
4.0 g (13.8 mmol) Boc-Asp-OtBu und 1.8 g (15.2 mmol) N-hydroxysuccinimid wurden in 100 mL Ethyl Acetate gelöst und bei 0°C mit 3.1 g (15.2 mmol) 1, 3 -Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei 0°C gerührt und dann über Nacht bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann filtriert und im Vakuum verdampft. Man erhielt 4.1 g (77 % d. Th.) der Verbindung l-tert-Butyl-4-(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-aspartat. 3-Amino-N-[(benzyloxy)carbonyl]-D-alanin (2.53 g, 10.6 mmol) wurde in 30 mL DMF gelöst und mit N,N-Diisopropylethylamin (2.74 g, 21.2 mmol) und l-tert-Butyl-4-(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)- N-(tert-butoxycarbonyl)-L-aspartat (4.10 g, 10.6 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und im Vakuum verdampft. Man erhielt 4.9 g (90 % d. Th.) der Verbindung (2R)-2- { [(Benzyloxy)carbonyl]amino} -3-( {(3 S)-4-tert-butoxy-3-[(tert- butoxycarbonyl)amino]-4-oxobutanoyl}amino)propansäure.
(2R)-2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-3-({(3S)-4-tert-butoxy-3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4- oxobutanoyl}amino)propansäure (4.90 g, 9.62 mmol) wurde in 100 ml of Acetonitril gelöst und mit Pyridin (1.6 ml, 19 mmol), 2-(Trimethylsilyl)ethanol (1.7 ml, 12 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (2.38 g, 11.5 mmol) bei RT versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 0°C gerührt und dann über Nacht bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde BHC 15 1 040-A - 360 - dann filtriert und im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.9 g (66 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-N-{(2R)-2- {[(benzyloxy)carbonyl]amino}-3-oxo-3-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]propyl}-N2-(tert- butoxycarbonyl)-L-asparaginat.
Tert-Butyl-N-{(2R)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-3-oxo-3-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]propyl}- N2-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat (3.80 g, 6.23 mmol) wurde in 120 ml Methanol gelöst und mit 380 mg Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 2 Stunde hydriert und dann filtriert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Man erhielt 2.9 g (84 % d. Th.) der Titel Verbindung
'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 0.04 (s, 9H), 0.97 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.39 (s, 9H), 1.89 (bs, 2H), 2.43 (m, 1H), 3.18 (m, 3H), 3.38 (m, 1H), 4.11 (m, 3H), 6.93 (d, 1H), 7.91 (bt, 1H)
Intermediat L125
Trifluoressigsäure— tert-butyl-N-(2-aminoethyl)-N2-(bromacetyl)-D-alpha-glutaminat (1 :1)
Figure imgf000361_0001
Dieses Intermediat wurde ausgehend von (2R)-2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-5-tert-butoxy-5- oxopentansäure und tert-Butyl (2-aminoethyl)carbamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.49 min; MS (ESIpos): m/z = 366 und 368 (M+H) BHC 15 1 040-A - 361 -
Intermediat Fl 04
Trifluoressigsäure--(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(^^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 - yl)acetyl]amino} eth l)butanamid( 1 :1)
Figure imgf000362_0001
10 mg (0.014 mmol) von Intermediat C53 wurden in 3.3 mL DMF gelöst und mit 8.5 mg (0.027 mmol) von Intermediat LI sowie mit 7.8 mg (0.02 mmol) HATU und 12 μΐ Ν,Ν- Diisopropylethylamin versetzt. Der Ansatz wurde 15 min bei RT gerührt und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt und nach Lyophilisation wurden 5.6 mg (38% d. Th.) der geschützten Zwischstufe erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.32 min; MS (ESIpos): m/z = 915 (M+H)+.
5.6 mg (0.006 mmol) dieses Intermediats wurden in 2 ml DMF aufgenommen und mit 69 mg (0.61 mmol) l,4-Diazabicyclo(2.2.2)octan versetzt. Der Ansatz wurde 2 h im Ultraschallbad behandelt. Anschließend wurden 35 μΐ Essigsäure zugegeben und der Ansatz im Hochvakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 2.4 mg (48% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.84 min; MS (EIpos): m/z = 693 [M+H]+. HPLC (Methode 11): Rt = 1.91 min;
Alternativ wurde die Titelverbindung auch ausgehend von Intermediat C58 hergestellt. 15 mg (0.023 mmol) von Intermediat C58 wurden zunächst mit 11 mg (0.036 mmol) Intermediat LI in Gegenwart von 13 mg ( 0.034 mmol) HATU sowie 10 μΐ Ν,Ν-Diisopropylethylamin umgesetzt. Nach 60 min Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 12.3 mg (63%o d. Th.) des geschützten Intermediats erhalten. BHC 15 1 040-A - 362 -
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.3 min; MS (EIpos): m/z = 837 [M+H]
Im zweiten Schritt wurde dieses Intermediat in 3 mL 2,2,2 -Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12 mg (0.088 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 26 mg (0.088 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure sowie 2 mL einer 0.1%-igen wässrigen Trifluoressigsäurelösung zugesetzt. Der Ansatz wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 8.1 mg (68% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 693 (M+H)+.
Intermediat Fl 19
Trifluoressigsäure-(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N- {2-[(bromacetyl)amino]ethyl}butanamid (1 :1)
Figure imgf000363_0001
29 mg (0.044 mmol) von Intermediat C58 wurden in 3.4 mL DMF aufgenommen und mit 36 mg (0.087 mmol) von Intermediat L52 sowie mit 25 mg ( 0.065 mmol) HATU und 19 μΐ Ν,Ν- Diisopropylethylamin versetzt. Nach 60 min Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 26.4 mg (73%o d. Th.) der Zwischenstufe erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 820 und 822 (M+H)+.
Dieses Intermediat wurde in 3 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 6.5 mg (0.048 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C gerührt. Dann wurden 13.9 mg (0.048 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure sowie 2 mL einer 0.1%o-igen wässrigen Trifluoressigsäurelösung zugesetzt. Der Ansatz wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach BHC 15 1 040-A - 363 -
Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 14.4 mg (58% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 676 und 678 (M+H)+. Intermediat F127
Trifluoressigsäure— (2S)-2-amino-4-({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} [(2S)-2-methoxypropanoyl]amino)-N-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino}ethyl)butanamid (1 :1)
Figure imgf000364_0001
12 mg (0.015 mmol) von Intermediat C59 wurden in 2.4 mL DMF gelöst und mit 14.6 mg (0.046 mmol) von Intermediat LI sowie mit 6 mg (0.031 mmol) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl- carbodiimid-Hydrochlorid, 5.9 mg (0.039 mmol) l-Hydroxy-li7-benzotriazol-Hydrat und 8 μΐ NN-
Diisopropylethylamin versetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. 11 mg (70% d. Th.) dieser Zwischenstufe wurden erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 942 (M+H)+.
11 mg (0.011 mmol) dieses Intermediats wurden in 2 ml DMF aufgenommen und mit 123 mg (1.1 mmol) l,4-Diazabicyclo(2.2.2)octan versetzt. Der Ansatz wurde 2 h im Ultraschallbad behandelt. Anschließend wurden 63 μΐ Essigsäure zugegeben und der Ansatz im Hochvakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 2 mg (22% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (EIpos): m/z = 721 [M+H]+.
HPLC (Methode 11): Rt = 1.95 min; BHC 15 1 040-A - 364 -
Intermediat Fl 53
Trifluoressigsäure --(28)-2^ηιίηο-4-({(1Κ)-1-[1-06ηζγ1-4-(2,5-(1ίι1υοφ1ΐ6ηγ1)-1Η-ρνπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} [(2S)-2-hydroxypropanoyl]amino)-N-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino}ethyl)butanamid (1 :1)
Figure imgf000365_0001
Die Synthese erfolgte in Analogie zu Intermediat Fl 04 ausgehend von Intermediat C60. LC-MS (Methode 1): Rt = 1.1 min; MS (ESIpos): m/z = 707 (M+H)+.
Intermediat F155
N6-(N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl)-N2-{N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl}-L-lysin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000365_0002
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 14 mg (0.019 mmol) des Intermediats C61 mit 15 mg (0.021 mmol) von Intermediat L61 in Gegenwart von 8.7 mg (0.023 mmol) HATU sowie 17 μΐ BHC 15 1 040-A - 365 -
Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 13 mg (59% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 1076 (M+H)
Intermediat Fl 73
N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-L-alanyl-N- [2-( {(2S)-2-amino-4- [{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino] tanoyl}amino)ethyl]-L-glutamin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000366_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 15 mg (0.018 mmol) Intermediat C64 durch Kupplung mit 12 mg (0.02 mmol) von Intermediat L63 in Gegenwart von 7.7 mg ( 0.02 mmol) HATU sowie 16 μΐ Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mittels Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 12 mg (58% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.91 min; MS (EIpos): m/z = 1048 [M+H]+.
BHC 15 1 040-A - 366 -
Intermediat F178
Trifluoressigsäure--(lR,2S)-2-({(2S)-2-amino-4-[{(lR)-H^
pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)-N-{2-[(bromacetyl)am ethyl } cy clopentan arboxamid (1 :1)
Figure imgf000367_0001
Die Titelverbindung wurde in Anlogie zu Intermediat Fl 77 hergestellt, wobei an Stelle von Intermediat LI das Intermediat L52 eingesetzt wurde.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (EIpos): m/z = 787 und 789 [M+H]+.
BHC 15 1 040-A - 367 -
Intermediat F180
N- [2-( {(2S)-2-Amino-4- [ {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl^
dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)em^
yl)acet l]-L-glutamin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000368_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 9.6 mg (0.012 mmol) Intermediat C64 mit 5 mg (0.013 mmol) von Intermediat L64 in Gegenwart von 7 mg ( 0.018 mmol) HATU sowie 6 μΐ Ν,Ν- Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mittels Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 3.1 mg (28% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.85 min; MS (EIpos): m/z = 822 [M+H]+.
BHC 15 1 040-A - 368 -
Intermediat F192
Ν-{(28)-2-ΑΓηίηο-4-[{(1Κ)-1-[1 -06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3 - { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)acetyl]amino}-L-alanin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000369_0001
60mg (0.091 mmol) von Intermediat C58 wurden in 8 ml DMF aufgenommen und mit 45 mg (0.100 mmol) von Intermediat L65 in Gegenwart von 42 mg (0.11 mmol) HATU und 64 μΐ. NN- Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurde das Intermediat in 10 ml Ethanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 45 min lang bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produkt durch präparative HPLC gereinigt. Nach Lyophilisation aus Acetonitril/Wasser 1 :1 wurden 24.5 mg (31% d.Th. über 2 Stufen) von 2- (Trimethylsilyl)ethyl-3-amino-N-[(2S)-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2- yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino) butanoyl]-L-alaninat erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.17 min; MS (EIpos): m/z = 844 [M+H]+.
Die Titelverbindung wurde dann durch Kupplung von 10 mg (0.012 mmol) dieses Intermediats mit 2 mg (0.013 mmol) von kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1- yl)essigsäure Intermediat in Gegenwart von 5.4 mg ( 0.014 mmol) HATU sowie 8 μΐ Ν,Ν- Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 3.5 mg (33% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.81 min; MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 369 -
Intermediat F193
Ν-{(28)-2-Αηιίηο-4-[{(1Κ)-1-[1 -06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3 - { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)acetyl]amino} -D-alanin -trifluoressi säure (1 :1)
Figure imgf000370_0001
Die Synthese der Titelverbindung erfolgte in Analogie zu Intermediat Fl 92 ausgehend von 3- { [(Benzyloxy)carbonyl]amino } -N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alanin - N-cyclohexylcyclohexanamine (1 :1).
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H)+. Intermediat F194
N-{5-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-valyl-N-{3-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]propyl}-L-alaninamid
Figure imgf000370_0002
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Beispiel M9 zunächst durch Kupplung mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 1 -stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt und das BHC 15 1 040-A - 370 - entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit l,l'-[(l,5-Dioxopentan-l,5- diyl)bis(oxy)] dipyrrolidin-2,5-dion in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.19 min; MS (ESIpos): m/z = 851 [M+H]+.
Intermediat F207
N6-(N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl)-N2-{N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l-yl)acetyl]-L-valyl-L-alanyl}-L-lysin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000371_0001
BHC 15 1 040-A - 371 -
Intermediat F213
Trifluoressigsäure--3-({2-[(3-aminopropyl){(lR)-l-[l -be
yl] -2,2-dimethylpropyl } amino] -2-oxo
yl)acetyl]amino ethyl)propanamid (1 :1)
Figure imgf000372_0001
27.5 mg (0.04 mmol) 1 l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermediat C69) wurden zusammen mit 15.9 mg (0.05 mmol) Trifluoressigsäure — N-(2- aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetamid (1 :1) (Intermediat LI) in 1.8 mL Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 32.4 mg (0.31 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin zugegeben und 32.4 mg (0.05 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 11.9 mg (35 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[ 13- {(1 R)- 1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}-l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2,7,12-trioxo-10-thia-3,6,13- triazahexadecan- 16-yl] carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.39 min; MS (ESIpos): m/z = 881 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 372 -
11.9 mg (0.01 mol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[13^
pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2,7, 12-trioxo-10-thia- 3,6,13-triazahexadecan-16-yl]carbamat wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 5.5 mg (0.04 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 11.8 mg (0.04 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.4 mg (60 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.75 min; MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H)+.
Intermediat F216
S-{2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino] -2-oxoethyl} -N-[ 19-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo- 4,7,10,13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 -oyl]-L-cysteinyl-beta-alanin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000373_0001
Unter Argon wurden 30.2 mg (0.06 mmol) N,N'-Bis[(benzyloxy)carbonyl]-L-cystin in 2.0 mL Wasser und 2.0 mL zso-Propanol vorgelegt und mit 56.7 mg (0.20 mmol) TCEP versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 min bei RT gerührt. Es wurden dann 50.0 mg (0.08 mmol) 2- (Trimethylsilyl)ethyl- {3 -[ {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]propyl}carbamat (Intermediat C70) gelöst in 2.0 mL iso- Propanol und 122.2 mg (0.48 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 7 h bei 50 °C gerührt. Dann wurden nochmals 122.2 mg (0.48 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 50 °C BHC 15 1 040-A - 373 - gerührt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. Natriumhydrogencarbonat-Lsg. extrahiert und mit ges. NaCl-Lsg. gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 43.1 mg (64 % d. Th.) der Verbindung S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12- dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 851 (M+H)+.
16.5 mg (0.05 mmol) 4-Methylbenzolsulfonsäure-benzyl-beta-alaninat (1 :1) wurden zusammen mit 14.0 mg (0.11 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin in 1.5 mL Acetonitril vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde 3 min bei RT gerührt und dann wurden 30.8 mg (0.04 mmol) S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12- dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-cystein gelöst in 1.5 mL Acetonitril, 23.4 mg (0.18 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 29.9 mg (0.05 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Benzyl-S-(11- {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12- dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-cysteinyl-beta-alaninat wurde als Verbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.59 min; MS (ESIpos): m/z = 1012 (M+H)+.
43.8 mg (43.3 μιηοΐ) Benzyl-S-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N- [(benzyloxy)carbonyl]-L-cysteinyl-beta-alaninat wurden in 8.0 mL Ethanol gelöst, mit 4.4 mg Palladium auf Aktivkohle (10%) versetzt und bei RT und Normaldruck über Nacht hydriert. Die Reaktionsmischung wurde über einen Pappfilter filtriert und der Filterkuchen wurde mit einem Ethanol nachgewaschen. Das Lösemittel wurden im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde noch zweimal wie soeben beschrieben behandelt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 14.5 mg (37 % d. Th.) der Verbindung S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difhK^henyl)-lH- BHC 15 1 040-A - 374 - pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-13-yl)-
L-cysteinyl-beta-alanin -trifluoressigsäure (1 :1).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.08 min; MS (ESIpos): m/z = 788 (M+H)+.
14.5 mg (16.1 μιηοΐ) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cysteinyl-beta- alanin-trifluoressigsäure (1 :1) wurden zusammen mit 9.1 mg (17.7 μιηοΐ) 3-(2,5-Dioxo-2,5- dihydro-lH-pyrrol-l -yl)-N-{15-[(2,5-dioxopyrrolidin-l -yl)oxy]-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadec- l-yl}propanamid in 1.0 mL DMF vorgelegt und mit 4.9 mg (48.2 μιηοΐ) 4-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit 3.4 mg (0.06 mmol) Essigsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.9 mg (50 % d. Th.) der Verbindung S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cysteinyl-beta- alanin-trifluoressigsäure (1 :1).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.28 min; MS (ESIpos): m/z = 1186 (M+H)+.
14.1 mg (11.9 μιηοΐ) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-N-[ 19-(2,5- dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo-4,7, 10, 13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 -oyl]-L- cysteinyl-beta-alanin-trifluoressigsäure (1 :1) wurden in 1.5 mL Trifluorethanol gelöst und mit 9.7 mg (71.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Es wurden nochmals 9.7 mg (71.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Es wurden nochmals 9.7 mg (71.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 70 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 20.8 mg (0.07 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 %> TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 6.2 mg (44 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.82 min; MS (ESIpos): m/z = 1042 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 375 -
Intermediat F217
S- {2-[(3-Aminopropyl) {(1 RH -[1 -benz^
dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-[(2,5-dioxo-2,5-dm^ - trifluoressigsäure (1 :1)
Unter Argon wurden 7.5 mg (0.05 mmol) (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)essigsäure in 1.5 mL DMF vorgelegt und mit 7.5 mg (0.05 mmol) HOBt, 15.5 mg (0.05 mmol) TBTU und 6.2 mg (0.05 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. Es wurden dann 40.0 mg (0.05 mmol) S-(l l-{(lRH-[l-Benzyl-4-(2,5-difh^henyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)- L-cystein-trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) gelöst in 1.5 mL DMF und 18.7 mg (0.14 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin zugegeben und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 11.2 mg (25 % d. Th.) der Verbindung S-(l l-{(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}- 2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-1 -yl)acetyl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.37 min; MS (ESIpos): m/z = 854 (M+H)+.
10.9 mg (12.8 μιηοΐ) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(2,5-dioxo- 2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-cystein wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 10.4 mg (76.6 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 22.4 mg (0.08 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt BHC 15 1 040-A - 376 - mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 7.5 mg (65 %> d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.92 min; MS (ESIpos): m/z = 710 (M+H)+.
Intermediat F241
Trifluoressigsäure -(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-(2-{[N-(bromacetyl)glycyl]amino}ethyl)butanamid (1 :1)
Figure imgf000377_0001
Die Titelverbindung wurde aus Intermediat C66 durch Kupplung mit kommerziell erhältlichem 1 - (2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion und anschließender Deblockierung mit Zinkclorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.84 min; MS (EIpos): m/z = 733 und 735 [M+H]+.
BHC 15 1 040-A - 377 -
Intermediat F242
Trifluoressigsäure -(28)-2^ηιίηο-4-[{(1Κ)-1-[1-06ηζγ1-4-(2,5-(1ίί1υοφ1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N-(3- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 - yl)acetyl]amino}propyl)butanamid (1 :1)
Figure imgf000378_0001
Die Synthese der Titelverbindung erfolgte in Analogie zu Intermediat Fl 04. LC-MS (Methode 1): Rt = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 707 (M+H)+. Intermediat F243
Trifluoressigsäure -(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N-[2-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 - yl)acetyl]amino}ethoxy)ethyl]butanamid (1 :1)
Figure imgf000378_0002
Die Synthese der Titelverbindung erfolgte in Analogie zu Intermediat F242. BHC 15 1 040-A - 378 -
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.81 min; MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H)+
Intermediat F245
Trifluoressigsäure -N-{(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butyl}-N'-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino}ethyl)succinamid (1 :1)
Figure imgf000379_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 10 mg (0.0135 mmol) von Intermediat C65 mit 8 mg (0.027 mmol) von Intermediat LI in 8 ml DMF in Gegenwart von 15 mg ( 0.04 mmol) HATU sowie 9 μΐ Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 8.8 mg (58% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 778 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 379 -
Intermediat F247
Trifluoressigsäure -methyl-4-[(2-{[2-({(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-^^^
lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]amm
oxoethyl)amino] -2-brom-4-oxobutanoat (1 :1)
Figure imgf000380_0001
14 mg (0.018 mmol) von Intermediat C66 wurden in 14 mL DCM gelöst und mit 10.1 mg (0.037 mmol) 2-Brom-l-ethylpyridinium-Tetrafluoroborat (BEP) sowie portionsweise mit insgesamt 250 μΐ Pyridin versetzt, wobei der pH-Wert zwischen 5 und 6 gehalten wurde. Dann wurde mit Essigsäure ein pH-Wert von 4 eingestellt, der Ansatz eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Lyophilisation und Trocknung wurden 4 mg (21% d.Th.) der geschützten Zwischenstufe erhalten, die anschließend mit Zinkchlorid an der Aminofunktion entschützt wurde. Nach HPLC -Reinigung und Lyophilisation wurden 3 mg (72% d.Th.) der Titelverbindung als farbloser Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 805 und 807(M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 380 -
Intermediat F248
Trifluoressigsäure --(28)-2^ηιίηο-4-[{(1Κ)-1-[1-06ηζγ1-4-(2,5-(1ίι1υοφ1ΐ6ηγ1)-1Η-ρνπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)ethoxy]ethyl}butanamid 1 :1)
Figure imgf000381_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 10 mg (0.015 mmol) Intermediat C58 mit 5 mg (0.017 mmol) Intermediat LI 2 in Gegenwart von HATU und anschließende Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt. Es wurden 6.5 mg (52% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 1): Rt = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 680 (M+H)+.
Intermediat F254
Trifluoressigsäure -methyl-(3S)-4-[(2-{[2-({(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluor phenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl] amino}-2- oxoethyl)amino] -3 -brom-4-oxobutanoat (1 :1)
Figure imgf000381_0002
BHC 15 1 040-A - 381 -
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat 247 durch Kupplung von 15 mg (0.02 mmol) Intermediat C66 mit 21 mg (0.099 mmol) (2S)-2-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure, die wie in (J.Org.Chem. 200, 65, 517-522) beschrieben aus (2S)-2-Amino-4-methoxy-4- oxobutansäurehydrochlorid (1 :1) synthetisiert wurde, hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 805 und 807(M+H)+.
Intermediat F255
R/S-(N- [ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo-4,7, 10, 13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- l-oyl]-L-alpha-glutamyl-S-{2-[(3-aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- rrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl})- homocystein-trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000382_0001
13.1 mg (0.04 mmol) (2S)-5-(Benzyloxy)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-5-oxopentansäure wurden in 1.0 mL DMF vorgelegt und mit 5.4 mg (0.04 mmol) HOBt, 11.4 mg (0.04 mmol) TBTU und 4.6 mg (0.04 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 30.0 mg (0.04 mmol) R/S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)- homocystein-trifluoressigsäure(l :l) (Intermediat O l) gelöst in 12.9 mg (0.1 mmol) N,N- Diisopropylethylamin und 1 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 32 mg (73 %) der Verbindung 4- [2-[ [( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorophenyl)pyrrol-2-yl] -2,2-dimethyl-propyl]- [3 - BHC 15 1 040-A - 382 -
(2-trimethylsilylethoxycarbonylamino)propyl]amino]-2-oxo-ethyl]sulfanyl-2-[[(2S)-5-b
2-(benzyloxycarbonylamino)-5-oxo-pentanoyl]amino]butansäure.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.53 min; MS (ESIpos): m/z = 1084 (M+H)+.
41.4 mg (0.038 mmol) 4-[2-[[(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorophenyl)pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl- propyl]-[3-(2-trimethylsilylethoxycarbonylamino)propyl]amino]-2-oxo-ethyl]sulfanyl-2-[[(2S)-5- benzyloxy-2-(benzyloxycarbonylamino)-5-oxo-pentanoyl]amino]butansäure wird in 10 mL Ethanol, mit 4.2 mg Pd/C versetzt und mit Normaldruck hydriert. Die Reaktionsmischung wurde über einen Pappfilter filtriert und der Filterkuchen mit Ethanol nachgewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum ohne Erwärmen verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 21.1 mg (56 %) der Verbindung R/S-(L-alpha-Glutamyl-S-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2- silatridecan-13-yl))-homocystein -trifluoressigsäure (1 :1).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.11 min; MS (ESIpos): m/z = 860 (M+H)+.
20.4 mg (20.94 μιηοΐ) R/S-(L-alpha-Glutamyl-S-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl))- homocystein -trifluoressigsäure (1 :1) wurden zusammen mit 11.8 mg (23.04 μιηοΐ) 3-(2,5-Dioxo- 2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-N-{15-[(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-15-oxo-3,6,9,12- tetraoxapentadec-l-yl}propanamid in 1.0 mL DMF vorgelegt und mit 4.2 mg (41.88 μιηοΐ) 4- Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit 3.1 mg (0.05 mmol) Essigsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.5 mg (36 %) der Verbindung R/S-(N-[19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-17-oxo- 4,7,10,13-tetraoxa-16-azanonadecan-l-oyl]-L-alpha-glutamyl-S-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2- silatridecan- 13 -yl))-homocystein.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.66 min; MS (ESIpos): m/z = 1259 (M+H)+.
9.4 mg (7.47 μιηοΐ) R/S-(N-[19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-17-oxo-4,7,10,13- tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 -oyl]-L-alpha-glutamyl-S-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2- BHC 15 1 040-A - 383 - silatridecan-13-yl))-homocystein wurden in 1.5 mL Trifluorethanol gelöst und mit 6.1 mg (44.81 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 13.1 mg (0.05 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 6.9 mg (75 %>) der Titelverbindung
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 1114 (M+H)+. Intermediat F256
Trifluoressigsäure -N-{(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butyl}-N'-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino}ethoxy)ethyl]succinamid (1 :1)
Figure imgf000384_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 10 mg (0.014 mmol) von Intermediat C65 und 9.6 mg (0.027 mmol) Trifluoressigsäure— N-[2-(2-aminoethoxy)ethyl]-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l-yl)acet amid (1 :1) in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 8 mg (64%o d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 822 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 384 -
Intermediat F257
R-{2-[(3-Aminopropyl){(lR) -[l-bemyl-4-(2,5-difluo^henyl) H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino] -2-oxoethyl} -N-[ 18-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17- 4,7,10,13 -tetraoxa- 16-azaoctadecan- 1 -oyl] -L-cystein-trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000385_0001
50.0 mg (0.06 mmol) R-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-p nol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cystein- trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) und 29 mg (0.07 mmol) 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5- dioxopyrrol-l-yl)acetyl]amino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propansäure (Intermediat L74) wurden in 3.0 mL DMF gelöst und mit 27.3 mg (0.07 mmol) HATU und 23.3 mg (0.18 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 17.4 mg (26 %) der Verbindung R-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12- dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-[ 18-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17- oxo-4,7, 10,13 -tetraoxa- 16-azaoctadecan- 1 -oyl] -L-cystein.
LC-MS (Methode 6): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 1101 (M+H)+.
17 mg (0.02 mmol) R-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[18-(2,5- dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo-4,7, 10, 13 -tetraoxa- 16-azaoctadecan- 1 -oyl] -L-cystein wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 6.3 mg (0.05 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 13.5 mg (0.05 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser BHC 15 1 040-A - 385 -
(0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.6 mg (46 %) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 957 (M+H)+. Intermediat F258
Trifluoressigsäure -(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino] -N- [3 -( {2- [(bromacetyl)amino] ethyl } amino)-3 - oxopropyl]butanamid (1 :1)
Figure imgf000386_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von Intermediat C58 mit Trifluoressigsäure -benzyl- [2-(beta-alanylamino)ethyl]carbamat (1 :1) mittels HATU, anschließender Hydrogenolyse, dann folgender Kupplung mit 1 -(2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion und schließlich durch Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 747 und 749(M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 386 -
Intermediat F259
N- {(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH- yrrol-2-yl]-2,2-dimethyl propyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-3-{pvi-(bromacetyl)glycyl]amino}-D-alanin -trifluoressig (1 : 1)
Figure imgf000387_0001
75mg (0.1 14 mmol) von Intermediat C58 wurden in 12.5 ml DMF aufgenommen und mit 78 mg (0.171 mmol) von Intermediat L75 in Gegenwart von 65 mg (0.11 mmol) HATU und 79 μΐ^ Ν,Ν- Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurde das Intermediat in 20 ml Ethanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produkt durch präparative HPLC gereinigt. Nach Lyophilisation aus Acetonitril/Wasser 1 : 1 wurden 63 mg (64% d.Th. über 2 Stufen) von 2-(Trimethylsilyl)ethyl-3- amino-N-[(2S)-4-[{(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-2-( {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino) butanoyl]-D- alaninat erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.16 min; MS (EIpos): m/z = 844 [M+H]+.
40 mg (0.047 mmol) von diesem Intermediat wurden dann wie oben beschrieben mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]glycin in Gegenwart von HATU gekuppelt und anschließend erneut hydrogenolytisch entschützt.
Die Titelverbindung wurde dann durch Kupplung von 10 mg (0.012 mmol) dieses Intermediats mit 7.7 mg (0.032 mmol) von kommerziell erhältlichem l -(2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von 4 μΐ Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat F l 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 1.3 mg der Titelverbindung erhalten. BHC 15 1 040-A - 387 -
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 777 und 779 (M+H)
Intermediat F261
Trifluoressigsäure -(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-(2-{2-[(bromacetyl)amino]ethoxy}ethyl)butanamid (1 :1)
Figure imgf000388_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 20 mg (0.03 mmol) Intermediat C58 mit 25.8 mg (0.061 mmol) Intermediat L77 in Gegenwart von HATU und anschließende Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt. Es wurden 11.9 mg (47% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 722 und 720 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 388 -
Intermediat F262
S-{2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyM
dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- l)propanoyl]amino } ethoxy)ethoxy]propanoyl} -L-cy stein -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000389_0001
30 mg (36 μιηοΐ) S-{2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) wurden zusammen mit 16,9 mg (40 μιηοΐ) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-N-[2-(2-{3- [(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-3-oxopropoxy}ethoxy)ethyl]propanamid in 1.5 mL DMF vorgelegt und mit 10,9 mg (108 μιηοΐ) 4-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit 7.58 mg (0.13 mmol) Essigsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 33,4 mg (80 %> d. Th.) der Verbindung S- ( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl- 6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -yl)propanoyl] amino } ethoxy)ethoxy]propanoyl } -L-cy stein.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 1027 (M+H)+.
32.8 mg (32 μιηοΐ) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N- {3 - [2-(2- { [3 - (2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)propanoyl]amino}ethoxy)ethoxy]propanoyl}-L-cystein wurden in 3.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 26.1 mg (192 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die BHC 15 1 040-A - 389 -
Reaktionsmischung rührte 2 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 56.0 mg (0.192 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 22.9 mg (71 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 883 (M+H)+.
Intermediat F263
N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)acetyl]-beta-alanyl-S-{2-[(3-aminopropyl){(lR)-l-[l- benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-L-cystein trifluoressigsäur
Figure imgf000390_0001
30.0 mg (0.036 mmol) R-(l l-{(lR)-l -[l -Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cystein- trifluoressigsäure (1 : 1) (Intermediat C71) und 9.8 mg (0.04 mmol) N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l -yl)acetyl]-beta-alanin (Intermediat L78) wurden in 1.0 mL DMF gelöst und mit 16.4 mg (0.04 mmol) HATU und 14.0 mg (0.1 1 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.2 mg (13 %>) der Verbindung N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetyl]-beta-alanyl-S-(l l -{(lR)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cystein.
LC-MS (Methode 6): Rt = 1.31 min; MS (ESIpos): m/z = 925 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 390 -
11.3 mg (0.011 mmol) N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-beta-alanyl-S-(l l-{(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- yrrol-2-yl]-2,2-dimethyl ro yl}-2,2-dimethyl-6,12-diox 5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cystein wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 5.0 mg (0.04 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 2 Stunde bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 10.7 mg (0.04 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.4 mg (40 %>) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 781 (M+H)+.
Intermediat F264
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-beta-alanyl-S-{2-[(3-aminopropyl){(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-L- cystein -trifl ressigsäure (1 :1)
Figure imgf000391_0001
30.0 mg (0.036 mmol) R-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cystein- trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) und 12.2 mg (0.04 mmol) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-beta-alanin (Intermediat L79) wurden in 1.0 mL DMF gelöst und mit 16.4 mg (0.04 mmol) HATU und 14.0 mg (0.11 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 8.9 mg (24 %>) der Verbindung N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- BHC 15 1 040-A - 391 - yl)hexanoyl] -beta-alanyl-S-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difhH^henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cystein.
LC-MS (Methode 6): Rt = 1.38 min; MS (ESIpos): m/z = 981 (M+H)+.
15.3 mg (0.015 mmol) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-beta-alanyl-S-(l l- {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12- dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cystein wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 6.3 mg (0.045 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 2 Stunde bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 13.5 mg (0.045 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 %> TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.1 mg (62 %>) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.92 min; MS (ESIpos): m/z = 837 (M+H)+.
Intermediat F265
Trifluoressigsäure N-(3-aminopropyl)-N-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}-22-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-6,17-dioxo-10,13-dioxa-3-thia- 7, 16-diazadocosan- 1 -amid 1 :1)
Figure imgf000392_0001
30.0 mg (42.7 μιηοΐ) 1 l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermediat C69) und 25.3 mg (55.6 μιηοΐ) Trifluoressigsäure N-{2-[2-(2- BHC 15 1 040-A - 392 - aminoethoxy)ethoxy]ethyl}-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanamid (1 :1) (Intermediat L82) wurden in 1.9 mL Acetonitril vorgelegt und mit 60 μΐ (340 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 33 μΐ (56 μιηοΐ) 2,4,6-Tripropyl-l,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinan-2,4,6-trioxid 50 % in Ethylacetat versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT nachgerührt. Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben und die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 26.7 mg (60 %> d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[4-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -26-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-5, 10,21 -trioxo- 14, 17- dioxa-7-thia-4, 11 ,20-triazahexacos- 1 -yl]carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.40 min; MS (ESIpos): m/z = 1025 (M+H)+.
25.3 mg (24.7 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[4-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -26-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-5, 10,21 -trioxo- 14, 17- dioxa-7-thia-4,l l,20-triazahexacos-l-yl]carbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 20.2 mg (148 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 43.3 mg (148 μιηοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 %> TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 23.4 mg (95 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 881 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 393 -
Intermediat F266
Trifluoressigsäure N-(3-aminopropyl)-N-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-diflu^
2,2-dimethylpropyl}-l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-py
diazaoctadecan- 18-amid (1 :1)
Figure imgf000394_0001
30.0 mg (0.043 mmol) 1 l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermediat C69) wurden zusammen mit 22.2 mg (0.056 mmol) Trifluoressigsäure N-{2-[2-(2- aminoethoxy)ethoxy]ethyl}-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-1 -yl)acetamid (1 :1) (Intermediat L83) in 1.9 mL Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 60 μΐ (0.34 mmol) N,N-Diisopropylethylamin zugegeben und 33 μΐ (0.056 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 20.5 mg (49 % d. Th.) der Verbindung 2- (Trimethylsilyl)ethyl-[ 19- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 13,18-trioxo-6,9-dioxa- 16-thia- 3,12,19-triazadocosan-22-yl] carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.38 min; MS (ESIpos): m/z = 969 (M+H)+.
19.1 mg (19.7 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[19-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 13 , 18-trioxo-6,9- dioxa-16-thia-3,12,19-triazadocosan-22-yl]carbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und BHC 15 1 040-A - 394 - mit 16.1 mg (118 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 34.6 mg (118 μιηοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 13.9 mg (75 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 825 (M+H)+.
Intermediat F267
S-{2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-[l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2,18-dioxo- 6,9,12, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan-l 8-yl]-L-cysteinyl-beta-alanin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000395_0001
Unter Argon wurden 13.4 mg (33.3 μιηοΐ) l-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2-oxo- 6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-säure (Intermediat L74) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 9.3 μΐ (54.4 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 12.6 mg (33.3 μιηοΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 25.0 mg (27.7 μιηοΐ) S-(11-{(1R)-1-[1-Benzyl- 4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11- diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cysteinyl-beta-alanin -trifluoressigsäure (1 :1) (siehe Synthese Intermediat F216) gelöst in 4,7 μΐ (27.7 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 90 Minuten bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 %> TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 6.90 mg (19 % d. Th.) der Verbindung S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12- BHC 15 1 040-A - 395 - dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2,18- dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cysteinyl-beta-alanin.
LC-MS (Methode 5): Rt = 4.44 min; MS (ESIpos): m/z = 1172 (M+H)+.
6.70 mg (5.71 μηιοΐ) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[l-(2,5-dioxo- 2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2,18-dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cysteinyl- beta-alanin wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 4.67 mg (34.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 10 mg (34.3 μιηοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.4 mg (67 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 1028 (M+H)+. Intermediat F268
Trifluoressigsäure N-(3-aminopropyl)-N-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}-28-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-6,23-dioxo-10,13,16,19-tetraoxa- 3-thia-7,22-diaza tacosan-l-amid (1 :1)
Figure imgf000396_0001
30.0 mg (0.043 mmol) 1 l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermediat C69) wurden zusammen mit 30.2 mg (0.056 mmol) Trifluoressigsäure N-(14-amino- BHC 15 1 040-A - 396 -
3 ,6,9, 12-tetraoxatetradec- 1 -yl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanamid (1 :1) (Intermediat L84) in 2.0 mL Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 60 μΐ (0.34 mmol) N,N- Diisopropylethylamin zugegeben und 33 μΐ (0.056 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 27.9 mg (59 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[4-{(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-32-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-5, 10,27-trioxo- 14, 17,20,23 -tetraoxa- 7-thia-4, 11 ,26-triazadotriacont- 1 -yl] carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.41 min; MS (ESIpos): m/z = 1114 (M+H)+.
25.6 mg (23.0 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[4-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-32-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-5,10,27-trioxo- 14,17,20,23-tetraoxa-7-thia-4,l l,26-triazadotriacont-l-yl]carbamat wurden in 2.5 mL Trifluorethanol gelöst und mit 18.8 mg (138 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 40.3 mg (138 μιηοΐ) Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 %> TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 %> TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 22.2 mg (88 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.94 min; MS (ESIpos): m/z = 969 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 397 -
Intermediat F269
4-{[(8Κ,14Κ)-13-(3-ΑηιίηορΓοργ1)-14-[1-06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-1-(2,5- dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 15,15-dimethyl-2,7, 12-trioxo- 10-thia-3 ,6, 13 -triazahexadecan-8- yl]amino}-4-oxobutansäure -trifluoressi säure (1 :1)
Figure imgf000398_0001
17.0 mg (0.0195 mmol) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-(4-tert-butoxy- 4-oxobutanoyl)-L-cystein (Intermediat C77) wurden zusammen mit 4.99 mg (0.0253 mmol) N-(2- Aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetamid (Intermediat LI) in 1.0 mL Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 27 μΐ (0.16 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin zugegeben und 15 μΐ (0.025 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.5 mg (46 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-4-{[(16R)-l 1-{(1R)-1-[1- benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-23-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -yl)-2,2-dimethyl-6, 12, 17,22-tetraoxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 , 18,21 -tetraaza-2-silatricosan- 16- yl]amino } -4-oxobutanoat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.47 min; MS (ESIpos): m/z = 1052 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 398 -
8.3 mg (7.89 μιηοΐ) tert-Butyl-4-{[(16R) 1-{(lRH-[l-be^
yl]-2,2-dimethylpropyl}-23-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2,2-dimethyl-6
tetraoxo-5-oxa-14-thia-7,l l,18,21-tetraaza-2-silatricosan-16-yl]amino}-4-oxobutanoat wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 6.45 mg (47.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 6 h bei 50 °C. 6.45 mg (47.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C Die Reaktionsmischung wurde mit 27.7 mg (94.6 μιηοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.10 mg (14 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 852 (M+H)+. Intermediat F270
Trifluoressigsäure -N-(3-aminopropyl)-N- {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2- yl]-2,2-dimethylpropyl}-N'-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino ethyl)succinamid (1 :1)
Figure imgf000399_0001
Unter Argon wurden 15.0 mg (22.9 μιηοΐ) l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silapentadecan-l 5-säure (Intermediat C78) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 8.0 μΐ (45.8 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 10.4 mg (27.4 μιηοΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 8.54 mg (27.4 μιηοΐ) Trifluoressigsäure N-(2-aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetamid (1 :1) (Intermediat LI) gelöst in 4.0 μΐ (22.9 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 1.0 BHC 15 1 040-A - 399 - mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 14.7 mg (77 %> d. Th.) der Verbindung 2- (Trimethylsilyl)ethyl-[3-({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} {4-[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]amino}ethyl)amino]-4- oxobutanoyl } amino)propyl] carbamat.
LC-MS (Methode 5): Rt = 1.33 min; MS (ESIpos): m/z = 835 (M+H)+.
13.2 mg (15.8 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[3-({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {4-[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino}ethyl)amino]-4-oxobutanoyl}amino)propyl]carbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 12.9 mg (94.8 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 27.7 mg (94.6 μιηοΐ) Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 %> TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 %> TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.9 mg (83 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 691 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 400 -
Intermediat F271
4-{[(20R,26R)-25-(3-Aminopropyl)-26-[l-^
dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-27,27-dimethy^
3 18,25-triazaoctacosan-20-yl]amino}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000401_0001
Unter Argon wurden 19.4 mg (22.2 μιηοΐ) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)- N-(4-tert-butoxy-4-oxobutanoyl)-L-cystein (Intermediat C77) in 2.0 ml DMF vorgelegt und mit 21.7 mg (44.4 μιηοΐ) Trifluoressigsäure — N-(14-amino-3,6,9,12-tetraoxatetradec-l-yl)-2-(2,5- dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetamid (1 :1) (Intermediat L74), 12 μΐ (67 μιηοΐ) Ν,Ν- Diisopropylethylamin und 16.9 mg (44.4 μιηοΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 18.1 mg (66 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-4- { [( 16R)- 11 - {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-35-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2,2-dimethyl-6,12,17,34-tetraoxo- 5,21 ,24,27,30-pentaoxa- 14-thia-7, 11,18,33 -tetraaza-2-silapentatriacontan- 16-yl]amino} -4- oxobutanoat.
LC-MS (Methode 4): Rt = 1.79 min; MS (ESIpos): m/z = 1250 (M+Na)+.
18.1 mg (14.7 μιηοΐ) tert-Butyl-4-{[(16R)-l l-{(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-35-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2,2-dimethyl-6,12,17,34- BHC 15 1 040-A - 401 - tetraoxo-5,21 ,24,27,30-pentaoxa- 14-thia-7, 11,18,33 -tetraaza-2-silapentatriacontan- 16-yl]amino } -4- oxobutanoat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 12.0 mg (88.4 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 25.8 mg (88.4 μιηοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1%o TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 12.3 mg (73 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 1028 (M+H)+. Intermediat F272
Trifluoressigsäure -N-(3-aminopropyl)-N- {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2- yl]-2,2-dimethylpropyl}-N'-[17-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-16-oxo-3,6,9,12-tetraoxa- 15 -azahe tadec- 1 -yl] succinamid (1 :1)
Figure imgf000402_0001
Unter Argon wurden 15.0 mg (22.9 μιηοΐ) l l-{(lR)-l -[ l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silapentadecan-l 5-säure (Intermediat C78) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 8.0 μΐ (45.8 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 10.4 mg (27.4 μιηοΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 13.4 mg (27.4 μιηοΐ) Trifluoressigsäure N-(14-amino-3,6,9,12-tetraoxatetradec-l-yl)-2-(2,5-dioxo-2,5- dihydro-lH-pyrrol-l -yl)acetamid (1 :1) (Intermediat L85) gelöst in 4.0 μΐ (22.9 μιηοΐ) Ν,Ν- Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1%o TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 15.8 mg (68 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[23-{(lR)- l -[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]- BHC 15 1 040-A - 402 -
2,2-dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 19,22-trioxo-6,9, 12,15-tetraoxa- 3,18,23-triazahexacosan-26-yl]carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.35 min; MS (ESIpos): m/z = 1011 (M+H)+.
15.1 mg (14.9 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[23-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 19,22 -trioxo- 6,9,12,15-tetraoxa-3,18,23-triazahexacosan-26-yl]carbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 12.2 mg (89.6 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 26.2 mg (89.6 μιηοΐ) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 %> TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.3 mg (70 %> d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 867 (M+H)+.
Intermediat F273
Trifluoressigsäure N-(3-aminopropyl)-N-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 19-dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-22- thia-3 , 18 -diazatetracosan-24-amid 1 :1)
Figure imgf000403_0001
Unter Argon wurden 20.0 mg (28.5 μιηοΐ) l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-l 4-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan-l 7- säure (Intermediat C69) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 10.0 μΐ (57.0 μιηοΐ) Ν,Ν- BHC 15 1 040-A - 403 -
Diisopropylethylamin und 13.0 mg (34.2 μιηοΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 16.7 mg (34.2 μιηοΐ) Trifluoressigsäure N-(14-amino-3,6,9,12- tetraoxatetradec-l-yl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetamid (1 :1) (Intermediat L85) gelöst in 5.0 μΐ (28.5 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 18.6 mg (62 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[25-{(lR)-l-[l-benzyl-4- (2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)-2,19,24-trioxo-6,9,12,15-tetraoxa-22-thia-3,18,25-triazaoctacosan-28-yl]carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.37 min; MS (ESIpos): m/z = 1057 (M+H)+.
17.1 mg (16.2 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[25-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 19,24-trioxo- 6,9,12,15-tetraoxa-22-thia-3,18,25-triazaoctacosan-28-yl]carbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 13.2 mg (97.0 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 28.4 mg (97.0 μιηοΐ) Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 %> TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 %> TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.80 mg (59 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 913 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 404 -
Intermediat F274
N- [(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl]-L-valyl-L-alanyl-S- {2- [(3 -aminopropyl) {( 1 R)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoeth^ cystein -trifluoressi säure (1 :1)
Figure imgf000405_0001
13.9 mg (0.0167 mmol) S-(l 1-{(^)-1-[1-Β6ηζ 1-4-(2,5^ίΑυοφ1ΐ6η 1)-1Η-ρ π·ο1-2- 1]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cystein trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) wurden zusammen mit 7.07 mg (0.0217 mmol) N-[(2,5- Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- l-yl)acetyl]-L-valyl-L-alanin (Intermediat L86) in 2.0 mL Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 23 μΐ (0.13 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin zugegeben und 13 μΐ (0.022 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.70 mg (19 % d. Th.) der Verbindung N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-valyl-L- alanyl-S-( 11 - {( 1R)-1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2- dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cystein.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 1024 (M+H)+.
10.6 mg (10.3 μιηοΐ) N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-valyl-L-alanyl-S-(l l- {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol -2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12- BHC 15 1 040-A - 405 - dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cystein wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 8.46 mg (62.1 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 18.1 mg (62.1 μιηοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.60 mg (54 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.69 min; MS (ESIpos): m/z = 880 (M+H)+.
Intermediat F275
N-[3-({2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)propanoyl]-N-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)acetyl]amino ethyl)-L-alpha-glutamin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000406_0001
39.0 mg (55.6 μιηοΐ) 1 l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermediat C69) wurden in 4.0 mL DMF vorgelegt, mit 41.6 mg (111 μιηοΐ) l-Benzyl-5-[2- (trimethylsilyl)ethyl]-L-glutamathydrochlorid (1 :1) (Intermediat L89), 29 μΐ (170 μιηοΐ) Ν,Ν- Diisopropylethylamin und 42.3 mg (111 μιηοΐ) HATU versetzt und 1 Stunde bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt BHC 15 1 040-A - 406 - mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 53.1 mg (93 % d. Th.) der Verbindung l-Benzyl-5-[2- (trimethylsilyl)ethyl] -N-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-L- glutamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.71 min; MS (ESIpos): m/z = 1021 [M+H]+
Unter Argon wurden 7.60 mg (33,9 μιηοΐ) Palladium(II)acetat in 3.0 ml Dichloromethan vorgelegt und mit 14 μΐ (100 μιηοΐ) Triethylamin und 110 μΐ (680 μmol) Triethylsilan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 5 min bei RT gerührt und mit 69.2 mg (67.7 μιηοΐ) l-Benzyl-5-[2- (trimethylsilyl)ethyl] -N-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-L- glutamat gelöst in 3.0 mL Dichlormethan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über einen Pappfilter filtriert und der Filterkuchen mit Dichlormethan nachgewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 38.4 mg (61 % d. Th.) der Verbindung 19S)-11-{(1R)-1-[1- Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12,17-trioxo- 19- {3-0X0-3 - [2-(trimethylsilyl)ethoxy]propyl} -5-oxa- 14-thia-7, 11,18-triaza-2-silaicosan-20-säure. LC-MS (Methode 1): Rt = 1.53 min; MS (ESIpos): m/z = 931 (M+H)+.
10.0 mg (10.7 μιηοΐ) (19S)-1 l-{(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo- 19- {3 -oxo-3 - [2-(trimethylsilyl)ethoxy]propyl} -5- oxa-14-thia-7,l l,18-triaza-2-silaicosan-20-säure wurden in 1.0 mL DMF vorgelegt, mit 6.73 mg (21.5 μιηοΐ) N-(2-Aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetamid 2,2,2- trifluorethan-l ,l-diol (1 :1) (Intermediat LI), 5.6 μΐ (32 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 8.17 mg (21.5 μιηοΐ) HATU versetzt und 1 Stunde bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunde bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1%o TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 6.90 mg (58 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N2-(l l-{(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12,17-trioxo-5-oxa-14-thia- BHC 15 1 040-A - 407 -
7,1 l-diaza-2-silaheptadecan-17-yl)-N-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino } ethyl)-L-alpha-glutaminat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.57 min; MS (ESIpos): m/z = 1110 [M+H]+
6.90 mg (6.21 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N2-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2- silaheptadecan- 17-yl)-N-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-1 -yl)acetyl]amino} ethyl)-L-alpha- glutaminat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 5.1 mg (37.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 5.1 mg (37.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 5.1 mg (37.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 10.1 mg (74.4 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C und 72 h bei RT. Die Reaktionsmischung wurde mit 54.5 mg (186 μιηοΐ) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 %> TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.4 mg (39 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 866 (M+H)+.
Intermediat F276
S-{2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-{3-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino}ethoxy)ethoxy]propanoyl}-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000408_0001
BHC 15 1 040-A - 408 -
Unter Argon wurden 9.08 mg (28.9 μιηοΐ) 3-[2-(2-{[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetyl]amino}ethoxy)ethoxy]propansäure (Intermediat L87) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 8.33 μΐ (48.2 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 11.0 mg (28.9 μιηοΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 20.0 mg (27.7 μιηοΐ) S-(11-{(1R)-1-[1-Benzyl- 4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11- diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) gelöst in 4,67 μΐ (24.1 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCNAVasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.70 mg (19 % d. Th.) der Verbindung S-(l 1-{(^)-1-[1-Βεηζ 1-4-(2,5^ί^0φ1ΐ6η 1)-1Η- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)- N- {3-[2-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yl)acetyl]amino} ethoxy)ethoxy]propanoyl} -L- cystein.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.47 min; MS (ESIpos): m/z = 1013 (M+H)+.
13.9 mg (13.7 μιηοΐ) S-(l l-{(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N- {3 - [2-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl]amino } ethoxy)ethoxy]propanoyl} -L-cystein wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 5.6 mg (41.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. 5.6 mg (41.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 30 Minuten bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 24.1 mg (82.4 μιηοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 %> TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1%o TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.8 mg (80 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.58 min; MS (ESIpos): m/z = 869 (M+H)+. Intermediat F277
N-[3-({2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino] -2-oxoethyl } sulfanyl)propanoyl] -3 - [(bromacetyl)amino] -D-alanin trifluoressigsäure (1 :1) BHC 15 1 040-A - 409 -
Figure imgf000410_0001
8.90 mg (8.88 μιηοΐ) Trifluoressigsäure 2-(trimethylsilyl)ethyl-3-amino-N-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl- 4-(2,5-difluoφhenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa-14- thia-7,1 l-diaza-2-silaheptadecan-17-yl)-D-alaninat (1 :1) (Intermediat C80) und 2.31 mg (9.77 μιηοΐ) l-(2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion wurden in 1 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2.9 μΐ (27 μmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.80 mg (65% d. Th.) der Verbinfung 2- (Trimethylsilyl)ethyl-N-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12,17-trioxo-5-oxa-14-thia-7,l l-diaza-2-silaheptadecan-17-yl)-3- [(bromacetyl)amino]-D-alaninat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.57 min; MS (ESIpos): m/z = 1008 (M+H)+.
5.80 mg (5.75 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2- silaheptadecan-17-yl)-3-[(bromacetyl)amino]-D-alaninat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 4.70 mg (34.5 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 4.70 mg (34.5 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 5 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 20.2 mg (69.0 μιηοΐ) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 %> TFA) versetzt. Die Reinigung BHC 15 1 040-A - 410 - erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.70 mg (34 %> d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.90 min; MS (ESIpos): m/z = 764 (M+H)+.
Intermediat F278
N-[3-({2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino] -2-oxoethyl} sulfanyl)propanoyl]-3 - { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)acetyl]amino -D-alanin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000411_0001
10.0 mg (9.98 μιηοΐ) Trifluoressigsäure 2-(trimethylsilyl)ethyl-3-amino-N-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl- 4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa-14- thia-7,1 l-diaza-2-silaheptadecan-17-yl)-D-alaninat (1 :1) (Intermediat C80) und 2.77 mg (11.0 μιηοΐ) l-{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-2-oxoethyl}-lH-pyrrol-2,5-dion wurden in 1 ml Dimethylformamid gelöst und mit 3.3 μΐ (30 μιηοΐ) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 2.0 μΐ (35 μιηοΐ) Essigsaeure versetzt und direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 %oTFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.50 mg (54%o d. Th.) der Verbinfung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2- BHC 15 1 040-A - 411 - yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5 -oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan-
17-yl)-3-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]amino}-D-alaninat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.51 min; MS (ESIpos): m/z = 1024 (M+H)+.
5.50 mg (5.36 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2- silaheptadecan- 17-yl)-3 - { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl]amino} -D-alaninat wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 4.39 mg (32.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. 4.39 mg (32.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. . 4.39 mg (32.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 28.2 mg (96.5 μιηοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1%o TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.70 mg (56 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 781 (M+H)+. Intermediat F279
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}[({(2R)-2-carboxy-2-[(3- carboxypropanoyl)amino]ethyl}sulfanyl)acetyl]amino)propyl]-L-alaninamid
Figure imgf000412_0001
BHC 15 1 040-A - 412 -
12.2 mg (14 μιηοΐ) S-(l 1-{(1Κ)-1-[1-Β6ηζγ1-4-(2,5-ώΑυο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ρνπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-(4-tert-butoxy- 4-oxobutanoyl)-L-cystein (Intermediat C77) wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 11.4 mg (83.8 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 24.5 mg (83.8 μιηοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.60 mg (42 % d. Th.) der Verbindung 4-{[(lR)-2-({2-[(3- Aminopropyl) {(1 R)-l -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)-l-carboxyethyl]amino}-4-oxobutansäure trifluoressigsäure (1 :1).
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 673 (M+H)+.
10.0 mg (12.7 μιηοΐ) 4-{[(lR)-2-({2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)-l-carboxyethyl]amino}-4- oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1) und 7.41 mg (12.7 μιηοΐ) 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-[6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alaninat (Intermediat L88) wurden in 1.5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 4.4 μΐ (25 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 2.0 μΐ (35 μιηοΐ) Essigsaeure versetzt und direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%iTFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.20 mg (39%> d. Th.) der Titel Verbinfung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.11 min; MS (ESIpos): m/z = 1036 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 413 -
Intermediat F280
Trifluoressigsäure --N-[2-({(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benz^
yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amm^
pyrrol- 1 -yl)benzamid (1 :1)
Figure imgf000414_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C64 durch Kupplung mit kommerziell erhältlichem l-(3-{[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]carbonyl}phenyl)-lH-pyrrol-2,5-dion und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 755 (M+H)+.
Intermediat F281
N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl} -3- {[N-(bromacetyl)-beta-alanyl]amino} -D-alanin trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000414_0002
BHC 15 1 040-A - 414 -
Zunächst wurden die modifizierten Aminosäurebausteine N-(Bromacetyl)-beta-alanin sowie 2- (Trimethylsilyl)ethyl-3-amino-N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alaninat nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. Anschließend wurden diese in Gegenwart von HATU und Morpholin miteinander gekuppelt. Dann wurde mittels 10%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgruppe abgelöst und so das Intermediat 2-(Trimethylsilyl) ethyl-3-{[N- (bromacetyl)-b eta-alanyl] amino } -D-alaninat erhalten.
Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und 4-Methylmorpholin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 791 und 793 (M+H)+.
Intermediat F282
Trifluoressigsäure -(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino] -N-(3 - { [N-(bromacetyl)glycyl] amino } propyl)butanamid (1 :1)
Figure imgf000415_0001
Zunächst wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von tert-Butylglycinat und Bromessigsäureanhydrid das Intermediat Trifluoressigsäure -N-(3-aminopropyl)-N2- (bromacetyl)glycinamid (1 :1) hergestellt.
Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und 4-Methylmorpholin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 747 und 749 (M+H) BHC 15 1 040-A - 415 -
Intermediat F283
N-[(2R)-2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lRH-[l -benz^^
dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)-2-carbox
asparagin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000416_0001
Zunächst wurde ausgehend von (2S)-2-Amino-4-oxo-4-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]butansäure und Bromessigsäureanhydrid der modifizierten Aminosäurebaustein (2S)-2-[(Bromacetyl)amino]-4- oxo-4-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]butansäure sowie ausgehend von kommerziell erhältlichem 3- { [(Benzyloxy)carbonyl]amino } -N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alanin — N-cyclohexylcyclohexanamin (1 :1) der Aminosäurebaustein 2-(Trimethylsilyl)ethyl-3-amino-N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alaninat hergestellt. Beide Bausteine wurden in Gegenwart von HATU und Morpholin miteinander gekuppelt und anschließend wurde mittels 5%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgruppe unter Erhalt der Silylethylester-Schutzgruppen abgelöst und so das Intermediat Trifluoressigsäure — 2-(trimethylsilyl)ethyl-N- {(2R)-2-amino-3-oxo-3 -[2-
(trimethylsilyl)ethoxy] propyl}-N2-(bromacetyl)-L-alpha-asparaginat (1 :1) erhalten.
Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und 4-Methylmorpholin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 835 und 837 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 416 -
Intermediat F284
Ν-{(28)-2-Αηιίηο-4-[{(1Κ)-1-[1 -06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3 - { [ 1 -(2,5 -dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 18- dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan- 18-yl]amino } -D-alanin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000417_0001
Zunächst wurde Intermediat L80 mit kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt und anschließend wurde mittels 16%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgruppe unter Erhalt der Silylethylester-Schutzgruppe abgelöst.
Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und N, N-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 984.45 (M+H)
BHC 15 1 040-A - 417 -
Intermediat F285
Ν-{(28)-2-Αηιίηο-4-[{(1Κ)-1-[1 -06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3 -[( 18-brom- 17-oxo-4,7, 10,13 -tetraoxa- 16- azaoctadecan-l -oyl)amino] -D-alanin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000418_0001
Zunächst wurde Intermediat L80 mit kommerziell erhältlichem Bromessigsäureanhydrid gekuppelt und anschließend wurde mittels 20%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgruppe unter Erhalt der Silylethylester-Schutzgruppe abgelöst.
Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und N, N-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 967 und 969 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 418 -
Intermediat F286
1-[(Ν-{(28)-2-Αηιίηο-4-[{(1Κ)-1-[1-06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3 - { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl) acetyl]amino}-D-alanyl)amino]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-säure -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000419_0001
Zunächst wurde Intermediat L91 mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamm gekuppelt und anschließend wurde mit 12.5%-iger TFA in DCM die Boc-Schutzgruppe abgelöst. Das so erhaltene Intermediat wurde mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamm gekuppelt und anschließend durch Entschützung mit Zinkchlorid in die Titelverbindung überfuhrt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 984 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 419 -
Intermediat F288
Ν-{(28)-2-Αηιίηο-4-[{(1Κ)-1-[1 -06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3 -( {N- [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)acetyl]-L-seryl}amino)-D-alanin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000420_0001
35 mg (39 μιηοΐ) von Intermediat C74 wurden in Gegenwart von HATU und N, N- Diisopropyethylamin mit N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-serin gekuppelt, das zuvor ausgehend von tert-Butyl-O-tert-butyl-L-serinat und (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)essigsäure hergestellt wurde. Nach Entschützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 14 mg (38% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.43 min; MS (ESIpos): m/z = 824.34 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 420 -
Intermediat F289
N2-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benz^
dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-N6-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyr^
lysin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000421_0001
Zunächst wurde Trifluoressigsäure -2-(trimethylsilyl)ethyl-N6-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l-yl)acetyl]-D-lysinat (1 :1) nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von N6- [(Benzyloxy)carbonyl]-N2-(tert-butoxycarbonyl)-D-lysin hergestellt.
12.5 mg (25 μιηοΐ) von diesem Intermediat wurden in Gegenwart von HATU und 4- Methylmorpholin mit 15 mg (23 μιηοΐ) von Intermediat C58 gekuppelt. Nach Entschützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 14 mg (53% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 779 (M+H)
BHC 15 1 040-A - 421 -
Intermediat F290
Ν2-{(28)-2-Αηιίηο-4-[{(1Κ)-1-[1-06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ρνπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-N6-(bromacetyl)-D-lysin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000422_0001
Zunächst wurde Trifluoressigsäure— 2-(trimethylsilyl)ethyl-N6-(bromacetyl)-D-lysinat (1 :1) nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von N6-[(Benzyloxy)carbonyl]-N2-(tert- butoxycarbonyl)-D-lysin hergestellt.
12 mg (25 μιηοΐ) von diesem Intermediat wurden in Gegenwart von HATU und 4- Methylmorpholin mit 15 mg (23 μιηοΐ) von Intermediat C58 gekuppelt. Nach Entschützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 7 mg (36% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 762 und 764 (M+H)
BHC 15 1 040-A - 422 -
Intermediat F291
N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-valyl-N-{3-[{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5- άίΑυοφ
Figure imgf000423_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Beispiel M9 zunächst durch Kupplung mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 1 -stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Kupplung mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamm in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.21 min; MS (ESIpos): m/z = 777 (M+H)
BHC 15 1 040-A - 423 -
Intermediat F293
Ν-{(28)-2-Αηιίηο-4-[{(1Κ)-1-[1 -06ηζγ1-4-(2,5-ώηυο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3 - { [3 -(2,5 -dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)benzoyl]amino} -D-alanin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000424_0001
35 mg (39 μιηοΐ) von Intermediat C74 wurden in 4 ml DMF gelöst und in Gegenwart von N, N- Diisopropylethylamin mit 13.5 mg (43 μιηοΐ) kommerziell erhältlichem l-(3-{[(2,5- Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy] carbonyl}phenyl)-lH-pyrrol-2,5-dion gekuppelt. Nach Entschützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 12 mg (34% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt = 0.93 min; MS (ESIpos): m/z = 799 (M+H)+.
Intermediat F294
N-{5-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-valyl-N-{(l S)-3-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-
(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-l-carboxypropyl}-L- alaninamid
Figure imgf000424_0002
BHC 15 1 040-A - 424 -
41 mg (0.05 mmol) von Intermediat C76 gelöst in 12 mL Methanol wurden über 10 mg 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h lang bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhielt 32 mg (92%> d.Th.) des entschützten Intermediats.
15 mg (0.022 mmol) von diesem Intermediat wurden in DMF gelöst und mit 13 mg (0.039 mmol) l,l'-[(l,5-Dioxopentan-l,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion und 7 μΐ^ N, N-Diisopropylethyl amin versetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand mittels HPLC gereinigt. So wurden 9 mg (45%o d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.08 min; MS (ESIpos): m/z = 895 (M+H)+.
Intermediat F295
N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-valyl-N-{(l S)-3-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl] -2,2-dimethylpropyl } (gly coloyl)amino] - 1 -carboxypropyl } -L- alaninami
Figure imgf000425_0001
41 mg (0.05 mmol) von Intermediat C76 gelöst in 12 mL Methanol wurden über 10 mg 10%o-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h lang bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhielt 32 mg (92%o d.Th.) des entschützten Intermediats.
15 mg (0.022 mmol) von diesem Intermediat wurden in 4 mL DMF gelöst und mit 10 mg (0.039 mmol) l-{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l -yl)oxy]-2-oxoethyl}-lH-pyrrol-2,5-dion und 7 μΐ^ N, N- BHC 15 1 040-A - 425 -
Diisopropylethyl amin versetzt. Nach 2 h Rühren bei RT wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand mittels HPLC gereinigt. So wurden 10 mg (56% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.08 min; MS (ESIpos): m/z = 821 (M+H)+.
Intermediat F296
Trifluoressigsäure -(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N- {2-[(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-1 - yl)acetyl]amino} ethyl)sulfonyl]ethyl}butanamid (1 :1)
Figure imgf000426_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat L81 durch Kupplung mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 30-minütige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Das entschützte Intermediat wurde anschließend durch Kupplung mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamm und schließlich durch Entschützung mit Zinkchlorid in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 785 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 426 -
Intermediat F297
S-{2-[{(lR) -[l-Ber^l-4-(2,5-difluo^henyl) H-pyrrol-2-yl]-2,2-dime lpropyl}^
ylmethyl)amino]-2-oxoethyl}-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-cystein^ trifluoressigsäure (1 :1) (Isomer 1)
Figure imgf000427_0001
Eine Lösung von 36 mg (0.03 mmol, 68% Reinheit) S-[2-({(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl] -2,2-dimethylpropyl } { [ 1 -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3 - yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-cystein (Intermediat C95) in 0.74 ml 2,2,2-Trifluoroethanol unter Argon wurde mit 15 mg (0.11 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 7 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 32 mg (0.11 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 6,4 mg (25 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.95 min; MS (ESIpos): m/z = 792 (M+H-CF3C02H)+. BHC 15 1 040-A - 427 -
Intermediat F298
S-{2-[{(lR) -[l-Ber^l-4-(2,5-difluo^henyl) H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl^
ylmethyl)amino]-2-oxoethyl}-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-cystei trifluoressigsäure (1 :1) (Isomer 2)
Figure imgf000428_0001
Eine Lösung von 45 mg (0.04 mmol, 71% Reinheit) S-[2-({(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl] -2,2-dimethylpropyl } { [ 1 -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3 - yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-cystein (Intermediat C96) in 0.94 ml 2,2,2-Trifluoroethanol unter Argon wurde mit 19 mg (0.14 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 42 mg (0.14 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 5,7 mg (18 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.96 min; MS (ESIpos): m/z = 791 (M+H-CF3C02H)+. BHC 15 1 040-A - 428 -
Intermediat F299
S-(2-{(3-Aminopropyl)[(R)-[l-benzyl-4-(2,5-diflu^
yl] (cyclohexyl)methyl] amino } -2^
yl)hexanoyl]-L-cy stein -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000429_0001
Eine Lösung von 88.0 mg (0.09 mmol) 8-{11-[(Κ)-[1-Β6ηζγ1-4-(2,5-ώΑυο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ρνΓΓθ1-2- yl](cyclohexyl)methyl]-2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl} -N-[6-(2,5- dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-cystein (Intermediat C85) in 1.88 ml 2,2,2- Trifluoroethanol wurde mit 76.8 mg (0.57 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 164.6 mg (0.57 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 31 mg (35 % d. Th ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.82 min; MS (ESIpos): m/z = 792 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 429 -
Intermediat F300
(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-(2-{[(2R)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)propanoyl]amino}ethyl)butanamid
Figure imgf000430_0001
Eine Lösung von 7 mg (0.08 mmol)) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-{(2S)-4-[{(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH- yrrol-2-yl]-2,2-dimethyl ro yl}(glycoloyl)amino]-l-[(2-{[(2R)-2-(2,5-dioxo- 2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)propanoyl]amino } ethyl)amino]- 1 -oxobutan-2-yl} carbamat
(Intermediat 100) in 0.2 ml 2,2,2-Trifluoroethanol unter Argon wurde mit 11 mg (0.08 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 8 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 14 mg (0.05 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 1 ,6 mg (27 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 707 (M+H-CF3CO2H) BHC 15 1 040-A - 430 -
Intermediat F302
S-{2-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorophenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(pyCT ylmethyl)amino]-2-oxoethyl}-N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-cysteine trifluoroacetate (1 :1) (Isomer 1)
Figure imgf000431_0001
Eine Mischung von 56.9 mg (58.2 mmol, 85 % Reinheit) S-[2-({(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl] -2,2-dimethylpropyl } { [( 1 -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3 - yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-cystein (Intermediat C99) in 1.4 ml 2,2,2-Trifluoroethanol unter Argon wurde mit 31.7 mg (0.23 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 68.0 mg (0.23 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 7 mg (13 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 736 (M+H-CF3C02H)+. BHC 15 1 040-A - 431 -
Intermediat F304
N-(2- { [3 -( {2-[ {( 1 RH -[ 1 -benzyl-4-(2,5-diflTO^
dimethylpropyl } (pyrrolidin-3 -yta
(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanamid (1 :1) Trifluoressigsäure (Isomer 2)
Figure imgf000432_0001
Eine Lösung von 22.3 mg (0.02 mmol) tert-Butyl-3-[2-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-18-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-3,8,13 rioxo-5- thia-2,9,12-triazaoctadec-l-yl]pyrrolidin-l-carboxylat (Intermediat 105) in 0.64 ml 2,2,2- Trifluoroethanol wurde mit 13.2 mg (0.10 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 8 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 28.36 mg (0.10 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Man erhielt 5 mg ( 23 % d. Th ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 5): Rt 3.05 min; MS (ESIpos): m/z = 819 (M+H-CF3C02H)+. BHC 15 1 040-A - 432 Intermediat F305
N-{(lR) -[l-Ber^l-4-(2,5-difluo^henyl) H-pyrrol-2-yl]-2,2-dime lpropyl}-22-^
2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-6, 17-dioxo-N-(pyrrolidin-3-ylmethyl)- 10, 13 -dioxa-3-thia-7,16- diazadocosan-l-amid (1 :1) Trifluoressigsäure (Isomer 2)
Figure imgf000433_0001
Eine Lösung von 24.80 mg (0.02 mmol) tert-Butyl-3-[2-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-24-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-3,8,19 rioxo- 12,15-dioxa-5-thia-2,9,18-triazatetracos-l-yl]pyrrolidin-l-carboxylat (Intermediat C99) in 0.65 ml 2,2,2-Trifluoroethanol wurde mit 13.42 mg (0.10 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 8 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 28.78 mg (0.10 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 10 mg (44 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 5): R* = 3.11 min; MS (ESIpos): m/z = 907 (M+H-CF3C02H)+. BHC 15 1 040-A - 433 -
Intermediat F306
N6-(N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-bra^
dimethylpropyl } (gly coloyl)amino^
pyrrol-1 -yl)acetyl]-L-valyl-L-alanyl-beta-alanyl} -L-lysin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000434_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 24 mg (0.029 mmol) des Intermediats C61 mit 30 mg (0.035 mmol) von Intermediat L99 in Gegenwart von 16.7 mg (0.044 mmol) HATU sowie 15 μΐ Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 19 mg (52% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 1091 (M+H)
BHC 15 1 040-A - 434 -
Intermediat F307
N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-L-alanyl-S- {(5R, 14R)- 13-(3- aminopropyl)- 14-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -5-carboxy- 15,15-dimethyl- 2,7,12-trioxo-10-thia-3,6,13-triazahexadec-l- l}-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000435_0001
8.90 mg (8.88 μιηοΐ) Trifluoressigsäure 2-(trimethylsilyl)ethyl-3-amino-N-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl- 4-(2,5-difluoφhenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa-14- thia-7,1 l-diaza-2-silaheptadecan-17-yl)-D-alaninat (1 :1) (Intermediat C80) und 2.31 mg (9.77 μιηοΐ) l-(2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion wurden in 1 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2.9 μΐ (27 μιηοΐ) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.80 mg (65% d. Th.) der Verbinfung 2- (Trimethylsilyl)ethyl-N-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12,17-trioxo-5-oxa-14-thia-7,l l-diaza-2-silaheptadecan-17-yl)-3- [(bromacetyl)amino]-D-alaninat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.57 min; MS (ESIpos): m/z = 1008 (M+H)+.
2-(Trimethylsilyl)ethyl-N-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12,17-trioxo-5-oxa-14-thia-7,l l-diaza-2-silaheptadecan-17-yl)-3- BHC 15 1 040-A - 435 -
[(bromacetyl)amino]-D-alaninat (31.9 mg, 31.6 μιηοΐ) und L-Cystein (7.66 mg, 63.2 μιηοΐ) wurden in 3.0 ml DMF gelöst und über Nacht bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 28.1 mg (76% d. Th.) der Verbinfung S-[(19R)-11-{(1R)-1- [l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12,17,22- tetraoxo-19- { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -5-oxa-l 4-thia-7, 11 , 18,21 -tetraaza-2-silatricosan- 23-yl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1).
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.52 min; MS (ESIpos): m/z = 1049 [M+H]+
S-[( 19R)-11 - {(1 R)-l -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2- dimethyl-6, 12,17,22-tetraoxo- 19- { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -5 -oxa- 14-thia-7, 11,18,21- tetraaza-2-silatricosan-23-yl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (13.5 mg, 11.6 μιηοΐ) wurde in 1.0 ml DMF gelöst, mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alaninat (6.76 mg, 11.6 μιηοΐ) (Intermediat L88) und N,N- Diisopropylethylamin (4.0 μΐ, 23 μιηοΐ) versetzt und lh bei RT nachgerührt gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%iTFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 11.1 mg (68%o d. Th.) der Verbinfung N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-L-alanyl-S-[( 19R)- 11 - {( 1 R)- 1 - [ 1 - benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17,22- tetraoxo-19- { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -5-oxa-l 4-thia-7, 11 , 18,21 -tetraaza-2-silatricosan- 23-yl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 14): Rt = 7.38 min; MS (ESIpos): m/z = 1412 [M+H]+
N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-L-alanyl-S- [( 19R)- 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 - benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17,22- tetraoxo-19- { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -5-oxa-l 4-thia-7, 11 , 18,21 -tetraaza-2-silatricosan- 23-yl]-L-cystein (9.40 mg, 6.65 μιηοΐ) wurde in 2.0 ml Trifluorethanol gelöst, mit Zinkdichlorid (5.44 mg, 39.9 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Zinkdichlorid (5.44 mg, 39.9 μιηοΐ) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure (23.4 mg, 79.8 μιηοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 %> TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% BHC 15 1 040-A - 436 -
TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.60 mg (66 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.93 min; MS (ESIpos): m/z = 1168 (M+H)+.
Intermediat F308
N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-N-[( 12R, 19R)- 19-amino-4- {( 1 R)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-12,19-dicarboxy-5,10,15- trioxo-7,17-dithia-4,l l,14-triazanonadec-l-yl]-L-alaninamid -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000437_0001
N-[3-({2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino] -2-oxoethyl } sulfanyl)propanoyl] -3 - [(bromacetyl)amino] -D-alanin trifluoressigsäure (1 :1) (12.7 mg, 14.5 μιηοΐ) und N-{[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L- cystein (3.84 mg, 14.5 μιηοΐ) wurden in 1.5 ml DMF gelöst und über Nacht bei RT nachgerührt. Dann wurde N,N-Diisopropylethylamin (2.5 μΐ, 14 μmol)zugegeben. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei RT und wurde dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.40 mg (48 % d. Th.) der Verbindung S-{(5R,14R)-13-(3-Aminopropyl)- 14-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -5-carboxy- 15,15-dimethyl-2,7, 12-trioxo- 10- thia-3 ,6, 13 -triazahexadec- 1 -yl} -N- { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L-cystein
trifluoressigsäure (1 :1). BHC 15 1 040-A - 437 -
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.03 min; MS (ESIpos): m/z = 949 [M+H]+
S-{(5R,14R)-13-(3-Aminopropyl)-14-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-5-carboxy- 15,15-dimethyl-2,7, 12-trioxo- 10-thia-3 ,6, 13-triazahexadec- 1 -yl} -N- { [2-
(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (7.50 mg, 7.05 μιηοΐ) wurde in 1.0 ml DMF gelöst und mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alaninat (4.11 mg, 82 % Reinheit, 7.05 μιηοΐ) (Intermediat L88) und N,N- Diisopropylethylamin (2.5 μΐ, 14 μmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde lh bei RT gerührt und dann direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.30 mg (46 %>) der Verbindung N-[6-(2,5- Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[(8R,15R)-23-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -8, 15-dicarboxy-2,2-dimethyl-6, 12,17,22- tetraoxo-5-oxa-10,20-dithia-7,13,16,23-tetraaza-2-silahexacosan-26-yl]-L-alaninamid.
LC-MS (Methode 14): Rt = 6.47 min; MS (ESIpos): m/z = 1312 [M+H]+
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[(8R,15R)-23-{(lR)-l-[l- benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-8,15-dicarboxy-2,2-dimethyl- 6, 12, 17,22-tetraoxo-5-oxa-l 0,20-dithia-7, 13,16,23-tetraaza-2-silahexacosan-26-yl]-L-alaninamid (4.00 mg, 3.05 μιηοΐ) wurde in 1.0 ml Trifluorethanol gelöst und mit Zinkdichlorid (2.49 mg, 18.3 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C und wurde dann mit Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure (5.34 mg, 18.3 μιηοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1%o TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.50 mg (64 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.00 min; MS (ESIpos): m/z = 1168 [M+H]+
BHC 15 1 040-A - 438 -
Intermediat F309
4-{[(11Κ,17Κ)-16-(3-ΑηιίηορΓοργ1)-17-[1-06ηζγ1-4-(2,5-ώΑυο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-1-(2,5- dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 18,18-dimethyl-6,6-dioxido-2, 10,15-trioxo-61ambda6, 13 -dithia- 3,9,16-triazanonadecan-l l-yl]amino}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000439_0001
S-(l l-{(lR) -[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl) H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl- 6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-(4-tert-butoxy-4-oxobutanoyl)-L-cystein (50.0 mg, 57.3 μιηοΐ) (Intermediat C77) und Trifluoressigsäure -benzyl-{2-[(2- aminoethyl)sulfonyl]ethyl}carbamat (1 :1) (27.5 mg, 68.7 μιηοΐ) (Intermediat L81) wurden in 4.0 ml DMF vorgelegt, mit HATU (26.1 mg, 68.7 μιηοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin: (30 μΐ, 170 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und dann direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 53.9 mg (81 %) der Verbindung tert-Butyl-4-{[(12R)-17-{(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-26,26-dimethyl-7,7-dioxido-3,l 1,16,22- tetraoxo- 1 -phenyl-2,23-dioxa-71ambda6, 14-dithia-4, 10, 17,21 -tetraaza-26-silaheptacosan- 12- yl]amino } -4-oxobutanoat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.54 min; MS (ESIpos): m/z = 1141 [M+H]+
Unter Argon, wurde Palladium(II)acetat (5.12 mg, 22.8 μιηοΐ) in 3.0 ml DCM vorgelegt, mit Triethylamin (9.5 μΐ, 68 μιηοΐ) und Triethylsilan (73 μΐ, 460 μmol) versetzt und 5 min. gerührt. Dann wurde tert-Butyl-4-{[(12R)-17-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -26,26-dimethyl-7,7-dioxido-3 ,11,16,22-tetraoxo- 1 -phenyl-2,23 -dioxa- 71ambda6, 14-dithia-4, 10, 17,21 -tetraaza-26-silaheptacosan- 12-yl]amino} -4-oxobutanoat (52.1 mg, BHC 15 1 040-A - 439 -
45.6 μmol) in 2.0 ml DCM zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT nachgerührt und mit 2.0 ml Wasser versetzt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mit Acetonitril versetzt, filtriert und mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/ Wasser/0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 43.4 mg (85 %>) der Verbindung trifluoressigsäure-tert-butyl-4-{[(16R)-23-amino-l l-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-21 ,21 -dioxido-6, 12,17-trioxo-5 - oxa- 14,21 lambda6-dithia-7, 11,18-triaza-2-silatricosan- 16-yl]amino} -4-oxobutanoat (1 :1).
LC-MS (Method 1): Rt = 1.21 min; MS (ESIpos): m/z = 1007 [M+H]+
Trifluoressigsäure-tert-butyl-4- { [( 16R)-23-amino- 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-21 ,21 -dioxido-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14,21 lambda6- dithia-7,1 l,18-triaza-2-silatricosan-16-yl]amino}-4-oxobutanoat (1 :1) (20.0 mg, 17.8 μιηοΐ) und (2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)essigsäure (3.32 mg, 21.4 μιηοΐ) wurden in 2.0 ml DMF vorgelegt, und mit HATU (8.14 mg, 21.4 μιηοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (9.3 μΐ, 54 μιηοΐ) versetzt.
Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/ Wasser/0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 17.4 mg (85 %) der Verbindung tert-Butyl-4-{[(16R)-l 1-{(1R)-1-[1- benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-26-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -yl)-2,2-dimethyl-21 ,21 -dioxido-6, 12,17,25-tetraoxo-5-oxa- 14,21 lambda6-dithia-
7.11.18.24- tetraaza-2-silahexacosan-l 6-yl]amino} -4-oxobutanoat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 1144 [M+H]+
Tert-Butyl-4- { [( 16R)- 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-26-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2,2-dimethyl-21,21-dioxido-
6.12.17.25- tetraoxo-5 -oxa- 14,21 lambda6-dithia-7, 11 , 18,24-tetraaza-2-silahexacosan- 16-yl]amino } - 4-oxobutanoat (15.9 mg, 13.9 μιηοΐ) wurde in 2.0 ml Trifluorethanol gelöst, mit Zinkdichlorid (11.4 mg, 83.4 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Zinkdichlorid (11.4 mg, 83.4 μιηοΐ) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Zinkdichlorid (11.4 mg, 83.4 μιηοΐ) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure (73.2 mg, 250 μιηοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% BHC 15 1 040-A - 440 -
TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10 mg (68 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.45 min; MS (ESIpos): m/z = 944 [M+H]+
Intermediat F310
Trifluoressigsäure-N-[(8R, 14R)- 13 -(3 -aminopropyl)- 14-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H- pyrrol-2-yl] - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 15, 15-dimethyl-2,7, 12-trioxo- 10-thia- 3,6,13 -triazahexadecan- 8-yl]-2,5,8,l l -tetraoxatetrade can- 14 -amid (1 :1)
Figure imgf000441_0001
S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl- 6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (100 mg, 120 μιηοΐ) (Intermediat C70) und l-[(14-Oxo-2,5,8,l l-tetraoxatetradecan-14-yl)oxy]pyrrolidin-2,5- dion (44.1 mg, 132 μιηοΐ) wurden in 3.0 ml DMF vorgelegt und mit 4-Methylmorpholin (40 μΐ, 360 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt, mit Essigsäure (420 μιηοΐ) gequencht und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 69.4 mg (62 % d. Th.) der Verbindung S- ( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl- 6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-( 14-oxo-2,5,8, 11 -tetraoxatetradecan- 14-yl)-L- cystein.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.61 min; MS (ESIneg): m/z = 933 [M-H]" BHC 15 1 040-A - 441 -
S^l l-{(lR) -[l-Bem^l-4-(2,5-difluo^henyl) H-pyrrol-2-yl]-2,2-dime lpropyl^
6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-( 14-oxo-2,5,8, 11 -tetraoxatetradecan- 14-yl)-L- cystein (27.0 mg, 28.9 μmol) wurde in 2.0 ml DMF vorgelegt und mit N-(2-Aminoethyl)-2-(2,5- dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetamid (11.4 mg, 57.7 μιηοΐ) (Intermediat LI), N,N- Diisopropylethylamin (15 μΐ, 87 μιηοΐ) und HATU (22.0 mg, 57.7 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3h bei RT gerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/ Wasser/0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 13.7 mg (43 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-{(16R)-21-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} - 16- [(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)acetyl]amino}ethyl)carbamoyl]-14,20-dioxo-2,5,8,l l-tetraoxa-18-thia-15,21-diazatetracosan-24- yljcarbamat.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.54 min; MS (ESIpos): m/z = 1114 [M+H]+
2-(Trimethylsilyl)ethyl- {( 16R)-21 - {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-16-[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]amino}ethyl)carbamoyl]- 14,20-dioxo-2,5,8,l l-tetraoxa-18-thia-15,21-diazatetracosan-24-yl}carbamat (13.7 mg, 12.3 μιηοΐ) wurde in 2.0 ml Trifluorethanol gelöst, mit Zinkdichlorid (10.1 mg, 73.8 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure (21.6 mg, 73.8 μιηοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.30 mg (47 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.01 min; MS (ESIpos): m/z = 970 [M+H]+
BHC 15 1 040-A - 442 -
Intermediat F311
S-{2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-bra^
dimethylpropyl} amino] -2-oxoethyl} -N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2,30-dioxo- 6,9, 12, 15, 18,21 ,24,27-octaoxa- -azatriacontan-30- l]-L-cystein-trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000443_0001
1 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2-oxo-6,9, 12, 15, 18,21 ,24,27-octaoxa-3 -azatriacontan- 30-säure (10.8 mg, 18.7 μιηοΐ) (Intermediat L97) wurde in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit N,N- Diisopropylethylamin (5.4 μΐ, 31.2 μmol) und HATU (7.10 mg, 18.7 μιηοΐ) versetzt und 10min. nachgerührt. Dann wurde S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cystein trifluoressigsäure (1 :1) (12.9 mg, 15.6 μιηοΐ) (Intermediat C71) in 1.0 ml DMF und N,N- Diisopropylethylamin (2.7 μΐ, 15.6 μmol) gelöst, zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei RT gerührt und dann direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.5 mg (18 %) der Verbindung S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12- dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2,30- dioxo-6,9,12,15,18,21,24,27-octaoxa-3-azatriacontan-30-yl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.30 min; MS (ESIneg): m/z = 1276 [M-H]" BHC 15 1 040-A - 443 -
S^l l-{(lR) -[l-Ber^l-4-(2,5-difluo^henyl) H-pyrrol-2-yl]-2,2-dime lpropyl^
6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)- 2,30-dioxo-6,9,12,15,18,21,24,27-octaoxa-3-azatriacontan-30-yl]-L-cystein (3.50 mg, 2.74 μιηοΐ) wurde in 1.0 ml Trifluorethanol gelöst, mit Zinkdichlorid (6.25 mg, 16.4 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure (47 μΐ, 16 μmol) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.0 mg (59 % d. Th.) der Titel Verbindung. LC-MS (Methode 1): Rt = 0.94 min; MS (ESIpos): m/z = 1133 (M+H)+.
Intermediat F312
N- [(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl]-L-valyl-N- [(2S)-4-[ {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-l-{[2-(L-gamma- glutamylamino)ethyl]amino} - 1 -oxobutan-2-yl] -L-alaninamid -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000444_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C103 durch Kupplung mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 1 -stündige Hydrierung über 10%>- igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Das entschützte Intermediat wurde anschließend durch Kupplung mit (2,5-Dioxo-2,5- BHC 15 1 040-A - 444 - dihydro-lH-pyrrol-l -yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamm und schließlich durch Entschützung mit Zinkchlorid und Reinigung durch präparative HPLC in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.9 min; MS (ESIpos): m/z = 992 (M+H)+. Intermediat F313
S-[2-( {(1 R)-l -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} { [(3R,4R)-4- fluorpyrrolidin-3 -yl]methyl} amino)-2-oxoethyl]-N- [ 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 2, 18-dioxo-6,9, 12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-l 8-yl]-L-cystein-trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000445_0001
Zu einer Lösung von 55.0 mg (0.14 mmol) von l-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-2-oxo- 6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-säure in 2.60 ml DMF unter Argon wurden 16.9 mg (0.13 mmol) Ν,Ν-diisoprylethylamin und 50.0 mg (0.13 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 40.0 mg (0.05 mmol) S-[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} {[(3R,4R)-4-fluor-l-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}pyrrolidin-3- yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-L-cystein (Intermediat C107) hinzugegeben und das Gemisch über Nacht bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurdemittels präp. HPLC gereinigt Man erhielt 10 mg (13 % d. Th., Reinheit 82%) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.36 min; MS (ESIpos): m/z = 1145 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 445 -
Eine Lösung von 10.9 mg (7.8 mmol, 82% Reinheit) S-[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[(3R,4R)-4-fluor-l- {[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-N-[l-(2,5- dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2, 18-dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]- L-cystein in 0.85 ml 2,2,2-Trifluoroethanol wurde mit 4.3 mg (0.03 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 9.1 mg (0.03 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung mittels präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 2.3 mg ( 26 % d. Th ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 781 (M+H-CF3C02H)+.
Intermediat F314
Trifluoressigsäure -3 - { [2-( {(1 R)- 1 - [ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} {[(3S,4R)-4-fluoφyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]sulfanyl}-N-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]amino}ethyl)propanamid
Figure imgf000446_0001
Zu einer Lösung von 50.0 mg (0.04 mmol, ) von 3-{[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[(3R, 4R)-4-fluor-l-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]sulfanyl}propansäure (Intermediat 106) in 3.14 ml DMF unter Argon wurden 16.89 mg (0.13 mmol) Ν,Ν-diisoprylethylamin und 33.13 mg (0.087 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 27.29 mg (0.09 mmol) N-(2-Aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5- dihydro-lH-pyrrol-l -yl)acetamid (l :l)Trifluoressigsäure (Intermediat LI) hinzugegeben und das Gemisch 15 Minuten bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit BHC 15 1 040-A - 446 -
Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurdemittels präp. HPLC gereinigt Man erhielt 41 mg (68 % d. Th, Reinheit 66%.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.55 min; MS (ESIneg): m/z = 959 (M-H+Na)".
Eine Lösung von 41.1 mg (0.03 mmol, Reinheit 66%) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3R,4R)-3-[2- {(1R)- 1 -[ l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} - 14-(2,5- dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-3,8, 13-trioxo-5-thia-2,9, 12-triazatetradec-l-yl]-4- fluorpyrrolidin-l-carboxylat in 2.54 ml 2,2,2-Trifluoroethanol wurde mit 24.7 mg (0.18 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 53.0 mg (0.18 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung mittels präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 10 mg ( 36 %> d. Th ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 781 (M+H-CF3C02H)+. Intermediat F315
S-{2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-{3-[5-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino } ethyl)- 1 ,2,4-oxadiazol-3 -yl]propanoyl} -L-cy stein
Figure imgf000447_0001
BHC 15 1 040-A - 447 -
Zu einer Lösung von 50.0 mg (0.07 mmol) von 3-[5-(2-{[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetyl]amino}ethyl)-l,2,4-oxadiazol-3-yl]propansäure (Intermediat L100) in 3.5 ml DMF unter Argon wurden 18.02 mg (0.14 mmol) Ν,Ν-diisoprylethylamin und 31.82 mg (0.09 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 50.0 mg (0.07 mmol) N-(2-Aminoethyl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)hexanamidacetat (1 :1) (Intermediat C107) hinzugegeben und das Gemisch 2h bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 49 mg (21 % d. Th, Reinheit 31%.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.30 min; MS (ESIpos): m/z = 1022 (M+H)+.
Eine Lösung von 49.0 mg (0.015 mmol, 31% Reinheit) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2- silatridecan- 13 -yl)-N- {3 - [5-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl]amino } ethyl)- 1 ,2,4- oxadiazol-3-yl]propanoyl}-L-cystein_in 0.5 ml 2,2,2-Trifluoroethanol wurde mit 8.0 mg (0.06 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 17.2 mg (0.06 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung mittels präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 3 mg ( 21 %> d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 877 (M+H-CF3C02H)+.
BHC 15 1 040-A - 448 -
Intermediat F316
Trifluoressigsäure-N- {2-[(3 - { [2-( {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethyl ro yl} {[(3S,4R)-4-fluoφyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propanoyl)amino]ethyl}-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanami (1 :1)
Figure imgf000449_0001
Zu einer Lösung von 50.0 mg (0.04 mmol, 65% Reinheit) von 3-{[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[(3R, 4R)-4-fluor-l-{[2-(trimethylsilyl) ethoxy ] carbonyl } pyrrolidin-3 -yl]methyl } amino)-2-oxoethyl] sulfanyl jpropansäure (Intermediat 106) in 3.0 ml DMF unter Argon wurden 16.89 mg (0.13 mmol) Ν,Ν-diisoprylethylamin und 33.13 mg (0.087 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 37.2 mg (0.09 mmol, Reinheiete 70%) N-(2- Aminoethyl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanamidacetat (1 :1) (Intermediat L73) hinzugegeben und das Gemisch 7 Minuten bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 57 mg (77 %> d. Th, Reinheit 59%.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.60 min; MS (ESIpos): m/z = 981 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 449 -
Eine Lösung von 56.0 mg (0.03 mmol, 59% Reinheit) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3R,4R)-3-[2-{(lR)- 1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- yrrol-2-yl]^
1 H-pyrrol- 1 -yl)-3 ,8, 13 -trioxo-5 -thia-2,9, 12-triazaoctadec- 1 -yl]-4-fhH^yrrolidin- 1 -carboxylat in
2.8 ml 2,2,2-Trifluoroethanol wurde mit 36.0 mg (0.27 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 78.3 mg (0.27 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung mittels präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 16 mg ( 44 % d. Th., 85% Reinheit ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 837 (M+H-AcOH)+.
Intermediat F317 l-[(S-{2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-[l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2,18-dioxo- 6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cysteinyl)amino]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15- säure -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000450_0001
Unter Argon wurden 30.2 mg (0.06 mmol) N,N'-Bis[(benzyloxy)carbonyl]-L-cystin in 2.0 mL Wasser und 2.0 mL zso-Propanol vorgelegt und mit 56.7 mg (0.20 mmol) TCEP versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 min bei RT gerührt. Es wurden dann 50.0 mg (0.08 mmol) 2- BHC 15 1 040-A - 450 -
(Trimethylsilyl)ethyl- {3 -[ {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difhK^henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]propyl}carbamat (Intermediat C70) gelöst in 2.0 mL iso- Propanol und 122.2 mg (0.48 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 7 h bei 50 °C gerührt. Dann wurden nochmals 122.2 mg (0.48 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 50 °C gerührt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. Natriumhydrogencarbonat-Lsg. extrahiert und mit ges. NaCl-Lsg. gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 43.1 mg (64 % d. Th.) der Verbindung S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12- dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 851 (M+H)+.
Unter Argon wurde S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N- [(benzyloxy)carbonyl]-L-cystein (50.0 mg, 59 μιηοΐ) in 1.0 ml DMF gelöst und mit N,N- Diisopropylethylamin (20.5 μΐ, 117 μιηοΐ) und HATU (26.8 mg, 70 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min nachgerührt. Tert-Butyl-l-amino-3, 6,9,12-tetraoxapentadecan- 15-oat (22.6 mg, 70 μιηοΐ) wurde dann gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde nachgerührt und dann direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 59.3 mg (87.5 % d. Th.) der Verbindung tert- Butyl-l-({S-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}- 2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L- cysteinyl} amino)-3,6,9, 12-tetraoxapentadecan- 15-oat.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.97 min; MS (ESIpos): m/z = 1154 [M+H]+
Unter Argon wurde Palladium(II)acetat (6.74 mg, 30.0 μιηοΐ) in 3.0 ml Dichlormethan vorgelegt und mit Triethylamin (13 μΐ, 90 μιηοΐ) und Triethylsilan (96 μΐ, 600 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 5 min gerührt und dann, mit tert-Butyl-l-({S-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl-4- (2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1- diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-cysteinyl}amino)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-oat (69.3 mg, 60.0 μιηοΐ) in 1.0 ml Dichlormethan versetzt. Die BHC 15 1 040-A - 451 -
Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT nachgerührt und dann mit Triethylsilan (48 μΐ, 300 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT nachgerührt und mit 2.0 ml Wasser (0,1%TFA) versetzt. Das Lösemittel wurde im Vakuum ohne Erwärmen verdampft. Der Rückstand wurde in Aceonitril aufgenommen, durch einen Spritzenfilter filtriert und mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 65.9 mg (97 % d. Th.) der Verbindung Trifluoressigsäure tert-butyl-l-{[S-(l 1-{(1R)-1-[1- benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 7,11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cysteinyl]amino } -3 ,6,9, 12-tetraoxapentadecan- 15-oat (1 :1). LC-MS (Methode 1): Rt = 1.22 min; MS (ESIpos): m/z = 1020 [M+H]+
Unter Argon wurde l-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2-oxo-6,9,12,15-tetraoxa-3- azaoctadecan- 18 -säure (4.26 mg, 10.6 μιηοΐ) in 1.0 ml DMF vorgelegt und mit N,N- Diisopropylethylamin (3.2 μΐ, 18 μιηοΐ) und HATU (4.02 mg, 10.6
Figure imgf000452_0001
Die Reaktionsmischung wurde 10 min gerührt und dann mit Trifluoressigsäure tert-butyl-l-{[S-(l l - {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12- dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cysteinyl]amino } -3 ,6,9, 12-tetraoxapentadecan- 15- oat (1 :1) (10.0 mg, 8.82 μιηοΐ) in 1.0 ml DMF und N,N-Diisopropylethylamin (1,5 μΐ, 8.8 versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei RT nachgerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.9 mg (93 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-l -({S-(l 1-{(1R)-1-[1- benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 18-dioxo- 6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cysteinyl}amino)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oat. LC-MS (Methode 1): Rt = 1.44 min; MS (ESIpos): m/z = 1404 [M+H]+
Tert-Butyl- 1 -( { S-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[l-(2,5-dioxo- 2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2,18-dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L- cysteinyl}amino)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oat (8.20 mg, 5.84 μιηοΐ) wurde in 2.0 Trifluorethanol gelöst und mit Zinkchlorid (4.77 mg, 35.0 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 50°C gerührt.
Zinkchlorid (4.77 mg, 35.0 μιηοΐ) wurde versetzt und die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 50°C nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure BHC 15 1 040-A - 452 -
(10.2 mg, 35.0 μιηοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.1 mg (53 %> d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.90 min; MS (ESIpos): m/z = 1204 [M+H]+
Intermediat F318
Trifluoressigsäure 3 - { [2-( [3 -amino-4-fluorbutyl] {(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5 -difluorphenyl)- 1 H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)-2-oxoethyl]sulfanyl}-N-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -yl)acet l] amino } ethyl)propanamid (1 :1)
Figure imgf000453_0001
(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropan-l -amin (124 mg, 350 μιηοΐ) (Intermediat C52) wurde in 5.0 ml Dichlormethan vorgelegt und mit Natriumtriacetoxyborhydrid (104 mg, 491 μιηοΐ) und Essigsäure (23 μΐ, 400 μmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 5 min bei RT gerührt und dann, mit tert-Butyl-[l-fluor-4-oxobutan-2- yl]carbamat (82.7 mg, 403 μιηοΐ) (Intermediat L123) in 3.0 ml Dichlormethan gelöst versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT nachgerührt und dann, mit Ethylacetat versetzt. Der Ansatz wurde zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und dann mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie über Biotage/Isolera (SNAP 25g) mit Cyclohexan/Ethylacetat 95:5 als Eluent gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 146 mg BHC 15 1 040-A - 453 -
(77 % d. Th.) der Verbindung ί6τΐ-Βώγ1-[4-({(1Κ)-1-[1^6ηζγ1-4-(2,5^ίί1^ 1ΐ6ηγ1)-1Η- γπ·ο1-2- yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)-l-fluorbutan-2-yl]carbamat.
LC-MS (Methode 13): Rt = 2.57 min; MS (ESIneg): m/z = 588 [M+CHOOH-H]"
Tert-Bu1yl-[4-({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino)-l-fluorbutan-2-yl]carbamat (100mg, 184 μmol) wurde in 6.0 ml DCM gelöst und mit Triethylamin (85 μΐ, 610 μιηοΐ) und Chloracetylchlorid (47 μΐ, 590 μmol) bei 0°C versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in Aceonitril/Wasser aufgenommen und mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 80 mg (70 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-{4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl] -2,2-dimethylpropyl } (chloracetyl)amino] - 1 -fluorbutan-2- yljcarbamat.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.67 min; MS (ESIneg): m/z = 664 [M-H+COOH]"
Tert-Butyl-{4-[{(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]-l-fluorbutan-2-yl}carbamat (79.2 mg, 128 μιηοΐ) und 3- Sulfanylpropansäure (12 μΐ, 140 μmol) wurden in 3.0 ml Methanol mit einem Tropfen Wasser vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde mit Kaliumcarbonat (61.8 mg, 447 μιηοΐ) versetzt und 4h bei 50°C nachgerührt. Der Ansatz wurde mit Ethyl Acetat versetzt und mehrmals mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 68.6 mg (78 % d. Th.) der Verbindung 9-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difhK^henyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -6-(fluormethyl)-2,2-dimethyl-4, 10-dioxo-3 -oxa- 12-thia-5,9- diazap entade can- 15 -säure .
LC-MS Methode 12): Rt = 2.46 min; MS (ESIneg): m/z = 688 [M-H]"
9-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-6-(fluormethyl)- 2,2-dimethyl-4,10-dioxo-3-oxa-12-thia-5,9-diazapentadecan-15-säure (15.0 mg, 21.7 μιηοΐ) und Trifluoressigsäure N-(2-aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetamid (1 :1) (8.12 mg, 26.1 μιηοΐ) (Intermediat LI) wurden in 1.6 ml DMF vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde mit HATU (9.92 mg, 26.1 μιηοΐ) und mit N,N-Diisopropylethylamin (11 μΐ, 65 μιηοΐ) versetzt und 5 min bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und BHC 15 1 040-A - 454 - direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 18.6 mg (98 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-[13-{(lR)-l-[l-benzyl-4- (2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)- 17-fluor-2,7, 12-trioxo- 10-thia-3 ,6, 13 -triazaheptadecan- 16-yl]carbamat.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.36 min; MS (ESIpos): m/z = 869 [M+H]+
Tert-Butyl-[13-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-l- (2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-fluor-2,7, 12-trioxo- 10-thia-3 ,6, 13 -triazaheptadecan- 16- yl]carbamat (17.0 mg, 19.6 μιηοΐ) wurde in 2.0 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (16.0 mg, 117 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (16.0 mg, 117 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (68.6 mg, 234 μιηοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 10.7 mg (60 % d. Th.) der titel Verbindung,
LC-MS (Methode 14): Rt = 5.51 min; MS (ESIpos): m/z = 769 [M+H]+
BHC 15 1 040-A - 455 -
Intermediat F319
N-(3-{[2-({(lR) -[l-BeiizyM-(2,5-difl^
(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl}amino)propyl]am
oxoethyl]sulfanyl}propanoyl)-beta-alanyl-L-asparaginsäure
Figure imgf000456_0001
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-({(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}[({3-[(2- carboxyethyl)amino]-3-oxopropyl}sulfanyl)acetyl]amino)propyl]-L-alaninamid (9.80 mg, 9.88 μιηοΐ) (Intermediat C116) und Di-tert-butyl-L-aspartathydrochlorid (1 : 1) (3.34 mg, 11.9 μιηοΐ) in 1.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (4.51 mg, 11.9 μιηοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (5.2 μΐ, 30 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT nachgerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.5 mg (87 % d. Th.) der Verbindung Di-tert-butyl-N-(3-{[2-({(lR)-l-[l - benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} [3-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5- dihydro-lH-pyrrol-l -yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl}amino)propyl]amino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propanoyl)-beta-alanyl-L-aspartat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.33 min; MS (ESIpos): m/z = 1219 [M+H]+
Di-tert-butyl-N-(3 - { [2-( { ( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5 -difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2- dimethylpropyl}[3-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L- alanyl}amino)propyl]amino)-2-oxoethyl]sulfanyl}propanoyl)-beta-alanyl-L-aspartat (9.70 mg, 7.95 BHC 15 1 040-A - 456 - μmol) wurde in 1.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (6.50 mg, 47.7 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (6.50 mg, 47.7 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (27.9 mg, 55.4 μιηοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 4.10 mg (47 % d. Th.) der titel Verbindung, LC-MS (Methode 1): Rt = 1.07 min; MS (ESIpos): m/z = 1107 [M+H]+
Intermediat F320
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} { [(3 - { [( 1 S)- 1 ,3 -dicarboxypropyl]amino } -3 - oxopropyl)sulfanyl] acetyl } amino)propyl] -L-alaninamid
Figure imgf000457_0001
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-({(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[(2- carboxyethyl)sulfanyl]acetyl}amino)propyl]-L-alaninamid (20.0 mg, 21.7 μιηοΐ) (Intermediat C115) und di-tert-butyl-L-glutamathydrochlorid (1 :1) (7.71 mg, 26.1 μιηοΐ) in 2.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (9.91 mg, 26.1 μιηοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (11 μΐ, 65 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und dann direkt mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die BHC 15 1 040-A - 457 -
Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 16.4 mg (65 % d. Th.) der Verbindung Di-tert-butyl-(2S)-2-{[(13S,16S)-7-{(lR)-l-[l- benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-23-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -yl)-l 6-isopropyl- 13-methyl-6, 12,15,18-tetraoxo-4-thia-7, 11,14,17-tetraazatricosan- 1 - oyl] amino } pentandioat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.40 min; MS (ESIpos): m/z = 1162 [M+H]+
Di-tert-butyl-(2S)-2-{[(13S,16S)-7-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-23-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-16-isopropyl-13-methyl-6,12,15,18- tetraoxo-4-thia-7,l l,14,17-tetraazatricosan-l-oyl]amino}pentandioat (14.7 mg, 12.6 μιηοΐ) wurde in 1.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (10.3 mg, 75.9 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (10.3 mg, 75.9 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (44.4 mg, 152 μιηοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert Man erhielt 6.0 mg (45 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.10 min; MS (ESIneg): m/z = 1048 [M-H]"
BHC 15 1 040-A - 458 -
Intermediat F321
N-(3-{[2-({(lR) -[l-BeiizyM-(2,5-difl^
(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl}am
oxoethyl] sulfanyl } propanoyl)-b eta-alanyl-D-glutaminsäure
Figure imgf000459_0001
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-({(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}[({3-[(2- carboxyethyl)amino]-3-oxopropyl}sulfanyl)acetyl]amino)propyl]-L-alaninamid (9.80 mg, 9.88 μιηοΐ) (Intermediat Cl 16) und Di-tert-butyl-D-glutamathydrochlorid (1 :1) (3.51 mg, 11.9 μιηοΐ) in 1.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (4.51 mg, 11.9 μιηοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (5.2 μΐ, 30 μmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 11.7 mg (96 % d. Th.) der Verbindung Di-tert-butyl-N-(3-{[2-({(lR)-l-[l - benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} [3-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5- dihydro-lH-pyrrol-l -yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl}amino)propyl]amino)-2- oxoethyl] sulfanyl } propanoyl)-b eta-alanyl-D-glutamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 1233 [M+H]+
Di-tert-butyl-N-(3 - { [2-( { ( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5 -difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2- dimethylpropyl}[3-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L- BHC 15 1 040-A - 459 - alanyl}amino)propyl]amino)-2-oxoethyl]sulfanyl}propanoyl)-beta-alanyl-D-glutamat (11.5 mg, 9.32 μιηοΐ) wurde in 1.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit (7.62 mg, 55.9 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (7.62 mg, 55.9 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (32.6 mg, 112 μιηοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 6.5 mg (62 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.07 min; MS (ESIpos): m/z = 1121 [M+H]+
Intermediat F322
N-(3-{[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}[3-({N-[6-
(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl}amino)propyl]amino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propanoyl)-beta-alanyl-L-glutaminsäure
Figure imgf000460_0001
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-({(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}[({3-[(2- carboxyethyl)amino]-3-oxopropyl}sulfanyl)acetyl]amino)propyl]-L-alaninamid (9.80 mg, 9.88 μιηοΐ) (Intermediat C116) und Di-tert-butyl-L-glutamathydrochlorid (1 :1) (3.51 mg, 11.9 μιηοΐ) in 1.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (4.51 mg, 11.9 μιηοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (5.2 BHC 15 1 040-A - 460 - μΐ, 30 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 11.3 mg (93 % d. Th.) der Verbindung Di-tert-butyl-N-(3-{[2-({(lR)-l-[l - benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} [3-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5- dihydro-lH-pyrrol-l -yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl}amino)propyl]amino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propanoyl)-beta-alanyl-L-glutamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 1233 [M+H]+
Di-tert-butyl-N-(3 - { [2-( { ( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5 -difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2- dimethylpropyl}[3-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L- alanyl}amino)propyl]amino)-2-oxoethyl]sulfanyl}propanoyl)-beta-alanyl-L-glutamat (11.0 mg, 8.92 μιηοΐ) wurde in 1.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (7.29 mg, 53.5 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (7.29 mg, 53.5 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (31.2 mg, 107 μιηοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 5.10 mg (51 % d. Th.) der titel Verbindung. LC-MS (Methode 1): Rt = 1.07 min; MS (ESIpos): m/z = 1121 [M+H]+
BHC 15 1 040-A - 461 -
Intermediat F323
N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-N-[3 -( { [(3 - { [( 1 R)-2-(L-beta- asparagylamino)-l-carboxyethyl]amino}-3-oxopropyl)sulfanyl]acetyl} {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)propyl]-L-alaninamid trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000462_0001
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-({(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[(2- carboxyethyl)sulfanyl]acetyl}amino)propyl]-L-alaninamid (10.0 mg, 7.05 μmol) (Intermediat Cl 15) und tert-Butyl-N-{(2R)-2-amino-3-oxo-3-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]propyl}-N2-(tert- butoxycarbonyl)-L-asparaginat (4.02 mg, 8.46 μιηοΐ) (Intermediat L124) in 2.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (3.22 mg, 8.46 μιηοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (3.7 μΐ, 21 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 4.3 mg (32 % d. Th.) der Verbindung 6-tert-Butyl-l l-[2- (trimethylsilyl)ethyl]-(6S,l lR,25S,28S)-19-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2- yl]-2,2-dimethylpropyl}-35-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-28-isopropyl-2,2,25-trimethyl- BHC 15 1 040-A - 462 -
4,8,13,18,24,27,30-heptaoxo-3-oxa-16-thia-5,9,12,19,23,26,29-heptaazapentatriacontan-6,l 1- dicarboxylat.
LC-MS (Methode 5): Rt = 5.32 min; MS (ESIpos): m/z = 1379 [M+H]+
6-tert-Butyl-l l-[2-(trimethylsilyl)ethyl]-(6S,l lR,25S,28S)-19-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-35-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)- 28-isopropyl-2,2,25-trimethyl-4,8,13,18,24,27,30-heptaoxo-3-oxa-16-thia-5,9,12,19,23,26,29- heptaazapentatriacontan-6,11-dicarboxylat (4.10 mg, 73 % Reinheit, 2.17 μιηοΐ) wurde in 2.0 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (1.77 mg, 13.0 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch fünfmal mit Zinkchlorid (1.77 mg, 13.0 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (22.0 mg, 78 μιηοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert Man erhielt 2.1 mg (69 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.98 min; MS (ESIpos): m/z = 1122 [M+H]+
Intermediat F324
S-[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}[pyrrolidin-3- ylmethyl]amino)-2-oxoethyl]-N-[l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2,18-dioxo-6,9,12,15- tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (Isomer 1)
Figure imgf000463_0001
BHC 15 1 040-A - 463 -
Unter Argon wurde l-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2-oxo-6,9,12,15-tetraoxa-3- azaoctadecan- 18 -säure (99.6 mg, 247 μιηοΐ) (Intermediat L74) in 1.4 ml DMF vorgelegt und mit HATU (90.4 mg, 238 μιηοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (41 μΐ, 240 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und mit S-[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl] -2,2-dimethylpropyl } { [ 1 -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3 - yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-L-cystein (70.0 mg, 95.2 μιηοΐ) (Intermediat C90) in 1.4 ml DMF gelöst versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT nachgerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 19.0 mg (18.4 % d. Th.) der Verbindung S-[2- ({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[(3R)-l-(tert- butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-N-[l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l-yl)-2,18-dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.29 min; MS (ESIpos): m/z = 1082 [M+H]+
S-[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[l-(tert- butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-N-[l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l-yl)-2,18-dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cystein (17.0 mg, 15.7 μιηοΐ) wurde in 2.0 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (8.56 mg, 62.8 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (8.56 mg, 62.8 μιηοΐ) versetzt und 2 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (36.7 mg, 126 μιηοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.90 mg (22 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 983 [M+H]+
BHC 15 1 040-A - 464 -
Intermediat F325
N- [2-( {(2S)-2-Amino-4- [ {( 1 R) -[ 1 -benzyl-4^^
dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)em^
yl)acetyl]-D-alpha-glutamin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000465_0001
30 mg (0.046 mmol) von Intermediat C58 wurden mit 29 mg (0.055 mmol) Trifluoressigsäure - benzyl-N-(2-aminoethyl)-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-D-alpha-glutaminat (1 :1) in Gegenwart von 1.5 Equiv. HATU und 3 Equiv. NN-Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 39.5 mg (82% d.Th.) des geschützten Intermediats erhalten. Von diesem wurden zunächst hydrogenolytisch die Benzylestergruppen abgespalten. Die anschließende Kupplung mit l-{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-2-oxoethyl}-lH-pyrrol-2,5-dion in DMF in Gegenwart von 3 Equiv. NN-Diisopropylethylamin sowie die Abspaltung der Teoc-Schutzgruppe mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 führte dann in 2 weiteren Schritten zur Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.44 min; MS (ESIpos): m/z = 822 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 465 -
Intermediat F326
N- [2-( {(2S)-2-Amino-4- [ {( 1 R) -[ 1 -benzyl-4-^
dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethy
trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000466_0001
43 mg (0.066 mmol) von Intermediat C58 wurden mit 57 mg (0.077 mmol) Intermediat LI 25 in Gegenwart von 1.5 Equiv. HATU und 4 Equiv. 4-Methylmorpholin gekuppelt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 27 mg (34% d.Th.) des geschützten Intermediats erhalten. Dieses wurde anschließend mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat F 119 beschrieben in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 805 und 807 (M+H)+.
BHC 15 1 040-A - 466 -
B: Herstellung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADO
B-l. Allgemeines Verfahren zur Generierung von Anti-B7H3 Antikörpern
Die Anti-B7H3 Antikörper wurden durch das Screening einer Phagen Display Bibliothek auf rekombinantem murinen B7H3 und B7H3 humanen exprimierenden Zellen generiert. Die so gewonnenen Antikörper wurden ins humane IgGl Format reformatiert und für die hier beschriebenen Ausführungsbeispiele verwendet.
B-2. Allgemeines Verfahren zur Expression von Anti-B7H3 Antikörpern in Säugerzellen
Die Antikörper, zum Beispiel TPP-3803 und TPP-5706 wurden in transienten Säugerzellkulturen produziert, wie von Tom et al., Kapitel 12 in Methods Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 (siehe AK-Beispiel 1) beschrieben.
B-3. Allgemeines Verfahren zur Aufreinigung von Antikörpern aus Zellüberständen.
Die Antikörper, zum Beispiel TPP-3803 und TPP-5706 wurden aus den Zellkulturüberständen gewonnen. Die Zellüberstände wurden durch Zentrifugation von Zellen geklärt. Anschließend wurde der Zellüberstand durch Affinitätschromatographie auf einer MabSelect Sure (GE Healthcare) Chromatographiesäule gereinigt. Dazu wurde die Säule in DPBS pH 7.4 (Sigma/Aldrich) equillibriert, der Zellüberstand aufgtretragen und die Säule mit ca 10 Säulenvolumina DPBS pH 7.4 + 500 mM Natriumchlorid gewaschen. Die Antikörper wurden in 50 mM Natriumacetat pH 3.5 + 500 mM Natriumchlorid eluiert und anschliessend durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200 Säule (GE Helthcare) in DPBS pH 7.4 weiter gereinigt.
B-4. Allgemeines Verfahren zur Kupplung an Cvstein-Seitenketten
In die Kupplungsreaktionen wurde folgende Anti-B7H3Antikörper eingesetzt:
TPP-6497
TPP-6499
TPP-6501 BHC 15 1 040-A - 467 -
TPP-6502
TPP-6515
TPP-761 1
TPP-8322
TPP-8382
TPP-8564
TPP-8565
TPP-8567
TPP-8568
Die Kupplungsreaktionen wurden üblicherweise unter Argon durchgeführt. Verfahren A:
Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt im Bereich von ungefähr 5mg/ml bis 15 mg/ml wurden zwischen 2 und 5 Äquivalenten Tris(2-carboxyethyl)phosphin-Hydrochlorid (TCEP), gelöst in PBS-Puffer, gegeben und 30 min bis 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 12 Äquivalenten, bevorzugt etwa 5-10 Äquivalente der zu kuppelnden Maleinimid- Vorläufer- Verbindung oder Halogenid- Vorläufer- Verbindung als Lösung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Der Ansatz wurde bei Maleinimid-Precursern 60-240 min bei RT und bei Halogenid-Precursern zwischen 8 und 24 h bei RT gerührt und anschließend über in PBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Üblicherweise wurden, wenn nicht anders angegeben, 5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer zur Reduktion und der nachfolgenden Kupplung eingesetzt. Nach Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des entsprechenden ADCs in 3.5 mL PBS-Puffer erhalten. Anschließend wurde eine Aufkonzentration mittels Ultrazentrifugation durchgeführt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zurückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die Aufkonzentration mittels Ultrafiltration nach Rückverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/mL eingestellt. Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausführungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt.
Die nach diesem Verfahren dargestellten ADCs können in Abhängigkeit vom Linker gegebenenfalls auch mehr oder weniger stark ausgeprägt in Form der hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäureamide mit den Antikörpern verknüpft vorliegen. BHC 15 1 040-A - 468 -
Insbesondere die KSP-I-ADCs, die über die Linker-Substruktur
Figure imgf000469_0001
mit Thiolgruppen der Antikörper verknüpft sind, können auch ggf. durch Umpuffern im Anschluss an die Kupplung und ca. 20-24-stündiges Rühren bei pH 8 gemäß Schema 28 gezielt in die die über offenkettige Bersteinsäureamide verknüpften ADCs hergestellt werden.
#1 stellt die Schwefelbrücke zum Antikörper dar und #2 die Verknüpfungsstelle zum modifizierten KSP-Inhibitor
Solche ADCs, bei denen der Linker über hydrolysierte offenkettige Bernsteinsäureamide mit den Antikörpern verknüpft vorliegt, können gegebenenfalls auch gezielt nach einer exemplarischen Vorschrift wie folgt dargestellt werden:
Small Scale Kupplung:
Zu einer Lösung von 2-5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt im Bereich von ungefähr 5 mg/ml bis 15 mg/ml wurden zwischen 2 und 5 Äquivalenten Tris(2-carboxyethyl)phosphin-Hydro- chlorid (TCEP), gelöst in PBS-Puffer, gegeben und 30 min bis lh bei RT gerührt. Dazu kann die Lösung des jeweils eingesetzten Antikörpers in der in den Ausführungsbeispielen angegebenen Konzentration eingesetzt werden oder gegebenenfalls auch mit PBS Puffer bis etwa auf die Hälfte der angegebenen Startkonzentration verdünnt werden, um in den bevorzugten Konzentrationsbereich zu kommen. Anschließend wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 12 Äquivalenten, bevorzugt etwa 5-10 Äquivalente der zu kuppelnden Maleinimid- Vorläufer- Verbindung als Lösung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Der Ansatz wurde 60-240 min bei RT gerührt und anschließend mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 3-7 ml verdünnt und über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Diese Lösung wurde dann über eine mit PBS-Puffer pH7.2 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH7.2 eluiert. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). BHC 15 1 040-A - 469 -
Medium scale Kupplung:
60 mg des betreffenden Antikörpers in 5 ml PBS-Puffer (c~12 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0,344mg TCEP in ΙΟΟμΙ PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.003 mmol einer Maleinimid- Vorläuferverbindung gelöst in 600μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 1.5h- 2h Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1075μ1 PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.
Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pH8 auf ein Gesamtvolumen von 14 ml verdünnt. Diese Lösung wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Dann erfolgte ggf. wieder ein Umpuffern auf pH 7.2. Die ADC-Lösung wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH7.2) und dann ggf. erneut bis auf eine Konzentration von etwa 1 Omg/mL aufkonzentriert.
Weitere potentiell hydrolyse-sensitive Thianylsuccinimid-Brücken zum Antikörper in den Ausführungsbeispielen enthalten folgende Linker-Substrukturen, wobei #1 die Thioetherverknüpfung zum Antikörper und #1 die Verknüpfungsstelle zum modifizierten KSP- Inhibitor darstellt:
Figure imgf000470_0001
BHC 15 1 040-A - 470 -
Diese Linker-Substrukturen stellen die Verknüpfungseinheit zum Antikörper dar und haben (neben der weiteren Linkerzusammensetzung) einen signifikanten Einfluß auf die Struktur und das Profil der in Tumorzellen gebildeten Metabolite.
In den dargestellten Strukturformeln hat dabei AK die Bedeutung
AK = anti-B7H3 AK (partiell reduziert)- S§' wobei
§ 1 die Verknüpfung mit der Succinimid-Gruppe oder mit ggf. daraus entstandenen isomeren hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäureamiden bzw. des Alkylenrestes bedeutet, und
S für das Schwefelatom eines Cystein-Restes des partiell reduzierten Antikörpers steht.
B-5. Allgemeines Verfahren zur Kupplung an Lysin-Seitenketten
In die Kupplungsreaktionen wurde folgende Anti-B7H3Antikörper eingesetzt: I TPP-6502 I
Die Kupplungsreaktionen wurden üblicherweise unter Argon durchgeführt.
Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt etwa 10 mg/mL, wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 8 Äquivalente der zu kuppelnden Vorläufer- Verbindung als Lösung in DMSO gegeben. Nach 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge an Vorläufer- Verbindung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Nach weiteren 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde der Ansatz über in PBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Üblicherweise wurden, wenn nicht anders angegeben, 5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer zur Reduktion und der nachfolgenden Kupplung eingesetzt. Nach Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des BHC 15 1 040-A - 471 - entsprechenden ADCs in 3.5 mL PBS-Puffer erhalten. Anschließend wurde eine Aufkonzentration mittels Ultrazentrifugation durchgeführt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zurückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die Aufkonzentration mittels Ultrafiltration nach Rückverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/mL eingestellt.
Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausführungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt.
In den dargestellten Strukturformeln hat dabei AK2 die Bedeutung
AK2 = anti-B7H3 AK - NH§2 wobei
2
§ die Verknüpfung mit der Carbonylgruppe bedeutet, und
NH für die Seitenketten-Aminogruppe eines Lysin-Restes des Antikörpers steht.
B-6a. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von geschlossenen Succinimid-Cvstein- Addukten:
In einer beispielhaften Ausführung wurden 10 μιηοΐ der oben beschriebenen Maleinimid- Vorläuferverbindungen wurden in 3-5 mL DMF aufgenommen und mit 2.1 mg (20 μιηοΐ) L- Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen 2h und 24 h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels präparativer HPLC gereinigt.
B-6aa. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von isomeren geöffneten Bernsteinsäureamid- Cystein-Addukten:
In einer beispielhaften Ausführung wurden 68 μιηοΐ der oben beschriebenen Maleinimid- Vorläuferverbindungen in 15 mL DMF aufgenommen und mit 36 mg (136 μιηοΐ) N-{[2- (Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde ~20h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach BHC 15 1 040-A - 472 -
Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 15 mL THF/Wasser 1 :1 gelöst. Es wurden 131 μΐ^ einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer IM Salzsäure neutral gestellt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden -50% d. Th. der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.
Im letzten Schritt wurden 0.023 mmol von diesen regiosisomeren Hydrolyseprodukten in 3 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12.5 mg (0.092 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 27 mg (0.092 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden die hydrolysierten offenen Sulfanylbernsteinsäure- amide als Regioisomerengemisch erhalten.
Weitere Aufreinigung und Charakterisierung der erfindungsgemäßen Konjugate
Nach erfolgter Umsetzung wurde in einigen Fällen das Reaktionsgemisch beispielsweise durch Ultrafiltration aufkonzentriert und anschließend mittels Chromatographie, beispielsweise mittels einer Sephadex® G-25, entsalzt und gereinigt. Die Elution erfolgte beispielsweise mit Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Anschließend wurde die Lösung sterilfiltriert und eingefroren. Alternativ kann das Konjugat lyophylisiert werden.
B-7. Bestimmung des Antikörpers, der Toxophorbeladung und des Anteils geöffneter Cvstein-Addukte
Zur Protein-Identifizierung wurde neben der Molekulargewichtsbestimmung nach Deglykosilierung und/oder Denaturierung ein tryptischer Verdau durchgeführt, der nach Denaturierung, Reduktion und Derivatisierung die Identität des Proteins anhand der nachgewiesenen tryptischen Peptide bestätigt.
Von den erhaltenen Lösungen der in den Ausführungsbeispielen beschriebenen Konjugate in PBS Puffer wurde die Toxophorbeladung wie folgt bestimmt:
Die Bestimmung der Toxophor Beladung von Lysin-verknüpften ADCs erfolgte nach massenspektrometrischer Bestimmung der Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies. Hierbei wurden vorab die Antikörperkonjugate mittels PNGaseF deglycosyliert, die Probe BHC 15 1 040-A - 473 - angesäuert und nach HPLC -Trennung/Entsalzung massenspektrometrisch mittels ESI-MicroTofQ (Bruker Daltonik) analysiert. Alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) wurden addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies auf Basis von MaxEnt Deconvolution kalkuliert. Nach Signal Integration der verschiedenen Spezies wurde dann die DAR (= Drug/ Antibody Ratio) berechnet.
Die Bestimmung der Toxophorbeladung von Cystein-verknüpften Konjugaten wurde über Reversed-Phase-Chromatographie des reduzierten und denaturierten ADCs bestimmt. Zur ADC- Lösung (Img/mL, 50μΚ) wurde Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCl) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 μΚ) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und über HPLC analysiert.
Die HPLC-Analyse wurde auf einem Agilent 1260 HPLC-System mit Detektion bei 220 nm durchgeführt. Es wurde eine Polymer Laboratories PLRP-S Polymerie Reversed Phase Säule (Katalognummer PL1912-3802) (2.1 xl 50 mm, 8 μιη particle size, 1000 Ä) bei einer Flussrate von 1 mL/min mit folgendem Gradienten verwendet: 0 min, 25 %B; 3 min, 25 %B; 28 min, 50 %B. Laufmittel A bestand aus 0.05 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, Laufmittel B aus 0.05 % Trifluoressigsäure in Acetonitril.
Die detektierten Peaks wurden durch Retentionszeitvergleich mit der leichten Kette (L0) und der schweren Kette (HO) des nicht konjugierten Antikörpers zugeordnet. Peaks, die ausschließlich in der konjugierten Probe detektiert wurden, wurden der leichten Kette mit einem Toxophor (LI) und den schweren Ketten mit einem, zwei und drei Toxophoren (Hl, H2, H3) zugeordnet.
Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch Integration bestimmten Peakflächen als die zweifache Summe der HC -Beladung und der LC -Beladung bestimmt, wobei sich die LC -Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks berechnet, und wobei sich die HC-load aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller HC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks berechnet In vereinzelten Fällen kann es vorkommen, dass die Toxophorbeladung aufgrund von Ko-Elutionen einiger Peaks nicht exakt möglich ist.
In den Fällen, in denen keine ausreichende HPLC-Trennung von leichter und schwerer Kette möglich war, erfolgte die Bestimmung der Toxophorbeladung von Cystein verknüpften Konjugaten BHC 15 1 040-A - 474 - mittels massenspektrometrischer Bestimmung der Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette.
Zur ADC -Lösung (Img/mL, 50μΚ) wurde Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCl) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 μΚ) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und massenspektrometrisch nach online Entsaltzung mittels ESI- MicroTofQ (Bruker Daltonik) analysiert.
Zur DAR-Bestimmung wurden alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette auf Basis von MaxEnt Deconvolution berechnet. Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch Integration bestimmten Peakflächen als die zweifache Summe der HC -Beladung und der LC -Beladung bestimmt, wobei sich die LC -Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC -Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks berechnet, und wobei sich die HC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller HC -Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks berechnet.
Zur Bestimmung des Anteils des geöffneten Cystein-Addukts wurde das Molekulargewichtsflächenverhältnis vom geschlossenen und offenen Cystein-Addukt (Molekulargewichtsdelta 18Dalton) aller einfach konjugierten leichten und schweren Kettenvarianten bestimmt. Der Mittelwert über alle Varianten ergab den Anteil des geöffneten Cystein-Addukts .
B-8. Überprüfung der Antigen-Bindung des ADCs
Die Bindefähigkeit des Binders an das Zielmolekül wurde nach erfolgter Kopplung überprüft. Dazu sind dem Fachmann vielfältige Methoden bekannt, beispielsweise kann die Affinität des Konjugats mittels ELISA-Technologie oder Oberflächenplasmonresonanzanalyse (BIAcore™ Messungen) überprüft werden. Die Konjugatkonzentration kann der Fachmann mit gängigen Methoden messen, beispielsweise für Antikörper-Konjugate mittels Proteinbestimmung, (siehe auch Doronina et al.; Nature Biotechnol. 2003; 21 :778-784 und Polson et al., Blood 2007; 1102:616-623). BHC 15 1 040-A - 475 -
Ausführungsbeispiele Metabolite
Beispiel Ml
8-[1-(2-{[2-({(28)-2-Αηιίηο-4-[{(1Κ)-1-[1 -06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } amino)ethyl] amino } -2-oxoethyl)-2,5 -dioxopyrrolidin- 3-yl]-L-c stein -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000476_0001
1.8 mg (2 μιηοΐ) von Intermediat Fl 04 wurden in 1 ml DMF aufgenommen und mit 2.7 mg (22 μιηοΐ) L-Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels präparativer HPLC gereinigt. Es verblieben 0.6 mg (26% d. Th.) der Titelverbindung als farbloser Schaum.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.80 min; MS (EIpos): m/z = 814 [M+H]+.
Beispiel M2
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]amino}-2-oxoethyl)amino]-3-{[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl] sulfanyl } -4 -oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1)
und
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]amino}-2-oxoethyl)amino]-2-{[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl] sulfanyl } -4 -oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1) BHC 15 1 040-A ■476
Figure imgf000477_0001
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.80 min; MS (EIpos): m/z = 814 [M+H]+.
Zunächst wurde L-Cystein mit l-({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidine-2,5-dion in DMF in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin in N-{[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L- cystein überführt.
406 mg (1.53 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cystein wurden in 10 ml DMF gelöst und mit 157.5 mg (1.606 mmol) Maleinsäureanhydrid versetzt und der Ansatz 1 Stunde bei RT gerührt. 130 μΐ^ dieser Lösung wurden mit 7.5 mg (0.01 mmol) von Intermediat C66 versetzt und der Ansatz 5 min bei RT gerührt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Das Lösemeittel wurde im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 10 mg (89%) des geschützten Intermediats erhalten, wobei weder im HPLC noch im LC-MS die Regioisomere aufgetrennt werden konnten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.38 min; MS (EIpos): m/z = 1120 [M+H]+.
Im letzten Schritt wurden die 10 mg von diesem Intermediat in 2 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12 mg (0.088 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 30 min bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 26 mg (0.088 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 8.3 mg (99% d. Th.) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch imVerhältnis 87:13 erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.3 min und 2.43 min; MS (ESIpos): m/z = 832 (M+H)+.
Ή-NMR Hauptregioisomer: (500 MHz, DMSO-d«): δ = 8.7 (m, 1H), 8.5 (m, 2H), 8.1 (m, 1H), 7.6 (m, 1H), 7.5 (s, 1H) 7.4-7.15 (m, 6H), 6.9-7.0 (m, 1H), 6.85 (s, 1H), 5.61 (s, 1H), 4.9 und 5.2 (2d, 2H), 4.26 und 4.06 (2d, 2H), 3.5-3.8 (m, 5H), 3.0-3.4 (m, 5H), 2.75-3.0 (m, 3H), 2.58 und 2.57 (dd, 1H), 0.77 und 1,5 (2m, 2H), 0.81 (s, 9H). BHC 15 1 040-A - 477 -
Altemativ wurden die regioisomeren Titelverbindungen wie folgt hergestellt:
Zunächst wurde dazu L-Cystein mit l-({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidine-2,5- dion in DMF in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin in N-{[2- (Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L-cystein überführt.
55 mg (0.068 mmol) von Intermediat F104 und 36 mg (0.136 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl) ethoxy]carbonyl} -L-cystein 15 ml DMF gelöst und der Ansatz 20 h bei RT gerührt. Anschließend wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 15 mL THF/Wasser 1 :1 gelöst. Es wurden 131 μΐ^ einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer IM Salzsäure neutral gestellt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 37 mg (50% d. Th.) der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 3.33 min und 3.36 min; MS (ESIpos): m/z = 976 (M+H)+.
Im letzten Schritt wurden 25 mg (0.023 mmol) von diesem Intermediat in 3 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12.5 mg (0.092 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 27 mg (0.092 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 18.5 mg (85%o d. Th.) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch imVerhältnis 21 :79 erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.37 min und 3.44 min; MS (ESIpos): m/z = 832 (M+H)+. Beispiel M3
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } amino)-2 -carboxyethyl] amino } -2-oxoethyl)amino] -3 - { [(2R)-2-amino-2-carboxyethyl]sulfanyl} -4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1) und
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } amino)-2 -carboxyethyl] amino } -2-oxoethyl)amino] -2- { [(2R)-2-amino-2-carboxyethyl]sulfanyl} -4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1) BHC 15 1 040-A ■478
Figure imgf000479_0001
Zunächst wurde L-Cystein mit l -({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidine-2,5-dion in DMF in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin in N-{[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L- cystein überführt.
1 1 mg (0.013 mmol) von Intermediat F 193 und 8 mg (0.016 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl) ethoxy]carbonyl}-L-cy stein wurden 3 ml DMF gelöst und der Ansatz 20 h bei RT gerührt. Anschließend wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt.
Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 2 mL THF/Wasser 1 : 1 gelöst. Es wurden 19 μΐ^ einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT gerührt. Dann wurden nochmals 19 μΐ^ der 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz über Nacht bei RT gerührt. Anschließend wurde mit einer IM Salzsäure neutral gestellt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 4.1 mg (38% d. Th.) der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.03 min (breit); MS (ESIpos): m/z = 1020 (M+H)+.
Im letzten Schritt wurden 4.1 mg (0.004 mmol) von diesem Intermediat in 3 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 3 mg (0.022 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 1 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 6 mg (0.022 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure und 2 ml einer 0.1 %-igen wässrigen Trifluoressigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 5 mg (quant.) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch im Verhältnis 20:80 erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.78 min (breit); MS (ESIpos): m/z = 876 (M+H)+.
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.36 min und 2.39 min; MS (ESIpos): m/z = 876 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 479 -
Beispiel M4
8-(1-{2-[2-({(28)-2-ΑΓπίηο-4-[{(1Κ)-1-[1-06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl } (glycoloyl)amino]butanoyl } amino)ethoxy] ethyl } -2,5 -dioxopyrrolidin-3-yl)-L- cystein -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000480_0001
3 mg (4 μιηοΐ) von Intermediat F248 wurden in 2 ml DMF aufgenommen und mit 0.9 mg (8 μιηοΐ) L-Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 18 h bei RT gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden eingeengt und nach Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser verblieben 1.1 mg (32% d. Th.) der Titelverbindung als weißer Feststoff.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.78 min; MS (EIpos): m/z = 801 [M+H]+.
Beispiel M5
(3R,7S)-7-Amino-17-{[(2R)-2-amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-3-[l -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-4-glycoloyl-2,2-dimethyl-8, 16-dioxo-l 2-oxa-4,9, 15-triazanonadecan-l 9-säure trifluoressigsäure (1 :1)
und
(3R,7S)-7-Amino-18-{[(2R)-2-amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-3-[l -benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-4-glycoloyl-2,2-dimethyl-8, 16-dioxo-l 2-oxa-4, 9, 15-triazanonadecan-l 9-säure trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000480_0002
BHC 15 1 040-A - 480 -
8 mg (0.010 mmol) von der geschützten Zwischenstufe von Intermediat F248 und 5.1 mg (0.02 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl) ethoxy]carbonyl}-L-cy stein 3 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT gerührt und anschließend 2 h im Ultraschallbad behandelt. Anschließend wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 2 mL THF/Wasser 1 :1 gelöst. Es wurden 15 μΐ^ einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 15 min bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer IM Salzsäure auf einen pH-Wert von ~3 eingestellt, mit 20 ml Kochsalzlösung verdünnt und zweimal mit 20 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, eingeengt und der Rückstand aus Acetonitril/Wasser lyophilisiert. Es wurden 8.4 mg (78% d. Th. über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.44 min und 3.43 min; MS (ESIpos): m/z = 1107 (M+H)+.
Im letzten Schritt wurden 8 mg (0.007 mmol) von diesem Intermediat in 5 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 9.8 mg (0.072 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 1.5 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 4 mg (59% d. Th.) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch imVerhältnis 31 :67 erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.79 min und 0.81 min; MS (ESIpos): m/z = 819 (M+H)+. Beispiel M6
2- {[(2R)-2-Amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-({(14R)-13-(3-aminopropyl)-14-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]- 15, 15-dimethyl-2,7, 12-trioxo- 10-thia-3,6, 13 -triazahexadec- 1 - yl}amino)-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :2) und
3- {[(2R)-2-Amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-({(14R)-13-(3-aminopropyl)-14-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]- 15, 15-dimethyl-2,7, 12-trioxo- 10-thia-3,6, 13 -triazahexadec- 1 - yl}amino)-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :2) BHC 15 1 040-A ■481
Figure imgf000482_0001
18 mg (0.021 mmol) von Intermediat F213 und 11.2 mg (0.04 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl) ethoxy]carbonyl}-L-cy stein 2 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (21.2 mg) wurde in 3 mL THF/Wasser 1 :1 gelöst. Es wurden 0.04 mL einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 3 Stunden bei RT gerührt. Es wurden 0.02 mL einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit 7.2 mg (0.12 mmol) Essigsäure auf einen pH-Wert von ~7 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 13 mg (57% über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.03 min; MS (ESIpos): m/z = 1020 (M+H)+.
Im letzten Schritt wurden 13 mg (0.01 mmol) von diesem Intermediat in 2 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 6.2 mg (0.05 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 7 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde 13.3 mg (0.05 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemitte wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 10.3 mg (81.4%) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.03 min; MS (ESIpos): m/z = 875 (M+H) BHC 15 1 040-A - 482 -
Beispiel M7
8-(2-{[2-({(28)-2-Αηιίηο-4-[{(1Κ)-1-[1-06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } amino)ethyl] amino } -2-oxoethyl)-L-cystein trifluoressigsäure 1 :1)
Figure imgf000483_0001
6 mg (8 μιηοΐ) von Intermediat Fl 19 wurden in 3 mL DMF aufgenommen und mit 1.8 mg (15 μιηοΐ) L-Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 6 h bei RT gerührt und dann 3 Tage bei RT stehen gelassen. Anschließend wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und das Produkt mittels präparativer HPLC gereinigt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.81 min; MS (ESIpos): m/z = 717 (M+H)+. Beispiel M8
(3R)-6-{(l l S,15R)-l l-Amino-15-[l -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-14-glycoloyl- 16,16-dimethyl-2,5, 10-trioxo-3 ,6,9, 14-tetraazaheptadec- 1 -yl} -5 -oxothiomorpholin-3 -carbonsäure - trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000483_0002
BHC 15 1 040-A - 483 -
4 mg (0.004 mmol) der Verbindung aus Beispiel 135 wurden in 4 mL THF/Wasser gelöst und mit 48 μΐ^ einer 2molaren wässrigen Lithiumhydroxidlösung versetzt. Der Ansatz wurde 1 h bei RT gerührt und anschließend eingeengt und mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Vereinigung, Einengen und Lyophilisation aus Acetonitril/Wasser der entsprechenden Fraktionen wurden 2.4 mg (60% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.86 min; MS (EIpos): m/z = 814 [M+H]+. Beispiel M9
N-(3-Aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2-hydroxyacetamid
Figure imgf000484_0001
150.0 mg (0.42 mmol) (lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropan-l -amin (Intermediat C52) wurden in 2.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 29.2 mg (0.49 mmol) HOAc und 125.6 mg (0.59 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid versetzt und 5 min bei RT gerührt. Es wurden 98.9 mg (0.49 mmol) 3-(l,3-Dioxo-l,3-dihydro-2H-isoindol-2- yl)propanal zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase zweimal mit ges. Natriumcarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand mittels Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol 100:1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 188.6 mg (74 %) der Verbindung 2-[3-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} amino)propyl] - 1 H-isoindol- 1 ,3 (2H)-dion.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.00 min; MS (ESIpos): m/z = 541 [M+H]+. BHC 15 1 040-A - 484 -
171.2 mg (0.32 mmol) 2-[3-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pynol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino)propyl]-lH-isoindol-l,3(2H)-dion wurden in 5.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 73.6 mg (0.73 mmol) Triethylamin versetzt. Bei 0 °C wurden 94.9 mg (0.70 mmol) Acetoxyessigsäurechlorid zugegeben und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase zweimal mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 10 g SNAP, Fluss 12 mL/min, Ethylacetat/Cyclohexan 1 :3) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 159.0 mg (77 %) der Verbindung 2-({(lR)-l- [ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} [3-( 1 ,3 -dioxo- 1 ,3-dihydro- 2H-isoindol-2-yl)propyl]amino)-2-oxoethylacetat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.35 min; MS (ESIpos): m/z = 642 [M+H]+.
147.2 mg (0.23 mmol) 2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}[3-(l,3-dioxo-l,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)propyl]amino)-2-oxoethylacetat wurden in 4.0 mL Ethanol vorgelegt und mit 356.2 mg (4.59 mmol) Methanamin (40 % in Wasser) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 50 °C gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand dreimal mit Toluol kodestilliert. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol 10:1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 67.4 mg (63 %) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 470 [M+H]+.
Beispiel MIO
(2R,28R)-28-Amino-2-[( {2-[(3-aminopropyl) {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)methyl]-25-(carboxymethyl)-4,20,24-trioxo- 7,10,13,16-tetraoxa-26-thia-3,19,23-triazanonacosan-l,29-disäure -trifluoressigsäure (1 :2) und ( 1 R,28R,34R)- 1 -Amino-33 -(3 -aminopropyl)-34-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]- 35,35-dimethyl-6,10,26,32-tetraoxo-14,17,20,23-tetraoxa-3,30-dithia-7,l 1,27,33- tetraazahexatriacontan-l,4,28-tricarbonsäure -trifluoressigsäure (1 :2) BHC 15 1 040-A ■485
Figure imgf000486_0001
20 mg (0.018 mmol) R-{2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-diflu^
yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxo^
oxo-4,7, 10,13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 -oyl]-L-cystein-trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat F209) und 9.78 mg (0.036 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl) ethoxy]carbonyl}-L-cystein wurden in 2 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (47.7 mg) wurde in 3 mL THF/Wasser 1 :1 gelöst. Es wurden 0.08 mL einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit 9.26 mg (0.15 mmol) Essigsäure auf einen pH-Wert von ~7 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 15.3 mg (29% über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate erhalten.
LC-MS (Methode 6): Rt = 12.26 min und 12.30min; MS (ESIpos): m/z = 1254 (M+H)+.
Im letzten Schritt wurden 15.3 mg (0.01 mmol) von diesem Intermediat in 2 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 6.1 mg (0.05 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde 13.1 mg (0.05 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemitte wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus BHC 15 1 040-A - 486 -
Acetonitril/Wasser wurden 11.9 mg (79.5%) der Titelverbindung als Regioisomereng erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 1110 (M+H)+. Beispiel Mll
S-{2-[(3-Amino ro yl){(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH- yrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoeth l}-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :2)
Figure imgf000487_0001
15.0 mg (0.018 mmol) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cystein trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 7.4 mg (0.054 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 15.8 mg (0.054 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 %> TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 11.1 mg (77 %>) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 573 (M+H)+. BHC 15 1 040-A - 487 -
Beispiel M12
4-{[(1Κ)-2-({2-[(3-ΑΓηίηορΓοργ1){(1Κ)-1-[1-06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)-l-carboxyethyl]amino}-4-oxobutansäure trifluoressigsäure (1 :1
Figure imgf000488_0001
12.2 mg (0.014 mmol) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-(4-tert-butoxy- 4-oxobutanoyl)-L-cystein (Intermediat 77) wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 11.4 mg (0.084 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 24.5 mg (0.084 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.6 mg (42 %>) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 673 (M+H)+.
Beispiel M13
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]amino}-2-oxoethyl)amino]-2-{[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl] sulfanyl } -4 -oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1)
Regioisomer 1, Epimer 1 (2R) oder (2S) BHC 15 1 040-A 488
Figure imgf000489_0001
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.44 min; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]
Zunächst wurde Methyl-L-cysteinathydrochlorid (1 :1) mit l-({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl}oxy)pyrrolidine-2,5-dion in DMF in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin in Methyl -N- { [2-(trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl} -L-cysteinat überfuhrt.
408 mg (1.93 mmol) von kommerziell erhältlicher 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure und 180 mg (0.644 mmol) Methyl-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L-cysteinat wurden in 8 ml DMF gelöst und mit 147 mg (0.97 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 18 h Rühren bei RT wurden nochmals 136 mg (0.64 mmol) 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure sowie 147 mg (0.97 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en hinzugefügt und der Ansatz weitere 12 h bei RT gerührt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 151 mg (57% d. Th.) 4-Methoxy-3-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy ] carbonyl } amino)propyl] sulfanyl } -4-oxobutansäur e erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.74 min; MS (ESIneg): m/z = 408 (M-H)\
Von diesem Intermediat wurden 145 mg mittels überkritischer Fluidchromatographie über chirale Säulen in die Einzeldiastereomere aufgetrennt (SFC; Säule: DAICEL, AD-H 5u 250x20 mm; Fluss: 80 mL/min; Methode: AD-25%ETOH-80ml; Druck: 100 bar; Wellenlänge: 210 nM) und dabei wurden von Epimer 1 63 mg (43%) und von Epimer 2 58 mg (40%o) erhalten.
Epimer 1 wurde wie folgt charakterisiert:
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.94 min; MS (ESIneg): m/z = 408 (M-H)\ BHC 15 1 040-A - 489 -
Ή-NMR: (400 MHz, DMSO-d«): δ = 7.57 (d, 1H), 4.24 (m, 1H), 4.05 (t, 2H), 3.67 (t, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.05 (dd, 1H), 2.70-2.88 (m, 2H), 2.59 (dd, 1H), 0.93 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
Epimer 2 wurde wie folgt charakterisiert:
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.95 min; MS (ESIneg): m/z = 408 (M-H)\
Ή-NMR: (400 MHz, DMSO-d«): δ = 7.58 (d, 1H), 4.16-4.23 (m, 1H), 4.05 (t, 2H), 3.67 (dd, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.64 (s, 3H), 3.04 (dd, 1H), 2.88 (dd, 1H), 2.77 (dd, 1H), 2.61 (dd, 1H), 0.92 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
32.5 mg (0.079 mmol) von Epimer 1 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylmorpholin mit 50 mg (0.066 mmol) von Intermediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 43 mg (57% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat Methyl-4-{[(8S)-8-{2-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl propyl}(glycoloyl)amino]ethyl} -2,2-dimethyl-6,9, 14-trioxo-5-oxa-7, 10,13-triaza-2-silapentadecan- 15-yl]amino}-2-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)propyl] sulfanyl}-4-oxobutanoat erhalten wurden.
Anschließend wurden 40 mg (0.035 mmol) dieses Intermediats mit 0.9 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 11 ml Methanol 20 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methylestergruppen abgespalten wurden. Nach HPLC -Reinigung wurden 12 mg (31% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 4.74 min; MS (ESIpos): m/z = 1120 [M+H]+.
10 mg (0.009 mmol) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 2.6 mg (30%o d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.44 min; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]+. BHC 15 1 040-A - 490 -
Beispiel M14
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benz^
dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } amino)ethyl] amino } -2-oxoethyl)amino]-2-{[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl] sulfanyl } -4 -oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1)
Regioisomer 1, Epimer 2 (2R oder 2S)
Figure imgf000491_0001
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.44 min; MS (EIpos): m/z = 832 [M+H]+.
Das in Beispiel Ml 3 beschriebene Intermediat Epimer 2 wurde in Analogie zu der Beschreibung in Beispiel Ml 3 umgesetzt:
32.5 mg (0.079 mmol) von Epimer 2 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylmorpholin mit 50 mg (0.066 mmol) von Intermediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 43 mg (57% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat Methyl-4-{[(8S)-8-{2-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl propyl}(glycoloyl)amino]ethyl} -2,2-dimethyl-6,9, 14-trioxo-5-oxa-7, 10,13-triaza-2-silapentadecan- 15-yl]amino}-2-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)propyl] sulfanyl}-4-oxobutanoat erhalten wurden.
Anschließend wurden 40 mg (0.035 mmol) dieses Intermediats mit 0.9 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 11 ml Methanol 20 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methylestergruppen abgespalten wurden. Nach HPLC -Reinigung wurden 11 mg (28% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 4.74 min; MS (ESIpos): m/z = 1120 [M+H]+.
10 mg (0.009 mmol) von diesem Intermediat wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC BHC 15 1 040-A - 491 - gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 4.4 mg (52% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.44 min; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]+.
Beispiel Ml 5
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } amino)ethyl] amino } -2-oxoethyl)amino] -3 - { [(2R)-2- amino-2-carboxyethyl] sulfanyl } -4 -oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1)
Regioisomer 2, Epimer 1 (3R oder 3S)
Figure imgf000492_0001
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.45 min; MS (EIpos): m/z = 832 [M+H]+.
742.8 mg (3.3 mmol) von kommerziell erhältlicher 2-Brom-4-ethoxy-4-oxobutansäure und 802 mg (2.87 mmol) Methyl-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cysteinat wurden in 32 ml DMF gelöst und mit 655.4 mg (4.31 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 20 h Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 521 mg (43% d. Th.) 4-Ethoxy-2-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)propyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 3.13 min; MS (ESIpos): m/z = 424 (M+H) BHC 15 1 040-A - 492 -
Von diesem Intermediat wurden 510 mg mittels überkritischer Fluidchromatographie über chirale Säulen in die Einzeldiastereomere aufgetrennt (SFC; Säule: DAICEL, AD-H 5u 250x20 mm; Fluss: 80 mL/min; Methode: AD-10%ETOH-80ml; Druck: 100 bar; Wellenlänge: 210 nM) und dabei wurden von Epimer 1 100 mg (20%) und von Epimer 2 141 mg (28%) erhalten.
Epimer 1 wurde wie folgt charakterisiert:
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.99 min; MS (ESIneg): m/z = 422 (M-H)\
Ή-NMR: (400 MHz, DMSO-d«): δ = 7.60 (d, 1H), 4.18-4.26 (m, 1H), 4.01-4.08 (m, 4H), 3.63 (s, 3H), 3.59 (dd, 1H), 3.04 (dd, 1H), 2.92 (dd, 1H), 2.80 (dd, 1H), 2.63 (dd, 1H), 1.17 (t, 3H), 0.92 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
Epimer 2 wurde wie folgt charakterisiert:
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.95 min; MS (ESIneg): m/z = 408 (M-H)\
Ή-NMR: (400 MHz, DMSO-d«): δ = 7.56 (d, 1H), 4.21-4.29 (m, 1H), 4.01-4.1 (m, 4H), 3.64 (s, 3H), 3.58 (dd, 1H), 3.08 (dd, 1H), 2.85 (dd, 1H), 2.78 (dd, 1H), 2.60 (dd, 1H), 1.17 (t, 3H), 0.93 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
33.6 mg (0.079 mmol) von Epimer 1 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylmorpholin mit 50 mg (0.066 mmol) von Intermediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 51 mg (63%o d. Th.) vom voll geschützten Intermediat Ethyl-4- { [(8S)-8- {2-[ {(1 R)-l -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl propyl}(glycoloyl)amino]ethyl} -2,2-dimethyl-6,9, 14-trioxo-5-oxa-7, 10,13-triaza-2-silapentadecan- 15-yl]amino}-3-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl}amino)propyl] sulfanyl}-4-oxobutanoat erhalten wurden.
Anschließend wurden 49 mg (0.042 mmol) dieses Intermediats mit 0.5 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 12 ml THF/Wasser 1 :1 30 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methylestergruppen abgespalten wurden. Nach Ansäuern und HPLC -Reinigung wurden 11 mg (24%o d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 4.68 min; MS (ESIpos): m/z = 1120 [M+H]+.
11 mg (0.01 mmol) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 3.7 mg (39%o d. Th.) der Titelverbindung erhalten. BHC 15 1 040-A - 493 -
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.45 min; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]+.
Beispiel Ml 6
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } amino)ethyl] amino } -2-oxoethyl)amino] -3 - { [(2R)-2- amino-2-carboxyethyl] sulfanyl } -4 -oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1)
Regioisomer 2, Epimer 2 (3R oder 3S)
Figure imgf000494_0001
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.44 min; MS (EIpos): m/z = 832 [M+H]+.
Das in Beispiel Ml 5 beschriebene Intermediat Epimer 2 wurde in Analogie zu der Beschreibung in Beispiel Ml 5 umgesetzt:
33.6 mg (0.079 mmol) von Epimer 2 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylmorpholin mit 50 mg (0.066 mmol) von Intermediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 51 mg (63% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat Ethyl-4-{[(8S)-8-{2-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl propyl}(glycoloyl)amino]ethyl} -2,2-dimethyl-6,9, 14-trioxo-5-oxa-7, 10,13-triaza-2-silapentadecan- 15-yl]amino}-3-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl} amino )propyl] sulfanyl}-4-oxobutanoat erhalten wurden.
Anschließend wurden 49 mg (0.042 mmol) dieses Intermediats mit 0.5 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 12 ml THF/Wasser 1 :1 30 min lang bei RT gerührt, wobei beide BHC 15 1 040-A - 494 -
Methylestergruppen abgespalten wurden. Nach Ansäuern und HPLC -Reinigung wurden 13.4 mg
(28% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 4.66 min; MS (ESIpos): m/z = 1120 [M+H]+.
13.4 mg (0.012 mmol) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 7.5 mg (66% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.44 min; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]+.
Beispiel Ml 7
(2S)-2-Amino-4-[ {( 1 R)-l -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butansäur hydrochlorid (1 :1)
Figure imgf000495_0001
150 mg (0.2 mmol) von Intermediat C53 wurden in 15 mL DMF gelöst und mit 2.29 g (20.39 mmol) DABCO versetzt. Der Ansatz wurde 30 min im Ultraschallbad behandelt. Durch Zugabe von 1.17 ml Essigsäure wurde der Ansatz dann auf pH 3-4 gebracht und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt und die entsprechenden Fraktionen wurden bei RT im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Acetonitril/Wasser 1 :1 aufgenommen, mit 5 mL einer 4N Salzsäure versetzt und anschließend lyophilisiert. So wurden 81 mg (68%o d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.69 min; MS (EIpos): m/z = 514 [M+H] BHC 15 1 040-A - 495 -
Beispiel Ml 8
Ν-[2-({(28)-2-ΑΓηίηο-4-[{(1Κ)-1-[1-06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]-L-glutamin -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000496_0001
Zunächst wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie Trifluoressigsäure -benzyl-N-(2- aminoethyl)-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-L-glutaminat (1 :1) hergestellt. Diese Intermediat wurde dann in Gegenwart von HATU mit Intermediat C58 gekuppelt. Anschließend wurde zunächst durch hydrogenolytische Spaltung die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe sowie der Benzylester entfernt und anschließend mit Zinkchlorid die 2-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-Schutzgrupe. LC-MS (Methode 6): Rt = 1.91 min; MS (EIpos): m/z = 685 [M+H]+.
Beispiel M19
N6-(N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } ( (1 :1)
Figure imgf000496_0002
Zunächst wurde nach in der Peptidchemie bekannten klassischen Schutzgruppenoperationen Trifluoressigsäure — 2-(trimethylsilyl)ethyl-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-L-lysinat (1 :1) hergestellt. Dieses Intermediat wurde dann in Gegenwart von HATU mit Intermediat C61 gekuppelt. Anschließend wurde zunächst mit Zinkchlorid die 2-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-Schutzgrupe sowie der 2-(Trimethylsilyl)ethylester gespalten. Schließlich wurde die Titelverbindung durch BHC 15 1 040-A - 496 - hydrogenolytische Spaltung der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe und Reinigung durch präparative HPLC erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt = 1.65 min;
Beispiel M20
( 1 R,4R,27R,33R)- 1 -Amino-32-(3 -aminopropyl)-33-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)- 1 H-pyrrol-2- yl]-34,34-dimethyl-6,9,25,31-tetraoxo-13,16,19,22-tetraoxa-3,29-dithia-7,10,26,32- tetraaza entatriacontan- 1 ,4,27-tricarbonsäure -trifluoressigsäure (1 :2)
Figure imgf000497_0001
Zunächst wurde Methyl-L-cysteinathydrochlorid (1 :1) mit l-({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl}oxy)pyrrolidine-2,5-dion in DMF in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin in Methyl -N- { [2-(trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl} -L-cysteinat überfuhrt.
408 mg (1.93 mmol) von kommerziell erhältlicher 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure und 180 mg (0.644 mmol) Methyl-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L-cysteinat wurden in 8 ml DMF gelöst und mit 147 mg (0.97 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 18 h Rühren bei RT wurden nochmals 136 mg (0.64 mmol) 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure sowie 147 mg (0.97 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en hinzugefügt und der Ansatz weitere 12 h bei RT gerührt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 151 mg (57% d. Th.) 4-Methoxy-3-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy ] carbonyl } amino)propyl] sulfanyl } -4-oxobutansäure erhalten. BHC 15 1 040-A - 497 -
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.74 min; MS (ESIneg): m/z = 408 (M-H)\
3.66 mg (8.93 μηιοΐ) von 4-Methoxy-3-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)propyl] sulfanyl}-4-oxobutansäure wurden in Gegenwart von 3.66 mg (8.93 μιηοΐ) HATU und 1.6 μΐ (15 μιηοΐ) 4-Μ6 1πιοφΙιοΗη mit 13.0 mg (7.44 μιηοΐ) von S-(l l-{(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}- 2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-[ 15-(glycylamino)-4,7, 10,13- tetraoxapentadecan-l-oyl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C80) gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 3.9 mg (37% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat S-(l 1-{(1R)-1-[1- Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5- oxa-7,1 l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[15-({N-[(8R,l 1R)-8,11 -bis(methoxycarbonyl)-2,2- dimethyl-6,13-dioxo-5-oxa-10-thia-7-aza-2-silatridecan-13-yl]glycyl}amino)-4,7,10,13- tetraoxapentadecan-l-oyl]-L-cystein erhalten wurden.
Anschließend wurden 3.90 mg (2.76 μιηοΐ) dieses Intermediats mit 35 μΐ einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 1.0 ml THF/Wasser 3:1 15 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methylestergruppen abgespalten wurden. Nach HPLC -Reinigung wurden 3.60 mg (94% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 4.83 min; MS (ESIpos): m/z = 1385 [M+H]+.
3.60 mg (2.60 μιηοΐ) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 1.92 mg (55%o d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.72 min; MS (ESIneg): m/z = 1094 [M-H]\
BHC 15 1 040-A - 498 -
Beispiel M21
(2Κ,248,27Κ)-27-ΑΓηίηο-2-[({2-[(3-αΓπίηορΓοργ1){(1Κ)-1-[1-06ηζγ1-4-(2,5-ώί1υο 1ΐ6ηγ1)-1Η- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} amm^
trioxo-7, 10,13,16 sigsäure ( 1 :2)
Figure imgf000499_0001
742.8 mg (3.3 mmol) von kommerziell erhältlicher 2-Brom-4-ethoxy-4-oxobutansäure und 802 mg (2.87 mmol) Methyl-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cysteinat wurden in 32 ml DMF gelöst und mit 655.4 mg (4.31 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 20 h Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 521 mg (43% d. Th.) 4-Ethoxy-2-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)propyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 3.13 min; MS (ESIpos): m/z = 424 (M+H)+.
4.36 mg (10.3 μιηοΐ) von 4-Ethoxy-2-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)propyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure wurden in Gegenwart von 3.92 mg (10.3 μιηοΐ) HATU und 1.9 μΐ (17 μιηοΐ) 4-Methylmorpholin mit 15.0 mg (8.59 μιηοΐ) von S-(l l-{(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}- 2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-[ 15-(glycylamino)-4,7, 10,13- tetraoxapentadecan-l-oyl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C80) gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 3.6 mg (26% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat S-(l 1-{(1R)-1-[1- Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5- oxa-7,1 l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[15-({N-[(8R,l 1 S)-1 l-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-8- BHC 15 1 040-A - 499 -
(methoxycarbonyl)-2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 10-thia-7-aza-2-siladodecan- 12- yl]glycyl}amino)-4,7,10,13-tetraoxapentadecan-l-oyl]-L-cystein erhalten wurden.
Anschließend wurden 6.20 mg (2.82 μιηοΐ) dieses Intermediats mit 35 μΐ einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 1.0 ml THF/Wasser 1 :1 15 min lang bei RT gerührt, wobei beide Estergruppen abgespalten wurden. Nach Ansäuern und HPLC -Reinigung wurden 3.60 mg (92% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 4.71 min; MS (ESIpos): m/z = 1385 [M+H]+.
3.60 mg (1.69 μιηοΐ) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 0.88 mg (39% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.72 min; MS (ESIneg): m/z = 1094 [M-H]\
Beispiel M22
(2R,27R)-27-Amino-2-[( {2-[(3-aminopropyl) {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)methyl]-24-(carboxymethyl)-4,20,23-trioxo- 7,10,13, 16-tetraoxa-25-thia-3,19,22-triazaoctacosan-l,28-disäure-trifluoressigsäure (1 :2) und (lR,27R,33R)-l-Amino-32-(3-aminopropyl)-33-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]- 34,34-dimethyl-6,9,25,31 -tetraoxo-13,16,19,22-tetraoxa-3,29-dithia-7,l 0,26,32- tetraazapentatriacontan-1 ,4,27-tricarbonsäure-trifluoressigsäure (1 :2)
Figure imgf000500_0001
BHC 15 1 040-A - 500 -
16.5 mg (0.015 mmol) S-{2-[(3-Amino ro yl){(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- yrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-2, 18- dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat F257) und 8.18 mg (0.031 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl) ethoxy]carbonyl}-L-cystein wurden in 2 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (28.9 mg) wurde in 3 mL THF/Wasser 1 :1 gelöst. Es wurden 0.046 mL einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 3 Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit 5.2 μΐ (0.092 mmol) Essigsäure auf einen pH-Wert von ~7 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 12.1 mg (58% über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.82 min; MS (ESIpos): m/z = 1240 (M+H)+.
Im letzten Schritt wurden 12,1 mg (0.009 mmol) von diesem Intermediat in 2 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 7.3 mg (0.054 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde 15.7 mg (0.054 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemitte wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 6.4 mg (59%) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 1096 (M+H)+. Beispiel M23
N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl propyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-L-glutaminsäure -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000501_0001
BHC 15 1 040-A - 501 -
Zunächst wurde Di-tert-butyl L-glutamate hydro Chloride (1 :1) in Gegenwart von HATU und NN- Diisopropylethylamin mit Intermediat C61 gekuppelt. Anschließend wurde das geschützte Intermediat in Trifluorethanol aufgenommen und durch Rühren über Nacht bei 50°C in Gegenwart von Zinkchlorid vollständig entschützt. Die Aufarbeitung erfolgte nach Zugabe von EDTA durch Reinigung mittels präparativer HPLC.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.45 min; MS (ESIpos): m/z = 714 [M+H]+. Beispiel M24
N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutaminsäure -trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000502_0001
Zunächst wurde Di-tert-butyl D-glutamat Hydrochlorid (1 :1) in Gegenwart von HATU und NN- Diisopropylethylamin mit Intermediat C61 gekuppelt. Anschließend wurde das geschützte Intermediat in Trifluorethanol aufgenommen und durch Rühren bei 50°C in Gegenwart von Zinkchlorid vollständig entschützt. Die Aufarbeitung erfolgte nach Zugabe von EDTA durch Reinigung mittels präparativer HPLC.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.41 min; MS (ESIpos): m/z = 714 [M+H]+. Beispiel M25
Ν-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl propyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-L-glutaminsäure -trifluoressigsäure (1 :1) BHC 15 1 040-A - 502 -
Figure imgf000503_0001
Zunächst wurde Di-tert-butyl L-glutamat Hydrochloride (1 :1) in Gegenwart von HATU und NN- Diisopropylethylamin mit Intermediat C61 gekuppelt. Im nächsten Schritt wurde die Z- Schutzgruppe durch 45-minütige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Methanol bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Anschließend wurde das partiell geschützte Intermediat in Trifluorethanol aufgenommen und durch 7 stündiges Rühren bei 50°C in Gegenwart von Zinkchlorid vollständig entschützt. Die Aufarbeitung erfolgte nach Zugabe von EDTA durch Reinigung mittels präparativer HPLC.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.44 min; MS (ESIpos): m/z = 643 [M+H]+.
Beispiel M26
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]amino}-2-oxoethyl)amino]-2-{[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1)
Regioisomer 1 , Epimerengemisch
Figure imgf000503_0002
Dieses Beipiel beschreibt das Epimerengemisch der Verbindungen aus Beispiel 13 und Beispiel 14. Die Synthese erfolgte in Analogie zu Beispiel 13, wobei auf die Auftrennung der beiden Epimere durch überkritische Fluid-Chromatograpie verzichtet wurde und die Titelverbindung als Epimerengemisch hergestellt wurde. BHC 15 1 040-A - 503 -
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.43 min; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]+. Beispiel M27
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (gly coloyl)amino]butanoyl } amino)ethyl] amino } -2-oxoethyl)amino] -3 - { [(2R)-2- amino-2-carboxyethyl] sulfanyl } -4 -oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1)
Regioisomer 2, Epimerengemisch
Figure imgf000504_0001
Dieses Beipiel beschreibt das Epimerengemisch der Verbindungen aus Beispiel 15 und Beispiel 16. Die Synthese erfolgte in Analogie zu Beispiel 15, wobei auf die Auftrennung der beiden Epimere durch überkritische Fluid-Chromatograpie verzichtet wurde und die Titelverbindung als Epimerengemisch hergestellt wurde.
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.45 min; MS (EIpos): m/z = 832 [M+H]+.
BHC 15 1 040-A - 504 -
Ausführungsbeispiele ADCs
Die Kupplungsreaktionen wurden unter Argon durchgeführt.
Die in den Strukturformen der Ausführungsbeispiele dargestellten ADCs, die über Maleinimid- Reste an Cysteinseitenketten der Antikörper gekuppelt wurden, liegen in Abhängigkeit vom Linker und von dem Kupplungsprotokoll zum überwiegenden Teil in den jeweils dargestellten ring- geöffheten bzw. ring-geschlossenen Formen vor. Zu einem kleinen Anteil kann jedoch die jeweils andere Form in der Präparation enthalten sein.
Die in den Ausführungsbeispielen dargestellten ADCs wurden teilweise mit mehreren anti-B7H3 Antikörpern hergestellt. Die jeweils eingesetzten Antikörper sowie die analytischen Daten der hergestellten ADCs sind in Tabelle 1 am Ende der Ausführungsbeispiele zusammengefasst.
Beispiel 173
Figure imgf000505_0001
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat Fl 73 5 mg der betreffenden Anti-B 7H3 Antikörper in PBS (c=l 1.1 mg/mL). Nach Zugabe von 0.029 mg TCEP gelöst in 50 PBS Puffer wurde der Ansatz 30 min bei RT gerührt. Dann wurden 0.31 mg (0.23 μιηοΐ) F 173 in 50 μΐ^ DMSO zugegeben und der Ansatz weitere 1.5 h bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS. 1 040-A 505 194
Figure imgf000506_0001
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat Fl 94 5 mg der betreffenden Anti-B 7H3 Antikörper in 450 μΐ, PBS (c = 11.1 mg/mL). Zunächst wurden 5Eq von Intermediat Fl 94 gelöst in 50μΙ. DMSO zugesetzt und nach lh Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Beispiel 208
Figure imgf000506_0002
BHC 15 1 040-A - 506 -
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 450 μL· PBS (c=l 1.1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.287 mg TCEP in 50 μΐ PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.215 mg (0.000267 mmol) von Intermediat F104 gelöst in 50 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.
Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Beispiel 240
Figure imgf000507_0001
3 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 75 μL· ml PBS (c=39.8 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.017 mg TCEP in 30μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1335 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.119 mg (0.00014 mmol) von Intermediat F240 gelöst in 60 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1.0 ml PBS-Puffer pH 8 verdünnt und über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS- Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. BHC 15 1 040-A Beispiel 257
Figure imgf000508_0001
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 133 μL· ml PBS (c=44.1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 2237 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.250 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F257 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen.
Beispiel 263
Figure imgf000508_0002
BHC 15 1 040-A - 508 -
25 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 2,363 ml PBS (c=10,58 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.14 mg TCEP in 0.20 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.746 mg (0.00083 mmol) von Intermediat F263 gelöst in 200 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der mittels PD-10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Eluate wurden dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH-Wert von 7.2 umgepuffert und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert.
Beispiel 267
Figure imgf000509_0001
25 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 2,363 ml PBS (c=10,58 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.14 mg TCEP in 0.20 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.952 mg (0.00083 mmol) von Intermediat F267 gelöst in 200 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der mittels PD-10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Eluate wurden dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH-Wert von 7.2 umgepuffert und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert.
Figure imgf000510_0001
25 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 2,363 ml PBS (c=10,58 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.14 mg TCEP in 0.20 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.761mg (0.00083 mmol) von Intermediat F271 gelöst in 200 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der mittels PD-10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Eluate wurden dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH-Wert von 7.2 umgepuffert und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert.
BHC 15 1 040-A - 510 - Beispiel 274
Figure imgf000511_0001
2.5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 132 μL· ml PBS (c=38.0 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 2218 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.232 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F274 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der Ring-geschlossenen Form vorliegen
BHC 15 1 040-A Beispiel 281
Figure imgf000512_0001
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F281 5 mg der betreffenden Anti-B 7H3 Antikörpern in 510 μΐ, PBS bei pH 7.2 (c=9.8 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.22 mg (0.23 μιηοΐ) F281 in 50 μΐ^ DMSO 20 h bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Figure imgf000512_0002
BHC 15 1 040-A - 512 -
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 450 μL· ml PBS (c=l 1.1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0,26 mg (0.23 μιηοΐ) von Intermediat F284 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer pH 8 auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Beispiel 296
Figure imgf000513_0001
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 500 μL· ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0,21 mg (0.23 μιηοΐ) von Intermediat F296 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer pH 8 auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). BHC 15 1 040-A Beispiel 297
Figure imgf000514_0001
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F297 3 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 270 μΐ, PBS bei pH 7.2 (c= 11.1 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.017 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.13 mg (0.14 μιηοΐ) F297 in 50 μΐ^ DMSO, 2 h bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
BHC 15 1 040-A 514 Beispiel 307
Figure imgf000515_0001
25 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 2,363 ml PBS (c=10,58 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.14 mg TCEP in 0.20 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 1.07 mg (0.00083 mmol) von Intermediat F307 gelöst in 200 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der mittels PD-10 Säulen gereinigt und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert.
BHC 15 1 040-A 515 - Beispiel 308
Figure imgf000516_0001
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 473 μL· ml PBS (c=10.58 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1877 μΐ PBS-Puffer verdünnt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.256 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F308 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gereinigt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer.
BHC 15 1 040-A Beispiel 309
Figure imgf000517_0001
25 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 2,363 ml PBS (c=10,58 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.14 mg TCEP in 0.20 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.705 mg (0.00083 mmol) von Intermediat F309 gelöst in 200 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der mittels PD-10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Eluate wurden dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH-Wert von 7.2 umgepuffert und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
BHC 15 1 040-A Beispiel 311
Figure imgf000518_0001
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 450 μL· ml PBS (c=l 1.11 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.291 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F311 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS-Puffer pH8 verdünnt, dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). BHC 15 1 040-A Beispiel 314
Figure imgf000519_0001
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 450 μL· ml PBS (c=l 1.11 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.209 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F314 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS-Puffer pH8 verdünnt, dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
BHC 15 1 040-A 519 Beispiel 317
Figure imgf000520_0001
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 450 μL· ml PBS (c=l 1.11 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.308 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F317 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS-Puffer pH8 verdünnt, dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
BHC 15 1 040-A Beispiel 318
Figure imgf000521_0001
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 450 μL· ml PBS (c=l 1.11 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.206 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F318 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ PBS-Puffer pH8 verdünnt, dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Beispiel 319
BHC 15 1 040-A - 521 -
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 319 ml PBS (c=15.69 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 2031 μΐ PBS-Puffer verdünnt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.258 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F319 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gereinigt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer.
Beispiel 320
Figure imgf000522_0001
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 319 μL· ml PBS (c=15.69 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 2031 μΐ PBS-Puffer verdünnt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.245 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F320 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gereinigt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer.
BHC 15 1 040-A - 522 -
Beispiel 321
Figure imgf000523_0001
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 319 ml PBS (c=15.69 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 2031 μΐ PBS-Puffer verdünnt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.262 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F321 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gereinigt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer.
BHC 15 1 040-A - 523 -
Beispiel 322
Figure imgf000524_0001
30 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 3 ml PBS (c=10,0 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.172 mg TCEP in 0.30 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 1.12 mg (0.001 mmol) von Intermediat F322 gelöst in 300 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der mittels PD-10 Säulen gereinigt und das Eluat mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert.
BHC 15 1 040-A Beispiel 323
Figure imgf000525_0001
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 450 μL· ml PBS (c=l 1.11 mg/mL) wurden unter
Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.328 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F323 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1950 μΐ
PBS-Puffer verdünnt, dann über PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gereinigt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer.
Beispiel 325
Figure imgf000525_0002
BHC 15 1 040-A - 525 -
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 0.400 ml PBS (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50 μΐ PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F325 gelöst in 50 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer pH 8 auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Beispiel 326
Figure imgf000526_0001
5 mg der betreffenden Anti-B7H3 Antikörper in 0.400 ml PBS (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50 μΐ PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F326 gelöst in 50 μΐ DMSO zugegeben. Der Ansatz wurde anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt, dann mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH7.2 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Tabelle 1: Eingesetzte Antikörper und analytische Daten der ADCs aus den Ausführungsbeispielen: BHC 151040-A 526
Beispiel eingesetzter mAb ADC Konzentration DAR
TPP mg/ml
173-6515 6515 2.12 3.5
194-6502 6502 1.36 1.4
208-6497 6497 1.42 3.2
208-6497 6497 11.7 3.9
208-6499 6499 1.05 2.7
208-6501 6501 0.66 2.7
208-6501 6501 8.36 3.3
208-6502 6502 1.12 2.9
208-6502 6502 11.18 3.7
208-6515 6515 2.05 3.6
208-6515 6515 12.8 4.2
208-7611 7611 8.35 4.6
208-8322 8322 8.35 4.0
208-8382 8382 11.18 4.6
208-8564 8564 6.97 3.6
208-8565 8565 8.77 3.9
208-8567 8567 1.92 3.5
208-8567 8567 10.13 4.8
208-8568 8568 2.34 3.2
240-6497 6497 0.97 2.6
240-8382 8382 8.12 3.5
257-6499 6499 0.99 3.1
257-6497 6497 7.99 3.7
257-8382 8382 7.76 3.5
257-8567 8567 1.77 3.6
263-6497 6497 8.36 3.4
267-6797 6497 8.06 1.7
271-6497 6497 8.53 3.1
274-6499 6499 0.69 3.5
281-6501 6501 0.76 1.0
281-8382 8382 1.95 3.1
281-8567 8567 1.80 3.5
284-6501 6501 0.38 1.7
284-8382 8382 1.89 4.2
284-8567 8567 2.06 4.3
296-8382 8382 1.77 4.1
296-8567 8567 1.91 4.1
297-6501 6501 0.62 2.4
307-6497 6497 4,79 3.3
308-6497 6497 1.41 2.6 BHC 151040-A -527 -
309-6497 6497 8.25 3.8
311-8382 8382 1.45 1.5
314-8382 8382 1.33 4.2
318-6497 6497 1.75 1.9
318-8382 8382 1.49 4,1
319-8382 8382 1.89 2.8
320-8382 8382 1.85 2.7
321-8382 8382 2.02 2.8
322-8382 8382 9.45 3.5
323-8382 8382 2.09 4.6
325-8382 8382 1.73 3.5
326-8382 8382 1.95 2.6
BHC 15 1 040-A - 528 -
C: Bewertung der biologischen Wirksamkeit
Die biologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch die nachstehend beschriebenen Assays gezeigt werden: a. C-la Bestimmung der cvtotoxischen Wirkung der gegen B7H3 gerichteten ADCs
Die Analyse der cytototoxischen Wirkung der Anti-B7H3-ADCs erfolgt auf verschiedenen Zelllinien:
A498: humane Nierenkarzinomzellen, ATCC-CRL-HTB-44, Standardmedium: RPMI 1640; (Biochrom; # FG 1215, mit stabilem Glutamin) + 10% FCS (Biochrom; # S0415), B7H3 positiv.
MCF-7: humane Brustkrebszellen, Standardmedium: RPMI 1640; (Biochrom; # F 1275, ohne Phenolrot) + E2 (final: 1E-10M; ß-estradiol, Sigma # E2758 oder ZK 5018 im CLL) + 10% CCS, + 2mUnits/ml Insulin (bovine, Biochrom; # K 3510) + L-Alanyl-L-Glutamine; (final: 2mM, Biochrom; # K 0302), B7H3 positiv.
Caki-2: humane Nierenkarzinomzellen, ATCC-HTB-27, Standardmedium: DMEM / Ham's F12 (#FG4815, Biochrom AG) + 10% FCS (#F2442, Sigma), B7H3 positiv.
Raji: humane Burkitt's Lymphomzellen, DMSZ-ACC-319, Standardmedium: RPMI 1640; (Biochrom; # FG 1215, mit stabilem Glutamin) + 10% FCS (Biochrom; # S0415), B7H3 negativ.
NCI-H292: humane mukoepidermoide Lungenkarzinomzellen, ATCC-CRL-1848, Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Biochrom; #S0415).
SCC4: humane Zungengrundkarzinom. Zellen, Standardmedium: DMEM / Ham's F12; (Biochrom; # FG 4815, mit stabilem Glutamin + 10% FCS (Biochrom; #S0415), Hydrocortison; (final: 40ng/mL, Biochrom; # K 3520).
U251 : humane Glioblastomzellen, Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Biochrom; #S0415).
Kultivierung der Zellen erfolgt nach Standard-Methode, wie bei der American Tissue Culture Collection (ATCC) für die jeweiligen Zelllinien angegeben. BHC 15 1 040-A - 529 -
CTG-Assay
Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach StandardMethode, mit den unter C-l angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Zellen mit einer Lösung von Trypsin (0.05%) und EDTA (0.02%) in PBS (Biochrom AG #L2143) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weissem Boden (Costar #3610) ausgesät (in 75μ1/1χ>οΙι, folgende Zellzahlen je Loch: NCI-H292: 2500 Zellen/ Loch, BxPC3 2500 Zellen / Loch) und im Brutschrank bei 37°C und 5%> Kohlendioxid inkubiert. Nach 24h wurden die Antikö^er-Wirkstoffkonjugate in 25 μΐ Kulturmedium (vierfach konzentriert) auf die Zellen gegeben, so dass finale Konzentrationen der Antikö^er^Virkstoffkonjugate von 3 x 10"7 M bis 3 x 10"11 M auf den Zellen erreicht wurden (Triplikate). Anschließend wurden die Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5%> Kohlendioxid inkubiert. In einer parallelen Platte wurde die Zellvitalität zu Beginn der Wirkstoffbehandlung (Tag 0) mit dem Cell Titer Glow (CTG) Luminescent Cell Viability Assay (Promega #G7573 und #G7571) bestimmt. Dazu wurden pro Zellansatz 1 ΟΟμΙ des Substrats hinzugefügt, die Platten anschließend mit Alufolie abgedeckt, für 2 Minuten mit dem Plattenschüttler bei 180 rpm geschüttelt, für 8 Minuten auf der Laborbank stehen gelassen und dann mit einem Luminometer (Victor X2, Perkin Elmer) gemessen. Das Substrat detektiert den ATP-Gehalt in den lebenden Zellen, wobei ein Lumineszenz-Signal erzeugt wird, dessen Höhe direkt proportional zur Vitalität der Zellen ist. Nach 72h Inkubation mit den Antikörper- Wirkstoffkonjugaten wurde nun auch in diesen Zellen die Vitalität mit dem Cell Titer Glow Luminescent Cell Viability Assay wie oben beschrieben bestimmt. Aus den gemessenen Daten wurde die IC50 der Wachstumshemmung im Vergleich zum Tag 0 unter Verwendung des DRC (Dose Response Curve) Analysis Spreadsheets anhand einer 4-Parameter Anpassung berechnet. Das DRC Analysis Spreadsheet ist ein von Bayer Pharma AG und Bayer Business Services auf der Plattform IDBS E-WorkBook Suite entwickeltes Biobook Spreadsheet (IDBS: ID Business Solutions Ltd., Guildford, UK).
In der folgenden Tabellen la und lb sind die IC50- Werte repräsentativer Ausführungsbeispiele mit den Anti-B7H3 -Antikörpern aus diesem Assay aufgeführt:
Tabelle la
MCF-7 CTG A498 CTG Caki-2 CTG Raji CTG
(IC50 M)
(IC50 M) (IC 50 M) (IC50 M)
Beispielnr.
M09 3E-11 - - 3E-1 1 BHC 15 1 040-A - 530 -
Figure imgf000531_0001
Tabelle lb
U251 CTG NCI-H292 CTG
(IC50 M) (IC 50 M)
Beispielnr.
208-
Isotypkontrolle 7.76E-8 1 .37E-7
208-8382 3 «(}&■·· 0 1 ,37 E-9
208-8564 1 .13E-10 1 .30E-9
257-8382 8.56E-1 1 nicht getestet
208-6497 7,68 E-ll nicht getestet
208-6501 2,95 E-10 nicht getestet
208-6502 9,33 E-10 nicht getestet
208-6515 4,10 E-10 nicht getestet
208-7611 2,49 E-10 nicht getestet
208-8322 6,75 E-ll nicht getestet
208-8564 1,13E-10 l,30E-09
208-8565 8,38 E-ll nicht getestet
208-8567 <3,00 E-ll 3,74 E-10
208-8567 3,40 E-10 9,46 E-9
208-8568 3,99 E-10 9,03 E-8
240-6497 2,97 E-10 nicht getestet
240-8382 2,24 E-10 nicht getestet
257-6497 5,58 E-ll nicht getestet
257-6499 7,36 E-ll 1 .09 E-09
257-8382 8,56 E-ll nicht getestet BHC 15 1 040-A - 531 -
Figure imgf000532_0001
Die angegebenen Wirkdaten beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausführungsbeispiele mit den angegebenen Drug/mAB-Ratios. Die Werte können bei anderen Drug/mAB-Ratios gegebenenfalls abweichen. Bei den IC50-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Experimenten oder um Einfachwerte. Die Wirkung der BHC 15 1 040-A - 532 -
B7H3- Antikö^er-Wirkstofikonjugate war targetspezifisch versus nicht-B7H3-exprimierenden Tumorzellen und selektiv versus der jeweiligen Isotypkontrolle, die den jeweils entsprechenden Linker und Toxophor enthielt. Die unkonjugierten Antikörper zeigten ebenfalls keine Wirkung auf die Proliferation der oben genannten Zellinien.
MTT-Assay
Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach Standardmethode, mit den unter C-l angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Zellen mit einer Lösung von Accutase in PBS (Fa. Biochrom AG #L2143) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weißem Boden (Fa. Costar #3610) ausgesät (NCI H292: 2500 Zellen/well in Ι ΟΟμΙ Gesamtvolumen). Anschließend wurden die Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 48h wurde ein Mediumwechsel durchgeführt. Dann wurden die Metaboliten in Ι ΟμΙ^ Kulturmedium in Konzentrationen von 10"5M bis 10" 13M zu den Zellen (Triplikate) pipettiert, bevor der Ansatz im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubierte. Nach 96h erfolgte die Detektion der Zellproliferation mit Hilfe des MTT-Assays (ATCC, Manassas, Virginia, USA, Katalog-Nr. 30-101 OK). Hierzu wurde das MTT Reagens für 4h mit den Zellen inkubiert, bevor durch Zugabe des Detergenzes die Lyse der Zellen über Nacht erfolgte. Die Detektion des gebildeten Farbstoffs erfolgte bei 570nm (Infinite Ml 000 pro, Fa. Tecan). Aus den gemessenen Daten wurde der ICso-Wert der Wachstumshemmung unter Verwendung der DRC (Dose Response Curve) berechnet. Die Proliferation ohne Testsubstanz, aber ansonsten identisch behandelten Zellen, wird als 100% Wert definiert.
C-lb Bestimmung der Inhibition des Kinesinspindelproteins KSP/ Eg5 durch ausgewählte Beispiele
Die Motordomäne des humanen Kinesinspindelproteins KSP /Eg5 (Fa. tebu-bio/ Cytoskeleton Inc, No. 027EG01 -XL) wurde in einer Konzentration von Ι ΟηΜ mit 50μg/ml Taxol (Fa. Sigma No. T7191-5MG) stabilisierten Microtubuli (bovine oder porcine, Fa. tebu-bio/ Cytoskeleton Inc) für 5 min bei RT in 15mM PIPES, pH 6,8 (5mM MgCl2 und l OmM DTT, Fa. Sigma) inkubiert. Die frisch hergestellte Mischung wurde in eine 384 MTP (Fa. Greiner bio-one REF 781096) aliquotiert. Es folgte die Zugabe der zu untersuchenden Inhibitoren in Konzentration von 1.0 xlO-6M bis l .Ox 10-13M und ATP (finale Konzentration 500μΜ; Fa. Sigma). Die Inkubation erfolgte über 2h bei RT. Die ATPase-Aktivität wurde durch den Nachweis des entstehenden anorganischen Phosphats mit Malachit-Grün detektiert (Fa. Biomol). Nach der Zugabe des Reagenz erfolgte eine 50min BHC 15 1 040-A - 533 -
Inkubation bei RT, bevor die Detektion der Absorption bei einer Wellenlänge von 620nm erfolgte. Als Positivkontrolle wurden Monastrol (Fa. Sigma, M8515-lmg) und Ispinesib (Fa. AdooQ Bioscience AI 0486) verwendet. Die Einzeldaten der Dosis-Wirkungskurve stellen achtfach Bestimmungen dar. Bei den I C50- Werten handelt es sich um Mittelwerte aus zwei unabhängigen Experimenten. Als 100% Kontrolle diente die nicht mit Inhibitoren behandelte Probe.
In der folgenden Tabelle 2 sind die ICso-Werte repräsentativer Ausführungsbeispiele aus dem beschriebenen Assay aufgeführt sowie die korrespondierenden zytotoxischen Daten (MTT-Assay).
Tabelle 2
NCI-H292 KP 1.4
Beispiele KSP-Assay
IC50 [M] IC50 [M] IC50 [M]
MTT Assay MTT Assay
Ml 2.01E-09 5.00E-07 5.00E-07
M2 2.45E-09 2.04E-07 1.63E-07
M3 1.52E-09 3.21E-08 9.00E-08
M4 2.71E-10 4.43E-08 1.76E-07
M5 4.57E-10 7.94E-08 2.22E-07
M6 1.78E-09 4.63E-08 1.93E-07
M7 6.21E-10 2.22E-08 9.25E-08
M9 1.07E-09 7,74E-10 2.57E-10
MIO 4.70E-10 3.03E-07 2.26E-07
Ml l 1.11E-09 4.32E-11
M12 4.46E-10 3.3E-08
M13 1.50E-09 1.52E-07 1.69E-07
M14 2.16E-09 1.74E-07 1.82E-07
M15 9.64E-10 1.33E-07 1.69E-07
M16 1.48E-09 1.43E-07 1.95E-07
M17 4.17E-09 7.35E-09
M18 5.17E-09 3.55E-08
M19 2.58E-09 1.21E-07
M20 1.50E-09 1.49E-07 2.13E-07
M21 2.31E-09
M22 8.27E-10 2.89E-08 1.82E-07
M23 1.26E-09 5.00E-07 5.00E-07
M24 2.90E-09 1.67E-07 5.00E-07 BHC 15 1 040-A 534 -
M25 2.91E-09 5.00E-07 5.00E-07
M26 9.441E-10 6.38E-08
M27 2.03E-09 2.76E-07
Die angegebenen Wirkdaten beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausführungsbeispiele.
C-2 Internalisierungsassay
Internalisierung ist der Schüsselprozess, um eine spezifische und effiziente Bereitstellung der zytotoxischen Payload in Antigen-exprimierenden Krebszellen durch Antikörper-Drug-Konjugate (ADC) zu ermöglichen. Dieser Prozess wird über Fluoreszenzmarkierung von spezifischen B7H3- Antikörpern und einen Isotyp-Kontrollantikörper verfolgt. Hierzu wurde zunächst die Konjugation des Fluoreszenzfarbstoffes an Lysine des Antikörpers durchgeführt. Die Konjugation erfolgte mit zweifach molarem Überschuss von CypHer 5E mono NHS ester (Batch 357392, GE Healthcare) bei pH 8, 3. Nach erfolgter Kupplung wurde die Reaktionsmischung gelchromatographisch aufgereinigt (Zeba Spin Desalting Columns, 40K, Fa. Thermo Scientific, No. 87768; Elutionspuffer: DULBECCO'S PBS, Fa. Sima-Aldrich, No. D8537), um überschüssigen Farbstoff zu eliminieren und den pH-Wert zu adjustieren. Die Ankonzentrierung der Proteinlösung erfolgte mittels VIVASPIN 500 Säulen (Fa Sartorius stedim biotec). Die Bestimmung der dye load des Antikörpers erfolgte mittels spektrophotometrischer Analyse (Fa. NanoDrop) und anschließender Berechnung (D: P = Adye 8protein:(A28o-0,16Adye)8dye).
Die dye load der hier untersuchten B7H3 -Antikörper sowie der Isotyp-Kontrolle lagen in vergleichbarer Größenordnung. In Zellbindungs-Assays wurde getestet, dass die Kupplung zu keiner Affinitätsänderung der Antikörper führte.
Die markierten Antikörper wurden im Internalisierungs-Assays eingesetzt. Vor dem Behandlungsstart wurden Zellen (2xl04/well) in ΙΟΟμΙ. Medium in einer 96-MTP ausgesät (fat, black, clear bottom No 4308776, Fa. Applied Biosystems). Nach 18h Inkubation bei 37°C/5%C02 wurde das Medium gewechselt und markierte Anti-B7H3 -Antikörper in variierender Konzentration hinzugefügt (10, 5, 2.5, 1, O.^g/mL). Das gleiche Behandlungsschema erfolgte mit der markierten Isotyp-Kontrolle (negative control). Die gewählten Inkubationszeiten waren 0h, 0,25h, 0,5h, lh, 1,5h 2h, 3h, 6h and 24h. Die Fluoreszenz- Messung wurde mit Hilfe des BHC 15 1 040-A - 535 -
InCellAnalyzer 1000 (Fa. GE Healthcare) durchgeführt. Es erfolgte eine kinetische Evaluierung über die Messung der Parameter granule counts/cell und totale granule intensity/cell.
B7H3 -Antikörper wurden nach Bindung an B7H3 auf ihre Internalisierungsfähigkeit hin untersucht. Hierzu wurde die B7H3-exprimierende Zelllinien (A498, 786-0) gewählt. Es konnte Target-vermittelte spezifische Internalisierung mit den B7H3 -Antikörpern beobachtet werden (Fig. 2 Besispiel A498 Zelllinie), wohingegen die Isotyp-Kontrolle keine Internalisierung zeigte.
C-3 In vitro Tests zur Bestimmung der Zell-Permeabilität
Die Zell-Permeabilität einer Substanz kann mittels in vzYro-Testung in einem Flux-Assay unter Verwendung von Caco-2 -Zellen untersucht werden [M.D. Troutman und D.R. Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. Hierzu wurden die Zellen auf 24-Loch-Filterplatten für 15-16 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz in einem HEPES- Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC (Agilent 1200, Böblingen, Deutschland) unter Verwendung von reverse phase- Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Qua- dropol-Massenspektrometer API 4000 (AB SCIEX Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp-Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et ah, J. Med. Chem. 46, 1716- 1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als aktiv transportiert klassifiziert, wenn das Verhältnis von Papp (B-A) zu Papp (A-B) (efflux ratio) >2 oder <0.5 war.
Von entscheidender Bedeutung für Toxophore, die intrazellulär freigesetzt werden, sind die Permeabilität von B nach A [Papp (B-A)] und das Verhältnis von Papp (B-A) zu PapP (A-B) (efflux ratio): Je niedriger diese Permeabilität ist, desto langsamer sind die aktiven und passiven Transportvorgänge der Substanz durch die Monoschicht von Caco-2-Zellen. Gibt das efflux ratio zudem keine Hinweise auf aktiven Transport, kann die Substanz nach intrazellulärer Freisetzung länger in der Zelle verweilen. Damit steigt auch die Zeit, die für eine Interaktion mit dem biochemischen Target (hier: Kinesin-Spindelprotein, KSP / Eg5) zur Verfügung steht.
In der folgenden Tabelle 5 sind Permeabilitätsdaten repräsentativer Ausführungsbeispiele aus diesem Assay aufgeführt: BHC 15 1 040-A - 536 Tabelle 3
Figure imgf000537_0001
C-4 In vitro Tests zur Bestimmung der Substrateigenschaften für P-Glycoprotein (P-gp)
Viele Tumorzellen exprimieren Transporterproteine für Wirkstoffe, was häufig mit einer Resistenzentwicklung gegenüber Cytostatika einhergeht. Substanzen, die keine Substrate von solchen Trans- BHC 15 1 040-A - 537 - porterproteinen wie beispielsweise P-Glycoprotein (P-gp) oder BCRP sind, könnten somit ein verbessertes Wirkprofil aufzeigen.
Die Substrateigenschaften einer Substanz für P-gp (ABCB1) wurden mittels eines Flux-Assays unter Verwendung von LLC-PKl -Zellen, die P-gp überexprimieren (L-MDRl -Zellen), bestimmt [A.H. Schinkel et ah, J. Clin. luvest. 96, 1698-1705 (1995)]. Hierzu wurden die LLC-PKl - oder L-MDRl -Zellen auf 96-Loch-Filterplatten für 3-4 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz allein oder in Gegenwart eines Inhibitors (wie z.B. Ivermectin oder Verapamil) in einem HEPES-Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompar- timenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC unter Verwendung von reverse phase- Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Qua- dropol-Massenspektrometer API 3000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines PapP- Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et ah, J. Med. Chem. 46, 1716- 1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als P-gp-Substrat klassifiziert, wenn das Efflux-Verhältnis Papp (B-A) zu Papp (A-B) >2 war.
Als weitere Kriterien zur Bewertung der P-gp-Substrateigenschaften können die Efflux- Verhältnisse in L-MDRl - und LLC-PKl -Zellen oder das Efflux-Verhältnis in An- oder Abwesenheit eines Inhibitors miteinander verglichen werden. Wenn sich diese Werte um mehr als einen Faktor 2 unterscheiden, so handelt es sich bei der betreffenden Substanz um ein P-gp-Substrat.
C-5 Pharmakokinetik
Nach i.v. Applikation von 3-30 mg/kg verschiedener ADCs können die Plasma- und Tumorkonzentrationen der Antikörperteile der ADCs mittels ELISA gemessen (siehe Kapitel: Analytik zur Quantifizierung von Antikörpern) und die pharmakokinetischen Parameter wie Clearance (CL), Fläche unter der Kurve (AUC) und Halbwertszeit (tia) berechnet werden. Analog dazu können die potentiell auftretenden Metabolitkonzentrationen der ADCs in Plasma, Tumor und Gewebe gemessen werden.
Nach Applikation von 5 mg/kg i.v. des ADC Beispiels 208-8382 in männliche Ratten konnten folgende Parameter für das ADC bestimmt werden:
Parameter Beispiel 208-8382 BHC 15 1 040-A - 538 -
Figure imgf000539_0001
Analytik zur Quantifizierung der verwendeten Antikörper
Der Antikör erteil der ADCs wurde mittels Liganden-Bindungs-Assay (ELISA) als Gesamt-IgG- Konzentration in Plasmaproben und Tumorlysaten bestimmt. Dabei wurde das Sandwich-ELISA- Format verwendet. Dieser ELISA war qualifiziert und validiert für die Bestimmung in Plasma- und Tumorproben. Die ELISA-Platten wurden mit anti-human-IgG-Fc- Antikörpern der Ziege beschichtet. Nach Inkubation mit der Probe wurden die Platten gewaschen und mit einem Detektor- Konjugat aus anti-human-IgG(H+L)-Antikörper des Affen und Meerrettichperoxidase (HRP) inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde das HRP-Substrat OPD hinzugegeben und die Farbentwicklung über die Absorption bei 490 nm verfolgt. Standardproben mit bekannter IgG- Konzentration wurden mittels 4-Parameter-Gleichung gefittet. Innerhalb der unteren (LLOQ) und oberen (ULOQ) Quantifizierungsgrenzen wurden die unbekannten Konzentrationen über Interpolation ermittelt.
C-6 Wirksamkeitstest in vivo
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Konjugate wurde in vivo beispielsweise mittels Xenograft-Modellen getestet. Der Fachmann kennt Methoden im Stand der Technik, anhand derer die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen getestet werden kann (siehe z.B. WO BHC 15 1 040-A - 539 -
2005/081711 ; Polson et al., Cancer Res. 2009 Mar 15;69(6):2358-64). Beispielsweise wurde hierzu Nagern (z.B. Mäusen) eine Tumorzelllinie, welche das Zielmolekül des Binders exprimiert, implantiert. Anschließend wurde den Implantat-Tieren entweder ein erfindungsgemäßes Konjugat, ein Isotyp-Antikörper-Kontrollkonjugate oder ein Kontrollantikörper oder isotonische Salzlösung appliziert. Die Applikation erfolgte einmalig oder öfter. Nach einer Inkubationszeit von mehreren Tagen wurde die Tumorgröße im Vergleich von Konjugat-behandelten Tieren und der Kontrollgruppe bestimmt. Die Konjugat-behandelten Tiere zeigten eine geringere Tumorgröße.
C-6a. Wachstumshemmung / Regression von experimentellen Tumoren in der Maus
Humane Tumorzellen, die das Antigen für das Antikörper- Wirkstoffkoniugat exprimieren, werden subkutan in die Flanke von immunsupprimierten Mäusen inokuliert, beispielsweise NMRi Nudeoder SCID-Mäuse. 1-10 Millionen Zellen werden aus der Zellkultur abgelöst, zentrifugiert und mit Medium oder Medium / Matrigel resuspendiert. Die Zellsuspension wird unter die Haut der Maus gespritzt.
Innerhalb von einigen Tagen wächst ein Tumor heran. Die Behandlung beginnt nach Etablierung des Tumors, ungefähr bei einer Tumorgröße von 40 mm2. Um die Wirkung auf größere Tumoren zu untersuchen, kann die Behandlung auch erst bei einer Tumorgröße von 50-100 mm2 begonnen werden.
Die Behandlung mit den ADCs erfolgt über die intravenöse (i.v.) Route in die Schwanzvene der Maus. Das ADC wird mit einem Volumen von 5 mL / kg appliziert.
Das Behandlungsschema richtet sich nach der Pharmakokinetik des Antikörpers. Als Standard wird drei Mal in Folge jeden vierten Tag behandelt. Bei langsam wachsenden Tumoren bietet sich eine wöchentliche Behandlung an. Für eine zeitnahe Beurteilung kann sich auch ein Schema mit einer Einmalbehandlung eignen. Die Behandlung kann aber auch weiter fortgesetzt werden oder es kann sich zu einem späteren Zeitpunkt ein zweiter Zyklus mit drei Behandlungstagen anschließen.
Standardmäßig werden 8 Tiere pro Behandlungsgruppe eingesetzt. Neben den Gruppen, die die Wirksubstanzen bekommen, wird eine Gruppe als Kontrollgruppe nur mit dem Puffer nach dem gleichen Schema behandelt.
Im Verlauf des Experiments wird die Tumorfläche regelmäßig mit einer Schieblehre in zwei Dimensionen (Länge / Breite) gemessen. Die Tumorfläche wird mittels Länge x Breite bestimmt. Der Vergleich der mittleren Tumorfläche der Behandlungsgruppe mit der Kontrollgruppe wird als T/C area angegeben. BHC 15 1 040-A - 540 -
Werden alle Gruppen des Experimentes nach Behandlungsende gleichzeitig beendet, können die Tumore entnommen und gewogen werden. Der Vergleich der mittleren Tumorgewichte der Behandlungsgruppe mit der Kontrollgruppe wird als T/C weight angegeben.
C-6b. Wirksamkeit in humanen Tumor-Xenograftmodellen
Die jeweiligen Tumorzellen werden subkutan in die Flanke von weiblichen NMRI-nude Mäusen (Janvier) inokuliert. Bei einer Tumorgröße von ~40 mm2 wird intravenös mit dem Antikörper- Wirkstoffkonjugat behandelt. Im Anschluss an die Behandlung wird das Tumorwachstum ggf. weiterverfolgt.
Die Behandlung mit den anti-B7H3- Antikörp er- Wirkstoffkonjugaten führt zu einer deutlichen und lang anhaltenden Wachstumshemmung der Tumore im Vergleich zur Kontrollgruppe und den Isotyp -Wirkstoffkonjugaten (die Unwirksamkeit letzterer wurde in vorangehenden Experimenten nachgewiesen). Die Tabelle 8 gibt die T/C Werte an, ermittelt über die Tumorgewichte und Tumorfläche am Tag mit dem letzten Messwert der Kontrollgruppe gerechnet nach Behandlungsstart.
Tabelle 8:
Figure imgf000541_0001
Ausführungsbeispiele für Anti-B7H3-Antikörper BHC 15 1 040-A - 541 -
Alle Beispiele wurden unter Verwendung von Standardverfahren ausgeführt, die dem Fachmann bekannt sind, sofern sie nicht hier im Detail beschrieben werden. Routine- Molekularbiologie- Verfahren der folgenden Beispiele können wie in Standardlaborbüchern beschrieben ausgeführt werden, wie Sambrook et al., Molecular Cloning: ein Laboratory Manual, 2 Auflage; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
Bindung von anti-B7H3 Antikörpern an verschiedene humane B7 Antigen mittels ELISA
TPP6497, TPP6499, TPP6501 , TPP6502und TPP6515 wurden wie oben beschrieben synthetisiert. Die Bindung der Antikörper an humanes B7H3 sowie an humanes B7H2 und B7H4 wurde mithilfe von ELISAs charakterisiert. Schwarze 384er MaxisorpPlatten (Nunc) wurden mit einem anti-human IgG Fe (Sigma, 12316; 1 :440 Verdünnung) in einfach coating Puffer (Candor) für eine Stunde bei 37 Grad Celsius gecoatet. Nach einmaligem waschen mit PBS, 0.05% Tween wurde die Platte mit 100% Smart Block (Candor) für eine Stunde bei 37 Grad Celsius geblockt. Anschliessend wurde der zu testende Antikörper an die Platte gebunden (2μ§/τ \ IgG in PBS, 0.05%o Tween, 10%o Smart Block; 1 Stunde, Raumtemperatur). Nach dreimaligem Waschen wurden die Platte mit dem relevanten Antigen oder nur mit Puffer inkubiert (37ng/ml in PBS, 0.05%o Tween, 10% Smart block; B7H2: RnDSystems, 8206-B7; B7H3: RnDSystems, 2318-B3-050/CF; B7H4: RnDSystems, 6576-B7; 1 Stunde, Raumtemperatur). Nach dreimaligem Waschen wurde die Platte mit einem anti-His HRP Antikörper inkubiert (Novagen, 71840-3; 1 : 10000 Verdünnung; 1 Stunde, Raumtemperatur). Nach dreimaligem Waschen wurde die Platte 30 Minuten mit Amplex Red inkubiert und anschliessend ausgelesen. Die Daten in Tabelle AK-1 zeigen, dass TPP6497, TPP6499, TPP6501 , TPP6502und TPP6515 B7H3, aber nicht B7H2 oder B7H4 bindet.
Tabelle AK-1 : Bindung von anti-B7H3 Antikörpern an B7H2, B7H3 und B7H4
B7 Protein B7H2 B7H3 B7H4
Quotient Signal <1.5 111 <1.5
(B7)/Signal (Puffer)
TPP6497
Quotient Signal <1.5 109 <1.5
(B7)/Signal (Puffer)
TPP6499
Quotient Signal <1.5 118 <1.5
(B7)/Signal (Puffer)
TPP6501
Quotient Signal <1.5 126 <1.5
(B7)/Signal (Puffer)
TPP6502
Quotient Signal <1.5 116 <1.5
(B7)/Signal (Puffer)
TPP6515 BHC 15 1 040-A - 542 -
Aufgrund ihrer spezifischen Bindung an B7H3 sind TPP6497, TPP6499, TPP6501, TPP6502 und TPP6515 geeignete Kandidaten für die Entwicklung von Therapeutika zur Behandlung von Krankheiten und anderen Beeinträchtigungen, in welche B7H3-exprimierende Zellen involviert sind. Erfindungsgemäß lässt sich für die genannten Antikörper mittels der unten aufgeführten Aminosäuresubstitutionen eine noch weitere Annäherung an die humanen Keimbahnsequenzen erzielen: Diese sind für TPP6497 in der leichten Kette: P33T, G51S, S53N, N54Q, S77T, R80Q, S81A, Q90A, S91A, F92W, F92Y, S94D, K97N, K97S, K98G, K105Q. Für TPP6497 in der schweren Kette: R30S, S50A, V51I, A58T, L59Y, T97A, R98K. Für TPP6499 in der leichten Kette: G25S, Y26S, V29I, G31S, N33Y, N33T, N35Y, G51R, S53N, N54Q, S77T, R80Q, S81A, Q90A, S91A, Y92W, S94D, K106Q. Für TPP6499 in der schweren Kette: R30S, D31 S, F32Y, Y33A, N35S, I37V, S50A, S50Y, A53G, A53S, K56G, K56S, Y57S, Y57T, P114S, P114Y. Für TPP6501 in der leichten Kette: R31 S, I33Y, I33T, N35Y, S52N, Q90A, T91A, G93D, T94D, G95S, W96L, V97S, F98G, K103Q. Für TPP6501 in der schweren Kette: G33A, H35S, N101Y, L103Y, L103N, L113T. Für TPP6502 in der leichten Kette: G25S, P33Y, P33T, N35Y, G51R, S53N, K54Q, Q90A, S91A, Y92W, S94D, W99V, G103E, K106E. Für TPP6502 in der schweren Kette: T31S, G33A, H35S, T97A, R98K, LI 13T. Für TPP6515 in der leichten Kette: T33Y, N35Y, D53N, L56P, L57S, Q90A, S91A, Y92W, S94D, W99V, G103E, K106E. Für TPP6515 in der schweren Kette: G33A, H35S, V40A, T57S, L104Y, L104W, Y107S.
Diese Substitutionen führen zu einer weiteren Reduktion der Immunogenität im Menschen, was eine vorteilhafte Eigenschaft im Hinblick auf die Entwicklung von Therapeutika darstellt, welche auf den erfindungsgemäßen Antikörpern basieren.
Bestimmung der Bindungsaffinität der Antikörper mittels Oberflächenplasmonenresonanz
Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Experimente zur quantitativen Bindungsanalyse wurden mit einem Biacore T200 Instrument (GE Healthcare Biacore, Inc.) durchgeführt. Hierbei wurden die zu untersuchenden Antikörper mithilfe eines an die Sensorchipoberfläche amingekoppelten antihuman Fe Antikörpers ("Human Antibody Capture Kit", BR-1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.") fixiert. Die Aminkopplung wurde nach den Herstellervorschriften mit l-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS) und Ethanolamin-HCl pH 8.5 („Amine Coupling Kit" BR-1000-50, GE Healthcare Biacore, Inc.) durchgeführt. Für die Analysen wurden Series S Sensor Chips CM5 (GE Healtchare Biacore, Inc.) mit dem Laufpuffer HBS-EP+ verwendet (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 % Surfactant P20). Alle experimentellen Schritte erfolgten bei 25 °C. Nach erfolgter Fixierung der zu untersuchenden anti-B7H3 Antikörper wurden Injektionen der extrazellulären BHC 15 1 040-A - 543 -
Domäne von B7H3 (Analyt, R&D Systems) in einer Konzentration von 400 nM vorgenommen, wobei nach jeder Antigeninjektion die Sensoroberfläche mit Glycin-HCl pH 2.0 regeneriert wurde. Vor einer erneuten Analytinjektion wurden jeweils Antikörper unter identischen Bedingungen wie zuvor fixiert. Bei allen Messungen diente eine vorgeschaltete Flusszelle, in der lediglich amingekopp elter anti-human Fe Antikörper immobilisiert vorlag, als Referenzzelle. Die Auswertung der erhaltenen Sensorgramme zum semi-quantitativen Vergleich untereinander erfolgte nach Doppelreferenzierung (Subtraktion des Referenzflusszellensignals und einer Pufferinjektion) durch einen globalen Fit basierend auf einem 1 :1 Langmuir Bindungsmodell mithilfe der Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare Biacore, Inc.).
Table AK-2: Verwendete rekombinante Antigene (B7H3) zum Affinitätsvergleich
Figure imgf000544_0001
Table AK-3: Monovalente und apparente KD Näherungswerte der anti-B 7H3 Antikörper bestimmt durch SPR mit B7H3 short und B7H3 long Proteinen (TPP-3761 und TPP-3760 als Analyt)
Figure imgf000544_0002
Bindung von anti-B7H3 Antikörpern an verschiedene Antigen-exprimierende Krebszelllinien
Die Bindung der anti-B7H3 Antikörper wurde mittels Durchflusszytometrie an verschiedenen humanen Krebs Zelllinien (A498, U251, U87 MG) untersucht. Hierzu wurden die Zellen (5xl05 cells/well) in FACS Buffer (PBS ohne Ca/Mg, 3% FCS, Biochrom) mit l(^g/mL Primärantikörperlösung (Startkonzentration) auf Eis für 30-45min lichtgeschützt inkubiert. Es wurde eine Dosiswirkungskurven (1 :5 Verdünnung) erhoben. Nach erfolgter Inkubation wurden 200μί eiskalten FACS Puffer zupipettiert und die Zellsuspension bei 4°C 400g, für 4min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 300μί eiskaltem FACS-Puffer gewaschen, bevor das gewonnen Pellet in ΙΟΟμΙ^ FACS-Puffer resuspendiert und mit Sekundärantikörper (monoclonal BHC 15 1 040-A - 544 -
Anti-Kappa light chains-FITC antibody, Fa. Sigma, No. SAB4700605) in einer 1 :10 Verdünnung erneut 30min auf Eis inkubiert wurde. Danach wurden die Zellen mit eiskaltem FACS-Puffer gewaschen und auf eine Zellkonzentration von 0.5x106 Zellen/mL eingestellt, bevor die Durchflusszytometrie mit einem Guava flow cytometer (Fa. Millipore) durchgeführt wurde. Propidium lodid (finale Konzentration ^g/mL) wurde zur Lebendfarbung genutzt. Mit Hilfe der Hintergrund bereinigte Geo Mean Fluoreszenz Werten wurde der IC50 Wert des zu untersuchenden Antiköpers ermittelt.
Table AK-4: FACS Analyse: Bindung der anti-B7H3 Antikörper an verschiedene Krebszelllinien.
Zell Linie A498 EC50 [M] U251 MG EC50 [M] U87 MG EC50 [M]
Source ATCC No. HTW-44 CLS No.300385 ATCC No. HTB-14
TPP-6497 3.10E-10
TPP-7611 5.99E-10 4.85E-10
TPP-8382 1 ,03E-09 1 ,42E-09 2.15E-09
TPP-8564 1 ,39E-09 1 .61 E-09 1 .71 E-09
TPP-8567 1 ,79E-09 1 .10E-09 1 ,67E-09
TPP-6502 1 .43E-10
TPP-8322 1 ,02E-09 8,33-10 8.87E-10
TPP-8565 9.41 E-10 8.18E-10 8.21 E-10
TPP-8568 6.75E-10 6.20E-10 8.18E-10
TPP-8748 1 ,67E-09 7.83E-10
TPP-8750 8.55E-10 7.07E-10
TPP-6501 1 ,23E-09
TPP-6499 8.47E-10
TPP-6515 6.61 E-10

Claims

Patentansprüche
1. Konjugat eines Antikörpers mit einem oder mehreren Wirkstoffmolekülen der folgenden Formel:
BINDER- -KSP wobei für einen glycosylierten oder aglycosylierten anti-B7H3-Antikörpers, oder für ein antigenbindendes Fragment von diesem steht, für einen Linker steht, für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht, und
KSP für eine Verbindung der folgenden Formel (I) steht:
Formel (I):
Figure imgf000546_0001
wobei
R1 -H, -L-#l , -MOD oder -(CH2)o-3Z darstellt,
wobei
Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -C(=0)-NY'Y2, oder
-C(=0)-OY3 darstellt, BHC 15 1 040-A - 546 -
Y1 und Y2 unabhängig voneinander -H, -NH2,
-(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z' (z.B.
-(CH2)o-3Z'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen
Y3 -H oder -(CH2)0-3Z' darstellt,
Z' -H, -NH2, -SO3H, -COOH,
-NH-C(=0)-CH2-CH2-CH(NH2)COOH
oder -(C=0-NH-CHY4)i_3COOH darstellt;
W H oder OH darstellt,
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NH-C(=0)-
NH2 substituiertes C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit - NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 H, -MOD, -C(=0)-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
wobei
Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY'Y2 oder
-C(=0)-OY3 darstellt,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander -H, -NH2 oder -(CH2)0-3Z'
darstellen,
Y3 -H oder -(CH2)0-3Z' darstellt,
Z' -H, -SO3H, -NH2 oder -COOH darstellt;
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit
-NH-C(=0)-NH2 substituiertes, Ci-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und
Y5 -H oder -C(=0)-CHY6-NH2 darstellt,
Y6 lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl darstellt;
-H, -L-#l, , -SGlys-(C=O)0.i -R4', -C(=0)-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darstellt,
wobei BHC 15 1 040-A - 547 -
SGjyS eine durch lysosomale Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid,
R4' eine Ci-io-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Cö-io-Aralkyl-, C5-10-
Heteroalkyl-, G-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl-, C5-10-
Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-,
Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy- oder Ce-
10-Aralkoxy-, Cs io-Heteroaralkoxy-, Ci-io-Alkyl-0-C6 io-
Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2,
NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -SO3H,
-SO2NH2, -S02-N(Alkyl)2, -COOH, -C(=0)-NH2,
-C(=0)-N(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox-(CH2CH20)v-R4" darstellt, wobei x 0 oder 1 ist
wobei v eine Zahl von 1 bis 20 darstellt, wobei R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise Ci-i2-Alkyl),
-CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder
-CH2-CH2-NH2 darstellt);
Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -C(=0)-NY'Y2, oder
-C(=0)-OY3 darstellt,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander -H, -NH2, oder -(CH2)0-3Z'
darstellen,
Y3 -H oder -(CH2)0-3Z' darstellt,
Z' -H, -SO3H, -NH2 oder -COOH darstellt;
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit
-NH-C(=0)-NH2 substituiertes, G-e Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt,
Y5 -H oder -C(=0)-CHY6-NH2 darstellt und
Y6 lineares oder verzweigtes G-6 Alkyl darstellt; oder
R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRn- oder
-CHRn-CH2- darstellen,
wobei BHC 15 1 040-A - 548 -
R11 -H, -NH2, -S03H, -COOH, -SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), CM Alkyl,
Figure imgf000549_0001
Haloalkyl, G-4 Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes C1-4 Alkyl, -C(=0)-0-(C 1-4 Alkyl) oder -OH darstellt;
A -C(=0)-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -S(=0)2NH- oder -CNNH2- darstellt;
R3 -L-#l, -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-,
Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-#l oder eine CMO- Alkyl-, Cö-io-Aryl- oder Cö-io-Aralkyl-, Cs io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6 io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl- Gruppe, die jeweils substituiert sein können mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 -O-Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 -0-C(=0)-Alkyl Gruppen, 1-3 -0-C(=0)-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-C(=0)-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-C(=0)-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -S(=0)n- Alkyl Gruppen, 1-3 -S(=0)2-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2)0-3Z Gruppen,
wobei
n für 0, 1 oder 2 steht,
Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=0)-NY'Y2 oder
-C(=0)-OY3 darstellt,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander -H, -NH2, oder -(CH2)0-3Z'
darstellen,
Figure imgf000549_0002
CH3)Z', -(CH2)0-3-CH(NH2)Z', oder
-(CH2)o-3Z' darstellt,
Z' -H, -SO3H, -NH2 oder -COOH darstellt,
R5 -H, -NH2, -NO2, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3,
-OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei
Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, -NHY3, -C(=0)-NY'Y2, oder
-C(=0)-OY3 darstellt, BHC 15 1 040-A - 549 -
Y1 und Y2 unabhängig voneinander -H, -NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen,
Y3 -H oder -(CH2)o-3Z' darstellt,
Z' -H, -S03H, -NH2 oder -COOH darstellt;
R6 und R7 unabhängig voneinander -H, Cyano, G-10-Alkyl, Fluor- G-io-Alkyl,C2-io-
Alkenyl, Fluor- C2-io-Alkenyl, C2-io-Alkinyl, Fluor- C2-io-Alkinyl, Hydroxy, -NO2, -NH2, -COOH oder Halogen darstellen,
R8 Ci-10-Alkyl, Fluor-Ci-10-Alkyl, C2-io-Alkenyl, Fluor-C2-io-Alkenyl, C2-10-
Alkinyl, Fluor-C2-io-Alkinyl, C4 io-Cycloalkyl, Fluor-C4-io-Cycloalkyl oder -(CH2)0-2-(HZ2) darstellt, welche ein- oder zweifach, gleich oder verschieden mit -OH, -COOH oder -NH2 substituiert sein können und
wobei
HZ2 einen 4 bis 7-gliedrigen Heterocyclus mit bis zu zwei
Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darstellt,
R9 -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F oder -CHF2 darstellt;
wobei
einer der Substituenten R1, R3 und R4 -L-#l darstellt,
L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper steht,
-MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt,
wobei
R10 -H oder G-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NH-C(=0)- , -C(=0)-NH- darstellt
(wobei wenn Gl -NHC(=0)- darstellt, R10 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-,
-S(=0)-, -S(=0)2-, -NRy-, -NRyC(=0)-, -C(=0)-NRy-, BHC 15 1 040-A - 550 -
-NRyNRy-, -S(=0)2-NRyNRy-, -C(=0)-NRyNRy-, wobei
Ry -H, Phenyl, C γ -C γ 0-Alkyl, C2-C γ 0-Alkenyl oder
C2-C1 g-Alkinyl darstellt, die jeweils ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit
-NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2,
-NH-CN-NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder
Sulfonsäure substituiert sein können,
und/ oder die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -C(=0)-, -CRx=N-0- unterbrochen sein können,
wobei
Rx -H, C 1 -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt und wobei
die Kohlenwasserstoffkette einschließlich einer gegebenenfalls an der Kohlenwasserstoffgruppe substituierten G-Go-Alkylgruppe als Seitenkette, mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, -NH-CN-NH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
G3 -H oder -COOH darstellt,
und
wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist;
sowie ihre Salze, Solvate,Salze der Solvate und Epimere.
2. Konjugat nach Anspruch 1 , wobei A für -C(=0)- steht.
3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei R1 für -H, -L-#l, -COOH, -C(=0)-NHNH2,
-(CH2)i_3NH2,
Figure imgf000551_0001
NH2 und -C(=0)-NZ"CH2COOH ist, wobei Z" für -H oder -NH2 steht. BHC 15 1 040-A - 551 -
4. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R2 und R4 für - H stehen, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes)
-CHR1 !-CHz- oder -CH2-CHR1 1- darstellen;
wobei R11 -H, -COOH, -F, Methyl, -CH2F, -OMethyl, -CH2OH, -C(=0)-0-(Ci-4 Alkyl) oder OH darstellen.
5. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R3 für -L-#l steht oder für eine Phenylgruppe, die ein- oder mehrfach mit Halogen, C1 .3 Alkyl oder
Fluor-Ci .3 Alkyl substituiert sein kann, oder eine G-10-Alkylgruppe oder Fluor- C O-
Alkylgruppe darstellt, die gegebenenfalls mit -OY4, -SY4,
-0-C(=0)-Y4, -0-C(=0)-NH-Y4, -NH-C(=0)-Y4, -NH-C(=0)-NH-Y4, -S(0)n-Y4 , -
S(=0)2-NH-Y4, -NH-Y4, oder -N(Y4)2, substituiert sein kann,
wobei
n 0, 1 oder 2 darstellt,
Y4 für -H Phenyl, welches gegebenfalls ein- oder mehrfach mit Halogen, C1 .3 Alkyl oder Fluor- C1 .3 Alkyl substituiert ist, steht oder für Alkyl steht, welches mit -OH, - COOH, und/oder -NH-C(=0)-Ci-3-Alkyl substituiert sein kann.
6. Konjugat nach An (Ilj) aufweist:
Figure imgf000552_0001
wobei
R3 -L-#l darstellt;
A -C(=0)- darstellt; und
R6, R7, R8 und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) in Anspruch 1 aufweisen. BHC 15 1 040-A 552
7. Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Substituent R1
-L-#l darstellt.
Konjugat nach Anspruch 7, wobei das Konjugat die Formel (Ilk) aufweist:
Figure imgf000553_0001
wobei
R1 -L-#l darstellt;
A -C(=0)- und
R3 -CH2OH- darstellt;
R6, R7, R8, und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) in Anspruch 1 aufweisen.
Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R5 -H oder -F ist.
Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R6 und R7 unabhängig voneinander -H, G-3-Alkyl, Fluor- G-3-Alkyl,
Figure imgf000553_0002
Fluor- C2-4- Alkenyl,
Figure imgf000553_0003
-Hydroxy oder Halogen darstellen.
Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R8 eine verzweigte G-5-Alkyl-Gruppe oder Cyclohexyl ist.
12. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R9
Fluor ist.
13. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Linker -L- eine der folgenden Grundstrukturen (i) bis (iv) aufweist: BHC 15 1 040-A 553
(i) -(C= =o)m- -SG1-L1-L2-
(ü) -(C= =o)m -L1-SG-L1-L2
(iii) -(c= =o)m -L1-L2-
(iv) -(c= =o)m -L1-SG-L2
wobei m 0 oder 1 ist, SG und SGI eine in vivo spaltbare Gruppe ist, LI unabhängig voneinander für in vivo nicht spaltbare organische Gruppen stehen, und L2 für eine Kopplungsgruppe an den Binder steht.
Konjugat nach Anspruch 13, wobei die in vivo spaltbare Gruppe SG eine 2-8
Oligopeptidgruppe, bevorzugt eine Tri- oder Dipeptidgruppe oder ein Disulfid, ein Hydrazon, ein Acetal oder ein Aminal ist und SGI eine 2-8 Oligopeptidgruppe, bevorzugt eine Dipeptidgruppe ist.
Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
wobei der Linker L an eine Cy stein- Seitenkette bzw. Cysteinrest gebunden ist und die folgende Formel aufweist:
§-(C(=0)-)m-Ll-L2-§§
wobei
m 0 oder 1 ist;
§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
§ § die Bindung an den Antikörper darstellt, und
-L2- für
Figure imgf000554_0001
Figure imgf000554_0002
BHC 15 1 040-A - 554 - steht, wobei
#' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers
kennzeichnet,
#2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet,
L1 -(NR10)n-(Gl)o-G2- darstellt,
wobei
R10 -H, -NH2 oder Ci-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NH-C(=0)- darstellt;
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 (vorzugsweise 1 bis 25) Kohlenstoffatomen aus Arylgruppen, und/oder geradkettigen und/oder verzweigten Alkylgruppen, und/oder cyclischen Alkylgruppen ist, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -N-CH3-, -NHNH-, -S(=0)2-NHNH-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NH-NH- und einen 5 bis 1 Oghedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit 1 bis 4 gleichen oder verschiedenen Heteroatomen und/ oder Heterogruppen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2-, unterbrochen sein kann
wobei geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, -NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein kann, oder eine der folgenden Gruppen darstellt:
Figure imgf000555_0001
wobei Rx -H, Ci-C3-Alkyl oder Phenyl darstellt. BHC 15 1 040-A 555
16. Konjugat nach Anspruch 15, wobei L2 dargestellt wird durch eine oder beide der folgenden Formeln:
Figure imgf000556_0001
wobei die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet,
R -COOH darstellt, und die Bindungen an das Schwefelatom des Binders zu über 80 %, (bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Binder) in einer dieser beiden Strukturen vorliegen.
17. Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche 15 oder 16, wobei L1 die folgenden Formeln aufweist:
Figure imgf000556_0002
Figure imgf000557_0001
in denen
r eine Zahl von 0 bis 8 ist.
Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergenden Ansprüche, wobei der Linker - an eine Cy stein- Seitenkette bzw. Cysteinrest gebunden ist und die folgende Formel aufweist:
Figure imgf000557_0002
wobei
§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
§ § die Bindung an den Antikörper darstellt,
m 0, 1, 2, oder 3 ist;
n 0, 1 oder 2 ist;
p 0 bis 20 beträgt; und BHC 15 1 040-A 557
L3
Figure imgf000558_0001
0 oder 1 ist;und
eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 (vorzugsweise 1 bis 25) Kohlenstoffatomen aus Arylgruppen, und/oder geradkettigen und/oder verzweigten Alkylgruppen, und/oder cyclischen Alkylgruppen ist, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -N-CH3-, -NHNH-, -S(=0)2-NHNH-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NH-NH- und einen 5 bis 1 Ogliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit 1 bis 4 gleichen oder verschiedenen Heteroatomen und/ oder Heterogruppen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2-, unterbrochen sein kann,
wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, - H2, -NH-CN-NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein kann.
19. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Konjugat eine der folgenden Formeln aufweist:
Figure imgf000558_0002
BHC 15 1 040-A - 558 -
Figure imgf000559_0001
Figure imgf000559_0002
Figure imgf000559_0003
Figure imgf000560_0001
Figure imgf000560_0002
Figure imgf000560_0003
Figure imgf000560_0004
BHC 151040-A -560 -
Figure imgf000561_0001
Figure imgf000561_0002
Figure imgf000561_0003
BHC 151040-A -561 -
Figure imgf000562_0001
Figure imgf000562_0002
Figure imgf000562_0003
BHC 15 1 040-A - 562 -
Figure imgf000563_0001
wobei
AK1 einen über Cystein verknüpften und BHC 15 1 040-A - 563 -
AK2 einen über Lysin verknüpften Antikörper darstellt, welcher an B7H3 bindet und eine chimäre oder humanisierte Variante des Antikörpers TPP-6497 ist, n eine Zahl von 1 bis 20 darstellt; und
Li eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 30
Kohlenstoffatomen, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -C(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, Cyclopentyl, Piperidinyl, Phenyl unterbrochen sein kann,
wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit -COOH, oder -NH2 substituiert sein kann,
sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
20. Konjugat nach Anspruch 19, wobei der Linker Li für die Gruppe
§-NH-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)6-§§;
§-NH-(CH2)2-0-(CH2)2-§§;
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-§§
§-NH-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH-(CH2)2-C(=0)-0-(CH2)2-§ § ;
§-NH-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-§ § ;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)3-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-§ § ;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH(CH3)-§ § ;
§-NH-(CH2)2-0-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§-NH-CH(COOH)-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH(C2H4COOH)-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-((CH2)2-0)3-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)2-S(=0)2-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH2-§§; BHC 15 1 040-A - 564 -
§-NH-(CH2)3-NH-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH(CH2COOH)-§ § ;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH(C2H4COOH)-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH(CH2OH)-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH[C(=0)-NH-(CH2)2-0)4-(CH2)2COOH]-CH2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-§§;
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-
(CH2)5-§§;
§-NH-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)- CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§-NH-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)- CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)- CH[(CH2)3-NH-C(=0)-NH2]-NH-C(=0)- CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=0)- CH(CH3)-NH-C(=0)- CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-NH-CH(CH3)-C(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)- CH(CH3)-NH-C(=0)- CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-NH-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH[(CH2)3-NH-C(=0)-NH2]-NH- C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-NH C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
§-NH ^ Q C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH C(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH[(CH2)3-NH-C(=0)-NH2]- NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-NH ' QA C(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH[(CH2)3-NH-C(=0)-NH2]-NH- C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH ^ o C(=0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)- CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ; BHC 15 1 040-A - 565 -
§-NH-(CH2)2-C(=0)-NH-CH(isoC3H7)-C(=0)-NH-CH[(CH2)3-NH-C(=0)-NH2]-C(=0)-0
/ ^ v C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)2-C(=0)-NH-CH(isoC3H7)-C(=0)-NH-CH(CH3)-C(=0)-0 / C(=0)- CH2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH
Figure imgf000566_0001
-C(=0) §§;
-NH-(CH2)2-C(=0)-NH-CH(CH3)-C(=0)-NH-CH[(CH2)3-NH-C(=0)-NH2]-C(=0)-NH
Figure imgf000566_0002
§-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
§-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-§ § ;
§-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-
§
§
Figure imgf000566_0003
NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2- NH-C(=0)-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-(CH2)5-C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)2-§ § ;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)5-§ § ;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH5-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(NH2)-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§; BHC 15 1 040-A - 566 -
§-CH2 ■S-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)4 -(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§-CH2 ■S-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-CH2 ■S-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ;
§-CH2 -S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)2-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§-CH2 -S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§-CH2 -S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)8-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§ § ;
§-CH2 -S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-§§;
§-CH2 -S-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-§§;
§-CH2 -S-(CH2)2-C(=0)-NH-CH(C2H4COOH)-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2 -S-CH2CH[NH-C(=0)-(CH2)2-COOH]-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2 ■S-CH2CH[NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-CH3]-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2 -S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-CH2-
§§;
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=0)-(CH2)2-COOH]-C(=0)-NH-(CH2)2-S(=0)2-(CH2)2-NH- C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=0)-(CH2)2-COOH]-C(=0)-NH-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)- CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH[C(=0)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)- CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH[C(=0)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C(=0)- (CH2)2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-(CH2)2CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2- NH-C(=0)-CH2-§§
§-CH2-S-CH2CH[C(=0)-NH-((CH2)2-0)4-(CH2)2-COOH]-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2- NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-CH[(CH2)2-COOH]-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2-
NH-C(=0)-(CH2)2-§§,
oder
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH2-S-CH2CH(COOH)- NH-
C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§ § ,
steht, wobei
§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt und BHC 15 1 040-A - 567 -
1S0C3H7 einen isoPropyl-Rest darstellt, sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Figure imgf000568_0001
Figure imgf000568_0002
BHC 15 1 040-A - 568 -
Figure imgf000569_0001
BHC 151040-A -569 -
Figure imgf000570_0001
BHC 151040-A -570 -
Figure imgf000571_0001
Figure imgf000571_0002
BHC 151040-A -571 -
Figure imgf000572_0001
Figure imgf000572_0002
BHC 151040-A -572 -
Figure imgf000573_0001
Figure imgf000573_0002
BHC 15 1 040-A - 573 -
Figure imgf000574_0001
Figure imgf000574_0002
BHC 151040-A -574 -
Figure imgf000575_0001
BHC 15 1 040-A - 575 -
Figure imgf000576_0001
BHC 151040-A -576 -
Figure imgf000577_0001
Figure imgf000577_0002
BHC 151040-A -577 -
Figure imgf000578_0001
BHC 15 1 040-A - 578 -
Figure imgf000579_0001
BHC 151040-A -579 -
Figure imgf000580_0001
Figure imgf000580_0002
BHC 15 1 040-A - 580 -
Figure imgf000581_0001
wobei
AK einen über Cystein verknüpften und
AK2 einen über Lysin verknüpften Antikörper darstellt, welcher an B7H3 bindet und eine chimäre oder humanisierte Variante des Antikörpers TPP-6497 ist und n eine Zahl von 1 bis 20 darstellt. BHC 15 1 040-A - 581 -
22. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti-B7H3- Antikörper ein aglycosylierter Antikörper ist.
23. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti-B 7H3- Antikörper oder das antigenbindende Fragment hiervon an einPolypeptid wie dargestellt durch SEQ ID NO: 52 bindet.
24. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti- B7H3 -Antikörper oder das antigenbindendes Fragment hiervon umfasst: eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 3 und die variable CDR3 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 7 und die variable CDR3 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 8, oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 13 und die variable CDR3 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 18, oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 BHC 15 1 040-A - 582 - und die variable CDR3 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 28, oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 34 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 37 und die variable CDR3 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 38, oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 42, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 43 und die variable CDR3 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 44 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 46, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 47 und die variable CDR3 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 48, oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 56 und die variable CDR3 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4 sowie BHC 15 1 040-A - 583 - eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 58 und die variable CDR3 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 8.
25. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti-B 7H3- Antikörper oder das antigenbindendes Fragment hiervon umfasst: eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:l sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:5 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 11 sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 15 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:21 sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:25 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:31 sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:35, oder
eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:41 sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 45, oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:55 sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:57.
26. Konjugat gemäß einer der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti-B7H3 -Antikörper ein IgG Antikörper ist.
27. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti- B7H3-Antikörper oder das antigenbindende Fragment hiervon umfasst: BHC 15 1 040-A - 584 - eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:9 sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19 sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:20 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:29 sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:30 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:39 sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:40, oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:49 sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:50, oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:59 sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:60, oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:61 sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:60, oder. eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:62 sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:60.
28. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti- B7H3 -Antikörper oder das antigenbindende Fragment hiervon eine humanisierte Variante eines der Antikörper TPP-6497, TPP-6499, TPP-6501, TPP-6502, TPP-6515, TPP-7611, TPP- 8382, TPP-8564, TPP-8567, TPP-8322, TPP-8565, TPP-8568, TPP-8748 und TPP-8750.
ist. BHC 15 1 040-A - 585 -
29. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti- B7H3-Antikörper oder das antigenbindende Fragment hiervon einer der Antikörper TPP- 8382, TPP-8564 und TPP-8567 ist.
30. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti- B7H3-Antikörper oder das antigenbindende Fragment hiervon umfasst: eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:9, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen R30S, S50A, V51I, A58T, L59Y, T97A, R98K sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen P33T, G51 S, S53N, N54Q, S77T, R80Q, S81A, Q90A, S91A, F92W, F92Y, S94D, K97N, K97S, K98G, K105Q, oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen R30S, D31 S, F32Y, Y33A, N35S, I37V, S50A, S50Y, A53G, A53S, K56G, K56S, Y57S, Y57T, P114S, P114Y sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 20, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen G25S, Y26S, V29I, G31S, N33Y, N33T, N35Y, G51R, S53N, N54Q, S77T, R80Q, S81A, Q90A, S91A, Y92W, S94D, K106Q, oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:29, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen G33A, H35S, N101Y, L103Y, L103N, L113T sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:30, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen R31S, I33Y, I33T, N35Y, S52N, Q90A, T91A, G93D, T94D, G95S, W96L, V97S, F98G, K103Q, oder BHC 15 1 040-A - 586 - eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:39, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen T31 S, G33A, H35S, T97A, R98K, L113T sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:40, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen G25S, P33Y, P33T, N35Y, G51R, S53N, K54Q, Q90A, S91A, Y92W, S94D, W99V, G103E, K106E, oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:49, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen G33A, H35S, V40A, T57S, L104Y, L104W, Y107S sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:50, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen T33Y, N35Y, D53N, L56P, L57S, Q90A, S91A, Y92W, S94D, W99V, G103E, K106E.
31 Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 36 in Kombination mit einem inerten, nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff.
32. Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 36 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten.
33 Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 36 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen.
PCT/EP2016/064158 2015-06-23 2016-06-20 Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-b7h3-antikörpern WO2016207104A1 (de)

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