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WO2016143017A1 - 光音響イメージング用ナノ粒子 - Google Patents

光音響イメージング用ナノ粒子 Download PDF

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Publication number
WO2016143017A1
WO2016143017A1 PCT/JP2015/056754 JP2015056754W WO2016143017A1 WO 2016143017 A1 WO2016143017 A1 WO 2016143017A1 JP 2015056754 W JP2015056754 W JP 2015056754W WO 2016143017 A1 WO2016143017 A1 WO 2016143017A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
infrared absorbing
polymer
photoacoustic imaging
nanoparticle
nanoparticles
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/056754
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
英一 小関
功 原
Original Assignee
株式会社島津製作所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社島津製作所 filed Critical 株式会社島津製作所
Priority to PCT/JP2015/056754 priority Critical patent/WO2016143017A1/ja
Priority to TW105102762A priority patent/TW201632456A/zh
Publication of WO2016143017A1 publication Critical patent/WO2016143017A1/ja

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo

Definitions

  • the present invention relates to nanoparticles used for photoacoustic imaging.
  • Patent Document 1 describes that an amphiphilic block polymer having a hydrophilic block chain containing a sarcosine unit and a hydrophobic block chain containing a lactic acid unit is useful as a probe agent for positron tomography or fluorescence imaging. Has been.
  • Biological imaging methods such as positron tomography (PET), fluorescence imaging (FI), nuclear magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound imaging (US) are methods for grasping the situation inside the living body without dissecting the living body. It has attracted attention in recent years.
  • PET positron tomography
  • FI fluorescence imaging
  • MRI nuclear magnetic resonance imaging
  • US ultrasound imaging
  • Photoacoustic imaging which is a kind of biological imaging method, is a method for obtaining an image to be measured by detecting the generation position and intensity of an acoustic wave (generally an ultrasonic wave) generated by the photoacoustic effect.
  • the photoacoustic effect is a phenomenon in which molecules that absorb light energy release heat, and an acoustic wave is generated by volume expansion due to the heat.
  • Photoacoustic imaging is a technique for detecting ultrasonic waves with low spatial resolution as an excitation means and detecting ultrasound with low attenuation in the tissue. It is attracting attention as.
  • a near-infrared (wavelength 700 to 900 nm) nanopulse laser with high biological permeability is used.
  • the target site may be difficult to observe due to near-infrared absorption by hemoglobin or melanin in vivo. Therefore, in order to effectively amplify the acoustic wave from the site to be measured and enable more detailed detection and measurement, a contrast agent having near infrared absorptivity such as gold nanoparticles and single-walled carbon nanotubes is used. Yes. However, since contrast agents made of inorganic materials are toxic, administration to living bodies is limited.
  • organic molecules such as indocyanine green (ICG) are known as contrast agents with low toxicity to living bodies.
  • ICG indocyanine green
  • near-infrared absorbing organic molecules such as ICG have a small molecular size and therefore have low accumulation at the site to be measured. Therefore, it has been proposed that a near infrared absorbing organic molecule such as ICG is encapsulated in a nanoparticle and used as a contrast agent for photoacoustic imaging.
  • Patent Document 2 discloses that particles in which ICG aggregates are encapsulated in liposomes can be used as a contrast agent for photoacoustic imaging.
  • Patent Document 2 discloses that a target site can be specifically labeled by immobilizing a substance (such as an antibody) that specifically binds to a target site such as a tumor on a particle.
  • Patent Document 2 only shows that liposomes encapsulating near-infrared absorbing dyes have a high retention rate in serum, and no examples of application to living bodies are shown. Moreover, the measurement example of photoacoustic imaging is not shown, and it cannot be said that the usefulness is shown.
  • an object of the present invention is to provide nanoparticles for photoacoustic imaging that use organic molecules that are less toxic to the living body and that are excellent in accumulation in the living body.
  • the present invention relates to nanoparticles for photoacoustic imaging used as a contrast agent for photoacoustic imaging.
  • the nanoparticle of the present invention comprises a molecular assembly including an amphiphilic block polymer having a hydrophilic block chain having 20 or more sarcosine units and a hydrophobic block chain having 10 or more lactic acid units.
  • the molecular assembly includes a near-infrared absorbing organic molecule containing a near-infrared absorbing functional group at a concentration of 5 ⁇ mol / g or more.
  • the particle diameter of the molecular assembly is preferably 20 to 200 nm.
  • the near-infrared absorbing organic molecule is a hydrophobic polymer in which a near-infrared absorbing functional group is bonded to a polymer chain containing 10 or more lactic acid units.
  • the near infrared absorbing functional group is, for example, a functional group represented by the following formula (I).
  • R 1 is an alkyl group which may be substituted
  • R 2 is an alkylene group which may be substituted
  • R 3 and R 3 ′ are a hydrogen atom or a group that is linked to each other to form a cyclic structure.
  • X is hydrogen or halogen.
  • Ring B and ring D are each a nitrogen-containing fused aromatic heterocyclic ring which may be the same or different.
  • a ⁇ is an anion
  • m is 0 or 1.
  • the near-infrared absorbing functional group is a group derived from indocyanine green.
  • the nanoparticle of the present invention is an organic molecule and excellent in biodegradability, it has low toxicity when administered to a living body.
  • the nanoparticle of the present invention has the property of specifically accumulating in vascular lesions and cancerous sites. Therefore, by applying the nanoparticles of the present invention as a contrast agent to a living body and performing photoacoustic imaging using near-infrared excitation light, the position of vascular lesions and cancerous sites can be visualized and accurately determined. Can do.
  • FIG. 1 It is a block diagram of the photoacoustic imaging apparatus used in the Example.
  • A is the absorption spectrum of the nanoparticle (ICG lactosome) of an Example
  • B is the absorption spectrum of ICG.
  • the photoacoustic imaging measurement results, (A) to (D) are the photoacoustic signals with the excitation light of 796 nm, and (E) and (F) are the visualization of the photoacoustic signals with the excitation light of 532 nm. .
  • a nanoparticle consists of a molecular assembly containing an amphiphilic block polymer, and includes a near-infrared absorbing organic molecule in the molecular assembly.
  • an amphiphilic block polymer forms a molecular assembly together with a near infrared absorbing polymer; an amphiphilic block polymer to which a near infrared absorbing group is bonded is a molecule.
  • amphiphilic block polymer In the nanoparticle of the present invention, the cohesive force of the amphiphilic block polymer becomes a driving force to form a molecular assembly. That is, the amphiphilic block polymer is a basic element of the molecular assembly.
  • the amphiphilic block polymer has a hydrophilic block chain and a hydrophobic block chain.
  • Hydrophilic of the hydrophilic block chain means that the hydrophilic block chain is relatively hydrophilic. Specifically, the hydrophilic block chain means hydrophilicity to such an extent that the copolymer molecule as a whole can realize amphiphilicity by forming a block copolymer with the hydrophobic block chain. Similarly, “hydrophobic” of the hydrophobic block chain means that the hydrophobic block chain is relatively hydrophobic with respect to the hydrophilic block chain. Specifically, this means that the hydrophobic block chain forms a block copolymer with the hydrophilic block chain so that the copolymer molecule as a whole can realize amphipathic properties.
  • the hydrophilic block chain is a hydrophilic molecular chain having 20 or more units (sarcosine units) derived from sarcosine (N-methylglycine). Sarcosine is highly water soluble.
  • polysarcosine since polysarcosine has an N-substituted amide, cis-trans isomerization is possible, and since there is little steric hindrance around the ⁇ -carbon, it has high flexibility. Therefore, by using a polysarcosine chain as a structural unit, a hydrophilic block chain having both high hydrophilicity and flexibility is formed.
  • the hydrophilic blocks of the adjacent block polymer are easily aggregated, and the self-aggregation property is enhanced, so that a molecular assembly is easily formed.
  • the upper limit of the number of sarcosine units in the hydrophilic block chain is not particularly limited, but is preferably 500 or less from the viewpoint of stabilizing the structure of the molecular assembly. If the number of sarcosine units is too large, the molecular assembly tends to lack stability.
  • the number of sarcosine units in the hydrophilic block chain is more preferably 30 to 300, and even more preferably 50 to 200.
  • all sarcosine units may be continuous, or the sarcosine units may be discontinuous as long as the properties of the above polysarcosine are not impaired.
  • the hydrophilic block chain has a monomer unit other than sarcosine, the monomer unit other than sarcosine is not particularly limited, and examples thereof include a hydrophilic amino acid or an amino acid derivative.
  • Amino acids include ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids, and ⁇ -amino acids, and are preferably ⁇ -amino acids.
  • hydrophilic ⁇ -amino acids include serine, threonine, lysine, aspartic acid, glutamic acid and the like.
  • the hydrophilic block may have a sugar chain, a polyether or the like.
  • the hydrophilic block preferably has a hydrophilic group such as a hydroxyl group at the terminal (terminal opposite to the linker part with the hydrophobic block).
  • the hydrophilic block chain may be a straight chain or may have a branched structure.
  • each branch chain contains two or more sarcosine units.
  • the hydrophobic block chain has 10 or more lactic acid units (in this specification, this hydrophobic block chain having a lactic acid unit as a basic unit may be simply referred to as polylactic acid).
  • Polylactic acid has excellent biocompatibility and stability. Therefore, a molecular assembly obtained from an amphiphilic polymer having polylactic acid as a building block is useful in applications to living bodies, particularly the human body.
  • polylactic acid since polylactic acid has excellent biodegradability, it is rapidly metabolized and has low accumulation in tissues other than the lesion site in vivo. Therefore, a molecular assembly obtained from an amphiphilic substance having polylactic acid as a building block is very useful in terms of specific accumulation in vascular lesions.
  • polylactic acid has high solubility in a low-boiling solvent
  • a low-boiling organic solvent can be used for the solution for producing the molecular assembly. Therefore, the remaining amount of the solvent used for the production of the molecular assembly can be easily reduced, and the safety to the living body is excellent, and the production efficiency of the molecular assembly is increased.
  • the hydrophobic block chain has 10 or more lactic acid units, a hydrophobic core is easily formed and the self-aggregation property is enhanced, so that a molecular assembly is easily formed.
  • the upper limit of the number of lactic acid units in the hydrophobic block chain is not particularly limited, but is preferably 100 or less from the viewpoint of stabilizing the structure of the molecular assembly.
  • the number of lactic acid units in the hydrophobic block is more preferably 20 to 80, and further preferably 30 to 50.
  • Adjustment of the chain length of polylactic acid is also preferable in that it contributes as a factor in shape control and size control of a molecular assembly obtained from an amphiphilic substance having polylactic acid as a building block.
  • all of the lactic acid units may be continuous or discontinuous.
  • the lactic acid unit constituting the hydrophobic block chain may be L-lactic acid or D-lactic acid. Further, L-lactic acid and D-lactic acid may be mixed. In the hydrophobic block chain, all lactic acid units may be continuous, or the lactic acid units may be discontinuous.
  • the monomer unit other than lactic acid contained in the hydrophobic block chain is not particularly limited, for example, hydroxy acid such as glycolic acid, hydroxyisobutyric acid, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, tyrosine, tryptophan,
  • hydroxy acid such as glycolic acid, hydroxyisobutyric acid, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, tyrosine, tryptophan
  • hydrophobic amino acids or amino acid derivatives such as glutamic acid methyl ester, glutamic acid benzyl ester, aspartic acid methyl ester, aspartic acid ethyl ester, and aspartic acid benzyl ester.
  • the hydrophobic block chain may be linear or may have a branched structure.
  • a compact hydrophobic core tends to be formed at the time of molecular assembly formation, and the density of the hydrophilic block chain tends to increase. Therefore, in order to form a core / shell type molecular assembly having a small particle size and high structural stability, the hydrophobic block chain is preferably linear.
  • the amphiphilic polymer is obtained by bonding a hydrophilic block chain and a hydrophobic block chain.
  • the hydrophilic block chain and the hydrophobic block chain may be bonded via a linker.
  • the linker includes a lactic acid monomer (lactic acid or lactide), which is a structural unit of a hydrophobic block chain, or a functional group (for example, a hydroxyl group, an amino group, etc.) capable of binding to a polylactic acid chain and a sarcosine, which is a structural unit of a hydrophilic block.
  • a monomer for example, sarcosine or N-carboxysarcosine anhydride
  • a functional group for example, an amino group
  • the method for synthesizing the amphiphilic block polymer is not particularly limited, and a known peptide synthesis method, polyester synthesis method, depsipeptide synthesis method, or the like can be used. Specifically, an amphiphilic block polymer can be synthesized with reference to WO 2009/148121 (Patent Document 1).
  • Near-infrared absorbing organic molecules contain functional groups that absorb near-infrared (wavelength 700-1300 nm). The substituent of the compound having a hydrogen bond has absorption in the near infrared region, but the absorption is relatively small, and the near infrared ray is likely to pass through living tissue. Therefore, if a contrast agent containing a near-infrared absorbing organic molecule that absorbs near-infrared rays and releases thermal energy is administered to a living body and photoacoustic imaging is performed, information on a site where the contrast agent is integrated can be obtained accurately. It becomes possible. That is, the inclusion of near-infrared absorbing organic molecules in the nanoparticles enables photoacoustic imaging of a living body using near-infrared excitation light.
  • Examples of the near-infrared absorbing organic molecule include those having a form in which a near-infrared absorbing group is bonded to a polymer (near-infrared absorbing polymer) and the near-infrared absorbing organic molecule itself (near-infrared absorbing agent).
  • the near-infrared absorbing polymer is a polymer in which a near-infrared absorbing group is bonded to a polymer chain.
  • a near-infrared absorbing group bonded to the above-mentioned amphiphilic polymer may be used as a near-infrared absorbing polymer, or a near-infrared absorbing group bonded to a polymer capable of forming a molecular assembly together with the amphiphilic polymer. Further, it may be used as a near infrared absorbing polymer.
  • near-infrared absorbing group those constituting a long conjugated ⁇ -electron system by combining a plurality of aromatic rings through a conjugated system are used.
  • Specific examples include functional groups derived from dyes such as cyanine dyes, phthalocyanine dyes, naphthoquinone dyes, diimmonium dyes, and azo dyes.
  • cyanine is preferable because it has a high near-infrared extinction coefficient and can easily increase the photoacoustic signal intensity.
  • An example of a group derived from a cyanine dye is represented by the following general formula (I).
  • R 1 is an alkyl group which may be substituted
  • R 2 is an alkylene group which may be substituted
  • R 3 and R 3 ′ are a hydrogen atom or a group that is linked to each other to form a cyclic structure.
  • X is hydrogen or halogen.
  • Ring B and ring D are each a nitrogen-containing fused aromatic heterocyclic ring which may be the same or different.
  • a ⁇ is an anion, and m is 0 or 1.
  • Ring B and ring D are nitrogen-containing fused aromatic heterocycles which may be the same or different.
  • R 1 (alkyl group) and R 2 (alkylene group) have 1 to 20 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms.
  • the substituent may be anionic.
  • the substituent include a carboxyl group, a carboxylate group, a metal carboxylate group, a sulfonyl group, a sulfonate group, a metal sulfonate group, and a hydroxyl group.
  • the metal may be an alkali metal or an alkaline earth metal.
  • the halogen can be Cl, Br and I.
  • R 1 and R 2 are an anionic group and takes a betaine structure as a whole molecule.
  • a ⁇ can be a halogen ion such as Cl ⁇ , Br ⁇ and I ⁇ , CIO 4 ⁇ , BF 4 ⁇ , PF 6 ⁇ , SbF 6 ⁇ , SCN ⁇ and the like.
  • Ring A and Ring B may each independently be a nitrogen-containing bicyclic or tricyclic aromatic heterocycle.
  • ring B and ring D are the same.
  • ring B the following structures are exemplified.
  • the following structures are exemplified.
  • R 4 and R 5 can both be hydrogen.
  • R 4 and R 5 may be linked to each other to form an aryl ring.
  • the aryl ring may be a benzene ring that may be substituted.
  • a preferred near infrared absorbing group is a group derived from an indocyanine compound represented by the following structural formula (II).
  • preferred near-infrared absorbing groups include ICG group (formula III below), IC7-1 group (formula formula IV below) and IR820 group, wherein both ring B and ring D are nitrogen-containing tricyclic aromatic heterocycles (Formula V); IR783 group (Formula VI below) and IR806 group (Formula VII below) in which both ring B and ring D are nitrogen-containing bicyclic aromatic heterocycles; and ring B is a nitrogen-containing tricycle And an IC7-2 group (formula VIII below) wherein the ring C is a nitrogen-containing bicyclic aromatic heterocycle.
  • the structure of the polymer chain portion of the near infrared absorbing polymer is not particularly limited.
  • the polymer chain is preferably hydrophobic. If the near-infrared absorbing polymer is hydrophobic, it is easy to aggregate in the hydrophobic core of the molecular assembly, and nanoparticles with high photoacoustic signal intensity due to near-infrared excitation light can be obtained.
  • the hydrophobic polymer chain preferably has a plurality of lactic acid units.
  • the main component may be a lactic acid unit (ie, a polylactic acid chain), or may have a hydrophilic block in addition to the hydrophobic block of a plurality of lactic acid units (ie, an amphiphilic block polymer chain).
  • the hydrophobic polymer chain of the near-infrared absorbing polymer preferably has 5 or more lactic acid units.
  • the number of lactic acid units in the hydrophobic polymer chain is more preferably 5 to 50, and further preferably 15 to 35. All lactic acid units may be continuous or discontinuous.
  • the structural unit and chain length of the hydrophobic polymer chain of the near-infrared absorbing polymer are basically the hydrophobic block in the above-mentioned amphiphilic block polymer. It can be determined from the same viewpoint as the molecular design of the chain. In this way, since the affinity between the near-infrared absorbing polymer and the hydrophobic block chain of the amphiphilic block polymer is high, it is easy to obtain a molecular assembly including the near-infrared absorbing polymer in the hydrophobic core portion.
  • the polymer chain of the near infrared absorbing polymer does not exceed the length of the amphiphilic block polymer.
  • the polymer chain of the near infrared absorbing polymer preferably does not exceed twice the length of the hydrophobic block in the amphiphilic block polymer.
  • the near infrared absorbing group is preferably bonded to the terminal structural unit of the polymer chain.
  • n is an integer, preferably 5-50.
  • a near-infrared absorber can form a part of a molecular assembly by being encapsulated in the molecular assembly having the above-mentioned amphiphilic block polymer as a basic element.
  • the near infrared absorber include cyanine dyes, phthalocyanine dyes, naphthoquinone dyes, diimmonium dyes, azo dyes, and the like. Among these, cyanine is preferable because it has a high near-infrared extinction coefficient and can easily increase the photoacoustic signal intensity.
  • An example of a cyanine dye is represented by the following general formula (I ′).
  • R 2 ′ is obtained by adding a hydrogen atom, an alkyl group, or other substituents to R 2 in the above formula (I).
  • the formula (I ') is, R 2 is R 2' except that replaced, the same as in the above formula (I).
  • the near-infrared absorber represented by the above formula (I ′) include ICG (formula III ′ below), IC7-1, wherein both ring B and ring D are nitrogen-containing tricyclic aromatic heterocycles (Formula IV 'below) and IR820 (Formula V' below); IR783 (Formula VI 'below) and IR806 (Formula VII' below) where both ring B and ring D are nitrogen-containing bicyclic aromatic heterocycles; And IC7-2 (formula VIII ′ below), wherein ring B is a nitrogen-containing tricyclic aromatic heterocycle and ring C is a nitrogen-containing bicyclic aromatic heterocycle.
  • the nanoparticle of the present invention comprises a molecular assembly of the amphiphilic polymer formed so as to include the above-mentioned near-infrared absorbing organic molecule.
  • the nanoparticle containing a near-infrared absorption organic molecule is obtained by forming the molecular assembly of an amphiphilic block polymer.
  • the method for producing the nanoparticles is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the size and characteristics of the nanoparticles, the type, properties, content, etc. of the near-infrared absorbing organic molecules to be supported. The formation of nanoparticles can be confirmed by observation with an electron microscope.
  • a film obtained by drying a solution containing an amphiphilic polymer and a near-infrared absorbing organic molecule is brought into contact with an aqueous liquid, and the nanoparticles are dispersed in the aqueous liquid.
  • a method for obtaining a dispersion film method
  • a method for obtaining a dispersion by bringing the solution into contact with an aqueous liquid injection method.
  • a solution containing a component of a molecular assembly such as an amphiphilic block polymer or a near infrared absorbing organic molecule and a solvent is used.
  • the solvent is not particularly limited as long as it can dissolve the components of the molecular assembly.
  • a low boiling point solvent is preferably used.
  • the low boiling point solvent means a solvent having a boiling point at 1 atm of 100 ° C. or lower, preferably 90 ° C. or lower.
  • the solution used for forming the nanoparticles may contain components other than the amphiphilic block polymer, the near-infrared absorbing organic molecule, and the solvent.
  • a polymer other than the amphiphilic block polymer or near-infrared absorbing polymer may be included as a component of the molecular assembly.
  • the polymer other than the amphiphilic block polymer and the near infrared absorbing polymer include hydrophobic polymers.
  • hydrophobic polymer a polymer equivalent to the polymer chain of the near-infrared absorbing polymer (not including a near-infrared absorbing group) can be used.
  • hydrophobic polymers other than near-infrared absorbing polymers ie, hydrophobic polymers that do not contain near-infrared absorbing groups. Or it is preferable to reduce the amount used.
  • the amount of the hydrophobic polymer containing no near infrared absorbing group is preferably 30 parts by mole or less, more preferably 20 parts by mole or less, and more preferably 10 parts by mole or less with respect to 100 parts by mole of the near infrared absorbing polymer. Further preferred.
  • the film method is a method used for preparing liposomes. Since the above-mentioned amphiphilic block polymer has a hydrophobic block chain having a lactic acid unit and is soluble in a low-boiling solvent, nanoparticles can be prepared using this method.
  • a step of preparing the above solution in a container such as a glass container; a step of removing an organic solvent from the solution and obtaining a film containing a polymer and a near infrared absorbing organic molecule on the inner wall of the container; and in the container Adding a water-based liquid to the film, and converting the film-like substance into a molecular assembly containing near-infrared absorbing organic molecules to obtain a dispersion of nanoparticles.
  • a film containing a polymer constituting the molecular assembly and near-infrared absorbing organic molecules is formed on the inner wall of the container.
  • the method for removing the solvent is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the boiling point of the solvent to be used.
  • the solvent may be removed under reduced pressure, or the solvent may be removed by natural drying.
  • a molecular assembly is formed in the process in which an aqueous liquid is added to the container to which this film is attached and the film is peeled off from the inner wall of the container.
  • the aqueous liquid is water or an aqueous solution, and may be any one that is biochemically and pharmaceutically acceptable, and examples thereof include distilled water for injection, physiological saline, and buffer solution.
  • a heating treatment or an ultrasonic treatment may be performed after the aqueous liquid is added to the container.
  • the heating treatment can be performed, for example, under conditions of 70 to 100 ° C. and 5 to 60 minutes.
  • a film may be formed on a substrate such as a film or a glass plate, and nanoparticles may be formed by contacting the film on the substrate with an aqueous liquid. It can.
  • the contact between the film on the substrate and the aqueous liquid can be performed, for example, by immersing the substrate on which the film is formed in the aqueous liquid.
  • the injection method is a method used for the preparation of many other nanoparticles.
  • nanoparticles are prepared by dispersing the above solution in an aqueous liquid and performing purification treatment such as gel filtration chromatography, filtering, ultracentrifugation, etc., and then removing the organic solvent. Can do.
  • purification treatment such as gel filtration chromatography, filtering, ultracentrifugation, etc.
  • the nanoparticle dispersion obtained by the film method or the injection method can be directly administered to a living body as a contrast agent for photoacoustic imaging. Further, the obtained dispersion liquid may be freeze-dried. As a freeze-drying treatment method, a known method can be adopted. For example, the nanoparticle dispersion liquid is frozen with liquid nitrogen or the like and sublimated under reduced pressure to obtain a freeze-dried nanoparticle product. This makes it possible to store the nanoparticles as a lyophilized product. If necessary, nanoparticles can be used for use by adding an aqueous liquid to the lyophilized product to obtain a dispersion of nanoparticles.
  • the dispersion before the lyophilization treatment there may be a case where a polymer or a near infrared absorbing organic molecule that has not contributed to the formation of nanoparticles remains as such.
  • a dispersion is subjected to a freeze-drying process, it is possible to form nanoparticles further from the polymer and the near-infrared absorbing organic molecules that remain without forming nanoparticles during the process of solvent concentration. become. Therefore, it is possible to efficiently prepare the nanoparticles of the present invention.
  • concentration of the near-infrared absorption organic molecule in the nanoparticle for photoacoustic imaging is 5 micromol / g or more.
  • concentration of the near-infrared absorbing organic molecules By increasing the concentration of the near-infrared absorbing organic molecules, the intensity of the photoacoustic signal when nanoparticles are administered to a living body can be increased.
  • concentration of the near-infrared absorbing organic molecule is less than 5 ⁇ mol / g, it is difficult to obtain a photoacoustic signal to the extent that living body imaging can be performed even if the dose of nanoparticles to the living body is increased.
  • the concentration of the near-infrared absorbing organic molecule in the nanoparticles is preferably 10 ⁇ mol / g or more, more preferably 15 ⁇ mol / g or more, and further preferably 20 ⁇ mol / g or more.
  • the upper limit of the concentration of the near-infrared absorbing organic molecules in the nanoparticles is not particularly limited, and the photoacoustic signal intensity tends to increase as the concentration increases. However, if the concentration of the near-infrared absorbing organic molecule is too high, the structure of the molecular assembly tends to become unstable.
  • the concentration of the near-infrared absorbing organic molecule in the nanoparticles is preferably 100 ⁇ mol / g or less, more preferably 70 ⁇ mol / g or less, and further preferably 50 ⁇ mol / g or less.
  • Near-infrared absorbing groups such as ICG are also fluorescent dyes and emit fluorescence when irradiated with near-infrared rays, and are therefore used as fluorescent contrast agents.
  • fluorescence imaging when the concentration of the fluorescent dye increases, the signal decreases due to concentration quenching.
  • concentration of the fluorescent dye molecules is in close proximity. Quenching easily occurs. For example, when ICG is encapsulated in a nanoparticle of a molecular assembly, when the concentration is 5 ⁇ mol / g or more, fluorescence from ICG is hardly observed.
  • the concentration of the near-infrared absorbing organic molecules in the nanoparticles can be increased by adjusting the use ratio of the amphiphilic polymer and the near-infrared absorbing organic molecules.
  • the amount of the near-infrared absorbing polymer is 5 with respect to 100 mol parts of the amphiphilic polymer. ⁇ 200 mol parts are preferable, 10 to 100 mol parts are more preferable, and 15 to 70 mol parts are more preferable.
  • the size of the nanoparticle for photoacoustic imaging of the present invention is preferably 20 to 200 nm.
  • “Particle size” refers to the particle size that appears most frequently in the particle distribution, that is, the center particle size.
  • the size of the nanoparticles can be measured by an observation method using a transmission electron microscope (TEM) or a dynamic light scattering (DLS) method.
  • the method for controlling the size of the nanoparticles includes a method for adjusting the chain length of the amphiphilic block polymer and the hydrophobic polymer, and a method for adjusting the blending amount of the hydrophobic polymer. As the blending amount of the hydrophobic polymer increases, the volume of the hydrophobic core of the molecular assembly increases, so that the nanoparticles tend to increase.
  • the nanoparticle for photoacoustic imaging of the present invention is a molecular assembly (so-called lactosome) having an amphiphilic block polymer having a hydrophilic block chain having a sarcosine unit and a hydrophobic block chain having a lactic acid unit as basic elements.
  • lactosome has a feature that it has a high blood retention and a remarkably low accumulation amount in the liver as compared with other molecular assemblies.
  • pigments such as near-infrared absorbers can be used for photoacoustic imaging.
  • pigments such as indocyanine green have high accumulation in the liver, and lesions such as blood vessels are present at the lesion site. It was difficult to accumulate at the site.
  • the nanoparticle of the present invention if used, the property that the nanoparticles staying in the blood easily accumulate in a vascular lesion site such as a tumor site, an inflammatory site, an arteriosclerosis site, or an angiogenesis site ( By utilizing the EPR (enhanced “permeability” and “retention” effect), photoacoustic imaging targeting a cancerous part or the like becomes possible.
  • the living body to which the nanoparticles are administered is not particularly limited, and may be a human or non-human animal.
  • Non-human animals include mammals other than humans, more specifically primates, rodents (mouse, rat, etc.), rabbits, dogs, cats, pigs, cows, sheep, horses and the like.
  • the method of administration into the living body is not particularly limited, and any of systemic administration and local administration may be used. That is, administration of nanoparticles can be performed by any of injection, internal use, and external use.
  • the concentration of nanoparticles in the administration liquid is about 0.5 to 100 mg / mL, preferably 0.8 to 50 mg / mL, more preferably 1 to 20 mg / mL.
  • the time from administration of the nanoparticle to the start of detection can be appropriately determined according to the type of near-infrared absorbing organic molecule that the nanoparticle has, the type of administration target, and the like. For example, it can be 3 to 48 hours after administration, or 1 to 24 hours. Below the above range, if the nanoparticles are not sufficiently retained in the target, such as a cancerous site, or if the signal is too strong to clearly separate the administration target from other sites (background) There is. When the above range is exceeded, nanoparticles may be excreted from the administration target.
  • Photoacoustic imaging device Photoacoustic imaging uses a phenomenon (photoacoustic effect) in which a molecule that absorbs light energy releases heat and an acoustic wave is generated by volume expansion due to the heat.
  • an appropriate apparatus can be used according to the imaging region or the like.
  • the photoacoustic imaging apparatus includes a photoexcitation unit, an acoustic wave detection unit, and an imaging unit.
  • the photoexcitation unit irradiates near-infrared rays to excite near-infrared absorbing organic molecules contained in nanoparticles administered to the living body.
  • a near-infrared coherent light source is preferable, and among them, an OPD laser is preferably used.
  • the OPD laser is a coherent light source based on optical parametric oscillation (Optical Parametric Oscillation; OPD), and has been put into practical use as a light source having a continuously variable wavelength in a wide wavelength range from the visible range to the infrared range.
  • the acoustic wave detection unit detects an acoustic wave (specifically, an ultrasonic wave) generated by volume expansion due to heat released from the molecules excited by the irradiation light from the photoexcitation unit.
  • an acoustic sensor capable of detecting ultrasonic waves can be used.
  • the imaging unit only needs to be able to visualize the position and size of the tissue where the nanoparticles are present based on the position of the acoustic wave detection unit and the waveform of the detected acoustic wave. From the obtained photoacoustic image, it is possible to know the staying state of the nanoparticles in the living body, and based on this, it is possible to diagnose the presence / absence or position of a vascular lesion.
  • Nanoparticles of a molecular assembly composed of a near-infrared absorbing polymer (ICG-PLLA 30 ) and an amphiphilic block polymer (PSar 70 -PLLA 30 ) were prepared as follows.
  • glycolic acid 72 mg, 0.95 mmol
  • O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphoric acid Salt HATU
  • DIEA N, N-diisopropylethylamine
  • ICG lactosome The content of ICG-modified poly L-lactic acid in the nanoparticles was 27 ⁇ mol / g.
  • FIG. 2B shows an absorption spectrum of indocyanine green (concentration: 2 ⁇ M).
  • ICG lactosome had a smaller absorption peak width than that of ICG alone, and the molar extinction coefficient increased by about 10%.
  • the photoacoustic signal is proportional to the extinction coefficient. Therefore, it can be seen that by using the nanoparticles of the present invention, optical imaging with high signal intensity is possible compared to the case where the dye is used alone. The reason for the change in the maximum of the near-infrared absorption peak and the shape is not clear. However, in the nanoparticle of the present invention, since a plurality of ICG groups are closely fixed to the rigid body in one molecular assembly, the ICG It is considered that intermolecular interaction between groups occurs and the conjugated ⁇ -electron system is perturbed.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of the photoacoustic imaging measurement system used in this embodiment.
  • the photoacoustic excitation light source 1 a 30 Hz optical parametric oscillator (pulse width 6 nanoseconds) was used.
  • the excitation light source was adjusted to 796 nm corresponding to the absorption peak of ICG-lactosome.
  • the output light pulse is divided into four beams by the beam splitter 5, and each beam is guided to the optical fiber 11 through the lens 7.
  • the energy of the irradiation pulse light from each optical fiber was adjusted to less than 20 ⁇ J, and the intensity on the tissue surface was about 13 mJ / cm 2 .
  • the tips of the four optical fibers 11 are attached to the photoacoustic sensor head 15.
  • the imaging probe of the photoacoustic sensor head 15 has four excitation optical fibers 11 arranged obliquely and a 50 MHz ultrasonic sensor for acoustic wave detection provided with an acoustic lens. This probe has a depth resolution of 39 ⁇ m and an XY plane resolution of 56 ⁇ m.
  • the photoacoustic sensor head 15 is connected to the movable stage 13 and its position is controlled by the computer 50. In this example, a 4 mm square area was scanned in 150 ⁇ m steps. Photoacoustic waves (ultrasonic waves) induced by the optical pulses of the four excitation optical fibers 11 are amplified by the field effect transistor amplifier 25. The phototube 23 detects laser oscillation from the photoacoustic excitation light source 1, and using this as a trigger, the acoustic wave amplified by the amplifier 25 is detected and recorded by the digital oscilloscope 21 and averaged.
  • the time waveform of the photoacoustic wave is converted into a depth profile based on the speed of sound in the tissue (1540 m / sec), and reconstructed into a three-dimensional photoacoustic image by visualization software (Kitware VolView 3.4).
  • Photodynamic therapy was performed 18 hours after administration using a 808 nm fiber coupled CW laser diode. Laser irradiation was performed for 10 minutes (360 J / cm 2 ) at a spot size of 10 mm and a power density of 600 mW / cm 2 so as to cover the entire tumor region. A photoacoustic imaging image measured after PDT is shown in FIG.
  • Photoacoustic imaging of blood vessels Photoacoustic imaging measurements of blood vessels were performed before administration of ICG lactosomes and after PDT.
  • a 100 Hz optical parametric oscillator pulse width 9 nanoseconds
  • the excitation wavelength is adjusted to 532 nm, which is the isosbestic point of oxygenated hemoglobin (HbO 2 ) and deoxygenated hemoglobin (HHb). did.
  • Photoacoustic imaging images before administration and after PDT are shown in FIGS. 3 (E) and 3 (F).
  • the nanoparticle of the present invention was specifically accumulated in the blood vessel at the lesion site, and the concentration was rapidly decreased by PDT, which could be observed by photoacoustic imaging using near infrared rays. Yes. From these results, it can be seen that the nanoparticles of the present invention are useful for diagnosis of vascular lesions.

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Abstract

　本発明のナノ粒子は、両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体からなる。両親媒性ポリマーは、２０個以上のサルコシン単位を有親水性ブロック鎖と１０個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖を有する。分子集合体は、近赤外線吸収官能基を含む近赤外線吸収有機分子を含有し、その濃度が５μｍｏｌ／ｇ以上である。近赤外線吸収有機分子は、１０個以上の乳酸単位を含むポリマー鎖に前記近赤外線吸収官能基が結合した疎水性ポリマーであることが好ましい。本発明のナノ粒子は、光音響イメージングのコントラスト剤として用いられる。

Description

光音響イメージング用ナノ粒子
　本発明は、光音響イメージングに用いられるナノ粒子に関する。
　近年、ナノテクノロジーへの関心が高まっており、ナノサイズ物質特有の性質を活かした新規機能性材料が開発されている。特許文献１には、サルコシン単位を含む親水性ブロック鎖と乳酸単位を含む疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーが、ポジトロン断層法や蛍光イメージング用のプローブ剤として有用であることが記載されている。
　ポジトロン断層法（PET）、蛍光イメージング（FI）、核磁気共鳴イメージング（MRI）、超音波イメージング（US）等の生体イメージング法は、生体を解剖することなく生体内の状況を把握する方法として、近年注目されている。
　生体イメージング法の一種である光音響イメージング（PAI）は、光音響効果により生じた音響波（一般には超音波）の発生位置および強度を検出して、測定対象の画像を得る方法である。光音響効果とは、光エネルギーを吸収した分子が熱を放出し、その熱による体積膨張で音響波が発生する現象である。光音響イメージングは、励起手段として空間分解能の高いレーザ光を使用可能であり、組織内での減衰が小さい超音波を検出する手法であるため、空間分解能および深達度の両者に優れる生体イメージング手法として注目されている。光音響イメージングでは、一般に、生体透過性の高い近赤外線（波長７００～９００ｎｍ）のナノパルスレーザが用いられる。
　光音響イメージングでは、生体内のヘモグロビンやメラニンによる近赤外線吸収に起因して、目的部位が観察しづらい場合がある。そのため、測定対象部位からの音響波を有効に増幅してより詳細な検出や測定を可能とするために、金ナノ粒子や単層カーボンナノチューブ等の近赤外線吸収性を有するコントラスト剤が用いられている。しかし、無機材料からなるコントラスト剤は毒性があるため、生体への投与が制限される。
　一方、生体への毒性が小さいコントラスト剤として、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）等の有機分子が知られている。しかし、ＩＣＧ等の近赤外線吸収有機分子は、分子サイズが小さいため、測定対象部位への集積性が低い。そこで、ＩＣＧ等の近赤外線吸収有機分子を、ナノ粒子内に内包させて、光音響イメージングのコントラスト剤として用いることが提案されている。
　例えば、特許文献２では、リポソームにＩＣＧの会合体を内包させた粒子が、光音響イメージングのコントラスト剤として使用可能であることが開示されている。また、特許文献２では、腫瘍等の標的部位に特異的に結合する物質（抗体等）を粒子に固定化することにより、標的部位を特異的に標識できることが開示されている。
ＷＯ２００９／１４８１２１号パンフレット ＷＯ２０１３／１２５２３７号パンフレット
　しかし、上記特許文献２では、近赤外線吸収色素を内包するリポソームが血清中での保持率が高いことが示されているのみであり、生体への適用例は示されていない。また、光音響イメージングの測定例も示されておらず、その有用性が示されているとは言い難い。
　上記に鑑み、本発明は、生体への毒性が少ない有機分子を用い、かつ生体内への集積性に優れる、光音響イメージング用ナノ粒子の提供を目的とする。
　本発明者らが検討の結果、赤外線吸収有機分子を含む両親媒性ポリマーの分子集合体のナノ粒子が、上記目的を達成し得ることを見出し本発明に至った。本発明は、光音響イメージングのコントラスト剤として用いられる光音響イメージング用ナノ粒子に関する。
　本発明のナノ粒子は、２０個以上のサルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と１０個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖を有する両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体からなる。分子集合体は、近赤外線吸収官能基を含む近赤外線吸収有機分子を５μｍｏｌ／ｇ以上の濃度で含む。分子集合体の粒子径は、２０～２００ｎｍであることが好ましい。
　好ましい形態において、近赤外線吸収有機分子は、１０個以上の乳酸単位を含むポリマー鎖に近赤外線吸収官能基が結合した疎水性ポリマーである。
　近赤外線吸収官能基は、例えば、下記式（Ｉ）で表される官能基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　上記式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアルキル基であり、Ｒ２は、置換されていてもよいアルキレン基である。Ｒ３およびＲ３’は、水素原子、または互いに連結して環状構造を形成する基である。Ｘは水素またはハロゲンである。環Ｂおよび環Ｄは、それぞれ同一または異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。Ａ－は陰イオンであり、ｍは０または１である。
　一実施形態において、近赤外線吸収官能基は、インドシアニングリーンに由来する基である。
　本発明のナノ粒子は、有機分子であり生分解性に優れるため、生体に投与した場合の毒性が小さい。また、本発明のナノ粒子は、血管病変や癌疾部位に特異的に集積する特性を有する。そのため、本発明のナノ粒子をコントラスト剤として生体に投与して、近赤外の励起光による光音響イメージングを行うことにより、血管病変や癌疾部位の位置を可視化して、正確に確定することができる。
実施例で用いた光音響イメージング装置の構成図である。 （Ａ）は実施例のナノ粒子（ＩＣＧラクトソーム）の吸収スペクトルであり、（Ｂ）はＩＣＧの吸収スペクトルである。 光音響イメージングの測定結果であり、（Ａ）～（Ｄ）は７９６ｎｍの励起光での光音響信号、（Ｅ）および（Ｆ）は５３２ｎｍの励起光での光音響信号を可視化したものである。
　本発明のナノ粒子は、生体等に投与することにより、光音響イメージングのコントラスト剤として用いられる。ナノ粒子は、両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体からなり、分子集合体中に、近赤外線吸収有機分子を含む。分子集合体中に近赤外線吸収有機分子を含む形態としては、両親媒性ブロックポリマーが、近赤外線吸収ポリマーとともに分子集合体を形成したもの；近赤外線吸収基が結合した両親媒性ブロックポリマーが分子集合体を形成したもの；両親媒性ブロックポリマーの分子集合体内に、近赤外線吸収剤が内包されたもの；および両親媒性ブロックポリマーと疎水性ポリマーとの分子集合体に、近赤外線吸収剤が内包されたものを含む。
［両親媒性ブロックポリマー］
　本発明のナノ粒子では、両親媒性ブロックポリマーの凝集力がドライビングフォースとなって分子集合体を形成する。すなわち、両親媒性ブロックポリマーは、分子集合体の基本的要素である。両親媒性ブロックポリマーは、親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖を有する。
　親水性ブロック鎖が有する「親水性」とは、疎水性ブロック鎖に対して相対的に親水性が強いことを意味する。具体的には、当該親水性ブロック鎖が疎水性ブロック鎖とブロックコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性を意味する。同様に、疎水性ブロック鎖が有する「疎水性」とは、親水性ブロック鎖に対して、相対的に疎水性が強いことを意味する。具体的には、当該疎水性ブロック鎖が、親水性ブロック鎖とブロックコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を意味する。
（親水性ブロック鎖）
　親水性ブロック鎖は、サルコシン（Ｎ－メチルグリシン）に由来する単位（サルコシン単位）を２０個以上有する親水性分子鎖である。サルコシンは、水溶性が高い。また、ポリサルコシンはＮ置換アミドを有することからシス－トランス異性化が可能であり、かつ、α炭素まわりの立体障害が少ないことから、高い柔軟性を有する。そのため、ポリサルコシン鎖を構成単位として用いることにより、高い親水性と柔軟性とを併せ持つ親水性ブロック鎖が形成される。
　親水性ブロック鎖のサルコシン単位が２０個以上であれば、隣接して存在するブロックポリマーの親水性ブロック同士が凝集しやすく、自己凝集性が高められるため、分子集合体が形成されやすくなる。親水性ブロック鎖中のサルコシン単位の数の上限は特に制限されないが、分子集合体の構造を安定化させる観点からは５００個以下が好ましい。サルコシン単位の数が過度に大きいと、分子集合体が安定性を欠く傾向がある。親水性ブロック鎖のサルコシン単位の数は、３０～３００個がより好ましく、５０～２００個がさらに好ましい。
　親水性ブロック鎖は、全てのサルコシン単位が連続していてもよく、上記のポリサルコシンの特性を損なわない限りにおいてサルコシン単位が非連続であってもよい。親水性ブロック鎖がサルコシン以外のモノマー単位を有する場合、サルコシン以外のモノマー単位は特に限定されないが、例えば親水性アミノ酸あるいはアミノ酸誘導体が挙げられる。アミノ酸は、α－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸を含み、好ましくは、α－アミノ酸である。親水性のα－アミノ酸としては、セリン、スレオニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。また、親水性ブロックは、糖鎖やポリエーテル等を有していてもよい。親水性ブロックは、末端（疎水性ブロックとのリンカー部と反対側の末端）に、水酸基等の親水性基を有することが好ましい。
　親水性ブロック鎖は、直鎖状でもよく、分枝構造を有していてもよい。親水性ブロック鎖が分枝構造を有する場合、各分枝鎖に２以上のサルコシン単位が含まれることが好ましい。
（疎水性ブロック鎖）
　疎水性ブロック鎖は、１０個以上の乳酸単位を有する（本明細書においては、乳酸単位を基本単位とするこの疎水性ブロック鎖を、単にポリ乳酸と記載することがある）。ポリ乳酸は、優れた生体適合性および安定性を有する。そのため、ポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性ポリマーから得られる分子集合体は、生体、特に人体への応用において有用である。また、ポリ乳酸は、優れた生分解性を有することから、代謝が早く、生体内において病変部位以外の組織への集積性が低い。そのため、ポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、血管病変への特異的な集積性という点で非常に有用である。また、ポリ乳酸は、低沸点溶媒への溶解性が高いため、分子集合体を製造するための溶液に、低沸点の有機溶媒を使用可能である。そのため、分子集合体の製造に用いられる溶剤の残存量を容易に低減可能であり、生体への安全性に優れるとともに、分子集合体の製造効率が高められる。
　疎水性ブロック鎖が１０個以上の乳酸単位を有していれば、疎水コアが形成されやすく、自己凝集性が高められるため、分子集合体が形成されやすくなる。疎水性ブロック鎖中の乳酸単位の数の上限は特に制限されないが、分子集合体の構造を安定化させる観点からは１００個以下が好ましい。疎水性ブロックにおける乳酸単位の数は、２０～８０個がより好ましく、３０～５０個がさらに好ましい。
　ポリ乳酸の鎖長を調整することは、ポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体の形状制御および大きさ制御の一要因として寄与する点においても好ましい。疎水性ブロック鎖は、乳酸単位のすべてが連続していてもよいし、非連続であってもかまわない。
　疎水性ブロック鎖を構成する乳酸単位は、Ｌ－乳酸でもＤ－乳酸でもよい。また、Ｌ－乳酸とＤ－乳酸が混在していてもよい。疎水性ブロック鎖は、全ての乳酸単位が連続していてもよく、乳酸単位が非連続であってもよい。疎水性ブロック鎖に含まれる乳酸以外のモノマー単位は特に限定されないが、例えば、グリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸等のヒドロキシ酸や、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、グルタミン酸メチルエステル、グルタミン酸ベンジルエステル、アスパラギン酸メチルエステル、アスパラギン酸エチルエステル、アスパラギン酸ベンジルエステル等の疎水性アミノ酸あるいはアミノ酸誘導体が挙げられる。
　疎水性ブロック鎖は、直鎖状でもよく、分枝構造を有していてもよい。疎水性ブロック鎖が分枝していない方が、分子集合体形成時に、コンパクトな疎水コアが形成されやすく、親水性ブロック鎖の稠密度が増大する傾向がある。そのため、粒子径が小さく、構造安定性の高いコア／シェル型分子集合体を形成するためには、疎水性ブロック鎖は直鎖状であることが好ましい。
（両親媒性ブロックポリマーの構造および合成方法）
　両親媒性ポリマーは、親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とを結合させたものである。親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とは、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーとしては、疎水性ブロック鎖の構成単位である乳酸モノマー（乳酸やラクチド）またはポリ乳酸鎖と結合可能な官能基（例えば、水酸基、アミノ基等）と、親水性ブロックの構成単位であるサルコシンモノマー（例えばサルコシンやＮ－カルボキシサルコシン無水物）またはポリサルコシンと結合可能な官能基（例えばアミノ基）とを有するものが好ましく用いられる。リンカーを適宜に選択することにより、親水性ブロック鎖や疎水性ブロック鎖の分枝構造を制御することができる。
　両親媒性ブロックポリマーの合成法は、特に限定されず、公知のペプチド合成法、ポリエステル合成法、デプシペプチド合成法等を用いることができる。詳細には、ＷＯ２００９／１４８１２１号（上記特許文献１）等を参照して、両親媒性ブロックポリマーを合成することができる。
［近赤外線吸収有機分子］
　近赤外線吸収有機分子は、近赤外線（波長７００～１３００ｎｍ）を吸収する官能基を含む。水素結合を有する化合物の置換基は近赤外領域に吸収を有するが、その吸収は比較的小さく、近赤外線は生体組織を透過しやすい。そのため、近赤外線を吸収して熱エネルギーを放出する近赤外線吸収有機分子を含むコントラスト剤を生体に投与して光音響イメージングを行えば、コントラスト剤が集積された部位の情報を正確に得ることが可能となる。すなわち、ナノ粒子中に近赤外線吸収有機分子が含まれることにより、近赤外の励起光を用いた生体の光音響イメージングが可能となる。
　近赤外線吸収有機分子としては、ポリマーに近赤外線吸収基が結合した態様を有するもの（近赤外線吸収ポリマー）および近赤外線吸収有機分子そのもの（近赤外線吸収剤）が挙げられる。
＜近赤外線吸収ポリマー＞
　近赤外線吸収ポリマーは、ポリマー鎖に近赤外線吸収基が結合したものである。上記の両親媒性ポリマーに近赤外線吸収基が結合したものを近赤外線吸収ポリマーとしてもよく、両親媒性ポリマーとともに自己集合により分子集合体を形成可能なポリマーに近赤外線吸収基が結合したものを、近赤外線吸収ポリマーとして用いてもよい。分子集合体の疎水コアに近赤外線吸収有機分子を複数存在させ、光音響信号の強度を高める観点からは、疎水性ポリマーに近赤外線吸収基が結合したものが好ましく用いられる。
（近赤外線吸収基）
　近赤外線吸収基としては、共役系を介して複数の芳香環が結合していることにより、長大な共役π電子系を構成しているものが用いられる。具体的には、シアニン系色素、フタロシアニン系色素、ナフトキノン系色素、ジインモニウム系色素、アゾ系色素等の色素に由来する官能基が挙げられる。中でも、近赤外の吸光係数が高く、光音響信号強度が高められやすいことから、シアニン系が好ましい。シアニン系色素に由来する基の一例は、以下の一般式（I）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記式（Ｉ）中、Ｒ１は、置換されていてもよいアルキル基であり、Ｒ２は、置換されていてもよいアルキレン基である。Ｒ３およびＲ３’は、水素原子、または互いに連結して環状構造を形成する基である。Ｘは水素またはハロゲンである。環Ｂおよび環Ｄは、それぞれ同一または異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。Ａ－は陰イオンであり、ｍは０または１である。環Ｂおよび環Ｄは、同一でも異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。
　Ｒ１（アルキル基）およびＲ２（アルキレン基）は、炭素数が１～２０であり、好ましくは炭素数が２～５である。Ｒ１およびＲ２が置換基を有している場合、当該置換基はアニオン性であってもよい。置換基としては、カルボキシル基、カルボキシレート基、金属カルボキシレート基、スルホニル基、スルホネート基、金属スルホネート基、水酸基等が挙げられる。前記金属は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属でありうる。
　Ｘがハロゲンである場合、ハロゲンは、Ｃｌ、ＢｒおよびＩでありうる。ｍが０の場合、Ｒ１およびＲ２のいずれか一方がアニオン性基であり、分子全体としてベタイン構造をとる。ｍが１の場合、Ａ－は、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－等のハロゲンイオン、ＣＩＯ４ －、ＢＦ４ －、ＰＦ６ －、ＳｂＦ６ －、ＳＣＮ－等でありうる。
　環Ａおよび環Ｂは、それぞれ独立に、含窒素二環式や三環式芳香族複素環でありうる。好ましくは、環Ｂと環Ｄは同一である。環Ｂの好ましい態様としては、以下に示す構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　環Ｄの好ましい態様としては、以下に示す構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　上記式において、Ｒ４およびＲ５は、いずれも水素でありうる。または、Ｒ４およびＲ５は、それらが互いに連結してアリール環を形成していてもよい。前記アリール環は、置換されてよいベンゼン環でありうる。
　好ましい近赤外線吸収基は、下記構造式（II）で示される、インドシアニン化合物由来の基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　好ましい近赤外線吸収基の具体例としては、環Ｂおよび環Ｄがいずれも含窒素三環式芳香族複素環であるＩＣＧ基（下記式III）、ＩＣ７－１基（下記式IV）およびＩＲ８２０基（下記式V）；環Ｂおよび環Ｄがいずれも含窒素二環式芳香族複素環であるＩＲ７８３基（下記式VI）およびＩＲ８０６基（下記式VII）；ならびに、環Ｂが含窒素三環式芳香族複素環、環Ｃが含窒素二環式芳香族複素環であるＩＣ７－２基（下記式VIII）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（ポリマー鎖）
　近赤外線吸収ポリマーのポリマー鎖部分の構造は特に限定されない。ポリマー鎖は、好ましくは疎水性である。近赤外線吸収ポリマーが疎水性であれば、分子集合体の疎水コアに凝集しやすく、近赤外の励起光による光音響信号強度の高いナノ粒子が得られる。
　疎水性ポリマー鎖は、好ましくは、複数の乳酸単位を有する。例えば、乳酸単位を主たる構成成分とするもの（すなわちポリ乳酸鎖）でもよく、複数の乳酸単位の疎水性ブロックに加えて親水性ブロックを有するもの（すなわち両親媒性ブロックポリマー鎖）でもよい。近赤外線吸収ポリマーの疎水性ポリマー鎖は、好ましくは５個以上の乳酸単位を有する。疎水性ポリマー鎖の乳酸単位の数は、５～５０がより好ましく、１５～３５がさらに好ましい。乳酸単位はすべてが連続していてもよいし、非連続でもよい。
　分子集合体が、両親媒性ポリマーと近赤外線吸収ポリマーを含む場合、近赤外線吸収ポリマーの疎水性ポリマー鎖の構成単位や鎖長は、基本的に、上記の両親媒性ブロックポリマーにおける疎水性ブロック鎖の分子設計と同様の観点で決定することができる。このようにすれば、近赤外線吸収ポリマーと両親媒性ブロックポリマーの疎水性ブロック鎖との親和性が高いため、疎水コア部分に近赤外線吸収ポリマーを含む分子集合体が得られ易くなる。
　近赤外線吸収ポリマーのポリマー鎖は、両親媒性ブロックポリマーの長さを超えないことが好ましい。また、近赤外線吸収ポリマーのポリマー鎖は、両親媒性ブロックポリマーにおける疎水性ブロックの２倍の長さを超えないことが好ましい。上記の近赤外線吸収基は、ポリマー鎖の末端構成単位に結合していることが好ましい。
　疎水性ポリマー鎖に近赤外線吸収基としてインドシアニングリーンに由来するＩＣＧ基が結合した近赤外線吸収ポリマーの具体例としては、下記式のポリマーが挙げられる。下記式において、ｎは整数であり、好ましくは５～５０である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
＜近赤外線吸収剤＞
　近赤外線吸収剤は、上記の両親媒性ブロックポリマーを基本的要素とする分子集合体に内包されることにより、分子集合体の一部を形成し得る。近赤外線吸収剤としては、シアニン系色素、フタロシアニン系色素、ナフトキノン系色素、ジインモニウム系色素、アゾ系色素等が挙げられる。中でも、近赤外の吸光係数が高く、光音響信号強度が高められやすいことから、シアニン系が好ましい。シアニン系色素の一例は、以下の一般式（I’）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　上記式（Ｉ’）において、Ｒ２’は、上記式（Ｉ）におけるＲ２に、水素原子、アルキル基、その他の置換基が付加したものである。上記式（Ｉ’）は、Ｒ２がＲ２’に置き換わったことを除き、上記式（Ｉ）と同様である。
　上記式（Ｉ’）で表される近赤外線吸収剤の具体例としては、環Ｂおよび環Ｄがいずれも含窒素三環式芳香族複素環であるＩＣＧ（下記式III’）、ＩＣ７－１（下記式IV’）およびＩＲ８２０（下記式V’）；環Ｂおよび環Ｄがいずれも含窒素二環式芳香族複素環であるＩＲ７８３（下記式VI’）およびＩＲ８０６（下記式VII’）；ならびに、環Ｂが含窒素三環式芳香族複素環、環Ｃが含窒素二環式芳香族複素環であるＩＣ７－２（下記式VIII’）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
［ナノ粒子の形成］
　本発明のナノ粒子は、上記の近赤外線吸収有機分子を含むように形成された上記両親媒性ポリマーの分子集合体からなる。なお、近赤外線吸収基が結合した両親媒性ブロックポリマーを用いる場合は、両親媒性ブロックポリマーの分子集合体を形成することにより、近赤外線吸収有機分子を含むナノ粒子が得られる。ナノ粒子の作製法は特に限定されず、ナノ粒子の大きさ、特性、担持させる近赤外線吸収有機分子の種類、性質、含有量等に応じて、適宜選択することができる。ナノ粒子が形成されたことは、電子顕微鏡観察により確認できる。
　ナノ粒子の形成方法の具体例としては、両親媒性ポリマーと近赤外線吸収有機分子とを含む溶液を乾固させて得られたフィルムと水系液体とを接触させ、水系液体中にナノ粒子が分散した分散液を得る方法（フィルム法）や、当該溶液を水系液体と接触させて分散液を得る方法（インジェクション法）等が挙げられる。
　フィルム法およびインジェクション法のいずれにおいても、両親媒性ブロックポリマーや近赤外線吸収有機分子等の分子集合体の構成成分および溶媒を含む溶液が用いられる。溶媒は、分子集合体の構成成分を溶解し得るものであれば特に限定されない。フィルム法には、低沸点溶媒が好ましく用いられる。低沸点溶媒とは、１気圧における沸点が１００℃以下、好ましくは９０℃以下のものをいう。具体的には、クロロホルム、ジエチルエーテル、アセトニトリル、エタノール、トリフルオロエタノール、イソプロパノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ヘキサン等が挙げられる。インジェクション法では、上記の低沸点溶媒の他、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の高沸点溶媒も制限なく用いることができる。
　ナノ粒子の形成に用いられる溶液は、両親媒性ブロックポリマー、近赤外線吸収有機分子、および溶媒以外の成分を含んでいてもよい。例えば、両親媒性ブロックポリマーや近赤外線吸収ポリマー以外のポリマーを、分子集合体の構成成分として含んでいてもよい。親媒性ブロックポリマーや近赤外線吸収ポリマー以外のポリマーとしては、疎水性ポリマーが挙げられる。疎水性ポリマーを加えることにより、分子集合体の疎水コアの形成促進や、疎水コアの体積制御等を行いうる。疎水性ポリマーとしては、上記の近赤外線吸収ポリマーのポリマー鎖（近赤外線吸収基を含まないもの）と同等のものを用いることができる。なお、近赤外線吸収有機分子の濃度を高め、光音響イメージング用のナノ粒子を得るためには、近赤外線吸収ポリマー以外の疎水性ポリマー（すなわち、近赤外線吸収基を含まない疎水性ポリマー）を使用しないか、あるいは使用量を極力小さくすることが好ましい。具体的には、近赤外線吸収基を含まない疎水性ポリマーの量は、近赤外線吸収ポリマー１００モル部に対して、３０モル部以下が好ましく、２０モル部以下がより好ましく、１０モル部以下がさらに好ましい。
（フィルム法）
　フィルム法は、リポソームの調製に用いられている方法である。上記の両親媒性ブロックポリマーは、疎水性ブロック鎖が乳酸単位を有し、低沸点溶媒への溶解性を有するため、この方法を用いたナノ粒子の調製が可能である。フィルム法は、ガラス容器等の容器中に、上記溶液を用意する工程；溶液から有機溶媒を除去し、容器の内壁にポリマーと近赤外線吸収有機分子とを含むフィルムを得る工程；および、容器中に水系液体を加え、フィルム状物質を、近赤外線吸収有機分子を内包する分子集合体に変換してナノ粒子の分散液を得る工程、を含む。
　容器内の溶液から溶媒を除去することにより、容器内壁に分子集合体を構成するポリマーと近赤外線吸収有機分子とを含むフィルムが形成される。溶媒の除去の方法は特に限定されず、使用する溶媒の沸点等に応じて、適宜決定できる。例えば、減圧下における溶媒除去を行ってもよいし、自然乾燥による溶媒除去を行ってもよい。
　このフィルムが張り付いた容器中に、水系液体を加え、容器内壁からフィルムが剥がれる過程で分子集合体が形成される。水系液体は、水または水溶液であり、生化学的、薬学的に許容することができるものであればよく、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が挙げられる。容器内壁からフィルムを剥離させ、ナノ粒子の形成を促進するために、容器内に水系液体が加えられた後、加温処理や超音波処理が行われてもよい。加温処理は、例えば７０～１００℃、５～６０分の条件下で行うことができる。
　なお、容器の内壁にフィルムを形成する代わりに、フィルムやガラス板等の基材上にフィルムを形成し、基材上のフィルムと水系液体とを接触させることにより、ナノ粒子を形成することもできる。基材上のフィルムと水系液体との接触は、例えば、フィルムが形成された基材を水系液体中に浸漬することにより行い得る。
（インジェクション法）
　インジェクション法は、他の多くのナノ粒子の調製に用いられる方法である。この方法においては、上記の溶液を、水系液体に分散させ、精製処理、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、フィルタリング、超遠心等の処理を行った後、有機溶媒を除去することによってナノ粒子を調製することができる。インジェクション法において、溶液の溶媒として、生体に有害な有機溶媒を用いた場合は、有機溶媒の除去を厳密に行うことが好ましい。
（ナノ粒子の凍結乾燥処理）
　フィルム法やインジェクション法により得られたナノ粒子の分散液は、そのまま光音響イメージング用のコントラスト剤として、生体に投与することができる。また、得られた分散液を凍結乾燥処理しても良い。凍結乾燥処理の方法としては公知の方法を採用できる。例えば、ナノ粒子の分散液を液体窒素等によって凍結させ、減圧下で昇華させることにより、ナノ粒子の凍結乾燥処理物が得られる。これにより、ナノ粒子を凍結乾燥処理物として保存することが可能になる。必要に応じ、この凍結乾燥物に水系液体を加えて、ナノ粒子の分散液を得ることにより、ナノ粒子を使用に供することができる。
　凍結乾燥処理前の分散液中には、ナノ粒子の形成に寄与しなかったポリマーや近赤外線吸収有機分子が各々それ自体として残存している場合がある。このような分散液を凍結乾燥処理に供すると、溶媒が濃縮される過程で、ナノ粒子を形成せず残存していたポリマーと近赤外線吸収有機分子とから、さらにナノ粒子を形成することが可能になる。従って、本発明のナノ粒子の調製を効率的に行うことが可能になる。
（近赤外線吸収有機分子の濃度）
　光音響イメージング用ナノ粒子における近赤外線吸収有機分子の濃度は、５μｍｏｌ／ｇ以上である。近赤外線吸収有機分子の濃度を高くすることにより、ナノ粒子を生体に投与した場合の光音響信号の強度が高められる。近赤外線吸収有機分子の濃度が５μｍｏｌ／ｇ未満の場合、生体へのナノ粒子の投与量を増大させても、生体イメージングを行い得る程度の光音響信号を得ることが困難である。より精度の高い光音響イメージングを実現可能とするために、ナノ粒子における近赤外線吸収有機分子の濃度は、１０μｍｏｌ／ｇ以上が好ましく、１５μｍｏｌ／ｇ以上がより好ましく、２０μｍｏｌ／ｇ以上がさらに好ましい。ナノ粒子における近赤外線吸収有機分子の濃度の上限は特に制限されず、濃度が高いほど光音響信号強度が高められる傾向がある。ただし、近赤外線吸収有機分子の濃度が高すぎると、分子集合体の構造が不安定となる傾向がある。そのため、ナノ粒子における近赤外線吸収有機分子の濃度は、１００μｍｏｌ／ｇ以下が好ましく、７０μｍｏｌ／ｇ以下がより好ましく、５０μｍｏｌ／ｇ以下がさらに好ましい。
　ＩＣＧ等の近赤外線吸収基は、蛍光色素でもあり、近赤外線の照射により蛍光を発することから、蛍光コントラスト剤としても用いられている。蛍光イメージングでは、蛍光色素の濃度が高くなると濃度消光によるシグナルの低下が生じる。特に、分子集合体内に近赤外蛍光色素が内包されている場合、１つの分子集合体の疎水コア内に複数の蛍光色素分子が存在すると、蛍光色素分子同士が近接して存在するために濃度消光が生じやすい。例えば、分子集合体のナノ粒子中にＩＣＧを内包する場合、その濃度が５μｍｏｌ／ｇ以上になると、ＩＣＧからの蛍光がほぼ観測されなくなる。そのため、蛍光イメージング用のナノ粒子では、蛍光色素で標識された疎水性ポリマーに加えて、蛍光色素で標識されていない疎水性ポリマーを用い、疎水コアに取り込まれる蛍光色素の数を制限する必要がある。一方、光音響イメージングでは、１つの分子集合体内に複数の赤外線吸収基を存在させ、蛍光では濃度消光が生じるほどの高濃度とすることにより、生体イメージングを行い得る程度の光音響信号が得られる。
　両親媒性ポリマーと近赤外線吸収有機分子の使用比率を調整することにより、ナノ粒子中の近赤外線吸収有機分子の濃度を高めることができる。近赤外線吸収有機分子として疎水性ポリマー鎖に近赤外線吸収基が結合した疎水性の近赤外線吸収ポリマーが用いられる場合、近赤外線吸収ポリマーの量は、両親媒性ポリマー１００モル部に対して、５～２００モル部が好ましく、１０～１００モル部がより好ましく、１５～７０モル部がさらに好ましい。
（ナノ粒子の大きさ）
　本発明の光音響イメージング用ナノ粒子の大きさは、好ましくは２０～２００ｎｍである。「粒子径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒子径、すなわち中心粒子径をいう。粒子径が２０ｎｍより小さいものは、分子集合体内に近赤外線吸収有機分子を高濃度に内包することが困難であり、２００ｎｍより大きいものは、特に生体内へ注射により投与する場合に、注射剤として好ましくない場合がある。ナノ粒子の大きさは、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope;ＴＥＭ）による観察法や、動的光散乱（Dynamic Light Scattering;ＤＬＳ）法により測定できる。
　ナノ粒子の大きさを制御する方法としては、両親媒性ブロックポリマーや疎水性ポリマーの鎖長を調整する方法や、疎水性ポリマーの配合量を調整する方法が挙げられる。疎水性ポリマーの配合量の増大に伴って、分子集合体の疎水コアの体積が増大するため、ナノ粒子が大きくなる傾向がある。
［ナノ粒子の光音響イメージングへの適用］
　本発明の光音響イメージング用ナノ粒子は、サルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖を有する両親媒性ブロックポリマーを基本的要素とする分子集合体（いわゆるラクトソーム）である。ラクトソームは、高い血中滞留性を有し、かつ他の分子集合体に比して肝臓への集積量が著しく低いとの特長を有する。
　これまでも、近赤外線吸収剤等の色素を光音響イメージングに使用可能であることが知られているが、インドシアニングリーン等の色素は肝臓への集積性が高く、病変部位に血管等の病変部位に集積させることは困難であった。これに対して、本発明のナノ粒子を用いれば、血中に滞留しているナノ粒子が、腫瘍部位、炎症部位、動脈硬化部位、血管新生部位等の血管病変部位に蓄積しやすいという性質（ＥＰＲ(enhanced permeability and retention)効果）を利用することにより、癌疾部位等を標的とした光音響イメージングが可能となる。
（生体へのナノ粒子の投与）
　ナノ粒子の投与対象の生体は特に限定されず、ヒトまたは非ヒト動物でありうる。非ヒト動物としては、ヒト以外の哺乳類、より具体的には、霊長類、齧歯類（マウス、ラットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。生体内への投与方法は特に限定されず、全身投与および局所投与のいずれでもよい。すなわち、ナノ粒子の投与は、注射、内服、外用のいずれの方法によっても行うことができる。投与液中におけるナノ粒子の濃度は、０．５～１００ｍｇ／ｍＬ程度であり、好ましくは０．８～５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１～２０ｍｇ／ｍＬである。
　ナノ粒子の投与から検出開始までの時間は、ナノ粒子が有する近赤外線吸収有機分子の種類や投与ターゲットの種類等に応じて、適宜決定することができる。例えば、投与後３～４８時間、或いは１～２４時間とすることができる。上記範囲を下回ると、癌疾部位等の標的へのナノ粒子の滞留が不十分であったり、シグナルが強すぎるために投与ターゲットと他の部位（バックグラウンド）とを明確に分けることができない場合がある。上記範囲を上回ると、ナノ粒子が投与ターゲットから排泄されてしまう場合がある。
（光音響イメージング装置）
　光音響イメージングは、光エネルギーを吸収した分子が熱を放出し、その熱による体積膨張で音響波が発生する現象（光音響効果）を利用するものである。光音響イメージング装置としては、イメージング部位等に応じて適宜の装置を用いることができる。光音響イメージング装置は、光励起部と音響波検出部とイメージング部とを有する。
　光励起部は、近赤外線を照射し、生体に投与されたナノ粒子に含まれる近赤外線吸収有機分子を励起させる。光励起部としては、近赤外のコヒーレント光源が好ましく、中でも、ＯＰＤレーザが好ましく用いられる。ＯＰＤレーザは、光パラメトリック発振（Optical Parametric Oscillation; OPD）によるコヒーレント光源であり、可視域から赤外域までの広波長域で連続波長可変の光源として実用化されている。
　音響波検出部は、光励起部からの照射光により励起された分子から放出された熱による体積膨張で発生した音響波（具体的には超音波）を検出する。音響波検出部としては、超音波を検出可能な音響センサを用いることができる。
　イメージング部は、音響波検出部の位置および検出された音響波の波形に基づいて、ナノ粒子が存在する組織の位置や大きさを可視化できるものであればよい。得られた光音響イメージから、生体内におけるナノ粒子の滞留状況を知ることができ、これに基づいて、血管病変の有無や位置等を診断することができる。
　以下に本発明のナノ粒子を用いた光音響イメージングの実施例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［分子集合体の作製］
　以下のように、近赤外線吸収ポリマー（ＩＣＧ－ＰＬＬＡ３０）と両親媒性ブロックポリマー（ＰＳａｒ７０－ＰＬＬＡ３０）とから構成される分子集合体のナノ粒子を作製した。
＜ＩＣＧ修飾ポリＬ－乳酸（ＩＣＧ－ＰＬＬＡ３０）の合成＞
（アミノ化ポリＬ－乳酸の合成）
　Ｌ－ラクチドとＮ－カルボベンゾキシ－１，２－ジアミノエタン塩酸塩とを用い、下記のスキーム１にしたがって、アミノ化ポリＬ－乳酸（ａ－ＰＬＡ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　オクタン酸スズ（６．９１ｍｇ）をトルエン（１．０ｍＬ）に拡散させたものを、重合開始剤であるＮ－カルボベンゾキシ－１，２－ジアミノエタン塩酸塩（３１０ｍｇ，１．６０ｍｍｏｌ）に加えた。トルエンを減圧留去した後、Ｌ－ラクチド（３．４５ｇ，２４ｍｍｏｌ）を加え、Ａｒ雰囲気下、１２０℃にて１２時間重合反応を行った後、反応容器を室温に空冷した。得られた黄白色固体を約１０ｍＬのクロロホルムに溶解させ、冷メタノール（１００ｍＬ）に滴下して、白色沈殿を得た。得られた白色沈殿は遠心分離により回収し、減圧乾燥した。
　得られた白色沈殿（５００ｍｇ）のジクロロメタン（１ｍＬ）溶液に、２５ｖ／ｖ％臭化水素／酢酸（２．０ｍＬ）を加え、遮光、乾燥空気下にて２時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を冷メタノール（１００ｍＬ）に滴下し、析出した沈殿を遠心分離にて回収した。得られた白色沈殿はクロロホルムに溶解させた後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液にて洗浄し、無水ＭｇＳＯ４にて脱水操作を行った。セライト濾過によりＭｇＳＯ４を除去した後、真空乾燥して、ａ－ＰＬＡの白色のアモルファス状粉末（４４０ｍｇ）を得た。
（近赤外線吸収基の修飾）
　アミノ化ポリＬ－乳酸（ａ－ＰＬＡ）を１．９ｍｇ含むＤＭＦ溶液に、インドシアニングリーン誘導体（ＩＣＧ－ｓｕｌｆｏ－ＯＳｕ）１ｍｇ（ａ－ＰＬＡに対して１．３当量）を含むＤＭＦ溶液を加え、室温で約２０時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し、ＬＨ－２０カラムにて精製を行い、アミノ基を介してポリＬ－乳酸にインドシアニングリーン由来の近赤外線吸収官能基が結合したポリマー（ＩＣＧ－ＰＬＬＡ３０）を得た（下記スキーム２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
＜両親媒性ブロックポリマー（ＰＳａｒ７０－ＰＬＬＡ３０）の合成＞
　アミノ化ポリＬ－乳酸（ａ－ＰＬＡ）（３８３ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）とサルコシン－Ｎ－カルボン酸無水物（Ｓａｒ－ＮＣＡ）（３．２１ｇ，２７．９ｍｍｏｌ）に、Ａｒ雰囲気下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１４０ｍＬ）を加え、室温にて１２時間攪拌した。反応溶液を０℃に冷却した後、グリコール酸（７２ｍｇ，０．９５ｍｍｏｌ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾル－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（３５７ｍｇ，０．９４ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（２４５μＬ，１．４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１８時間反応させた（下記スキーム３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　ロータリーエバポレーターによりＤＭＦを減圧溜去した後、ＬＨ２０カラムにて精製を行い、２７０ｎｍにピークが検出されたフラクションを回収・濃縮した。得られた濃縮溶液を０℃にてジエチルエーテル中に滴下し、再沈澱することにより、ポリ乳酸－ポリサルコシン両親媒性ブロックポリマー（ＰＳａｒ７０－ＰＬＬＡ３０）１．７ｇを得た。
＜ナノ粒子の作製＞
　ポリ乳酸－ポリサルコシン両親媒性ブロックポリマー（ＰＳａｒ７０－ＰＬＬＡ３０・２６Ｈ２Ｏ，Ｍｗ＝７７６７）およびＩＣＧ修飾ポリＬ－乳酸（ＩＣＧ－ＰＬＬＡ３０，Ｍｗ＝２９９８）それぞれのクロロホルム溶液（０．２ｍＭ）を調製し、ＩＣＧ修飾ポリＬ－乳酸のモル濃度が２０ｍｏｌ％となるように、ガラス容器内で両溶液の混合液を調製した。混合液から溶媒を減圧留去し、ガラス容器の壁面に、混合ポリマーのフィルムを形成させた。ガラス容器内に水を加え、温度８２℃で２０分間湯せんした後、室温で３０分間放置した。０．２ｍｍのフィルターでろ過して浮遊異物を除去した後、凍結乾燥を行い、分子集合体（ＩＣＧラクトソーム）のナノ粒子を得た。ナノ粒子中のＩＣＧ修飾ポリＬ－乳酸の含有量は、２７μｍｏｌ／ｇであった。Malvern社製 Zetasizer Nano Sを用い、動的光散乱（ＤＬＳ）法により測定したナノ粒子の粒子径は、６０ｎｍであった。
　得られたナノ粒子の水分散液の吸収スペクトルを図２（Ａ）に示す。また、インドシアニングリーン（濃度：２μＭ）の吸収スペクトルを図２（Ｂ）に示す。ＩＣＧ単体の吸収スペクトルでは、吸収極大波長が７７９ｎｍであるのに対して、ＩＣＧラクトソームの吸収極大波長は７９６ｎｍであり、分子集合体の形成により、長波長側にシフトしていることが分かる。また、ＩＣＧラクトソームは、ＩＣＧ単体に比べて吸収ピーク幅が小さくなっており、モル吸光係数が約１０％増大していた。
　光音響信号は、吸光係数に比例する。そのため、本発明のナノ粒子を用いることにより、色素を単独で用いる場合に比べて、信号強度の高い光イメージングが可能であることが分かる。近赤外吸収ピークの極大および形状の変化の理由は明らかではないが、本発明のナノ粒子では、１つの分子集合体内に複数のＩＣＧ基が近接してリジッドに固定されているために、ＩＣＧ基同士の分子間相互作用が生じ、共役π電子系が摂動を受けているものと考えられる。
［光音響イメージング］
　図１は、本実施例で用いた光音響イメージング測定システムの構成概要図である。光音響用励起光源１として、３０Ｈｚの光パラメトリック発振器（パルス幅６ナノ秒）を用いた。励起光源は、ＩＣＧ－ラクトソームの吸収ピークに対応する７９６ｎｍに調整された。出力光パルスは、ビームスプリッタ５で４本のビームに分割され、それぞれのビームが、レンズ７を介して光ファイバ１１に導かれる。各光ファイバからの照射パルス光のエネルギーは２０μＪ未満に調整され、組織表面での強度は約１３ｍＪ／ｃｍ２であった。
　４本の光ファイバ１１の先端は、光音響センサヘッド１５に取り付けられている。光音響センサヘッド１５のイメージングプローブは、斜めに配置された４本の励起用光ファイバ１１、および音響レンズを備える音響波検出用の５０ＭＨｚ超音波センサを有する。このプローブは、深さ分解能が３９μｍ、ＸＹ面分解能が５６μｍである。
　光音響センサヘッド１５は、可動ステージ１３に連結されており、コンピュータ５０によりその位置が制御される。本実施例では、１５０μｍステップで、４ｍｍ四方の領域を走査した。４本の励起用光ファイバ１１の光パルスによって誘起された光音響波（超音波）は、電界効果トランジスタアンプ２５で増幅される。光電管２３は、光音響用励起光源１からのレーザ発振を検出し、これをトリガとして、アンプ２５で増幅された音響波が、デジタルオシロスコープ２１で検出・記録され平均化される。光音響波の時間波形は、組織内の音速（１５４０ｍ／秒）に基づいて深さプロファイルに変換され、可視化ソフトウェア（Kitware VolView 3.4）により三次元光音響イメージに再構築される。
［マウスモデルへのＩＣＧラクトソームの投与］
　ヒト頭頸部扁平上皮癌細胞（ＦａＤｕ）を培養して、雌のマウス（８週齢）の左大腿部に移植し（４×１０６個／４０μＬ）、腫瘍体積が１００ｍｍ３程度のものを用いた１．５ｗｔ％のＩＣＧラクトソーム生理食塩水分散液を、この皮下腫瘍マウスモデルに、尾静脈注射により投与した（１５０ｍｇ／ｋｇ体重）。投与前、投与３０分後、および投与１８時間後に行った光音響イメージング像を、図３（Ａ）～（Ｃ）に示す。
［光線力学治療］
　投与１８時間後に、８０８ｎｍのファイバーカップリングＣＷレーザダイオードを用いて、光線力学治療（ＰＤＴ）を実施した。腫瘍領域全体をカバーするように、スポットサイズ１０ｍｍ、パワー密度６００ｍＷ／ｃｍ２で１０分間（３６０Ｊ／ｃｍ２）レーザ照射を行った。ＰＤＴ後に測定した光音響イメージング像を、図３（Ｄ）に示す。
［血管の光音響イメージング］
　ＩＣＧラクトソームの投与前およびＰＤＴ後に、血管の光音響イメージング測定を行った。血管の光音響イメージングには、１００Ｈｚの光パラメトリック発振器（パルス幅９ナノ秒）を用い、酸素化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）と脱酸素化ヘモグロビン（ＨＨｂ）の等吸収点である５３２ｎｍに励起波長を調整した。投与前およびＰＤＴ後の光音響イメージング像を、図３（Ｅ）、（Ｆ）に示す。
　ＩＣＧラクトソーム投与前は、５３２ｎｍの励起光で血管の構造を示す光音響信号が確認されたが（図３（Ｅ））、７９６ｎｍの励起光での光音響信号は低かった（図３（Ａ）。投与３０分後に、７９６ｎｍの励起光での光音響信号の増大が確認された（図３（Ｂ））。これは、ＩＣＧラクトソームが、血管内を循環したことに起因すると考えられる。投与１８時間後には、７９６ｎｍの励起光での光音響信号が顕著に増大しており（図３（Ｃ））、腫瘍内にＩＣＧラクトソームが効率的に蓄積したことを示している。
　光線力学治療（ＰＤＴ）実施後は、７９６ｎｍの励起光での光音響信号が急速に減少しており（図３（Ｄ））、光線力学反応によるＩＣＧの光退色が生じたことを示している。また、ＰＤＴ後は、５３２ｎｍの励起光での光音響信号もほとんどが消失し、残りの信号も振幅が約３５％減少していた（図３（Ｆ））。これは、ＰＤＴにより、血管のシャットダウンが生じたことを示唆している。
　以上の結果は、本発明のナノ粒子が病変部位の血管内に特異的に集積し、ＰＤＴにより急速に濃度が減少することを、近赤外線を用いた光音響イメージングにより観測できたことを示している。これらの結果から、本発明のナノ粒子は、血管病変の診断に有用であることが分かる。

Claims (7)

  1. 　光音響イメージングのコントラスト剤として用いられる光音響イメージング用ナノ粒子であって、
    　２０個以上のサルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と１０個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖を有する両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体からなり、
    　前記分子集合体中に、近赤外線吸収官能基を含む近赤外線吸収有機分子を５μｍｏｌ／ｇ以上の濃度で含む、光音響イメージング用ナノ粒子。
  2. 　前記近赤外線吸収有機分子は、１０個以上の乳酸単位を含むポリマー鎖に前記近赤外線吸収官能基が結合した疎水性ポリマーである、請求項１に記載の光音響イメージング用ナノ粒子。
  3. 　前記近赤外線吸収官能基が、下記式（Ｉ）で表される官能基である、請求項１または２に記載の光音響イメージング用ナノ粒子：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアルキル基であり；Ｒ２は、置換されていてもよいアルキレン基であり；Ｒ３およびＲ３’は、水素原子、または互いに連結して環状構造を形成する基であり；Ｘは水素またはハロゲンであり；環Ｂおよび環Ｄは、それぞれ同一または異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環であり；Ａ－は陰イオンであり、ｍは０または１である。
  4. 　前記近赤外線吸収官能基が、インドシアニングリーンに由来する基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の光音響イメージング用ナノ粒子。
  5. 　前記分子集合体の粒子径が、２０～２００ｎｍである、請求項１～４のいずれか１項に記載の光音響イメージング用ナノ粒子。
  6. 　血管病変の診断に用いられる、請求項１～５のいずれか１項に記載の光音響イメージング用ナノ粒子。
  7. 　癌疾部位の検出に用いられる、請求項１～５のいずれか１項に記載の光音響イメージング用ナノ粒子。
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