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WO2015091079A1 - Procede d'hydrolyse enzymatique avec production in situ de glycosides hydrolases par des microorganismes genetiquement modifies (mgm) et non mgm - Google Patents

Procede d'hydrolyse enzymatique avec production in situ de glycosides hydrolases par des microorganismes genetiquement modifies (mgm) et non mgm Download PDF

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Publication number
WO2015091079A1
WO2015091079A1 PCT/EP2014/076940 EP2014076940W WO2015091079A1 WO 2015091079 A1 WO2015091079 A1 WO 2015091079A1 EP 2014076940 W EP2014076940 W EP 2014076940W WO 2015091079 A1 WO2015091079 A1 WO 2015091079A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzymes
mgm
microorganism
genetically modified
enzymatic hydrolysis
Prior art date
Application number
PCT/EP2014/076940
Other languages
English (en)
Inventor
Fadhel Ben Chaabane
Jean-Guy BERRIN
Original Assignee
IFP Energies Nouvelles
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IFP Energies Nouvelles filed Critical IFP Energies Nouvelles
Publication of WO2015091079A1 publication Critical patent/WO2015091079A1/fr

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
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    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the invention relates to a method of enzymatic hydrolysis with in situ production of glycosides hydrolases by genetically modified (MGM) and non-MGM microorganisms.
  • MGM genetically modified
  • This invention describes a second generation ethanol production process comprising two enzyme production units:
  • a main unit where a non-GMM microorganism is used preferably
  • the enzymes produced in the main unit are not separated. They are used with the whole must during the enzymatic hydrolysis step, whether it is carried out separately or not from the fermentation.
  • the enzymes produced in the secondary unit are separated from the microorganism and then added to the enzymes produced in the main unit to increase their efficiency.
  • the invention relates to a method for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials, wherein the reaction medium comprises a mixture of Trichoderma reesei non-genetically modified mushroom (non-GMM) and enzymes that it secretes, supplemented with enzymes.
  • purified secreted by at least one genetically modified microorganism (MGM) said enzymes having been separated from said MGM microorganism, and the proportion of said enzymes secreted by the MGM microorganism and separated from said microorganism is from 1% to 20% relative to the total amount of enzymes.
  • the MGM microorganism is selected from the group consisting of Trichoderma, Aspergillus, Penicillium and Schizophyllum, Clostridium, Pichia, Saccharomyces, Escherichia coli.
  • the hydrolysis takes place at a temperature of 45-50 ° C., a pH of 4.5-5.5, with an MS (dry matter) of between 5% and 25% (MS of the reaction medium, including the substrate to be treated).
  • the invention can operate in SHF mode (hydrolysis and fermentation separated) or SSF.
  • SSF method processes where enzymatic hydrolysis and fermentation are carried out simultaneously (SSF method), especially when the fermentation is carried out in the presence of the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the temperature is between 30 and 37 ° C and the concentration of the yeast is between 0.25 and 1 g / kg.
  • the industrial strains used in the main unit belong to the species Trichoderma reesei. Preferably, they have been modified to improve the cellulolytic and / or hemicellulolytic enzymes by mutation-selection (random mutagenesis) methods, for example the strain CL847 (French patent FR-B-2555803).
  • Trichoderma reesei non-MGM The conduct of enzyme production by Trichoderma reesei non-MGM is carried out in two stages:
  • the conditions are such that the pH is adjusted between 3.5 and 6 and the temperature between 20 and 35 ° C.
  • a pH of 4.8 and a temperature of 27 ° C. during the growth phase and a pH of 3.5 and a temperature of 25 ° C. during the production phase in fed-batch mode are preferably chosen.
  • the vvm (rate of aeration expressed in volume of air per volume of reaction medium and per minute) applied during the process is between 0.3 and 1.5 min-1 and the rpm (speed of rotation) must allow to regulate the oxygen pressure between 20% and 60%.
  • An aeration of 0.4 to 1 and preferably close to 0.5 min-1 will preferably be chosen and stirring may be used to regulate the oxygen pressure from 25% to 40% and preferably close to 30% (% dissolved oxygen relative to to saturation.
  • the main source of carbon (present for fungal growth and enzyme production) is a sugar (such as glucose, lactose or xylose) used such as (eg an industrial soluble sugar) or it may be present in a material or be derived from the treatment of a material (biomass hydrolysis residue).
  • This source of carbon can also be used by genetically improved strains.
  • This may be for example an extract of the hemicellulosic fraction in the form of monomers from the pretreated biomass.
  • An aqueous solution of hemicellulosic hydrolyzate from pretreatment by acid hydrolysis or steam explosion after H2S04 impregnation can be used for the production phase.
  • it is mixed with other carbon substrates.
  • the carbon substrates used are lactose or glucose, they will be dissolved in this solution. This will have a concentration of 200 to 600 g / L depending on the degree of solubility of the carbon substrates used.
  • marc solid residue
  • An inducing substrate most often lactose, is added for the production of enzymes.
  • the previously described marc can also be used as a total carbon source, that is, for the growth of the microorganism and the induction of protein production.
  • the carbon substrate chosen for obtaining the biomass is introduced into the fermentor before sterilization or is sterilized separately and introduced into the fermentor after sterilization.
  • the inducing source may not be added in this phase but later.
  • a non-MGM Trichoderma reesei stream is obtained with its produced enzymes.
  • This stream can be used as preferably. It can also undergo a partial separation of the fungus.
  • the MGM microorganism is chosen from cellulolytic fungi or other modified microorganisms (yeasts, bacteria).
  • the cellulolytic microorganism belongs to the genera Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Schizophyllum, Pichia, Saccharomyces, E. coli, ... or it is chosen from anaerobic bacteria belonging to for example to the genus Clostridium.
  • the MGM microorganism is Trichoderma or Pichia.
  • MGM microorganism The choice of the MGM microorganism is focused on those that produce enzymes (glycosides hydrolases and in particular cellulases and hemicellulases) suitable for the hydrolysis of cellulose and hemicelluloses.
  • the conduct of the production of enzymes by the MGM microorganism, and in particular Pichia and Trichoderma, is carried out under the conditions known to those skilled in the art and depending on the strains used so as to maximize the production yield of the auxiliary enzymes.
  • the production of enzymes by the Trichoderma MGM strain is carried out under the same conditions as those described for the non-MGM Trichoderma strain.
  • the enzymes are separated from the must by the separation technologies known to those skilled in the art.
  • Another preferred means is centrifugation and / or microfiltration (filter of 0.8 ⁇ for example).
  • the enzymes are then advantageously concentrated by ultrafiltration.
  • All MGM musts can then be destroyed, for example by adding 0.2 mol / L NaOH and heating at 80 ° C. for one hour.
  • they are made periodically. This has the advantage of better controlling the enzymatic activity by possibly adjusting the quantities added.
  • the separate feed with flow control of at least one flow provides significant flexibility and fine control of enzymatic activity.
  • the streams are as concentrated as possible in enzymes to avoid a dilution effect.
  • the enzymatic hydrolysis takes place with a proportion of 1% to 20% of enzymes secreted by the MGM microorganism relative to the total amount of enzymes.
  • total amount of enzymes is meant the amount of Trichoderma reesei non-MGM fungus with its enzymes produced plus the amount of enzymes produced by the MGM microorganism that are added, the amounts being expressed in MS (dry matter).
  • the total amount of enzymes is between 1 and 50 mg / g of MS in the reaction medium, even more preferably from 10 to 20 mg / g and even more advantageously from 5 to 30 mg / g.
  • the enzymatic hydrolysis is carried out under the conditions known to those skilled in the art.
  • the hydrolysis takes place at a temperature of 45-50 ° C at a pH of 4.5-5.5, with an MS (dry matter) of between 5% and 25%.
  • Hydrolysis can be carried out simultaneously with fermentation (SSF).
  • the yeast is added at the same time as the enzymes (originating from the MGM microorganism) in the same reactor.
  • Another preferred way is to add the yeast after starting the hydrolysis; thus the products of hydrolysis begin to be present in the medium and can be fermented.
  • the temperature is then lowered between 30 and 37 ° C, preferably 33-37 ° C, and the yeast is added at a concentration generally between 0.25 and 1 g / kg.
  • the lignocellulosic biomass to be treated has been advantageously pretreated so as to improve the accessibility of the cellulose to the enzymes. Such pretreatment methods are known.
  • a preferred method is the steam explosion under acidic conditions.
  • the enzymatic hydrolysis is carried out in SHF mode, that is to say separately from the fermentation (2 separate units) or in SSF mode, that is to say simultaneously with the fermentation (1 unit).
  • SHF mode that is to say separately from the fermentation (2 separate units)
  • SSF mode that is to say simultaneously with the fermentation (1 unit).
  • one operates in SSF mode which is more economical and limits the contaminations.
  • the proportion according to the invention makes it possible to maintain a sufficient enzymatic activity. Indeed, it has been found that if the presence of beta-glucosidase increases the activity in enzymatic hydrolysis, it reduces the yield of fermentation in some cases.
  • the invention makes it possible to conduct the method in SSF mode.
  • the yeasts used in fermentation and in particular Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces
  • the proportion of the enzymes according to the invention makes it possible to maintain a good level of enzymatic hydrolysis.
  • the invention can significantly improve the final conversion efficiency of cellulose and hemicellulose compared to methods operating without enzymes from MGM microorganism.
  • the enzymatic hydrolysis reaction medium thus comprises the lignocellulosic biomass, non-MGM Trichoderma reesei, the enzymes secreted by non-MGM Trichoderma reesei and the enzymes secreted by the genetically modified microorganism (MGM) and separated from said microorganism.
  • MGM genetically modified microorganism
  • the process can operate in batch, fed-batch or continuous mode.
  • the enzymes secreted by at least one genetically modified microorganism (MGM) and separated from said microorganism are added to the reaction medium.
  • the reaction medium comprises, as flow of enzymes, only the stream containing non-MGM Trichoderma reesei with the enzymes secreted by non-MGM Trichoderma reesei.
  • the flow of secreted enzymes is then added to at least one genetically modified microorganism and separated from the microorganism.
  • the invention therefore proposes to incorporate in the second generation biofuel production plant, two enzyme production units:
  • the secondary unit will be smaller in size than the main unit, usually by a factor of 5 to 10. It will be confined to the rest of the plant so that it can handle the GMM waste.
  • FIG. 1 illustrates the invention.
  • the lignocellulosic biomass is fed via line (1) into the enzymatic hydrolysis reactor (2). This biomass has been advantageously pretreated.
  • a mushroom / enzyme separation unit may be placed after the unit (3).
  • a unit for producing enzymes by a genetically modified microorganism said secondary unit (5), a flow (6) of said microorganism and said enzymes is produced.
  • the production reactor must be equipped with an air filter at the outlet of 0.2 ⁇ in order to prevent the spread of spores in the environment.
  • the stream (6) is sent to a separation unit (7) to separate the enzymes of said MGM microorganism.
  • This unit can be a centrifugation and / or microfiltration (0.2 ⁇ filter for example).
  • the enzymes (line 8) are concentrated in the ultrafiltration unit (9).
  • the enzymes secreted by the genetically modified microorganism (MGM) and separated from said microorganism are sent to the reactor (2) via line (10).
  • Enzyme introduction lines (4) and (10) are provided with a flow control means which may be simply a valve, respectively the valves (11) and (12).
  • yeasts are also introduced by an additional pipe not shown. It leaves the reactor (2) a flow (13). This stream is the hydrolyzate containing sugars and especially glucose, when the reactor (2) operates in SHF mode. It is a flow containing ethanol when the reactor (2) operates in SSF mode.
  • the separation unit (7) From the separation unit (7), it also leaves via the conduit (14) a must of the MGM microorganism that is treated according to the regulations in force. For example, it is destroyed in a unit (15) for destroying the MGM microorganism.
  • a technique known to those skilled in the art is destruction by adding NaOH with heating at 80 ° C for one hour.
  • Example 1 shows that it is possible to carry out an enzymatic SSF without separating the enzymes from the mushroom must.
  • Example 2 shows the gain in terms of SSF efficiency by adding 1/10 th of improved MGM-derived enzymes to non-MGM must.
  • Example 1 non-compliant
  • the production of cellulases is carried out mechanically stirred bioreactor with strain CL847.
  • the mineral medium has the following composition: KOH 1.66 g / L, H3PO4 85% 2 mL / L, (NH4) 2SO4 2.8 g / L, MgSO4, 7 H20 0.6 g / L, CaCl2 0, 6 g / L, MnSO 4 3.2 mg / L, ZnSO 4, 7 H 2 O 2.8 mg / L, CoCl 2 4.0 mg / L, FeSO 4, 7 H 2 O 10 mg / L, Corn Steep 1.2 g / L , antifoam 0.5 mL / L.
  • the bioreactor containing the mineral medium is sterilized at 120 ° C for 20 minutes, the glucose carbon source is sterilized separately at 120 ° C for 20 minutes and then added sterilely into the bioreactor so as to have a final concentration of 30 g / l.
  • the bioreactor is inoculated at 10% (v / v) with a liquid preculture of the strain of Trichoderma reesei CL847 (which is non-GMM).
  • the mineral medium of the preculture is identical to that of the bioreactor apart from the addition of potassium phthalate to 5 g.L-1 to buffer the pH.
  • Growth of the preculture mushroom is done using glucose as a carbon substrate at a concentration of 30 g / L. Inoculum growth lasts 2 to 3 days and is carried out at 28 ° C in a shake incubator. Transfer to the bioreactor is achieved if the residual glucose concentration is less than 15 g / L
  • the experiment carried out in bioreactor comprises two phases:
  • the aeration is 0.5 vvm and stirring is increased between 200 and 800 rpm depending on the p02 (dissolved oxygen pressure), which is maintained above 30%.
  • Enzyme production is monitored by the extracellular protein assay by the Lowry method and standard BSA, after separation of the mycelium by filtration or formed cells).
  • the final protein concentration obtained in Example 1 is 38 g / L.
  • the must obtained is separated into two:
  • one liter is transferred sterilely into a previously sterilized container.
  • the rest of the culture is separated by a series of frontal filtrations (2.7 ⁇ , 0,8 ⁇ and 0,2 ⁇ ).
  • the enzymes obtained are thus cleared of all traces of fungus by sterilizing final filtration.
  • the two solutions obtained are used to produce a SSF (hydrolysis and fermentation separated) on a wheat straw pretreated by steam explosion under acidic conditions.
  • the SSFs are made in duplicate at 10% DM and 10 mg enzymes per gram of DM.
  • the temperature is 37 ° C and the yeast is added to 1 g per kg of product.
  • the medium is buffered at 4.8 with 50mM acetate buffer.
  • Example 2 (Compliant): Addition of Enhanced Enzymes Produced by an MGM
  • a genetically modified strain (10OB1 resulting from CL847 whose preparation is described in the examples of WO-2010/29259) is used to produce an improved enzyme cocktail with xylanase and ⁇ -glucosidase activity.
  • the enzymes are produced under the same conditions as Example 1 with a 0.2 ⁇ filter at the outlet of the fermenter. A final protein concentration of 30 g / L is obtained. The enzymes are separated by a series of frontal filtrations with final filtration at 0.2 ⁇ . The mushroom must is destroyed by adding 0.2 mol / L NaOH (final concentration) and heating at 80 ° C. for 1 hour. Two comparative SSFs are made:

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'hydrolyse enzymatique de matériaux ligno-cellulosiques, dans lequel le milieu réactionnel produit sur site comprend un mélange de champignon Trichoderma reesei non génétiquement modifié (non MGM) et des enzymes qu'il sécrète, complémenté d'enzymes purifiées sécrétées par au moins un microorganisme génétiquement modifié (MGM), lesdites enzymes ayant été séparées dudit microorganisme MGM, et la proportion desdites enzymes sécrétées par le microorganisme MGM et séparées dudit microorganisme est de 1% à 20% par rapport à la quantité totale d'enzymes.

Description

PROCEDE D'HYDROLYSE ENZYMATIQUE AVEC PRODUCTION IN SITU DE GLYCOSIDES HYDROLASES PAR DES MICROORGANISMES GENETIQUEMENT MODIFIES (MGM) ET NON MGM La présente invention concerne la production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques et/ou lignolytiques, notamment dans le cadre de la production d'éthanol à partir de matériaux ligno-cellulosiques dans lequel les enzymes sont produites sur site.
Art antérieur
La biomasse ligno-cellulosique se caractérise par une structure complexe constituée de trois principales fractions: la cellulose, les hémicelluloses et les lignines. De façon classique, le procédé de transformation de cette biomasse en éthanol comprend plusieurs étapes. Le prétraitement permet de rendre la cellulose accessible aux cellulases. L'étape d'hydrolyse enzymatique permet la transformation de la cellulose en glucose . Le glucose est ensuite transformé en éthanol lors de l'étape de fermentation par , en général, la levure Saccharomyces cerevisiae. Enfin l'étape de distillation va permettre de séparer et récupérer l'éthanol du moût de fermentation. Les différentes études technico-économiques démontrent que la réduction du coût des cellulases est un des points-clés des procédés de production biologique d'éthanol à partir des matières premières lignocellulosiques. A l'heure actuelle, les cellulases industrielles sont principalement produites par un champignon filamenteux, Trichoderma reesei, en raison de son fort pouvoir de sécrétion.
GB 1489145 enseigne la culture du microorganisme cellulolytique et d'enzymes à partir de résidus de cellulose, ainsi que l'utilisation de l'ensemble du milieu de culture/production des enzymes sans séparation d'aucun constituant pour l'hydrolyse enzymatique
Le champignon est choisi dans le groupe formé par Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Fusarium solani, Fusarium javanicum.
Ils affirment que l'utilisation de l'ensemble du milieu « selon l'invention », sans traitement (filtration, concentration ou autre) autre qu'un éventuel ajustement de pH, permet d'améliorer l'hydrolyse de la cellulose en terme de vitesse et de rendement.
L'hydrolyse enzymatique est réalisée à 25-50°C ,et de préférence à des températures qui empêchent la croissance du champignon (entre 45°C et 55°C), à pH=4,8-5,2, avec une concentration en enzymes de 0,01 à 5 pds dans le milieu réactionnel et une concentration en substrat de l-30 pds.
Barta et al. (« Process Design and Economies of On-Site Cellulase Production on Various Carbon Sources in a Softwood-Based Ethanol Plant », Enzyme Research, Vol.2010) font une évaluation technico-économique à partir de plusieurs scénarios. L'un inclut l'addition de la totalité du milieu contenant le microorganisme cellulolytique à l'étape de SSF. Selon les auteurs, ceci ne pose pas de problème car la SSF est conduite à 37°C, alors que la croissance du champignon est totalement inhibée lorsque la température dépasse 35°C. Néanmoins, aucun champignon n'est cité, l'aspect fermentation est le seul concerné par cette étude technico-économique.
L'art antérieur montre que l'utilisation du moût entier (enzymes+champignon) est possible en hydrolyse et en SSF.
Toutefois, cela peut poser des problèmes de législation si le microorganisme utilisé est MGM et que l'on souhaite valoriser les co-produits en alimentation animale (par exemple les drêches de blé). Les cocktails enzymatiques produits par des microorganismes non MGM ne vont pas poser ce genre de problèmes. Par contre, les enzymes produites par les souches Trichoderma reesei non MGM sont limitées en activité β-glucosidase ainsi qu'en activités auxiliaires type xylanases.
L'invention propose un procédé permettant de résoudre les inconvénients de l'art antérieur. Elle permet de valoriser au mieux les produits et sous-produits. Elle permet également d'avoir un procédé flexible où plusieurs types de microorganismes MGM (Trichoderma, Pichia, Clostridium,...) peuvent être utilisés selon l'enzyme auxiliaire choisie pour complémenter le cocktail de base de Trichoderma reesei. Le procédé selon l'invention peut s'analyser comme un bon compromis entre la production d'enzymes élevée obtenue via Trichoderma reesei non OGM et l'efficacité enzymatique élevée des enzymes sécrétées par le microorganisme MGM. Elle a d'autres avantages:
-faire baisser le prix des enzymes en les produisant sur site avec les co-produits du procédé
-ne pas séparer les enzymes du champignon, ce qui réduit les pertes en enzymes -ne nécessite pas de concentrer les enzymes
-ne nécessite pas le transport des enzymes -choisir un microorganisme MGM en fonction de l'efficacité de ses enzymes sécrétées et moduler la quantité de ce microorganisme (ou de ces enzymes) en fonction de la productivité recherchée . Le principal effet de l'invention est d'augmenter considérablement l'activité des enzymes présentes dans le milieu réactionnel.
Il est donc proposé un procédé dans lequel la majorité des enzymes est produite avec un microorganisme non MGM et des enzymes complémentaires efficaces produites par un microorganisme MGM sont ajoutées, microorganisme MGM qui est séparé des enzymes, et lesdites enzymes sont utilisées en hydrolyse enzymatique.
Résumé de l'invention L'invention concerne un procédé d'hydrolyse enzymatique avec production in situ de glycosides hydrolases par des microorganismes génétiquement modifiés (MGM) et non MGM.
Cette invention décrit un procédé de production d'éthanol de deuxième génération comprenant deux unités de production d'enzymes:
- une unité principale où un micro-organisme non MGM est utilisé,de préférence
Trichoderma reesei
une unité secondaire où un micro-organisme MGM est utilisé.
Les enzymes produites dans l'unité principale ne sont pas séparées. Elles sont utilisées avec le moût entier lors de l'étape d'hydrolyse enzymatique, qu'elle soit réalisée séparément ou non de la fermentation. Les enzymes produites dans l'unité secondaire sont séparées du microorganisme puis ajoutées aux enzymes produites dans l'unité principale pour augmenter leur efficacité.
Plus précisément, l'invention concerne un procédé d'hydrolyse enzymatique de matériaux ligno-cellulosiques, dans lequel le milieu réactionnel comprend un mélange de champignon Trichoderma reesei non génétiquement modifié (non MGM) et des enzymes qu'il sécrète, complémenté d'enzymes purifiées sécrétées par au moins un microorganisme génétiquement modifié (MGM) , lesdites enzymes ayant été séparées dudit microorganisme MGM, et la proportion desdites enzymes sécrétées par le microorganisme MGM et séparées dudit microorganisme est de 1% à 20% par rapport à la quantité totale d'enzymes. De préférence, le microorganisme MGM est choisi dans le groupe formé par Trichoderma, Aspergillus, Pénicillium et Schizophyllum, Clostridium, Pichia, Saccharomyces, Escherichia coli.
Le microorganisme MGM préféré est Trichoderma ou Pichia, et de préférence Trichoderma . Le procédé opère en batch , fed-batch ou en continu , et de préférence en continu.
L'hydrolyse a lieu à une température de 45-50°C, un pH de 4.5-5.5, avec une MS (Matière sèche) comprise entre 5% et 25% (MS du milieu réactionnel, y compris le substrat à traiter). L'invention peut opérer en mode SHF (Hydrolyse et fermentation séparées) ou SSF. L'invention s'applique particulièrement bien dans les procédés où l'hydrolyse enzymatique et la fermentation sont réalisées simultanément (procédé SSF), notamment lorsque la fermentation est réalisée en présence de la levure Saccharomyces cerevisiae .
En présence de levure, la température est comprise entre 30 et 37°C et la concentration de la levure est comprise entre 0,25 et 1 g/Kg.
Description détaillée de l'invention
Les souches industrielles utilisées dans l'unité principale appartiennent à l'espèce Trichoderma reesei. De préférence, elles ont été modifiées pour améliorer les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques par les procédés de mutation- sélection (mutagénèse aléatoire), comme par exemple la souche CL847 (brevet français FR-B-2555803).
Ces souches sont cultivées en fermenteurs agités et aérés dans des conditions compatibles avec leur croissance et la production des enzymes, selon les méthodes connues de l'homme du métier.
La conduite de la production d'enzymes par Trichoderma reesei non MGM est réalisée en deux étapes :
-une première étape de 30 à 50h en mode « batch » de 5 à 60 g/L de substrat carboné permettant de produire entre 2,5 et 30 g/L de biomasse cellulaire
-une étape en mode fed-batch de 100 à 200 h avec un flux limitant de source de carbone de 35 à 45 mg par gramme de biomasse et par heure
Les conditions sont telles que le pH est ajusté entre 3.5 et 6 et la température entre 20 et 35 °C. On choisira de préférence un pH de 4,8 et une température de 27°C durant la phase de croissance et un pH de 3.5 et une température de 25 °C durant la phase de production en mode fed-batch. La vvm (taux d'aération exprimé en volume d'air par volume de milieu réactionnel et par minute) appliquée durant le procédé est comprise entre 0.3 et 1.5 min-1 et la rpm (vitesse de rotation) doit permettre de réguler la pression en oxygène entre 20% et 60% . On choisira de préférence une aération de 0.4 à 1 et de préférence voisine de 0.5 min-1 et une agitation permettant de réguler la pression en oxygène de 25% à 40% et de préférence voisine de 30 % (%d'oxygène dissous par rapport à la saturation.
La source de carbone principale (présente pour la croissance du champignon et la production d'enzymes) est un sucre (tel que le glucose, le lactose ou le xylose) utilisé tel que (un sucre soluble industriel par ex) ou il peut être présent dans une matière ou être issu du traitement d'une matière (résidu d'hydrolyse de biomasse). Cette source de carbone pourra être utilisée également par les souches améliorées génétiquement.
Ce peut être par exemple un extrait de la fraction hémicellulosique sous forme de monomères provenant de la biomasse prétraitée. Une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement par hydrolyse acide ou explosion à la vapeur après imprégnation à l'H2S04 peut être utilisée pour la phase de production. Avantageusement, elle est en mélange avec d'autres substrats carbonés. Dans le cas où les substrats carbonés utilisés sont le lactose ou le glucose, ils seront dissous dans cette solution. Celle-ci aura une concentration de 200 à 600 g/L selon le degré de solubilité des substrats carbonés utilisés.
Ce peut être aussi un marc (résidu solide) provenant du prétraitement de la biomasse qui contient de la cellulose.
Un substrat inducteur, le plus souvent le lactose, est ajouté pour la production d'enzymes. Le marc décrit précédemment peut aussi être utilisé aussi comme source de carbone totale, c'est- à-dire pour la croissance du microorganisme et l'induction de la production de protéines.
Selon sa nature, le substrat carboné choisi pour l'obtention de la biomasse est introduit dans le fermenteur avant stérilisation ou est stérilisé séparément et introduit dans le fermenteur après stérilisation. La source inductrice peut ne pas être ajoutée dans cette phase mais ultérieurement.
A l'issue de l'unité de production , il est obtenu un flux de Trichoderma reesei non MGM avec ses enzymes produites. Ce flux peut être utilisé tel que de préférence. Il peut aussi subir une séparation partielle, du champignon.
Le microorganisme MGM est choisi parmi les champignons cellulolytiques ou d'autres microorganismes modifiés (levures, bactéries). De façon préférée, le microorganisme cellulolytique appartient aux genres Trichoderma, Aspergillus, Pénicillium, Schizophyllum, Pichia , Saccharomyces, E. coli,... ou il est choisi parmi les bactéries anaérobies appartenant par exemple au genre Clostridium. De préférence , le microorganisme MGM est Trichoderma ou Pichia.
Le choix du microorganisme MGM se porte sur ceux qui produisent des enzymes (glycosides hydrolases et notamment cellulases et hémicellulases) adaptées à l'hydrolyse de la cellulose et des hémicelluloses.
La conduite de la production d'enzymes par le microorganisme MGM, et notamment Pichia et Trichoderma , est réalisée dans les conditions connues de l'homme du métier et fonction des souches utilisées de façon à maximiser le rendement de production des enzymes auxiliaires. La conduite de la production d'enzymes par la souche de Trichoderma MGM est réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites pour la souche de Trichoderma non MGM.
A la fin de l'expérience les enzymes sont séparées du moût par les technologies de séparation connues de l'homme du métier. Un autre moyen préféré est une centrifugation et/ou une microfiltration (filtre de 0,8μιη par ex).
Les enzymes sont ensuite avantageusement concentrées par ultrafiltration.
Tous les moûts MGM (champignons récupérés lors des étapes de séparation) peuvent être ensuite détruits par exemple par ajout de NaOH à 0,2 mol/L et chauffage à 80°C pendant une heure. On vérifiera par étalement sur milieu PDA et incubation durant 72h à 30°C l'absence de croissance de ces microorganismes.
Il est ainsi obtenu d'une part un flux de Trichoderma reesei non MGM avec ses enzymes produites et d'autre part un flux d'enzymes produites par le microorganisme MGM et séparées dudit microorganisme.
Ces flux peuvent être combinés (cocktail enzymatique) pour l'hydrolyse enzymatique.
Ils peuvent être envoyés séparément à l'hydrolyse enzymatique. Les introductions ou ajouts en hydrolyse enzymatique peuvent être faits en continu.
De préférence, ils sont faits périodiquement. Ceci présente l'avantage de mieux contrôler l'activité enzymatique en adaptant éventuellement les quantités ajoutées.
L'alimentation séparée avec contrôle du débit d'au moins un flux permet d'apporter une flexibilité importante et un contrôle fin de l'activité enzymatique.
Avantageusement, les flux sont le plus concentrés possible en enzymes pour éviter un effet de dilution. L'hydrolyse enzymatique a lieu avec une proportion de 1% à 20% d'enzymes sécrétées par le microorganisme MGM par rapport à la quantité totale d'enzymes. On entend par quantité totale d'enzymes, la quantité de champignon Trichoderma reesei non MGM avec ses enzymes produites plus la quantité d'enzymes produites par le microorganisme MGM qui sont ajoutées, les quantités étant exprimées en MS (matière sèche).
De préférence, la quantité totale d'enzymes est comprise entre 1 et 50mg/g de MS dans le milieu réactionnel, de façon encore plus préféré de 10 à 20mg/g et encore plus avantageusement de 5 à 30mg/g. L'hydrolyse enzymatique est réalisée dans les conditions connues de l'homme du métier.
Généralement, l'hydrolyse a lieu à une température de 45-50°C un pH de 4.5-5.5, avec une MS (Matière sèche) comprise entre 5% et 25%.
L'hydrolyse peut être conduite simultanément avec la fermentation (SSF). De façon avantageuse, la levure est ajoutée en même temps que les enzymes (issues du microorganisme MGM) dans le même réacteur. Une autre façon préférée est d'ajouter la levure après le démarrage de l'hydrolyse ; ainsi les produits de l'hydrolyse commencent à être présents dans le milieu et peuvent être fermentés. En présence de levure, la température est alors abaissée entre 30 et 37°C , de préférence 33-37°C, et la levure est ajoutée à une concentration généralement comprise entre 0,25 et 1 g/Kg. La biomasse ligno-cellulosique à traiter a été avantageusement prétraitée de façon à améliorer l'accessibilité de la cellulose aux enzymes. De tels procédés de prétraitement sont connus. Un procédé préféré est l'explosion à la vapeur en condition acide.
L'hydrolyse enzymatique est conduite en mode SHF c'est-à-dire séparément de la fermentation (2 unités séparées) ou en mode SSF c'est-à-dire simultanément à la fermentation (1 unité). De préférence, on opère en mode SSF, qui est plus économique et limite les contaminations.
La proportion selon l'invention permet de maintenir une activité enzymatique suffisante. En effet, on a pu constater que si la présence de beta-glucosidase permet d'élever l'activité en hydrolyse enzymatique, elle réduit par contre le rendement de la fermentation dans certains cas.
L'invention permet de conduire le procédé en mode SSF. D'une part , les levures utilisées en fermentation (et en particulier Saccharomyces cerevisiae et Kluyveromyces) sont compatibles avec les enzymes sécrétées par les microorganismes ici décrits. D'autre part, la proportion des enzymes selon l'invention permet de maintenir un bon niveau d'hydrolyse enzymatique. Quel que soit le mode de conduite adopté (SSF ou SHF), l'invention permet d'améliorer notablement le rendement final de conversion de cellulose et d'hémicellulose par rapport aux procédés opérant sans enzymes provenant de microorganisme MGM.
Le milieu réactionnel d'hydrolyse enzymatique comprend donc la biomasse ligno-cellulosique, Trichoderma reesei non MGM, les enzymes sécrétées par Trichoderma reesei non MGM et les enzymes sécrétées par le microorganisme génétiquement modifié (MGM) et séparées dudit microorganisme.
Le procédé peut opérer en batch, fed-batch ou continu. On ajoute au milieu réactionnel les enzymes sécrétées par au moins un microorganisme génétiquement modifié (MGM) et séparées dudit microorganisme. En début de réaction, le milieu réactionnel comprend comme flux d'enzymes , seulement le flux contenant Trichoderma reesei non MGM avec les enzymes sécrétées par Trichoderma reesei non MGM . On ajoute ensuite le flux des enzymes sécrétées par au moins un microorganisme génétiquement modifié et séparées duduit microorganisme. En mode continu, on peut opérer de la même façon, avec en plus un ajout périodique ou continu, et selon les besoins, du flux contenant Trichoderma reesei non MGM avec les enzymes sécrétées par Trichoderma reesei non MGM.
L'invention propose donc d'incorporer dans l'usine de production de biocarburant de deuxième génération, deux unités de production d'enzymes:
-une unité principale où un organisme non MGM est utilisé
-une unité secondaire où un organisme MGM est utilisé.
L'unité secondaire sera plus petite en taille que l'unité principale , généralement d'un facteur 5 à 10. Elle sera confinée du reste de l'usine de façon à pouvoir gérer les déchets MGM.
La figure 1 permet d'illustrer l'invention . La biomasse ligno-cellulosique est amenée par la conduite (1) dans le réacteur d'hydrolyse enzymatique (2). Cette biomasse a été avantageusement prétraitée .
Une unité de production d'enzymes par Trichoderma reesei non génétiquement modifié (non MGM) , dite unité principale (3) fournit au réacteur (2) un flux (4) dudit champignon et desdites enzymes. On a représenté des canalisations (3bis, 3ter) permettant d'ensemencer ladite unité avec le champignon et les substrats, nutriments... nécessaires. Éventuellement, une unité de séparation champignon/enzymes peut être placée après l'unité (3).
Dans une unité de production d'enzymes par un microorganisme génétiquement modifié (MGM), dite unité secondaire (5), est produit un flux (6) dudit microorganisme et desdites enzymes. On a représenté des canalisations (5bis, 5ter) permettant d'ensemencer ladite unité avec le microorganisme et les substrats, nutriments... nécessaires. Le réacteur de production devra être équipé de filtre d'air en sortie de 0.2μιη pour éviter la dissémination de spores dans l'environnement. Le flux (6) est envoyé dans une unité de séparation (7) pour séparer les enzymes dudit microorganisme MGM. Cette unité peut être une centrifugation et/ou une microfiltration (filtre 0,2μιη par ex) . De préférence , les enzymes (conduite 8) sont concentrées dans l'unité d'ultrafiltration (9).
Les enzymes sécrétées par le microorganisme génétiquement modifié (MGM) et séparées dudit microorganisme sont envoyées au réacteur (2) par la conduite (10).
Les conduites (4) et (10) d'introduction des enzymes sont munies d'un moyen de contrôle du débit qui peut être simplement une vanne , respectivement les vannes (11) et (12).
Lorsque le réacteur (2) opère en mode SSF, des levures sont introduites également, par une conduite supplémentaire non représentée. II sort du réacteur (2) un flux (13). Ce flux est l'hydrolysat contenant des sucres et notamment du glucose, lorsque le réacteur (2) opère en mode SHF. C'est un flux contenant de l'éthanol lorsque le réacteur (2) opère en mode SSF.
De l'unité de séparation (7), il sort également par la conduite (14) un moût du microorganisme MGM qui est traité selon la réglementation en vigueur. Par exemple, il est détruit dans une unité (15) de destruction du microorganisme MGM. Une technique connue de l'homme du métier est la destruction par ajout de NaOH avec chauffage à 80°C pendant une heure.
Exemples
L'exemple 1 montre qu'il est possible de réaliser une SSF enzymatique sans séparer les enzymes du moût de champignon.
L'exemple 2 montre le gain obtenu en terme d'efficacité de SSF en ajoutant 1/10 ème d'enzymes améliorées issues d'un MGM à un moût non MGM. Exemple 1 (non-conforme)
La production de cellulases est effectuée en bioréacteur agité mécaniquement avec la souche CL847. Le milieu minéral a la composition suivante : KOH 1,66 g./L, H3P04 85 % 2 mL/L, (NH4)2S04 2,8 g/L, MgS04, 7 H20 0,6 g/L, CaC12 0,6 g/L, MnS04 3,2 mg/L, ZnS04, 7 H20 2,8 mg/L, CoC12 10 4,0 mg/L, FeS04, 7 H20 10 mg/L, Corn Steep 1,2 g/L, anti-mousse 0,5 mL/L.
Le bioréacteur contenant le milieu minéral est stérilisé à 120 °C pendant 20 minutes , la source carbonée glucose est stérilisée à part à 120°C pendant 20 minutes puis ajoutée stérilement dans le bioréacteur de façon à avoir une concentration finale de 30 g/L. Le bioréacteur est ensemencé à 10% (v/v) avec une préculture liquide de la souche de Trichoderma reesei CL847 (qui est non MGM). Le milieu minéral de la préculture, est identique à celui du bioréacteur mis à part l'addition de phtalate de potassium à 5 g.L-1 pour tamponner le pH. La croissance du champignon en préculture est faite en utilisant le glucose comme substrat carboné, à la concentration de 30 g/L. La croissance de l'inoculum dure de 2 à 3 jours et est effectuée à 28 °C dans un incubateur agité. Le transfert vers le bioréacteur est réalisé si la concentration résiduelle en glucose est inférieure à 15 g/L
L'expérience effectuée en bioréacteur comporte deux phases :
- Une phase de croissance sur substrat carboné glucose (concentration initiale = 30 g/L) à une température de 27 °C et un pH de 4,8 (régulé par de l'ammoniaque 5.5 M). L'aération est de 0,5 vvm et l'agitation est augmentée entre 200 et 800 rpm en fonction de la p02 (pression en oxygène dissous), qui est maintenue supérieure à 30 %.
-Une phase de production d'enzymes. Lorsque le substrat initial du fermenteur est épuisé et la solution de lactose à 250 g/L est injectée en continu au débit de 35 à 45 mg par g de cellules et par heure jusqu'à 164 heures. La température est baissé à 25 °C et le pH à 4 jusqu'à la fin de la culture. Le pH est régulé par addition d'une solution d'ammoniaque à 5.5 N qui apporte l'azote nécessaire à la synthèse des protéines excrétées. La teneur en oxygène dissous est maintenue au-dessus de 15 à 20 % par action sur l'aération et l'agitation.
La production d'enzymes est suivie par le dosage des protéines extracellulaires par la méthode de Lowry et standard BSA, après séparation du mycélium par filtration ou de cellules formées). La concentration finale en protéines obtenue à l'exemple 1 est égale à 38 g/L. Le moût obtenu est séparé en deux:
un litre est transféré stérilement dans un récipient préalablement stérilisé . le reste de la culture est séparée par une série de filtrations frontales ( 2,7μηι, 0,8 μηι et 0,2μηι). Les enzymes obtenues sont donc débarrassées de toute trace de champignon par une filtration finale stérilisante. Les deux solutions obtenues sont utilisées pour réaliser une SSF (hydrolyse et fermentation séparées) sur une paille de blé prétraitée par explosion à la vapeur en conditions acide. Les SSF sont réalisées en duplicate à 10% de MS et 10 mg d'enzymes par g de MS. La température est de 37 °C et la levure est ajoutée à lg par kg de produit. Le milieu est tamponné à 4,8 grâce à du tampon acétate 50mM.
Les cinétiques de SSF sont représentées sur la figure 1.
On voit qu'il n'y a pas d'écart significatif entre les enzymes séparées et les enzymes non séparées du moût. Exemple 2 (conforme): ajout d'enzymes améliorées produites par un MGM
Pour l'exemple 2 une souche génétiquement modifiée (lOOBl l issue de la CL847 dont la préparation est décrite dans les exemples de WO-2010/29259) est utilisée pour produire un cocktail enzymatique amélioré en activité xylanases et β-glucosidase.
Les enzymes sont produites dans les mêmes conditions que l'exemple 1 avec un filtre de 0,2 μιη en sortie du fermenteur. Une concentration finale en protéine de 30 g/L est obtenue. Les enzymes sont séparées par une série de filtrations frontales avec une filtration finale à 0,2μιη. Le moût de champignon est détruit par ajout de NaOH à 0,2 mol/L (concentration finale) et chauffage à 80°C pendant lh. Deux SSF comparatives sont réalisés:
une SSF témoin à 10 mg d'enzymes par gramme de MS: 9 mg/ g de MS (moût +enzymes de l'exemple 1) + lmg /g de MS d'enzymes séparées issues de l'exemple 1) Les enzymes utilisées sont toutes issues de l'exemple 1 produites par la CL847.
une SSF à 10 mg d'enzymes par gramme de MS: 9 mg/ g de MS (moût +enzymes) issues de l'exemplel + lmg /g de MS d'enzymes séparées issues de l'exemple2
Les résultats sont montrés figure 2.
Il a suffit d'ajouter 10% (par rapport à la quantité totale d'enzymes) d'enzymes issues de la souche génétiquement modifiée (issue de la CL847) pour augmenter les performances des enzymes produites par le microorganisme non MGM.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'hydrolyse enzymatique de matériaux ligno-cellulosiques, dans lequel le milieu réactionnel comprend un mélange de champignon Trichoderma reesei non génétiquement modifié (non MGM) et des enzymes qu'il sécrète, complémenté d'enzymes purifiées sécrétées par au moins un microorganisme génétiquement modifié (MGM) , lesdites enzymes ayant été séparées dudit micro-organisme MGM, et la proportion desdites enzymes sécrétées par le micro-organisme MGM et séparées dudit micro-organisme est de 1% à 20% par rapport à la quantité totale d'enzymes.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le microorganisme MGM est choisi dans le groupe formé par Trichoderma, Aspergillus, Pénicillium et Schizophyllum, Clostridium, Pichia, Saccahromyces, Escherichia coll. 3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le microorganisme MGM est Trichoderma ou Pichia.
4. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel le procédé opère en batch , fed-batch ou en continu , et de préférence en continu.
5. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel l'hydrolyse ayant lieu à une température de 45-50°C, un pH de 4.5-5.5, avec une MS (Matière sèche) comprise entre 5% et 25% . ô.Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel l'hydrolyse enzymatique et la fermentation sont réalisées simultanément (procédé SSF).
7. Procédé selon la revendication 6 dans lequel la fermentation est réalisée en présence de la levure Saccharomyces cerevisiae.
8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7 dans lequel , en présence de levure, la température est comprise entre 30 et 37°C et la concentration de la levure est comprise entre 0,25 et 1 g/Kg.
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