JP2019510500A - 前処理されたリグノセルロース系搾汁残渣によってセルラーゼを生産するための方法 - Google Patents
前処理されたリグノセルロース系搾汁残渣によってセルラーゼを生産するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
− 25〜30℃の温度および4〜5.5のpHにおいて、10および90g/Lの間の濃度の少なくとも1つの炭素質増殖基質の存在下における閉鎖型反応器内でのセルロース分解微生物の増殖段階a)
− 25〜27℃の温度および4〜5のpHにおいて少なくとも1つの誘導物質性炭素質基質が添加される酵素生産段階b)
を含み、
この方法において、前記誘導物質性基質は、リグノセルロース系材料の前処理プロセスから得られる前処理された搾汁残渣であり、これは酵素的加水分解を受けておらずかつ流加または連続モードで添加され、これは具体的な特徴:試験において80%を超える加水分解収率と試験において測定される10s−1のせん断速度での1Pa.s未満の見かけ粘度とを有する。
Description
− リグノセルロース系材料の生化学的変換のための前記プロセスへの外部起源の炭素質基質の供給を減少またはさらには除外する。
− 閉鎖型反応器内での少なくとも1つの炭素質増殖基質の存在下における前記微生物の増殖段階a)。前記増殖段階は10および90g/lの間の炭素質増殖基質の濃度において行われる。前処理された搾汁残渣はこの段階では導入されない。このようにして前記微生物の培養物が得られる。
− 25〜30℃の間の温度および4から5.5のpHにおける10および90g/lの間の濃度の少なくとも1つの炭素質増殖基質の存在下での、閉鎖型反応器内におけるセルロース分解微生物の増殖段階a)、
− 少なくとも1つの誘導物質性炭素質基質が25〜27℃の温度および4〜5のpHにおいて導入される酵素生産段階b)、
を含み、
このプロセスにおいて、
− 前記誘導物質性基質はリグノセルロース系材料の前処理プロセスから得られる前処理された搾汁残渣であり、前記搾汁残渣は酵素的加水分解を受けておらず、流加または連続モードで導入され、
− 前記搾汁残渣は96h後に少なくとも80%の酵素的加水分解収率を示し、前記加水分解は、前記搾汁残渣に対して、50℃およびpH4.8において15wt.%の乾燥物重量(DM)でDMのグラムあたり10mgのCELLIC(登録商標)CTEC2酵素によって実施され、前記収率は、前処理からもたらされる全てのセルロース、ヘミセルロース、およびオリゴマーが加水分解された場合に得られるであろう理論上の最大質量によって除算された、酵素的加水分解によって遊離した単純な糖の質量の比率であり、
− 室温において10wt.%のDMで懸濁された前記前処理された搾汁残渣は、10s−1のせん断速度において1Pa.s未満、好ましくは0.15Pa.s未満の見かけ粘度を有し、
− 前記搾汁残渣は、連続モードでは培地のリットルあたりかつ時間あたり0.3および0.8グラムの間のDMの速度で導入され;流加モードでは、f時間毎に追加される搾汁残渣の量は培地のリットルあたり0.3fおよび0.8fグラムの間の乾燥物重量であり、fは0.5hおよび48hの間である。
段階a)
本発明に従って酵素カクテルを生産するためのプロセスに用いられる微生物は、Trichoderma、Aspergillus、Penicillium、またはSchizophyllum属に属する菌類の株であり、好ましくはTrichoderma reesei種に属する。最も有効な工業株は例えば株CL847(仏国特許FR−2555803)などのTrichoderma reesei種に属する株であり、酵素カクテルを改善するように変異−選択プロセスによって改変されている。遺伝子組み換え技術によって改善された株もまた用いられ得る。それらの株は、それらの増殖および酵素の生産と適合性の条件下において通気撹拌反応器内で培養される。いくつもの改善された株、例えばMCG77(Gallo−米国特許4275167)、MCG80(Allen, AL and Andreotti, RE, Biotechnol-Bioengi 1982 12, 451-459 1982)、RUT C30(Montenecourt, BS and Eveleigh, DE, Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782)、およびCL847(Durand et al, 1984 Proc.SFM Symposium "Genetics of Industrial Microorganisms", Paris, HESLOT H. Ed, pp 39-50)が公知である。
段階b)
本発明に従うと、前記生産段階b)に用いられる前記誘導物質性炭素質基質は有利には前処理された搾汁残渣である。
− 15%の乾燥物重量(DM)になされた前記搾汁残渣のサンプルによって、DMのグラムあたり10mgのCELLIC(登録商標)CTEC2酵素(ノボザイムズによって市販されている)によって50℃およびpH4.8で行われる酵素的加水分解試験においては、96時間後に、加水分解収率は80%を超える。加水分解収率は、前処理からもたらされる全てのセルロース、ヘミセルロース、およびオリゴマーが加水分解された場合に得られるであろう理論上の最大質量によって除算された、酵素的加水分解によって遊離した単純な糖(例えばグルコース、キシロース)の質量の比率であり、
− 粘度試験においては、10%DMを有する懸濁液中において、前処理された搾汁残渣は10s−1のせん断速度では1Pa.s未満、好ましくは0.15Pa.s未満の見かけ粘度を有する。測定は、TAインスツルメントからのAR2000レオメーターによって、螺旋帯型の幾何学によって、記事"Experimental guidelines to optimize two crucial steps of lignocellulosic bioethanol production: a rheological approach" by Henault et al. 2014に記載されているように行われる。
実施例1:回分モードによる前処理された搾汁残渣の使用:全ての搾汁残渣は実験の始めに添加する。
− 2つの実験を10%DMで行った
− 2つの実験を20%DMで行った
セルラーゼの生産を機械振盪発酵器内で行う。ミネラル培地は次の組成を有する:KOH;1.66g/L、85%のH3PO4;2mL/L、(NH4)2SO4;2.8g/L、MgSO4・7H2O;0.6g/L、CaCl2;0.6g/L、MnSO4;3.2mg/L、ZnSO4・7H2O;2.8mg/L、CoCl2;4.0mg/L、FeSO4・7H2O;10mg/L、コーンスティープ;1.2g/L、消泡剤;0.5mL/L。
実施例2:流加モードによる実験
5つの実験を行った(実験1から5)。
− 12時間毎に培地のリットルあたり6gの搾汁残渣乾燥物重量(実験3、実験4、実験5)、
− または同じ頻度によるリットルあたり12gの乾燥物重量(実験1および実験2)
を添加することによって、24時間後に始まる。
− ススキ1は加水分解試験および粘度試験に合致する(10s−1における見かけ粘度は0.09Pa.sに等しい)(実験1および実験5)
− ススキ2は加水分解試験試験に合致しない(収率<70%)(実験2および実験3)
− 麦わら1は加水分解試験および粘度試験に合致する(10s−1における見かけ粘度は1.1Pa.sに等しい)(実験4)
加水分解試験および粘度試験は上に記載されているものである。
実験1: 搾汁残渣ススキ1 − 最適手順に2倍優る量の搾汁残渣による手順
実験2: 搾汁残渣ススキ2 − 最適手順に2倍優る量の搾汁残渣による手順
実験3: 搾汁残渣ススキ2 − いわゆる最適手順
実験4: 搾汁残渣麦わら1 − いわゆる最適手順
実験5: 搾汁残渣ススキ1 − いわゆる最適手順
実験3、4、または5に用いたセルラーゼの生産のためのいわゆる最適手順プロトコールは次の通りである:
15g/Lのグルコースによる回分モードでの24時間の増殖段階後に、ススキ搾汁残渣の添加が、約12時間毎に培地のリットルあたり6gの乾燥物重量の添加によってなされた。120h後に、添加の頻度をCO2シグナルに応じて調節した。
Claims (14)
- セルロース分解酵素またはヘミセルロース分解酵素を生産するための方法であって:
− 25〜30℃の温度および4〜5.5のpHにおいて、10および90g/lの間の濃度の少なくとも1つの炭素質増殖基質の存在下における閉鎖型反応器内でのセルロース分解微生物の増殖段階a)、
− 25〜27℃の温度および4〜5のpHにおいて少なくとも1つの誘導物質性炭素質基質が導入される酵素生産段階b)、
を含み、
この方法において、
− 前記誘導物質性基質はリグノセルロース系材料の前処理プロセスから得られる前処理された搾汁残渣であり、前記搾汁残渣は酵素的加水分解を受けておらず、流加または連続モードで導入され、
− 前記搾汁残渣は、前記搾汁残渣に対して、50℃およびpH4.8において15wt.%の乾燥物重量(DM)で、DMのグラムあたり10mgのCELLIC(登録商標)CTEC2酵素によって行われる酵素的加水分解においては、96h後に少なくとも80%の酵素的加水分解収率を有するものであり、前記収率は、前処理からもたらされる全てのセルロース、ヘミセルロース、およびオリゴマーが加水分解された場合に得られるであろう理論上の最大質量によって除算された、酵素的加水分解によって遊離した単純な糖の質量の比率であり、
− 室温において10wt.%のDMで懸濁された前記前処理された搾汁残渣は、10s−1のせん断速度において1Pa.s未満、好ましくは0.15Pa.s未満の見かけ粘度を有し、
− 前記搾汁残渣は、連続モードでは培地のリットルあたりかつ時間あたり0.3および0.8グラムの間のDMの速度で導入され;流加モードでは、f時間毎に添加される搾汁残渣の量は培地のリットルあたり0.3fおよび0.8fグラムの間の乾燥物重量であり、fは0.5hおよび48hの間である、
セルロース分解酵素またはヘミセルロース分解酵素を生産するための方法。 - ステップb)の培地の見かけ粘度が10s−1のせん断速度において10Pa.s未満、好ましくは1Pa・s未満のままである、請求項1に記載の方法。
- 前記搾汁残渣は導入される前に洗浄されている、請求項1または2に記載の方法。
- 前記搾汁残渣は導入される前に洗浄されていない、請求項1または2に記載の方法。
- 前記セルロース分解微生物がTrichoderma reesei種の菌類である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記前処理が酸性条件下における蒸煮爆砕である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 段階b)において、添加される糖の非存在下において操作される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記前処理された搾汁残渣が唯一の誘導物質性基質である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記前処理された搾汁残渣が液体および固体の形を成し、前記固体が20〜70%の乾燥物重量を含有し、その20〜50%がリグニンである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記前処理された搾汁残渣が液体および固体の形を成し、かつ、前記前処理された搾汁残渣の固体が30〜60wt.%のセルロースと1〜10wt.%のミネラル化合物およびヘミセルロースとを含有し、前記液体が30〜80wt.%の糖を含有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記搾汁残渣が添加される段階において、大気圧下の培地中の酸素飽和における溶存酸素の濃度pO2が30%超に維持される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記前処理された搾汁残渣が、リグノセルロース系バイオマス前処理ステップからもたらされる前処理された搾汁残渣の一部であり、前処理された搾汁残渣の別の一部は、前記酵素生産段階によって得られた酵素の存在下に行われる酵素的加水分解ステップに導入され、得られた加水分解物はエタノール発酵ステップに渡され、得られた流出液はエタノールを分離するために蒸留される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前処理された搾汁残渣の前記一部が直接的に段階b)に用いられる、請求項12に記載の方法。
- 前処理された搾汁残渣の前記一部中に含有される液体の一部または全てが分離され、得られた搾汁残渣が段階b)に導入される、請求項12または13に記載の方法。
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