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WO2015072580A1 - 細胞増殖促進または細胞障害抑制による角膜内皮治療薬 - Google Patents

細胞増殖促進または細胞障害抑制による角膜内皮治療薬 Download PDF

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WO2015072580A1
WO2015072580A1 PCT/JP2014/080831 JP2014080831W WO2015072580A1 WO 2015072580 A1 WO2015072580 A1 WO 2015072580A1 JP 2014080831 W JP2014080831 W JP 2014080831W WO 2015072580 A1 WO2015072580 A1 WO 2015072580A1
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WO
WIPO (PCT)
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μmol
corneal endothelial
map kinase
fluorophenyl
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/080831
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English (en)
French (fr)
Inventor
範子 小泉
直毅 奥村
木下　茂
Original Assignee
学校法人同志社
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Publication date
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Priority to EP14861468.8A priority patent/EP3069732B1/en
Priority to CA2928626A priority patent/CA2928626C/en
Priority to JP2015547822A priority patent/JP6730701B2/ja
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a technique and method for culturing corneal endothelial cells in a normal state, and a drug and a medium therefor.
  • Visual information is transmitted from the cornea, the transparent tissue on the foreground of the eyeball, to reach the retina and excite the neurons in the retina. To be recognized.
  • the cornea needs to be transparent.
  • the transparency of the cornea is maintained by keeping the water content constant by the pump function and the barrier function of corneal endothelial cells.
  • Human corneal endothelial cells exist at a density of about 3000 cells per square millimeter at birth, but do not have the ability to regenerate once damaged.
  • bullous keratopathy caused by corneal endothelial degeneration or corneal endothelial dysfunction due to various causes, the cornea becomes edema and turbidity, resulting in a significant loss of visual acuity.
  • full-thickness keratoplasty is performed in which all three layers of the corneal epithelium, parenchyma and endothelium are transplanted.
  • the cornea donation in Japan is insufficient, and the number of corneal transplants performed in Japan is about 1700 per year for about 2600 waiting patients for corneal transplantation.
  • the cornea is located in front of the eyeball and is a transparent tissue mainly having a three-layer structure of a corneal epithelial cell layer, a corneal stroma layer, and a corneal endothelial cell layer.
  • the corneal endothelial cell layer is a single cell layer present in the deep corneal layer, has a barrier function and a pump function, and plays a role of maintaining the transparency of the cornea by keeping the water content of the cornea constant.
  • Patent Document 1 is an outline of local therapy for diseases of the ocular surface.
  • Non-Patent Document 1 describes the effect of inhibitors on freezing treatment in p38 corneal endothelium.
  • Non-Patent Document 2 describes the effect of p38 MAP kinase on loss of barrier function in TNF ⁇ -induced corneal endothelium.
  • Non-Patent Documents 3 and 4 describe treatment methods for corneal epithelial cells using p38 kinase.
  • Non-Patent Document 5 describes the involvement of the p38 MAP kinase signal in the fibrotic wound repair process.
  • Non-Patent Document 6 describes the relationship between corneal endothelial cell migration and MAP kinase.
  • Non-Patent Document 7 describes the relationship between corneal endothelial injury and TGF ⁇ .
  • Non-Patent Document 8 describes the association with TGF ⁇ for regenerative healing for corneal wounds.
  • Non-Patent Document 9 describes the relationship between corneal endothelial cells and TGF ⁇ .
  • the present inventors have found that a p38 MAP kinase inhibitor can be used for the treatment or prevention of corneal endothelial injury requiring cell proliferation, and have completed the present invention. Therefore, the present invention typically provides the following.
  • the corneal endothelial disorder is at least one selected from the group consisting of Fuchs corneal endothelial dystrophy, sustained decrease in corneal endothelial density after corneal transplantation, trauma, ophthalmic surgery, aging, and corneal endotheliitis
  • the therapeutic or prophylactic agent according to item (1) wherein (3) The therapeutic or prophylactic agent according to item (1) or (2), wherein the p38 MAP kinase inhibitor is water-soluble.
  • the p38 MAP kinase inhibitor is 4- (4-fluorophenyl) -2- (4-hydroxyphenyl) -5- (4-pyridyl) -1H-imidazole (SB-202190), trans-4- [ 4- (4-Fluorophenyl) -5- (2-methoxy-4-pyrimidinyl) -1H-imidazol-1-yl] cyclohexanol (SB-239063), 4- (4-fluorophenyl) -2- (4 -Methylsulfinylphenyl) -5- (4-pyridyl) -1H-imidazole (SB-203580), 4- (4-fluorophenyl) -5- (2-methoxypyrimidin-4-yl) -1- (piperidine- 4-yl) imidazole (SB-242235), 4- (4-fluorophenyl) -2- (4-hydroxy-1-butynyl) -1 (3-
  • the p38 MAP kinase inhibitor includes 4- [4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -1H-imidazol-5-yl] pyridine) (SB203580) or a salt thereof.
  • the therapeutic or prophylactic agent according to any one of items (1) to (4).
  • the p38MAP kinase inhibitor includes 4- [4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -1H-imidazol-5-yl] pyridine) (SB203580) hydrochloride (1)
  • the therapeutic or prophylactic agent according to any one of (5) to (5).
  • a p38 MAP kinase inhibitor for the treatment or prevention of corneal endothelial injury requiring cell proliferation comprising a step of administering an effective amount of a p38 MAP kinase inhibitor to a subject in need thereof.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 analyzed the role of p38 MAP kinase in the corneal endothelium in special systems such as freezing treatment and loss of TNF ⁇ -induced barrier function, and also explained the effects of the inhibitors.
  • the effect on corneal endothelial dysfunction requiring cell proliferation such as a wound (trauma) could not be predicted.
  • the recovery of wounds and the like is extremely remarkable, and the healing effect is remarkable as compared with conventional pharmaceuticals, and it is understood that they are useful as eye drops.
  • FIG. 1 shows that p38MAP kinase signal inhibition suppresses cyclin-dependent kinase inhibitors and shifts the cell cycle of corneal endothelial cells.
  • Corneal endothelial cells cultured from research cornea imported from Seattle Eye Bank were cultured and used for the following studies.
  • SB203580 a p38 MAP kinase inhibitor
  • p27, p21, and p16 were all suppressed by adding SB203580 (A; p27, p21, p16, and GAPDH are shown in order from the top.
  • the left lane is control, the center is SB203580 10 ⁇ M, and the right lane is SB203580 30 ⁇ M).
  • p27, p21, and p16 have been reported to be cyclin-dependent kinase inhibitors that negatively regulate cell proliferation of corneal endothelial cells.
  • phosphorylation of Rb protein and expression of cyclins D1 and D3 as molecules involved in the transition of the G1 / S phase of the cell cycle were examined by Western blotting. When SB203580 was added, these were 12 hours and 24 hours later, respectively. (B; two stages from the top indicate phosphorylated Rb protein, cyclin D1, cyclin D3, and GAPDH.
  • the upper side indicates control and stimulation by the lower side SB203580 (10 ⁇ M).
  • SB203580 10 ⁇ M
  • SB203580 (C; phosphorylated p38, phosphorylated ATF2, GAPDH is shown, control from the left lane, SB203580 10 ⁇ M in the center, SB203580 30 ⁇ M in the right lane.
  • FIG. 2 shows that p38MAP kinase signal inhibition promotes cell proliferation of corneal endothelial cells.
  • the cultured human corneal endothelial cells were stimulated with SB203580, a p38 MAP kinase inhibitor, and immunostained with Ki67, a marker for cell proliferation, 3 days later.
  • FIG. 3 shows that p38 MAP kinase inhibitor instillation promotes wound healing in a rabbit partial corneal endothelial dysfunction model.
  • the SB203580 instillation group was smaller than the control (left panel photograph, each lower side).
  • the wound area was significantly reduced in the SB203580 instillation group (right graph, vertical axis indicates wound area (mm 2 ), right is DMSO (control), left Shows the results of stimulation with SB203580. * Indicates statistical significance at p ⁇ 0.01.), P38 MAP kinase signal inhibition was shown to promote corneal endothelium wound healing.
  • FIG. 4 shows that p38 MAP kinase inhibitor instillation promotes cell proliferation of corneal endothelial cells in a rabbit partial corneal endothelial dysfunction model.
  • the corneal tissue was immunostained with Ki67, which is a marker for cell proliferation (left photo; the left side in the photograph shows the control, the right side shows the SB203580 (10 mM) eye drop group, the right graph).
  • Ki67 positive cell ratios are shown for control (left) and SB203580 instillation (10 mM)).
  • Significantly more cells expressed Ki67 by instillation with SB203580 was shown that inhibition of p38 MAP kinase signal promotes cell proliferation of corneal endothelial cells in vivo.
  • FIG. 5 shows that p38 MAP kinase signal inhibition suppresses cell density reduction due to cell hypertrophy occurring in the culture environment.
  • corneal endothelial cells have a decrease in cell density of about 0.5% per year with aging.
  • cell density is reduced by various corneal endothelial diseases.
  • Cell culturing also causes cell aging-like reduction, similar to the living body, such as cell enlargement and density reduction as in the living body.
  • the effect of p38 MAP kinase signal inhibition on the decrease in corneal endothelial cell density which is a decrease in cell senescence, was examined.
  • FIG. 6 shows that p38 MAP kinase signal inhibition maintains pump and barrier functions and inhibits cell density reduction due to culture.
  • the cultured human corneal endothelial cells were stimulated at various concentrations using SB203580, a p38 MAP kinase inhibitor, and 20 days later, Na + / K + ⁇ was used as a marker for the pump function and the barrier function that are functions of the corneal endothelial cells.
  • ATPase and ZO-1 immunostaining was performed (left: Na + / K + -ATPase, right:.
  • FIG. 7 shows the result indicating that p38MAP kinase signal inhibition suppresses cytokines produced by corneal endothelial cells.
  • Reference Spot indicates a reference spot.
  • GROa, sICAM-1, IL-6, IL-8, IL-23, MCP-1, MIF, and SerpinE1 indicate spots of respective markers.
  • FIG. 8 shows that p38MAP kinase signal inhibition suppresses IL-6 produced by corneal endothelial cells. It was shown by PCR method (left) and ELISA (right) that IL-6 production was reduced by adding SB203580 and culturing compared to control.
  • the left lane shows control
  • the right lane shows SB203580
  • the upper row shows IL-6
  • the lower row shows GAPDH as a control.
  • the graph in the right column shows DMSO as a control from the left
  • the right shows SB203580.
  • the y-axis shows IL-6 production (pg / mL).
  • FIG. 9 shows that p38 MAP kinase signal inhibition suppresses corneal endothelium cell death.
  • the upper left is the control upper right shows SB203580
  • the lower left shows only UV irradiation
  • the lower right shows the result of combining SB203580 with UV irradiation.
  • the graph on the left shows the results of UV irradiation and treatment with SB203580, respectively.
  • the y-axis indicates the number of cells (% with respect to control). ** indicates statistical significance at p ⁇ 0.05.
  • cultured human corneal endothelial cells were stimulated with 100 J / m 2 of ultraviolet light (UV) to induce cell death, and the effect of SB203580 was examined.
  • the phase contrast micrograph (left) is 9 hours after UV irradiation.
  • On the right is a graph 12 hours after UV irradiation, expressed as a ratio of viable cell count to control.
  • FIG. 10 shows that p38 MAP kinase signal inhibition suppresses apoptosis upon UV stimulation of the corneal endothelium. Both left and right are Western blot results. Each lane shows the difference with and without UV irradiation and SB203580, and shows caspase 3, PARP, GAPDH from the upper panel.
  • the right panel also shows the difference between UV irradiation and the presence or absence of SB203580, and shows H2AX and GAPDH from the upper panel.
  • the left shows that SB203580 suppresses activation by cleavage of caspase 3 and PARP, which are molecules that undergo apoptosis by UV irradiation.
  • the right shows that the expression of phosphorylated histone H2AX induced by double-strand breakage of DNA by UV irradiation is suppressed by SB203580.
  • FIG. 11 shows that SB203580, a p38 MAPK inhibitor, promotes proliferation of cultured corneal endothelial cells. BrdU incorporation is shown as a percentage of control (y axis).
  • the x-axis shows, from the left, the control (without SB203580 added), final concentrations 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, 100 ⁇ M. * Indicates p ⁇ 0.01.
  • FIG. 12 shows that semapimod, a p38 MAPK inhibitor, promotes the growth of cultured corneal endothelial cells. BrdU incorporation is shown as a percentage of control (y axis).
  • the x-axis shows, from the left, the control (without Semapomod addition), final concentrations of 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M. * Indicates p ⁇ 0.01.
  • FIG. 12 shows that semapimod, a p38 MAPK inhibitor, promotes the growth of cultured corneal endothelial cells. BrdU incorporation is shown as a percentage of control (y axis).
  • the x-axis shows, from
  • FIG. 13 shows that BIRB796, a p38 MAPK inhibitor, promotes proliferation of cultured corneal endothelial cells.
  • BrdU incorporation is shown as a percentage of control (y axis).
  • the x-axis shows, from the left, the control (without BIRB796 added), final concentrations of 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, 100 ⁇ M. * Indicates p ⁇ 0.01.
  • FIG. 14 shows that PH-79804, a p38 MAPK inhibitor, promotes proliferation of cultured corneal endothelial cells. BrdU incorporation is shown as a percentage of control (y axis).
  • the x-axis shows, from the left, the control (without BIRB796 addition), final concentrations of 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M. * Indicates p ⁇ 0.01.
  • FIG. 15 shows that VX-702, a p38 MAPK inhibitor, promotes proliferation of cultured corneal endothelial cells. BrdU incorporation is shown as a percentage of control (y axis).
  • the x-axis shows, from the left, the control (without BIRB796 added), final concentrations of 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, 100 ⁇ M.
  • FIG. 16 shows that LY2288820, a p38 MAPK inhibitor, promotes proliferation of cultured corneal endothelial cells. BrdU incorporation is shown as a percentage of control (y axis). The x-axis shows, from the left, the control (without BIRB796 addition), final concentrations of 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M. * Indicates p ⁇ 0.01.
  • FIG. 17 shows that TAK-715, a p38 MAPK inhibitor, promotes proliferation of cultured corneal endothelial cells. BrdU incorporation is shown as a percentage of control (y axis).
  • the x-axis shows, from the left, the control (without BIRB796 added), final concentrations of 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, 100 ⁇ M. * Indicates p ⁇ 0.01.
  • FIG. 18 shows that p38 MAPK inhibitors promote the growth of cultured monkey corneal endothelial cells. BrdU incorporation is shown as a percentage of control (y axis).
  • the x-axis shows, from the left, control (DMSO 1/1000, no drug added), SB203580 10 ⁇ M, Semapimod 1 ⁇ M, BIRB796 3 ⁇ M, PH-798041 ⁇ M, VX-702 3 ⁇ M, LY2288820 3 ⁇ M, TAK-715 3 ⁇ M. * Indicates p ⁇ 0.01.
  • FIG. 19 shows that p38 MAPK inhibitors promote the growth of cultured human corneal endothelial cells. BrdU incorporation is shown as a percentage of control (y axis).
  • the x-axis shows, from the left, control (DMSO 1/1000, no drug added), SB203580 10 ⁇ M, Semapimod 1 ⁇ M, BIRB796 3 ⁇ M, PH-798041 ⁇ M, VX-702 3 ⁇ M, LY2288820 3 ⁇ M, TAK-715 3 ⁇ M. * Indicates p ⁇ 0.01.
  • FIG. 20 shows that activation of p38 MAPK induces apoptosis.
  • the left panel is a photograph in which cell morphology was observed under a phase contrast microscope (after 9 hours).
  • the control anisomycin group, anisomycin and Z-VAD-FMK group are shown from the top.
  • FIG. 21 shows that SB203580 eye drops promote proliferation of primate corneal endothelium. Growth promotion was confirmed by immunostaining.
  • the upper row shows the control, and the lower row shows SB203580 (3 mM).
  • FIG. 22 shows that SB203580 eye drops promote proliferation of primate corneal endothelium.
  • the percentage of Ki67 positive cells in the control (left) and SB203580 (right) is shown (y axis).
  • Ki67 positive cells were found to be significantly larger in the eyes instilled with SB203580. ** indicates p ⁇ 0.01.
  • FIG. 23 shows that p38 MAPK inhibitors suppress cell death of cultured corneal endothelial cells.
  • Upper row shows staining with control (DMSO only added), UV (100 J / m 2 ), Z-VAD, and middle row shows SB203580, BIRB796, PH-79804 from the left.
  • the lower row shows VX-702, LY2288820, and TAK-715 from the left.
  • the concentrations used were 10 ⁇ M for SB203580, 1 ⁇ M for Semapimod, 3 ⁇ M for BIRB796, 1 ⁇ M for PH-79804, 3 ⁇ M for VX-702, 3 ⁇ M for LY2288820, and 3 ⁇ M for TAK-715, all using cell damage caused by UV Of p38 MAPK inhibitors.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 24 shows that p38 MAPK inhibitors suppress apoptosis of cultured corneal endothelial cells.
  • Upper row shows staining with control (DMSO only added), UV (100 J / m 2 ), Z-VAD, and middle row shows SB203580, BIRB796, PH-79804 from the left.
  • the lower row shows VX-702, LY2288820, and TAK-715 from the left.
  • Green staining indicates annexin V and blue staining indicates DAPI staining.
  • UV-induced apoptosis was suppressed by all p38 MAPK inhibitors used.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 25 shows that p38 MAPK inhibitors suppress corneal endothelium apoptosis.
  • the concentrations used were 10 ⁇ M for SB203580, 1 ⁇ M for Semapimod, 3 ⁇ M for BIRB796, 1 ⁇ M for PH-799804, 3 ⁇ M for VX-702, 3 ⁇ M for LY2288820, and 3 ⁇ M for TAK-715, respectively.
  • UV-induced apoptosis was suppressed by all p38 MAPK inhibitors used.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 26 shows that p38 MAPK inhibitors suppress corneal endothelium apoptosis. The percentage of annexin V positive cells is shown.
  • UV irradiation SB203580, BIRB796, PH-707804, VX-702, LY2288820, and TAK715 are shown.
  • the test is a Dunnett test, and * indicates p ⁇ 0.05.
  • MAP kinase is an enzyme that phosphorylates mitogen-activating protein (MAP) and is a family of serine / threonine kinases.
  • MAP kinases are a group of protein serine / threonine kinases that are activated in response to various extracellular stimuli and mediate signal transduction from the cell surface to the nucleus.
  • MAP kinase also called extracellular signal-regulated protein kinases or ERK, is a terminal enzyme of the 3-kinase cascade.
  • the standard MAP kinase module consists of three protein kinases. That is, a MAP kinase kinase (or MEKK) activates a MAP kinase kinase (or MEK), which in turn activates a MAPK / ERK enzyme.
  • the MAPK / ERK, JNK (c-jun amino terminal protein kinase (or SAPK)), and p38 cascade are composed of three enzyme modules, including MEKK, MEK and ERK, or MAP kinase superfamily members, respectively.
  • Various extracellular signals when associated with their respective cell surface receptors, trigger an early event that is then transmitted inside the cell where it activates the appropriate cascade.
  • MAP kinase is a mitogen-activated protein kinase (or ERK) superfamily and has a TXY consensus sequence in the catalytic core.
  • ERK1 / 2, p38HOG, and JNK / SAPK are related but distinct terminal enzymes in the parallel pathway.
  • Sebolt-Leopold et al. Nat. Med. , 5 (7): 810-6 (Jul, 1999) describes an in vitro cascade assay system for identifying small molecule inhibitors of the MAP kinase (MAPK) pathway.
  • Glutathione-S-transferase (GST) -MEK1 and GST-MAPK fusion proteins were prepared from bacterial cells and sequentially in this assay system to MEK1 MAPK and MBP (myelin basic protein). Used for phosphorylation.
  • PD184352 [2- (2-Chloro-4-iodo-phenylamino) -N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluoro-benzamide], which directly inhibits MEK1, has also been found.
  • p38 MAP kinase inhibitor refers to any drug that inhibits MAP kinase signaling related to p38.
  • p38 MAP kinase inhibitors relate to compounds that target, decrease or inhibit p38-MAP kinase, a MAP kinase family member.
  • the p38 MAP kinase inhibitor is preferably water-soluble. This is because if it is not water-soluble, it may be necessary to use a solvent that is not compatible with the body. Whether it is water-soluble or not can be classified based on the pharmacopoeia solubility definition.
  • water-soluble means that any water-soluble one can be used as long as it dissolves an effective amount when water is used as a solvent.
  • 4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -5- (4-pyridyl) -1H-imidazole (SB-203580) is soluble in methanol but in water. Is difficult to dissolve, and the hydrochloride of 4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -5- (4-pyridyl) -1H-imidazole (SB-203580) It is considered soluble and classified as water soluble.
  • P38 is a mammalian MAP kinase superfamily member and is activated by stress, ultraviolet light, and inflammatory cytokines.
  • the catalyst core has a TGY consensus sequence.
  • dysregulated kinases are a major etiology in many diseases, particularly proliferative and inflammatory disorders.
  • One of the oncogenes first identified in the oncology area was for epidermal growth factor receptor kinase (EGFR), but its overexpression is associated with lung, breast, brain, prostate, GI and ovarian cancer.
  • EGFR epidermal growth factor receptor kinase
  • constitutive activation of MAP kinase is associated with primary tumors from many cancer cell lines (pancreas, colon, lung, ovary, and kidney) and various human organs (kidney, colon, and lung) ( Hoshino et al., Oncogene, 18 (3): 813-22 (Jan. 1999)).
  • p38 MAP kinase regulates the production of two cytokines, TNF ⁇ and IL-1, associated with the onset and progression of inflammation.
  • the p38 MAP kinase inhibitor that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a compound having p38 MAP kinase inhibitory activity in addition to VX-745 (Vertex Pharmaceuticals Inc.), for example, JP-A-2002-97189, JP 2000-503304, JP 2001-522357, JP 2003-535023, JP 2001-506266, JP 9-508123, WO 01/56553, International Publication No. 93/14081, International Publication No. 01/35959, International Publication No. 03/68229, International Publication No. 03/85859, Special Publication 2002-534468, Special Publication 2001-526222 , Special Table 2001-52622 No. 6, U.S. Pat. No.
  • SB202190 [4- (4-fluorophenyl) -5- (4-pyridinyl) -lH-imidazol-2-yl] phenol
  • SB202190 is a highly selective, potent and cell-permeable p38 MAP. It is a kinase inhibitor (SmithKline Beecham, plc) (Jiangget al., J. Biol. Chem, 271: 17920 (1996); Frantzet al., Biochemistry, 37: 138-46 (1998); Nemoto et al.
  • Anisomycin ((2R, 3S, 4S) -2-[(4-methoxyphenyl) methyl] -3,4-pyrrolidinediol-3-acetate) is a protein synthesis inhibitor (blocks translation). It is a potent activator of stress activated protein kinases (JNK / SAPK) and p38 MAP kinase, homologous desensitization induced by the immediate early genes (c-fos, fosB, c-jun, junB, and junD) Acts as a powerful signaling agonist that selectively induces the product.
  • JNK / SAPK stress activated protein kinases
  • p38 MAP kinase homologous desensitization induced by the immediate early genes (c-fos, fosB, c-jun, junB, and junD) Acts as a powerful signaling agonist that selectively induces the product.
  • SB203580 (4- [5- (4-fluorophenyl) -2- [4- (methylsulfonyl) phenyl] -lH-imidazol-4-yl] pyridine) is a highly selective of p38 mitogen-activated protein kinase. Inhibitor (SmithKline Beecham, plc).
  • SB203580 hydrochloride (4- [5- (4-fluorophenyl) -2- [4- (methylsulfonyl) phenyl] -lH-imidazol-4-yl] pyridine) compound is a highly selective p38 mitogen activated It is a water-soluble salt of a protein kinase inhibitor. It has been shown to inhibit interleukin-2-induced T cell proliferation, cyclooxygenase-1 and -2, and thromboxane synthase.
  • U0126 (1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis [2-aminophenylthio] butadiene) is a potent and selective non-competitive inhibitor of MAP kinase kinase.
  • Preferred p38 MAP kinase inhibitors include, but are not limited to, SB203580 (4- [4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -1H-imidazol-5-yl] pyridine). .
  • p38 MAP kinase inhibitors that can be used in the present invention include, for example, neutralizing antibodies to p38 MAP kinase, compounds that inhibit the activity of p38 MAP kinase, and transcription of genes encoding p38 MAP kinase.
  • Compounds eg, antisense nucleic acids, RNAi, ribozymes), peptides, and plant components (eg, polyphenols, flavonoids, glycosides).
  • concentration used examples include about 50 nmol / l to 100 ⁇ mol / l, and usually about 0.001 to 100 ⁇ mol / l, preferably about 0.01 to 75 ⁇ mol / l, about 0.05 to 50 ⁇ mol / l, About 1 to 10 ⁇ mol / l, about 0.01 to 10 ⁇ mol / l, about 0.05 to 10 ⁇ mol / l, about 0.075 to 10 ⁇ mol / l, about 0.1 to 10 ⁇ mol / l, about 0.5 to 10 ⁇ mol / l 1, about 0.75 to 10 ⁇ mol / l, about 1.0 to 10 ⁇ mol / l, about 1.25 to 10 ⁇ mol / l, about 1.5 to 10 ⁇ mol / l, about 1.75 to 10 ⁇ mol / l, about 2.
  • ⁇ mol / l about 4.0 to 5.0 ⁇ mol / l, about 0.01 to 3.0 ⁇ mol / l, about 0.05 to 3.0 ⁇ mol / l, about 0.075 to 3.0 ⁇ mol / l, about 0 1 to 3.0 ⁇ mol / l, about 0.5 to 3.0 ⁇ mol / l, about 0.75 to 3.0 ⁇ mol / l, about 1.0 to 3.0 ⁇ mol / l, about 1.25 to 3.0 mol / l, about 1.5 to 3.0 ⁇ mol / l, about 1.75 to 3.0 ⁇ mol / l, about 2.0 to 3.0 ⁇ mol / l, about 0.01 to 1.0 ⁇ mol / l, about 0 .05-1.0 ⁇ mol / l, about 0.075-1.0 ⁇ mol / l, about 0.1-1.0 ⁇ mol / l, about 0.5-1.0 ⁇ mol / l, about 0.75-1.0 ⁇ mol /
  • the antisense nucleic acid used in the present invention may inhibit the expression and / or function of a gene (nucleic acid) encoding the above-mentioned P38 MAP kinase signal transduction pathway member or the like by any of the above-described actions.
  • a gene nucleic acid
  • an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the mRNA of the gene encoding the above-mentioned P38 MAP kinase or the like is designed, it is considered effective for inhibiting the translation of the gene.
  • a sequence complementary to the coding region or the 3 'untranslated region can also be used.
  • the nucleic acid containing the antisense sequence of the sequence of the untranslated region is included in the antisense nucleic acid used in the present invention.
  • the antisense nucleic acid used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 'side.
  • the nucleic acid thus prepared can be transformed into a desired animal (cell) using a known method.
  • the sequence of the antisense nucleic acid is preferably a sequence complementary to a gene encoding P38 MAP kinase or the like possessed by the animal (cell) to be transformed, or a part thereof, as long as the gene expression can be effectively suppressed. In, it does not have to be completely complementary.
  • the transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, most preferably 95% or more, to the transcript of the target gene.
  • the length of the antisense nucleic acid is preferably at least 12 bases and less than 25 bases, but the antisense nucleic acid of the present invention is not necessarily of this length.
  • the antisense nucleic acid may be composed only of DNA, but may contain nucleic acid other than DNA, for example, locked nucleic acid (LNA).
  • the antisense nucleic acid used in the present invention may be an LNA-containing antisense nucleic acid containing LNA at the 5 'end and LNA at the 3' end.
  • an antisense nucleic acid for example, Hirashima and Inoue, Shinsei Kagaku Kogaku Kenkyu 2 (Replication and Expression of Nucleic Acid IV Gene, edited by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin, 1993, 319-347.
  • An antisense sequence can be designed based on a nucleic acid sequence such as P38 MAP kinase.
  • ribozymes refers to an RNA molecule having catalytic activity. Although ribozymes have various activities, research focusing on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes that cleave RNA in a site-specific manner. Some ribozymes have a size of 400 nucleotides or more, such as group I intron type or M1 RNA contained in RNase P, but some have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type. (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, protein nucleic acid enzyme, 1990, 35, 2191.).
  • the self-cleaving domain of hammerhead ribozyme cleaves 3 ′ of C15 in the sequence G13U14C15, but base pairing between U14 and A9 is important for its activity, and instead of C15, A15 or U15 However, it has been shown that it can be cleaved (Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.).
  • a restriction enzyme-like RNA-cleaving ribozyme that recognizes the sequence UC, UU or UA in the target RNA can be created (Koizumi, M.
  • Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention.
  • This ribozyme is found, for example, in the minus strand of tobacco ring spot virus satellite RNA (Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.). It has been shown that target-specific RNA-cleaving ribozymes can also be produced from hairpin ribozymes (Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl. Acids Res, 1991, 19, 6751., Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology) , 1992, 30, 112.).
  • the expression of the gene can be inhibited by specifically cleaving the transcription product of the gene encoding P38 MAP kinase or the like using a ribozyme.
  • RNA interference RNA interference
  • RNAi RNA interference
  • siRNA short-chain dsRNA
  • siRNA is an RNA molecule having a double-stranded RNA portion consisting of 15 to 40 bases, cleaving the mRNA of a target gene having a sequence complementary to the antisense strand of the siRNA, It has a function of suppressing the expression of the target gene.
  • the siRNA in the present invention comprises a sense RNA strand comprising a sequence homologous to a continuous RNA sequence in mRNA such as P38 MAP kinase, and an antisense RNA strand comprising a sequence complementary to the sense RNA sequence. It is RNA containing the double stranded RNA part which becomes.
  • siRNAs and mutant siRNAs described below are within the skill of the artisan. It is within the scope of ordinary trials for those skilled in the art to select any continuous RNA region of mRNA that is a transcription product of a sequence such as P38 MAP kinase and to produce a double-stranded RNA corresponding to this region. It can be done as appropriate. In addition, selection of siRNA sequences having a stronger RNAi effect from mRNA sequences that are transcripts of the sequences can also be appropriately performed by those skilled in the art by known methods. If one strand is known, those skilled in the art can easily know the base sequence of the other strand (complementary strand). siRNA can be appropriately prepared by those skilled in the art using a commercially available nucleic acid synthesizer. In addition, for synthesis of a desired RNA, a general synthesis contract service can be used.
  • the length of the double-stranded RNA portion is 15 to 40 bases, preferably 15 to 30 bases, more preferably 15 to 25 bases, still more preferably 18 to 23 bases, and most preferably 19 to 21 bases as a base. . It is understood that these upper and lower limits are not limited to these specific ones and may be any combination of those listed.
  • the terminal structure of the sense strand or antisense strand of siRNA is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, it may have a blunt end or a protruding end (overhang) It is preferable that the 3 ′ end protrudes.
  • siRNA having an overhang consisting of several bases, preferably 1 to 3 bases, more preferably 2 bases, at the 3 ′ end of the sense RNA strand and the antisense RNA strand suppresses the expression of the target gene. In many cases, the effect is large, which is preferable.
  • the type of the overhanging base is not particularly limited, and may be either a base constituting RNA or a base constituting DNA.
  • Preferred overhang sequences include dTdT (deoxy T 2 bp) at the 3 'end.
  • preferred siRNAs include, but are not limited to, those in which dTdT (deoxy T is 2 bp) is attached to the 3 'end of the sense / antisense strands of all siRNAs.
  • siRNA in which 1 to several nucleotides are deleted, substituted, inserted and / or added in one or both of the sense strand or antisense strand of the siRNA can also be used.
  • the 1 to several bases are not particularly limited, but preferably 1 to 4 bases, more preferably 1 to 3 bases, and most preferably 1 to 2 bases.
  • Such mutations include those in which the number of bases in the 3 ′ overhang portion is 0 to 3, or the base sequence in the 3 ′ overhang portion is changed to another base sequence, or base insertion or addition Or, there may be mentioned those in which the length of the sense RNA strand differs from that of the antisense RNA strand by 1 to 3 bases due to deletion, or in which the base is substituted with another base in the sense strand and / or antisense strand. However, it is not limited to these. However, it is necessary that the sense strand and the antisense strand can hybridize in these mutant siRNAs, and that these mutant siRNAs have the ability to suppress gene expression equivalent to siRNA having no mutation.
  • the siRNA may be a molecule having a structure in which one end is closed, for example, a siRNA having a hairpin structure (Short Hairpin RNA; shRNA).
  • shRNA is a RNA comprising a sense strand RNA of a specific sequence of a target gene, an antisense strand RNA consisting of a sequence complementary to the sense strand sequence, and a linker sequence connecting both strands, and a sense strand portion and an antisense strand The portions hybridize to form a double stranded RNA portion.
  • siRNA does not show a so-called off-target effect in clinical use.
  • the off-target effect refers to the action of suppressing the expression of another gene that is partially homologous to the siRNA used in addition to the target gene.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • RNA of the present invention In order to produce the siRNA of the present invention, a known method such as a method using chemical synthesis or a method using a gene recombination technique can be appropriately used.
  • double-stranded RNA can be synthesized by a conventional method based on sequence information.
  • an expression vector encoding a sense strand sequence or an antisense strand sequence is constructed, and the sense strand RNA or antisense strand RNA generated by transcription after introducing the vector into a host cell. It can also be produced by acquiring each of the above.
  • a desired strand can be expressed by expressing a shRNA that forms a hairpin structure, including a sense strand of a specific sequence of a target gene, an antisense strand consisting of a sequence complementary to the sense strand sequence, and a linker sequence that connects both strands.
  • the double-stranded RNA can also be prepared.
  • all or part of the nucleic acid constituting the siRNA may be a natural nucleic acid or a modified nucleic acid.
  • the siRNA in the present invention does not necessarily need to be a set of double-stranded RNAs for the target sequence, and a plurality of sets for the region containing the target sequence (this “plurality” is not particularly limited, but preferably 2 to 5) It may be a mixture of double-stranded RNA.
  • siRNA as a nucleic acid mixture corresponding to the target sequence can be appropriately prepared by a person skilled in the art using a commercially available nucleic acid synthesizer and a DICER enzyme. Synthetic contract service can be used.
  • the siRNA of the present invention includes so-called “cocktail siRNA”. In the siRNA of the present invention, not all nucleotides are necessarily ribonucleotides (RNA).
  • the one or more ribonucleotides constituting the siRNA may be corresponding deoxyribonucleotides.
  • This “corresponding” refers to the same base species (adenine, guanine, cytosine, thymine (uracil)) although the structures of the sugar moieties are different.
  • deoxyribonucleotide corresponding to ribonucleotide having adenine refers to deoxyribonucleotide having adenine.
  • a DNA (vector) capable of expressing the RNA of the present invention is also included in a preferred embodiment of a nucleic acid capable of suppressing the expression of P38 MAP kinase and the like.
  • the DNA (vector) capable of expressing the double-stranded RNA of the present invention is a DNA encoding one strand of the double-stranded RNA and a DNA encoding the other strand of the double-stranded RNA, Each DNA has a structure linked to a promoter so that it can be expressed.
  • the expression vector of the present invention can be prepared by appropriately inserting DNA encoding the target RNA into various known expression vectors.
  • a modified nucleic acid may be used as the nucleic acid that suppresses the expression of the target gene.
  • the modified nucleic acid means one having a structure different from that of a natural nucleic acid, in which a nucleoside (base site, sugar site) and / or internucleoside binding site is modified.
  • Examples of the “modified nucleoside” constituting the modified nucleic acid include an abasic nucleoside; an arabino nucleoside, 2′-deoxyuridine, ⁇ -deoxyribonucleoside, ⁇ -L-deoxyribonucleoside, and other sugars.
  • nucleosides having modifications include peptide nucleic acids (PNA), peptide nucleic acids to which phosphate groups are bound (PHONA), locked nucleic acids (LNA), morpholino nucleic acids and the like.
  • PNA peptide nucleic acids
  • PONA peptide nucleic acids to which phosphate groups are bound
  • LNA locked nucleic acids
  • nucleoside having a sugar modification include substituted pentose monosaccharides such as 2′-O-methylribose, 2′-deoxy-2′-fluororibose, and 3′-O-methylribose; 1 ′, 2′-deoxyribose Arabinose; substituted arabinose sugars; nucleosides with hexose and alpha-anomeric sugar modifications are included.
  • These nucleosides may be modified bases with modified base sites.
  • modified bases include, for example, pyrimidines such as 5-hydroxycytosine, 5-flu
  • modified internucleoside bond constituting the modified nucleic acid
  • examples of the “modified internucleoside bond” constituting the modified nucleic acid include, for example, alkyl linker, glyceryl linker, amino linker, poly (ethylene glycol) bond, methylphosphonate internucleoside bond; methylphosphonothioate, phosphotriester , Phosphothiotriester, phosphorothioate, phosphorodithioate, triester prodrug, sulfone, sulfonamide, sulfamate, formacetal, N-methylhydroxylamine, carbonate, carbamate, morpholino, boranophosphonate, phosphoramidate, etc.
  • Non-natural internucleoside linkages include, for example, alkyl linker, glyceryl linker, amino linker, poly (ethylene glycol) bond, methylphosphonate internucleoside bond; methylphosphonothioate, phosphotriester
  • Examples of the nucleic acid sequence contained in the double-stranded siRNA of the present invention include siRNA for P38 MAP kinase or other P38 MAP kinase signal members.
  • siRNA shows very excellent specific post-transcriptional repression effect in vitro, but in vivo it is rapidly degraded by the nuclease activity in serum, so its duration is limited and more optimal and effective delivery. System development has been demanded.
  • One example is Ochiya, T et al. , Nature Med.
  • telocollagen which is a biocompatible material
  • nucleic acid When atelocollagen, which is a biocompatible material, is mixed with nucleic acid to form a complex, it has the effect of protecting the nucleic acid from degrading enzymes in the living body and is very suitable as a carrier of siRNA.
  • the method of introducing the nucleic acid, therapeutic or prophylactic agent of the present invention is not limited thereto. In this way, in the living body, it is rapidly degraded by the action of the nucleolytic enzyme in the serum, so that a long-term effect can be achieved. For example, Takeshita F.I. PNAS.
  • bovine skin-derived atelocollagen forms a complex with nucleic acid and protects the nucleic acid from in vivo degrading enzymes
  • siRNA siRNA
  • a corneal endothelial disease, disorder or condition requiring cell proliferation, inhibition of cell damage or inhibition of cell aging refers to a disease, disorder or condition of the corneal endothelium, which requires cell proliferation. Any disease, disorder or condition associated with at least one of cell disorder, cell disorder or cell aging, wherein improvement or cure can be achieved by performing cell proliferation, cell disorder inhibition or cell aging inhibition refers to a failure or condition.
  • Corneal endothelial diseases, disorders or conditions that require cell proliferation, cytopathic inhibition or cellular aging inhibition include, for example, Fuchs corneal endothelial dystrophy, sustained decrease in corneal endothelial density after corneal transplantation, trauma, ophthalmic surgery, aging, Although the disorder
  • a corneal endothelium disorder requiring cell proliferation refers to a state in which the corneal endothelium is deficient due to trauma, surgery, etc.
  • a cellular disorder refers to Fuchs corneal endothelial dystrophy, intracorneal Apoptosis or cell death occurs due to dermatitis, etc.
  • Cell aging means cytoplasm enlargement, cell density reduction, cell size increase, hexagonal cell rate decrease, cell proliferation ability decrease This refers to the state in which this occurs.
  • the present invention provides a therapeutic or prophylactic agent for corneal endothelial injury requiring cell proliferation, including a p38 MAP kinase inhibitor.
  • a p38 MAP kinase inhibitor is believed to be involved in various signal transductions and is also thought to be involved in inflammation, the mechanism of corneal endothelium has not been clarified, and corneal endothelium, which particularly requires cell proliferation, has not been clarified. It could not be expected to be effective in healing or preventing wounds due to disorders, for example inhibition thereof. Therefore, it can be said that the present inventors have unexpectedly discovered that a p38 MAP kinase inhibitor is applied to the treatment or prevention of a corneal endothelial disorder requiring cell proliferation. In particular, an embodiment that can be used as an eye drop has not been found in the past, and it should be said that such a form is highly evaluated in an actual bed leaving place.
  • the p38 MAP kinase inhibitor is water soluble. This is because if it is water-soluble, water that is not a problem for biocompatibility can be used as a solvent. Even if it is not water-soluble, it can be used as long as it is soluble in a pharmaceutically acceptable solvent (for example, ethanol). Solubility can be classified based on the pharmacopoeia definition of solubility.
  • water-soluble means that any water-soluble one can be used as long as it dissolves an effective amount when water is used as a solvent.
  • the target solubility in the case of water, water-soluble
  • the target solubility is in the category of “easily soluble”, but in some cases it is “slightly soluble”.
  • those that are classified as “slightly insoluble” or “not easily soluble” can be used.
  • 4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -5- (4-pyridyl) -1H-imidazole SB-203580
  • SB-203580 4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -5- (4-pyridyl) -1H-imidazole
  • the method of use of the present invention includes administration methods such as injection into the anterior chamber, impregnation into sustained-release agent, subconjunctival injection, systemic administration (internal use, intravenous injection) in addition to eye drops. be able to.
  • the p38 MAP kinase inhibitor used in the present invention is 4- (4-fluorophenyl) -2- (4-hydroxyphenyl) -5- (4-pyridyl) -1H-imidazole (SB-202190).
  • the p38 MAP kinase inhibitor is 4- [4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -1H-imidazol-5-yl] pyridine) (SB203580), N- [ 3-tert-Butyl-1- (4-methylphenyl) pyrazol-5-yl) -N ′-[4- (2-morpholinoethoxy) -1-naphthyl] urea (Doramapimod; BIRB796), 2- Benzamido-4- [2-ethyl-4- (3-methylphenyl) thiazol-5-yl] pyridine (TAK-715), 1- (carbamoyl-6- (2,4-difluorophenyl) pyridin-2-yl ) -1- (2,6-difluorophenyl) urea (VX-702; 2- (2,4-difluoropheny
  • the p38 MAP kinase inhibitor comprises 4- [4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -1H-imidazol-5-yl] pyridine) (SB203580) or a salt thereof.
  • the salt is a pharmaceutically acceptable salt.
  • the p38 MAP kinase inhibitor comprises 4- [4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -1H-imidazol-5-yl] pyridine) (SB203580) hydrochloride.
  • 4- [4- (4-Fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -1H-imidazol-5-yl] pyridine) (SB203580) hydrochloride is water soluble and can be used directly as eye drops. This is because there is little risk of side effects and it is preferable for wound healing.
  • the concentration of the p38 MAP kinase agent used in the present invention is usually about 0.1 to 100 ⁇ mol / l, preferably about 0.1 to 30 ⁇ mol / l, more preferably about 1 ⁇ mol / l.
  • Other concentration ranges can be appropriately changed, for example, usually about 0.001 to 100 ⁇ mol / l, preferably about 0.01 to 75 ⁇ mol / l, about 0.05 to 50 ⁇ mol / l, about 1 ⁇ 10 ⁇ mol / l, about 0.01-10 ⁇ mol / l, about 0.05-10 ⁇ mol / l, about 0.075-10 ⁇ mol / l, about 0.1-10 ⁇ mol / l, about 0.5-10 ⁇ mol / l, About 0.75 to 10 ⁇ mol / l, about 1.0 to 10 ⁇ mol / l, about 1.25 to 10 ⁇ mol / l, about 1.5 to 10 ⁇ mol / l, about 1.75 to 10 ⁇ mol
  • the therapeutic or prophylactic agent of the present invention can be directed to any animal having a corneal endothelium, such as a mammal, and is preferably intended for the treatment or prevention of primate corneal endothelium.
  • the subject of treatment or prevention is human corneal endothelium.
  • the corneal endothelial disease, disorder or condition targeted by the therapeutic and prophylactic agents of the present invention is a corneal endothelial disease, disorder or condition that requires cell proliferation, cell disorder inhibition or cell aging inhibition, Examples include, but are not limited to, Fuchs corneal endothelial dystrophy, sustained decrease in corneal endothelial density after corneal transplantation, trauma, ophthalmic surgery, aging, corneal endotheliitis, and the like.
  • the present invention provides a method for the treatment or prevention of corneal endothelial disorders that require cell proliferation, comprising administering an effective amount of a p38 MAP kinase inhibitor to a subject in need thereof.
  • Examples of administration (transplantation) subjects of the therapeutic and prophylactic agents or methods of the present invention include mammals (eg, humans, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, horses, sheep, monkeys, etc.) Primates are preferred, especially humans.
  • mammals eg, humans, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, horses, sheep, monkeys, etc.
  • Primates are preferred, especially humans.
  • the corneal endothelium treatment in primates has not achieved satisfactory results so far, and in this sense, the present invention provides an innovative treatment method and medicine.
  • the present invention is the first to achieve good therapeutic results using a p38 MAP kinase inhibitor in a case using a wound model of corneal endothelium.
  • the dose and frequency of administration vary depending on the symptoms, age, body weight, and administration form.
  • the active ingredient when used as an eye drop for normal adults, is preferably about 0.0001 to 0.5 w / v%, preferably Is a preparation containing about 0.003 to 0.03 w / v%, 1 to 10 times per day, preferably 1 to 6 times, more preferably 1 to 3 times per day, about 0.01 to 0. 1 mL can be administered.
  • a concentration of 1/10 to 1000 times the above concentration can be used.
  • a person skilled in the art can appropriately select the type and concentration of the p38 MAP kinase inhibitor depending on the disease state.
  • HCEC Human corneal endothelial cells
  • source and culture method Human corneal endothelial cells
  • HCEC were cultured as follows. Briefly, from the research cornea purchased from Seattle Eye Bank, the Descemet's membrane containing corneal endothelial cells is exfoliated, and the corneal endothelial cells are mechanically exfoliated together with the basement membrane, and collagenase (ROCHE catalog number: 10 103 586). 001) (typically treated with 1 mg / mL collagenase A (Roche Applied Science) at 37 ° C. for 2 hours), and then primary culture was performed.
  • the medium is Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Liquid (INVITROGEN catalog number: 31985-070), 8% fetal bovine serum (FBS) (BIOWEST, catalog number: S1820-500), 200 mg / ml CaCl 2.
  • the culture medium was prepared according to published protocols with some modifications. Briefly, OptiMEM-I (Life Technologies), 8% FBS, 5 ng / mL epidermal growth factor (EGF) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 20 ⁇ g / mL ascorbic acid (Sigma-Aldrich) A basic culture medium containing 200 mg / L calcium chloride (Sigma-Aldrich), 0.08% chondroitin sulfate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka City) and 50 ⁇ g / mL gentamicin and then inactivated Conditioned media was collected after culturing 3T3 fibroblasts.
  • 3T3 fibroblasts were incubated with 4 ⁇ g / mL mitomycin C (MMC) (Kyowa Hakko Kirin Co., Tokyo) for 2 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 and then trypsinized. And plated on plastic dishes at a density of 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • MMC mitomycin C
  • HCEC was cultured in a humidified atmosphere at 37 ° C. in 5% CO 2 and the culture medium was changed every two days.
  • HCECs When HCECs reached confluence in 14-28 days, they were rinsed in Ca 2+ and Mg 2+ free PBS, trypsinized with 0.05% trypsin-EDTA for 5 minutes at 37 ° C., and 1: Passage at a ratio of 2.
  • -Cell observation method such as staining (histological examination): Cell observation was performed with a phase contrast microscope. In addition, after cells were fixed, immunostaining was performed using ZO-1, Na + / K + -ATPase as a function-related marker, and observation was performed with a fluorescence microscope.
  • cultured HCEC were placed in Lab-Tek TM Chamber Slides TM (NUNC A / S, Roskilde, Denmark) and fixed with 4% formaldehyde for 10 minutes at room temperature (RT), 1% bovine serum albumin Incubated with (BSA) for 30 minutes.
  • RT room temperature
  • BSA bovine serum albumin
  • cultured HCEC on Lab-Tek TM Chamber Slides TM was fixed in 4% formaldehyde for 10 minutes at room temperature and 30 minutes with 1% bovine serum albumin (BSA). Incubated.
  • ZO-1 Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, Calif.
  • a tight junction-related protein Na + / K + -ATPase (Upstate Biotec), a protein related to pump function. , Inc., Lake Placid, NY)
  • immunohistochemical analysis of fibronectin BD, Franklin Lakes, NJ
  • fibronectin and type 1 collagen was used to do this.
  • Staining of ZO-1, Na + / K + -ATPase, type 1 collagen and fibronectin uses a 1: 200 dilution of ZO-1 polyclonal antibody, Na + / K + -ATPase monoclonal antibody, and fibronectin monoclonal antibody, respectively. Carried out. Secondary antibodies used were Alexa Fluor® 488 labeled or 1: 2000 dilution of Alexa Fluor® 594 labeled goat anti-mouse IgG (Life Technologies). Actin staining was performed using a 1: 400 dilution of Alexa Fluor® 488-labeled phalloidin (Life Technologies).
  • the cell nuclei were then stained with DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) or PI (Sigma-Aldrich). The slides were then observed with a fluorescence microscope (TCS SP2 AOBS; Leica Microsystems, Welzlar, Germany). Western blotting: Proteins extracted with RIPA buffer were electrophoresed with 7.5% polyacrylamide. The separated protein was transferred to a PVDF membrane (manufactured by PALL LIFE SCIENCE, catalog number: EH-2222).
  • mouse-IgG antibody HRP complex (CELL SIGNALING, catalog number: 7074P2) and rabbit-IgG antibody HRP complex (GE Healthcare, catalog number: NA934) were incubated, washed, and then ECL. -A band emitted by ADVAVCE (GE Healthcare Japan, catalog number: RPN2135V) was detected.
  • Immunostaining Confluent cells were washed with PBS (Nissui, catalog number: 5913) and then ice-cooled ethanol (Nacalai Tesque, catalog number: 14713-95) and acetic acid (WAKO catalog number: 017-00256) (95 : 5) for 10 minutes.
  • Tris-buffered saline (10 mM Tris-HCl, pH 7 supplemented with 0.1% (vol / vol) polyethylene sorbitan monolaurate (Nacalai Tesque, catalog number: 28353-85) (TBS-T) and 10% fetal calf serum .4; 100 mM NaCl) for 1 hour to perform a blocking operation.
  • Rabbit anti-human ZO-1 antibody (1: 200) and mouse anti-human Na + / K + -ATPase antibody (1: 200) were used as primary antibodies and reacted at room temperature for 1 hour. A dilution ratio of 1: 200 or 1: 1000 was appropriately used.
  • Antibody against ZO-1 Mouse INVITROGEN (INVITROGEN catalog number: 339100), rabbit ZYMED LABORATORIES (ZYMED LABORATORIES catalog number: 61-7300) were used.
  • -Antibodies to GAPDH those manufactured by ABCAM (catalog number: ab36840) were used.
  • Secondary antibody HPR-conjugated anti-rabbit IgG secondary antibody manufactured by Cell Signaling Technology (catalog number: 7074)
  • Secondary antibody anti-rabbit IgG secondary antibody manufactured by Cell Signaling Technology (catalog number: 7076) Cytokine antibody corneal endothelial cells were cultured in the presence of 10 ⁇ M SB203580, and the culture supernatant was collected and used as a sample solution.
  • the proteome profiler (# ARY005, R & D) comprehensively quantified cytokines in the culture supernatant.
  • the membrane on which the cytokine antibody was blotted was placed on a tray, 2 ml of blocking solution was added, and incubated at room temperature for 1 hour. Biotin antibody was added to the sample solution and incubated at room temperature for 1 hour. The blocking solution was discarded and the antibody solution was immersed in a membrane and incubated overnight at 4 ° C. After washing the membrane, 2 ml of HRP-labeled streptavidin solution diluted with blocking solution was added and incubated at room temperature for 30 minutes. After washing the membrane, a substrate solution was added and detected with LAS400 (Fuji Film).
  • PCR method PCR was performed on each laminin chain and integrin chain by RT-PCR (semi-quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction).
  • the primer used was purchased from INVITROGEN, an oligonucleotide synthesis company, and desalted.
  • RNEasy Mini Kit QIAGEN, catalog number: 74106 was used. From the research cornea purchased from Seattle Eye Bank, the Descemet's membrane containing corneal endothelial cells was peeled off, and the corneal endothelial cells were mechanically peeled together with the basement membrane and used for RNA extraction from the corneal endothelial cells.
  • RNA was subjected to reverse transcription reaction (42 ° C., 60 minutes) by RiverTra Ace (TOYOBO (catalog number: TRT-101)), and CD166 with TAPARA TaqHotStart Version (Takara Bio, catalog number: RR001A) as internal standard.
  • CD73 was amplified.
  • the same amount of cDNA was amplified by a PCR machine (GeneAmp9700; Applied Biosystems) and the following primer pair. The following primers were used for the PCR reaction. These primers were obtained from Life Technologies Japan Ltd. (catalog number: 10336022).
  • IL6-F CACAAGCGCCCTCGGTCCAGTT (SEQ ID NO: 1)
  • IL6-R TCTGCCAGTGCCCTCTTGCTGC (SEQ ID NO: 2)
  • GAPDH-F GAGTCAACGGATTTGGTCCGT (SEQ ID NO: 3)
  • GAPDH-R TTGATTTTGGAGGGGATCTG (SEQ ID NO: 4)
  • the amplified DNA fragment was electrophoresed on a 1.5% agarose gel (Nacalai Tesque, catalog number: 01149-76) and detected by staining with ethidium bromide (Nacalai Tesque, catalog number: 14603-51).
  • RNA extraction was performed with RneasyMini (QIAGEN). PCR was performed using 277 ng of total RNA reverse transcribed with ReverseAce (Toyobo) and cDNA synthesis as a template. 10 ⁇ l of PCR solution containing 1 ⁇ l of reaction mixture for single-stranded cDNA synthesis was added at 94 ° C. For 1 minute and then 94 ° C. for 1 minute, 54 ° C. for 30 seconds and 72 ° C.
  • IL-6 sense primer cacaagcgccttcgggtccagtt (SEQ ID NO: 1)
  • IL-6 antisense primer tctgcccagtgcctctttgctgctgc (SEQ ID NO: 2)
  • ELTSA method (BrdU): seeded in a 96-well culture plate at a seeding density of 5,000 cells / well and cultured overnight. Thereafter, 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) was added to the medium and cultured overnight. The medium was removed, and a fixing solution (Amersham cell propagation biotrak ELISA system, version 2) was added and incubated at room temperature for 30 minutes.
  • the fixing solution was removed, and a blocking solution (Amersham cell propagation biotrak ELISA system, version 2) was added and left at room temperature for 30 minutes. Subsequently, the blocking solution was removed, a peroxidase-conjugated anti-BrdU antibody was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 90 minutes.
  • the plate was washed three times with the washing buffer, TMB (3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine) substrate (Amersham cell purification biotrak ELISA system, version 2) was added, and the plate was allowed to stand for 5 to 30 minutes. The reaction was stopped with 1 M sulfuric acid, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Example 1 Transition of cell cycle of corneal endothelial cell by suppressing cyclin-dependent kinase inhibitor by inhibiting p38MAP kinase signal
  • inhibition of p38 MAP kinase signal is shown to suppress cyclin-dependent kinase inhibitors and shift the cell cycle of corneal endothelial cells.
  • corneal endothelial cells cultured from a research cornea imported from Seattle Eye Bank were cultured and used for the following examination.
  • SB203580 13067, Cayman
  • p27, p21, and p16 which are cyclin-dependent kinase inhibitors, was examined 20 days later by Western blotting.
  • p27, p21, and p16 were all suppressed by the addition of SB203580 (FIG. 1, A; showing p27, p21, p16, and GAPDH in order from the top.
  • the left lane is control, the center is SB203580 10 ⁇ M, and the right lane is SB203580 30 ⁇ M. .)
  • p27, p21, and p16 have been reported to be cyclin-dependent kinase inhibitors that negatively regulate cell proliferation of corneal endothelial cells.
  • Rb protein phosphorylation and cyclin D1 and D3 expression as molecules involved in the G1 / S phase of the cell cycle were examined by Western blotting. The results are shown in FIG. The expression of these molecules was promoted 12 hours and 24 hours after addition of SB203580 (B; two stages from the top, p-pRb, cyclin D1, cyclin D3, and GAPDH are shown. The upper side in each two stages. Shows stimulation with control, lower SB203580 (10 ⁇ M), left lane shows 12 hours, right lane shows 24 hours).
  • Example 2 Promotion of cell proliferation of corneal endothelial cells by p38 MAP kinase inhibitor
  • promotion of cell proliferation of corneal endothelial cells by a p38 MAP kinase inhibitor was demonstrated.
  • the cultured human corneal endothelial cells were stimulated with SB203580, a p38 MAP kinase inhibitor, and immunostained based on the experimental procedure described herein above with Ki67 (Dako, M7240), a marker for cell proliferation, 3 days later. went. The method is as described above.
  • Example 3 Promotion of cell proliferation of corneal endothelium with p38 MAP kinase inhibitor in a rabbit partial corneal endothelial dysfunction model
  • p38 MAP kinase inhibitor in this example, it was examined whether inhibition of p38 MAP kinase signal promotes cell proliferation of corneal endothelium in vivo using a rabbit partial corneal endothelial injury model.
  • a 7 mm diameter stainless steel tip is immersed in liquid nitrogen and cooled, and then contacted with the central cornea of a Japanese white rabbit under general anesthesia (obtained from Oriental Bioservice) for 15 seconds, and the central corneal endothelial cells are partially Dropped out. Thereafter, 50 ⁇ l of SB203580 adjusted to 10 mM was administered by instillation 4 times a day for 2 days.
  • a base was instilled into an eye in which a partial corneal endothelial disorder was similarly produced, and a photograph was taken. Further, the cornea was excised and excised, and the wound area of the corneal endothelium was stained and observed with Alizarin Red S (Nacalai Tesque, CI-58005). Furthermore, immunostaining of corneal tissue was performed with Ki67, which is a cell proliferation marker. Immunostaining used the same method as the above-mentioned Example etc.
  • FIG. 3 shows the anterior segment photograph after 50 ⁇ l of SB203580 adjusted to 10 mM on the right side of the left panel photograph once a day for 4 days for 2 days, the upper right photograph shows the whole image, and the lower right photograph shows alizarin.
  • the range of corneal endothelial wounds by staining is shown.
  • the upper right photo shows the whole image, and the lower right photo shows the area of the corneal endothelial wound by alizarin staining.
  • the corneal transparency of SB203580 was rapidly recovered from the anterior segment photograph.
  • the corneal endothelium was stained with alizarin staining after euthanasia, the cornea was excised, and the SB203580 instillation group was smaller than the control.
  • the wound area was significantly reduced in the SB203580 eye drop group, and inhibition of p38 MAP kinase signal was shown to promote wound healing of the corneal endothelium.
  • the rabbit model is known to be a good model that can be extrapolated for primates, particularly humans. From the results of this example, inhibition of p38 MAP kinase signal promotes corneal endothelium wound healing in primates including humans. It is expected to do.
  • FIG. 1 the result of immunostaining the corneal tissue with Ki67, which is a marker for cell proliferation, is shown in FIG.
  • the left side of the photograph shows a control
  • the right side shows a representative example (10 mM) of an individual who received SB203580 instillation.
  • the ratio of Ki67 positive cells is shown for control (left) and SB203580 stimulation (10 mM).
  • Example 4 Suppression of decrease in corneal endothelial cell density by p38 MAP kinase inhibitor
  • inhibition of p38 MAP kinase signal is shown to suppress a decrease in cell density due to cell enlargement that occurs in a culture environment.
  • Figure 5 shows the results. Cultured human corneal endothelial cells are stimulated at various concentrations using SB203580, a p38 MAP kinase inhibitor, and phase contrast micrographs after 20 days are shown (upper panel). Depending on the concentration of SB203580, the decrease in cell density due to culture was inhibited, and the cell density increased (lower panel).
  • Example 5 Maintaining a pump function and a barrier function that are functions of a corneal endothelial cell by a p38 MAP kinase inhibitor and suppressing a decrease in density
  • p38MAP kinase signal inhibition maintained the pump function and the barrier function to inhibit the cell density reduction due to culture.
  • Cultured human corneal endothelial cells were stimulated at various concentrations using SB203580, a p38 MAP kinase inhibitor, and after 20 days, Na + / K + -Immunostaining with ATPase and ZO-1.
  • corneal endothelial cells by p38MAP kinase signaling inhibition maintained in all cell Na + / K + -ATPase and ZO-1 and has normal function expressing, suppressing a decrease in hypertrophy and cell density of the corneal endothelial cells It was shown that. This is understood that p38 MAP kinase signal inhibition does not lose cell function or stratify, but suppresses cellular senescence while maintaining normal cell function.
  • the p38 MAP kinase inhibitor maintains the pump function and the barrier function, which are functions of the corneal endothelial cells, and suppresses the decrease in density.
  • Example 6 p38 MAP kinase inhibitor suppresses cytokine production by corneal endothelial cells
  • cytokine expression patterns in human corneal endothelial cultures were examined using a cytokine antibody array (Proteome Profiler, # ARY005, R & D Systems) on which 36 types of antibodies were blotted.
  • FIG. 7 signals of GROa, sICAM-1, IL-6, IL-8, IL-23, MCP-1, MIF, and SerpinE1 were detected regardless of the presence or absence of SB203580.
  • cytokines other than serpinE1 were decreased as compared to vehicle. This indicates that cytokine production caused by the culture environment of corneal endothelial cells is suppressed.
  • production of cytokines such as IL-6 has increased due to cell aging, and attention has been paid to be involved in aging. Therefore, whether to suppress the production of IL-6 was examined by PCR and ELISA. The results are shown in FIG.
  • IL-6 production was reduced by adding SB203580 and culturing compared to control. Quantification of the expression level of IL-6 in human corneal endothelial cells by ELISA (IL-6) and RT-PCR was performed as described in the experimental method described above.
  • Example 6 Examination of effect on cell death by p38 MAP kinase inhibitor
  • a p38 MAP kinase inhibitor suppresses cell death of the corneal endothelium.
  • cultured human corneal endothelial cells were stimulated with 100 J / m 2 of ultraviolet light (UV) to induce cell death, and SB203580 (used at 10 ⁇ M) was used. The effect of was examined. The examination was performed by counting the number of cells.
  • UV ultraviolet light
  • the phase contrast micrograph (left) is 12 hours after UV irradiation.
  • the right is a graph 12 hours after UV irradiation, expressed as a ratio of the number of viable cells to the control.
  • the number of viable cells decreases by UV irradiation, but increases significantly by SB203580. From this, it is understood that inhibition of p38 MAP kinase signal suppresses cell damage of corneal endothelial cells and suppresses cell death.
  • Example 7 Examination of effect on apoptosis by p38 MAP kinase inhibitor
  • caspase 3 and PARP which are the execution molecules of apoptosis by UV irradiation, are suppressed by activation, and whether the expression of phosphorylated histone H2AX induced by double-strand break of DNA by UV irradiation is suppressed Whether or not was confirmed by Western blot according to the experimental procedure described herein above.
  • anti-caspase 3 antibody 9662, Cell Signaling
  • anti-PARP antibody 9542, Cell Signaling
  • anti-H2AX antibody 05-636, Millipore
  • anti-GAPDH antibody 2118, The conditions for Cell Signaling were as follows: 100 J / m 2 .
  • SB203580 As the p38 MAP kinase signal inhibitor, SB203580 was used, and its concentration was 10 ⁇ M.
  • FIG. The left shows that SB203580 suppresses activation by cleavage of caspase 3 and PARP, which are molecules that undergo apoptosis by UV irradiation.
  • the right shows that SB203580 suppresses the expression of phosphorylated histone H2AX induced by double-strand breakage of DNA by UV irradiation. From these results, it was shown that p38 MAP kinase signal inhibition suppresses apoptosis of corneal endothelial cells.
  • p38 MAP kinase signal inhibition promotes cell proliferation of corneal endothelial cells, suppresses cellular senescence, and suppresses cell death, and thus is a target for treatment and prevention of corneal endothelial injury. It was.
  • ophthalmic administration, intra-atrial administration, subconjunctival injection, systemic administration, etc. of the p38 MAP kinase inhibitor used in this study have the potential for development as therapeutic agents.
  • Example 8 Promotion of growth with various p38 MAPK inhibitors This example demonstrates the promotion of proliferation with various p38 MAPK inhibitors, and demonstrates that the effects of the present invention are not limited to specific p38 MAPK inhibitors but are seen with p38 MAPK inhibitors in general. did. In this example, all of the effects of the present invention are caused not by the inhibition of other kinases but by the inhibition of p38 MAPK by using a reagent that is supposed to have an inhibitory action specifically on p38 MAPK. Proved that.
  • SB203580 (4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -5- (4-pyridyl) -1H-imidazole) (Cayman, catalog number: 13067): SB203580 is a MAPK It is known to be a specific (selective) inhibitor (Biochem Biophys Res Commun. 1999 Oct 5; 263 (3): 825-31.). Therefore, the experimental results with SB203580 can be identified as being due to inhibition of MAPK.
  • Semapimod N, N′-bis [3,5-bis [1- [2- (aminoiminomethyl) hydrazono] ethyl] phenyl] decandiamide
  • MAPK Retriepsin
  • Semapimod is known to be a good inhibitor of MAPK (Gastroenterology. 2002 Jan; 122 (1): 7-14 .; Transplant Proc. 1998 Mar; 30 (2): 409-10 .; Auton Neurosci.2000 Dec 20; 85 (1-3): 141-7.; Gastroenterology.2009 Feb; 136 (2): 619-29.doi: 10.1053 / j.gastro.2008.10.10.17. pub 2008 Oct 9.).
  • BIRB796 Doramapimod; N- [3-tert-butyl-1- (4-methylphenyl) pyrazol-5-yl] -N ′-[4- (2-morpholinoethoxy) -1-naphthyl] urea) (Selleck Chemicals, catalog number: S1574): BIRB796 is known to be a specific (selective) inhibitor of MAPK (Nat Struct Biol. 2002 Apr; 9 (4): 268-72.). Therefore, the experimental results with BIRB796 can be identified as due to inhibition of MAPK.
  • PH-797804 (3- (3-bromo-4-((2,4-difluorobenzyl) oxy) -6-methyl-2-oxopyridin-1 (2H) -yl) -N, 4-dimethyl Benzamide) (Selleck Chemicals, catalog number: S2726): PH-79804 is known to be a specific (selective) inhibitor of MAPK (Bioorg Med Chem Lett. 2011 Jul 1; 21 (13): 4066). -71.doi: 10.016 / j.bmcl.2011.04.121.Epub 2011 May 11.). Therefore, the experimental results with PH-79804 can be identified as being due to inhibition of MAPK.
  • VX-702 (1- (carbamoyl-6- (2,4-difluorophenyl) pyridin-2-yl) -1- (2,6-difluorophenyl) urea) (Selleck Chemicals, catalog number: S6005) : VX-702 is known to be a specific (selective) inhibitor of MAPK (Curr Opin Investig Drugs. 2006 Nov; 7 (11): 1020-5.). Therefore, the experimental results with VX-702 can be identified as being due to inhibition of MAPK.
  • LY2288820 (Rarimetinib; 5- (2- (tert-butyl) -5- (4-fluorophenyl) -1H-imidazol-4-yl) -3-neopentyl-3H-imidazo [4,5 -B] Pyridin-2-amine) (Selleck Chemicals, catalog number: S1494): LY2288820 is known to be a potent specific (selective) inhibitor of MAPK (Br J Haematol.
  • TAK-715 (2-benzamido-4- [2-ethyl-4- (3-methylphenyl) thiazol-5-yl] pyridine) (Selleck Chemicals, catalog number: S2928): TAK-715 is MAPK Is known to be a potent specific (selective) inhibitor (J Med Chem. 2005 Sep 22; 48 (19): 5966-79.). Therefore, the experimental results with TAK-715 can be identified as due to inhibition of MAPK.
  • SB203580 (4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfinylphenyl) -5- (4-pyridyl) -1H-imidazole)
  • the medium was removed from the culture dish in which cynomolgus monkey corneal endothelial cells (Nissei Bairis) were being cultured, and a phosphate buffer (Nacalai Tesque, 14249-95) previously warmed to 37 ° C. was added and washed. . This operation was repeated twice. After removing the phosphate buffer, 0.05% Trypsin-EDTA (Nacalai Tesque, 35554-64) was added and incubated at 37 ° C. (5% CO 2 ) for 10 minutes.
  • DMEM + 1% P / S serum-free medium
  • SB203580 (Cayman, catalog number: 13067) was added to a final concentration of 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 ⁇ mol / l dissolved in DMSO in a medium of DMEM + 10% FBS + 1% P / S. And cultured for 24 hours. As a control, DMSO was added.
  • the cells are then suspended in DMEM (Nacalai Tesque, 08456-94) + 10% FBS (Biowest, S1820-500) + 1% penicillin / streptomycin (Nacalai Tesque, catalog number: 26252-94) and centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes. Was recovered.
  • the 96-well plate was treated with FNC coating mix (50 ml (AES-0407), ATHENA, catalog number: 0407).
  • Monkey corneal endothelial cells (lot: 20120204-3L-P8) were seeded at a rate of 5000 cells per well in a coated 96-well plate and cultured at 37 ° C. (5% CO 2 ) for 30 hours.
  • DMEM + 1% P / S serum-free medium
  • Semapimod HCl MedKoo Biosciences, catalog number: 202590, so as to have final concentrations of 0.1, 0.3, 1, 3, 10 ⁇ mol / l dissolved in DMSO in a medium of DMEM + 10% FBS + 1% P / S, Lot number: SMC20120918
  • DMSO was added as a control.
  • BrdU labeling reagent (Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2, GE Healthbare, catalog number: RPN250) was added to the medium of DMEM + 10% FBS + 1% P / S at a final ratio of 1: 1000. Semapimod HCl was added at a concentration of 1, 0.3, 1, 3, 10 ⁇ mol / l and cultured for 24 hours. As a control, DMSO was added. After 24 hours, BrdU ELISA was performed using Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2 (GE Healthbare, catalog number: RPN250), and absorbance at 450 nm was measured.
  • BrdU labeling reagent (Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2, GE Healthbare, catalog number: RPN250) was added to the medium of DMEM + 10% FBS + 1% P / S at a final ratio of 1: 1000.
  • BIRB796 Doramapimod
  • DMSO was added as a control.
  • BrdU ELISA was performed using Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2 (GE Healthbare, catalog number: RPN250), and absorbance at 450 nm was measured.
  • PH-797804 (3- (3-bromo-4-((2,4-difluorobenzyl) oxy) -6-methyl-2-oxopyridin-1 (2H) -yl) -N, 4-dimethyl Benzamide)
  • the medium was removed from the culture dish in which cynomolgus monkey corneal endothelial cells were being cultured, and PBS ( ⁇ ) preliminarily warmed to 37 ° C. was added for washing. This operation was repeated twice. After removing PBS ( ⁇ ), 0.05% Trypsin-EDTA (Nacalai Tesque, 35554-64) was added and incubated at 37 ° C. (5% CO 2 ) for 10 minutes.
  • the cells are then suspended in DMEM (Nacalai Tesque, 08456-94) + 10% FBS (Biowest, S1820-500) + 1% penicillin / streptomycin (Nacalai Tesque, catalog number: 26252-94) and centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes. Was recovered.
  • the 96-well plate was treated with FNC coating mix (50 ml (AES-0407), ATHENA, catalog number: 0407).
  • Monkey corneal endothelial cells (lot: 20120204-3L-P9) were seeded at a rate of 5000 cells per well in a coated 96-well plate and cultured at 37 ° C. (5% CO 2 ) for 30 hours.
  • DMEM + 1% P / S serum-free medium
  • PH-798044 Selleck Chemicals, catalog number
  • BrdU labeling reagent (Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2, GE Healthbare, catalog number: RPN250) was added to the medium of DMEM + 10% FBS + 1% P / S at a final ratio of 1: 1000. PH-797804 was cultured for 24 hours at 1, 0.3, 1, 3, 10, 30 ⁇ mol / l. As a control, DMSO was added. After 24 hours, BrdU ELISA was performed using Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2 (GE Healthbare, catalog number: RPN250), and absorbance at 450 nm was measured.
  • VX-702 (1- (carbamoyl-6- (2,4-difluorophenyl) pyridin-2-yl) -1- (2,6-difluorophenyl) urea (2- (2,4-difluorophenyl) ) -6- (1- (2,6-difluorophenyl) ureido) nicotinamide))
  • the medium was removed from the culture dish in which cynomolgus monkey corneal endothelial cells were being cultured, and PBS ( ⁇ ) preliminarily warmed to 37 ° C. was added for washing. This operation was repeated twice.
  • Trypsin-EDTA (Nacalai Tesque, 35554-64) was added and incubated at 37 ° C. (5% CO 2 ) for 10 minutes. The cells are then suspended in DMEM (Nacalai Tesque, 08456-94) + 10% FBS (Biowest, S1820-500) + 1% penicillin / streptomycin (Nacalai Tesque, catalog number: 26252-94) and centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes. Was recovered. The 96-well plate was treated with FNC coating mix (50 ml (AES-0407), ATHENA, catalog number: 0407).
  • FNC coating mix 50 ml (AES-0407), ATHENA, catalog number: 0407).
  • Monkey corneal endothelial cells (lot: 20120204-3L-P9) were seeded at a rate of 5000 cells per well in a coated 96-well plate and cultured at 37 ° C. (5% CO 2 ) for 30 hours. After 30 hours, the medium was removed, and the medium was changed to serum-free medium: DMEM + 1% P / S and cultured for 18 hours. After 18 hours, VX-702 (Selleck Chemicals, so that the final concentration was 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 ⁇ mol / l dissolved in DMSO in a medium of DMEM + 10% FBS + 1% P / S. Catalog number: S6005, lot number: 02) was added and cultured for 24 hours.
  • DMSO DMSO was added.
  • BrdU labeling reagent (Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2, GE Healthbare, catalog number: RPN250) was added to the medium of DMEM + 10% FBS + 1% P / S at a final ratio of 1: 1000.
  • VX-702 was added so that it might become 1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 micromol / l, and it culture
  • DMSO was added.
  • BrdU ELISA was performed using Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2 (GE Healthbare, catalog number: RPN250), and absorbance at 450 nm was measured.
  • LY2288820 (Rarimetinib; 5- (2- (tert-butyl) -5- (4-fluorophenyl) -1H-imidazol-4-yl) -3-neopentyl-3H-imidazo [4,5 -B] pyridin-2-amine)
  • the medium was removed from the culture dish in which cynomolgus monkey corneal endothelial cells were being cultured, and PBS ( ⁇ ) preliminarily warmed to 37 ° C. was added for washing. This operation was repeated twice. After removing PBS ( ⁇ ), 0.05% Trypsin-EDTA (Nacalai Tesque, 35554-64) was added and incubated at 37 ° C.
  • DMEM + 1% P / S serum-free medium
  • LY2288820 (Selleck Chemicals, catalog number: S1494) was prepared to a final concentration of 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 ⁇ mol / l dissolved in DMEM + 10% FBS + 1% P / S medium with DMSO. , Lot number: 01) was added and cultured for 24 hours. As a control, DMSO was added.
  • BrdU labeling reagent (Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2, GE Healthbare, catalog number: RPN250) was added to the medium of DMEM + 10% FBS + 1% P / S at a final ratio of 1: 1000.
  • LY2288820 was added at 1, 0.3, 1, 3, 10, 30 ⁇ mol / l and cultured for 24 hours.
  • DMSO was added as a control.
  • BrdU ELISA was performed using Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2 (GE Healthbare, catalog number: RPN250), and absorbance at 450 nm was measured.
  • TAK-715 (2-benzamido-4- [2-ethyl-4- (3-methylphenyl) thiazol-5-yl] pyridine)
  • the medium was removed from the culture dish in which cynomolgus monkey corneal endothelial cells were being cultured, and PBS ( ⁇ ) preliminarily warmed to 37 ° C. was added for washing. This operation was repeated twice. After removing PBS ( ⁇ ), 0.05% Trypsin-EDTA (Nacalai Tesque, 35554-64) was added and incubated at 37 ° C. (5% CO 2 ) for 10 minutes.
  • the cells are then suspended in DMEM (Nacalai Tesque, 08456-94) + 10% FBS (Biowest, S1820-500) + 1% penicin / streptomycin (Nacalai Tesque, catalog number: 26252-94) and centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes. Was recovered.
  • the 96-well plate was treated with FNC coating mix (50 ml (AES-0407), ATHENA, catalog number: 0407).
  • Monkey corneal endothelial cells (lot: 20120204-3L-P9) were seeded at a rate of 5000 cells per well in a coated 96-well plate and cultured at 37 ° C. (5% CO 2 ) for 30 hours.
  • BrdU labeling reagent (Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2, GE Healthbare, catalog number: RPN250) was added to the medium of DMEM + 10% FBS + 1% P / S at a final ratio of 1: 1000. TAK-715 was added at a concentration of 1, 0.3, 1, 3, 10, 100 ⁇ mol / l and cultured for 24 hours. As a control, DMSO was added. After 24 hours, BrdU ELISA was performed using Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2 (GE Healthbare, catalog number: RPN250), and absorbance at 450 nm was measured.
  • Example 9 Effect in various animal species
  • This example demonstrates that not only monkeys but also humans can promote growth with various p38 MAPK inhibitors, and the effects of the present invention are not limited to specific animal species but include humans. It was demonstrated that this effect is seen in a wide range of animal species.
  • the reagents used in Example 8 were used in all cases.
  • the cells are then suspended in DMEM (Nacalai Tesque, 08456-94) + 10% FBS (Biowest, S1820-500) + 1% penicillin / streptomycin (Nacalai Tesque, catalog number: 26252-94) and centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes. Was recovered.
  • the 96-well plate was treated with FNC coating mix (50 ml (AES-0407), ATHENA, catalog number: 0407).
  • Monkey corneal endothelial cells (lot: 20120204-3L-P9) were seeded at a rate of 3000 per well in a coated 96-well plate and cultured at 37 ° C. (5% CO 2 ) for 30 hours. After 30 hours, the medium was removed, and the medium was changed to serum-free medium: DMEM + 1% P / S and cultured for 18 hours.
  • SB203580 (Cayman, catalog number: 13067) was dissolved in DMSO in a medium of DMEM + 10% FBS + 1% P / S to a final concentration of 10 ⁇ mol / l, and Semapimod HCl (final concentration 1 ⁇ mol / l).
  • PH-797804 (Selleck Chemicals, catalog number: S2726, lot number: 01), so that the final concentration is 3 ⁇ mol / l.
  • X-702 (Selleck Chemicals, catalog number: S6005, lot number: 02), LY2288820 (Selleck Chemicals, catalog number: S1494, lot number: 01), final concentration of 3 ⁇ mol / l to a final concentration of 3 ⁇ mol / l.
  • TAK-715 (Selleck Chemicals, catalog number: S2928, lot number: 01) was added and cultured for 24 hours. As a control, DMSO was added.
  • BrdU labeling reagent (Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2, GE Healthbare, Catalog No .: RPN250) was added at a ratio of 1: 1000 in a molar ratio of 1: 1000 to a medium of DMEM + 10% FBS + 1% P / S.
  • the 96-well plate was treated with FNC coating mix (50 ml (AES-0407), ATHENA, catalog number: 0407).
  • Human corneal endothelial cells (lot: C1642-P8) were seeded in a coated 96-well plate at a rate of 3000 cells per well in Condition Medium medium for humans and cultured at 37 ° C. (5% CO 2 ) for 30 hours. After 30 hours, the medium was removed, and the medium was changed to serum-free medium: Opti-MEM + 1% P / S and cultured for 18 hours.
  • SB203580 (Cayman, catalog number: 13067) at a final concentration of 10 ⁇ mol / l, dissolved in DMSO in human condition medium, SemapimodHCl (MedKoo Biosciences, catalog number to a final concentration of 1 ⁇ mol / l) : 202590, lot number: SMC20120918), BIRB796 (Doramapimod) (Selleck Chemicals, catalog number: S1574, lot number: S157402) to a final concentration of 3 ⁇ mol / l, PH-798044 (final concentration of 1 ⁇ mol / l) Selleck Chemicals, catalog number: S2726, lot number: 01), final concentration 3 ⁇ mol / l X-702 (Selleck Chemicals, catalog number: S6005, lot number: 02), LY2288820 (Selleck Chemicals, catalog number: S1494, lot number: 01), final concentration of 3 ⁇ mol / l to a final concentration of 3 ⁇ mol / / /
  • TAK-715 (Selleck Chemicals, catalog number: S2928, lot number: 01) was added and cultured for 24 hours.
  • DMSO was added.
  • BrdU labeling reagent (Amersham Cell Proliferation Biotrak ELISA System, Version 2, GE Healthbare, Catalog No .: RPN250) was added at a ratio of 1: 1000 in a molar ratio of 1: 1000 to a medium of DMEM + 10% FBS + 1% P / S.
  • Example 10 Activation of p38 MAPK induces apoptosis
  • p38 MAPK induces apoptosis.
  • the medium used was Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco, 12320-032), 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin (Nacalai tesque, 26252-94).
  • Z-VAD (OMe) -FMK (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 269-02071) was added as a acclimation treatment at a concentration of 10 ⁇ M and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 16 hours.
  • dimethyl sulfoxide (DMSO) Dimethyl Sulphoxide, Sterile-filtered; nacalai test, 13408-64 which is a reagent solvent was added to the Control group and the anisomysin group.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the medium used was Gibco DMEM, 1% P / S.
  • anisomycin anisomsin; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 017-16861
  • anisomycin anisomsin; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 017-16861
  • anisomysin + Z-VAD-FMK group 10 ⁇ M Z-VAD was added together with anisomycin.
  • DMSO DMSO was added.
  • the cells were cultured for up to 9 hours. Cell morphology was observed under a phase contrast microscope. I took a picture after 9 hours. Nine hours later, cellular proteins were collected, and the protein expression levels were compared by the Western Blot method.
  • Anti-Caspase 3 antibody (cell signaling, 9661S), anti-p38 MAPK antibody (cell signaling, # 9212), and anti-pp38 MAPK antibody (cell signaling, # 4631S) were used as antibodies.
  • An anti-GAPDH antibody (MBL, 3H12) was used as an internal standard.
  • Example 11 p38 MAPK inhibitor eye drop administration test in a monkey corneal endothelium partial injury model
  • a 7mm diameter stainless steel rod with liquid nitrogen to both eyes of two cynomolgus monkeys (purchased from Shiga Medical University)
  • contact the cornea and drop the corneal endothelium about 7mm in diameter to create a partially impaired model.
  • 50 ⁇ l of SB203580 (3 mM) was applied to the right eye four times a day.
  • a phosphate buffer solution as a base was instilled into the left eye as a control.
  • a monkey model was prepared and used for the following experiments.
  • FIG. 21 is a photograph showing that SB203580 eye drops promote proliferation of primate corneal endothelium.
  • FIG. 22 is a counting result showing that SB203580 instillation promotes proliferation of primate corneal endothelium.
  • Ki67 positive cells were observed in eyes instilled with SB203580.
  • FIG. 23 when the positive cell rate of Ki67 was analyzed, Ki67 positive cells were significantly increased in the eyes instilled with SB203580. Both monkeys confirmed the same trend. From these results, it was shown that, even in primates in general, a p38 MAPK inhibitor acts on the corneal endothelium when administered as an eye drop or the like, and promotes the proliferation of corneal endothelial cells.
  • Example 13 p38 MAPK inhibitor suppresses cell death of cultured corneal endothelial cells
  • Examination of the effect of p38 MAPK inhibitor on apoptosis of cultured monkey corneal endothelial cells 1 ⁇ 10 5 cultured monkey corneal endothelial cells were seeded on 12 well plates coated with FNC Coating Mix and confluent at 37 ° C. under 5% CO 2 condition. Cultured for about 5 days until reached.
  • Medium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, 12320-032), 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin (nacalai tesque, 26252-94)
  • each inhibitor was added at the concentration shown in the above table, and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 16 hours.
  • Dimethyl Sulphoxide, Sterile-filtered (nacalai tests, 13408-64) MSO which is a solvent of each reagent was added to Control group and UV group.
  • Gibco DMEM, 1% P / S (penicillin / streptomycin) was used as the medium. Thereafter, the cell supernatant was removed, and the cells were irradiated with UV (100 J / m 2 ). After irradiation, the medium containing each inhibitor was added to the cells again and cultured for 9 hours. Cell morphology and apoptosis were observed under a phase contrast microscope.
  • Example 14 p38 MAPK inhibitor suppresses apoptosis of cultured corneal endothelial cells
  • the cells after nine hours of culture were stained at 37 ° C. for 20 minutes using MEBCYTO-Apoptosis Kit (Annexin V-FITC Kit) (manufacturer: MBL, Code: 4700). Then, it was fixed with 95% ethanol acetate for 10 minutes. After fixation, it was stained with DAPI Solution (manufacturer: DOJINDO, Code: GA098) for 30 minutes and observed with a confocal microscope.
  • MEBCYTO-Apoptosis Kit Annexin V-FITC Kit
  • Example 15 p38 MAPK inhibitor suppresses apoptosis of corneal endothelium
  • corneal endothelial cells were irradiated with UV100 J / m 2 and stored again at 4 ° C. for 24 hours under light shielding.
  • DMSO was used for the Control group
  • Optisol-GS registered trademark
  • the cornea piece was washed with PBS ( ⁇ ), and stained with Annexin V and DAPI using MEBCYTO-Apoptosis kit (Annexin V-FITC kit) (MBL) (Lot. 027FA). Thereafter, it was fixed by immersing in 95% ethanol cooled at ⁇ 30 ° C. for 30 minutes.
  • FIG. 25 shows the fluorescence observation results of observing Annexin V and nuclei.
  • any p38 MAPK inhibitor it was shown that the p38 MAPK inhibitor suppresses apoptosis of the corneal endothelium.
  • the result of having measured the Annexin V positive cell rate is shown in FIG. All p38 MAPK inhibitors significantly reduced the Annexin V positive cell rate compared to the UV irradiated control. From the above, it was demonstrated that the p38 MAPK inhibitor has an effect of suppressing apoptosis of the corneal endothelium.
  • Example 16 Examples of other administration forms of p38 MAP kinase inhibitor
  • SB203580 which is a p38 MAP kinase inhibitor
  • a preparation prepared as follows is injected into the anterior chamber by a conventional method.
  • Preparation examples of drugs to be administered Prepared by diluting a drug (for example, SB203580) in physiological saline or purified water.
  • Subconjunctival injection A preparation prepared as follows is injected into the anterior chamber by a conventional method.
  • Preparation examples of drugs to be administered Prepared by diluting a drug (for example, SB203580) in physiological saline or purified water.
  • Intra-anterior administration with sustained release A sustained-release agent using a carrier such as gelatin or polylactic acid is impregnated with a drug (for example, SB203580) and injected into the anterior chamber.
  • a drug for example, SB203580
  • a sustained-release agent using a carrier such as gelatin or polylactic acid is impregnated with a drug (for example, SB203580) and injected under the conjunctiva.
  • Example 17 Eye drops as formulation examples
  • the composition of the test substance at each concentration is shown below.
  • SB203580 (available from CALBIOCHEM, catalog number: 559389, etc.) or SB203580 hydrochloride (available from Wako Pure Chemical (193-15611), etc.) or other p38MAP kinase inhibitors: 0.003 g, 0.01 g, 0.03 g 0.05 g or 0.1 g (dose as dehydrochlorinated form) Sodium chloride 0.85g Sodium dihydrogen phosphate dihydrate 0.1g Benzalkonium chloride 0.005g Sodium hydroxide appropriate amount Purified water appropriate amount Total amount 100 mg (pH 7.0).
  • O Eye drops can be diluted with a base.
  • composition of the substrate are as follows, but can be changed as appropriate.
  • a therapeutic or preventive drug for corneal endothelial injury requiring cell proliferation was provided, and in particular, a technique for treating or preventing corneal endothelial wounds was provided.
  • Technologies that can be used in industries (pharmaceuticals, etc.) related to technologies related to formulations based on such technologies are provided.
  • IL6-F CACAAGCGCCCTTCGGTCCCAGTT
  • IL6-R TCTGCCAGTGCCCTCTTTGCTGC
  • GAPDH-F GAGTCAACGGATTTGGTCGT
  • GAPDH-R TTGATTTTGGAGGGATCTCG

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Abstract

本発明は、細胞増殖を必要とする角膜内皮障害の治療または予防を提供する。より詳細には本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬を含む、細胞増殖を必要とする角膜内皮障害の治療または予防薬を提供する。好ましい実施形態では、角膜内皮障害は、創傷である。好ましい実施形態では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は水溶性である。ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は４－［４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－メチルスルフィニルフェニル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］ピリジン）（ＳＢ２０３５８０）またはその塩を含みうる。

Description

細胞増殖促進または細胞障害抑制による角膜内皮治療薬
　本発明は、角膜内皮細胞を正常な状態で培養するための技術、方法、ならびにそのための薬剤および培地に関する。
　視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。
　ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力を持たない。角膜内皮変性症や種々の原因による角膜内皮の機能不全によって生じる水疱性角膜症では、角膜が浮腫と混濁を生じ、著しい視力低下をきたす。現在、水疱性角膜症に対しては、角膜の上皮、実質および内皮の３層構造のすべてを移植する全層角膜移植術が行われている。しかし、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は１７００件程度である。
　角膜は眼球の前方に位置し、主に角膜上皮細胞層、角膜実質層、角膜内皮細胞層の３層構造を持った透明な組織である。角膜内皮細胞層は角膜深層部に存在する単層の細胞層であり、バリア機能とポンプ機能を持ち、角膜の水分量を一定に保つことで角膜の透明性を維持する役割を果たしている。また、障害を受けても生体内で増殖しないことが知られており、角膜内皮細胞が外傷や疾患等によって障害されて細胞数が減少することで、重篤な視覚障害が生じることが知られている。
　特許文献１は、眼表面の疾患の局所療法の概説である。非特許文献１は、ｐ３８の角膜内皮における凍結処置に対する阻害剤の影響を記載する。非特許文献２は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの、ＴＮＦα誘導性の角膜内皮におけるバリア機能（ｉｎｔｅｇｒｅｔｙ）の損失に対する影響を記載する。非特許文献３および４はｐ３８キナーゼを利用した角膜上皮細胞に関する処置方法を記載する。非特許文献５は、線維性創傷修復過程に関するｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナルの関与を記載する。非特許文献６は、角膜内皮細胞の遊走とＭＡＰキナーゼとの関係について記載する。非特許文献７は、角膜内皮障害とＴＧＦβとの関連を記載する。非特許文献８は、角膜創傷に関する再生治癒に関するＴＧＦβとの関連を記載する。非特許文献９は、角膜内皮細胞とＴＧＦβとの関連を記載する。
特表２００９−５３９９７７号公報
Ｓｏｎｇ　ＪＳ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈｌａｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５１（２），８２２−８２９　２０１０ Ｓｈｉｖａｎｎａ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ，Ｏｐｈｔｈｌａｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５１（３），１５７５−１５８２　２０１０ Ｌｉ　Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｖｏｌ．２２６，Ｎｏ．９，Ｐａｇｅ．２４２９−２４３７　（２０１１） Ｋａｎｇ　ＭＧ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　Ｖｏｌ．２７８，Ｎｏ．２４，Ｐａｇｅ．２１９８９−２１９９７　（２００３） Ｓｈａｒｍａ　ＧＤ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｖｏｌ．１０８，Ｎｏ．２，Ｐａｇｅ．４７６−４８８　（２００９） 上甲ら、角膜カンファランス・日本角膜移植学会プログラム・抄録集　Ｖｏｌ．３２ｎｄ−４４ｔｈ，Ｐａｇｅ．５５（２００８） ｈｔｔｐ：／／ｋａｋｅｎ．ｎｉｉ．ａｃ．ｊｐ／ｄ／ｐ／２１７９１７０５／２００９／３／ｊａ．ｊａ．ｈｔｍｌ、２０１３年１１月６日ダウンロード Ｍｉ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌ　Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２００９　Ｎｏｖ；２４（１１）：１４０５−１６． Ｊｏｋｏ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．２０１３　Ｍａｒ；１０８：２３−３２
　本発明者らは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬が、細胞増殖を必要とする角膜内皮障害の治療または予防に使用することができることを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は代表的に以下を提供する。
（１）ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬を含む、細胞増殖、細胞障害抑制または細胞老化抑制を必要とする角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防薬。
（２）前記角膜内皮障害は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後の持続する角膜内皮密度減少、外傷、眼科手術、加齢、および角膜内皮炎に関連する障害からなる群より選択される少なくとも１つである、項目（１）に記載の治療または予防薬。
（３）前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は水溶性である、項目（１）または（２）に記載の治療または予防薬。
（４）前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０２１９０）、ｔｒａｎｓ−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール（ＳＢ−２３９０６３）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）、４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシピリミジン−４−イル）−１−（ピペリジン−４−イル）イミダゾール（ＳＢ−２４２２３５）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−１−ブチニル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＲＷＪ−６７６５７）、４−（４−フルオロフェニル）−１−（ピペリジン−４−イル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＨＥＰ−６８９）、（Ｓ）−２−（２−アミノ−３−フェニルプロピルアミノ）−１−メチル−５−（２−ナフチル）−４−（４−ピリジル）ピリミジン−６−オン（ＡＭＧ−５４８）、２−クロロ−４−（４−フルオロ−２−メチルアニリノ）−２’−メチルベンゾフェノン（ＥＯ−１６０６）、３−（４−クロロフェニル）−５−（１−ヒドロキシアセチルピペリジン−４−イル）−４−（ピリミジン−４−イル）ピラゾール（ＳＤ−０６）、５−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（２，４−ジフルオロフェニルチオ）ピリミド［３，４−ｂ］ピリダジン−６−オン（ＶＸ−７４５）、４−アセチルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルベンズアミド（ＣＰＩ−１１８９）、Ｎ−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−メチルフェニル）ピラゾール−５−イル］−Ｎ’−［４−（２−モルホリノエトキシ）−１−ナフチル］ウレア（ドラマピモド（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ））、２−ベンズアミド−４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）チアゾール−５−イル］ピリジン（ＴＡＫ−７１５）、タルマピモド（Ｔａｌｍａｐｉｍｏｄ；ＳＣＩＯ−４６９）、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２；２−（２，４−ジフルオロフェニル）−６−（１−（２，６−ジフルオロフェニル）ウレイド）ニコチンアミド）、ジルマピモド（ｄｉｌｍａｐｉｍｏｄ；ＧＳＫ−６８１３２３）、４−（５−（シクロプロピルカルバモイル）−２−メチルフェニルアミノ）−５−メチル−Ｎ−プロピルピロロ（１，２−ｆ）（１，２，４）トリアジン−６−カルボキサミド（ＰＳ−５４０４４６）、抗ＦＧＦ−７抗体（ＳＣ−８００３６）、ＡＶＥ−９９４０、［５−アミノ−１−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−４−イル］［３−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロポキシ）フェニル］メタノン（ＲＯ−３２０−１１９５）、１−（１，３−ジヒドロキシプロプ−２−イル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−［２−フェノキシピリミジン−４−イル］イミダゾール（ＳＢ−２８１８３２）、２−［５−（｛４−［（４−フルオロフェニル）メチル］ピペリジン−１−イル｝カルボニル）−６−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−インドル−３−イル］−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２−オキソアセトアミド（ＳＣＩＯ−３２３）、２−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ｍ−トリル−２Ｈ−ピラゾル−３−イル）−２−ヒドロキシイミド−Ｎ−［４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ナフタレン−１−イル］−アセトアミド（ＫＣ−７０６）、Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−（２−アミジノヒドラゾノ）エチル］フェニル］デカンジアミド、Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル］フェニル］デカンジアミド（セマピモド（Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ））、３−（３−ブロモ−４−（（２，４−ジフルオロベンジル）オキシ）−６−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）−Ｎ，４−ジメチルベンズアミド（ＰＨ−７９７８０４）、および５−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−３−ネオペンチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン（ＬＹ２２２８８２０）からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目（１）~（３）のいずれか１項に記載の治療または予防薬。
（５）前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（ＳＢ２０３５８０）またはその塩を含む、項目（１）~（４）のいずれか１項に記載の治療または予防薬。
（６）前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（ＳＢ２０３５８０）塩酸塩を含む、項目（１）~（５）のいずれか１項に記載の治療または予防薬。
（７）細胞増殖を必要とする角膜内皮障害の治療または予防のためのｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害物質。
（８）ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬の有効量をそれを必要な被験体に投与する工程を含む、細胞増殖を必要とする角膜内皮障害の治療または予防のための方法。
　本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　本発明は、従来では達成が困難であった角膜内皮障害を予防または治癒させることができる技術を提供する。特に、非特許文献１および２では、凍結処置やＴＮＦα誘導性のバリア機能（ｉｎｔｅｇｒｅｔｙ）の損失等の特殊な系でのｐ３８ＭＡＰキナーゼの角膜内皮における役割が解析され、その阻害剤の効果も説明されているが、創傷（外傷）等の細胞増殖を必要とする角膜内皮障害における効果は予測できなかった。特に、実施例等に示されるように、創傷等の回復は極めて顕著であり、その治癒効果は従来の医薬品に比べても顕著であり、点眼薬として有用であることが理解される。また、理論に束縛されることを望まないが、実施例に示される細胞障害抑制効果についても従来技術から予測できないものであり、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後、角膜内皮炎など細胞障害が継続的に進行する疾患において有用であると理解される。
図１は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害はサイクリン依存性キナーゼ阻害因子を抑制し角膜内皮細胞の細胞周期を移行させることを示す。シアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を培養して以下の検討に用いた。細胞培養用培地にｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬であるＳＢ２０３５８０を添加して２０日後にサイクリン依存性キナーゼ阻害因子であるｐ２７、ｐ２１、ｐ１６の発現をウエスタンブロッティング法にて検討した。ｐ２７、ｐ２１、ｐ１６は全てＳＢ２０３５８０を添加により抑制された（Ａ；上から順にｐ２７、ｐ２１、ｐ１６、ＧＡＰＤＨを示す。左レーンはコントロール、中央はＳＢ２０３５８０　１０μＭ、右レーンはＳＢ２０３５８０　３０μＭを示す。）。ｐ２７、ｐ２１、ｐ１６は角膜内皮細胞の細胞増殖を負に制御するサイクリン依存性キナーゼ阻害因子であることが報告されている。また、細胞周期のＧ１／Ｓ期の移行に関わる分子としてＲｂタンパクのリン酸化、サイクリンＤ１およびＤ３の発現をウエスタンブロッティング法にて検討したところＳＢ２０３５８０を添加により１２時間後、２４時間後それぞれでこれらの分子の発現が促進された（Ｂ；上から２段ずつ、リン酸化Ｒｂタンパク、サイクリンＤ１、サイクリンＤ３、ＧＡＰＤＨを示す。各２段において上側はコントロール、下側ＳＢ２０３５８０（１０μＭ）による刺激を示す。左レーンは１２時間、右レーンは２４時間を示す。）。また、ＳＢ２０３５８０によりｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナルの下流分子であるＡＴＦ２のリン酸化が抑制されていることを刺激後２０日後の時点のウエスタンブロッティング法にて確認した（Ｃ；上からリン酸化ｐ３８、リン酸化ＡＴＦ２、ＧＡＰＤＨを示す。左レーンからコントロール、中央はＳＢ２０３５８０　１０μＭ、右レーンはＳＢ２０３５８０　３０μＭを示す。）。これらのことよりｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害はサイクリン依存性キナーゼ阻害因子を抑制し角膜内皮細胞の細胞周期を移行させることが示された。また、ｐ２７、ｐ２１、ｐ１６の発現は老化により促進されることが知られているが、ＳＢ２０３５８０により抑制され細胞老化を抑制することが示された。 図２は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は角膜内皮細胞の細胞増殖を促進することを示す。培養したヒト角膜内皮細胞をｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬であるＳＢ２０３５８０により刺激して３日後に細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７にて免疫染色を行った。ＳＢ２０３５８０による刺激により有意に多くの細胞にＫｉ６７の発現を認めた（Ａ，Ｂ；Ａの左側写真はコントロールを示し、右側はＳＢ２０３５８０刺激を示す（１０μＭ）。ＢはＫｉ６７陽性の細胞の割合を示す。縦軸はＫｉ６７陽性細胞の比率であり（％）、左バーはコントロール、右バーはＳＢ２０３５８０刺激（１０μＭ）を示す。）。また、同様に３日後に細胞増殖のマーカーとしてＢｒｄＵの取り込み量を指標にＥＬＩＳＡ法により検討したところ、ＳＢ２０３５８０による刺激により有意にＢｒｄＵの取り込みが促進された（Ｃ；縦軸はＢｒｄＵ取り込み量（コントロールに対する相対値）を示し、横軸はＳＢ２０３５８０を種々の量（０、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ）で刺激した結果を示す。）。これらのことからｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は角膜内皮細胞の細胞増殖を促進することが示された。 図３は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬点眼はウサギ部分的角膜内皮障害モデルにおいての創傷治癒を促進することを示す。ウサギの部分的角膜内皮障害モデルを用いてｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害が生体において角膜内皮の細胞増殖を促進するかどうかについて検討を行った。直径７ｍｍのステンレス製チップを液体窒素に浸漬して冷却した後に、全身麻酔下の白色ウサギの角膜中央部に１５秒間接触させ、中央部分の角膜内皮細胞を部分的に脱落させた。その後に、１０ｍＭに調整したＳＢ２０３５８０を１回５０μｌを１日４回、２日間点眼投与した（左パネル写真、右側。右上写真は全体像を示し、右下写真は創傷部分を示す。）。コントロールとして同様に部分的角膜内皮障害を作製した眼に基剤を点眼した（左パネル写真、左側。左上写真は全体像を示し、左下写真は創傷部分を示す。）。２日目に前眼部写真よりＳＢ２０３５８０点眼群で角膜の透明性の回復が早いことを確認した。また、安楽死させて角膜を摘出してアリザリン染色により角膜内皮の創傷範囲を染色したところ、ＳＢ２０３５８０点眼群はコントロールより縮小していた（左パネル写真、各下側）。また、合計６眼ずつで検討を行ったところ、有意に創傷面積はＳＢ２０３５８０点眼群において縮小しており（右グラフ、縦軸は創傷面積（ｍｍ２）を示し、右がＤＭＳＯ（コントロール）、左がＳＢ２０３５８０による刺激の結果を示す。＊はｐ＜０．０１での統計学的有意を示す。）、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は角膜内皮の創傷治癒を促進することが示された。 図４は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬点眼はウサギ部分的角膜内皮障害モデルにおいて角膜内皮細胞の細胞増殖を促進することを示す。図３に加え、さらに、細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７にて角膜組織の免疫染色を行った（左写真；写真中左側はコントロールを示し、右側はＳＢ２０３５８０（１０ｍＭ）点眼群を示す。右側グラフは、Ｋｉ６７陽性細胞の比率をコントロール（左）およびＳＢ２０３５８０点眼（１０ｍＭ）に関して示す。）。ＳＢ２０３５８０による点眼により有意に多くの細胞にＫｉ６７の発現を認めた。これらのことからｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は生体においても角膜内皮細胞の細胞増殖を促進することが示された。 図５は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は培養環境で生じる細胞の肥大化による細胞密度低下を抑制することを示す。角膜内皮細胞は生体において、加齢とともに年率０．５％程度細胞密度の低下が生じる。また、種々の角膜内皮疾患によっても細胞密度の低下が生じる。細胞培養によっても生体内同様に細胞の肥大化および密度低下という生体同様の細胞老化様減少が生じる。そこでｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害により角膜内皮細胞密度低下という細胞老化様減少への影響を検討した。培養したヒト角膜内皮細胞をｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬であるＳＢ２０３５８０を用いて各種濃度で刺激して２０日後の位相差顕微鏡写真を示す（上パネル；左からコントロール、ＳＢ２０３５８０　１μＭ、３μＭ、１０μＭを示す。）。ＳＢ２０３５８０の濃度依存的に培養による細胞密度低下は阻害され、細胞密度が上昇した。（下パネル：縦軸は細胞密度（ｍｍ２）を示し、横軸は、左からコントロール、ＳＢ２０３５８０　１μＭ、３μＭ、１０μＭを示す。＊＊はコントロールに対する統計学的有意（ｐ＜０．０５）を意味する。）。 図６は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害はポンプ機能およびバリア機能を維持して培養による細胞密度低下を阻害することを示す。培養したヒト角膜内皮細胞をｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬であるＳＢ２０３５８０を用いて各種濃度で刺激して２０日後に、角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能についてそれぞれのマーカーとしてＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１による免疫染色を行った（左：Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、右：ＺＯ−１。各パネル中、左上はコントロール、右上は、ＳＢ２０３５８０　１μＭ、左下はＳＢ２０３５８０　３μＭ、右下はＳＢ２０３５８０　１０μＭを示す。）。ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害により角膜内皮細胞は、全ての細胞においてＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１を発現しており正常な機能を維持していることが示された。 図７は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は角膜内皮細胞が産生するサイトカインを抑制することを示す結果である。Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｐｏｔは参照スポットを示す。ＧＲＯａ、ｓＩＣＡＭ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２３、ＭＣＰ−１、ＭＩＦ、ＳｅｒｐｉｎＥ１は、それぞれのマーカーのスポットを示す。コントロール（上段）ではＧＲＯａ、ｓＩＣＡＭ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２３、ＭＣＰ−１、ＭＩＦ、ＳｅｒｐｉｎＥ１が検出された。他方、ＳＢ２０３５８０（下段）を添加した培養上清においてｓｅｒｐｉｎＥ１以外のサイトカインはコントロールと比較して減少していた。 図８は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は角膜内皮細胞が産生するＩＬ−６を抑制することを示す。コントロールと比べてＳＢ２０３５８０を添加して培養することで、ＩＬ−６の産生が低下することをＰＣＲ法（左）、ＥＬＩＳＡ（右）により示された。左欄では、左レーンがコントロールを示し、右レーンがＳＢ２０３５８０を示し、上段はＩＬ−６、下段はコントロールであるＧＡＰＤＨを示す。右欄のグラフは左からコントロールであるＤＭＳＯを示し、右がＳＢ２０３５８０を示す。ｙ軸はＩＬ−６産生量（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 図９は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は角膜内皮の細胞死を抑制することを示す。左側の写真は左上がコントロール右上がＳＢ２０３５８０を示し、左下がＵＶ照射のみ、右下がＵＶ照射にＳＢ２０３５８０を組み合わせた結果を示す。左側のグラフは、それぞれ示されるＵＶの照射、およびＳＢ２０３５８０での処置を行った結果を示す。ｙ軸は細胞数（コントロールに対する％）を示す。＊＊はｐ＜０．０５での統計学的有意を示す。ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害の細胞死への影響を検討するために、培養したヒト角膜内皮細胞を１００Ｊ／ｍ２の紫外線（ＵＶ）にて刺激して細胞死を誘導しＳＢ２０３５８０の効果を検討した。位相差顕微鏡写真（左）はＵＶ照射後９時間である。右は生細胞数のコントロールに対する割合で表記した、ＵＶ照射後１２時間後のグラフである。ＵＶ照射により生細胞数は低下するがＳＢ２０３５８０により有意に増加する。このことよりｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害により角膜内皮細胞の細胞障害が抑制され細胞死が抑制されるものと理解される。 図１０は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害が角膜内皮のＵＶ刺激時のアポトーシスを抑制することを示す。左右ともウェスタンブロットの結果である。各レーンはＵＶ照射およびＳＢ２０３５８０の有無での相違を示し、上パネルからカスパーゼ３、ＰＡＲＰ、ＧＡＰＤＨを示す。右もＵＶ照射およびＳＢ２０３５８０の有無での相違を示し、上パネルからＨ２ＡＸ、ＧＡＰＤＨを示す。左はＳＢ２０３５８０によりＵＶ照射によるアポトーシスの実行分子であるカスパーゼ３およびＰＡＲＰの切断による活性化が抑制されることを示す。右はＳＢ２０３５８０によりＵＶ照射によるＤＮＡの二本鎖切断により誘導されるリン酸化ヒストンＨ２ＡＸ　の発現が抑制されることを示す。 図１１は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬であるＳＢ２０３５８０が培養角膜内皮細胞の増殖を促進することを示す。ＢｒｄＵ取り込みをコントロールに対する割合で示す（ｙ軸）。ｘ軸は、左から、コントロール（ＳＢ２０３５８０添加なし）、最終濃度０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭを示す。＊はｐ＜０．０１を示す。 図１２は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬であるＳｅｍａｐｉｍｏｄが培養角膜内皮細胞の増殖を促進することを示す。ＢｒｄＵ取り込みをコントロールに対する割合で示す（ｙ軸）。ｘ軸は、左から、コントロール（Ｓｅｍａｐｏｍｏｄ添加なし）、最終濃度０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭを示す。＊はｐ＜０．０１を示す。 図１３は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬であるＢＩＲＢ７９６が培養角膜内皮細胞の増殖を促進することを示す。ＢｒｄＵ取り込みをコントロールに対する割合で示す（ｙ軸）。ｘ軸は、左から、コントロール（ＢＩＲＢ７９６添加なし）、最終濃度０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭを示す。＊はｐ＜０．０１を示す。 図１４は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬であるＰＨ−７９７８０４が培養角膜内皮細胞の増殖を促進することを示す。ＢｒｄＵ取り込みをコントロールに対する割合で示す（ｙ軸）。ｘ軸は、左から、コントロール（ＢＩＲＢ７９６添加なし）、最終濃度０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭを示す。＊はｐ＜０．０１を示す。 図１５は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬であるＶＸ−７０２が培養角膜内皮細胞の増殖を促進することを示す。ＢｒｄＵ取り込みをコントロールに対する割合で示す（ｙ軸）。ｘ軸は、左から、コントロール（ＢＩＲＢ７９６添加なし）、最終濃度０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭを示す。＊はｐ＜０．０１を示す。 図１６は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬であるＬＹ２２２８８２０が培養角膜内皮細胞の増殖を促進することを示す。ＢｒｄＵ取り込みをコントロールに対する割合で示す（ｙ軸）。ｘ軸は、左から、コントロール（ＢＩＲＢ７９６添加なし）、最終濃度０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭを示す。＊はｐ＜０．０１を示す。 図１７は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬であるＴＡＫ−７１５が培養角膜内皮細胞の増殖を促進することを示す。ＢｒｄＵ取り込みをコントロールに対する割合で示す（ｙ軸）。ｘ軸は、左から、コントロール（ＢＩＲＢ７９６添加なし）、最終濃度０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭを示す。＊はｐ＜０．０１を示す。 図１８は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は培養サル角膜内皮細胞の増殖を促進することを示す。ＢｒｄＵ取り込みをコントロールに対する割合で示す（ｙ軸）。ｘ軸は、左から、コントロール（ＤＭＳＯ１／１０００、薬剤添加なし）、ＳＢ２０３５８０　１０μＭ、Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ　１μＭ、ＢＩＲＢ７９６　３μＭ、ＰＨ−７９７８０４　１μＭ、ＶＸ−７０２　３μＭ、ＬＹ２２２８８２０　３μＭ、ＴＡＫ−７１５　３μＭを示す。＊はｐ＜０．０１を示す。 図１９は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は培養ヒト角膜内皮細胞の増殖を促進することを示す。ＢｒｄＵ取り込みをコントロールに対する割合で示す（ｙ軸）。ｘ軸は、左から、コントロール（ＤＭＳＯ１／１０００、薬剤添加なし）、ＳＢ２０３５８０　１０μＭ、Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ　１μＭ、ＢＩＲＢ７９６　３μＭ、ＰＨ−７９７８０４　１μＭ、ＶＸ−７０２　３μＭ、ＬＹ２２２８８２０　３μＭ、ＴＡＫ−７１５　３μＭを示す。＊はｐ＜０．０１を示す。 図２０は、ｐ３８ＭＡＰＫの活性化はアポトーシスを誘導することを示す。左パネルは、位相差顕微鏡下で細胞形態を観察した（９時間後）写真である。上からコントロールアニソマイシン群、アニソマイシンおよびＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫ群を示す。９時間後、細胞からタンパク質を回収し、タンパク質の発現量の比較をｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ法により行った結果を右パネルに示す。上からｐ３８ＭＡＰＫ、リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ、Ｃａｓｐａｓｅ３およびＧＡＤＰＨ（コントロール）の発現を示す。左列よりアニソマイシンもＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫも加えていないもの（コントロール）、アニソマイシンのみを加えたもの、アニソマイシンもＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫも両方加えたものを示す。 図２１は、ＳＢ２０３５８０点眼は霊長類の角膜内皮の増殖を促進することを示す。免疫染色により増殖促進を確認した。上段はコントロールを示し、下段はＳＢ２０３５８０（３ｍＭ）を示す。左からＤＡＰＩ染色、抗Ｋｉ６７抗体での免疫染色およびマージの写真を示す。 図２２は、ＳＢ２０３５８０点眼は霊長類の角膜内皮の増殖を促進することを示す。コントロール（左）およびＳＢ２０３５８０（右）でのＫｉ６７陽性細胞の割合を示す（ｙ軸）。右眼、左眼それぞれ５視野ずつ写真撮影を行い、Ｋｉ６７の陽性細胞率について解析したところ、ＳＢ２０３５８０を点眼した眼ではＫｉ６７の陽性細胞を有意に多く認めた。＊＊はｐ＜０．０１を示す。 図２３は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は培養角膜内皮細胞の細胞死を抑制することを示す。上段左からコントロール（ＤＭＳＯのみ添加）、ＵＶ（１００Ｊ／ｍ２）、Ｚ−ＶＡＤでの染色を示し、中段は、左からＳＢ２０３５８０、ＢＩＲＢ７９６、ＰＨ−７９７８０４を示す。下段は、左から、ＶＸ−７０２、ＬＹ２２２８８２０、およびＴＡＫ−７１５を示す。使用した濃度はそれぞれ、ＳＢ２０３５８０が１０μＭ、Ｓｅｍａｐｉｍｏｄが１μＭ、ＢＩＲＢ７９６が３μＭ、ＰＨ−７９７８０４が１μＭ、ＶＸ−７０２が３μＭ、ＬＹ２２２８８２０が３μＭ、ＴＡＫ−７１５が３μＭであるＵＶにより生じる細胞障害が用いた全てのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤により抑制された。スケールバーは１００μｍを示す。 図２４は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は培養角膜内皮細胞のアポトーシスを抑制することを示す。上段左からコントロール（ＤＭＳＯのみ添加）、ＵＶ（１００Ｊ／ｍ２）、Ｚ−ＶＡＤでの染色を示し、中段は、左からＳＢ２０３５８０、ＢＩＲＢ７９６、ＰＨ−７９７８０４を示す。下段は、左から、ＶＸ−７０２、ＬＹ２２２８８２０、およびＴＡＫ−７１５を示す。緑色染色はアネキシンＶを示し、青色染色はＤＡＰＩ染色を示す。ＵＶにより生じるアポトーシスが用いた全てのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤により抑制された。スケールバーは１００μｍを示す。 図２５は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は角膜内皮のアポトーシスを抑制することを示す。Ａｎｎｅｘｉｎ　ＶおよびＤＡＰＩの染色をした結果である。緑色染色はアネキシンＶを示し、青色染色はＤＡＰＩ染色を示す。上段は、左から、ＵＶ（１００Ｊ／ｍ２）照射（コントロールとしてＤＭＳＯ）、ＶＸ−７０２、ＰＨ−７９７８０４を示す。中段は、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ２２２８８２０を示す。下段は、ＢＩＲＢ７９６、ＴＡＫ−７１５を示す。使用した濃度はそれぞれ、ＳＢ２０３５８０が１０μＭ、Ｓｅｍａｐｉｍｏｄが１μＭ、ＢＩＲＢ７９６が３μＭ、ＰＨ−７９７８０４が１μＭ、ＶＸ−７０２が３μＭ、ＬＹ２２２８８２０が３μＭ、ＴＡＫ−７１５が３μＭである。ＵＶにより生じるアポトーシスが用いた全てのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤により抑制された。スケールバーは１００μｍを示す。 図２６はｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は角膜内皮のアポトーシスを抑制することを示す。アネキシンＶ陽性細胞の割合を示す。左から、ＵＶ照射、ＳＢ２０３５８０、ＢＩＲＢ７９６、ＰＨ−７０７８０４、ＶＸ−７０２、ＬＹ２２２８８２０、およびＴＡＫ７１５を示す。検定はＤｕｎｎｅｔｔ検定を行い、＊はｐ＜０．０５を示す。
　以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　（定義）
　本明細書において「細胞分裂因子（マイトージェン）活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ」とは、マイトージェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）をリン酸化する酵素であり、セリン／トレオニンキナーゼのファミリーである。ＭＡＰキナーゼは、様々な細胞外刺激に応答して活性化され、細胞表面から核へのシグナル伝達を仲介するタンパク質セリン／スレオニンキナーゼ群である。ＭＡＰキナーゼはまた、細胞外シグナル調節性プロテインキナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ）またはＥＲＫとも呼ばれ、３キナーゼカスケードの末端酵素である。関係するが区切られたシグナル伝達経路に対する３キナーゼカスケードの反復が、一経路内で逐次的に作用するモジュール多機能シグナル伝達要素としてのＭＡＰキナーゼ経路の概念を生み、この経路ではそれぞれの酵素がリン酸化してそれによりシーケンスの次のメンバーを活性化することが特徴である。このようにして、標準的ＭＡＰキナーゼモジュールは３つのプロテインキナーゼからなる。すなわち、あるＭＡＰキナーゼキナーゼ（またはＭＥＫＫ）があるＭＡＰキナーゼキナーゼ（またはＭＥＫ）を活性化し、これが、順に、あるＭＡＰＫ／ＥＲＫ酵素を活性化する。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、ＪＮＫ（ｃ−ｊｕｎアミノ末端プロテインキナーゼ（またはＳＡＰＫ）））、およびｐ３８カスケードは、それぞれＭＥＫＫ、ＭＥＫおよびＥＲＫ、またはＭＡＰキナーゼスーパーファミリーメンバーを含む３つの酵素モジュールからなる。様々な細胞外シグナルはそれらのそれぞれの細胞表面レセプターと連合すると初期事象をトリガーし、次いでこのシグナルが細胞内部に伝達され、そこで適切なカスケードを活性化する。
　ＭＡＰキナーゼはマイトージェン活性化プロテインキナーゼ（またはＥＲＫ）スーパーファミリーであって、ＴＸＹコンセンサス配列を触媒コアに有する。ＥＲＫ１／２、ｐ３８ＨＯＧ、およびＪＮＫ／ＳＡＰＫは、平行経路における関係するが別個の末端酵素である。
　Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，５（７）：８１０−６　（Ｊｕｌ，１９９９）は、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の小分子阻害剤を同定するためのｉｎ　ｖｉｔｒｏカスケードアッセイシステムを記載している。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＭＥＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＰＫ融合タンパク質を細菌細胞から調製して、これらをこのアッセイシステムにおいてＭＥＫ１のＭＡＰＫへ、ＭＢＰ（ｍｙｅｌｉｎ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ミエリン塩基性タンパク質））への逐次リン酸化に使用した。ＭＥＫ１を直接阻害するＰＤ１８４３５２［２−（２−クロロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロ−ベンズアミド］も見出されている。
　本明細書において「ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬（「ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬」ともいう。）」とは、ｐ３８に関連するＭＡＰキナーゼのシグナル伝達を阻害する任意の薬剤をいう。したがって、ｐ３８　ＭＡＰキナーゼ阻害薬は、ＭＡＰキナーゼファミリーメンバーであるｐ３８−ＭＡＰキナーゼを標的とし、低下させる、または阻害する化合物に関する。ｐ３８　ＭＡＰキナーゼ阻害薬は水溶性のものが好ましい。水溶性でなければ、溶媒として身体に適合しにくいものを使用することが必要となりうるからである。水溶性かどうかについては薬局方の溶解度の定義に基づき分類されうる。すなわち、溶質１ｇ又は１ｍＬを溶かすに要する溶媒量として、極めて溶けやすい：１ｍＬ未満；溶けやすい：１ｍＬ以上１０ｍＬ未満；やや溶けやすい：１０ｍＬ以上３０ｍＬ未満；やや溶けにくい：３０ｍＬ以上１００ｍＬ未満；溶けにくい：１００ｍＬ以上１０００ｍＬ未満；極めて溶けにくい：１０００ｍＬ以上１００００ｍＬ未満；ほとんど溶けない：１００００ｍＬ以上と定義されており、本明細書においても同様に評価する。水溶性とは、水を溶媒としたときに、これらのうち有効量を溶解させるものであれば、任意の溶解性のものを利用することができることが理解される。たとえば、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）であれば、メタノールに可溶であるが水には溶けにくいとされ、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）の塩酸塩であれば、水に可溶とされ、水溶性に分類される。
　ｐ３８は哺乳類動物ＭＡＰキナーゼスーパーファミリーメンバーであって、ストレス、紫外光、および炎症性サイトカインにより活性化される。触媒コアにＴＧＹコンセンサス配列を有する。
　異常調節されたキナーゼは多くの疾患、特に増殖性および炎症性障害における主な病因であるということが次第に認識されている。癌領域において最初に同定される発癌遺伝子の１つは、上皮増殖因子レセプターキナーゼ（ＥＧＦＲ）に対するものであったが、その過剰発現は肺、乳、脳、前立腺、ＧＩおよび卵巣癌と関連している。例えば、ＭＡＰキナーゼの構成的活性化は多数の癌細胞系統（膵臓、大腸、肺、卵巣、および腎臓）および様々なヒト器官（腎臓、大腸、および肺）由来の原発腫瘍と関連している（Ｈｏｓｈｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８（３）：８１３−２２（Ｊａｎ．１９９９））。さらに、ｐ３８　ＭＡＰキナーゼは、炎症の発症および進行と関連する２つのサイトカイン、ＴＮＦαおよびＩＬ−１の産生を調節する。
　本発明において使用されうるｐ３８　ＭＡＰキナーゼ阻害薬は、ＶＸ−７４５（Ｖｅｒｔｅｘ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ．）の他、ｐ３８　ＭＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物であれば特に制限されず、例えば特開２００２−９７１８９号公報、特表２０００−５０３３０４号公報、特表２００１−５２２３５７号公報、特表２００３−５３５０２３号、特表２００１−５０６２６６号公報、特表平９−５０８１２３号公報、国際公開第０１／５６５５３号公報、国際公開第９３／１４０８１号公報、国際公開第０１／３５９５９号公報、国際公開第０３／６８２２９号公報、国際公開第０３／８５８５９号公報、特表２００２−５３４４６８号公報、特表２００１−５２６２２２号公報、特表２００１−５２６２２３号公報、米国特許第６３４４４７６号明細書、国際公開第０３／９９８１１号公報、国際公開第０３／９９７９６号公報、特表２００４−５０６０４２号公報、国際公開第０４／６０２８６号公報、特表２００２−３６３１７９号公報、特表２００４−１０７３５８号公報、米国特許第５６７０５２７号明細書、米国特許第６０９６７５３号明細書、国際公開第０１／４２１８９号公報、国際公開第００／３１０６３号公報などの特許公報に記載された化合物が挙げられ、好ましくは４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０２１９０）、ｔｒａｎｓ−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール（ＳＢ−２３９０６３）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）、４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシピリミジン−４−イル）−１−（ピペリジン−４−イル）イミダゾール（ＳＢ−２４２２３５）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−１−ブチニル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＲＷＪ−６７６５７）、４−（４−フルオロフェニル）−１−（ピペリジン−４−イル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＨＥＰ−６８９）、（Ｓ）−２−（２−アミノ−３−フェニルプロピルアミノ）−１−メチル−５−（２−ナフチル）−４−（４−ピリジル）ピリミジン−６−オン（ＡＭＧ−５４８）、２−クロロ−４−（４−フルオロ−２−メチルアニリノ）−２’−メチルベンゾフェノン（ＥＯ−１６０６）、３−（４−クロロフェニル）−５−（１−ヒドロキシアセチルピペリジン−４−イル）−４−（ピリミジン−４−イル）ピラゾール（ＳＤ−０６）、５−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（２，４−ジフルオロフェニルチオ）ピリミド［３，４−ｂ］ピリダジン−６−オン（ＶＸ−７４５）、４−アセチルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルベンズアミド（ＣＰＩ−１１８９）、Ｎ−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−メチルフェニル）ピラゾール−５−イル）−Ｎ’−［４−（２−モルホリノエトキシ）−１−ナフチル］ウレア（ドラマピモド（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ））、２−ベンズアミド−４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）チアゾール−５−イル］ピリジン（ＴＡＫ−７１５）、ＳＣＩＯ−４６９、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２；２−（２，４−ジフルオロフェニル）−６−（１−（２，６−ジフルオロフェニル）ウレイド）ニコチンアミド）、ＧＳＫ−６８１３２３、ＰＳ−５４０４４６、ＳＣ−８００３６、ＡＶＥ−９９４０、ＲＯ−３２０−１１９５、１−（１，３−ジヒドロキシプロプ−２−イル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−［２−フェノキシピリミジン−４−イル］イミダゾール（ＳＢ−２８１８３２）、２−［５−（｛４−［（４−フルオロフェニル）メチル］ピペリジン−１−イル｝カルボニル）−６−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−インドル−３−イル］−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２−オキソアセトアミド（ＳＣＩＯ−３２３）、２−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ｍ−トリル−２Ｈ−ピラゾル−３−イル）−２−ヒドロキシイミド−Ｎ−［４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ナフタレン−１−イル］−アセトアミド（ＫＣ−７０６）、：Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−（２−アミジノヒドラゾノ）エチル］フェニル］デカンジアミド、Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル］フェニル］デカンジアミド（セマピモド（Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ））、３−（３−ブロモ−４−（（２，４−ジフルオロベンジル）オキシ）−６−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）−Ｎ，４−ジメチルベンズアミド（ＰＨ−７９７８０４）および５−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−３−ネオペンチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン（ＬＹ２２２８８２０）である。
　さらに、Ｔｏｃｒｉｓ　Ｃｏｏｋｓｏｎ社（Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｏｃｒｉｓ．ｃｏｍ／に例示される様々なＭＡＰキナーゼ阻害薬を提供する。例えば、ＳＢ２０２１９０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−ピリジニル）−ｌＨ−イミダゾル−２−イル］フェノール）は、高度に選択的、強力、かつ細胞浸透性のｐ３８　ＭＡＰキナーゼ阻害薬である（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ，ｐｌｃ）（Ｊｉａｎｇｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７１：１７９２０　（１９９６）；Ｆｒａｎｔｚｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１３８−４６（１９９８）；Ｎｅｍｏｔｏｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１６４１５　（１９９８）；およびＤａｖｉｅｓｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３５１：９５　（２０００））。また、アニソマイシン（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−［（４−メトキシフェニル）メチル］−３，４−ピロリジンジオール−３−アセテート）は、タンパク質合成インヒビター（翻訳をブロックする）である。これは、ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ）およびｐ３８　ＭＡＰキナーゼの強力なアクチベーターであり、前初期遺伝子（ｃ−ｆｏｓ、ｆｏｓＢ、ｃ−ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、およびｊｕｎＤ）誘導の相同的脱感作を選択的に誘発する強力なシグナル伝達アゴニストとして作用する。ＰＤ９８０５９（２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）は、マイトージェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）の特異的阻害薬である（Ｐｆｉｚｅｒ＝Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ）。ＳＢ２０３５８０（４−［５−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−ｌＨ−イミダゾル−４−イル］ピリジン）は、ｐ３８マイトージェン活性化プロテインキナーゼの高度に選択的な阻害薬（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍ，ｐｌｃ）である。インターロイキン−２−誘導によるＴ細胞増殖、シクロオキシゲナーゼ−１および−２、ならびにトロンボキサンシンターゼを阻害することが示されている。ＳＢ２０３５８０塩酸塩（４−［５−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−ｌＨ−イミダゾル−４−イル］ピリジン）化合物は、高度に選択的なｐ３８マイトージェン活性化プロテインキナーゼの阻害薬の水溶性塩である。インターロイキン−２−誘導によるＴ細胞増殖、シクロオキシゲナーゼ−１および−２、ならびにトロンボキサンシンターゼを阻害することが示されている。Ｕ０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス［２−アミノフェニルチオ］ブタジエン）は、ＭＡＰキナーゼキナーゼの強力かつ選択的な非競合性の阻害薬である。
　好ましいｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬としては、ＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）が例示されるがそれに限定されない。
　このほかの、本発明で用いることができるｐ３８　ＭＡＰキナーゼ阻害薬としては、例えば、ｐ３８　ＭＡＰキナーゼに対する中和抗体、ｐ３８　ＭＡＰキナーゼの活性を阻害する化合物、ｐ３８　ＭＡＰキナーゼをコードする遺伝子の転写を阻害する化合物（例えば、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ、リボザイム）、ペプチド、および植物成分（例えば、ポリフェノール、フラボノイド、配糖体）等の化合物が挙げられる。使用される濃度として、約５０ｎｍｏｌ／ｌ~１００μｍｏｌ／ｌが例示され、通常、約０．００１~１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１~７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~５０μｍｏｌ／ｌ、約１~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５~１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５~１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９~３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９~３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~１．０μｍｏｌ／ｌであるがこれらに限定されない。
　本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、上述のＰ３８　ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路のメンバー等をコードする遺伝子（核酸）の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの実施形態としては、上述のＰ３８　ＭＡＰキナーゼ等をコードする遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のＰ３８　ＭＡＰキナーゼ等をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有するＰ３８　ＭＡＰキナーゼ等をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも１２塩基以上２５塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば、１１塩基以下、１００塩基以上、または５００塩基以上であってもよい。アンチセンス核酸は、ＤＮＡのみから構成されていてもよいが、ＤＮＡ以外の核酸、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよい。１つの実施形態としては、本発明で用いられるアンチセンス核酸は、５’末端にＬＮＡ、３’末端にＬＮＡを含むＬＮＡ含有アンチセンス核酸であってもよい。また、本発明において、アンチセンス核酸を用いる実施形態では、例えば平島および井上，新生化学実験講座２　核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，１９９３，３１９−３４７．に記載される方法を用いて、Ｐ３８　ＭＡＰキナーゼ等の核酸配列に基づき、アンチセンス配列を設計することができる。
　Ｐ３８　ＭＡＰキナーゼ等の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ　Ｐに含まれるＭ１　ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．）。
　例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ，１９８８，２２８，２２８．）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ，１９８８，２３９，２８５．、小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．、Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１９８９，１７，７０５９．）。
　また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えば、タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，ＪＭ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２３，３４９．）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．＆　Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１９９１，１９，６７５１．、菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，１１２．）。このように、リボザイムを用いてＰ３８　ＭＡＰキナーゼ等をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
　Ｐ３８　ＭＡＰキナーゼ等の内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」と略称する）によっても行うことができる。ＲＮＡｉは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が直接細胞内に取り込まれると、このｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いることにより、ＲＮＡｉを誘導する事が可能で、ＲＮＡｉは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。ｓｉＲＮＡについては、本明細書において他の箇所において詳述される。
　本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」とは、１５~４０塩基からなる二本鎖ＲＮＡ部分を有するＲＮＡ分子であり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。詳細には、本発明におけるｓｉＲＮＡは、Ｐ３８　ＭＡＰキナーゼ等のｍＲＮＡ中の連続したＲＮＡ配列と相同な配列からなるセンスＲＮＡ鎖と、該センスＲＮＡ配列に相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ部分を含むＲＮＡである。かかるｓｉＲＮＡおよび後述の変異体ｓｉＲＮＡの設計および製造は当業者の技量の範囲内である。Ｐ３８　ＭＡＰキナーゼ等の配列の転写産物であるｍＲＮＡの任意の連続するＲＮＡ領域を選択し、この領域に対応する二本鎖ＲＮＡを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるｍＲＮＡ配列から、より強いＲＮＡｉ効果を有するｓｉＲＮＡ配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。ｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
　二本鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５~４０塩基、好ましくは１５~３０塩基、より好ましくは１５~２５塩基、更に好ましくは１８~２３塩基、最も好ましくは１９~２１塩基である。これらの上限および下限は、これら特定のものに限定されず、これら列挙されているものの任意の組み合わせであってもよいことが理解される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよく、３’端が突き出したタイプが好ましい。センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖の３’末端に数個の塩基、好ましくは１~３個の塩基、さらに好ましくは２個の塩基からなるオーバーハングを有するｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制する効果が大きい場合が多く、好ましいものである。オーバーハングの塩基の種類は特に制限はなく、ＲＮＡを構成する塩基あるいはＤＮＡを構成する塩基のいずれであってもよい。好ましいオーバーハング配列としては、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）等を挙げることができる。例えば、好ましいｓｉＲＮＡとしては、全てのｓｉＲＮＡのセンス・アンチセンス鎖の、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）をつけているものが挙げられるがそれに限定されない。
　さらに、上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の一方または両方において１~数個までのヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されているｓｉＲＮＡも用いることができる。ここで、１~数塩基とは、特に限定されるものではないが、好ましくは１~４塩基、さらに好ましくは１~３塩基、最も好ましくは１~２塩基である。かかる変異の具体例としては、３’オーバーハング部分の塩基数を０~３個としたもの、３’−オーバーハング部分の塩基配列を他の塩基配列に変更したもの、あるいは塩基の挿入、付加または欠失により上記センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖の長さが１~３塩基異なるもの、センス鎖および／またはアンチセンス鎖において塩基が別の塩基にて置換されているもの等が挙げられるが、これらに限定されない。ただし、これらの変異体ｓｉＲＮＡにおいてセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイゼーションしうること、ならびにこれらの変異体ｓｉＲＮＡが変異を有しないｓｉＲＮＡと同等の遺伝子発現抑制能を有することが必要である。
　さらに、ｓｉＲＮＡは、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するｓｉＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ　Ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖ＲＮＡ、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖ＲＮＡ、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含むＲＮＡであり、センス鎖部分とアンチセンス鎖部分がハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡ部分を形成する。
　ｓｉＲＮＡは、臨床使用の際には、いわゆるｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を示さないことが望ましい。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果とは、標的遺伝子以外に、使用したｓｉＲＮＡに部分的にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制する作用をいう。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けるために、候補ｓｉＲＮＡについて、予めＤＮＡマイクロアレイなどを利用して交差反応がないことを確認することが可能である。また、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などが提供する公知のデータベースを用いて、標的となる遺伝子以外に候補ｓｉＲＮＡの配列と相同性が高い部分を含む遺伝子が存在しないかを確認する事によって、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けることが可能である。
　本発明のｓｉＲＮＡを作製するには、化学合成による方法および遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖配列やアンチセンス鎖配列をコードする発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含み、ヘアピン構造を形成するｓｈＲＮＡを発現させることにより、所望の二本鎖ＲＮＡを作製することもできる。
　ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制活性を有する限りにおいては、ｓｉＲＮＡを構成する核酸の全体またはその一部は、天然の核酸であってもよいし、修飾された核酸であってもよい。
　本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖ＲＮＡである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組（この「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２~５個程度の少数を指す。）の２本鎖ＲＮＡの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機およびＤＩＣＥＲ酵素を用いて適宜作製することが可能であり、また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のｓｉＲＮＡには、所謂「カクテルｓｉＲＮＡ」が含まれる。また、本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド（ＲＮＡ）でなくともよい。即ち、本発明において、ｓｉＲＮＡを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことをいう。
　さらに、本発明の上記ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）もまた、Ｐ３８　ＭＡＰキナーゼ等の発現を抑制し得る核酸の好ましい実施形態に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）は、該二本鎖ＲＮＡの一方の鎖をコードするＤＮＡ、および該二本鎖ＲＮＡの他方の鎖をコードするＤＮＡが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するＤＮＡである。本発明の上記ＤＮＡは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
　本発明において標的遺伝子の発現を抑制する核酸には、修飾された核酸を用いてもよい。修飾された核酸とは、ヌクレオシド（塩基部位、糖部位）および／またはヌクレオシド間結合部位に修飾が施されていて、天然の核酸と異なった構造を有するものを意味する。修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド」としては、例えば、無塩基（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。上記糖修飾を有するヌクレオシドには、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース等の置換五単糖；１’，２’−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。これらのヌクレオシドは塩基部位が修飾された修飾塩基であってもよい。このような修飾塩基には、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メテルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；および他の複素環塩基等が挙げられる。
　修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド間結合」としては、例えば、アルキルリンカー、グリセリルリンカー、アミノリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデートなどの非天然ヌクレオシド間結合が挙げられる。
　本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡに含まれる核酸配列としては、Ｐ３８　ＭＡＰキナーゼまたは他のＰ３８　ＭＡＰキナーゼシグナルのメンバーに対するｓｉＲＮＡなどを挙げることができる。
　また、本発明の核酸または薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入することができる。そして、得られる細胞を例えば、静脈内、動脈内等に全身投与する。眼の必要な部位等に局所的に投与することもできる。ｓｉＲＮＡはｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまうため持続時間が限られるためより最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。一つの例としては、Ｏｃｈｉｙａ，Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．，５：７０７−７１０，１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，１　：３１−５２，２００１より生体親和性材料であるアテロコラーゲンが核酸と混合し複合体を形成させると、生体中の分解酵素から核酸を保護する作用がありｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適しているキャリアーであると報告されており、このような形態を利用することができるが、本発明の核酸、治療または予防薬の導入の方法はこれには限られない。このようにして、生体内においては血清中の核酸分解酵素の働きにより、速やかに分解されてしまうため長時間の効果の継続を達成することができる。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ　Ｆ．ＰＮＡＳ．（２００３）　１０２（３４）　１２１７７−８２、Ｍｉｎａｋｕｃｈｉ　Ｙ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅｒｃｈ（２００４）　３２（１３）　ｅ１０９では、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、ｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適していると報告されており、このような技術を用いることができる。
　本明細書において「細胞増殖、細胞障害抑制または細胞老化抑制を必要とする角膜内皮疾患、障害または状態」は、角膜内皮の疾患、障害または状態であって、細胞増殖が必要とされる角膜内皮の障害、細胞障害または細胞老化の少なくとも１つに関連する任意の疾患、障害または状態であって、細胞増殖、細胞障害抑制または細胞老化抑制を行うことによって改善または治癒が達成されうる任意の疾患、障害または状態をいう。細胞増殖、細胞障害抑制または細胞老化抑制を必要とする角膜内皮疾患、障害または状態としては、たとえば、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後の持続する角膜内皮密度減少、外傷、眼科手術、加齢、角膜内皮炎等に関連する障害等を挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において「細胞増殖が必要とされる角膜内皮の障害」とは、外傷、手術などにより角膜内皮が欠損している状態をいい、「細胞障害」とは、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜内皮炎などによりアポトーシス、細胞死などが生じている状態をいい、「細胞老化」とは細胞質の拡大、細胞密度の低下、細胞の大小不同の増加、六角形細胞率の低下、細胞増殖能の低下などが生じている状態をいう。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；　Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；　Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；　Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；　Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。角膜内皮細胞については、Ｎａｎｃｙ　Ｊｏｙｃｅらの報告｛Ｊｏｙｃｅ，２００４　＃１６１｝｛Ｊｏｙｃｅ，２００３　＃７｝がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　（好ましい実施形態の説明）
　以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
　１つの局面において、本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬を含む、細胞増殖を必要とする角膜内皮障害の治療または予防薬を提供する。ｐ３８ＭＡＰキナーゼは、種々のシグナル伝達に関与するとされており、炎症に関与するともされているが、角膜内皮では、そのメカニズムのすべては明らかにされておらず、特に細胞増殖を必要とする角膜内皮障害、たとえば、その阻害によって創傷の治癒または予防に有効であることは予想できなかった。したがって、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬を細胞増殖を必要とする角膜内皮障害の治療または予防に応用することは本発明者らが予想外に見出した発見であるといえる。特に、点眼薬として利用可能な実施形態のものは、従来見出されておらず、そのような形態についても実際の離床現場において評価が高いというべきである。
　１つの実施形態では、前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は水溶性である。水溶性であれば、溶媒として生体適合性に問題ではない水を利用することができるからである。水溶性でなくても、医薬として許容される溶媒（例えば、エタノール等）に溶解するものであれば、利用することができる。溶解性については薬局方の溶解度の定義に基づき分類されうる。すなわち、溶質１ｇ又は１ｍＬを溶かすに要する溶媒量として、極めて溶けやすい：１ｍＬ未満；溶けやすい：１ｍＬ以上１０ｍＬ未満；やや溶けやすい：１０ｍＬ以上３０ｍＬ未満；やや溶けにくい：３０ｍＬ以上１００ｍＬ未満；溶けにくい：１００ｍＬ以上１０００ｍＬ未満；極めて溶けにくい：１０００ｍＬ以上１００００ｍＬ未満；ほとんど溶けない：１００００ｍＬ以上とされており、本発明の成分の評価においても同様に判断する。水溶性とは、水を溶媒としたときに、これらのうち有効量を溶解させるものであれば、任意の溶解性のものを利用することができることが理解される。標準的には、本発明についていえば、対象となる溶解性（（水であれば、水溶性））は、「溶けやすい」の範疇以上のものをいうが、「やや溶けやすい」ものも場合によって使用することができ、低濃度で効果があるものであれば、「やや溶けにくい」ものや「溶けにくい」の分類にあたるものも使用することができる。たとえば、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）であれば、メタノールに可溶であるが水には溶けにくいとされ、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）の塩酸塩であれば、水に可溶とされ、水溶性に分類される。
　１つの実施形態において、本発明の利用法としては、点眼薬以外に前房内への注射、徐放剤への含浸、結膜下注射、全身投与（内服、静脈注射）などの投与方法を挙げることができる。
　１つの実施形態では、本発明において用いられるｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０２１９０）、ｔｒａｎｓ−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール（ＳＢ−２３９０６３）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）、４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシピリミジン−４−イル）−１−（ピペリジン−４−イル）イミダゾール（ＳＢ−２４２２３５）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−１−ブチニル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＲＷＪ−６７６５７）、４−（４−フルオロフェニル）−１−（ピペリジン−４−イル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＨＥＰ−６８９）、（Ｓ）−２−（２−アミノ−３−フェニルプロピルアミノ）−１−メチル−５−（２−ナフチル）−４−（４−ピリジル）ピリミジン−６−オン（ＡＭＧ−５４８）、２−クロロ−４−（４−フルオロ−２−メチルアニリノ）−２’−メチルベンゾフェノン（ＥＯ−１６０６）、３−（４−クロロフェニル）−５−（１−ヒドロキシアセチルピペリジン−４−イル）−４−（ピリミジン−４−イル）ピラゾール（ＳＤ−０６）、５−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（２，４−ジフルオロフェニルチオ）ピリミド［３，４−ｂ］ピリダジン−６−オン（ＶＸ−７４５）、４−アセチルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルベンズアミド（ＣＰＩ−１１８９）、Ｎ−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−メチルフェニル）ピラゾール−５−イル）−Ｎ’−［４−（２−モルホリノエトキシ）−１−ナフチル］ウレア（ドラマピモド（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ））、２−ベンズアミド−４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）チアゾール−５−イル］ピリジン（ＴＡＫ−７１５）、タルマピモド（Ｔａｌｍａｐｉｍｏｄ；ＳＣＩＯ−４６９）、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２；２−（２，４−ジフルオロフェニル）−６−（１−（２，６−ジフルオロフェニル）ウレイド）ニコチンアミド）、ジルマピモド（ｄｉｌｍａｐｉｍｏｄ；ＧＳＫ−６８１３２３）、４−（５−（シクロプロピルカルバモイル）−２−メチルフェニルアミノ）−５−メチル−Ｎ−プロピルピロロ（１，２−ｆ）（１，２，４）トリアジン−６−カルボキサミド（ＰＳ−５４０４４６）、抗ＦＧＦ−７抗体（ＳＣ−８００３６）、ＡＶＥ−９９４０（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、［５−アミノ−１−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−４−イル］［３−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロポキシ）フェニル］メタノン（ＲＯ−３２０−１１９５）、１−（１，３−ジヒドロキシプロプ−２−イル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−［２−フェノキシピリミジン−４−イル］イミダゾール（ＳＢ−２８１８３２）、２−［５−（｛４−［（４−フルオロフェニル）メチル］ピペリジン−１−イル｝カルボニル）−６−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−インドル−３−イル］−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２−オキソアセトアミド（ＳＣＩＯ−３２３）、２−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ｍ−トリル−２Ｈ−ピラゾル−３−イル）−２−ヒドロキシイミド−Ｎ−［４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ナフタレン−１−イル］−アセトアミド（ＫＣ−７０６）、Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−（２−アミジノヒドラゾノ）エチル］フェニル］デカンジアミド、Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル］フェニル］デカンジアミド（セマピモド（Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ））、３−（３−ブロモ−４−（（２，４−ジフルオロベンジル）オキシ）−６−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）−Ｎ，４−ジメチルベンズアミド（ＰＨ−７９７８０４）、および５−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−３−ネオペンチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン（ＬＹ２２２８８２０）からなる群より選択される少なくとも１つを含む。
　好ましい実施形態では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は、４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（ＳＢ２０３５８０）、Ｎ−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−メチルフェニル）ピラゾール−５−イル）−Ｎ’−［４−（２−モルホリノエトキシ）−１−ナフチル］ウレア（ドラマピモド（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ）；ＢＩＲＢ７９６）、２−ベンズアミド−４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）チアゾール−５−イル］ピリジン（ＴＡＫ−７１５）、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２；２−（２，４−ジフルオロフェニル）−６−（１−（２，６−ジフルオロフェニル）ウレイド）ニコチンアミド）Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル］フェニル］デカンジアミド（セマピモド（Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ））、３−（３−ブロモ−４−（（２，４−ジフルオロベンジル）オキシ）−６−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）−Ｎ，４−ジメチルベンズアミド（ＰＨ−７９７８０４）、および５−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−３−ネオペンチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン（ＬＹ２２２８８２０）、ならびにそれらの塩からなる群より選択される。より好ましくは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（ＳＢ２０３５８０）またはその塩を含む。好ましくは、塩は、医薬として許容される塩である。
　別の実施形態では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（ＳＢ２０３５８０）塩酸塩を含む。４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（ＳＢ２０３５８０）塩酸塩は水溶性であり、点眼薬として直接利用可能であり、副作用の危険性も少なく、創傷治癒として好ましいからである。
　本発明で使用されるｐ３８　ＭＡＰキナーゼ剤の濃度は、通常約０．１~１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１~３０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは約１μｍｏｌ／ｌであり、数種類使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１~１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１~７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~５０μｍｏｌ／ｌ、約１~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５~１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５~１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９~３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９~３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~１．０μｍｏｌ／ｌを挙げることができるがこれらに限定されない。
　１つの実施形態では、本発明の治療または予防薬は、角膜内皮を有する任意の動物、例えば哺乳動物を対象とすることができ、好ましくは霊長類の角膜内皮の治療または予防を目的とする。好ましくは、この治療または予防の対象は、ヒトの角膜内皮である。
　１つの実施形態では、本発明の治療および予防薬が対象とする角膜内皮疾患、障害または状態は、細胞増殖、細胞障害抑制または細胞老化抑制を必要とする角膜内皮疾患、障害または状態であり、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後の持続する角膜内皮密度減少、外傷、眼科手術、加齢、角膜内皮炎等に関連する障害等を挙げることができるがそれらに限定されない。
　別の局面では、本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬の有効量をそれを必要な被験体に投与する工程を含む、細胞増殖を必要とする角膜内皮障害の治療または予防のための方法を提供する。
　本発明の治療および予防薬または方法の投与（移植）対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。霊長類での角膜内皮治療はこれまで十分な成績が達成されておらず、その意味で本発明は画期的な治療法および医薬を提供する。特に、角膜内皮の創傷モデルを用いた症例でｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬を用いて良好な治療成績を上げたのは本発明が初めてである。投与量、投与回数は、症状、年齢、体重、投与形態により異なるが、通常成人に対し、例えば点眼剤として使用する場合には、有効成分を約０．０００１~０．５ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００３~０．０３ｗ／ｖ％含有する製剤を、１日あたり１~１０回、好ましくは１~６回、より好ましくは１~３回、１回当たり約０．０１~０．１ｍＬ投与することができる。本発明の医薬を前房内に注入する場合には、上記濃度の１０分の１~１０００分の１の濃度のものが使用され得る。当業者は疾患の状態によって、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬の種類および濃度を適宜選択することができる。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
　以下に、本発明の角膜内皮細胞の細胞を正常に培養する例を記載する。実験動物の使用にあたっては、動物を用いる生物医学研究に関する原則（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｇｕｉｄｉｎｇ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ　Ａｎｉｍａｌｓ）ならびに、動物の愛護および管理に関する法律、実験動物の飼養および保管等に関する基準に従った。また、本実験はＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎ　Ｖｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌｓ　ｉｎ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ　ａｎｄ　Ｖｉｓｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈに従って行った。組織の単離は、それぞれ、日精バイリス株式会社滋賀研究所（Ｓｈｉｇａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｉｓｓｅｉ　Ｂｉｌｉｓ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）（滋賀県大津市）（Ｏｈｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）の動物実験倫理委員会および株式会社イブバイオサイエンス（Ｅｖｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）（和歌山県橋本市）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）の動物実験委員会による承認を受けた。また、該当する場合生物試料等の取り扱いは、厚生労働省、文部科学省等において規定される基準を遵守し、該当する場合はヘルシンキ宣言またはその宣言に基づき作成された倫理規定に基づいて行った。研究のための眼の寄贈については、全ての故人ドナーの近親者から同意書を得た。
　（実験手法：研究グレードのヒト角膜組織）
　１２個のヒトドナー角膜は、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭアイバンクから入手し、全ての角膜を、初代培養前に１４日未満の期間にわたり、保存培地（Ｏｐｔｉｓｏｌ；Ｃｈｉｒｏｎ　Ｖｉｓｉｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中、４℃で保存した。
　（統計解析）
　２サンプルの比較の平均値における統計的有意差（Ｐ値）は、スチューデントのｔ検定を用いて決定した。複数のサンプルセットの比較における統計的有意差は、ダネットの多重比較検定を用いて解析した。グラフに示す値は平均±ＳＥを表す。
　（材料および方法）
・ヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ、入手先および培養方法）：ＨＣＥＣは、以下のように培養した。簡単に述べると、シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より、角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離して、コラゲナーゼ（ＲＯＣＨＥ　カタログ番号：１０　１０３　５８６　００１）を用いて基底膜よりはがして（代表的には、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて３７℃にて２時間処理した。）回収後、初代培養を行った。培地はヒトはＯｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ　Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ　Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ　カタログ番号：３１９８５−０７０）に、８％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）、２００ｍｇ／ｍｌ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ　カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）、０．０８％　コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ　カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）、２０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ　カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）、５０μｇ／ｍｌ　ゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ　カタログ番号：１５７１０−０６４）および５ｎｇ／ｍｌ　ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ　カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を加えた３Ｔ３フィーダー細胞用に馴化させたものを用いた。具体的には、３７℃での消化後、個々の角膜から得られたＨＣＥＣを培養培地中に再懸濁させ、ＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘ（登録商標）でコーティングした１２ウェルプレートの１ウェルにプレーティングした。培養培地は、一部の改変を加えた公開されたプロトコルに従って調製した。簡単に述べると、ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、８％　ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ　上皮増殖因子（ＥＧＦ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２０μｇ／ｍＬ　アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２００ｍｇ／Ｌ　塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０８％　コンドロイチン硫酸（和光純薬工業株式会社、大阪市）および５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有する基本培養培地を準備し、次いで、不活性化３Ｔ３線維芽細胞の培養後に馴化培地を回収した。３Ｔ３線維芽細胞の不活性化は、以前に記載されたとおりに実施した。簡単に述べると、コンフルエントな３Ｔ３線維芽細胞を４μｇ／ｍＬ　マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）（協和発酵キリン株式会社、東京都）とともに、５％ＣＯ２下で３７℃にて２時間インキュベートし、次いでトリプシン処理し、そして、２×１０４細胞／ｃｍ２の密度でプラスチック皿にプレーティングした。ＨＣＥＣは、５％ＣＯ２中３７℃にて加湿雰囲気下で培養し、２日おきに培養培地を交換した。ＨＣＥＣが１４~２８日でコンフルエントに達すると、これらを、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋非含有ＰＢＳ中でリンスし、３７℃にて５分間０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理し、そして、１：２の比で継代した。
・染色等の細胞観察方法（組織学的試験）：細胞観察は位相差顕微鏡にて行った。また、細胞を固定した後に機能関連マーカーとしてＺＯ−１、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅを用いて免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。組織染色検査のために、培養したＨＣＥＣをＬａｂ−ＴｅｋＴＭ　Ｃｈａｍｂｅｒ　ＳｌｉｄｅｓＴＭ（ＮＵＮＣ　Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に入れ、４％ホルムアルデヒドで１０分間室温（ＲＴ）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。具体的には、Ｌａｂ−ＴｅｋＴＭＣｈａｍｂｅｒ　ＳｌｉｄｅｓＴＭ（ＮＵＮＣ　Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）上の培養ＨＣＥＣを室温で１０分間４％ホルムアルデヒド中で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。ＣＥＣの表現型を調べるために、密着結合関連タンパク質であるＺＯ−１（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ポンプ機能に関連するタンパク質であるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ　Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、フィブロネクチン（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）およびアクチンの免疫組織化学分析を行った。ＣＥＣの機能に関連するマーカーとしてＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅを使用し、線維芽細胞様の変化を評価するためにフィブロネクチンおよび１型コラーゲンを使用し、そして、細胞の形態を評価するためにアクチンの染色を使用した。ＺＯ−１、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、１型コラーゲンおよびフィブロネクチンの染色は、それぞれ、ＺＯ−１ポリクローナル抗体、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅモノクローナル抗体、およびフィブロネクチンモノクローナル抗体の１：２００希釈を用いて実施した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識、または、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２０００希釈を使用した。アクチンの染色は、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ファロイジン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：４００希釈を用いて実施した。次いで、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）またはＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡（ＴＣＳ　ＳＰ２　ＡＯＢＳ；Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｌｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
・ウェスタンブロット法：ＲＩＰＡバッファーで抽出し得られたタンパク質を７．５％ポリアクリルアミドで電気泳動した。分離されたタンパク質はＰＶＤＦ膜（ＰＡＬＬ　ＬＩＦＥ　ＳＣＩＥＮＣＥ社製、カタログ番号：ＥＨ−２２２２）に転写した。０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリエチレンソルビタンモノラウレート（ナカライテスク、カタログ番号：２８３５３−８５）（ＴＢＳ−Ｔ）と５％無脂肪乾燥乳（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：９９９９）を補ったＴｒｉｓ緩衝化食塩水（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭＮａＣｌ）と、ブロットした膜を１時間インキュベートすることによりブロッキング操作を行った。この後、ｐ２７（ＳＣ−５２７、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ）、ｐ２１（２９４６、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ１６（４８２４、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ−ｐＲｂ（９３０８、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、サイクリンＤ１（２９２６、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、サイクリンＤ３（２９３６、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐｐ３８（４６３１、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ−ＡＴＦ２（ＳＣ−８３９８、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ）、ＧＡＰＤＨ（２１１８、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対する抗体を補ったＴＢＳ−Ｔにて１０００倍に希釈したものをメンブレンに浸し、室温で１時間反応させた。Ｔ−ＴＢＳで３回洗浄後、マウス−ＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：７０７４Ｐ２）とウサギ−ＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：ＮＡ９３４）インキュベートし、洗浄後、ＥＣＬ−ＡＤＶＡＶＣＥ（ＧＥ　ヘルスケア・ジャパン社、カタログ番号：ＲＰＮ２１３５Ｖ）で発光させたバンドを検出した。・免疫染色：コンフルエントに達した細胞をＰＢＳ（ニッスイ、カタログ番号：５９１３）洗浄後、氷冷したエタノール（ナカライテスク、カタログ番号：１４７１３−９５）と酢酸（ＷＡＫＯ　カタログ番号：０１７−００２５６）（９５：５）にて１０分間固定した。
　０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリエチレンソルビタンモノラウレート（ナカライテスク、カタログ番号：２８３５３−８５）（ＴＢＳ−Ｔ）と１０％ウシ胎仔血清を補ったＴｒｉｓ緩衝化食塩水（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭＮａＣｌ）で１時間インキュベートすることによりブロッキング操作を行った。ウサギ抗ヒトＺＯ−１抗体（１：２００）、マウス抗ヒトＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ抗体（１：２００）を一次抗体として使用し、室温にて１時間反応させた。希釈率は、１：２００または１：１０００を適宜使用した。
　次いでＴＢＳ−Ｔにて１０００倍に希釈したＡＬＥＸＡ　ＦＬＵＯＲ　５９４（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製（カタログ番号：Ａ２１２０３））とＡＬＥＸＡ　ＦＬＵＯＲ　４８８（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製（カタログ番号：Ａ２１２０６））で室温で１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ　ＷＩＴＨ　ＤＡＰＩ　（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社（カタログ番号：９４０１０））とともにスライドに封入し、共焦点顕微鏡（ライカ社製）で観察した。
・Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅに対する抗体：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ　カタログ番号：０５−３６９）のものを用いた。
・ＺＯ−１に対する抗体：マウスＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ　カタログ番号：３３９１００）、ウサギＺＹＭＥＤ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製（ＺＹＭＥＤ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ　カタログ番号：６１−７３００）のものを用いた。
・ＧＡＰＤＨに対する抗体：ＡＢＣＡＭ社製（カタログ番号：ａｂ３６８４０）のものを用いた。
・二次抗体（ＨＰＲ結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体）Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製（カタログ番号：７０７４）
・二次抗体（抗ウサギＩｇＧ二次抗体）Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製（カタログ番号：７０７６）
・サイトカイン抗体
角膜内皮細胞を１０μＭ　ＳＢ２０３５８０存在下で培養して培養上清を回収し試料液とした。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（＃ＡＲＹ００５，Ｒ＆Ｄ）で培養上清中のサイトカインを網羅的に半定量した。サイトカイン抗体をブロットしたメンブレンをトレイに置き、ブロッキング液を２ｍｌ添加し、室温で１時間インキュベートした。試料液にビオチン抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング液を捨て抗体溶液をメンブレンに浸して４℃で一晩インキュベートした。メンブレンを洗浄後、ブロッキング液で希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を２ｍｌ加え、３０分間室温でインキュベートした。メンブレンを洗浄後、基質液を加え、ＬＡＳ４００（フジフィルム）で検出した。
・ＰＣＲ法：ＲＴ−ＰＣＲ（半定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）により、各ラミニン鎖およびインテグリン鎖に対するＰＣＲ法を行った。プライマーは、オリゴヌクレオチド合成会社であるＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮから購入し、脱塩処理したものを用いた。細胞からの総ＲＮＡの抽出にはＲＮＥａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、カタログ番号：７４１０６）を用いた。シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より、角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離して、角膜内皮細胞からのＲＮＡ抽出に用いた。ＲＮＡはＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社（カタログ番号：ＴＲＴ−１０１））により逆転写反応（４２℃、６０分間）を行い、ＴＡＫＡＲＡ　ＴａｑＨｏｔＳｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社、カタログ番号：ＲＲ００１Ａ）によりＧＡＰＤＨを内部標準としてＣＤ１６６、ＣＤ７３を増幅した。同量のｃＤＮＡを、ＰＣＲ機（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、下記のプライマーペアによって増幅した。ＰＣＲ反応には下記に示すプライマーを用いた。これらのプライマーはライフテクノロジーズジャパン株式会社（カタログ番号：１０３３６０２２）から入手した。
・ＩＬ６−Ｆ：ＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＡＧＴＴ（配列番号１）
・ＩＬ６−Ｒ：ＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣ（配列番号２）
・ＧＡＰＤＨ−Ｆ：ＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号３）
・ＧＡＰＤＨ−Ｒ：ＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号４）
　増幅されたＤＮＡ断片は１．５％アガロースゲル（ナカライテスク、カタログ番号：０１１４９−７６）で電気泳動し、エチジウムブロマイド（ナカライテスク、カタログ番号：１４６０３−５１）での染色により検出した。
・ＲＴ−ＰＣＲによるヒト角膜内皮細胞のＩＬ−６発現量の定量は以下の方法で行った。
ヒト角膜内皮細胞（ｎ＝３，ｐａｓｓａｇｅ５）を１０μＭ　ＳＢ２０３５８０存在下で２０日間培養後、ＲｎｅａｓｙＭｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ）でＲＮＡ抽出を行った。ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ２７７ｎｇをＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（Ｔｏｙｏｂｏ）で逆転写し、ｃＤＮＡ合成したものをテンプレートとし、ＰＣＲを行った。一本鎖ｃＤＮＡ合成の反応混合物１μｌを含有するＰＣＲ溶液１０μｌを９４℃
の初期温度にて１分間そして次に９４℃にて１分間、５４℃にて３０秒間及び７２℃にて３０秒間、加熱した。この温度サイクルを３０回反復した。
ＩＬ−６　ｓｅｎｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：ｃａｃａａｇｃｇｃｃｔｔｃｇｇｔｃｃａｇｔｔ（配列番号１）
ＩＬ−６　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：ｔｃｔｇｃｃａｇｔｇｃｃｔｃｔｔｔｇｃｔｇｃ（配列番号２）
・ＥＬＴＳＡ法（ＢｒｄＵ）：９６ウェル培養プレートに、５，０００個／ウェルの播種密度で播種し一晩培養した。その後、培地に５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を添加し、一晩培養した。培地を除去し、固定溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　ｓｙｓｔｅｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ２）を加えて３０分間室温でインキュベートした。次いで、固定溶液を除去し、ブロッキング溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　ｓｙｓｔｅｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ２）を加えて３０分間、室温で静置した。次いで、ブロッキング溶液を除去し、ペルオキシダーゼ結合抗ＢｒｄＵ抗体を添加し、室温で９０分静置した。洗浄バッファーで３回プレートを
洗浄し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　ｓｙｓｔｅｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ２）を加えて５~３０分間静置した。１Ｍ硫酸で反応を停止し、プレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果は５回の測定の平均値±標準誤差として示した。
・ＥＬＩＳＡ法（ＩＬ−６）：ヒト角膜内皮細胞（ｎ＝３，ｐａｓｓａｇｅ５）を１０μＭ　ＳＢ２０３５８０存在下で２０日間培養後、新鮮培地に交換し、７日間後回収した培養上清中のＩＬ−６タンパク質量をＤｕｏＳｅｔＥＬＩＳＡ　ｈｕｍａｎ　ＩＬ−６（Ｒ　＆Ｄ　Ｃａｔ＃ＤＹ２０６）のキットの説明書に従い、定量した。ＩＬ−６抗体（２．０μｇ／ｍＬ）を平底プレート（ｎｕｎｃ）上に１００μＬ／ウェルでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で室温で一晩被覆した。プレートをＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、そして１％の血清アルブミン（ナカライテスク）を補足したＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（ＰＴＧ）で２時間ブロッキングした。培養上清０．１ｍｌを加え、室温で２時間インキュベーションした。洗浄後、ビオチン処理された抗ＩＬ−６抗体を加え、２時間、室温でインキュベートした。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを加え、２０分インキュベーションした。プレートを洗浄し、そして結合したペルオキシダーゼをｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒ　＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃａｔ＃ＤＹ９９９）で検出した。呈色反応を２Ｍ　Ｈ２ＳＯ４で止め、そしてプレートをＭｕｌｔｉｍａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で４５０ｎＭで読み取った。
　（実施例１：ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害によるサイクリン依存性キナーゼ阻害因子を抑制し角膜内皮細胞の細胞周期の移行）
　本実施例では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害はサイクリン依存性キナーゼ阻害因子を抑制し角膜内皮細胞の細胞周期を移行させることを示す。
　上述の調製例に倣い、シアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を培養して以下の検討に用いた。細胞培養用培地にｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬であるＳＢ２０３５８０（１３０６７，Ｃａｙｍａｎ）を添加して２０日後にサイクリン依存性キナーゼ阻害因子であるｐ２７、ｐ２１、ｐ１６の発現をウエスタンブロッティング法にて検討した。ｐ２７、ｐ２１、ｐ１６は全てＳＢ２０３５８０を添加により抑制された（図１、Ａ；上から順にｐ２７、ｐ２１、ｐ１６、ＧＡＰＤＨを示す。左レーンはコントロール、中央はＳＢ２０３５８０　１０μＭ、右レーンはＳＢ２０３５８０　３０μＭを示す。）。ｐ２７、ｐ２１、ｐ１６は角膜内皮細胞の細胞増殖を負に制御するサイクリン依存性キナーゼ阻害因子であることが報告されている。
　また、細胞周期のＧ１／Ｓ期の移行に関わる分子としてＲｂタンパク質のリン酸化、サイクリンＤ１およびＤ３の発現をウエスタンブロッティング法にて検討した。結果を図１に示す。ＳＢ２０３５８０を添加により１２時間後、２４時間後それぞれでこれらの分子の発現が促進された（Ｂ；上から２段ずつ、ｐ−ｐＲｂ、サイクリンＤ１、サイクリンＤ３、ＧＡＰＤＨを示す。各２段において上側はコントロール、下側ＳＢ２０３５８０（１０μＭ）による刺激を示す。左レーンは１２時間、右レーンは２４時間を示す。）。また、ＳＢ２０３５８０によりｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナルの下流分子であるＡＴＦ２のリン酸化が抑制されていることを刺激後２０日後の時点のウエスタンブロッティング法にて確認した（Ｃ；上からｐｐ３８、ｐ−ＡＴＦ２、ＧＡＰＤＨを示す。左レーンからコントロール、中央はＳＢ２０３５８０　１０μＭ、右レーンはＳＢ２０３５８０　３０μＭを示す。）。これらのことよりｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害はサイクリン依存性キナーゼ阻害因子を抑制し角膜内皮細胞の細胞周期を移行させることが示された。このことは発明者らの知る限り角膜内皮細胞では初めてであるといえる。
　（実施例２：ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬による角膜内皮細胞の細胞増殖の促進）
　本実施例では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬による角膜内皮細胞の細胞増殖の促進を実証
した。
　培養したヒト角膜内皮細胞細胞をｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬であるＳＢ２０３５８０により刺激して３日後に細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７（Ｄａｋｏ、Ｍ７２４０）にて本明細書にて上述の実験手法に基づき免疫染色を行った。手法は、上述のとおりである。
　結果を図２に示す。ＳＢ２０３５８０による刺激により有意に多くの細胞にＫｉ６７の発現を認めた（Ａ，Ｂ）。また、同様に３日後に細胞増殖のマーカーとしてＢｒｄＵの取り込み量を指標にＥＬＩＳＡ法により検討したところ、ＳＢ２０３５８０による刺激により有意にＢｒｄＵの取り込みが促進された（Ｃ）。これらのことからｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は角膜内皮細胞の細胞増殖を促進することが示された。
　（実施例３：ウサギの部分的角膜内皮障害モデルにおける、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬での角膜内皮の細胞増殖の促進）
　本実施例では、ウサギの部分的角膜内皮障害モデルを用いてｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害が生体において角膜内皮の細胞増殖を促進するかどうかについて検討を行った。
　直径７ｍｍのステンレス製チップを液体窒素に浸漬して冷却した後に、全身麻酔下の日本白色ウサギ（オリエンタルバイオサービスより入手）の角膜中央部に１５秒間接触させ、中央部分の角膜内皮細胞を部分的に脱落させた。その後に、１０ｍＭに調整したＳＢ２０３５８０を１回５０μｌを１日４回、２日間点眼投与した。コントロールとして同様に部分的角膜内皮障害を作製した眼に基剤を点眼し、写真を撮影した。また、安楽死させて角膜を摘出してアリザリンレッドＳ（ナカライテスク、ＣＩ−５８００５）により角膜内皮の創傷範囲を染色し観察した。さらに、細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７にて角膜組織の免疫染色を行った。免疫染色は上述の実施例等と同様の手法を用いた。
　結果を図３に示す。図３では左パネル写真右側に１０ｍＭに調整したＳＢ２０３５８０を１回５０μｌを１日４回、２日間点眼投与した後の前眼部写真を示し、右上写真は全体像を示し、右下写真はアリザリン染色による角膜内皮創傷の範囲を示す。左側に、右上写真は全体像を示し、右下写真はアリザリン染色による角膜内皮創傷の範囲を示す。２日目に前眼部写真よりＳＢ２０３５８０点眼群で角膜の透明性の回復が早いことを確認した。また、安楽死させて角膜を摘出してアリザリン染色により角膜内皮の創傷範囲を染色したところ、ＳＢ２０３５８０点眼群はコントロールより縮小していた。また、合計６眼ずつで検討を行ったところ、有意に創傷面積はＳＢ２０３５８０点眼群において縮小しており、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は角膜内皮の創傷治癒を促進することが示された。ウサギモデルは、霊長類、特にヒトについて外挿しうる良好なモデルであることが知られており、本実施例の結果からヒトを含む霊長類においてもｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は角膜内皮の創傷治癒を促進するものであると期待される。
　さらに、細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７にて角膜組織の免疫染色を行った結果を図４に示す。左写真では写真中左側はコントロールを示し、右側はＳＢ２０３５８０点眼を行った個体の代表例（１０ｍＭ）を示す。右グラフでは、Ｋｉ６７陽性細胞の比率をコントロール（左）およびＳＢ２０３５８０刺激（１０ｍＭ）について示す。ＳＢ２０３５８０による刺激により有意に多くの細胞にＫｉ６７の発現を認めた。これらのことからｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は生体においても角膜内皮細胞の細胞増殖を促進することが示された。
　（実施例４：ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬による角膜内皮細胞密度低下の抑制）
　本実施例では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は培養環境で生じる細胞の肥大化による細胞密度低下を抑制することを示す。
　細胞培養によって細胞の肥大化および密度低下という生体同様の細胞老化様減少が生じる。そこでｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害により角膜内皮細胞密度低下という細胞老化様減少への影響を検討した。
　図５にその結果を示す。培養したヒト角膜内皮細胞細胞をｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬であるＳＢ２０３５８０を用いて各種濃度で刺激して２０日後の位相差顕微鏡写真を示す（上パネル）。ＳＢ２０３５８０の濃度依存的に培養による細胞密度低下は阻害され、細胞密度が上昇した（下パネル）。
　以上から、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬による角膜内皮細胞密度低下の抑制が示された。
　（実施例５：ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬による角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能を維持し密度低下を抑制する）
　本実施例では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害はポンプ機能およびバリア機能を維持して培養による細胞密度低下を阻害するかどうかを確認した。培養したヒト角膜内皮細胞細胞をｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬であるＳＢ２０３５８０を用いて各種濃度で刺激して２０日後に、角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能についてそれぞれのマーカーとしてＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１による免疫染色を行った。
　その結果を図６に示す。ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害により角膜内皮細胞は、全ての細胞においてＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１を発現しており正常な機能を維持し、角膜内皮細胞の肥大および細胞密度の低下を抑制していることが示された。このことはｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害が細胞機能を喪失したり、重層化したりせず、正常な細胞機能を維持しつつ細胞老化を抑制しているものと理解される。
　以上から、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬による角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能を維持し密度低下を抑制することが示された。
　（実施例６：ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は角膜内皮細胞によるサイトカイン産生を抑制する）
　本実施例では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は角膜内皮細胞が産生するサイトカインを抑制するかどうかを確認した。
　上述の実験手法に基づいて、３６種類の抗体がブロットされたサイトカイン抗体アレイ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｐｒｏｆｉｌｅｒ、＃ＡＲＹ００５、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてヒト角膜内皮培養液中のサイトカインの発現パターンを調べた。
　その結果を図７に示す。図７に示されるように、ＳＢ２０３５８０の有無に関わらず、ＧＲＯａ，ｓＩＣＡＭ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−２３，ＭＣＰ−１，ＭＩＦ，ＳｅｒｐｉｎＥ１のシグナルが検出された。ＳＢ２０３５８０を添加した培養上清においてｓｅｒｐｉｎＥ１以外のサイトカインはｖｅｈｉｃｌｅと比較して減少していた。このことは角膜内皮細胞の培養環境により生じるサイトカイン産生を抑制することを示す。また、特に近年細胞老化によりＩＬ−６などのサイトカイン産生が増加し、老化に関与することが注目されているためＩＬ−６の産生を抑制するかどうかについてＰＣＲ法およびＥＬＩＳＡにより検討した。結果を図８に示す。コントロールと比べてＳＢ２０３５８０を添加して培養することで、ＩＬ−６の産生が低下することをＰＣＲ法（左）、ＥＬＩＳＡ（右）により示された。ＥＬＩＳＡ法（ＩＬ−６）およびＲＴ−ＰＣＲによるヒト角膜内皮細胞のＩＬ−６発現量の定量は、上述した実験方法に記載のように行った。
　以上から、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は角膜内皮細胞によるサイトカイン産生を抑制することが示された。
　（実施例６：ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬による細胞死への影響の検討）
　本実施例では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は角膜内皮の細胞死を抑制するかどうかを検討した。
　ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害の細胞死への影響を検討するために、培養したヒト角膜内皮細胞を１００Ｊ／ｍ２の紫外線（ＵＶ）にて刺激して細胞死を誘導しＳＢ２０３５８０（１０μＭで用いた。）の効果を検討した。検討は細胞数を計数することで行った。
　結果を図９に示す。位相差顕微鏡写真（左）はＵＶ照射後１２時間である。右は生細胞数のコントロールに対する割合で表記したＵＶ照射後１２時間後のグラフである。ＵＶ照射により生細胞数は低下するがＳＢ２０３５８０により有意に増加する。このことよりｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害により角膜内皮細胞の細胞障害が抑制され細胞死が抑制されるものと理解される。
　（実施例７：ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬によるアポトーシスへの影響の検討）
　本実施例では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害が角膜内皮のＵＶ刺激時のアポトーシスを抑制するかについて検討した。ＵＶ照射によるアポトーシスの実行分子であるカスパーゼ３およびＰＡＲＰの切断による活性化が抑制されるかどうか、およびＵＶ照射によるＤＮＡの二本鎖切断により誘導されるリン酸化ヒストンＨ２ＡＸの発現が抑制されるかどうかを、本明細書に上述した実験手法に従ってウェスタンブロットで確認した。ウェスタンブロットには、以下の抗体を用いた：抗カスパーゼ３抗体（９６６２、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＰＡＲＰ抗体（９５４２、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗Ｈ２ＡＸ抗体（０５−６３６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ＧＡＰＤＨ抗体（２１１８、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の条件は以下を用いた：１００Ｊ／ｍ２。ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害薬としては、ＳＢ２０３５８０を用い、その濃度は、１０μＭであった。
　結果を図１０に示す。左はＳＢ２０３５８０によりＵＶ照射によるアポトーシスの実行分子であるカスパーゼ３およびＰＡＲＰの切断による活性化が抑制されることを示す。右はＳＢ２０３５８０によりＵＶ照射によるＤＮＡの二本鎖切断により誘導されるリン酸化ヒストンＨ２ＡＸの発現が抑制されることを示す。これらのことよりｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は角膜内皮細胞のアポトーシスを抑制することが示された。
　上述の実施例より、ｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル阻害は角膜内皮細胞の細胞増殖を促進し、細胞老化を抑制し、細胞死を抑制することから、角膜内皮障害の治療および進行予防のターゲットとなることが示された。例えば、本検討で用いたｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬などの点眼投与、前房内投与、結膜下注射、全身投与などは治療薬としての開発の可能性を有するものである。
　（実施例８：種々のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤での増殖の促進）
　本実施例では、種々のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤での増殖の促進を実証し、本発明の効果が特定のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤に限局されるのではなく、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤全般にみられる効果であることを実証した。本実施例では、いずれも、ｐ３８ＭＡＰＫに特異的に阻害作用を有するとされている試薬を用いて、本発明の効果が、他のキナーゼの阻害に起因するのではなく、ｐ３８ＭＡＰＫの阻害に起因することを実証した。
　（試薬）
　使用した薬剤は以下のとおりである。
（１）ＳＢ２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール）（Ｃａｙｍａｎ、カタログ番号：１３０６７）：ＳＢ２０３５８０は、ＭＡＰＫの特異的（選択的）阻害剤であることが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９　Ｏｃｔ　５；２６３（３）：８２５−３１．）。したがって、ＳＢ２０３５８０での実験結果は、ＭＡＰＫの阻害によるものと特定することができる。
（２）Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ（Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル］フェニル］デカンジアミド）（ＣＮＩ−１４９３；ＭｅｄＫｏｏ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：２０２５９０）：Ｓｅｍａｐｉｍｏｄは、ＭＡＰＫの良好な阻害剤であることが知られている（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００２　Ｊａｎ；１２２（１）：７−１４．；Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｃ．１９９８　Ｍａｒ；３０（２）：４０９−１０．；Ａｕｔｏｎ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００　Ｄｅｃ　２０；８５（１−３）：１４１−７．；Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００９　Ｆｅｂ；１３６（２）：６１９−２９．ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２００８．１０．０１７．Ｅｐｕｂ　２００８　Ｏｃｔ　９．）。
（３）ＢＩＲＢ７９６（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ；Ｎ−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−メチルフェニル）ピラゾール−５−イル］−Ｎ’−［４−（２−モルホリノエトキシ）−１−ナフチル］ウレア）（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ１５７４）：ＢＩＲＢ７９６は、ＭＡＰＫの特異的（選択的）阻害剤であることが知られている（Ｎａｔ　Ｓｔｒｕｃｔ　Ｂｉｏｌ．２００２　Ａｐｒ；９（４）：２６８−７２．）。したがって、ＢＩＲＢ７９６での実験結果は、ＭＡＰＫの阻害によるものと特定することができる。
（４）ＰＨ−７９７８０４（３−（３−ブロモ−４−（（２，４−ジフルオロベンジル）オキシ）−６−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）−Ｎ，４−ジメチルベンズアミド）（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ２７２６）：ＰＨ−７９７８０４はＭＡＰＫの特異的（選択的）阻害剤であることが知られている（Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　Ｌｅｔｔ．２０１１　Ｊｕｌ　１；２１（１３）：４０６６−７１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｍｃｌ．２０１１．０４．１２１．Ｅｐｕｂ　２０１１　Ｍａｙ　１１．）。したがって、ＰＨ−７９７８０４での実験結果は、ＭＡＰＫの阻害によるものと特定することができる。
（５）ＶＸ−７０２（１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素）（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ６００５）：ＶＸ−７０２は、ＭＡＰＫの特異的（選択的）阻害剤であることが知られている（Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇ　Ｄｒｕｇｓ．２００６　Ｎｏｖ；７（１１）：１０２０−５．）。したがって、ＶＸ−７０２での実験結果は、ＭＡＰＫの阻害によるものと特定することができる。
（６）ＬＹ２２２８８２０（ラリメチニブ（ｒａｌｉｍｅｔｉｎｉｂ）；５−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−３−ネオペンチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン）（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ１４９４）：ＬＹ２２２８８２０は、ＭＡＰＫの強力な特異的（選択的）阻害剤であることが知られている（Ｂｒ　Ｊ　Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００８　Ｍａｙ；１４１（５）：５９８−６０６．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２１４１．２００８．０７０４４．ｘ．Ｅｐｕｂ　２００８　Ａｐｒ　７．；Ｍｏｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒ．２０１４　Ｆｅｂ；１３（２）：３６４−７４．ｄｏｉ：１０．１１５８／１５３５−７１６３．ＭＣＴ−１３−０５１３．Ｅｐｕｂ　２０１３　Ｄｅｃ　１９．；Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２０１３　Ｍａｒ　１；２８８（９）：６７４３−５３．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．４２５５５３．Ｅｐｕｂ　２０１３　Ｊａｎ　１８．）。したがって、ＬＹ２２２８８２０での実験結果は、ＭＡＰＫの阻害によるものと特定することができる。
（７）ＴＡＫ−７１５（２−ベンズアミド−４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）チアゾール−５−イル］ピリジン）（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ２９２８）：ＴＡＫ−７１５は、ＭＡＰＫの強力な特異的（選択的）阻害剤であることが知られている（Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ．２００５　Ｓｅｐ　２２；４８（１９）：５９６６−７９．）。したがって、ＴＡＫ−７１５での実験結果は、ＭＡＰＫの阻害によるものと特定することができる。
（１）ＳＢ２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール）
　カニクイザルの角膜内皮細胞（日精バイリス）を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたリン酸緩衝液（ナカライテスク、１４２４９−９５）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。リン酸緩衝液除去後、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３５５５４−６４）を添加し、３７℃（５％　ＣＯ２）で１０分インキュベートした。その後、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−９４）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、ナカライテスク、２６２５２−９４）で懸濁し、１２００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。
　９６ウェルプレートはＦＮＣ　ｃｏａｔｉｎｇ　ｍｉｘ（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）で処理した。コーティングした９６ウェルプレートにサル角膜内皮細胞（ロット：２０１２０４０４−３Ｌ−Ｐ８）を１ウェル当たり５０００個の割合で播種し、３７℃（５％　ＣＯ２）で３０時間培養した。３０時間後、培地を除去し、無血清培地：ＤＭＥＭ＋１％Ｐ／Ｓに変更し、１８時間培養した。１８時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＤＭＳＯで溶解した最終濃度０．３、１、３、１０、３０、１００μｍｏｌ／ｌとなるようにＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、カタログ番号：１３０６７）を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。さらに２４時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＢｒｄＵ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）を１：１０００の割合で添加し、最終濃度０．３、１、３、１０、３０、１００μｍｏｌ／ｌとなるようにＳＢ２０３５８０を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。２４時間後、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）にてＢｒｄＵ　ＥＬＩＳＡを実施し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。＊Ｐ＜０．０１，Ｄｕｎｎｅｔ検定　　ｎ＝５。
（２）Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ（Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル］フェニル］デカンジアミド）
　（１）と同様に、カニクイザルの角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたリン酸緩衝液を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。リン酸緩衝液除去後、０．０５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３５５５４−６４）を添加し、３７℃（５％　ＣＯ２）で１０分インキュベートした。その後、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−９４）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク、カタログ番号：２６２５２−９４）で懸濁し、１２００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。
　９６ウェルプレートはＦＮＣ　ｃｏａｔｉｎｇ　ｍｉｘ（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）で処理した。コーティングした９６ウェルプレートにサル角膜内皮細胞（ロット：２０１２０４０４−３Ｌ−Ｐ８）を１ウェル当たり５０００個の割合で播種し、３７℃（５％　ＣＯ２）で３０時間培養した。３０時間後、培地を除去し、無血清培地：ＤＭＥＭ＋１％Ｐ／Ｓに変更し、１８時間培養した。１８時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＤＭＳＯで溶解した最終濃度０．１、０．３、１、３、１０μｍｏｌ／ｌとなるようにＳｅｍａｐｉｍｏｄ　ＨＣｌ（ＭｅｄＫｏｏ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：２０２５９０、ロット番号：ＳＭＣ２０１２０９１８）を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。さらに２４時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＢｒｄＵ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）を１：１０００の割合で添加し、最終濃度０．１、０．３、１、３、１０μｍｏｌ／ｌとなるようにＳｅｍａｐｉｍｏｄ　ＨＣｌを添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。２４時間後、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）にてＢｒｄＵ　ＥＬＩＳＡを実施し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（３）ＢＩＲＢ７９６（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ；Ｎ−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−メチルフェニル）ピラゾール−５−イル］−Ｎ’−［４−（２−モルホリノエトキシ）−１−ナフチル］ウレア）
　（１）と同様に、カニクイザルの角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３５５５４−６４）を添加し、３７℃（５％　ＣＯ２）で１０分インキュベートした。その後、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−９４）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク、カタログ番号：２６２５２−９４）で懸濁し、１２００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。
　９６ウェルプレートはＦＮＣ　ｃｏａｔｉｎｇ　ｍｉｘ（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）で処理した。コーティングした９６ウェルプレートにサル角膜内皮細胞（ロット：２０１２０４０４−３Ｌ−Ｐ９）を１ウェル当たり５０００個の割合で播種し、３７℃（５％　ＣＯ２）で３０時間培養した。３０時間後、培地を除去し、無血清培地：ＤＭＥＭ＋１％Ｐ／Ｓに変更し、１８時間培養した。１８時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＤＭＳＯで溶解した最終濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００μｍｏｌ／ｌとなるようにＢＩＲＢ７９６（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ）（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ１５７４、ロット番号：Ｓ１５７４０２）を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。さらに２４時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＢｒｄＵ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）を１：１０００の割合で添加し、最終濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００μｍｏｌ／ｌとなるようにＢＩＲＢ７９６（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ）を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。２４時間後、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）にてＢｒｄＵ　ＥＬＩＳＡを実施し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（４）ＰＨ−７９７８０４（３−（３−ブロモ−４−（（２，４−ジフルオロベンジル）オキシ）−６−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）−Ｎ，４−ジメチルベンズアミド）
　（１）と同様に、カニクイザルの角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３５５５４−６４）を添加し、３７℃（５％　ＣＯ２）で１０分インキュベートした。その後、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−９４）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク、カタログ番号：２６２５２−９４）で懸濁し、１２００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。
　９６ウェルプレートはＦＮＣ　ｃｏａｔｉｎｇ　ｍｉｘ（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）で処理した。コーティングした９６ウェルプレートにサル角膜内皮細胞（ロット：２０１２０４０４−３Ｌ−Ｐ９）を１ウェル当たり５０００個の割合で播種し、３７℃（５％　ＣＯ２）で３０時間培養した。３０時間後、培地を除去し、無血清培地：ＤＭＥＭ＋１％Ｐ／Ｓに変更し、１８時間培養した。１８時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＤＭＳＯで溶解した最終濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０μｍｏｌ／ｌとなるようにＰＨ−７９７８０４（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ２７２６、ロット番号：０１）を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。さらに２４時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＢｒｄＵ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）を１：１０００の割合で添加し、最終濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０μｍｏｌ／ｌとなるようにＰＨ−７９７８０４を２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。２４時間後、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）にてＢｒｄＵ　ＥＬＩＳＡを実施し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（５）ＶＸ−７０２（１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（２−（２，４−ジフルオロフェニル）−６−（１−（２，６−ジフルオロフェニル）ウレイド）ニコチンアミド））
　（１）と同様に、カニクイザルの角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３５５５４−６４）を添加し、３７℃（５％　ＣＯ２）で１０分インキュベートした。その後、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−９４）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク、カタログ番号：２６２５２−９４）で懸濁し、１２００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。
　９６ウェルプレートはＦＮＣ　ｃｏａｔｉｎｇ　ｍｉｘ（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）で処理した。コーティングした９６ウェルプレートにサル角膜内皮細胞（ロット：２０１２０４０４−３Ｌ−Ｐ９）を１ウェル当たり５０００個の割合で播種し、３７℃（５％　ＣＯ２）で３０時間培養した。３０時間後、培地を除去し、無血清培地：ＤＭＥＭ＋１％Ｐ／Ｓに変更し、１８時間培養した。１８時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＤＭＳＯで溶解した最終濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００μｍｏｌ／ｌとなるようにＶＸ−７０２（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ６００５、ロット番号：０２）を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。さらに２４時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＢｒｄＵ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）を１：１０００の割合で添加し、最終濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００μｍｏｌ／ｌとなるようにＶＸ−７０２を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。２４時間後、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）にてＢｒｄＵ　ＥＬＩＳＡを実施し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（６）ＬＹ２２２８８２０（ラリメチニブ（ｒａｌｉｍｅｔｉｎｉｂ）；５−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−３−ネオペンチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン）
　（１）と同様に、カニクイザルの角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３５５５４−６４）を添加し、３７℃（５％　ＣＯ２）で１０分インキュベートした。その後、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−９４）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク、カタログ番号：２６２５２−９４）で懸濁し、１２００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。
　９６ウェルプレートはＦＮＣ　ｃｏａｔｉｎｇ　ｍｉｘ（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）で処理した。コーティングした９６ウェルプレートにサル角膜内皮細胞（ロット：２０１２０４０４−３Ｌ−Ｐ９）を１ウェル当たり５０００個の割合で播種し、３７℃（５％　ＣＯ２）で３０時間培養した。３０時間後、培地を除去し、無血清培地：ＤＭＥＭ＋１％Ｐ／Ｓに変更し、１８時間培養した。１８時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＤＭＳＯで溶解した最終濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０μｍｏｌ／ｌとなるようにＬＹ２２２８８２０（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ１４９４、ロット番号：０１）を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。さらに２４時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＢｒｄＵ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）を１：１０００の割合で添加し、最終濃度０．１、０．３、１、３、１０、３０μｍｏｌ／ｌとなるようにＬＹ２２２８８２０を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。２４時間後、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）にてＢｒｄＵ　ＥＬＩＳＡを実施し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（７）ＴＡＫ−７１５（２−ベンズアミド−４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）チアゾール−５−イル］ピリジン）
　（１）と同様に、カニクイザルの角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３５５５４−６４）を添加し、３７℃（５％　ＣＯ２）で１０分インキュベートした。その後、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−９４）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１％ペニシン／ストレプトマイシン（ナカライテスク、カタログ番号：２６２５２−９４）で懸濁し、１２００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。
　９６ウェルプレートはＦＮＣ　ｃｏａｔｉｎｇ　ｍｉｘ（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）で処理した。コーティングした９６ウェルプレートにサル角膜内皮細胞（ロット：２０１２０４０４−３Ｌ−Ｐ９）を１ウェル当たり５０００個の割合で播種し、３７℃（５％　ＣＯ２）で３０時間培養した。３０時間後、培地を除去し、無血清培地：ＤＭＥＭ＋１％Ｐ／Ｓに変更し、１８時間培養した。１８時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＤＭＳＯで溶解した最終濃度０．１、０．３、１、３、１０、１００μｍｏｌ／ｌとなるようにＴＡＫ−７１５（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ２９２８、ロット番号：０１）を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。さらに２４時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＢｒｄＵ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）を１：１０００の割合で添加し、最終濃度０．１、０．３、１、３、１０、１００μｍｏｌ／ｌとなるようにＴＡＫ−７１５を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。２４時間後、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）にてＢｒｄＵ　ＥＬＩＳＡを実施し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　（実施例９：種々の動物種における効果）
　本実施例では、サルのみならずヒトでも、種々のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤での増殖の促進がみられることを実証し、本発明の効果が特定の動物種に限局されるのではなく、ヒトを含む広い動物種にみられる効果であることを実証した。本実施例では、いずれも、実施例８で用いた試薬を用いた。
　（１）サル
　カニクイザルの角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３５５５４−６４）を添加し、３７℃（５％　ＣＯ２）で１０分インキュベートした。その後、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−９４）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク、カタログ番号：２６２５２−９４）で懸濁し、１２００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。
　９６ウェルプレートはＦＮＣ　ｃｏａｔｉｎｇ　ｍｉｘ（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）で処理した。コーティングした９６ウェルプレートにサル角膜内皮細胞（ロット：２０１２０４０４−３Ｌ−Ｐ９）を１ウェル当たり３０００個の割合で播種し、３７℃（５％　ＣＯ２）で３０時間培養した。３０時間後、培地を除去し、無血清培地：ＤＭＥＭ＋１％Ｐ／Ｓに変更し、１８時間培養した。１８時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＤＭＳＯで溶解した、最終濃度１０μｍｏｌ／ｌとなるようにＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、カタログ番号：１３０６７）、最終濃度１μｍｏｌ／ｌとなるようにＳｅｍａｐｉｍｏｄ　ＨＣｌ（ＭｅｄＫｏｏ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：２０２５９０、ロット番号：ＳＭＣ２０１２０９１８）、最終濃度３μｍｏｌ／ｌとなるようにＢＩＲＢ７９６（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ）（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ１５７４、ロット番号：Ｓ１５７４０２）、最終濃度１μｍｏｌ／ｌとなるようにＰＨ−７９７８０４（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ２７２６、ロット番号：０１）、最終濃度３μｍｏｌ／ｌとなるようにＶＸ−７０２（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ６００５、ロット番号：０２）、最終濃度３μｍｏｌ／ｌとなるようにＬＹ２２２８８２０（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ１４９４、ロット番号：０１）、最終濃度３μｍｏｌ／ｌとなるようにＴＡＫ−７１５（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ２９２８、ロット番号：０１）を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。さらに２４時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＢｒｄＵ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）を１：１０００の割合で添加し、最終濃度１０μｍｏｌ／ｌ　ＳＢ２０３５８０、最終濃度１μｍｏｌ／ｌ　Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ　ＨＣｌ、最終濃度３μｍｏｌ／ｌ　ＢＩＲＢ７９６　３μＭ、最終濃度１μｍｏｌ／ｌ　ＰＨ−７９７８０４、最終濃度３μｍｏｌ／ｌ　ＶＸ−７０２、最終濃度３μｍｏｌ／ｌ　ＬＹ２２２８８２０、最終濃度３μｍｏｌ／ｌ　ＴＡＫ−７１５を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。２４時間後、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）にてＢｒｄＵ　ＥＬＩＳＡを実施し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　（２）ヒト
　ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。ＰＢＳ（−）除去後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（×１０）（ＧＩＢＣＯ、Ａ１２１７７−０１）を添加し、３７℃（５％　ＣＯ２）で１０分インキュベートした。その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、３１９８５−０７０）で懸濁し、１２００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。
　９６ウェルプレートはＦＮＣ　ｃｏａｔｉｎｇ　ｍｉｘ（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）で処理した。コーティングした９６ウェルプレートにヒト角膜内皮細胞（ロット：Ｃ１６４２−Ｐ８）を１ウェル当たり３０００個の割合でヒト用Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ培地にて播種し、３７℃（５％　ＣＯ２）で３０時間培養した。３０時間後、培地を除去し、無血清培地：Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ＋１％Ｐ／Ｓに変更し、１８時間培養した。１８時間後、ヒト用Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ培地にＤＭＳＯで溶解した、最終濃度１０μｍｏｌ／ｌとなるようにＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、カタログ番号：１３０６７）、最終濃度１μｍｏｌ／ｌとなるようにＳｅｍａｐｉｍｏｄＨＣｌ（ＭｅｄＫｏｏ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：２０２５９０、ロット番号：ＳＭＣ２０１２０９１８）、最終濃度３μｍｏｌ／ｌとなるようにＢＩＲＢ７９６（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ）（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ１５７４、ロット番号：Ｓ１５７４０２）、最終濃度１μｍｏｌ／ｌとなるようにＰＨ−７９７８０４（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ２７２６、ロット番号：０１）、最終濃度３μｍｏｌ／ｌとなるようにＶＸ−７０２（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ６００５、ロット番号：０２）、最終濃度３μｍｏｌ／ｌとなるようにＬＹ２２２８８２０（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ１４９４、ロット番号：０１）、最終濃度３μｍｏｌ／ｌとなるようにＴＡＫ−７１５（Ｓｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：Ｓ２９２８、ロット番号：０１）を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。さらに２４時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの培地にＢｒｄＵ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）を１：１０００の割合で添加し、最終濃度１０μｍｏｌ／ｌ　ＳＢ２０３５８０、最終濃度１μｍｏｌ／ｌ　Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ　ＨＣｌ、最終濃度３μｍｏｌ／ｌ　ＢＩＲＢ７９６　３μＭ、最終濃度１μｍｏｌ／ｌ　ＰＨ−７９７８０４、最終濃度３μｍｏｌ／ｌ　ＶＸ−７０２、最終濃度３μｍｏｌ／ｌ　ＬＹ２２２８８２０、最終濃度３μｍｏｌ／ｌ　ＴＡＫ−７１５を添加して２４時間培養した。コントロールはＤＭＳＯを添加した。２４時間後、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｒａｋ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｂａｒｅ、カタログ番号：ＲＰＮ２５０）にてＢｒｄＵ　ＥＬＩＳＡを実施し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
＿（実施例１０：ｐ３８ＭＡＰＫの活性化はアポトーシスを誘導する）
　本実施例では、ｐ３８ＭＡＰＫの活性化がアポトーシスを誘導することを実証した。
　（材料および方法）
　培養サル角膜内皮細胞をＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘをコートした１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１×１０５個播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にてコンフルエントに到達するまで約５日間培養した。使用した培地はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，１２３２０−０３２）、１０％　ＦＢＳ，１％　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ，２６２５２−９４）であった。
　次に、馴化処理としてＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ　（和光純薬工業（株），２６９−０２０７１）を１０μＭの濃度で添加し３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて１６時間インキュベートした。なお、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、ａｎｉｓｏｍｙｓｉｎ群には試薬の溶媒であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ；ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ，１３４０８−６４）を添加した。使用した培地はＧｉｂｃｏ　ＤＭＥＭ，１％　Ｐ／Ｓであった。その後、細胞上澄を除去し、ａｎｉｓｏｍｙｓｉｎ群、ａｎｉｓｏｍｙｓｉｎ＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ群にアニソマイシン（ａｎｉｓｏｍｙｓｉｎ；和光純薬工業（株），０１７−１６８６１）を１０μＭの濃度で添加した。ａｎｉｓｏｍｙｓｉｎ＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ群には、アニソマイシンと共に１０μＭのＺ−ＶＡＤを添加した。Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫを添加しない群に関してはＤＭＳＯを添加した。その後、９時間まで培養を行った。位相差顕微鏡下で細胞形態を観察した。９時間後の写真を撮影した。
　９時間後、細胞のタンパクを回収し、タンパクの発現量の比較をｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ法により行った。抗体は抗Ｃａｓｐａｓｅ３抗体（ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，９６６２Ｓ）、抗ｐ３８ＭＡＰＫ抗体（ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９２１２）、抗ｐｐ３８ＭＡＰＫ抗体（ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃４６３１Ｓ）を使用した。また内部標準として抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ，３Ｈ１２）を使用した。
　（結果）
　結果を図２０に示す。ｐ３８の活性化作用を有するアニソマイシンによりｐ３８のリン酸化を認め、さらにカスパーゼ３の切断による活性化を認める。カスパーゼ３の活性化はカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫにより抑制された。以上よりｐ３８の活性化はアポトーシスを引き起こすことが示された。ｐ３８ＭＡＰＫの活性化が角膜内皮のアポトーシスを誘導することを実証されたため、この事実からも、本発明のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が、角膜内皮の細胞増殖促進または細胞障害抑制を生じさせ、角膜内皮治療薬として用いられることが実証された。
　（実施例１１：サル角膜内皮部分的障害モデルにおけるｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬点眼投与試験）
　２頭カニクイザル（滋賀医科大学より購入）の両眼に直径７ｍｍのステンレス製の棒を液体窒素で冷却した後に、角膜に接触させて、角膜内皮を約直径７ｍｍ脱落させて、部分的障害モデルを作製した。
　その後、右眼にはＳＢ２０３５８０　（３ｍＭ）を５０μｌ、１日４回点眼した。同様に左眼にはコントロールとして基剤であるリン酸緩衝液を点眼した。
　このようにしてサルモデルを作製し、以下の実験に用いた。
　（実施例１２：ＳＢ２０３５８０点眼は霊長類の角膜内皮の増殖を促進する）
　本実施例では、ＳＢ２０３５８０点眼が霊長類の角膜内皮の増殖を促進することを実証した。
　（材料および方法）
　（免疫染色による発現観察）
　免疫染色によりＳＢ２０３５８０点眼後に細胞増殖に関連するＫｉ−６７の発現が亢進されていることを確認した。免疫染色の手法は、上記調製例２に準じ、抗体については、Ｋｉ−６７に対する抗体に変更して実験を行った。
・Ｋｉ−６７に対する抗体：（Ｍ７２４０、Ｄａｋｏ）
　手短には以下のとおりに行った。
　組織染色検査のために、培養した細胞を４％ホルムアルデヒドで１０分間室温（ＲＴ）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに６０分間インキュベートした。Ｋｉ−６７に対する抗体を１：２００希釈を用いて実施した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：１０００希釈を使用した。次いで、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｃｅｌｌ　ｓｔａｉｎ　ＤＡＰＩ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡（オールインワン蛍光顕微鏡；ＫＥＹＥＮＣＥ，Ｏｓａｋａ，ＪＡＰＡＮ）で観察した。
　右眼、左眼それぞれ５視野ずつ写真撮影を行い、Ｋｉ６７の陽性細胞率について解析した。
　（結果）
　結果を図２１および図２２に示す。
　図２１は、ＳＢ２０３５８０点眼は霊長類の角膜内皮の増殖を促進することを示す写真である。図２２は、ＳＢ２０３５８０点眼は霊長類の角膜内皮の増殖を促進することを示す計数結果である。示されるように、ＳＢ２０３５８０を点眼した眼ではＫｉ６７の陽性細胞を多く認めた。また、図２３に示されるように、Ｋｉ６７の陽性細胞率について解析したところ、ＳＢ２０３５８０を点眼した眼ではＫｉ６７の陽性細胞を有意に多く認めた。２頭のサルともに同じ傾向であることを確認した。これらの結果より、霊長類一般においてもｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は点眼薬などとして投与することで角膜内皮に作用し、角膜内皮細胞の増殖を促進することが示された。
　（実施例１３：ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は培養角膜内皮細胞の細胞死を抑制する）
培養サル角膜内皮細胞のアポトーシスに対するｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬の効果の検討
培養サル角膜内皮細胞をＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘをコートした１２ｗｅｌｌｐｌａｔｅに１×１０５個播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にてコンフルエントに到達するまで約５日間培養した。
　培地：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ，１２３２０−０３２），１０％ＦＢＳ，１％　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ，２６２５２−９４）
　次に、各阻害薬を上記の表の濃度で添加し３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて１６時間インキュベートした。なお、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、ＵＶ群には各試薬の溶媒であるＤｉｍｅｔｈｙｌ　Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ，１３４０８−６４）ＭＳＯを添加した。培地としては、Ｇｉｂｃｏ　ＤＭＥＭ，１％Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）を使用した。
　その後、細胞上澄を除去し、細胞にＵＶ（１００Ｊ／ｍ２）を照射した。照射後、各阻害剤入りの培地を再度細胞に添加し、９時間培養を行った。位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
　（結果）
　結果を図２３に示す。いずれのｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬についても示されるように、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は培養角膜内皮細胞の細胞死を抑制することが示された。
（実施例１４：ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は培養角膜内皮細胞のアポトーシスを抑制する）
　九時間培養後の細胞をＭＥＢＣＹＴＯ−Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ−ＦＩＴＣ　Ｋｉｔ）（メーカー：ＭＢＬ，Ｃｏｄｅ：４７００）を用い、３７℃で２０分間染色した。その後、９５％酢酸エタノールで１０分間固定した。固定後、ＤＡＰＩ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（メーカー：ＤＯＪＩＮＤＯ，Ｃｏｄｅ：ＧＡ０９８）で３０分間染色し、共焦点顕微鏡で観察した。
　（結果）
　結果を図２４に示す。いずれのｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬についても示されるように、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は培養角膜内皮細胞の細胞死を抑制することが示された。
（実施例１５：ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は角膜内皮のアポトーシスを抑制する）
　次に、本実施例では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は角膜内皮のアポトーシスを抑制することを実証した。
　（材料および方法）
　安楽死後０−２４時間のウサギ眼球を実験に用いた．実体顕微鏡下で角膜輪部に沿ってスプリング剪刃を用いて強膜を切除し，水晶体，虹彩を取り除き強角膜片を作製した。強角膜片を４分割し、Ｃｏｎｔｒｏｌ群およびＳＢ２０３５８０類似薬添加群とした。角膜の分割後、Ｃｏｎｔｒｏｌ群はＤＭＳＯを添加したＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（登録商標）（Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ）（Ｌｏｔ．Ｗ０００６０９８）、ＳＢ２０３５８０類似薬添加群では各試薬を添加したＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（登録商標）にて２時間のｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔを遮光下にて行った。ＰＢＳ（−）にて角膜を２回洗浄後、角膜内皮細胞にＵＶ１００Ｊ／ｍ２を照射し、再び遮光下にて２４時間４℃で保存した。保存液にはＣｏｎｔｒｏｌ群にはＤＭＳＯ、各ＳＢ２０３５８０類似薬添加群には各試薬を添加したＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（登録商標）を用いた。強角膜片をＰＢＳ（−）で洗浄し，ＭＥＢＣＹＴＯ−Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｋｉｔ（Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ−ＦＩＴＣ　ｋｉｔ）（ＭＢＬ）（Ｌｏｔ．０２７ＦＡ）を用いＡｎｎｅｘｉｎ　ＶおよびＤＡＰＩの染色した．その後−３０℃に氷冷した９５％エタノールに３０分浸し固定した．エタノール成分を除去するため，５分毎にＰＢＳ（−）を交換し，３回洗浄した．その後退色防止剤を加え封入した、共焦点顕微鏡でＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖおよび核の観察を蛍光観察により行った．
　次に、上記ウサギ角膜組織におけるＡｎｎｅｅｘｉｎ　Ｖ陽性細胞率を計測した。＊ｐ＜０．０５。（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）。
　（結果）
　Ａｎｎｅｅｘｉｎ　Ｖおよび核を観察した蛍光観察結果を図２５に示す。いずれのｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬についても示されるように、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は角膜内皮のアポトーシスを抑制することが示された。また、Ａｎｎｅｅｘｉｎ　Ｖ陽性細胞率を計測した結果を図２６に示す。ＵＶを照射したコントロールと比較して全てのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤により有意にＡｎｎｅｅｘｉｎ　Ｖ陽性細胞率が減少した。以上から、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は角膜内皮のアポトーシスを抑制する効果を有することが実証された。
　（実施例１６：ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬の他の投与形態の例）
　本実施例では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬であるＳＢ２０３５８０を用いて、前房内投与、結膜下注射、徐放剤に薬剤を含有させて前房内、結膜下注射などが可能であるか確認する。これらは以下のとおりのプロトコルで行う。
　前房内投与：以下のように調製した製剤を前房内に常法にて注射する。
投与する薬剤の調製例：
　生理的食塩水や精製水などに薬剤（例えば、ＳＢ２０３５８０）を希釈して調製する。
　結膜下注射：以下のように調製した製剤を前房内に常法にて注射する。
投与する薬剤の調製例：
　生理的食塩水や精製水などに薬剤（例えば、ＳＢ２０３５８０）を希釈して調製する。
　徐放剤での前房内投与：
　ゼラチン、ポリ乳酸などの担体を用いた徐放剤に薬剤（例えば、ＳＢ２０３５８０）を含浸させて前房内に注入する。
　徐放剤での結膜下投与：
　ゼラチン、ポリ乳酸などの担体を用いた徐放剤に薬剤（例えば、ＳＢ２０３５８０）を含浸させて結膜下に注入する。
　これらの投与方法でも、上記実施例と同様に角膜内皮障害の治療および進行予防が達成されることが期待される。
　（実施例１７：製剤例としての点眼薬）
　各濃度の被験物質の組成を以下に示す。
　ＳＢ２０３５８０（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ、カタログ番号：５５９３８９等から入手可能）またはＳＢ２０３５８０塩酸塩（和光純薬（１９３−１５６１１）等から入手可能）または他のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬：０．００３ｇ、０．０１ｇ、０．０３ｇ、０．０５ｇまたは０．１ｇ（脱塩酸体としての用量）
　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　０．８５ｇ
　リン酸二水素ナトリウム二水和物　　０．１ｇ
　ベンザルコニウム塩化物　　　　　　０．００５ｇ
　水酸化ナトリウム　　　　　　　　　適量
　精製水　　　　　　　　　　　　　　適量
　　　　　　　　　　　　　　　　　　全量１００ｍｇ（ｐＨ７．０）。
　点眼剤は、基剤で希釈することもできる。
　基材の組成の代表例は以下のとおりであるが適宜変更することができる。
　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　０．８５ｇ
　リン酸二水素ナトリウム二水和物　　０．１ｇ
　ベンザルコニウム塩化物　　　　　　０．００５ｇ
　水酸化ナトリウム　　　　　　　　　適量
　精製水　　　　　　　　　　　　　　適量
　　　　　　　　　　　　　　　　　　全量１００ｍｇ（ｐＨ７．０）。
　以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本件は、日本国出願特願２０１３−２３５７６８に対して優先権を主張するものである。
　細胞増殖を必要とする角膜内皮障害の治療または予防薬が提供され、特に、角膜内皮創傷の治療または予防技術が提供された。このような技術に基づく製剤等に関連する技術に関与する産業（製薬等）において利用可能な技術が提供される。
配列番号１：ＩＬ６−Ｆ：ＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＡＧＴＴ
配列番号２：ＩＬ６−Ｒ：ＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣ
配列番号３：ＧＡＰＤＨ−Ｆ：ＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ
配列番号４：ＧＡＰＤＨ−Ｒ：ＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ

Claims (8)

  1. ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬を含む、細胞増殖、細胞障害抑制または細胞老化抑制を必要とする角膜内皮疾患、障害または状態の治療または予防薬。
  2. 前記角膜内皮障害は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後の持続する角膜内皮密度減少、外傷、眼科手術、加齢、および角膜内皮炎に関連する障害からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の治療または予防薬。
  3. 前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は水溶性である、請求項１に記載の治療または予防薬。
  4. 前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０２１９０）、ｔｒａｎｓ−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール（ＳＢ−２３９０６３）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）、４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシピリミジン−４−イル）−１−（ピペリジン−４−イル）イミダゾール（ＳＢ−２４２２３５）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−１−ブチニル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＲＷＪ−６７６５７）、４−（４−フルオロフェニル）−１−（ピペリジン−４−イル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＨＥＰ−６８９）、（Ｓ）−２−（２−アミノ−３−フェニルプロピルアミノ）−１−メチル−５−（２−ナフチル）−４−（４−ピリジル）ピリミジン−６−オン（ＡＭＧ−５４８）、２−クロロ−４−（４−フルオロ−２−メチルアニリノ）−２’−メチルベンゾフェノン（ＥＯ−１６０６）、３−（４−クロロフェニル）−５−（１−ヒドロキシアセチルピペリジン−４−イル）−４−（ピリミジン−４−イル）ピラゾール（ＳＤ−０６）、５−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（２，４−ジフルオロフェニルチオ）ピリミド［３，４−ｂ］ピリダジン−６−オン（ＶＸ−７４５）、４−アセチルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルベンズアミド（ＣＰＩ−１１８９）、Ｎ−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−メチルフェニル）ピラゾール−５−イル］−Ｎ’−［４−（２−モルホリノエトキシ）−１−ナフチル］ウレア（ドラマピモド（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ（ＢＩＲＢ７９６）））、２−ベンズアミド−４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）チアゾール−５−イル］ピリジン（ＴＡＫ−７１５）、タルマピモド（Ｔａｌｍａｐｉｍｏｄ；ＳＣＩＯ−４６９）、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２；２−（２，４−ジフルオロフェニル）−６−（１−（２，６−ジフルオロフェニル）ウレイド）ニコチンアミド）、ジルマピモド（ｄｉｌｍａｐｉｍｏｄ；ＧＳＫ−６８１３２３）、４−（５−（シクロプロピルカルバモイル）−２−メチルフェニルアミノ）−５−メチル−Ｎ−プロピルピロロ（１，２−ｆ）（１，２，４）トリアジン−６−カルボキサミド（ＰＳ−５４０４４６）、抗ＦＧＦ−７抗体（ＳＣ−８００３６）、ＡＶＥ−９９４０、［５−アミノ−１−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−４−イル］［３−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロポキシ）フェニル］メタノン（ＲＯ−３２０−１１９５）、１−（１，３−ジヒドロキシプロプ−２−イル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−［２−フェノキシピリミジン−４−イル］イミダゾール（ＳＢ−２８１８３２）、２−［５−（｛４−［（４−フルオロフェニル）メチル］ピペリジン−１−イル｝カルボニル）−６−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−インドル−３−イル］−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２−オキソアセトアミド（ＳＣＩＯ−３２３）、２−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ｍ−トリル−２Ｈ−ピラゾル−３−イル）−２−ヒドロキシイミド−Ｎ−［４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ナフタレン−１−イル］−アセトアミド（ＫＣ−７０６）、Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−（２−アミジノヒドラゾノ）エチル］フェニル］デカンジアミド、Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル］フェニル］デカンジアミド（セマピモド（Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ））、および３−（３−ブロモ−４−（（２，４−ジフルオロベンジル）オキシ）−６−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）−Ｎ，４−ジメチルベンズアミド（ＰＨ−７９７８０４）、および５−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−３−ネオペンチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン（ＬＹ２２２８８２０）からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１に記載の治療または予防薬。
  5. 前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（ＳＢ２０３５８０）またはその塩を含む、請求項１に記載の治療または予防薬。
  6. 前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬は４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（ＳＢ２０３５８０）塩酸塩を含む、請求項１に記載の治療または予防薬。
  7. 細胞増殖を必要とする角膜内皮障害の治療または予防のためのｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害物質。
  8. ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬の有効量をそれを必要な被験体に投与する工程を含む、細胞増殖を必要とする角膜内皮障害の治療または予防のための方法。
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