WO2015027891A1 - 一种新的丹酚酸化合物t、其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本文涉及医药领域。具体涉及一种结构式（I）所述的丹酚酸T、其手性异构体、其制备方法、含有该化合物的医药组合物、抗氧化剂、自由基清除剂以及该化合物的用途。

Description

一种新的丹酚酸化合物 T、 其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药领域。 具体涉及一种新的丹酚酸类化合物、 其制备方法和用途。

背景技术

丹参为唇形科鼠尾草属植物的根部， 性味苦， 微寒， 归心、 肝经， 具有祛瘀止痛、 活血通经、 清心 除烦之功效。 现代药理研究证明， 丹参具有扩张冠脉、 改善微循环、 保护心脏的作用， 能抑制和解除血 小板聚集， 提高机体耐缺氧能力以及抗肝炎、 抗肿瘤和抗病毒等活性。 2001年， 中国医学科学院协和医 科大学药物研究所报道了丹参及其同属植物的水溶性活性成分共计 13种酚酸类化合物， 包括丹酚酸 Α、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 J、 紫草酸、 迷迭香酸及异丹酚酸 C等 （黎莲娘等人， 医学研究通讯， 2001 年， 第 30卷， 第 7期）， 并报道了这 13种酚酸类化合物的药理作用。 2002年， 热娜 ·卡斯木等报道了丹 酚酸 K的化学结构（热娜 ·卡斯木等人， 新疆医科大学学报， 2002年， 第 25卷， 第 3期）。 国外也对丹参 水溶性活性成分进行了研究。 1999年， 美国乔治顿大学就 "丹参酚酸类 13个化学结构抗 HIV整合酶和 其它病毒" 申请并获得了美国专利， 表明丹参是一种极具潜力和开发价值的药用植物资源。

本发明所述的丹酚酸 T正是在大量筛选研究过程发现的丹参中一个新化合物， 而且涉及该结构的化 合物及药理作用迄今尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种结构式 （ I ) 的丹酚酸化合物1\ 其药学上可接受的盐、 其溶剂化物和可水 解的酯。

结构式 （I)

本发明的又一目的是提供丹酚酸 τ的制备方法。

本发明进一步的目的是提供含有丹酚酸 τ的药物组合物、 抗氧化剂、 自由基清除剂。

本发明的再一目的是提供丹酚酸 τ在制备治疗急性心肌梗塞和急性心肌缺血的药物中的应用。 本发明的再一目的是提供丹酚酸 τ在制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。

本发明的再一目的是提供丹酚酸 τ在制备抗氧剂中的应用。

本发明的再一目的是丹酚酸 τ用于治疗急性心肌梗塞、 急性心肌缺血或肺纤维化疾病。

本发明的再一目的是丹酚酸 τ用于延缓衰老。

本发明的再一目的是丹酚酸 τ用于抗氧化作用。

具体而言， 本发明涉及如下 （1 ) - (37 ) 项发明：

[1] 一种结构式 （I) 的丹酚酸丁、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物和可水解的酯。

结构式 （I)

[2] 一种如 [1]所述的丹酚酸 T的制备方法， 其中， 所述方法包括如下步骤：

(la) 提取： 将丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物进行水提， 滤液浓缩为水提浸膏， 然后醇 沉， 使上清液浓缩为醇沉浸膏；

(lb)分离： 将所述步骤所述（1) 中所得醇沉浸膏经水稀释后， 过大孔吸附树脂， 用酸性水溶液冲 洗除去杂质， 然后用乙醇洗脱， 将乙醇洗脱液浓缩为浸膏；

或者， 使用如下步骤 （1) 替换上述步骤 （la) 和 （lb):

(1) 合成： 将丹酚酸 B溶于水溶液， 加热反应；

(2)纯化： 将步骤（1)所得反应液调节 pH至酸性后或者将所述步骤（lb)所得浸膏使用高压制备 液相色谱仪进行纯化， 色谱填料为 C18反相硅胶柱， 洗脱液为乙腈 -水-甲酸， 进行等度洗脱或梯度洗脱， 检测波长 280nm_; 用高效液相色谱监测洗脱过程， 收集含有丹酚酸 T的洗脱液， 浓缩后得所述丹酚酸 T。

[3] 一种如 [1]所述的丹酚酸 Τ的手性异构体的制备方法， 其中， 所述方法包括如下步骤：

(la) 提取： 将丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物进行水提， 滤液浓缩为水提浸膏， 然后醇 沉， 使上清液浓缩为醇沉浸膏；

(lb) 分离： 将所述步骤 （la) 中所得醇沉浸膏经水稀释后， 过大孔吸附树脂， 用酸性水溶液冲洗 除去杂质， 然后用乙醇洗脱， 将乙醇洗脱液浓缩为浸膏；

或者， 使用如下步骤 （1) 替换上述步骤 （la) 和 （lb):

(1) 合成： 将丹酚酸 B溶于水溶液， 加热反应；

(2)纯化： 将步骤（1)所得反应液调节 pH至酸性后或者将所述步骤（lb)所得浸膏使用高压制备 液相色谱仪进行纯化， 色谱填料为 C18 反相硅胶柱， 洗脱液为乙腈 -水-甲酸， 进行等度洗脱， 检测波长 280nm_; 用高效液相色谱监测洗脱过程， 合并含有丹酚酸 T的洗脱液， 浓缩后得所述丹酚酸 T;

(3)手性异构体制备： 将所述步骤（2)得到的丹酚酸 T使用制备液相色谱仪进行手性异构体分离， 色谱柱为反相手性色谱柱， 洗脱液为乙腈 -水-甲酸， 进行等度洗脱或梯度洗脱， 检测波长 280nm_; 用高效 液相色谱监测洗脱过程，分别收集含有 丹酚酸 T和 (R)-丹酚酸 T的洗脱液，冻干后得到所述 丹酚酸 T和 (R)-丹酚酸 T纯品。

[4] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （la) 中， 所述丹参药材或丹参药材与其它药材的 混合物为饮片、 粉碎颗粒或粉末， 所述的其它药材为与丹参配伍的三七、 黄芪或二者的组合。

[5] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （la) 中， 所述水提步骤为加入 4-8倍所述药材体 积的水， 煎煮 1.5- 4h; 滤过； 滤液浓缩至相对密度为 1.10- 1.30 (80°C) 的水提浸膏。

[6] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （la) 中， 所述水提步骤为加入 6倍所述药材体积 的水， 煎煮 3h; 滤过； 滤液浓缩至相对密度为 1.22 (80°C) 的水提浸膏。

[7] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （la) 中， 所述水提步骤使用碱性水溶液进行， 所 述碱性水溶液为碳酸氢钠水溶液、 碳酸钠水溶液、 碳酸氢钾水溶液、 碳酸钾水溶液、 氢氧化钠水溶液、 氢氧化钾水溶液中的至少一种。 [8] 如 [7]所述的制备方法， 其中， 所述碱性水溶液为 0.3%-0.45% (w/v) 的碳酸氢钠水溶液。

[9] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （la) 中， 所述醇沉步骤为向上述水提浸膏中加入

95% (v/v) 乙醇进行醇沉至醇含量为 50%- 70% (v/v) (25°C )， 静置 8- 36h; 取上清液， 减压回收乙醇， 浓缩至相对密度为 1.25-1.5 ( 60°C ) 的醇沉浸膏。

[10] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （la) 中， 所述醇沉步骤为向上述水提浸膏中加入

95% (v/v) 乙醇进行醇沉至醇含量为 60% (v/v) (25°C )， 静置 24h; 取上清液， 减压回收乙醇， 浓缩至 相对密度为 1.32 (60°C ) 的醇沉浸膏。

[11] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤（lb) 中， 所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性大 孔吸附树脂。

[12] 如 [11]所述的制备方法，其中，所述非极性或弱极性大孔吸附树脂为 AB-8型、 HPD450型、 D101 型或 X5型大孔吸附树脂。

[13] 如 [12]所述的制备方法， 其中， 所述非极性或弱极性大孔吸附树脂为 AB-8型。

[14] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （lb) 中， 所述步骤 （la) 中使用的药材与所述大 孔吸附树脂的重量比为 (5： 1 )-( 1： 1 )。

[15] 如 [14]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （la) 中使用的药材与所述大孔吸附树脂的重量比为

3: 1。

[16] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （lb) 中， 所述酸性水溶液选自盐酸水溶液、 硫酸 水溶液、硝酸水溶液和乙酸水溶液中的任意一种或它们的组合； 将溶液的 pH调节为 1.0-5.0; 使用该酸性 溶液冲洗至洗脱液近乎无色。

[17] 如 [16]所述的制备方法， 其中， 所述酸性水溶液为盐酸水溶液； 将溶液的 pH调节为 3.0。

[18] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤（lb) 中， 使用柱体积 4-10倍量的 50%-95% (v/v) 乙醇进行洗脱； 然后， 将洗脱液浓缩为无醇味的浸膏。

[19] 如 [18]所述的制备方法， 其中， 使用柱体积 5倍量的 95% (v/v) 乙醇进行洗脱。

[20] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （1 ) 中， 所述反应原料为丹酚酸 B或其盐。

[21] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （1 ) 中， 所述丹酚酸 B与所述水溶液的质量比为

1 :0.1-1: 100000， 反应温度为 10- 150°C， 反应时间为 lOmin至 24h。

[22] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （1 ) 中， 所述丹酚酸 B与所述水溶液的质量比为 1 :200， 反应温度为 90°C， 反应时间为 lh。

[23] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （1 ) 中， 所述水溶液为酸性水溶液、 中性水溶液 或碱性水溶液。

[24] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （1 ) 中， 所述水溶液为碱性水溶液， 所述碱性水 溶液选自于如下水溶液中的至少一种： 碳酸氢钠水溶液、 碳酸钠水溶液、 碳酸氢钾水溶液、 碳酸钾水溶 液、 氢氧化钠水溶液和氢氧化钾水溶液。

[25] 如 [8]所述的制备方法， 其中， 所述碱性水溶液为 0.05%- 0.45% (w/v) 的碳酸氢钠水溶液。

[26] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （2) 中， 使用盐酸水溶液、 硫酸水溶液、 硝酸水 溶液和乙酸水溶液中的任意一种或者它们的任意组合将所述反应液的 pH调节为 1.0-6.0。

[27] 如 [26]所述的制备方法， 其中， 使用盐酸水溶液将所述反应液的 pH调节为 3.0。

[28] 如 [2]或 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （2) 中， 所述的高压制备液相色谱仪为动态轴向 高压制备液相色谱仪， 色谱填料为 C18反相硅胶柱， 将通过所述步骤 （1 ) 调节了 pH的反应液或者所述 步骤 （lb ) 中所得浸膏用流动相溶解， 所述流动相为乙腈:水:甲酸 （体积比） =(10:90: 1)- (90: 10: 1); 洗脱 液使用上述流动相配比， 洗脱为等度洗脱或梯度洗脱； 流速 300mL/mi_{n ;} 检测波长 280nm_; 使用高效液 相色谱法监测洗脱过程， 收集保留时间在 21.2-24.0min的组分， 浓缩至干， 得到丹酚酸 T样品。 [29] 如 [28]所述的制备方法， 其中， 所述流动相为乙腈:水:甲酸 (体积比) =(10:90: 1)- (50:50: 1)。

[30] 如 [28]所述的制备方法， 其中， 所述流动相为乙腈:水:甲酸 (体积比) =15:85: 1。

[31] 如 [28]所述的制备方法， 其中， 所述洗脱使用流动相乙腈:水:甲酸 （体积比） =15:85: 1进行等度 洗脱。

[32] 如 [3]所述的制备方法， 其中， 所述步骤（3 ) 中， 使用制备液相色谱仪进行手性异构体分离， 色 谱柱为反相手性色谱柱， 将步骤 （2 ) 中所得的丹酚酸 T样品用流动相溶解， 所述流动相为乙腈:水:甲酸 (体积比 )=(90_: 10_: 1)-(10_:90_: 1)；洗脱液使用上述流动相配比，洗脱为等度洗脱或梯度洗脱；流速 25mL/mi_{n ;} 检测波长 280nm_; 使用高效液相色谱法监测洗脱过程， 分别收集保留时间在 19.5-21.lmin的 丹酚酸 T 组分、 23.9-25.3min的 (R)-丹酚酸 T组分， 先低温浓缩后再冻干， 得到 丹酚酸 T和 (R)-丹酚酸 T纯品。

[33] 如 [32]所述的制备方法， 其中， 所述流动相为乙腈:水:甲酸 (体积比) =17:83: 1。

[34] 如 [32]所述的制备方法， 其中， 所述洗脱使用流动相乙腈:水:甲酸 （体积比） =17:83: 1进行等度 洗脱。

[35] 如 [32]所述的制备方法， 其中， 所述低温为 10-40°C。

[36] 如 [32]所述的制备方法， 其中， 所述低温为 30°C。

[37] 一种含有 [1]所述的丹酚酸 T、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯的 药物组合物。

[38] 一种含有 [1]所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯的 抗氧化剂。

[39] 一种含有 [1]所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯的 自由基清除剂。

[40] [1]所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯在制备治疗 急性心肌梗塞和急性心肌缺血的药物中的应用。

[41] [1]所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯在制备治疗 肺纤维化疾病的药物中的应用。

[42] [1]所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯在制备抗氧 剂中的应用。

[43] [1]所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯用于治疗急 性心肌梗塞、 急性心肌缺血或肺纤维化疾病。

[44] [1]所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯用于延缓衰 老。

[45] [1]所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯用于抗氧化 作用。

附图说明

图 1 丹酚酸 Τ的高分辨质谱图， A: (R)-丹酚酸 Τ; Β : 丹酚酸 Τ。

图 2丹酚酸 Τ的¹ H-NMR图 （500MHz, DMSO ) , A: (R)-丹酚酸 T; Β : ( -丹酚酸 Τ。

图 3 丹酚酸 Τ的¹³C-NMR图 （125MHz， DMSO ) , A: (R)-丹酚酸 T; B : ( -丹酚酸 T。

图 4丹酚酸 T的 DEPT谱， A: (R)-丹酚酸 T; B : ( -丹酚酸 T。

图 5 丹酚酸丁的 COSY谱， A: (R)-丹酚酸 T; B : ( -丹酚酸 T。

图 6丹酚酸 Τ的 ROESY谱， A: (R)-丹酚酸 T; Β : ( -丹酚酸 Τ。

图 7 丹酚酸 Τ的 HSQC谱， A: (R)-丹酚酸 T; B : ( -丹酚酸 T。

图 8 丹酚酸 Τ的 HMBC谱， A: (R)-丹酚酸 T; Β : ( -丹酚酸 Τ。 图 9 丹酚酸 T的 CD谱， A: (R)-丹酚酸 T; Β : ( -丹酚酸 Τ。

图 10丹酚酸 Τ的 CD谱与 ECD模拟谱对照， A: (R)-丹酚酸 T; Β : 丹酚酸 Τ。

图 11 丹酚酸 Τ抗冠脉结扎急性心肌梗塞作用的研究中， 各试验组的心脏切片图。

图 12 (R)-丹酚酸 Τ和 丹酚酸 Τ对 TGF-βΙ诱导的 L929细胞增殖的抑制作用。

具体实施方式

本发明的目的是提供一种结构式 （ I ) 的丹酚酸化合物1\ 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶 剂化物和可水解的酯。

结构式 （I )

本发明的酚酸类新化合物，经过化合物的理化性质、高分辨质谱（QFT-ESI)、 电喷雾质谱（ESI-MS )、

'H-NMR> ¹³C- NMR、 DEPT、 COSY、 HMBC、 HMQC、 CD等图谱的鉴定（图 1-图 10)， 确证了其结构。 'H-NMR (氢谱）提示分子中有 1个连氧次甲基质子信号 δ 4.93 (1Η， dd, 8.0， 4.5 Hz); 11个芳香质 子信号 δ 6.85 (1H， d, 8.5 Hz)、 5 7.31 (1H, d, 8.5 Hz)、 5 7.41 (1H, d, 15.5 Hz )、 5 6.27 (1H, d, 15.5 Hz)、 δ 6.62 (1Η， ί)> 5 6.63 (1H, d, 8.0 Hz)、 δ 6.47 (1H， d, 8.0 Hz)、 δ 6.44 (1Η， d, 2.0 Hz)、 δ 6.55 (1H， d, 8.5 Hz)、 5 6.43 (1H, dd, 8.5， 2.0 Hz)、 δ 7.69 (1Η， s); 2个脂肪族质子信号 δ 2.89 (2H， ddd, 14.0， 8.0， 4.5 Hz)。

¹³C-NMR (碳谱） 给出 27个碳信号， 其中 1个脂肪碳信号 δ 36.0; 1个连氧次甲基碳信号 δ 72.8 ; 3 个羰基碳信号 δ 166.0、 δ 170.6、 δ 168.4； 22个双键碳信号 δ 123.7、 δ 126.4、 δ 142.9、 δ 147.7、 δ 115.0、 δ 118.4、 δ 143.7、 δ 113.9、 δ 127.1、 δ 116.5、 δ 143.9、 δ 144.8、 δ 115.5、 δ 120.0、 δ 126.0、 δ 117.3、 δ 144.8、 δ 147.2、 δ 115.3、 δ 122.9、 δ 141.1、 δ 123.4。

本发明化合物两种异构体的旋光分别为： -157.5°、 196.6° 对 C-8'绝对构型设定为 构型的化合物分 别进行了分子结构优化， 然后采用具有 TD-SCF的 BPV86方法， 在 6-31++G ( 2d， ρ )基组下进行计算， 读 取其计算结果与本发明化合物 CD谱对照， 最终结果发现两种构型化合物的计算结果与本发明化合物的实 验 CD谱图基本重合， 推断本发明化合物两种异构体的 C-8'的绝对构型分别为 S构型和 R构型 （参见图 10)。 本发明的化合物主要 HMBC相关如

本发明的化合物为一个新的丹酚酸类化合物， 本 t将 ¾侖名为丹酚酸 T。 在提取制备过程中， 由于本发明的化合物可能发生构型、 构象的变化， 因此， 波谱数据可能会有所 变化。 但由构型、 构象变化所产生的各种异构体均在本发明的保护范围之内。

根据本领域的普通技术知识和现有技术， 本发明的丹酚酸 T还可以利用其药学上可接受的盐或溶剂 化物的形式。 本发明的丹酚酸 τ的药学上可接受的盐包括： 常规的、 药学上可接受的无机碱或有机碱生 成的盐， 所述的盐通过常规的成盐方法制备而得。 适合的盐的实例包括钠、 钾、 锂、 镁、 铝、 钙、 锌等 的盐， 或与 Ν,Ν'-二苄基乙二胺、 氯普鲁卡因、 胆碱、 二乙醇胺、 乙二胺、 Ν-甲基葡糖胺、 普鲁卡因、 黄 连素形成的盐。 在描述本发明第二方面之前， 下文所提到的丹酚酸 Τ包括式（I)所表示的丹酚酸 Τ及其 药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物和可水解的酯。

本发明的丹酚酸 Τ适宜以药物组合物的形式给药。 这类组合物可以按照常规方式与一种或多种生理 上可接受的载体或赋形剂混合使用。 若有可能， 在治疗上将本发明的丹酚酸 Τ作为原料药给药， 优选活 性成分直接作为药物制剂。 在与其它成分相容和对服药者无害的意义上， 载体必须是药学上可接受的。

因此， 本发明进一步提供本发明的丹酚酸 τ的药物制剂， 包括本发明的丹酚酸 Τ和一种或多种药学 上可接受的载体， 以及含有或不含其它治疗和 /或预防性成分。 这些制剂适用于口服、 胃肠外 （包括皮下 例如注射或药库片； 真皮内； 鞘内； 肌内例如药库； 静脉内等）、 直肠和局部 （如舌下） 给药， 但最适合 的给药途径应取决于患者的病症。 该制剂可以是单位制剂， 并且可以通过用药学领域熟知的任一种方法 制备。 所有方法包括使本发明的丹酚酸 τ与载体结合的步骤， 该载体构成一种或多种辅助成分。 一般来 说， 该制剂的制备过程如下： 使本发明的丹酚酸 τ与液体载体、 或微细粉碎的固体载体、 或二者的结合 均匀而紧密的结合， 然后， 如果必要的话， 使产物成型为所必须的制剂。

通常可使用标准的制药技术， 即可将本发明的丹酚酸 τ和药用载体制得本发明药物组合物， 这些方 法包括混合、 制粒和压制。 本领域技术人员所熟知的是， 可药用载体或稀释剂的形式和特性取决于与其 混合的活性成分的量、 给药途径和其它已知因素。

本文中， 所用的药用载体是可与药物组合物联用给药的各种有机或无机载体， 例如： 用于固体制剂 的赋形剂、 润滑剂、 粘合剂、 崩解剂和包衣剂； 也可使用药用添加剂， 例如着色剂和甜味剂。 所述药用 载体选自： 糖醇， 例如甘露醇、 山梨醇、 木糖醇； 氨基酸， 例如盐酸半胱氨酸、 蛋氨酸、 甘氨酸； 维生 素 C; EDTA二钠、 EDTA钙钠； 无机盐， 例如一价碱金属的碳酸盐、 醋酸盐、 磷酸盐或其水溶液； 氯化 钠、 氯化钾； 焦亚硫酸钠、 亚硫酸氢钠、 硫代硫酸钠； 碳酸钙、 碳酸氢钙； 硬脂酸盐， 例如硬脂酸钙、 硬脂酸镁； 无机酸， 例如盐酸、 醋酸、 硫酸、 磷酸； 有机酸盐， 例如乳酸钠； 寡糖、 多糖、 纤维素及其 衍生物， 例如麦芽糖、 葡萄糖、 果糖、 右旋糖苷、 蔗糖、 乳糖、 环糊精 （例如 β-环糊精)、 淀粉； 硅衍生 物； 藻酸盐； 明胶； 聚乙烯吡咯垸酮； 甘油； 琼脂； 表面活性剂， 例如吐温 80; 聚乙二醇； 磷脂类材料； 高岭土； 滑石粉等。

其药物制剂形式可以是任何可药用的剂型， 这些剂型包括： 片剂， 例如糖衣片剂、 薄膜衣片剂、 肠 溶衣片剂； 胶囊剂， 例如硬胶囊剂、 软胶囊剂； 口服液； 口含剂； 颗粒剂； 冲剂； 丸剂； 散剂； 膏剂； 丹剂； 混悬剂； 粉剂； 溶液剂； 注射剂； 栓剂； 膏剂， 例如软膏剂、 硬膏剂； 霜剂； 喷雾剂； 滴剂以及 贴剂。 本发明的制剂优选： 口服剂型， 如胶囊剂、 片剂、 口服液、 颗粒剂、 丸剂、 散剂、 丹剂、 膏剂等; 以及注射剂， 如粉针剂、 注射液、 输液等。 本发明的制剂最优选为片剂。

其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂、 粘合剂、 填充剂、 稀释剂、 压片剂、 润滑剂、 崩解剂、 着 色剂、 调味剂和湿润剂， 必要时可对片剂进行包衣。

优选的示例赋形剂包括： 乳糖、 D-甘露醇、 D-山梨醇、 淀粉如 a-淀粉、 糊精、 结晶纤维素、 低取代 的羟丙基纤维素、 羧甲基纤维素钠、 阿拉伯胶、 支链淀粉、 轻质无水硅酸、 合成硅酸铝、 硅酸铝镁等。

优选的示例润滑剂包括： 硬脂酸镁、 硬脂酸钙、 滑石粉、 硅胶等。

优选的示例粘合剂包括： a-淀粉、 蔗糖、 明胶、 阿拉伯胶、 甲基纤维素、 羧甲基纤维素、 羧甲基纤 维素钠、 结晶纤维素、 糖、 D-甘露醇、 海藻糖、 糊精、 支链淀粉、 羟丙基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 吡咯垸酮等。 优选的示例崩解剂包括： 乳糖、 糖、 淀粉、 羧甲基纤维素、 羧甲基纤维素钙、 氨垸基钠、 羧甲基淀 粉钠、 轻质无水硅酸、 低取代的羟丙基纤维素等。

优选的示例包衣剂包括： 羟丙基甲基纤维素、 羟丙基纤维素、 乙基纤维素、 羧甲基纤维素、 聚乙烯 醇等。

优选的示例着色剂包括： 水溶性食用枸橼黄染料 （食用染料例如食用红 No.2和 No.3， 食用黄 No.4 和 No.5， 食用蓝 No.l和 No.2) ; 水不溶性色沉染料 （例如上述水溶性食用枸橼黄染料的铝盐）； 天然染 料 （例如 β-胡萝卜素、 叶绿素、 铁丹） 等。

优选的示例甜味剂包括： 糖精钠、 甘草次酸、 阿斯帕坦、 甜菊等。

片剂的制备方法一般为， 本发明的丹酚酸 Τ与一种或多种药学上可接受的辅料一起压制或模制。 本发明的丹酚酸 Τ还可以制成口服液体制剂， 例如水性或油性悬液、 溶液、 乳剂、 糖浆剂等。 本发 明的丹酚酸 Τ还可以是干燥产品， 使用前用水或其它适合的载体混合。 这类液体制剂可以含有常规的添 加剂， 可以包括悬浮剂， 例如山梨醇糖浆、 甲基纤维素、 葡萄糖 /糖浆、 明胶、 羟乙基纤维素、 羧甲基纤 维素、 硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪； 乳化剂， 例如卵磷脂、 脱水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶； 非水 性载体 （可以包括食用油）， 如杏仁油、 分馏椰子油、 油性酯、 丙二醇或乙醇； 以及防腐剂， 如对羟基苯 甲酸甲酯或丙酯、 山梨酸。

用于胃肠道外给药的制剂包括水性与非水性无菌注射液， 其中可以含有抗氧化剂、 缓冲剂、 制菌剂、 等渗剂等； 以及水性与非水性无菌混悬液， 其中可以包括悬浮剂和增稠剂。 制剂可以存放在单剂量或多 计量容器内， 例如密封的安瓿和小瓶， 并且可以贮存在冷冻干燥 （冻干） 条件下， 仅需要在临时用前加 入无菌的液体载体， 例如注射用水。

用于直肠给药的制剂可以是栓剂， 含有常规的栓剂基质， 例如可可脂、 硬脂肪酸或其它甘油酯， 或 乙二醇。

用于口腔局部、 例如颊部或舌下给药的制剂包括锭剂， 其中在加味的基质中包含活性成分， 该基质 例如蔗糖和阿拉伯胶； 还包括软锭剂， 其中在基质中含有活性成分， 该基质可以是明胶和甘油、 或蔗糖 和阿拉伯胶。

本发明的丹酚酸 Τ还可以配制成药库制剂。 这类长效制剂可以通过植入 （如皮下或肌内） 或肌内注 射给药。 所以， 本发明丹酚酸 Τ可以与适合的聚合物或疏水性材料 （例如在可接受的油中的乳剂） 或离 子交换树脂进行配制， 或者配制成微溶性衍生物， 例如微溶性盐。

根据本领域的普通技术知识和现有技术， 本发明所涉及的治疗包括预防和既定疾病或症状的治疗。 而且， 用于治疗所需的本发明丹酚酸 Τ的量应根据所治疗病症的性质和患者条件而异， 或遵医嘱。 一般 来说， 用于成人治疗的剂量通常将在 0.02-5000mg/天的范围， 优选 l-1500mg/天。 所需剂量可以是单一的 剂量或多次的剂量， 按适当的间隔给药， 例如每天给予两次、 三次、 四次或更多。 根据本发明的制剂可 以含有 0.1-99wt%的活性成分， 对片剂和胶囊剂优选含有 30-95wt%的活性成分， 液体制剂优选含有 3-50wt%的活性成分。

第二方面， 本发明涉及丹酚酸 T的制备方法， 所述方法包括如下步骤：

( la) 提取： 将丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物进行水提， 滤液浓缩为水提浸膏， 然后醇 沉， 使上清液浓缩为醇沉浸膏；

( lb) 分离： 将步骤 （la) 中所得醇沉浸膏经水稀释后， 过大孔吸附树脂， 用酸性水溶液冲洗除去 杂质， 然后用乙醇洗脱， 将乙醇洗脱液浓缩为浸膏；

或者， 使用如下步骤 （1 ) 替换上述步骤 （la) 和 （lb) :

( 1 ) 合成： 将丹酚酸 B溶于水溶液， 加热反应；

(2)纯化： 将步骤（1 )所得反应液调节 pH至酸性后或者将所述步骤（lb)所得浸膏使用高压制备 液相色谱仪进行纯化， 色谱填料为 C18反相硅胶柱， 洗脱液为乙腈 -水-甲酸， 等度洗脱或梯度洗脱， 检测 波长 280nm_; 用高效液相色谱监测洗脱过程， 收集含有丹酚酸 T的洗脱液， 浓缩后得所述丹酚酸 T。 进一步地， 本发明涉及丹酚酸 T的手性异构体的制备方法， 其中， 所述方法包括如下步骤： (la) 提取： 将丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物进行水提， 滤液浓缩为水提浸膏， 然后醇 沉， 使上清液浓缩为醇沉浸膏；

(lb) 分离： 将步骤 （la) 中所得醇沉浸膏经水稀释后， 过大孔吸附树脂， 用酸性水溶液冲洗除去 杂质， 然后用乙醇洗脱， 将乙醇洗脱液浓缩为浸膏；

或者， 使用如下步骤 （1) 替换上述步骤 （la) 和 （lb):

(1) 合成： 将丹酚酸 B溶于水溶液， 加热反应；

(2)纯化： 将步骤（1)所得反应液调节 pH至酸性后或者将所述步骤（lb)所得浸膏使用高压制备 液相色谱仪进行纯化， 色谱填料为 C18反相硅胶柱， 洗脱液为乙腈 -水-甲酸， 进行等度洗脱或梯度洗脱， 检测波长 280nm_; 用高效液相色谱监测洗脱过程， 收集含有丹酚酸 T的洗脱液， 浓缩后得所述丹酚酸 T;

(3)手性异构体制备： 将所述步骤（2)得到的丹酚酸 T使用制备液相色谱仪进行手性异构体分离， 色谱柱为反相手性色谱柱， 洗脱液为乙腈 -水-甲酸， 等度洗脱或梯度洗脱， 检测波长 280nm_; 用高效液相 色谱监测洗脱过程， 分别收集含有 丹酚酸 T和 (R)-丹酚酸 T的洗脱液， 冻干后得到所述 丹酚酸 T 和 (R)-丹酚酸 T纯品。

所述步骤 （la) 中， 丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物， 可以是饮片、 粉碎颗粒或粉末， 优 选饮片； 所述的其它药材可以是本领域技术人员所公知的可以与丹参配伍的中药材， 优选三七、 黄芪或 二者的组合。

所述步骤（la) 中， 所述水提步骤为加入 4-8倍药材体积的水， 煎煮 1.5-4h， 优选加入 6倍药材体积 的水煎煮 3h; 滤过； 滤液浓缩至相对密度为 1.10-1.30 (80°C) 的水提浸膏， 优选相对密度为 1.22 (80°C) 的水提浸膏。 为了提高提取效率、 加快酚酸类物质的溶出， 所述水提步骤优选使用碱性水溶液进行， 所 述碱性水溶液优选碳酸氢钠水溶液、 碳酸钠水溶液、 碳酸氢钾水溶液、 碳酸钾水溶液、 氢氧化钠水溶液、 氢氧化钾水溶液中的至少一种， 优选 0.3%-0.45% (w/v) 的碳酸氢钠水溶液。

所述步骤 （la) 中， 所述醇沉步骤为向上述水提浸膏中加入 95% (v/v) 乙醇进行醇沉至醇含量为 50%- 70% (v/v) (25°C)， 优选 60% (v/v), 静置 8- 36h， 优选静置 24h; 取上清液， 减压回收乙醇， 浓缩 至相对密度为 1.25-1.5 (60°C)、 优选相对密度为 1.32 (60°C) 的醇沉浸膏。

所述步骤（lb)中，所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性树脂，可以选自 AB-8型、 HPD450型、 D101 型或 X5型大孔吸附树脂， 优选 AB-8型； 所述步骤 （1) 中使用的药材与所述大孔吸附树脂的重量比为 (5:1)-(1:1), 优选 3:1; 所述酸性水溶液选自盐酸水溶液、 硫酸水溶液、 硝酸水溶液和乙酸水溶液中的任意 一种或它们的组合， 优选盐酸水溶液； 将溶液的 pH调节为 1.0-5.0， 优选 3.0; 使用该酸性溶液冲洗至洗 脱液近乎无色。 然后， 使用柱体积 4-10倍量的 50%-95% (v/v) 乙醇进行洗脱， 优选使用柱体积 5倍量 的 95% (v/v) 乙醇进行洗脱； 洗脱液浓缩为无醇味的浸膏。

所述步骤 （1) 中， 所述反应原料为丹酚酸 B或其盐。

所述步骤（1) 中， 所述丹酚酸 B与所述水溶液的质量比可以为 1:0.1-1:100000， 优选 1:200; 反应温 度可以为 10-150°C， 优选 90°C; 反应时间可以为 lOmin至 24h， 优选 lh。

所述步骤 （1) 中， 所述水溶液可以是酸性水溶液、 中性水溶液或碱性水溶液， 优选碱性水溶液， 所 述碱性水溶液选自于碳酸氢钠水溶液、 碳酸钠水溶液、 碳酸氢钾水溶液、 碳酸钾水溶液、 氢氧化钠水溶 液和氢氧化钾水溶液中的任意一种； 进一步优选地， 所述碱性水溶液为 0.05%-0.45% (w/v) 的碳酸氢钠 水溶液。

所述步骤 （2) 中， 调节所述反应液的 pH可以使用盐酸水溶液、 硫酸水溶液、 硝酸水溶液和乙酸水 溶液中的任意一种或者它们的任意组合， 将所述反应液的 pH调节为 1.0-6.0; 优选使用盐酸水溶液， 将所 述反应液的 pH调节为 3.0。

所述步骤 （2) 中， 所述的高压制备液相色谱仪可以使用动态轴向高压制备液相色谱仪， 例如法国 NOVASEPLC80- 600， 色谱填料优选为 C18反相硅胶柱 （ΙΟμιη, YMC公司）， 将步骤 （lb) 中所得浸膏 用流动相溶解 （乙腈：水：甲酸 （体积比） =(10:90: 1)- (90: 10: 1) )， 优选乙腈：水：甲酸 （体积比） =(10:90: 1)- (50:50: 1)， 更优选乙腈:水:甲酸 (体积比) =15:85: 1； 洗脱液使用上述流动相配比， 洗脱可以选 择等度洗脱或梯度洗脱，优选乙腈:水:甲酸 (体积比) = 15 :85： 1等度洗脱；流速 300mL/min；检测波长 280nm。 使用高效液相色谱法监测洗脱过程， 收集保留时间在 21.2-24.0min的组分， 浓缩至干， 得到丹酚酸 T样 品。

所述步骤 （3 ) 中， 可以使用 Waters Prep 400 制备液相色谱仪进行手性异构体分离， 色谱柱为 CHIRALCEL® OD-RH反相手性色谱柱 （250x20mm， 5μιη) , 将步骤 （2 ) 中所得的丹酚酸 Τ样品用流动 相溶解（乙腈：水:甲酸 (体积比) =(90: 10: 1)- (10:90: 1))， 优选乙腈:水:甲酸 (体积比) =17:83: 1； 洗脱液使 用上述流动相配比， 洗脱可以选择等度洗脱或梯度洗脱， 优选乙腈:水:甲酸（体积比） =17:83: 1等度洗脱； 流速 25mL/mi_{n ;}检测波长 280nm。使用高效液相色谱法监测洗脱过程，分别收集保留时间在 19.5-21. Imin 的 丹酚酸 T组分、 23.9-25.3min的 (R)-丹酚酸 T组分， 先低温 （ 10-40 °C， 优选 30°C ) 浓缩后再冻干， 得到 丹酚酸 T和 (R)-丹酚酸 T纯品。

本发明的药效试验结果表明： 本发明的丹酚酸 T具有抗急性心肌梗塞活性和抗急性心肌缺血活性， 具有较好的自由基清除力和还原力， 并且， 还具有肺纤维化治疗活性。

因此， 本发明还涉及如下方面：

含有丹酚酸 T、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯的抗氧化剂、 自由基 清除剂。

丹酚酸 τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯在制备治疗急性心肌梗塞 和急性心肌缺血的药物中的应用。

丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯在制备治疗肺纤维化疾病 的药物中的应用。

丹酚酸 τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯在制备抗氧剂中的应用。 丹酚酸 τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯用于治疗急性心肌梗塞、 急性心肌缺血或肺纤维化疾病。

丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯用于延缓衰老。

丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯用于抗氧化作用。

实施例

下面将参考制备例和试验例对本发明的技术方案进行进一步的详细描述。 然而应当理解的是， 本发 明的保护范围并不限于这些制备例和试验例。

制备例 1 丹酚酸 Τ、 丹酚酸 Τ和 (R)-丹酚酸 Τ的制备

取丹参饮片， 置中药煎煮器中， 加入丹参饮片质量 6倍量的 0.3% ( w/v ) 的碳酸氢钠水溶液， 煎煮 2.5h， 滤过； 滤液浓缩至相对密度 1.22 ( 80°C ) 的水提浸膏。

在上述浸膏中加入 95% ( v/v ) 乙醇进行醇沉至醇含量 60% ( v/v ) (25 °C )， 静置 24h; 取上清液减压 浓缩至相对密度 1.32 ( 60°C ) 的醇沉浸膏。

将上述醇沉浸膏用水溶解，过 AB-8大孔吸附树脂，用 pH=3.0的盐酸水溶液冲洗至洗脱液近乎无色， 然后， 用柱体积 5倍量的 95% (v/v ) 乙醇进行洗脱， 洗脱液浓缩为无醇味的浸膏。

将前一步骤得到的浸膏用流动相溶解 （乙腈：水:甲酸 （体积比） =15:85: 1 )， 使用法国 NOVASEP LC80-600动态轴向高压制备液相色谱仪进行纯化， 色谱填料为 C 18反相硅胶柱 （ΙΟμιη, YMC公司）； 用乙腈：水:甲酸 （体积比） =15:85: 1进行等度洗脱； 流速 300mL/mi_{n ;} 检测波长 280nm。 使用高效液相色 谱法监测洗脱过程， 收集保留时间在 21.2-24.0min的组分， 用旋转蒸发仪浓缩至干， 得到丹酚酸 T样品。

将上述丹酚酸 T样品用流动相 （乙腈：水:甲酸 （体积比） =17:83: 1 ) 溶解， 使用 Waters Prep 400制备 液相色谱仪进行手性异构体分离， 色谱柱为 CHIRALCEL® OD-RH反相手性色谱柱 （250x20mm， 5μιη) _; 用乙腈：水:甲酸 （体积比） =17:83: 1进行等度洗脱； 流速 25mL/min_; 检测波长 280nm。 使用高效液相色 谱法监测洗脱过程， 收集保留时间在 19.5-21. Imin的 丹酚酸 T组分、 23.9-25.3min的 (R)-丹酚酸 T组 分， 先用旋转蒸发仪在 30°C下浓缩洗脱液， 然后再冻干， 得到 丹酚酸 T和 (R)-丹酚酸 T纯品。

高分辨质谱给出准分子离子峰 [M-H]— 丹酚酸 T m z=537.1033 _; (R)-丹酚酸 T m/¾=537.1032。

丹酚酸 T和 (R)-丹酚酸 T的核磁共振图谱数据归属见下表：

表 1 (R)-丹酚酸 T的核磁共振数据 （DMSO， / Hz)

表 2 丹酚酸 T的核磁共振数据 （DMSO， J Hz)

编号 δ_Η 5c 'H-'H COSY HMBC

1 123.8 H-5 , H-8

2 126.3 H-6, H-7, H-7"

3 142.9 H-5

4 147.7 H-5 , H-6

5 6.85 (1H， d， 8.5 Hz) 115.0 H-6

6 7.29 (1H， d, 8.5 Hz) 118.4 H-5 H-7

7 7.41 (1H， d, 15.5 Hz) 143.7 H-8 H-6

8 6.27 (1H， d, 15.5 Hz) 114.0 H-7 H-7

9 165.9 H-7, H-8, H-8'

1, 127.2 H-2', H-5', H-8', H-7'

2' 6.62 (1H， s) 116.5 H-6' H-6', H-7'

3' 143.9 H-2', H-5', H-6' 4' 144.9 Η- 2'， Η-5'

5' 6.63 (1H, d， 8.0 Hz) 115.5 Η-6'

6' 6.45 (1H， d, 8.0 Hz) 120.1 H- 2'， 5' Η- 2'， Η- 5'， Η-7'

2.87 (2H, ddd, 14.0， 8.0， 4.0

7' 36.1 Η-8' Η- 2'， Η- 5'， Η- 6'， Η-8'

Hz)

8' 4.92 (1H， dd, 8.0， 4.0 Hz) 72.9 Η-7' Η-7'

9' 170.6 Η- 7'， Η-8'

1" 126.0 Η-5"

2" 6.43 (1H, d, 2.0 Hz) 117.3 Η-6" Η-6", Η-7"

3" 144.8 Η- 2"， Η-5"

4" 147.2 Η- 2"， Η-5", Η-6"

5" 6.55 (1H， d， 9.0 Hz) 115.3 Η-6"

6" 6.43 (1H, dd, 8.5， 2.0 Hz) 122.9 Η- 2"， 5" Η- 2"， Η-7"

7" 7.69 (1H, s) 141.1 Η- 2"， Η-6"

8" 123.3

9" 168.4 Η-7"

制备例 2丹酚酸 Τ、 丹酚酸 Τ和 (R)-丹酚酸 Τ的制备

取丹参和三七饮片， 置中药煎煮器中， 加入丹参和三七饮片体积 4倍量的 0.45% ( w/v ) 碳酸氢钠水 溶液， 煎煮 2h， 滤过； 滤液浓缩至相对密度 1.25 ( 80°C ) 的水提浸膏。

在上述水提浸膏中加入 95% (v/v ) 乙醇进行醇沉至 65% ( v/v ) ( 25°C )， 静置 12h; 取上清液减压浓 缩至相对密度 1.28 ( 60°C ) 的醇沉浸膏。

将上述醇沉浸膏用水溶解， 过 AB-8大孔吸附树脂， 用 pH=2.5的盐酸水溶液冲洗至近乎无色， 然后， 使用柱体积 4倍量的 95% ( v/v ) 乙醇进行洗脱， 洗脱液浓缩为无醇味的浸膏。

将前一步骤得到的浸膏用流动相溶解 （乙腈：水:甲酸 （体积比） =15:85: 1 )， 使用法国 NOVASEP LC80-600动态轴向高压制备液相色谱仪进行纯化， 色谱填料为 C 18反相硅胶 （ΙΟμιη, YMC公司）； 采 用如下条件进行线性梯度洗脱：从 Omin至 60min， 乙腈:水:甲酸（体积比）由 15:85: 1线性变化至 20:80: 1 ; 流速 250mL/mi_{n ;} 检测波长 280nm。 使用高效液相色谱法监测洗脱过程， 收集保留时间在 29.5-32. lmin 组分， 用旋转蒸发仪浓缩至干， 得到丹酚酸 T样品。

将上述丹酚酸 T样品用流动相溶解 （乙腈：水:甲酸 （体积比） =17:83: 1 )， 使用 Waters Prep 400制备 液相色谱仪进行手性异构体分离， 色谱柱为 CHIRALCEL® OD-RH反相手性色谱柱 （250x20mm， 5μιη) _; 采用如下条件进行线性梯度洗脱：从 Omin至 45min，乙腈:水:甲酸 (体积比）由 17:83: 1线性变化至 22:78: 1 ; 流速 20mL/mi_{n ;} 检测波长 280nm。 使用高效液相色谱法监测洗脱过程， 收集保留时间在 25.2-27. lmin的 丹酚酸 T组分、 32.4-34.2min的 (R)-丹酚酸 T组分， 先用旋转蒸发仪在 30°C下浓缩洗脱液， 然后再冻 干， 得 丹酚酸 T和 (R)-丹酚酸 T纯品。

高分辨质谱给出准分子离子峰 [M-H]— 丹酚酸 T m z=537.1035 _; (R)-丹酚酸 T m/¾=537.1034。

丹酚酸 T和 (R)-丹酚酸 T的核磁共振图谱数据归属见下表：

表 3 O丹酚酸 T的核磁共振数据 （DMSO， / Hz)

编号 δ_Η 5c 'H-'H COSY HMBC

1 123.8 H-5 , H-8

2 126.3 H-6, H-7, H-7"

3 142.9 H-5

4 147.7 H-5 , H-6

5 6.85 (1H， d, 8.5 ) 115.0 H-6

6 7.29 (1H, d, 8.5 ) 118.4 H-5 H-7

7 7.41 (1H， d， 15.5 ) 143.7 H-8 H-6

8 6.27 (1H, d, 15.5 ) 114.0 H-7 H-7

酚酸 Τ的核磁共振数据 （DMSO， J Hz)

制备例 3丹酚酸 T、 丹酚酸 Τ和 (R)-丹酚酸 T的制备

取丹酚酸 Β， 溶于 200倍量 （质量比） 的 0.3%碳酸氢钠水溶液， 置圆底烧瓶中， 90°C回流 lh。 反应结束后， 用 O.lmol/L的盐酸水溶液调节 pH至 3.0， 然后用流动相溶解 （乙腈 :7j :甲酸 （体积比）

=15:85: 1 )， 使用法国 NOVASEPLC80-600动态轴向高压制备液相色谱仪进行纯化， 色谱填料为 C18 反 相硅胶柱 （ΙΟμιη, YMC 公司）； 用乙腈：水:甲酸 （体积比） =15:85: 1 进行等度洗脱； 流速 300mL/min; 检测波长 280nm。 使用高效液相色谱法监测洗脱过程， 收集保留时间在 21.2-24.0min 的组分， 用旋转蒸 发仪浓缩至干， 得到丹酚酸 T样品。

将上述丹酚酸 T样品用流动相 （乙腈：水:甲酸 （体积比） =17:83: 1 ) 溶解， 使用 Waters Prep 400制 备液相色谱仪进行手性异构体分离，色谱柱为 CHIRALCEL® OD-RH反相手性色谱柱（250χ20ηπη，5μηι) _; 用乙腈：水:甲酸 （体积比） =17:83: 1 进行等度洗脱； 流速 25mL/min_; 检测波长 280nm。 使用高效液相色 谱法监测洗脱过程，收集保留时间在 19.5-21. Imin 的 丹酚酸 T组分、 23.9-25.3min 的 (R)-丹酚酸 T组 分， 先用旋转蒸发仪在 30°C下浓缩洗脱液， 然后再冻干， 得到 丹酚酸 T和 (R)-丹酚酸 T纯品。

制备例 4丹酚酸 T、 丹酚酸 Τ和 (R)-丹酚酸 Τ的制备

取丹酚酸 Β镁盐， 溶于 300倍量（质量比） 的 0.05%碳酸氢钠水溶液， 置圆底烧瓶中， 90°C回流 2h。 反应结束后， 用 O.lmol/L的盐酸水溶液调节 pH至 3.0， 然后用流动相溶解 （乙腈 :7j :甲酸 （体积比）

=15:85: 1 )， 使用法国 NOVASEP LC80-600动态轴向高压制备液相色谱仪进行纯化， 色谱填料为 C18 反 相硅胶 （ΙΟμιη, YMC 公司）； 采用如下条件进行线性梯度洗脱： 从 Omin 至 60min， 乙腈冰：甲酸 （体 积比） 由 15:85: 1 线性变化至 20:80: 1 ; 流速 250mL/min; 检测波长 280nm。 使用高效液相色谱法监测洗 脱过程， 收集保留时间在 29.5-32. lmin组分， 用旋转蒸发仪浓缩至干， 得到丹酚酸 T样品。

将上述丹酚酸 T样品用流动相溶解 （乙腈：水:甲酸 （体积比） =17:83: 1 )， 使用 Waters Prep 400制备 液相色谱仪进行手性异构体分离，色谱柱为 CHIRALCEL® OD-RH反相手性色谱柱（250x20mm， 5μηι) _; 采用如下条件进行线性梯度洗脱： 从 Omin 至 45min， 乙腈:水:甲酸 （体积比） 由 17:83: 1 线性变化至 22:78: 1； 流速 20mL/mi_{n ;} 检测波长 280nm。 使用高效液相色谱法监测洗脱过程， 收集保留时间在 25.2-27. Imin 的 丹酚酸 T组分、 32.4-34.2min 的 (R)-丹酚酸 T组分，先用旋转蒸发仪在 30°C下浓缩洗 脱液， 然后再冻干， 得 丹酚酸 T和 (R)-丹酚酸 T纯品。

制剂例 1 丹酚酸 T、 丹酚酸 Τ和 (R)-丹酚酸 Τ片剂的制备

处方

丹酚酸 T或 丹酚酸 T或 fR 丹酚酸 T 100g

微晶纤维素 50g

乳糖 30g

淀粉 55g

羧甲基淀粉钠 10g

5% ( w/v ) PVP的无水乙醇溶液 适量

硬脂酸镁 5g 制成 1000片

工艺：

1. 制粒

丹酚酸 τ或 丹酚酸 Τ或 (R)-丹酚酸 Τ及处方中其它辅料分别过 100目筛， 称取处方量的丹酚酸 Τ 与微晶纤维素、 淀粉和羧甲基淀粉钠， 采用等量递加法混合均匀， 用适量 5% ( w/v ) PVP的无水乙醇溶 液制软材， 14目筛制粒， 于 50-6CTC干燥 lh， 加入处方量的硬脂酸镁， 用 14目筛进行整粒。

2. 压片

取上述颗粒用冲模压片机压片。 制剂例 2丹酚酸 T、 丹酚酸 Τ和 (R)-丹酚酸 Τ胶囊剂的制备

处方

丹酚酸 Τ或 丹酚酸 Τ或 fR 丹酚酸 T 100g

淀粉 200g

羧甲基淀粉钠 15g

5% ( w/v ) PVP的无水乙醇溶液 适量

硬脂酸镁 5g 制成 1000粒

工艺：

1. 制粒

丹酚酸 τ或 丹酚酸 T或 (R)-丹酚酸 T及处方中其它辅料分别过 100目筛， 称取处方量的丹酚酸 T 与淀粉、 羧甲基淀粉钠采用等量递加法混合均匀， 用适量 5% ( w/v ) PVP的无水乙醇溶液制软材， 14目 筛制粒， 50-6CTC干燥 lh， 加入处方量的硬脂酸镁， 用 14目筛进行整粒。

2. 灌装

取上述颗粒装入胶囊壳中。

制剂例 3丹酚酸 T、 丹酚酸 Τ和 (R)-丹酚酸 Τ注射液的制备

处方：

丹酚酸 Τ或 丹酚酸 Τ或 fR 丹酚酸 T 100g

甘露醇 100g

注射用水 加至 2500mL 制成 1000支

工艺：

取处方量的丹酚酸 T或^) -丹酚酸 T或 (R)-丹酚酸 T， 加注射用水 lOOOmL使溶解， 搅拌均匀； 另取 处方量的甘露醇， 加注射用水 500mL使溶解， 加入上述溶液中， 搅匀， 用 0.5g活性碳保温搅拌 30min， 过滤， 滤液调节 pH为 4.5-5.0， 加注射用水至 2500mL， 除菌过滤， 分装即得。

制剂例 4丹酚酸 T、 （S)-丹酚酸 Τ和 (R)-丹酚酸 Τ冻干粉针的制备

处方：

丹酚酸 Τ或 丹酚酸 Τ或 fR 丹酚酸 T 100g

甘露醇 100g

注射用水 2000mL 制成 1000支

工艺：

称取处方量的丹酚酸 T或 丹酚酸 T或 (R)-丹酚酸 T以及甘露醇， 加注射用水 1500mL， 搅拌溶解， 加 0.5g活性碳搅拌脱色 20min， 用 0.45μιη滤膜脱碳， 补水至 2000mL， 除菌过滤、 分装、 冷冻干燥即得。 药效试验例 1 («-丹酚酸 T抗冠脉结扎急性心肌梗塞作用

实验材料

1、 受试物及试剂：

〔W-丹酚酸 T， 批号： 120301， 由天士力控股集团研究院提供。 阿司匹林肠溶片： 规格： lOOmg/片， 拜耳医药保健有限公司， 批号： BJ07160。

0.9. (w/v) 氯化钠注射液： 规格： 500mL， 南京小营药业集团有限公司， 批号： 2012051205。 水合氯醛： AR， 国药集团化学试剂有限公司， 批号： 20100111。

红四氮唑 （TTC)， 国药集团化学试剂公司， 批号： F20040308。

肌酸激酶（CK)测定试剂盒， 批号： 20120917; 乳酸（LD)测定试剂盒， 批号： 20120919; 丙二醛

(MDA) 测定试剂盒， 批号： 20120919; 超氧化物歧化酶 （SOD ) 测定试剂盒， 批号： 20120918; 肌酸 激酶同工酶 （CK-MB ) 测定试剂盒， 批号： 20120922; ATP酶测定试剂盒， 批号： 20120921。 均由南京 建成生物工程研究所提供。

2. 主要仪器：

HX-300呼吸机： 成都泰盟科技有限公司。

ECG-6511心电图机： 上海光电医用电子仪器有限公司。

HH-2数显恒温水浴锅： 国华电器有限公司产品。

BS 224s型电子天平： 北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。

BS 110s型电子天平： 北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。

3. 实验动物：

SD 大鼠， 体重 210~230g， 雄性， 苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司， 动物生产质量合格证号： SCXK (苏） 2009-0001。

实验方法及结果

1. 剂量设计：

丹酚酸 T冻干粉给药剂量： 20mg/kg体重、 10mg/kg体重。 阿司匹林： 30mg/kg体重。

2. 实验方法

取清洁级雄性 SD大鼠， 按体重随机分组， 分别为： 伪手术组（蒸馏水）、 模型组（蒸馏水）、 阿司匹 林组、 丹酚酸 T低剂量组、 丹酚酸 T高剂量组， 每组 10只。 各组大鼠每天灌胃给药一次， 连续给 药 10天。 给药体积为 lmL/lOOg体重。 于末次给药后 lh， 腹腔注射水合氯醛 300mg/kg体重， 麻醉， 仰 位固定， 先后用碘酒和酒精对手术切口部位消毒， 之后在第三、 四根肋骨开胸， 并进行人工呼吸， 暴露 心脏，用医用无损伤缝合针 5/0结扎冠脉左前降支，迅速关闭胸腔并常规消毒， 手术操作过程不超过 30s， 术后继续人工呼吸 l〜2min，肌注（i. m. ) 20万单位青霉素预防感染。手术开始前 5min、结扎后 0s、 lmin、 5min、 15min、 lh、 4h分别记录标准 II导联心电图， 考察心电图 J点变化。

试验结束后， 立即取出心脏， 用生理盐水洗去血液， 剪去心房及心底部血管， 称心室重量， 将心室 沿房室沟平均切成 5片放入 1% (w/v) TTC溶液内，在 37°C恒温水浴染色 5min，取出后首先拍数码照片， 而后分离未染色部分（即梗塞部分） 并称重计算其占整个心室重量的百分率 （心肌梗塞百分率）， 并与缺 血模型组进行组间 ί检验。 计算梗塞百分率公式如下：

梗塞百分率 （％) = (苍白区重量 /心室重量） χ100%

以 2000rpm对血液进行离心处理 25min后， 分离出血清， 按试剂盒所述的方法， 测定血清肌酸激酶 ( CK)、 乳酸脱氢酶 （LD)、 肌酸激酶同工酶 （CK-MB )、 丙二醛 （MDA)、 超氧化物歧化酶 （SOD)、 ATP酶的含量或活性。 结果见表 5、 表 6、 表 7及图 11所示。

由表 5可见， 各组大鼠冠脉结扎手术后心电图 J点显著高于手术前 （P<0.01 )， 说明造模成功。 与模 型组比较， 术后 5min， 丹酚酸 T高剂量组能显著抑制 J点的抬高 （P<0.05 ) ; 术后 15min， 丹酚酸 T高剂量组能显著抑制 J点的抬高（P<0.05 ) ; 术后 lh和 4h， 阿司匹林组、 丹酚酸 T高剂量组均能显 著抑制 J点的抬高 （ P<0.05 )。

由表 6可见， 模型组和各给药组心肌梗塞率均显著高于伪手术组 （P<0.01 )， 表明造模成功。 与模型 组相比， 阿司匹林组、 丹酚酸 T高剂量组均能显著降低心肌梗塞率 （P<0.05)。 表 5 丹酚酸 T对冠脉结扎所致心肌梗塞大鼠 J点变化 （mv) 的影响 （ ±s， n=10)

剂量 手术后

组别 手术前 ·

(mg/kg) lmin 5min 15min lh 4h 模型组 -0.010土 0.003 0.179+0.042** 0.205土 0.014** 0.207土 0.045** 0.205+0.033** 0.198+0.009** 阿司匹林组 30 -0.012土 0.005 0.172+0.057** 0.184+0.024** 0.166+0.025** 0.169+0.036^##A 0.172土。.021** ^A 丹酚酸 T低剂 i组 5 -0.011土 0.003 0.176+0.050** 0.204土 0.010** 0.185+0.096** 0.206+0.036** 0.194+0.042** 丹酚酸 高剂 i组 10 -0.014土 0.005 0.169+0.033** 0.146+0.031**^A 0.160+0.027^##A 0.170土 0.014**^A 0.153+0.028** '⁴

P<0.05， <0.01， 造模后各时间点与造模前进行自身前后比较； ^AP<0.05， ^{A A}P<0.01， 与模型组比较。 表 6 ( -丹酚酸 T对大鼠冠脉结扎所致心肌梗塞的影响 （ +s, n=10)

组别 齐糧 (mg/kg) 梗塞率 （％)

伪手术组 0

模型对照组 35.6土 6.21**

阿司匹林组 30 24.4土 8.5^##A

丹酚酸 T低剂 i组 5 33.1土 7.4##

丹酚酸 T高剂 i组 10 25.4±7.4^##A

#Ρ<0.05， ** Ρ<0.01， 与伪手术组进行比较； ^ΑΡ<0.05， 与模型组进行比较。 表 7 ( -丹酚酸 Τ对冠脉结扎所致心肌梗塞大鼠血液生化指标的影响 （ +s, η=10)

剂量 MDA LD SOD CK CK- MB Na+- K+- ATPase 组别

(mg/kg) ( nmol/ml ) (mmol/L) (U/ml) (U/ml) (U/L) olPi/10⁷RBC/h) 伪手术组 4.85±1.14 1.6土 0.19 239.4土 20.7 0.82土 0.19 745.2土 121.4 0.006土 0.001 模型组 9.71土 2.39## 2.07+0.31** 188.3+28.5^## 1.74土 0.44## 1176.4土 197.8** 0.003+0.001^## 阿司匹林组 30 6.84土 0.97^A 1.75土 0.17^A 221.1土 24.7^A 1.01±0.16^{A A} 841.9土 20.3^{A A} 0.005+0.001 ^A 丹酚低剂 i组 5 7.46土 1.07 ^A 1.67+0.23 ^A 220.3+32.6 1.18+0.29 ^A 970.9土 225.1 0.004+0.001 ^A 丹酚高剂 t组 10 6.72+1.54^A 1.65土 0.24 ^A 241.7土 19.8^{A A} 0.88土 0.22^{A A} 846.7+144.2^{A A} 0.005土 0.006^A

#P<0.05， ## P<0.01， 与伪手术组进行比较； ^AP<0.05， "P<0.01， 与模型组进行比较。

由表 7可见， 模型组中的血清 MDA、 LD、 CK、 CK- MB水平显著高于伪手术组 (P<0.01)， 而 SOD、 Na⁺-K⁺-ATPa_Se活力显著低于伪手术组 (P<0.01)， 表明造模成功。 与模型组相比， 阿司匹林组、 丹酚 酸 T低剂量组、 丹酚酸 T高剂量组可显著降低心肌缺血大鼠血清 MDA及 LD含量（P<0.05 ) ; 阿司 匹林组、 丹酚酸 T高剂量组可显著升高心肌缺血大鼠血清 SOD活性 （分别为？<0.05、 P<0.01 ) ; 阿 司匹林组、 丹酚酸 T低剂量组、 丹酚酸 T 高剂量组可显著降低心肌缺血大鼠血清 CK 的活力 ( P<0.05， P<0.01 ) ; 阿司匹林组、 丹酚酸 T高剂量组可显著降低 CK- MB的活力（P<0.01 ) ; 阿司匹 林组、 （«-丹酚酸 T低剂量组、 丹酚酸 T高剂量组可显著升高 Na+- K+- ATPase的活力 （P<0.05 )。

从图 11可以看出， 丹酚酸 T高剂量组与阿司匹林组具有同等程度的抗冠脉结扎急性心肌梗塞 作用。 通过进一步的试验显示， 与 丹酚酸 T类似， （R)-丹酚酸 T高剂量组与阿司匹林组也具有同等 程度的抗冠脉结扎急性心肌梗塞作用。

药效试验例 2 (R)-丹酚酸 T对大鼠实验性急性心肌缺血的保护作用研究

实验材料

1 . 受试物及试剂： 垂体后叶素 (Pit)注射液， 南京新百药业有限公司生产， 批号： 081004： 生理盐水， 天津天安药业股份有限公司生产， 规格 500ml/瓶， 批号： 201009231， （R 丹酚酸 T， 纯度 95%以上， 由天士力控股集团研究院提供。

2. 主要仪器： MedLab八道生理记录仪： 南京美易科技公司。

3. 实验动物： SD大鼠， 体重 220-250g， 雌雄各半， 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供， 合格证： SCXK (京） 2007-0001。 词养在动物词养室中， 室温 20-25 °C， 照明时间 12h， 食用鼠专用词 料 （北京科澳协力词料有限公司生产）， 饮用自来水。

实验方法

1 . 剂量设计： （?)-丹酚酸 T冻干粉给药剂量： 高剂量组： 10.0mg/kg体重； 低剂量组： 5.0mg/kg体重。

2. 分组：

2.1动物筛选： 于正式实验前分别给大鼠尾静脉注射垂体后叶素 (Pit) (lU/kg)，描记正常及注射后 5min 心电图， 观察 J点抬高、 T波异常的情况， 将未注射前就出现异常心电图者以及对 Pit不敏感者剔除。

2.2动物分组：入选大鼠随机分为 3组，分别为①模型对照组；② (R 丹酚酸 T冻干粉低剂量组；③ (R)- 丹酚酸 T冻干粉高剂量组。

3. 实验方法： SD大鼠， 体重 220-250g， 雌雄各半， 随机分组， 每组 10只。 模型对照组的大鼠每日 灌胃等容积的生理盐水， 给药组每日灌服不同样品的水悬液， 全部动物均连续给药 7 天。 末次给药后 40min, 麻醉大鼠， 连接仪器， 描记 II导联正常心电图。 按 lU/kg体重由大鼠尾静脉恒速推注垂体后叶 素 (Pit), 推注时间控制在 10s左右， 描记给药后 0s、 15s、 30s > 45s及 lmin、 5min、 lOmin心电图变化， 比较各组注射 Pit前后以及给药组与模型对照组的差异， 分析 J点、 T波的变化。 结果用 t检验进行数 据统计分析。

实验结果

1 . 对于 J点的影响

表 8的结果表明， 在本实验条件下， 对于垂体后叶素造成的急性心肌缺血， iR 丹酚酸 T高剂量组 在 15s、 30s、 45s时， ECG的 J点升高巾 ^度小于模型对照组， 且差异有统计学意义 （P<0.05 )。

(R 丹酚酸 τ -0.049 -0.040 -0.069 -0.058 -0.052 -0.016 -0.058 -0.061 高剂量组 土 0.037 ±0.039 土 0.035* 土 0.035* +0.031* 土 0.037 ±0.049 ±0.049

*： Ρ<0.05， 与模型组进行比较。

表 9的结果表明， 在本实验条件下， （R)-丹酚酸 Τ高剂量组在 15s、 30s时， ECG的 T波升高幅度 小于模型组， 且差异有统计学意义 （P<0.05 )。

表 9 对急性心肌缺血的中 T波的变化 （ _±s, _n=10 )

*： P<0.05， 与模型组进行比较。

实验结论

(R)-丹酚酸 T高剂量组在 15s、 30s时， ECG的 J点和 T波升高幅度小于模型对照组， 且差异有统 计学意义 (P<0.05)。 结果表明： 在本实验条件下， （R)-丹酚酸 T ( 10.0mg/kg ) 有抗急性心肌缺血作用。 通过进一步的试验显示， 与 (R)-丹酚酸 T类似， 丹酚酸也具有类似的抗急性心肌缺血作用。

药效试验例 3 TR)-丹酚酸 T的自由基俘获反应

自由基具有直接或间接地发挥强氧化作用，广泛地参与机体的生理与病理过程。机体自由基过量时， 能通过氧化作用损伤机体。丹酚酸类化合物是酚羟基的供体， 具有抗氧化活性的结构基础。本药效实验 采用 1,1-二苯基 -2-苦肼基（l,l-diph_enyl-2-pi_Cryl-hyd_raZyl， DPPH ) 自由基清除反应模型观察 (¾/(R)-丹酚 酸 T对自由基的清除效力。

1、 试剂和仪器

TR)-丹酚酸 T， 纯度 95%以上， 由天士力控股集团研究院提供。维生素 C和 DPPH均购于 Sigma 公司。 紫外分光光度计 MV-1800购于北京瑞利分析仪器公司。

2、 实验方法

反应总体积为 2ml， 取 lml不同浓度样品 80%甲醇溶液加入 ΙΟΟμΜ DPPH甲醇溶液中， 混匀后在 暗处 25 °C下反应 20min， 测定反应液在 517nm处的吸光度。 实验中采用维生素 C作为阳性比较。 自由 基清除率采用下述公式计算：

由基清除率 (％)=[1- A /A / A χ100%。

其中， A 为受试样品的吸光度值， A «««为无受试样品的吸光度值。

3、 实验结果

TR)-丹酚酸 T的自由基清除力明显大于维生素 C的自由基清除力， 但两种异构体的自由基清除 力无显著性差异 （P<0.05 )。

表 10 ( /fR 丹酚酸 T的自由基清除力

药效试验例 4 丹酚酸 T的还原力测定

药物还原力的大小在一定程度上反映了其预防性抗氧化功能的强弱。 本发明对 rR)-丹酚酸 τ的 还原力进行实验研究。

1、 试剂和仪器

TR)-丹酚酸 T， 纯度 95%以上， 由天士力控股集团研究院提供。 铁氰化钾， 分析纯， 购于天津市 化学试剂一厂。 三氯乙酸， 分析纯， 购于国药集团化学试剂有限公司。 三氯化铁， 分析纯， 购于天津市 风船化学试剂科技有限公司。 维生素 C购于 Sigma公司。 紫外分光光度计 MV-1800购于北京瑞利分析 仪器公司。 冷冻离心机： Z323K, 德国 HEMMLE。

2、 实验方法

吸取 0.5mL含有不同浓度 (¾ TR 丹酚酸 T的 200mM pH 6.8磷酸缓冲液， 0.2mL 1.0% ( w/v ) 铁氰 化钾溶液， 50°C水浴 20min后冰浴冷却， 加入 0.5ml 10%三氯乙酸溶液， 于 1000g/min离心 10min， 取 上清液 1.0mL， 力 B l.OmL蒸馏水和 0.2ml 0.1 % ( w/v ) FeCl₃溶液， 静置 lOmin后于 700nm处测定吸光 度， 同时进行空白实验。 维生素 C是一种强还原性物质， 在本研究中作为阳性对照。 样品还原力等于 样品吸光值减去空白对照组的吸光值， 吸光度越大， 则还原力越强。

3、 实验结果

丹酚酸 T的还原力均明显强于维生素 C， 二者的还原力无显著性差异 （P<0.05 )。 表 11 («/(R)-丹酚酸 T的还原能力

药效试验例 5 R)-丹酚酸 τ抗小鼠肺纤维化实验

肺纤维化是肺损伤后常见的反应和并发症，其主要的病理改变为弥漫性肺泡炎症、肺成纤维细胞灶 的形成以及细胞外基质的反复修复和过度沉积。肺纤维化常以呼吸功能永久丧失为最终结局， 目前尚缺 乏有效防治手段。博来霉素诱导的小鼠肺纤维化是研究人体肺纤维化常用的模型，在这个模型中博来霉 素直接和间接产生的氧自由基是促发肺纤维化的机制之一。

1、 试剂和仪器

TR)-丹酚酸 T， 纯度 95%以上， 由天士力控股集团研究院提供。 超氧化物歧化酶 （SOD)、 过氧 化氢酶 （CAT)、 过氧化物酶 （POD)、 丙二醛 （MDA) 试剂盒均购自南京建成工程研究所。 博来霉素， 购自 Sigma公司。

2、 动物

昆明种小鼠， 全雌性， 体重 22-25g， 北京维通利华实验动物公司提供， 在温度 23±2°C、 相对湿度 65%-75% > 光照周期 12h: 12h环境中词养。

3、 实验方法

将 40只小鼠随机分为 4组： ①正常对照组， 鼻内滴生理盐水， 灌胃给生理盐水； ②模型对照组： 鼻内滴博来霉素， 灌胃给生理盐水； ③ 丹酚酸 T组 （ 16mg/kg )： 鼻内滴博来霉素， 灌胃给 丹酚 酸 T溶液； ④ fR 丹酚酸 T组 （16mg/kg ) : 鼻内滴博来霉素， 灌胃给 (R 丹酚酸 T溶液； 每组 10只小 鼠。

实验第一天， 用水合氯醛将小鼠麻醉， 博来霉素 50μ_§/只对小鼠一次性滴鼻建立肺纤维化模型。 实 验第二天， 两个治疗组灌胃给予 TR)-丹酚酸 Τ， 模型组和正常组灌胃给与等容量的生理盐水， 每日 1 次， 连续 3周。 实验第 21天， 眼眶静脉取血分离血清用于检测 TGF-βΙ , 处死小鼠取肺脏， 用双蒸馏水 研磨（肺脏与双蒸馏水的比例为 l :5 ( w/v ) )成组织匀浆，离心后用于组织 MDA、超氧化物歧化酶（SOD)、 过氧化氢酶 （CAT)、 过氧化物酶 （POD ) 检测。

统计方法： 结果均以 x±s表示， 采用 SPSS110统计软件进行组间单因素方差分析， 两两比较用两 组独立样本 ί检验。

4、 实验结果

对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响： 与正常小鼠比较， 博来霉素诱导的小鼠纤维化肺组织中 TGF-βΙ升高 9.96倍， MDA升高 1.83倍， 抗氧化酶 SOD、 POD、 CAT降低约 1.5倍， 血清 TGF-βΙ也 增加 4.44倍， 造模成功。 f /fR 丹酚酸 T均能抑制博来霉素诱导的小鼠血清 TGF-βΙ升高（表 12)， 阻 止博来霉素诱导的小鼠肺脏 SOD、 POD, CAT降低（表 13 )，并降低肺脏 MDA及 TGF- βΐ含量（表 12)。 表 12 f /fR 丹酚酸 Τ对博来霉素诱导的小鼠组织及血清中因子水平的影响 （x±s， n=10 )

*： P<0.05 ; **： P<0.01， 与模型组进行比较。 表 13 TR)-丹酚酸 T对博来霉素诱导的小鼠组织中氧化酶类水平的影响 （x±s， n=10 )

*： P<0.05 _; **： P<0.01， 与模型组进行比较。 药效试验例 6〔W/〔R)-丹酚酸 T对 TGF-β诱导的成纤维细胞的抑制作用

TGF-β诱导的成纤维细胞过度增生和成纤维细胞激活后向肌成纤维细胞分化在肺纤维化形成过程 中扮演了重要的角色， 抑制 TGF-β信号转导可阻止肺成纤维细胞的增生和激活， 对有效的防治肺纤维 化是重要的手段之一。

1、 试剂和仪器

(¾/TR -丹酚酸 Τ，纯度 95%以上，由天士力控股集团研究院提供。 DMEM培养基、 ΜΤΤ、重组 TGF-βΙ 购自 Sigma公司。 青霉素和链霉素为石家庄制药集团公司产品。 胎牛血清， 杭州四季青生物工程材料 研究所产品。 胶原检测试剂盒， Biocolor公司产品。 层粘连蛋白 (LN)放免试剂盒购自北京北方生物技术 研究所。

EL-800X型酶标仪，购自 BIO-TEK公司 C0₂培养箱，购自 Thermo公司；流式细胞仪，购自 FACS 公司。

2、 细胞株

L929细胞， 购自军事医学科学院细胞研究所。

3、 实验方法

将 L929细胞用含 10%胎牛血清的 DMEM培养液调细胞数 5xl0⁷/L接种于 96孔板， 培养 24h。 补 充含 2μ_§/ί的 TGF-βΙ及不同浓度 R 丹酚酸 T的同样培养基。 每个做 6个复孔， 酚酸 T 终浓度设为 0、 1、 3、 10、 20、 40、 80、 150μηιο1/ί。 培养 72h后除去培养基， 按 MTT法测定细胞活性。

4、 实验结果

丹酚酸 T和 fR 丹酚酸 T对 TGF-βΙ诱导的 L929细胞增殖有抑制作用 （图 12)， 丹酚酸 T 的 IC_5Q为 26.1 μιηο1/ί， （ ?)-丹酚酸 Τ的 IC_5Q为 26.9μιηο1/ί， 两者无显著性差异。

本发明的药效试验结果表明： 本发明的丹酚酸 Τ具有抗急性心肌梗塞活性和抗急性心肌缺血活性， 具有较好的自由基清除力和还原力， 并且还具有肺纤维化的治疗活性。

Claims

权利要求书

1. 一种结构式 （I) 的丹酚酸1\ 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物和可水解的酯。

结构式 （I)

2. —种如权利要求 1所述的丹酚酸 T的制备方法， 其中， 所述方法包括如下步骤：

(la)提取： 将丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物进行水提， 滤液浓缩为水提浸膏， 然后醇 沉， 使上清液浓缩为醇沉浸膏；

(lb) 分离： 将所述步骤所述 （1) 中所得醇沉浸膏经水稀释后， 过大孔吸附树脂， 用酸性水溶液 冲洗除去杂质， 然后用乙醇洗脱， 将乙醇洗脱液浓缩为浸膏；

或者， 使用如下步骤 （1) 替换上述步骤 （la) 和 （lb):

(1) 合成： 将丹酚酸 B溶于水溶液， 加热反应；

(2)纯化： 将步骤 （1) 所得反应液调节 pH至酸性后或者将所述步骤 （lb) 所得浸膏使用高压制 备液相色谱仪进行纯化， 色谱填料为 C18反相硅胶柱， 洗脱液为乙腈 -水-甲酸， 进行等度洗脱或梯度洗 脱， 检测波长 280nm_; 用高效液相色谱监测洗脱过程， 收集含有丹酚酸 T的洗脱液， 浓缩后得所述丹 酚酸 T。

3. 一种如权利要求 1所述的丹酚酸 Τ的手性异构体的制备方法， 其中， 所述方法包括如下步骤： (la)提取： 将丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物进行水提， 滤液浓缩为水提浸膏， 然后醇 沉， 使上清液浓缩为醇沉浸膏；

(lb)分离： 将所述步骤（la) 中所得醇沉浸膏经水稀释后， 过大孔吸附树脂， 用酸性水溶液冲洗 除去杂质， 然后用乙醇洗脱， 将乙醇洗脱液浓缩为浸膏；

或者， 使用如下步骤 （1) 替换上述步骤 （la) 和 （lb):

(1) 合成： 将丹酚酸 B溶于水溶液， 加热反应；

(2)纯化： 将步骤 （1) 所得反应液调节 pH至酸性后或者将所述步骤 （lb) 所得浸膏使用高压制 备液相色谱仪进行纯化， 色谱填料为 C18反相硅胶柱， 洗脱液为乙腈 -水-甲酸， 进行等度洗脱， 检测波 长 280nm_; 用高效液相色谱监测洗脱过程， 合并含有丹酚酸 T的洗脱液， 浓缩后得所述丹酚酸 T;

(3) 手性异构体制备： 将所述步骤 （2) 得到的丹酚酸 T使用制备液相色谱仪进行手性异构体分 离， 色谱柱为反相手性色谱柱， 洗脱液为乙腈 -水-甲酸， 进行等度洗脱或梯度洗脱， 检测波长 280nm_; 用高效液相色谱监测洗脱过程， 分别收集含有 丹酚酸 T和 (R)-丹酚酸 T的洗脱液， 冻干后得到所述 丹酚酸 T和 (R)-丹酚酸 T纯品。

4. 如权利要求 2或 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （la) 中， 所述丹参药材或丹参药材与其 它药材的混合物为饮片、 粉碎颗粒或粉末， 所述的其它药材为与丹参配伍的三七、 黄芪或二者的组合。

5. 如权利要求 2或 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （la) 中， 所述水提步骤为加入 4-8倍所 述药材体积的水， 煎煮 1.5- 4h; 滤过； 滤液浓缩至相对密度为 1.10- 1.30 (80°C) 的水提浸膏。

6. 如权利要求 2或 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （la) 中， 所述水提步骤为加入 6倍所述 药材体积的水， 煎煮 3h_; 滤过； 滤液浓缩至相对密度为 1.22 (80°C) 的水提浸膏。

7. 如权利要求 2或 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （la) 中， 所述水提步骤使用碱性水溶液 进行， 所述碱性水溶液为碳酸氢钠水溶液、 碳酸钠水溶液、 碳酸氢钾水溶液、 碳酸钾水溶液、 氢氧化钠 水溶液、 氢氧化钾水溶液中的至少一种。

8. 如权利要求 7所述的制备方法， 其中， 所述碱性水溶液为 0.3%-0.45% (w/v) 的碳酸氢钠水溶 液。

9. 如权利要求 2或 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （la) 中， 所述醇沉步骤为向上述水提浸 膏中加入 95% (v/v) 乙醇进行醇沉至醇含量为 50%- 70% (v/v) (25°C )， 静置 8- 36h; 取上清液， 减压 回收乙醇， 浓缩至相对密度为 1.25-1.5 ( 60°C ) 的醇沉浸膏。

10. 如权利要求 2或 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤（la) 中， 所述醇沉步骤为向上述水提浸 膏中加入 95% (v/v) 乙醇进行醇沉至醇含量为 60% (v/v) (25°C )， 静置 24h; 取上清液， 减压回收乙 醇， 浓缩至相对密度为 1.32 ( 60°C ) 的醇沉浸膏。

11. 如权利要求 2或 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤（lb) 中， 所述大孔吸附树脂为非极性或 弱极性大孔吸附树脂。

12. 如权利要求 11所述的制备方法，其中，所述非极性或弱极性大孔吸附树脂为 AB-8型、 HPD450 型、 D101型或 X5型大孔吸附树脂。

13. 如权利要求 12所述的制备方法， 其中， 所述非极性或弱极性大孔吸附树脂为 AB-8型。

14. 如权利要求 2或 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤（lb) 中， 所述步骤（la) 中使用的药材 与所述大孔吸附树脂的重量比为 (5： 1 )-( 1： 1 )。

15. 如权利要求 14所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （la) 中使用的药材与所述大孔吸附树脂的 重量比为 3: 1。

16. 如权利要求 2或 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤（lb) 中， 所述酸性水溶液选自盐酸水溶 液、 硫酸水溶液、 硝酸水溶液和乙酸水溶液中的任意一种或它们的组合； 将溶液的 pH调节为 1.0-5.0; 使用该酸性溶液冲洗至洗脱液近乎无色。

17. 如权利要求 16所述的制备方法， 其中， 所述酸性水溶液为盐酸水溶液； 将溶液的 pH调节为 3.0。

18. 如权利要求 2或 3所述的制备方法，其中，所述步骤（lb)中，使用柱体积 4-10倍量的 50%-95% (v/v) 乙醇进行洗脱； 然后， 将洗脱液浓缩为无醇味的浸膏。

19. 如权利要求 18所述的制备方法， 其中， 使用柱体积 5倍量的 95% (v/v) 乙醇进行洗脱。

20. 如权利要求 2或权利要求 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （1 ) 中， 所述反应原料为丹酚 酸 B或其盐。

21. 如权利要求 2或权利要求 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （1 ) 中， 所述丹酚酸 B与所述 水溶液的质量比为 1 :0.1-1 : 100000， 反应温度为 10-150°C， 反应时间为 lOmin至 24h。

22. 如权利要求 2或权利要求 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （1 ) 中， 所述丹酚酸 B与所述 水溶液的质量比为 1 :200， 反应温度为 90°C， 反应时间为 lh。

23. 如权利要求 2或权利要求 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （1 ) 中， 所述水溶液为酸性水 溶液、 中性水溶液或碱性水溶液。

24. 如权利要求 2或权利要求 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （1 ) 中， 所述水溶液为碱性水 溶液， 所述碱性水溶液选自于如下水溶液中的至少一种： 碳酸氢钠水溶液、 碳酸钠水溶液、 碳酸氢钾水 溶液、 碳酸钾水溶液、 氢氧化钠水溶液和氢氧化钾水溶液。

25. 如权利要求 8所述的制备方法， 其中， 所述碱性水溶液为 0.05%-0.45% (w/v)的碳酸氢钠水溶 液。

26. 如权利要求 2或权利要求 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （2) 中， 使用盐酸水溶液、 硫 酸水溶液、 硝酸水溶液和乙酸水溶液中的任意一种或者它们的任意组合将所述反应液的 pH调节为 1.0-6.0。

27. 如权利要求 26所述的制备方法， 其中， 使用盐酸水溶液将所述反应液的 pH调节为 3.0。

28. 如权利要求 2或 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （2 ) 中， 所述的高压制备液相色谱仪为 动态轴向高压制备液相色谱仪， 色谱填料为 C18反相硅胶柱， 将通过所述步骤 （1 ) 调节了 pH的反应 液或者所述步骤 （lb ) 中所得浸膏用流动相溶解， 所述流动相为乙腈：水：甲酸 （体积比） =(10:90: 1)-(90: 10: 1)； 洗脱液使用上述流动相配比， 洗脱为等度洗脱或梯度洗脱； 流速 300mL/mi_{n ;} 检 测波长 280nm_; 使用高效液相色谱法监测洗脱过程， 收集保留时间在 21.2-24.0min的组分， 浓缩至干， 得到丹酚酸 T样品。

29. 如权利要求 28所述的制备方法，其中，所述流动相为乙腈:水:甲酸 (体积比) =(10:90: 1)-(50:50: 1)。

30. 如权利要求 28所述的制备方法， 其中， 所述流动相为乙腈:水:甲酸 （体积比） =15:85: 1。

31. 如权利要求 28所述的制备方法， 其中， 所述洗脱使用流动相乙腈:水:甲酸 （体积比） =15:85: 1 进行等度洗脱。

32. 如权利要求 3所述的制备方法， 其中， 所述步骤 （3 ) 中， 使用制备液相色谱仪进行手性异构 体分离， 色谱柱为反相手性色谱柱， 将步骤 （2) 中所得的丹酚酸 T样品用流动相溶解， 所述流动相为 乙腈:水:甲酸（体积比） =(90: 10: 1)-(10:90: 1)；洗脱液使用上述流动相配比，洗脱为等度洗脱或梯度洗脱； 流速 25mL/mi_{n ;}检测波长 280nm;使用高效液相色谱法监测洗脱过程，分别收集保留时间在 19.5-21. Imin 的 丹酚酸 T组分、 23.9-25.3min的 (R)-丹酚酸 T组分，先低温浓缩后再冻干，得到 丹酚酸 T和 (R)- 丹酚酸 T纯品。

33. 如权利要求 32所述的制备方法， 其中， 所述流动相为乙腈:水:甲酸 （体积比） =17:83: 1。

34. 如权利要求 32所述的制备方法， 其中， 所述洗脱使用流动相乙腈:水:甲酸 （体积比） =17:83: 1 进行等度洗脱。

35. 如权利要求 32所述的制备方法， 其中， 所述低温为 10-40°C。

36. 如权利要求 32所述的制备方法， 其中， 所述低温为 30°C。

37. 一种含有权利要求 1所述的丹酚酸 T、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水 解的酯的药物组合物。

38. 一种含有权利要求 1所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水 解的酯的抗氧化剂。

39. 一种含有权利要求 1所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水 解的酯的自由基清除剂。

40. 权利要求 1所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯在 制备治疗急性心肌梗塞和急性心肌缺血的药物中的应用。

41. 权利要求 1所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯在 制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。

42. 权利要求 1所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯在 制备抗氧剂中的应用。

43. 权利要求 1所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯用 于治疗急性心肌梗塞、 急性心肌缺血或肺纤维化疾病。

44. 权利要求 1所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯用 于延缓衰老。

45. 权利要求 1所述的丹酚酸 Τ、 其药学上可接受的盐、 其手性异构体、 溶剂化物或可水解的酯用 于抗氧化作用。