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WO2014201587A1 - 具有酪氨酸激酶抑制活性的物质、其制备方法及用途 - Google Patents

具有酪氨酸激酶抑制活性的物质、其制备方法及用途 Download PDF

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WO2014201587A1
WO2014201587A1 PCT/CN2013/000720 CN2013000720W WO2014201587A1 WO 2014201587 A1 WO2014201587 A1 WO 2014201587A1 CN 2013000720 W CN2013000720 W CN 2013000720W WO 2014201587 A1 WO2014201587 A1 WO 2014201587A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
tumor
indanone
benzimidazole
tyrosine kinase
Prior art date
Application number
PCT/CN2013/000720
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
杨晓明
王林
李长燕
詹轶群
刘靖
罗腾
颜海燕
张首国
李围
温晓雪
彭涛
李鲁
Original Assignee
中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to PCT/CN2013/000720 priority patent/WO2014201587A1/zh
Priority to US14/900,473 priority patent/US9642839B2/en
Priority to JP2016520212A priority patent/JP6239103B2/ja
Publication of WO2014201587A1 publication Critical patent/WO2014201587A1/zh

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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
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    • A61K31/4178—1,3-Diazoles not condensed 1,3-diazoles and containing further heterocyclic rings, e.g. pilocarpine, nitrofurantoin
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    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
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    • C07D209/32—Oxygen atoms
    • C07D209/34—Oxygen atoms in position 2
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    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms

Definitions

  • the invention belongs to the field of medicine and relates to a new class of compounds, in particular to a class of 2-anthrone derivatives (formula 1), geometric isomers thereof, pharmaceutically acceptable salts thereof and preparation methods thereof Application in disease.
  • Tumors are a major disease that threatens human health. The number of deaths per year from malignant tumors worldwide ranks second among all deaths. Research on anti-tumor drugs has been closely watched around the world. Conventional chemotherapeutic drugs can non-specifically block cell division or directly cause cell death, thus killing tumor cells and destroying normal human cells. With the deep understanding of the mechanism of tumorigenesis and development, and the key enzymes of tumor cell signal transduction pathway as targets, the development of new drugs with high efficiency, low toxicity and specificity has become an important research direction of antitumor drugs.
  • the protein tyrosine kinase signaling pathway is closely related to the proliferation and differentiation of tumor cells. Interfering with or blocking the tyrosine kinase signaling pathway has become a hot spot in the development of anti-tumor drugs.
  • tyrosine kinase inhibitors such as the tyrosine kinase inhibitor gefitinib for the treatment of lung cancer, the tyrosine kinase inhibitor Gleevec for the treatment of chronic myelogenous leukemia, and the treatment of advanced renal cell carcinoma.
  • Suchitinib, etc. can act on multiple targets such as EGFR and VEGFR.
  • tyrosine kinase inhibitors under development that have entered different stages of clinical research.
  • Gifitinib is a tyrosine kinase inhibitor developed by AstraZeneca in the United Kingdom and approved for advanced or metastatic non-small cell lung cancer in the United States in 2003. Approved for listing in China in 2005. Clinical studies were conducted at five clinical research sites in China to assess the objective response rate of gefitinib 250 mg/day in patients with previously treated chemotherapy for non-small cell lung cancer. A total of 159 subjects took gefitinib 250 mg at least once. The results showed an objective response rate of 27.0% (gefitinib specification, http: ⁇ baike. soso. com/v8292080.htm). This shows that the drug is not efficient. Therefore, it is of great practical significance to continue to search for efficient tyrosine kinase inhibitors.
  • An object of the present invention is to provide a substance capable of inhibiting tyrosine kinase activity and a drug which has an antitumor effect.
  • a first aspect of the invention relates to a substance having tyrosine kinase inhibitory activity, which is a compound of the formula I, a geometric isomer thereof and a pharmaceutically acceptable salt thereof -
  • R 2 is hydrogen or halogen
  • R 3 is hydrogen or methyl
  • R 4 is phenyl, cyclohexyl, halogen substituted phenyl, tolyl
  • the compound of formula I includes any one of the following:
  • the present invention designs a series of compounds based on the structure-activity relationship of tyrosine kinase inhibitors, and evaluates the tyrosine kinase inhibitory activity of the synthesized compounds, confirming that these compounds have good tyrosine kinase inhibitory activity.
  • the compound of the present invention is effective for inhibiting the action of tyrosine kinase activity, and thus has potential antitumor activity and can be used for antitumor treatment.
  • geometric isomers of the above compounds, pharmaceutically acceptable salts thereof, hydrates or solvent compounds thereof, and pharmaceutical compositions of pharmaceutically acceptable carriers or excipients are also within the scope of the present invention. Specifically include:
  • salts of the above compounds including the sulfates, pyrosulfates, hydrogen sulfates, sulfites, bisulfites, phosphates, monohydrogen phosphates, dihydrogen phosphates, metaphosphates, pyrophosphates of the compounds , hydrochloride, bromide, iodide, acetate, propionate, octoate, acrylate, formate, isobutyrate, acidate, citrate, propiolate, oxalic acid Salt, malonate, succinate, suberate, sebacate, fumarate, maleate, 2-butyne- 1, 4-diate, 3-cyclohexyne -2, 5 diacid salt, benzoate, chlorobenzoate, phenylacetate, phenylpropionate, phenylbutyrate, citrate, lactate, hippurate, hydroxybutyrate Acid salt, glycolate, maleate, tartrate, methane
  • Another aspect of the invention relates to a process for the preparation of a compound of formula I, including
  • the basic catalyst is selected from the group consisting of: inorganic basic compounds, including potassium hydroxide, sodium hydroxide, ammonia, calcium oxide and aqueous solutions thereof; organic amine compounds, including triethylamine, piperidine, Dimethylaminopyridine, 2,4,5-trimethylpyridine or pyridine, and the like.
  • the acidic catalyst is selected from the group consisting of inorganic acid compounds, including hydrochloric acid, phosphoric acid, and the like; and organic acid compounds including p-toluenesulfonic acid, acetic acid, and the like.
  • a pharmaceutical composition having one or more of a pharmaceutically effective amount of a substance having tyrosine kinase inhibitory activity and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient is also within the scope of the present invention.
  • Pharmaceutical compositions containing an effective amount of a compound of the invention can be prepared using a pharmaceutical carrier well known to those skilled in the art.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a compound of formula I, a geometric isomer thereof, and a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a composition thereof, for the manufacture of a tyrosine kinase inhibitor drug or an antitumor drug.
  • the invention also encompasses the use of the compounds as prodrugs for the treatment, prevention, inhibition or alleviation of conditions of tumors and related diseases in mammals, preferably humans.
  • This application comprises providing a pharmaceutically effective amount of a medicament of the invention and a pharmaceutical composition thereof to a mammal in need of treatment.
  • This application is suitable for inducing tumor cell apoptosis, anti-tumor neovascularization, preventing tumor chemoresistance and preventing malignant metastasis of the tumor.
  • the tumor is breast cancer, lung cancer, skin cancer, colon cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, liver cancer, stomach cancer, head and neck cancer, glioma, neuroblastoma, melanoma, kidney cancer or leukemia.
  • the tyrosine kinase inhibitor drug is a therapeutic agent for a disorder associated with the c-Met or Trk signaling pathway.
  • Conditions associated with the c-Met signaling pathway include, but are not limited to, liver cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, colon cancer, gastric cancer, head and neck cancer, or leukemia.
  • Conditions associated with the Trk signaling pathway include, but are not limited to, breast cancer, lung cancer, skin cancer, gastric cancer, glioma, neuroblastoma, melanoma, renal cancer, or leukemia.
  • Another aspect of the invention relates to 3-(1H-benzimidazole-2-methylene)-5-(2-methylanilinosulfo)-2-indanone (Indo 5) in the preparation of the tyrosine
  • an acid kinase inhibitor or an antitumor drug including but not limited to breast cancer, lung cancer, colon cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, liver cancer, gastric cancer, head and neck cancer, glioma, melanoma, Renal cancer and leukemia, especially those associated with c-Met or Trk signaling pathways, including but not limited to liver cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, colon cancer, stomach cancer, head and neck cancer or leukemia, etc.
  • liver cancer, lung cancer or neuroblastoma include
  • the substance having tyrosine kinase inhibitory activity of the present invention can be administered by injection, orally or parenterally. It may be in the form of a tablet, a pill, a powder mixture, a capsule, a coating, a solution, an emulsion, a dispersing agent, an injection and a suppository, or other suitable form. These formulations are prepared according to methods well known to those skilled in the art.
  • the auxiliary materials used for the manufacture of tablets, capsules and coating agents are conventional auxiliaries such as starch, gelatin, gum arabic, silica, polyethylene glycol, solvents for liquid dosage forms such as water, ethanol, propylene glycol, vegetable oils. Such as corn oil, peanut oil, olive oil and so on.
  • auxiliaries such as surfactants, lubricants, disintegrants, preservatives, flavoring agents, pigments and the like may also be present in the preparation containing the compound of the present invention.
  • the effective dosage of the drug required to achieve the desired biological effect depends on a number of factors, such as the particular compound selected, the intended use, the type of administration, and the clinical condition of the patient.
  • the determination of the effective dose of the drug can be determined by reference to the existing tyrosine kinase inhibitor, the antitumor drug Gifitinib (Iressa), for example, 250 mg / day.
  • the present invention provides a class of 2-indolone derivatives having tyrosine kinase inhibitory activity, geometric isomers thereof, pharmaceutically acceptable salts thereof, and processes for preparing the compounds and uses thereof.
  • tyrosine kinase inhibitory activity evaluation it is confirmed that these compounds have good tyrosine kinase inhibitory activity, and thus have potential antitumor activity, and can be used as an active ingredient for preparing a medicament for preventing and treating tumor diseases (antitumor drugs),
  • the invention will play an important role in the treatment of anti-tumor and has broad application prospects.
  • Figure 1 shows the results of inhibition of tumors in HepG2 tumor-bearing mice by different doses of compound Indo 5
  • Figure 2 shows the inhibition of tumors in different doses of compound Indo 5 in MHCC97-L tumor-bearing mice
  • Figure 3 shows Tumor inhibition results of different doses of compound Indo 5 in MHCC97-H tumor-bearing mice
  • Figure 4 shows the inhibition of tumors in different doses of compound Indo 5 on NCI-H460 tumor-bearing mice
  • Figure 6A shows the results of inhibition of HGF-induced c-Met phosphorylation and signaling pathway in HepG2 cells by 2-indolone derivative Indo 5
  • Figure 6B shows the results of inhibition of c-Afet phosphorylation and signaling pathway in hepatoma cell line MHCC97-H by 2-indolone derivative indo 5
  • Figure 9 shows the inhibitory effect of 2-oxanone derivative Indo 5 on tumors in SK-N-SH tumor-bearing mice by intraperitoneal injection and intragastric administration.
  • the percentage concentrations are mass/volume (W/V) percent concentration or volume/volume (V/V) percent concentration unless otherwise stated.
  • biomaterials obtained in the examples are obtained by merely providing an experimentally obtained route for the purpose of specific disclosure and should not be a limitation on the source of the biomaterial of the present invention.
  • the sources of biological materials used are extensive, and any biological material that is not in violation of law and ethics can be replaced by the instructions in the examples.
  • Example 1 3-(1H-Benzimidazole-2-methylene)-5-(naphthylaminosulfo)-2-indanone (Indo 1) 0.17 g (0.5 ⁇ ) 5-( B-naphthylaminosulfo)-2-indanone and 0.10 g (0.685 awake ol) 1H-benzimidazole-2-carboxaldehyde was suspended in 6 mL of absolute ethanol, and 2 drops of piperidine were added in an oil bath. After heating under reflux for 30 min, a large amount of a yellow solid precipitated, which was filtered and washed with anhydrous ethanol to afford 0.18 g of pale yellow solid.
  • Example 3 3-(1 ⁇ -benzoimidazole-2-methylene)-5-(N-methylanilinosulfo)-2-indanone (Indo3) 0.15 g (0.5 draw 1) 5 - (N-methylanilinosulfo)-2-indanone and 0, 10g (0.685 awake ol) 1H benzimidazole-2-aldehyde was suspended in 6mL of absolute ethanol, adding 2 drops of piperidine, The oil was heated to reflux for 30 min, and a large amount of a yellow solid was precipitated, which was filtered and washed with anhydrous ethanol to give 0.14 g of pale yellow solid.
  • the pale yellow solid was analyzed as 3-(1H-benzimidazole-2-methylene)-5-(N-methylanilinosulfo)-2-indanone, and its structural formula is as shown in Formula I , among them, ! ⁇ is a methylanilinosulfo group, and R 2 is hydrogen.
  • Example 4 3-(1H-benzimidazole-2-methylidene)-5-(cyclohexylaminosulfonyl)-2-indanone (Indo4) 0.15 g (0.5 D1) 5- ( Cyclohexylaminosulfo)-2-nonanone and 0.10 g (0,685 awake) 1H-benzimidazole-2-aldehyde were suspended in 6 mL of absolute ethanol, and 2 drops of piperidine were added and heated in an oil bath. After refluxing for 30 min, a large amount of a yellow solid precipitated, which was filtered and washed with anhydrous ethanol to yield 0.17 g of pale yellow solid.
  • the pale yellow solid was analyzed as 3-(1H-benzimidazole-2-methylene)-5-(cyclohexylaminosulfo)-2-indanone, and its structural formula is as shown in Formula I, wherein , is a cyclohexylaminosulfonyl group, and R 2 is hydrogen.
  • Example 5 3-(1H-benzimidazole-2-methylidene)-5-(2-methylanilinosulfo)-2-indanone (Indo 5) 0.15 g (0.5 listens 1) 5-(2-methylanilinosulfo)-2-indanone and 0.10 g (0.685 11) 1H-benzimidazole-2 formaldehyde were suspended in 6 mL of absolute ethanol, and 2 drops of piperidine were added to the oil. Heated back in the bath 30rain, a large amount of yellow solid precipitated, filtered, washed with anhydrous ethanol to give 0.12g of pale yellow solid, yield 55.8
  • the pale yellow solid was analyzed as 3-(1H-benzimidazole-2-methylene)-5-(2-methylanilinosulfo)-2-indanone, and its structural formula is as shown in Formula I Wherein, it is a 2-methylanilinosulfo group, and R 2 is hydrogen.
  • Example 6 3-(1H-benzimidazole-2-methylidene)-5-(4-chloroanilinosulfo)-2-indanone (Indo6) 0.16 g (0.5 leg ol) 5- (4-Chloroanilinylsulfo)-2-oxanone and 0.10g (0.685 ⁇ ol) 1H-benzimidazole-2-aldehyde were suspended in 6mL absolute ethanol, add 2 drops of piperidine, in oil bath The mixture was heated to reflux for 30 min, and a large amount of a yellow solid was precipitated, which was filtered and washed with anhydrous ethanol to give 0.18 g of pale yellow solid.
  • Example 7 3-(1H-benzimidazole-2-methylidene)-5-(4-hydroxyethylanilinosulfo)-2-indanone (Indo 7 ) 0.16 g (0.5 mobil 1 5-(4-Hydroxyethylanilinosulfo)-2-indanone and 0.10 g (0.69 ol) 1H-benzimidazole-2-carboxaldehyde was suspended in 6 mL of absolute ethanol, and 2 drops of piper was added. The pyridine was heated to reflux for 30 min in an oil-bath, and a large yellow solid precipitated, which was filtered and washed with ethyl acetate to afford 0.16 g of pale yellow solid.
  • Example 8 3-(1H-benzimidazole-2-methylene)-5-(4-toluaminosulfonyl)-2-indanone (Indo 8) 0.15 g (0.5 leg ol) 5 - (4-Tolylaminosulfo)-2-oxanone and 0.10 g (0.685 ⁇ ol) 1H-benzimidazole-2-carboxaldehyde was suspended in 6 mL of absolute ethanol, 2 drops of piperidine was added, and the mixture was heated to reflux for 30 min in an oil bath. A large amount of a yellow solid was precipitated, filtered, and washed with anhydrous ethanol to give 0.18 g of pale yellow solid. , yield 83.7
  • Example 9 3-(1H-benzimidazole-2-methylidene)-5-(4-ethoxyanilinosulfo)-2-indanone (Indo 9) 0.16 g (0.5 mmol) 5-(4-Ethoxyanilinosulfo)-2-indanone and 0.10 g (0.685 ol) 1H-benzimidazole-2-carboxaldehyde were suspended in 6 mL of absolute ethanol, and 2 drops of piperidine were added. The mixture was heated to reflux for 30 min in an oil bath, and a large amount of yellow solid was precipitated, filtered, and washed with anhydrous ethanol to give 0.13 g of pale yellow solid.
  • Tyrosine kinase buffer 10mL 1M HEPES (pH 7.5), 0.4mL 5% BSA/PBS, 0.2mL 0.1M Na :i V0 4 , lmL 5M NaCl into 88.4mL double distilled water; (HEPES: Amresco ; N V0 4 : Sigma).
  • ATP adenosine triphosphate
  • tissue extract PTK The mouse brain tissue was quickly taken out, weighed, and 5 volumes of pre-cooled homogenization buffer was added and homogenized. After centrifugation at 1000 ° for 10 min, remove the nuclei and cell debris. Collect the supernatant Sl, centrifuge at 20 °C, 10000 g for 20 min, and collect the supernatant S2. Preserve the precipitate P2, which represents the crude membrane protein fraction. S2 contains the cytoplasmic protein, used for Detect PTK (tyrosine protein kinase) activity. If membrane protein fraction is detected, take P2, add 2 Double volume lysis buffer, placed on ice for 10 min. Centrifuge at 4 ° C, 1000 °g for 10 min.
  • the supernatant fraction S3 was collected to represent a crude membrane protein containing a soluble membrane protein for detecting PTK activity.
  • the protein content of the cytoplasm or membrane protein was measured using a BCA protein concentration kit (purchased from Biyuntian Biotechnology Research Institute). Tissue extract
  • 96-well plate coating Dissolve PTK substrate. Add 100 ⁇ L of substrate to each well, cover, and incubate overnight (10-12 hours) at 4 °C. Wash once with 200 ⁇ M elution buffer. After drying at 37 ° C for 2 h, it was washed once with lOraM PBS, dried at room temperature, and stored at 4 ° C until use.
  • IX tyrosine kinase buffer Take 1 mL (10X) of tyrosine kinase buffer plus 9 mL of double distilled water and mix. The tissue extract was diluted appropriately with IX tyrosine kinase buffer, gently mixed, and placed on ice. Dissolve the ATP storage solution, add 48 ⁇ l of 1 mL IX tyrosine kinase buffer, mix and place on ice. After each well was added to the microtiter plate according to the above experiment, the lid was capped and incubated at room temperature for 30 min. Wash with 200 ⁇ l elution buffer, pat dry, repeat 5 times.
  • Table 1 lists the experimental results of the drug group (corresponding to the compound number obtained in the examples) and the positive drug group (gefitinib). Table 1 Inhibition rate of tyrosine kinase by the compound of the present invention
  • Table 1 shows that the positive drug gefitinib has a significant inhibitory effect on tyrosine kinase at a concentration of 400 ⁇ M, and the inhibition rate is 40.2%; whereas in the examples of the present invention, the compound is at the same concentration for tyrosine.
  • the inhibitory effect of acid kinase was stronger, and the inhibition rate was above 45%, which was comparable to or better than that of the positive control drug, indicating that these compounds have potential preventive effects on tumors with high expression of tyrosine kinase.
  • 14 cell lines ( ⁇ -45 cells, MHCC97-L cells, MHCC97-H cells, HLE cells, HepG2 cells, 7721 cells, L02 cells, A375 cells, H460 cells, A549 cells, SK-N-SH) Cells, MCF-7 cells, K562 cells, Ba/F3-Tpr-Met cells (pre-B cells that are malignantly transformed by c-Met constitutive mutant Tpr Met) were seeded into 96-well plates at 1 ⁇ 107 wells, each well.
  • Tumor cells were cultured in T75 flasks, the cell state was reached in logarithmic growth phase, cells were trypsinized, and digestion was terminated with DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, and the cells were washed twice with PBS, and Suspend the cells, adjust the cell concentration to 5 ⁇ 10 7 , and take 150 ⁇ l to inject the right anterior dorsum of the mice. Observed daily after inoculation The tumor-bearing condition of nude mice was grouped when the volume reached 100 rnm 3 . Each nude mouse was numbered and the tumor size was measured, and the data was sorted into EXCEL to sort out the extreme values. A random number with the same number of mice was generated, and a random number was used to design the random block.
  • Mode of administration intraperitoneal injection, the injection dose is 4mg/kg, 8mg/kg, 16mg/kg, the solvent control group (control) injection of the same volume of DMSO; 24h administration once, a total of 6 times, during the administration process The change in tumor volume (length X width X width/2) was monitored and recorded in real time, and the results were expressed as mean ⁇ standard deviation. After 2 weeks, the mice were sacrificed, the tumors were weighed, and the inhibition rate of the compounds against the tumor was finally calculated.
  • Figure 1 shows the inhibition of tumors in HepG2 tumor-bearing mice by different doses of compound Indo 5; A is the tumor volume curve and B is the inhibition rate.
  • Figure 2 shows the inhibition of tumors in different doses of compound Indo 5 on MHCC97-L tumor-bearing mice; A is the tumor volume curve and B is the inhibition rate.
  • Figure 3 shows the results of inhibition of tumors in different doses of compound Indo 5 on MHCC97-H tumor-bearing mice; A is the tumor volume curve and B is the inhibition rate.
  • Figure 4 shows the results of inhibition of tumors in NCI-H460 tumor-bearing mice by different doses of compound Indo 5.
  • A is the tumor volume change curve, and B is the inhibition rate.
  • Tumor inhibition rate (average weight of control group - average weight of administration group) / average weight of control group X 100% Calculation results showed that intraperitoneal administration of compound Indo 5 inhibited tumor cell growth in a dose-dependent manner, the maximum dose (16 mg/kg)
  • the inhibition rates of compound Indo 5 on HepG2 cells, MHCC97-L/H cells, and NCI-H460 cells in vivo were: 61%, 68%, 61%, and 59%, respectively, indicating that compound Indo 5 was subcutaneously inoculated into various tumor cells.
  • the nude mouse model has a significant anti-tumor effect.
  • MHCC-97H cells were cultured in 1640 cell culture medium containing 10% fetal bovine serum (filling penicillin, streptomycin, ⁇ /mL), and placed in 37 ° C cells containing 5% C0 2 In the incubator, change the liquid every 1-2 days. After passage and digestion with 0.25% trypsin, centrifugation at lOOOr/min for 5 minutes, the supernatant was discarded, and subculture was carried out by adding fresh medium. The subcultured tumor cells were digested into suspensions under aseptic conditions, washed with sodium chloride injection, resuspended in suspension, and subcutaneously inoculated into the right forelimb of the nude mice.
  • liver after surgery was then placed back into the abdominal cavity of the mouse, and the abdominal muscles and skin were sequentially sutured with a surgical needle 4/0. After 2 weeks of normal feeding, the size of the liver tumor was observed by B-ultrasound, and the tumor body reached about 100 mm 3 , indicating that the in situ vaccination model was successful.
  • mice were randomly assigned to a vehicle control group, a low dose (18 mg/kg) group for intraperitoneal administration, a high dose (36 mg/kg) group for intraperitoneal administration, and a group (36 mg/kg) for intragastric administration. Group 9 only.
  • the drug was administered once every 24 hours, intraperitoneal administration was intraperitoneal injection, and the solvent control group was intraperitoneal injection of DMS0.
  • the administration cycle was six times. After the last administration, the words were continued for 3 weeks.
  • the animals were sacrificed by cervical dislocation and dissected. The liver was weighed and the tumor was weighed by the naked eye.
  • Fig. 5 shows photographs of the tumors peeled off after the death of 9 experimental animals in each group (arranged according to the size of the tumor, numbered from 1-9), in which the high dose group was intraperitoneally injected.
  • One experimental animal (No. 9) disappeared after the end of the experiment.
  • the 2-nonanone derivative (Indo 5) of the present invention can significantly inhibit the tumorigenic ability of a liver cancer cell line in the liver, and has a dose-dependent effect.
  • the anti-tumor effect of the intragastric administration and the intraperitoneal injection group was comparable, indicating that the compound of the present invention has an antitumor effect orally and has the potential to be developed as an oral antitumor drug.
  • Human lung cancer cell line A549 was cultured in 1640 cell culture medium containing 10% fetal bovine serum (filling penicillin, streptomycin, ⁇ /mL), and placed in a cell culture medium containing 5% CO 2 at 37 ° C. In the box, change the liquid every 1-2 days. Digestion with 0.25% trypsin, centrifugation at lOOOr/min for 5 minutes, discard the supernatant, Subculture was carried out by adding fresh medium. The subcultured tumor cells were digested into suspensions under aseptic conditions and injected in situ into the left chest wall between the third and fourth ribs of BALB/c nude mice (3. OxlOVmouse, 30 ⁇ 1), inoculated with needles.
  • the depth is about 5 mm into the lungs, and the first day of inoculation is D0. Animals were weighed after 7 days and randomized according to body weight. At this time, chest X-ray transmission showed that tumors were formed in the lungs of mice, and an animal model was constructed.
  • mice were randomly assigned to a solvent control group (intraperitoneal injection of DMS0), intraperitoneal injection of low dose (18 mg/kg) group, and intraperitoneal injection of high dose (36 mg/kg) group of three groups, once every 24 hours. After 6 consecutive administrations, the animals were kept, and the experiment was terminated after 30 days. The mice were sacrificed, the lungs were dissected, the tumors were isolated, and weighed.
  • the 2-nonanone derivative (Indo 5) of the present invention can significantly inhibit the tumorigenic ability of the lung cancer cell line A549 in situ in the lung, and has a dose-dependent effect.
  • the 2-nonanone derivative (Indo 5) of the invention inhibits lung in situ tumor formation ability of lung cancer cell A549
  • the reaction mixture of 12. 5 4 1 and 12. 5 ⁇ ⁇ pre-dissolved Indo 5 (different doses) Incubate for 5 minutes at room temperature, then add 25 ⁇ l 2 2 ⁇ ⁇ /substrate, mix, incubate for 30 minutes at room temperature.
  • the reaction was terminated by EDTA, pH 8). 25 ⁇ M of the above reaction and 75 ⁇ L of water were added to streptavidin-coupled 96-well plates and incubated for 60 minutes at room temperature. Wash the plate 3 times with 200 lPBS.
  • P- Tyr-100 antibody was diluted 1:1000 and added to a 96-well plate and incubated for 60 minutes at room temperature. The plate was washed 3 times with 200 ⁇ l PBS. The horseradish peroxidase-labeled secondary antibody was diluted, and 100 ⁇ M was added to a 96-well plate and incubated for 30 minutes at room temperature. After washing 3 times with 200 ⁇ l PBS/T, add 100 ⁇ M substrate and incubate for 15 minutes at room temperature, then add 100 ⁇ l of the stop solution, mix, and read the absorbance at 450 nm using a spectrophotometer. The SP50 software was used to calculate the IC50 value (the concentration at which the compound inhibited the kinase activity by 50%).
  • the 2-fluorenone derivative (Indo 5) of the present invention inhibits IC 5 of c-Met kinase.
  • the value was 0.16 ⁇
  • the IC50 for inhibiting TrkA kinase was 0.022 ⁇
  • the IC50 for inhibiting TrkB kinase was 0.23 ⁇
  • the IC50 for inhibiting other kinases was greater than 10 ⁇ .
  • the above results indicate that the 2-nonanone derivative (Indo 5) of the present invention has a remarkable inhibitory effect on c-Met kinase and Trk kinase (including TrkA, TrkB) activity in vitro, and has good selectivity.
  • the results of this experiment show that the 2-nonanone derivative (Indo 5) of the present invention specifically inhibits the activity of Met and Trk kinase, and has no significant effect on other kinases.
  • c-Met kinase is a high-affinity receptor for hepatocyte growth factor HGF, which plays an important role in tissue damage repair, wound healing, liver regeneration, and embryonic development.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • c-Met activates downstream signaling pathways, disrupts adhesion between tumor cells, promotes cell movement, and enhances tumor cell invasion and angiogenesis.
  • Abnormal expression of c-Met in clinical tumor patients is closely related to poor prognosis, rapid disease progression, high metastasis and short survival. c-Met has become an internationally recognized target for cancer therapy.
  • the present invention employs two liver cancer cell lines to detect the effect of compounds on the c-Met signaling pathway.
  • HepG2 cells highly express c-Met, which can stimulate the activation of e-Met and its downstream signaling pathways including ERK and Akt under HGF stimulation.
  • MHCC97-H cells are hepatocarcinoma cell lines that secrete HGF, and therefore, the cells have a higher sustained c-Met phosphorylation level under normal culture conditions.
  • the two hepatocellular carcinoma cell lines HepG2 and MHCC97-H were used to detect the inhibitory effect of the 2-indolone derivative of the present invention (using Indo 5 as an example) on HGF-induced c-Met phosphorylation and signaling pathway.
  • Liver cancer cell line HepG2 or c-Met with high expression of c-Met is successfully cultured in 1640 cell culture medium containing 10% fetal bovine serum (replenishing penicillin, streptomycin, ⁇ / (mL), placed in a 37 ° C 5% C0 2 cell culture incubator, changing every 1-2 days. 0. 25% trypsin digestion and passage, centrifugation at lOOOr/min for 5 minutes, discard the supernatant, and subculture with fresh medium.
  • MHCC97-H cells Add different concentrations (0. ⁇ , 0.5 ⁇ , 1. ⁇ , 2. ⁇ ) of Indo 5 or solvent DMS0 (0) or ⁇ to MHCC97-H cells cultured for 24 hours.
  • SU11274 treats cells.
  • SU11274 (purchased from Sigma) is a specific c-Met kinase inhibitor that blocks c-Met activation, but this compound is not a suitable clinical drug due to its solubility and side effects, but it can be used in experiments. Positive control compound. After the compound was incubated with the cells for 2 h, the cells were harvested to extract total protein.
  • MHCC97-H cells are human hepatoma cells with high metastatic properties that secrete HGF and activate the HGF/c-Met signaling pathway through an autocrine form.
  • MHCC97-H cells have higher levels of c-Met phosphorylation under normal culture conditions, and Indo 5 can inhibit c-Met phosphorylation and phosphorylation of downstream signaling pathways Akt and ERK in a dose-dependent manner (see image 6B); This result is comparable to the positive control SU11274, and the inhibitory effect of Indo 5 is comparable to that of SU11274 at 2 ⁇ concentration.
  • Trk (NTRK) kinase belongs to a small family of receptor tyrosine kinases, a neurotrophin receptor that plays an important role in the development and maintenance of the central and peripheral nervous systems. Members include TrkA (NTRK1), TrkB (NTRK2) and TrkC (NTRK3). Trk is closely related to tumorigenesis, and inhibition of Trk signaling has become one of the strategies for cancer therapy. Small molecule inhibitors against Trk and therapeutic-based monoclonal antibodies have been used in clinical interventions for peripheral pain, central nervous system abnormalities, and treatment of tumors.
  • TrkA is a high-affinity receptor for NGF
  • TrkB is a high-affinity receptor for BDNF
  • TrkA phosphorylation, TrkB phosphorylation, and downstream signaling can be used to evaluate 2-indolone derivatives of the present invention (indicated by Indo5)
  • the influence of this cellular pathway can further infer the inhibitory effects of neuroblastoma, breast cancer, lung cancer, and the like associated with the cellular pathway.
  • Neuroblastoma cells SK-N-SH were cultured in 1640 cell culture medium containing 10% fetal bovine serum (filling penicillin, streptomycin, ⁇ /mL), and placed at 37 ° C with 5% C0 2 In a cell culture incubator, change the solution every 1-2 days. After passage and digestion with 0.25% trypsin, centrifugation at 1000 r/min for 5 minutes, the supernatant was discarded, and subculture was carried out by adding fresh medium. SK-N-SH cells cultured in serum-free for 24 hours were added to different concentrations
  • the experimental results are shown in Fig. 7.
  • the 2-nonanone derivative (Indo 5) of the present invention is remarkable in a dose-dependent manner. Inhibition of phosphorylation of TrkA and its downstream signaling molecule ERK; as shown in Figure 8, the 2-anthracene derivative of the present invention
  • NGF/TrkA plays an important role in the development and progression of neuronal tumors.
  • SK-N-SH cells were selected as the research object, and a nude mouse tumor-bearing model was established to observe the effect of the 2-nonanone derivative (indo 5 as an example) on the tumor-bearing of nude mice.
  • Model establishment 6-8 weeks old nu/nu female nude mice, after breeding for one week at the animal center SPF level, each inoculated 5 ⁇ 10 6 neuroblastoma SK-N-SH cells (purchased from ATCC) Nude mice were subcutaneously implanted in the left forelimb, and the tumors of nude mice were observed every day after inoculation. When the volume reached 100 mm 3 , the cells were grouped. Each nude mouse was numbered and the tumor size was measured, and the data was sorted into EXCEL to sort out the extreme values. A random number with the same number of mice was generated, and a random number was used to design the random block.
  • mice Intraperitoneal injection, the intraperitoneal administration group and the intragastric administration group (16 mg/kg) were injected at doses of 1 ⁇ 2g/kg, 8mg/kg, 16mg/kg, respectively, and the same volume of DMSO (control) was injected into the solvent control group.
  • 10 experimental animals in each group once every 24 hours, a total of 6 times, the tumor volume (length X width X width/2) was monitored and recorded in real time during the administration, and the results were expressed by the mean soil standard deviation. .
  • the mice were sacrificed, and the tumors were weighed by the naked eye, and finally the compound inhibition rate of the tumor was calculated.
  • Figure 9 shows the results of inhibition of tumors in SK-N-SH tumor-bearing mice by different doses of compound Indo 5; A is the tumor volume curve and B is the inhibition rate. It is indicated that intraperitoneal injection of compound Indo 5 can effectively inhibit the growth of SK N-SH cells with a dose-effect relationship. The measured data were used to calculate the tumor inhibition rate, and the results showed that the compound Indo 5 administered intraperitoneally inhibited tumor cell growth in a dose-dependent manner, the maximum dose.
  • the compounds of the invention has an antitumor effect orally and has the potential to be developed as an oral antitumor drug.
  • the present invention provides 2-anthrone derivatives and preparation methods thereof, and these substances have tyrosine kinase inhibitory activity, and can be used as an active ingredient of a tyrosine kinase inhibitor drug or an antitumor drug, and are used for preventing and treating tumors. Development of diseases and anti-tumor drugs.

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Abstract

本发明公开一种具有酪氨酸激酶抑制活性的物质、其制备方法及用途，该物质为具有通式I结构的化合物、其几何异构体及其药用盐。本发明通过酪氨酸激酶抑制活性评价及相关实验，确证这些化合物具有良好的酪氨酸激酶抑制活性，能抑制多种肿瘤细胞，可开发为防治肿瘤疾病，特别是抗肝癌、肺癌和神经母细胞瘤的药物。

Description

具有酪氨酸激酶抑制活性的物质、 其制备方法及用途 技术领域
本发明属于医药领域， 涉及一类新化合物， 具体涉及一类 2-吲哚酮衍生物 （通 式 1 ) 、 其几何异构体、 其药用盐以及这些化合物的制备方法及其在防治肿瘤疾病 中的应用。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康的重大疾病， 全球每年因恶性肿瘤而死亡患者人数占所有 疾病死亡人数的第二位。 抗肿瘤药物的研究一直被全世界所密切关注。 传统的化学 治疗药物可非特异性地阻断细胞分裂或直接引起细胞死亡， 因此杀伤肿瘤细胞的同 时， 也破坏了人体正常细胞。 随着对肿瘤发生、 发展机制的深入了解， 以肿瘤细胞 信号转导通路的关键酶为靶点， 开发高效、 低毒、 特异性强的新型药物己经成为当 今抗肿瘤药物研究的重要方向。
在众多的抗肿瘤药物的靶点中， 蛋白酪氨酸激酶信号通路与肿瘤细胞的增殖和 分化有密切关系， 干扰或阻断酪氨酸激酶信号通路已成为当前抗肿瘤药物研发的热 点， 每年都有大量的研究报道。 已有多种酪氨酸激酶抑制剂上市， 如治疗肺癌的酪 氨酸激酶抑制剂吉非替尼、 治疗慢性髓性白血病的酪氨酸激酶抑制剂格列卫、 以及 治疗晚期肾细胞癌的苏尼替尼等， 它们可作用于 EGFR和 VEGFR等多个靶点。 还有更 多开发中的酪氨酸激酶抑制剂己进入不同的临床研究阶段。
抗肿瘤药物吉非替尼 （Gifit inib , Iressa) 是由英国阿斯利康公司开发的一种 酪氨酸激酶抑制剂， 于 2003年在美国批准用于晚期或转移性非小细胞肺癌。 2005 年在中国批准上市。 在中国的 5个临床研究基地中进行了临床研究， 以评估吉非替 尼片 250mg/日在既往接受过化学治疗的非小细胞肺癌患者中的客观缓解率。共有 159 名受试者至少服用了一次吉非替尼片 250 mg。 结果表明客观缓解率为 27. 0% (吉非 替尼说明书， http：〃 baike. soso. com/v8292080. htm) 。 这说明， 该药物的有效率 不高。 因此继续寻找高效的酪氨酸激酶抑制剂， 具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的在于提供能够抑制酪氨酸激酶活性的物质以及抗肿瘤作用的药 物。
本发明的第一个方面涉及具有酪氨酸激酶抑制活性的物质， 为具有通式 I的化 合物、 其几何异构体及其药学上可接受的盐-
Figure imgf000003_0001
其中： R2为氢或卤素； 为氢或 -S02NR3R4， 其中， R3为氢或甲基， R4为苯基、 环 己垸基、 卤素取代苯基、 甲苯基、 乙苯基、 乙氧基苯基、 羟苯基或 萘基。
所述式 I的化合物包括以下中的任何一种：
3- ( 1H-苯并咪唑 -2-亚甲基) -5- ( β-萘胺基磺基) -2-吲哚酮 (Indo l ) ；
3- ( 1H-苯并咪唑 -2-亚甲基) -5- (3-氯 -4-氟苯胺基磺基） -2-吲哚酮 (Indo 2) ；
3- ( 1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- (N-甲基苯胺基磺基） -2-吲哚酮 （Indo 3 ) ；
3- ( 1H-苯并咪唑 -2-亚甲基) -5- (环己胺基磺基) -2-吲哚酮 (Indo 4) ；
3- ( 1H-苯并咪唑 -2-亚甲基) -5- (2-甲基苯胺基磺基) -2-吲哚酮 (Indo 5 ) ；
3- ( 1H-苯并咪唑 -2-亚甲基) -5- (4-氯苯胺基磺基) -2-吲哚酮 (Indo 6) ；
3- ( 1H-苯并咪唑 -2-亚甲基) -5- (4-羟乙基苯胺基磺基) -2-吲哚酮 (Indo 7) ；
3- ( 1H-苯并咪唑 -2-亚甲基) -5- (4-甲苯胺基磺基) -2-吲哚酮 (Indo 8) ；
3- ( 1H-苯并咪唑 -2-亚甲基) -5- (4-乙氧基苯胺基磺基) -2-吲哚酮 (Indo 9) 。 本发明根据酪氨酸激酶抑制剂的构效关系， 设计一系列化合物， 并对合成的化 合物进行了酪氨酸激酶抑制活性评价， 确证这些化合物能够具有良好的酪氨酸激酶 抑制活性。
本发明的化合物能够有效抑制酪氨酸激酶活性的作用， 因而具有潜在的抗肿瘤 活性， 可用于抗肿瘤治疗。
上述化合物的几何异构体、 其药学上可接受的盐、 其水合物或溶剂化合物以及 可药用载体或赋形剂的药物组合物也属于本发明内容。 具体包括：
上述化合物的异构体或水合物， 如顺式 （syn) 或反式的化合物；
上述化合物的药用盐， 包括化合物的硫酸盐、 焦硫酸盐、 硫酸氢盐、 亚硫酸盐、 亚硫酸氢盐、 磷酸盐、 磷酸一氢盐、 磷酸二氢盐、 偏磷酸盐、 焦磷酸盐、 盐酸盐、 溴化物、 碘化物、 乙酸盐、 丙酸盐、 辛酸盐、 丙烯酸盐、 甲酸盐、 异丁酸盐、 更酸 盐、 癸酸盐、 丙炔酸盐、 草酸盐、 丙二酸盐、 丁二酸盐、 辛二酸盐、 癸二酸盐、 富 马酸盐、 马来酸盐、 2-丁炔- 1， 4-二酸盐、 3-环己炔 -2， 5 二酸盐、 苯甲酸盐、 氯 代苯甲酸盐、 苯乙酸盐、 苯丙酸盐、 苯丁酸盐、 柠檬酸盐、 乳酸盐、 马尿酸盐、 羟基丁酸盐、 乙醇酸盐、 马来酸盐、 酒石酸盐、 甲磺酸盐、 丙磺酸盐、 萘 -1-磺酸盐、 萘 2-磺酸盐、 扁桃酸盐、 谷氨酸盐、 精氨酸盐、 赖氨酸盐等。 就本发明化合物的医 药目的而言， 特别优选盐酸盐和磷酸盐。
本发明另一方面涉及具有通式 I的化合物的制备方法， 包括，
将式 Π化合物
与式 III化合物
Figure imgf000004_0001
在甲醇、 乙醇或异丙醇或其混合溶液中， 加入碱性或酸性催化剂后经回流得到， 其 中： 和!¾定义与前述相同。
在制备过程中， 所述碱性催化剂选自： 无机碱性化合物， 包括氢氧化钾、 氢氧 化钠、 氨气、 氧化钙及其水溶液等； 有机胺类化合物， 包括三乙胺、 哌啶、 二甲氨 基吡啶、 2, 4， 5-三甲基吡啶或吡啶等。 所述酸性催化剂选自： 无机酸类化合物， 包 括盐酸、 磷酸等； 有机酸类化合物， 包括对甲苯磺酸、 乙酸等。
以上有药物有效剂量的具有酪氨酸激酶抑制活性的物质中的一种或多种以及可 药用载体或赋形剂的药物组合物也属于本发明内容。 运用本领域技术人员熟知的药 物载体可以制成含有有效剂量的本发明化合物的药物组合物。
本发明另一方面涉及具有通式 I的化合物、 其几何异构体及其药学上可接受的 盐或所述的组合物在制备酪氨酸激酶抑制剂药物或抗肿瘤药物中的应用。
本发明还包括将所述化合物制成前体药物用于在哺乳动物优选人， 治疗、 预防、 抑制或减轻肿瘤及相关疾病的病症的应用。 该应用包括向需要治疗的哺乳动物提供 药物有效剂量的本发明药物和其药物组合物。
该应用适于诱导肿瘤细胞凋亡、 抗肿瘤新生血管形成、 防止肿瘤化疗耐药和阻 止肿瘤恶性转移。
所述的肿瘤为乳腺癌、 肺癌、 皮肤癌、 结肠癌、 前列腺癌、 胰腺癌、 肝癌、 胃 癌、 头颈部癌症、 神经胶质瘤、 神经母细胞瘤、 黑色素瘤、 肾癌或白血病。
所述酪氨酸激酶抑制剂药物为与 c-Met或 Trk信号通路相关的病症的治疗药物。 与 c-Met信号通路相关的病症包括但不限于肝癌、 乳腺癌、 肺癌、 前列腺癌、 胰腺癌、 结肠癌、 胃癌、 头颈部癌症或白血病等。
与 Trk信号通路相关的病症包括但不限于乳腺癌、 肺癌、 皮肤癌、 胃癌、 神经 胶质瘤、 神经母细胞瘤、 黑色素瘤、 肾癌或白血病。 本发明另一方面涉及 3- ( 1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- (2-甲基苯胺基磺基） -2- 吲哚酮 （Indo 5) 在制备所述酪氨酸激酶抑制剂或抗肿瘤药物中的应用， 所述肿瘤 包括但不仅限于乳腺癌、 肺癌、 结肠癌、 前列腺癌、 胰腺癌、 肝癌、 胃癌、 头颈部 癌症、 神经胶质瘤、 黑色素瘤、 肾癌及白血病等， 特别是与 c- Met或 Trk信号通路 相关的病症， 包括但不限于肝癌、 乳腺癌、 肺癌、 前列腺癌、 胰腺癌、 结肠癌、 胃 癌、 头颈部癌症或白血病等， 特别是肝癌、 肺癌或神经母细胞瘤。
本发明具有酪氨酸激酶抑制活性的物质可用注射、 口服方法或非肠胃道用药。 可以是片剂、 丸剂、 粉末混合物、 胶囊剂、 包衣剂、 溶液、 乳剂、 分散剂、 注射剂 和栓剂、 或其它适宜的形式。 这些制剂是按照本领域的技术人员所熟知的方法制备 的。 为了制造片剂、 胶囊剂、 包衣剂所用的辅料是常规用的助剂， 例如淀粉， 明胶， 阿拉伯胶， 硅石， 聚乙二醇， 液体剂型所用的溶剂例如水， 乙醇， 丙二醇， 植物油 类如玉米油， 花生油， 橄榄油等。 含有本发明化合物的制剂中还可有其它助剂， 例 如表面活性剂， 润滑剂， 崩解剂， 防腐剂， 矫味剂， 色素等。
与本发明化合物相关的药物在应用中， 为了达到所需生物学效果， 所需要的药 物有效剂量依赖于多种因素， 例如所选择的特定化合物、 预期用途、 给药的类型和 患者的临床状态等， 其药物有效剂量的确定可参照已有酪氨酸激酶抑制剂一抗肿瘤 药物吉非替尼 (Gifitinib, Iressa) 来确定， 例如 250mg/日。
本发明提供了一类具有酪氨酸激酶抑制活性的 2-吲哚酮衍生物、其几何异构体、 其药用盐以及这些化合物的制备方法及其应用。 通过酪氨酸激酶抑制活性评价， 确 证这些化合物具有良好的酪氨酸激酶抑制活性， 因而具有潜在的抗肿瘤活性， 可以 其为活性成分制备预防和治疗肿瘤疾病的药物 （抗肿瘤药物） ， 本发明将在抗肿瘤 的治疗中发挥重要作用， 应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图 1显示了不同剂量的化合物 Indo 5对 HepG2荷瘤小鼠中肿瘤的抑制结果； 图 2显示了不同剂量的化合物 Indo 5对 MHCC97-L荷瘤小鼠中肿瘤的抑制结果； 图 3显示了不同剂量的化合物 Indo 5对 MHCC97-H荷瘤小鼠中肿瘤的抑制结果； 图 4显示了不同剂量的化合物 Indo 5对 NCI-H460荷瘤小鼠中肿瘤的抑制结果； 图 5为用肝原位接种肿瘤模型检测本发明 2-吲哚酮衍生物 （Indo 5) 的体内抗 肿瘤活性
图 6A为 2-吲哚酮衍生物 Indo 5抑制肝癌细胞 HepG2中 HGF诱导的 c-Met磷酸 化及信号通路的检测结果 图 6B为 2-吲哚酮衍生物 indo 5抑制肝癌细胞 MHCC97-H中 c-Afet磷酸化及信号 通路的检测结果
图 Ί为 2-吲哚酮衍生物 Indo 5抑制 SK- N- SH细胞内 NGF诱导的 TrkA磷酸化及 信号通路的检测结果
图 8 本 2-吲哚酮衍生物 Indo 5抑制 SK- N- SH细胞内 BDNF诱导的 TrkB磷酸化 及信号通路的检测结果
图 9为腹腔注射及灌胃给药检测 2-吲哚酮衍生物 Indo 5对 SK-N- SH荷瘤小鼠中 肿瘤的抑制作用
具体实施方式
所述百分比浓度如无特别说明均为质量 /体积 (W/V)百分比浓度或体积 /体积 (V/V)百分比浓度。
实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以 达到具体公开的目的， 不应成为对本发明生物材料来源的限制。 事实上， 所用到的 生物材料的来源是广泛的， 任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以 按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施， 给出了详细的实施方式和具体 的操作过程， 实施例将有助于理解本发明， 但是本发明的保护范围不限于下述的实 施例。
实施例 1、 3- (1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- ( 萘胺基磺基） -2-吲哚酮（Indo 1) 将 0.17g (0.5画 ol) 5- ( B-萘胺基磺基） -2-吲哚酮和 0.10g (0.685醒 ol) 1H- 苯并咪唑 -2-甲醛混悬于 6mL无水乙醇中，加入 2滴哌啶， 于油浴中加热回流 30min， 有大量黄色固体析出， 过滤， 无水乙醇洗涤得到 0.18g淡黄色固体， 产率 77.3%。
其核磁共振谱的分析结果为: Ή-NMR (DMS0-d6) δ (ppm) ： 613.81 (s， 1H) ， 11.68 (s， 1H) ， 10.51 (s， 1H) ， 8.48 (s, 1H) , 8.13 (s， 1H) ， 7.58-7.82 (m， 6H) ， 7.64 (s， 1H， J=8.4Hz) ， 7.29-7.46 (m, 5H) ， 7.05 (d， 1H, J=8.4Hz) 。 ESI- MS m/z: 465[M-H]+ (100) 。 经分析， 该淡黄色固体为 3- (1H-苯并咪唑- 2-亚 甲基） -5- (β-萘胺基磺基） -2-吲哚酮， 其结构式如式 I所示， 其中， ^为 萘 胺基磺基， R2为氢。
实施例 2、 3- (1H-苯并咪唑- 2-亚甲基 )-5 (3-氯 -4-氟苯胺基磺基 )-2-吲哚酮（Indo 2)
将 0.17g ( 0.5mraol ) 5- ( 3-氯- 4-氟苯胺基磺基） -2-吲哚酮和 0.10g ( 0.685mmol ) 1Η-苯并咪唑- 2-甲醛混悬于 6raL无水乙醇中， 加入 2滴哌啶， 于油浴中加热回流 30min,有大量黄色固体析出，过滤，无水乙醇洗涤得到 0.15g淡黄色固体，产率 64.1
%。
其核磁共振谱的分析结果为： Ή-NMR (DMS0-d6) δ (ppm) ： δ 13.82 (s, 1H) ， 11.74 (s， 1H) ， 10.45 (s， 1H) ， 8.38 (s， 1H) ， 8.14 (s, 1H) ， 7.78-7.84 (q, 2H) ， 7.69 (d， 1H) ， 7.26-7.38 (m， 4H) ， 7.17—7.15 (m， 1H) , 7.09 (d， 1H,
J二 8.4Hz) 。 ESI MS m/z: 467[M- H]+ (100) 。 经分析， 该淡黄色固体为 3- (1H -苯 并咪唑 -2-亚甲基） -5- (3-氯 -4-氟苯胺基磺基） -2-吲哚酮， 其结构式如式 I所示， 其中， 为 3 -氯- 4 -氟苯胺基磺基， R2为氢。
实施例 3、 3-(1Η-苯并咪唑 -2-亚甲基 )-5-(N-甲基苯胺基磺基) -2-吲哚酮（Indo3) 将 0.15g (0.5画1) 5- (N -甲基苯胺基磺基) -2-吲哚酮和 0, 10g (0.685醒 ol) 1H 苯并咪唑- 2-甲醛混悬于 6mL无水乙醇中， 加入 2滴哌啶， 于油浴中加热回流 30min,有大量黄色固体析出，过滤，无水乙醇洗涤得到 0.14g淡黄色固体，产率 65.1
%。
其核磁共振谱的分析结果为： Ή-NMR (DMS0-d6) δ (ppm) ： δ 13.83 (s， 1H) , 11.73 (s， 1H) ， 8.24 (s， 1H) ， 8.20 (s， 1H) ， 7.81 (b， 2H) ， 7.27-7.37 (m, 6H) ， 7.17 (s， 1H) ， 7.15 (s， 1H) ， 7.05 (d， 1H， J=8.4Hz) ， 3.21 (s， 3H) 。 ESI- MS m/z: 429[M-H]+ (100) 。 经分析， 该淡黄色固体为 3- (1H-苯并咪唑- 2 -亚 甲基） -5- (N-甲基苯胺基磺基） -2-吲哚酮， 其结构式如式 I所示， 其中， ！^为^ 甲基苯胺基磺基， R2为氢。
实施例 4、 3- (1H-苯并咪唑- 2-亚甲基） -5- (环己胺基磺基） -2-吲哚酮（Indo4) 将 0.15g (0.5画 1) 5- (环己胺基磺基) - 2-吲哚酮和 0.10g (0,685醒 ol) 1H- 苯并咪唑- 2-甲醛混悬于 6mL无水乙醇中，加入 2滴哌啶，于油浴中加热回流 30min, 有大量黄色固体析出， 过滤， 无水乙醇洗涤得到 0.17g淡黄色固体， 产率 80.6%。
其核磁共振谱的分析结果为： - NMR (DMS0- d6) δ (ppm) ： δ 13.86 (s， 1H) ， 11.68 (s， 1H) ， 8.35 (s， 1H) ， 8.08 (s， 1H) ， 7.76—7.84 (m， 3H) ， 7.48 (d， 1H, J=7.2Hz) ， 7.66 (d， 1H, J-6. Hz) ， 7.38 (t， 1H) ， 7.31 (t， 1H) ， 7.10 (d, 1H, J=8.0Hz ) ， 3.02 (b， 1H) ， 1.60 (b， 5H) ， 1.50 (b， 5H) 。 ESI- MS m/z: 421[M-H]+ (100) 。 经分析， 该淡黄色固体为 3- ( 1H-苯并咪唑- 2-亚甲基） -5- (环 己胺基磺基） -2-吲哚酮， 其结构式如式 I所示， 其中， 为环己胺基磺基， R2为氢。 实施例 5、 3- (1H-苯并咪唑- 2-亚甲基 )-5- (2-甲基苯胺基磺基） -2-吲哚酮（Indo 5) 将 0.15g (0.5聽 1) 5- (2 甲基苯胺基磺基) -2-吲哚酮和 0.10g (0.685垂 1) 1H-苯并咪唑- 2 甲醛混悬于 6mL无水乙醇中， 加入 2滴哌啶， 于油浴中加热回流 30rain,有大量黄色固体析出，过滤，无水乙醇洗涤得到 0.12g淡黄色固体，产率 55.8
%。
其核磁共振谱的分析结果为： Ή-NMR (DMS0- d6) δ (ppm) ： δ 13.82 (s， 1H) ， 11.70 (s， 1H) ， 9.44 (s， 1H) ， 8.20 (s, 1H) ， 8.00 (s， 1H) ， 7.82 (d, 1H, J 8.0Hz) ， 7.78 (d， 1H， J=8.0Hz) ， 7.61 (dd, 1H, J=16.8Hz) ， 7.38 (t, 1H) ， 7.30 (t, 1H)， 7.00-7.15 (m， 5H)， 2.09 (s, 3H)。 ESI- MSm/z: 429[M-H]+ ( 100)。 经分析， 该淡黄色固体为 3- (1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5 -（2-甲基苯胺基磺基） -2- 吲哚酮， 其结构式如式 I所示， 其中， 为 2-甲基苯胺基磺基， R2为氢。
实施例 6、 3- (1H-苯并咪唑- 2-亚甲基） -5- (4-氯苯胺基磺基） -2-吲哚酮（Indo6) 将 0.16g (0.5腿 ol) 5- (4 -氯苯胺基磺基) - 2 -吲哚酮和 0.10g (0.685墮 ol) 1H-苯并咪唑- 2-甲醛混悬于 6mL无水乙醇中， 加入 2滴哌啶， 于油浴中加热回流 30min,有大量黄色固体析出，过滤，无水乙醇洗涤得到 0.18g淡黄色固体，产率 80.0 %。
其核磁共振谱的分析结果为： -NMR (DMS0- d6) δ (ppm) ： δ 13.81 (s， 1Η) ， 11.70 (s， 1H) ， 10.36 (s， 1H) ， 8.36 (s， 1H) ， 8.10 (s， 1H) ， 7.80 (b， 2H) ， 7.70 (dd, 1H, J=16.4Hz) ， 7.38 (b， 2H) ， 7.30 (d， 2H， J二 13.6Hz) ， 7, 17 (d， 2H， J=ll.6Hz) ， 7.08 (d， 1H， J=8.4Hz) 。 ESI - MSm/z: 449[M- ΗΓ (100) 。 经分 析， 该淡黄色固体为 3- (1H-苯并咪唑- 2-亚甲基） -5- (4-氯苯胺基磺基） -2-吲哚 酮， 其结构式如式 I所示， 其中， 1^为4-氯苯胺基磺基， R2为氢。
实施例 7、 3- (1H-苯并咪唑- 2-亚甲基) -5- (4-羟乙基苯胺基磺基) - 2-吲哚酮（ Indo 7 ) 将 0.16g (0.5動 1) 5- (4-羟乙基苯胺基磺基） -2-吲哚酮和 0.10g (0.69删 ol) 1H -苯并咪唑 -2-甲醛混悬于 6mL无水乙醇中， 加入 2滴哌啶， 于油浴中加热回流 30rain,有大量黄色固体析出，过滤，无水乙醇洗涤得到 0.16g淡黄色固体，产率 69.6 %。
其核磁共振谱的分析结果为： 'H-NMR (DMSO- d6) δ (ppm) ： δ 13.83 (s， 1H) ， 11.71 (s, 1H) , 10.12 (s, 1H) ， 8.33 (s， 1H) , 8.06 (s, 1H) , 7.81 (b, 2H) , 7.70 (dd, 1H， J=16.4Hz) ， 7.34 (d, 2H) , 7.06-7.08 (m, 5H) ， 4.60 (s, 1H) ，
4.49 (d， 2H) ， 2.59 (t, 3H) 。 ESI- MSm/z: 459[M- H]+ (100) 。 经分析， 该淡黄 色固体为 3- (1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- (4-羟乙基苯胺基磺基） -2-吲哚酮， 其 结构式如式 I所示， 其中， ！^为 4-羟乙基苯胺基磺基， R2为氢。
实施例 8、 3- (1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- (4-甲苯胺基磺基） -2-吲哚酮（Indo 8) 将 0.15g (0.5腿 ol) 5- (4-甲苯胺基磺基) - 2 -吲哚酮和 0.10g (0.685瞧 ol) 1H -苯并咪唑 -2-甲醛混悬于 6mL无水乙醇中， 加入 2滴哌啶， 于油浴中加热回流 30min,有大量黄色固体析出，过滤，无水乙醇洗涤得到 0.18g淡黄色固体，产率 83.7
%。
其核磁共振谱的分析结果为: Ή-NMR (DMS0-d6) δ (ppm) ： δ 13.82 (s， 1H) ， 11.70 (s， 1H) ， 10.06 (s， 1H) ， 8.32 (s， 1H) ， 8.06 (s， 1H) , 7.83 (d， 1H， J=8.0Hz) ， 7.79 (d， 1H， J=8.4Hz) , 7.67 (dd， 1H， J=16.8Hz) ， 7.38 (t， 1H) ， 7.31 (t， 1H) ， 7.30 (d， 2H， J=13.6Hz) ， 7.06 (d, 2H, J=8.4Hz) ， 7.03 (s， 4H) ， 2.17 (s， 3H) 。 ESI - MS m/z: 429[M- H]+ (100) 。 经分析， 该淡黄色固体为 3 （1H-苯并咪唑- 2-亚甲基） -5- (4 -甲苯胺基磺基） -2-吲哚酮， 其结构式如式 I 所示， 其中， 为 4 -甲苯胺基磺基， R2为氢。
实施例 9、3- (1H-苯并咪唑- 2-亚甲基) -5- (4-乙氧基苯胺基磺基) -2-吲哚酮 ( Indo 9) 将 0.16g(0.5mmol) 5- (4-乙氧基苯胺基磺基） -2-吲哚酮和 0.10g(0.685謹 ol) 1H-苯并咪唑 -2-甲醛混悬于 6mL无水乙醇中， 加入 2滴哌啶， 于油浴中加热回流 30rain,有大量黄色固体析出，过滤，无水乙醇洗涤得到 0.13g淡黄色固体，产率 58.3
%。
其核磁共振谱的分析结果为： Ή-NMR (DMSO- d6) δ (ppm) ： δ 13.82 (s， 1H) ， 11.71 (s， 1H) ， 9.83 (s， 1H) ， 8.24 (s， 1H) ， 8.02 (s， 1H) ， 7.83 (d， 1H， J=8.0Hz) ， 7.79 (d， 1H, J=8.0Hz) ， 7.62 (dd, 1H， J=16.4Hz) ， 7.38 (t, 1H) ， 7.31 (t， 1H) , 7.05 (d， 1H， J=8.4Hz) ， 7.01 (d, 2H, J=9.2Hz) ， 7.05 (d, 2H, J=8.8Hz) ， 3.90 (q， 2H) ， 1.24 (t, 3H) 。 ESI- MS m/z) ： 459[M- H]+ (100) 。 经分析， 该淡黄色固体为 3- (1H-苯并咪唑- 2-亚甲基） -5- (4-乙氧基苯胺基磺基） 2 H引哚酮， 其结构式如式 I所示， 其中， ！^为 4-乙氧基苯胺基磺基， R2为氢。
实验例 1、 2-吲哚酮衍生物的酪氨酸激酶抑制活性
所用材料：
酪氨酸激酶缓冲液： 10mL 1M HEPES (pH7.5) ， 0.4mL5% BSA/PBS, 0.2mL 0.1M Na:iV04， lmL 5M NaCl力口入 88.4mL双蒸水中； （HEPES: Amresco公司； N V04： Sigma 公司）。
ATP: 三磷酸腺苷， Amresco公司。
组织提取物 PTK的提取： 快速取出小鼠脑组织， 称重， 加入 5倍体积预冷匀浆 缓冲液， 匀浆。 4° ( 、 1000g离心 10min， 除去细胞核及细胞碎片。收集上清 Sl， 4°C、 10000g离心 20rain， 收集上清 S2。 保留沉淀 P2， 代表粗膜蛋白部分。 S2包含细胞浆 蛋白， 用于检测 PTK (酪氨酸蛋白激酶） 活性。 如果检测膜蛋白部分， 取 P2， 加 2 倍体积裂解缓冲液， 冰上放置 10min。 4°C、 lOOOOg离心 10min。 收集上清液部分 S3 代表粗膜蛋白， 其中包含可溶性膜蛋白， 用于检测 PTK活性。 用 BCA蛋白浓度试剂 盒 （购自碧云天生物技术研究所） 检测细胞浆或膜蛋白的蛋白含量。 组织提取物在
-70°C保存。
96孔板包被： 溶解 PTK底物。 加 100 μΐ底物到各孔， 盖上盖子， 4°C孵育过夜 (10-12小时） 。 用 200 μΐ洗脱缓冲液洗涤 1次。 37°C干燥 2h， 再以 lOraM PBS洗 涤一次， 室温干燥后存放于 4°C备用。
实验分组： 空白对照： 80μ1含 ATP的 IX酪氨酸激酶缓冲液 +20μ1 IX酪氨酸 激酶缓冲液； 阴性对照： 80μ1含 ΑΤΡ的 IX酪氨酸激酶缓冲液 +10μ1 IX酪氨酸激 酶缓冲液 +7 μΐ组织提取物 +3 H i IX酪氨酸激酶缓冲液； 阳性对照： 80μ1含 ATP 的 1 X酪氨酸激酶缓冲液 +10 μ 1吉非替尼 +7 μ 1组织提取物 +3 μ 1 1 X酪氨酸激酶缓 冲液（先在室温下让阳性药与酪氨酸激酶组织提取液作用 lOmin, 同时阴性对照组的 组织提取物也在室温下放置 10min， 再分别加入 80μ 1含 ATP的 IX酪氨酸激酶缓冲 液） ； 溶媒对照： 80μl含ATP的 lX酪氨酸激酶缓冲液+10μlDMSO+7μl组织提取 物 +3 μ 11 X酪氨酸激酶缓冲液； 待筛药物： 80μ1含 ΑΤΡ的 IX酪氨酸激酶缓冲液 + 10 μ 1受试药物 +7 μ 1组织提取物 +3 μ 1 IX酪氨酸激酶缓冲液。
ΡΤΚ活性测定： 准备 IX酪氨酸激酶缓冲液： 取 lmL (10X) 酪氨酸激酶缓冲液 加 9mL双蒸水， 混匀。 组织提取物用 IX酪氨酸激酶缓冲液适当稀释， 轻轻混匀， 放 置于冰上。 溶解 ATP存储液， 48μ1加 lmL IX酪氨酸激酶缓冲液， 混匀， 放置于冰 上。 按上述实验分组配制各孔加入酶标板后， 盖上盖， 室温孵育 30min。 200μ1洗 脱缓冲液洗涤， 拍干， 重复 5次。 各孔加 ΙΟΟμΙ抗体稀释液 （抗体用洗脱缓冲液按 1： 2000比例稀释） 。 盖上盖， 室温孵育 30min。 配 0PD溶液， 4.86mL 0. lmol/L柠 檬酸液加 5.14mL 0.2mol/L 21^04液中溶解 4mg 0PD, 加 50μ1 30% 02， 使其完 全溶解， 避光。 除去抗体液。 200 μΐ洗脱缓冲液洗涤， 拍干， 重复 5次。 加 ΙΟΟμΙ 现配的 0PD， 室温下避光准确反应 7min， 阳性孔呈橘黄色。加入 100 μ 12.5N¾S04终 止反应。 492nm测 0D值。
样品筛选： 初筛样品， 测定样品对蛋白质酪氨酸激酶活性的影响， 计算抑制率； 抑制率 （％) = (阴性对照 0D值-样品 0D值） / (阴性对照 0D值' -空白 0D值） X100%; *在求阳性药物抑制率时，式中的阴性对照 0D值改为溶媒对照 0D值，以扣除 DMS0对 PTK 活性的影响。
实验结果： 参见表 1。 表 1列出药物组 （对应实施例得到的化合物编号） 和阳性 药物组 （吉非替尼） 的实验结果。 表 1 本发明化合物对酪氨酸激酶的抑制率
Figure imgf000011_0001
表 1数据显示： 阳性药物吉非替尼在 400 μ Μ浓度下对酪氨酸激酶具有明显的抑制 作用， 抑制率为 40. 2 % ; 而本发明实施例中化合物在相同浓度下对酪氨酸激酶的抑 制作用均较强， 抑制率均在 45 %以上， 与阳性对照药物相当或更优， 说明这些化合 物对于高表达的酪氨酸激酶的肿瘤具有潜在的防治作用。
实验例 2、 检测本发明 2-吲哚酮衍生物的体外抗肿瘤活性
实验方法： 将 14种细胞系 （ΜΚΝ- 45细胞、 MHCC97-L细胞、 MHCC97-H细胞、 HLE 细胞、 HepG2细胞、 7721细胞、 L02细胞、 A375细胞、 H460细胞、 A549细胞、 SK-N-SH 细胞、 MCF-7细胞、 K562细胞、 Ba/F3- Tpr- Met细胞（为 c- Met组成型活化突变体 Tpr Met恶性转化的前 B细胞） 分别以 1 X 107孔接种 96孔板， 每孔加入 150μ1 含 10%胎牛血清 （购自 Hyclone公司） 的 DMEM培养基 （购自 Invitrogen公司） ， 待细 胞贴壁后， 除阴性对照 （为溶剂对照组） 和空白対照 （为培养基组） 外， 分别加入 不同浓度 （浓度 0. 1〜10μΜ) 的 2-吲哚酮衍生物， 37。C、 5 %的 C02的条件下培养 72 小时后， 加入 MTS试剂 （Promega公司） ， 继续培养 2-4 h后， 酶标仪检测 450nm 波长 0D值， 利用 SPSS软件计算 IC50值 （化合物对细胞增殖抑制率达到 50%时的浓 度） 。
实验结果如表 2 ( IC50 041)表示化合物对细胞增殖抑制率达到 50%时的浓度） 所示， 化合物除对正常肝细胞 L02无明显影响外， 对其它肿瘤细胞均有明显的抑制 作用， 表明本发明的 2-吲哚酮衍生物在体外具有明显抗肿瘤活性， 且对正常肝细胞 没有不良影响。
本发明 2-吲哚酮衍生物的体外抗肿瘤活性检测结果
Figure imgf000011_0002
H460 肺癌 1.54 1.78 1.05 0.78 1.067
HLE 肝癌 6.31 6.792 4.72 3.58 5.228
HepG2 肝癌 6.47 6.982 4.79 3.69 5.665
A375 皮肤 3.18 2.476 1.47 0.97 1.873
MCF-7 乳腺癌 1.72 1.953 0.96 1.46 1.281
A549 肺癌 2.89 3.156 1.54 2.32 2.193 神经母 1.35 1.793 0.85 0.54
SK-N-SH 1.187 细胞瘤
K562 白血病 3.02 3.267 2.07 1.34 2.583
L02 肝实质 24.77 23.69 22.19 26.77 20.88
Ba/F3- Tpr-Met 前 B细胞 5.31 5.93 3.87 2.54 4.791
IC50 (MM)
细胞系 组织来源
Indo 6 Indo 7 Indo 8 Indo9
MKN-45 冃¾3 1.38 1.13 2.02 1.72
MHCC97-L 肝癌 1.06 0.97 1.68 1.31
MHCC97-H 肝癌 0.91 0.69 1.53 1.17
H460 肺癌 0.94 0.92 1.63 1.25
HLE 肝癌 4.87 4.36 6.58 5.91
HepG2 肝癌 5.18 4.25 6.74 5.98
A375 皮肤 1.65 1.22 2.35 2.12
MCF-7 乳腺癌 1.12 0.83 1.81 1.35
A549 肺癌 1.99 1.28 3.02 2.52
神经母 1.06 0.67 1.57 1.22
SK-N-SH
细胞瘤
K562 白血病 2.21 1.67 3.11 2.64
L02 肝实质 22.65 25.69 25.33 23.22
Ba/F3 - Tpr- Met 前 B细胞 4.21 3.11 5.68 4.91 实验例 3、 用皮下接种裸鼠模型检测 2-吲哚酮衍生物（Indo 5) 的体内抗肿瘤 活性
实验方法： 为在整体水平评价本发明 2-吲哚酮衍生物的体内抗肿瘤活性， 建立 了多种裸鼠荷瘤模型，包括 HepG2细胞、 MHCC97- L、 MHCC97-H细胞和 NCI- H460细胞， 并观察腹腔注射 2-吲哚酮衍生物 （以 Indo 5为例） 对裸鼠荷瘤生长的影响。
荷瘤模型的建立： 肿瘤细胞在 T75培养瓶中培养， 使细胞状态达到对数生长期， 胰酶消化细胞， 并用含 10%胎牛血清的 DMEM培养基终止消化， PBS清洗细胞 2次， 并悬浮细胞， 调整细胞浓度为 5xl07， 取 150μ1注射小鼠右前背部。 接种后每天观察 裸鼠荷瘤情况， 当体积达到 lOOrnm3时进行分组。 对每只裸鼠编号并测量瘤体大小， 将所得数据输入 EXCEL中排序， 剔除极端值。 生成和小鼠数目相同的随机数， 利用 随机数进行随机区组的设计。
给药方式： 腹腔注射， 注射剂量分别为 4mg/kg、 8mg/kg、 16mg/kg, 溶剂对照组 ( control )注射相同体积的 DMSO; 24h给药一次， 共给药 6次， 在给药过程中实时 监测并记录肿瘤体积 （长 X宽 X宽 /2) 的变化情况， 结果用均数士标准差表示。 2 周后处死小鼠， 取出瘤体称重， 并最终计算化合物对肿瘤的抑制率。
实验结果：图 1显示了不同剂量的化合物 Indo 5对 HepG2荷瘤小鼠中肿瘤的抑 制结果； A为肿瘤体积变化曲线， B为抑制率。
图 2显示了不同剂量的化合物 Indo 5对 MHCC97-L荷瘤小鼠中肿瘤的抑制结果； A为肿瘤体积变化曲线， B为抑制率。
图 3显示了不同剂量的化合物 Indo 5对 MHCC97- H荷瘤小鼠中肿瘤的抑制结果； A为肿瘤体积变化曲线， B为抑制率。
图 4显示了不同剂量的化合物 Indo 5对 NCI-H460荷瘤小鼠中肿瘤的抑制结果。 A为肿瘤体积变化曲线， B为抑制率。
利用测得数据按下列公式计算肿瘤抑制率：
肿瘤抑制率 = (对照组平均重量-给药组平均重量） /对照组平均重量 X 100% 计算结果显示， 化合物 Indo 5腹腔给药能以剂量依赖方式抑制肿瘤细胞生长， 最大剂量 （16mg/kg) 化合物 Indo 5对 HepG2细胞、 MHCC97- L/H细胞、 NCI- H460细 胞体内增殖的抑制率分别为： 61 %、 68% , 61 %和 59%， 表明化合物 Indo 5对多种 肿瘤细胞皮下接种裸鼠模型具有明显的抑瘤效果。
实验例 4、 用肝原位接种肿瘤模型检测本发明 2-吲哚酮衍生物（以 Indo 5为 例） 的体内抗肿瘤活性
实验动物模型的建立： 将 MHCC- 97H细胞培养于含 10%胎牛血清的 1640细胞培 养液中 （补充青霉素、 链霉素各 ΙΟΟμΙ/mL) ， 置于 37'C含 5% C02的细胞培养箱中， 每 1-2天换液一次。 用 0. 25%胰酶消化传代， lOOOr/min离心 5分钟后， 弃上清液， 加入新鲜培养基传代培养。 将传代培养的肿瘤细胞， 在无菌条件下将细胞消化成悬 液， 以氯化钠注射液冲洗后重悬成悬液， 给予裸鼠右前肢腋部皮下接种保种。 传代 接种裸鼠皮下肿瘤生长至体积约为 1500- 2000mm3时， 无菌条件下取出瘤块， 将瘤块 切成约 1. 0 X 1. Oram大小的瘤块备用。 将要手术接种的裸鼠麻醉后， 将裸鼠固定在手 术台上， 消毒腹部皮肤， 在左中上腹部剪开约 lcm切口， 暴露肝脏， 手术洞巾覆盖。 将准备好的瘤块放入专用接种套管针内， 用套管针将瘤块植入肝脏内， 创口出血部 位用消毒纱布或消毒好的棉棒进行止血处理。然后将手术后的肝脏放回小鼠腹腔内， 用 4/0号手术缝合针依次缝合腹肌和皮肤。 正常喂养 2周后利用 B超观察肝脏肿瘤 大小， 瘤体达约 100mm3即表示原位接种模型成功。
实验方法： 将动物模型随机分配， 设溶剂对照组、 腹腔给药低剂量 （18mg/kg) 组、 腹腔给药高剂量 （36mg/kg) 组、 灌胃给药 （36mg/kg) 组， 每组 9只。 每 24小 时给药 1次， 腹腔给药为腹腔注射给药， 溶剂对照组为腹腔注射 DMS0, 给药周期六 次， 最后一次给药后继续词养 3周， 颈部脱臼处死动物， 解剖取肝脏， 并剥离肉眼 可见肿瘤称重。
实验结果如图 5和表 3所示， 图 5显示的是每组 9只实验动物处死后剥离的瘤 体照片 （按照瘤体大小进行排列， 从 1-9编号） ， 其中腹腔注射高剂量组有一只实 验动物（9号）实验结束后肝癌消失。可以看出， 本发明的 2-吲哚酮衍生物（Indo 5) 能够明显抑制肝癌细胞系在肝原位的成瘤能力， 并具有剂量依赖效应。 同时， 灌胃 与腹腔注射组抑瘤效果相当， 表明本发明化合物口服具有抗肿瘤效果， 具有开发为 口服抗肿瘤药物的潜力。
表 3 2-吲哚酮衍生物 （Indo 5) 对接种人肝癌细胞的裸鼠原位肿瘤模型
生长抑制作用的检测结果
Figure imgf000014_0001
实验例 5、 检测本发明 2-吲哚酮衍生物抑制肺癌细胞 A549的肺原位成瘤能力 检测本发明 2-吲哚酮衍生物 （以 Indo 5为例） 抑制肺癌细胞 A549的肺原位成 瘤能力。
动物模型的建立： 人肺癌细胞株 A549培养于含 10%胎牛血清的 1640细胞培养 液中 （补充青霉素、 链霉素各 ΙΟΟμΙ/mL) ， 置于 37°C含 5% C02的细胞培养箱中， 每 1-2天换液一次。 用 0. 25%胰酶消化传代， lOOOr/min离心 5分钟后， 弃上清液， 加入新鲜培养基传代培养。 将传代培养的肿瘤细胞， 在无菌条件下将细胞消化成悬 液，原位注射到 BALB/c裸鼠第三与第四肋骨间的左胸壁内（3. OxlOVmouse, 30μ1 )， 接种针的深度约为进入肺叶 5mm， 接种第一天作为 D0。 7天后对动物进行称重， 并根 据体重进行随机分组。 此时胸部 X光透射显示小鼠肺脏中形成肿瘤， 动物模型建成。
实验方法： 将动物模型随机分配， 设溶剂对照组 （腹腔注射 DMS0) 、 腹腔注射 低剂量 （18mg/kg) 组、 腹腔注射高剂量 （36mg/kg) 组共三组， 24小时给药 1次， 连续给药 6次后， 继续饲养动物， 并在 30天后结束实验， 处死小鼠， 解剖取肺脏， 分离肿瘤， 称重。
实验结果如表 4所示， 可以看出， 本发明的 2-吲哚酮衍生物 （Indo 5) 能够明 显抑制肺癌细胞系 A549在肺脏原位的成瘤能力， 并具有剂量依赖效应。
本发明 2-吲哚酮衍生物 （Indo 5) 抑制肺癌细胞 A549的肺原位成瘤能力
Figure imgf000015_0001
实验例 6、 检测本发明 2-吲哚酮衍生物（Indo 5)特异抑制 c-Met及 Trk激酶 的活性
选取包括 c-Met及 TrkA/B激酶在内的 15种受体酪氨酸激酶分别检测本发明 2- 吲哚酮衍生物 （以 Indo 5为例） 对它们体外磷酸化的影响， 实验方法如下：
1 ) 用 ELLASA法及 Met激酶检测试剂盒 （购自 Cell Signaling公司） 对 Indo 5体 外抑制 c- Met激酶的活性进行检测： 加入 1010 ΐ 10 mM ATP 到 1. 25ml 6 μ M 的底 物肽段， 并加入水稀释到 2. 5ml， 制备 2X ATP/底物混合物 （[ΑΤΡ]=40 μ M,
[substrate]=3 μ πι)的混合物。 从 - 80° C中取出酶迅速放置到冰上， 并在冰上冻 融。 在 4° C离心使液体集中在管的底部， 并迅速放回到冰上。 加入 10 l DTT ( 1. 25 Μ)到 4xHTScan酪氨酸激酶溶液 （（240 mM HEPES pH 7. 5, 20 mM MgCI2, 20 mM MnCI2, 12 μ M Na3V04) , 制备成 DTT/激酶溶液。 将 1. 2ml DTT/激酶溶液加入到每种激酶的 管中， 制备成 4x反应混合物 （[enzyme] = 4 ng/ μ L in 4X reaction cocktail) .将 12. 5 4 1的4 反应混合物与12. 5 μ ΐ预溶解的 Indo 5 (不同剂量） 在室温孵育 5分钟， 后加入 25 μ 1 2χ ΑΤΡ/底物， 混匀， 室温再孵育 30分钟。 加入 50 μ 1终止缓冲液（50 mM EDTA, pH 8)终止反应。 取 25 μΐ的上述反应物及 75 μΐ水加入到链霉亲和素偶联的 96 孔板中， 并在室温孵育 60分钟。 200 lPBS清洗板子 3次。 以 1: 1000稀释 P- Tyr-100 抗体， 并加入到 96孔板中， 室温孵育 60分钟。 200μ1 PBS清洗板子 3次。 稀释辣根过 氧化物酶标记的二抗， 取 100 μΐ加入到 96孔板中， 室温孵育 30分钟。 200μ1 PBS/T 清洗 3次， 加入 100 μΙΤΜΒ底物在室温孵育 15分钟后， 再加入 100 μ 1终止溶液， 混匀， 利用分光光度计在 450nm读取吸光值。 并利用 SPSS软件计算 IC50值（指化合物对激酶 活性抑制率达到 50%时的浓度） 。
2) 其它 14种受体酪氨酸激酶体外活性利用 Progmag公司的 Kinase Glo Plus assay format迸行检测， 根据抑制率计算对激酶活性的 IC5。值。
实验结果如表 5所示， 本发明的 2-吲哚酮衍生物 （Indo 5) 抑制 c-Met激酶的 IC5。值为 0.16μΜ,抑制 TrkA激酶的 IC50为 0.022μΜ，抑制 TrkB激酶的 IC50为 0.23μ , 而抑制其它激酶的 IC50均大于 10μΜ。以上结果说明本发明的 2-吲哚酮衍生物 (Indo 5)在体外对 c-Met激酶和 Trk激酶（包括 TrkA、 TrkB)活性有显著的抑制作用， 并 且具备良好的选择性。 该实验结果表明本发明的 2-吲哚酮衍生物 （Indo 5) 可特异 抑制 Met及 Trk激酶活性， 对其它激酶无明显作用。
表 5 本发明 2-吲哚酮衍生物 （Indo 5) 特异抑制 c- Met及
Trk激酶的活性检测结果
Figure imgf000016_0001
实验例 7、 2-吲哚酮衍生物 （Indo 5)抑制肝癌细胞中 c- Met磷酸化及信号通 路实验
已有文献表明， HGF介导的 c-Met信号通路化合物在肿瘤发生发展中发挥重要作 用。 c-Met激酶是肝细胞生长因子 HGF的高亲和力受体， 在组织损伤修复、 伤口愈 合、 肝再生及胚胎发育过程中行使重要功能。 研究表明 c-Met的异常表达可直接导 致肿瘤发生。 c-Met通过与 HGF结合后， 激活下游信号通路， 破坏肿瘤细胞间的黏 附，促进细胞运动，进而增强肿瘤细胞的侵袭能力及血管生成。临床肿瘤病人中 c-Met 的异常表达与肿瘤病人的预后差、 疾病进程快、 高转移及生存期短密切相关。 c-Met 已成为国际上公认的肿瘤治疗靶标。 本发明采用了两种肝癌细胞系检测了化合物对 c-Met信号通路的影响。 HepG2细胞高表达 c-Met，可在 HGF刺激下发生 e-Met磷酸 化及其下游信号通路包括 ERK、 Akt等的活化。 MHCC97-H细胞是自分泌 HGF的肝 癌细胞系， 因此， 在正常培养条件下该细胞具有较高的持续的 c-Met磷酸化水平。
用两种肝癌细胞系 HepG2和 MHCC97-H检测本发明 2-吲哚酮衍生物 （以 Indo 5 为例） 对 HGF诱导的 c-Met磷酸化及信号通路的抑制效果。
细胞培养： 高表达 c-Met的肝癌细胞系 HepG2或 c- Met持续活化的肝癌细胞系 MHCC97- H培养于含 10%胎牛血清的 1640细胞培养液中 （补充青霉素、 链霉素各 ΙΟΟμΙ/mL) ， 置于 37°C含 5% C02的细胞培养箱中， 每 1-2天换液一次。 0. 25%胰 酶消化传代， lOOOr/min离心 5分钟后， 弃上清液， 加入新鲜培养基传代培养。
Western blot检测：
(A)针对 HepG2细胞：无血清培养 24小时的 HePG2细胞加入不同浓度（0. ΙμΜ, 0. 5μ , Ι. ΟμΜ, 2. ΟμΜ) 的 Indo 5或溶剂 DMS0 (0) 预孵育 2h， 而后加入 20ng/mL 的 HGF (不加的记为 "-"）刺激 5min， 细胞裂解后提取总蛋白。用 c- Met磷酸化和非 磷酸化抗体、 ERK磷酸化和非磷酸化抗体， Akt磷酸化和非磷酸化抗体（均购自 Cell Signaling公司） 和 GAPDH抗体 (购自 Santa Cruz公司） 进行 Western blot检测。
(B) 针对 MHCC97- H细胞： 向正常培养 24小时的 MHCC97-H细胞加入不同浓度 (0. ΙμΜ, 0. 5μΜ, 1. ΟμΜ, 2. ΟμΜ) 的 Indo 5或溶剂 DMS0 (0) 或 ΙμΜ SU11274处理 细胞。 SU11274 (购自 Sigma公司） 是特异的 c- Met激酶抑制剂， 可阻断 c- Met活 化， 但该化合物由于溶解度及副作用大等原因， 并不是一个合适的临床用药物， 但 实验中可用做阳性对照化合物。 化合物与细胞孵育 2h后， 收取细胞提取总蛋白。 用 c-Met磷酸化和非磷酸化抗体、 ERK磷酸化和非磷酸化抗体、 Akt磷酸化和非磷酸化 抗体 （均购自 Cell Signaling公司） 和 GAPDH抗体 （购自 Santa Cruz公司） 进行 Western blot检测。 实验结果如图 6A和图 6B所示， 在 HepG2细胞中 HGF迅速诱导 c- Met磷酸化， Indo 5能够以剂量依赖方式抑制 HGF诱导的 c- Met磷酸化， 在 2μΜ时几乎完全抑制 Met磷酸化， 并抑制了 c-Met下游关键信号分子 Akt和 ERK的磷酸化（参见图 6A) 。
MHCC97-H细胞是一种具有高转移特性的人肝癌细胞， 该细胞可分泌 HGF， 并通过自 分泌的形式激活 HGF/c- Met信号通路。 MHCC97-H细胞在正常培养条件下细胞具有较 高水平的 c-Met磷酸化， 加入 Indo 5能够以剂量依赖方式抑制 c-Met磷酸化及其下 游信号通路分子 Akt和 ERK的磷酸化 （参见图 6B) ； 该结果与阳性对照 SU11274比 较， 在 2μ 浓度下， Indo 5的抑制效果与 SU11274效果相当。 上述结果表明本发明 的 2 吲哚酮衍生物 （Indo 5 ) 以剂量依赖方式显著抑制 c- Met活化及其下游信号分 子 ERK的磷酸化， 提示其在体外细胞中可有效抑制 HGF/c- Met, 有开发为抗肝癌及 c-Met异常活化肿瘤治疗药物的可能。
实验例 8、 Indo 5抑制细胞内 TrkA及 TrkB磷酸化及信号通路实验
Trk (NTRK)激酶属于受体酪氨酸激酶家族中的一个小家族， 该家族激酶是神经 营养蛋白 （neurottophin) 受体， 在中枢及周围神经系统的发育与维持中作用重要。 成员包括 TrkA (NTRK1), TrkB (NTRK2)和 TrkC (NTRK3)。 Trk与肿瘤发生发展密切 相关， 对 Trk信号通路的抑制已经成为肿瘤治疗的策略之一。 针对 Trk的小分子抑 制剂及基于治疗用的单克隆抗体已经被用于外周疼痛的临床干预、 中枢神经系统异 常及肿瘤的治疗中。 TrkA是 NGF的高亲和性受体， TrkB是 BDNF的高亲和力受体， 检测 TrkA磷酸化、 TrkB磷酸化及下游信号就可评价本发明 2-吲哚酮衍生物（以 Indo5 为例） 对该细胞通路的影响， 进而可以推知与该细胞通路相关的神经母细胞瘤、 乳 腺癌、 肺癌等的抑制作用。
实验方法：神经母细胞瘤细胞 SK- N- SH培养于含 10%胎牛血清的 1640细胞培养 液中 （补充青霉素、 链霉素各 ΙΟΟμΙ/mL) ， 置于 37°C含 5% C02的细胞培养箱中， 每 1-2天换液一次。 用 0. 25%胰酶消化传代， 1000r/min离心 5分钟后， 弃上清液， 加入新鲜培养基传代培养。 无血清培养 24小时的 SK- N-SH细胞加入不同浓度
(0. 05μΜ, 0. ΙμΜ, 0. 5μΜ, 1. ΟμΜ) 的 Indo 5， 或溶剂 DMS0 ( 0) 预孵育 2h, 而后加 入 500ng/mL的 NGF或 200ng/mlBDNF (不加的记为 "-"）刺激 5min， 细胞裂解后提取 总蛋白，用 TrkA磷酸化和非磷酸化（p- TrkA)抗体、 TrkB磷酸化和非磷酸化（p-TrkB) 抗体、 ERK磷酸化和非磷酸化 （P- ERK) 抗体、 Akt磷酸化和非磷酸化抗体 （p- Akt ) 及 GAPDH抗体进行 Western blot检测。
实验结果如图 7所示， 本发明 2-吲哚酮衍生物 （Indo 5) 以剂量依赖方式显著 抑制 TrkA及其下游信号分子 ERK的磷酸化； 如图 8所示， 本发明 2-吲哚酮衍生物
( Indo 5) 以剂量依赖方式显著抑制 TrkB及其下游信号分子包括 ERK及 Akt的磷酸 化， 提示本发明 2-吲哚酮衍生物（Indo 5 )在体外细胞中可有效抑制 Trk信号通路， 有开发为抗神经母细胞瘤、 乳腺癌、 肺癌等治疗药物的可能。
实验例 9、 Indo 5体内抑制神经母细胞瘤 SK- N- SH细胞生长实验
文献报道， NGF/TrkA在神经细胞肿瘤发生、 发展中起重要作用。 本实验选择神 经母细胞瘤 SK-N- SH细胞为研究对象， 建立裸鼠荷瘤模型， 观察本发明 2-吲哚酮衍 生物 （以 Indo 5为例） 对裸鼠荷瘤的影响。
模型建立： 6-8周 nu/nu雌性的裸鼠， 在动物中心 SPF级条件下饲养一周后， 每 只接种 5 X 106个神经母细胞瘤 SK-N- SH细胞 （购自 ATCC) 于裸鼠背部左前肢皮下， 接种后每天观察裸鼠荷瘤情况， 当体积达到 100mm3时进行分组。 对每只裸鼠编号并 测量瘤体大小， 将所得数据输入 EXCEL中排序， 剔除极端值。 生成和小鼠数目相同 的随机数， 利用随机数进行随机区组的设计。
实验方法： 腹腔注射， 注射剂量分别为 ½g/kg、 8mg/kg、 16mg/kg的腹腔给药 组及灌胃给药组 （16mg/kg) ， 溶剂对照组注射相同体积的 DMSO (control ) ， 每组 10只实验动物； 24h给药一次， 共给药 6次， 在给药过程中实时监测并记录肿瘤体 积（长 X宽 X宽 /2) 的变化情况， 结果用均数土标准差表示。 2周后处死小鼠， 剥离 肉眼可见肿瘤称重， 并最终计算化合物对肿瘤的抑制率。
图 9显示了不同剂量的化合物 Indo 5对 SK- N-SH荷瘤小鼠中肿瘤的抑制结果； A为肿瘤体积变化曲线， B为抑制率。 表明： 腹腔注射化合物 Indo 5能有效抑制 SK N-SH细胞的生长， 并具有剂量效应关系。利用测得数据计算肿瘤抑制率， 计算结 果显示， 化合物 Indo 5腹腔给药能以剂量依赖方式抑制肿瘤细胞生长， 最大剂量
( 16rag/kg) 化合物 Indo 5对 SK- N-SH细胞体内增殖的抑制率为 50% , 表明化合物 Indo 5对 SK-N- SH肿瘤细胞皮下接种裸鼠模型具有明显的抑瘤效果。
此外， 同时比较了灌胃与腹腔给药对于 SK-N-SH体内增殖的影响， 结果显示给 药 16mg/kg对于肿瘤细胞的增殖抑制率为 48%， 抑瘤效果与腹腔注射相当， 表明本 发明化合物口服具有抗肿瘤效果， 具有开发为口服抗肿瘤药物的潜力。
工业应用性
本发明提供了 2-吲哚酮衍生物及其制备方法， 且这些物质具有酪氨酸激酶抑制 活性， 可作为酪氨酸激酶抑制剂药物或抗肿瘤药物的活性成分， 应用在预防和治疗 肿瘤疾病及抗肿瘤药物的开发中。

Claims

权利要求
1. 一种具有酪氨酸激酶抑制活性的物质， 为具有通式 I的化合物、 其几何异构 体及其药学上可接受的盐：
Figure imgf000020_0001
其中：
R2为氢或卤素； 为氢或 -S02NR3R4， 其中， R3为氢或甲基， 1?4为苯基、 环己垸基、 卤素取代苯基、 甲苯基、 乙苯基、 乙氧基苯基、 羟苯基或 3-萘基。
2. 根据权利要求 1所述的物质， 其特征在于： 所述式 I的化合物包括以下中的 任何一种：
3- (1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- (β-萘胺基磺基) -2-吲哚酮 (Indol) ；
3- (1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- (3-氯 -4-氟苯胺基磺基） -2-吲哚酮 （Indo2)
3- (1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- (N-甲基苯胺基磺基) -2-吲哚酮 (Indo3) ；
3- (1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- (环己胺基磺基) -2-吲哚酮 (Indo4) ；
3- (1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- (2-甲基苯胺基磺基） -2-吲哚酮 （Indo5) ；
3- (1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- (4-氯苯胺基磺基） -2-吲哚酮 （Indo6) ；
3- (1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- (4-羟乙基苯胺基磺基） -2-吲哚酮 （Indo7)
3- (1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- (4-甲苯胺基磺基) -2-吲哚酮 (Indo8) ；
3- (1H-苯并咪唑 -2-亚甲基） -5- (4-乙氧基苯胺基磺基） -2-吲哚酮 （Indo9)
3. 制备权利要求或 2所述化合物的方法， 其特征在于， 包括，
将式 II化合物
与式 III化合物
Figure imgf000020_0002
在甲醇、 乙醇或异丙醇或其混合溶液中， 加入碱性或酸性催化剂后经回流得到； 其 中： 和 定义与权利要求 1相同。
4. 根据权利要求 3所述的制备方法， 其特征在于， 制备过程中， 所述的碱性催 化剂为选自无机碱性化合物， 包括氢氧化钾、 氢氧化钠、 氨气、 氧化钙及其水溶液 等， 有机胺类化合物， 包括三乙胺、 哌啶、 二甲氨基吡啶、 2，4，5-三甲基吡啶或吡啶 等； 所述的酸性催化剂为选自无机酸类， 包括盐酸、 磷酸等， 有机酸类化合物， 包 括对甲苯磺酸、 乙酸等。
5.组合物， 其为含有权利要求 1或 2所述的具有酪氨酸激酶抑制活性的物质中 的一种或多种以及可药用载体或赋形剂的药物组合物。
6. 权利要求 1或 2所述的化合物、 其几何异构体及其药学上可接受的盐或权利 要求 5所述的组合物在制备酪氨酸激酶抑制剂药物或抗肿瘤药物中的应用。
7. 根据权利要求 6所述的用途， 其特征在于， 其中抑制酪氨酸激酶的用途为防 治肿瘤， 防治肿瘤作用包括诱导肿瘤细胞凋亡、 抗肿瘤新生血管形成、 防止肿瘤化 疗耐药和阻止肿瘤恶性转移。
8. 根据权利要求 6或 7所述的用途， 其特征在于， 所述的肿瘤为乳腺癌、肺癌、 皮肤癌、 结肠癌、 前列腺癌、 胰腺癌、 肝癌、 胃癌、 头颈部癌症、 神经胶质瘤、 神 经母细胞瘤、 黑色素瘤、 肾癌或白血病。
9. 根据权利要求 6所述的用途， 其特征在于， 所述的酪氨酸激酶抑制剂药物为 与 c-Met或 Trk信号通路相关的病症的治疗药物。
10. 根据权利要求 9所述的用途， 其特征在于， 与 c- Met信号通路相关的病症 包括但不限于肝癌、 乳腺癌、 肺癌、 前列腺癌、 胰腺癌、 结肠癌、 胃癌、 头颈部癌 症或白血病等。
11. 根据权利要求 9所述的用途， 其特征在于， 与 Trk信号通路相关的病症包 括但不限于乳腺癌、 肺癌、 皮肤癌、 胃癌、 神经胶质瘤、 神经母细胞瘤、 黑色素瘤、 肾癌或白血病。
12. 3- ( 1H -苯并咪唑- 2 -亚甲基） -5- ( 2-甲基苯胺基磺基） -2 -吲哚酮（Indo 5) 在制备抗肿瘤药物中的应用， 所述肿瘤包括但不仅限于乳腺癌、 肺癌、 结肠癌、 前 列腺癌、 胰腺癌、 肝癌、 胃癌、 头颈部癌症、 神经胶质瘤、 黑色素瘤、 肾癌及白血 病等。
13. 根据权利要求 12所述的应用， 其特征在于， 所述肿瘤为乳腺癌、 肺癌、 肝 癌、 胃癌、 皮肤癌、 神经母细胞瘤或白血病。
14. 3 ( 1H-苯并咪唑- 2-亚甲基） -5- ( 2-甲基苯胺基磺基） -2-吲哚酮（Indo 5 ) 在制备酪氨酸激酶抑制剂药物中的应用。
15. 根据权利要求 14所述的用途， 其特征在于， 酪氨酸激酶抑制剂药物为与 c Met或 Trk信号通路相关的病症的治疗药物。
16. 根据权利要求 15所述的用途， 其特征在于， 与 c- Met信号通路相关的病症 包括但不限于肝癌、 乳腺癌、 肺癌、 前列腺癌、 胰腺癌、 结肠癌、 胃癌、 头颈部癌 症或白血病等。
17. 根据权利要求 15所述的用途， 其特征在于， 与 Trk信号通路相关的病症包 括但不限于乳腺癌、 肺癌、 皮肤癌、 胃癌、 神经胶质瘤、 神经母细胞瘤、 黑色素瘤、 肾癌或白血病。
18. 3- ( 1H-苯并咪唑- 2-亚甲基） -5- (2-甲基苯胺基磺基） -2-吲哚酮 （Indo 5 ) 在制备抗肿瘤药物中的应用， 所述肿瘤为肝癌、 肺癌或神经母细胞瘤。
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