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WO2012104936A1 - ヒト多能性幹細胞の培養方法 - Google Patents

ヒト多能性幹細胞の培養方法 Download PDF

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Publication number
WO2012104936A1
WO2012104936A1 PCT/JP2011/004691 JP2011004691W WO2012104936A1 WO 2012104936 A1 WO2012104936 A1 WO 2012104936A1 JP 2011004691 W JP2011004691 W JP 2011004691W WO 2012104936 A1 WO2012104936 A1 WO 2012104936A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
medium
stem cells
pluripotent stem
cells
supplement
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/004691
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
美保 古江
匡希 木根原
Original Assignee
独立行政法人医薬基盤研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 独立行政法人医薬基盤研究所 filed Critical 独立行政法人医薬基盤研究所
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Priority to CA2825070A priority patent/CA2825070A1/en
Priority to US13/982,127 priority patent/US20130309768A1/en
Priority to EP11857898.8A priority patent/EP2671945A4/en
Priority to SG2013056593A priority patent/SG192128A1/en
Publication of WO2012104936A1 publication Critical patent/WO2012104936A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
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    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing human pluripotent stem cells while maintaining an undifferentiated state, and a kit therefor, and more specifically, human pluripotency in a first medium in which an activin-containing supplement is added to a basal medium for pluripotent stem cells.
  • the first medium is replaced with a second medium obtained by adding an activin-free supplement to a basal medium for pluripotent stem cells to culture human pluripotent stem cells.
  • Step (b) and step (c) of subculturing human pluripotent stem cells in the first medium are repeated as (a) (b) (c) (b) (c).
  • the present invention relates to a method for culturing human pluripotent stem cells while maintaining an undifferentiated state and a kit for the same.
  • pluripotent stem cells such as ES cells can be differentiated into various tissues
  • application to elucidation models of tissue differentiation processes and regenerative medicine is considered.
  • a pluripotent stem cell culture method provided (for example, see Patent Document 1), a medium for maintaining pluripotency of mesenchymal stem cells characterized by containing TGF- ⁇ (for example, see Patent Document 2), stem cells Basal media that allow serum-free primary and subculture of 5-10% pannexin, 1-100 ng / mL bFGF, 1-100 ng / mL PDGF, A serum-free medium (for example, refer to Patent Document 3) obtained by mixing 100 ng / mL EGF and 1-1000 ⁇ g / mL vitamin C, polyvinyl alcohol (PVA) in the absence of feeder cells, and A method for maintaining embryonic stem cells (see, for example, Patent Document 4) characterized by suspension culture of embryonic stem cells in a serum-free medium
  • the present inventors have provided a medium for serum-free medium in which ES cells can be cultured for a long period of time while maintaining undifferentiation under serum-free conditions without using feeder cells in a type I collagen-coated flask.
  • a basal medium for producing such a medium see, for example, Patent Document 9
  • Preparing primate embryonic stem cells with a cell culture medium supplemented with ii), and ii) the primate embryonic stem cells The step of maintaining an undifferentiated state, more composed, in cell culture conditions without feeder cells and serum, we have developed a method for maintaining the primate embryonic stem
  • human ES cells can be maintained and cultured when they are coated with type I collagen using Shef human ES cells and the HUES-1 strain, and HEPES is added to a serum-free medium. It has been confirmed that, when added, it has an adverse effect on the maintenance of human ES cells (see, for example, Non-Patent Document 2) and assists the action of FGF-2 that promotes the proliferation of ES cells. It has been reported that even when heparin is added in the absence of FGF-2, the proliferative action of ES cells is promoted (see, for example, Non-Patent Document 3). When activin is added, ERK (extracellular signal-regulated protein kinases) is produced.
  • ERK extracellular signal-regulated protein kinases
  • Non-Patent Document 5 the basic culture methods for human ES cells are summarized (for example, see Non-Patent Document 5).
  • An object of the present invention is to provide a method for culturing human pluripotent stem cells while maintaining an undifferentiated state, which is more efficient than conventional methods, and a kit for the same.
  • pluripotent stem cells such as ES cells for a long period of time
  • Proliferating pluripotent stem cells in these media Death may occur at a high frequency or pluripotency may be lost in the culture process, often relying on the intuition and know-how of the experimenter, which is not impossible but requires advanced culture techniques It was.
  • conventional media usually contain animal-derived raw materials.
  • animal-derived raw materials For example, the use of bovine serum albumin, porcine-derived type I collagen and the like has a problem in that the supply amount is limited and the cost is high. It was.
  • animal-derived raw materials are usually non-heated preparations, there is a possibility of prion causing viral bovine spongiform encephalopathy (BSE), pathogens such as viruses, and the presence of foreign components. It has been considered that this is one of the causes of lowering the probability of culturing while maintaining the undifferentiated state, because there is a problem in sex, and variation occurs between lots of the produced medium.
  • BSE viral bovine spongiform encephalopathy
  • the present inventors can replace or delete animal-derived components to culture pluripotent stem cells that are highly safe and that do not vary from lot to lot while maintaining an undifferentiated state.
  • Attempts have been made to prepare
  • the component of the recombinant may have a structure different from that of a conventional animal-derived component, Since it has been known that immunogenicity may be different from conventional animal-derived raw materials, each component has been carefully examined.
  • the present inventors have continued to study components that further increase the undifferentiated maintenance rate of pluripotent stem cells.
  • a protein kinase C inhibitor is added to the medium, the cells have a higher probability of being undifferentiated. Maintained, and the need to mechanically remove some differentiated cells is almost eliminated.
  • the present inventors have completed the method for culturing human pluripotent stem cells of the present invention.
  • the present invention provides [1] (a) a step of culturing human pluripotent stem cells in a first medium obtained by adding an activin-containing supplement to a basal medium for pluripotent stem cells; (b) Culturing human pluripotent stem cells by replacing with a second medium in which activin-free supplement is added to the basal medium for pluripotent stem cells; (c) substituting the human pluripotent stem cells to the first medium; Subculturing; (a) after step (a), (b) and (c) steps are sequentially repeated, a method for culturing human pluripotent stem cells while maintaining an undifferentiated state, [2]
  • the supplement is characterized by comprising fibronectin, insulin, transferrin, 2-mercaptoethanol, 2-ethanolamine, sodium selenite, and oleic acid conjugated albumin
  • the present invention also provides [7] a kit for culturing human pluripotent stem cells while maintaining an undifferentiated state, comprising an activin-containing supplement, an activin-free supplement, and a basal medium component for human pluripotent stem cells.
  • kits according to [7] above, wherein the supplement comprises fibronectin, insulin, transferrin, 2-mercaptoethanol, 2-ethanolamine, sodium selenite, and oleic acid-conjugated albumin, [9] The kit according to [7] or [8] above, wherein fibronectin is added to the supplement, [10] Further, the protein kinase C inhibitor is included in the supplement.
  • basal medium [7] to [7] above, which is a chemically synthesized medium containing the above sugar, one or two or more inorganic salts, one or two or more amino acids, one or two or more vitamins, and trace components.
  • human pluripotent stem cells can be cultured and expanded while maintaining an undifferentiated state, and the pluripotent stem cells maintaining such an undifferentiated state are treated under appropriate conditions.
  • the cells can be differentiated into the target cells.
  • FIG. 3 shows micrographs of cells at the 1st to 6th passages of ES cell strain H9 (WA09) cultured by the method of the present invention. It is a figure which shows the expression of the undifferentiation / differentiation marker in the 5th passage of ES cell H9 strain
  • SSEA-3, SSEA-4, TRA-2-54, TRA-1-60, TRA-1-80 and CD90 show expression of undifferentiated markers
  • SSEA-1, CD105, CD56 and A2B5 show expression of differentiation markers Indicates.
  • the state of cells when 0, 20, 40, 80, 160, 320 ⁇ g / well of fibronectin is added to the medium and cultured by the method of the present invention is shown.
  • the situation of cells cultured in medium supplemented with 0, 1, 2.5, 5, 10 ⁇ M myristoylated protein kinase C peptide inhibitor is shown.
  • pluripotent stem cells are cultured in a first medium in which an activin-containing supplement is added to a basal medium for pluripotent stem cells.
  • B culturing human pluripotent stem cells by replacing the first medium with a second medium in which activin-free supplement is added to a basal medium for pluripotent stem cells;
  • the step of subculturing human pluripotent stem cells in the first medium is not particularly limited as long as it is a method in which (b) and (c) are sequentially repeated after step (a).
  • the kit for culturing human pluripotent stem cells while maintaining the undifferentiated state is not particularly limited as long as it is a kit comprising a supplement and a basal medium component for pluripotent stem cells.
  • Is fine Can culturing refers to a state in which water is added to "medium components".
  • “maintaining an undifferentiated state” here means a state in which the self-replicating ability is maintained and the characteristics of the pluripotent cell are maintained such that it has the ability to differentiate into all types of cells existing in the living body.
  • pluripotent stem cells are targeted, and pluripotent stem cells are isolated from embryonic stem cells (embryonic stem cells: ES cells) or embryonic primordial germ cells.
  • embryonic stem cells embryonic stem cells: ES cells
  • embryonic primordial germ cells embryonic primordial germ cells.
  • Embryonic germ cells EG cells
  • germline stem cells germline stem cells: GS cells
  • stem cells derived from bone marrow such as iliac bone marrow and jaw bone marrow
  • mesenchymal stem cells such as stem cells derived from adipose tissue
  • bodies such as skin cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cell
  • human ES cell H9 strain WA09
  • human ES cell H1 (WA01) strain National Stem Cell bank, WISC Bank
  • KhES-1, KhES-2 and KhES-3 All are the Center for Stem Cell Research, Kyoto University Research Institute
  • human ES cells such as HES3, HES4 and HES6 (National6Stem Cell bank, Monash University), Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, C-Myc gene and IPS cells obtained by introducing the Sox2 gene (RIKEN BioResource Center, Kyoto University), Tic (JCRB1331 strain), Dotcom (JCRB1327 strain), Squeaky (JCRB1329 strain), Toe (JCRB1338 strain), Lollipop (JCRB1336 strain) ) (Growth Medical Center, Pharmaceutical Base Research Center for Intractable Diseases and Disease Resources, JCRB Cell Bank), UTA-1 and UTA-1-SF-2-2 strains (all from the University of Tokyo), Oct3 / 4 gene,
  • the basal medium for pluripotent stem cells used in the present invention is not particularly limited as long as it is a medium capable of culturing human pluripotent stem cells while maintaining the undifferentiated state by adding the supplement of the present invention.
  • a chemically synthesized medium is preferable because it is easy and prevents variation from lot to lot.
  • One or more types of sugar (s), one or more types of inorganic salts (s), one or more types of amino acids ( Class) preferably contains 1 or 2 or more types of vitamin (s) and 1 or 2 or more types of trace component (s), and optionally contains antibiotics such as kanamycin for use in drug susceptibility testing You can also.
  • saccharide examples include monosaccharides such as glucose, lactose, mannose, fructose, and galactose, and disaccharides such as sucrose, maltose, and lactose, among which glucose is particularly preferable.
  • monosaccharides such as glucose, lactose, mannose, fructose, and galactose
  • disaccharides such as sucrose, maltose, and lactose, among which glucose is particularly preferable.
  • glucose is particularly preferable.
  • One or a combination of two or more can also be added.
  • the inorganic salts include calcium chloride, calcium nitrate, copper sulfate pentahydrate, iron (III) nitrate nonahydrate, iron (II) sulfate heptahydrate, magnesium chloride hexahydrate. , Magnesium sulfate, potassium chloride, sodium chloride, disodium hydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate dihydrate, sodium dihydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate dihydrate, zinc sulfate heptahydrate
  • any inorganic salt or a combination thereof can be used as long as it is a component that advantageously acts to maintain the undifferentiated state of pluripotent stem cells. it can.
  • amino acids include alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cystine, cysteine, glutamine, glycine, histidine, glutamic acid, hydroxyproline, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine.
  • amino acid (s) selected from, tryptophan, tyrosine, valine, etc., preferably L-amino acids and their derivatives and their salts and their hydrates Can do.
  • the arginine include arginine derivatives such as L-arginine hydrochloride and L-arginine monohydrochloride.
  • aspartic acid examples include L-aspartic acid sodium salt monohydrate, L-asparagine.
  • Derivatives of aspartic acid such as acid monohydrate, potassium L-aspartate, magnesium L-aspartate, and the like
  • cysteine examples include L-cysteine dihydrochloride and L-cysteine hydrochloride monohydrate
  • Derivatives of cysteine such as L-lysine hydrochloride and derivatives of lysine such as L-lysine hydrochloride
  • glutamic acid can include derivatives of glutamine such as L-glutamic acid monosodium salt
  • asparagine examples include derivatives of asparagine such as L-asparagine monohydrate.
  • tyrosine examples include derivatives of tyrosine such as L-tyrosine disodium dihydrate
  • histidine examples include derivatives of histidine such as histidine hydrochloride and histidine hydrochloride monohydrate.
  • the lysine examples include lysine derivatives such as L-lysine hydrochloride.
  • vitamins include one or two selected from ascorbic acid, biotin, choline, folic acid, inositol, niacin, pantothenic acid, pyridoxine, riboflavin, thiamine, vitamin B12, and paraaminobenzoic acid (PABA). Mention may be made of more than one type of vitamin (s) and derivatives of each of these components and their salts and their hydrates.
  • ascorbic acid includes ascorbic acid 2-phosphate ester, magnesium ascorbate phosphate, sodium ascorbate sulfate, ascorbyl aminopropyl phosphate, sodium ascorbate phosphate, etc.
  • examples of choline include derivatives of choline such as choline chloride, and niacin includes derivatives of niacin such as nicotinic acid, nicotinic acid amide, and nicotinic alcohol.
  • examples of pantothenic acid include derivatives of pantothenic acid such as calcium pantothenate, sodium pantothenate, and panthenol.
  • Examples of pyridoxine include pyridoxine hydrochloride, pyridoxal hydrochloride, pyridoxal phosphate, and pyridoxal phosphate.
  • thiamine derivatives such as thiamine hydrochloride, thiamine nitrate, bisthiamine nitrate, thiamine dicetyl sulfate, fursultiamine hydrochloride, octothiamine, benfotiamine and the like.
  • the said ascorbic acid is added.
  • the trace component is preferably a component that advantageously acts to maintain the undifferentiated state of pluripotent stem cells, such as glutathione, hypoxanthine, lipoic acid, linolenic acid, phenol red, putrescine, pyruvate, thymidine, NaHCO3. 3 and the like, derivatives thereof such as components and derivatives thereof and salts thereof, and hydrates thereof which are usually used as medium components, for example, putrescine dihydrochloride, sodium pyruvate and the like can be mentioned.
  • pluripotent stem cells such as glutathione, hypoxanthine, lipoic acid, linolenic acid, phenol red, putrescine, pyruvate, thymidine, NaHCO3. 3 and the like, derivatives thereof such as components and derivatives thereof and salts thereof, and hydrates thereof which are usually used as medium components, for example, putrescine dihydrochloride, sodium pyruvate and the like
  • basal medium for human pluripotent stem cells include known chemical synthesis such as commercially available Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), minimum essential medium (MEM), Eagle basal medium (BME), RPMI 1640 medium, F12 medium, etc.
  • a medium such as a medium, a medium in which any two or more of these mediums such as a DMEM / F12 medium (a medium in which DMEM and F12 medium are mixed at a ratio of 1: 1), and the like ascorbine Examples include a medium supplemented with an acid, preferably ascorbic acid 2-phosphate ester.
  • a basal medium having the composition shown in Table 1 above hereinafter referred to as “hESF-grow medium”. Can also be suitably exemplified.
  • the concentration (content) of each of the above-mentioned medium components is as follows.
  • a concentration within the range of 0 to 200 preferably a concentration within the range of 40 to 160, more preferably a concentration within the range of 80 to 120, and even more preferably a concentration within the range of 90 to 110 can be exemplified.
  • a concentration of 0 to 100 mg / L, preferably 20 to 80 mg / L, more preferably 40 to 60 mg / L, even more preferably 45 to 55 mg / L is suitable. Can be exemplified.
  • any supplement can be used as long as it becomes a medium capable of culturing human pluripotent stem cells while maintaining undifferentiation by adding to the basal medium for pluripotent stem cells.
  • Specific examples include those containing components such as fibronectin, insulin, transferrin, 2-mercaptoethanol, 2-ethanolamine, selenium, FGF-2, oleic acid-conjugated albumin, and protein kinase C inhibitor. can do.
  • the supplement which consists of 1 or 2 or more of the said component may be fractionated into plurality, and can also be put together as one supplement containing many said components.
  • the first medium used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it can culture human pluripotent stem cells by adding an activin-containing supplement to the basal medium for pluripotent stem cells.
  • the second medium used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it can culture human pluripotent stem cells by adding an activin-free supplement to the basal medium for pluripotent stem cells.
  • the activin-containing supplement is not particularly limited as long as it is a supplement containing activin, but preferably contains fibronectin.
  • Examples of the supplement include supplements containing one or more components selected from fibronectin, insulin, transferrin, 2-mercaptoethanol, 2-ethanolamine, selenium, FGF-2, albumin, oleic acid, and protein kinase C inhibitor.
  • a supplement comprising: a combination of: insulin, transferrin, 2-mercaptoethanol, 2-ethanolamine, selenium, FGF-2, albumin, oleic acid, protein kinase C inhibitor; Can be mentioned.
  • preferable examples include supplements containing fibronectin, insulin, transferrin, 2-mercaptoethanol, 2-ethanolamine, selenium, FGF-2, albumin, and oleic acid, and supplements further containing a protein kinase C inhibitor. be able to.
  • fibronectin is used as a component constituting a supplement to be added to the basal medium for pluripotent stem cells so as to coat the inside of the culture container in order to enhance the adhesion between the cells and the culture container.
  • it can be added to the basal medium together with other supplement components without coating the inside of the culture vessel.
  • activin; and the above-mentioned supplement excluding fibronectin are added to the basal medium, whereby the first medium (hereinafter also referred to as “first medium I”) is obtained.
  • fibronectin can be prepared, after coating fibronectin on the culture vessel, and with activin; including insulin, transferrin, 2-mercaptoethanol, 2-ethanolamine, selenium, FGF-2, albumin, and oleic acid; It is preferable to prepare the first medium I by adding the combination to the basal medium, and more preferably a protein kinase C inhibitor is added.
  • a first medium hereinafter also referred to as “first medium II” is prepared by adding both activin and the above supplement to the basal medium. can do.
  • the second medium is prepared by coating fibronectin on the inside of the culture vessel and then adding the above-mentioned supplement excluding fibronectin to the basal medium to prepare a second medium (hereinafter also referred to as “second medium I”).
  • second medium I can be added by adding insulin, transferrin, 2-mercaptoethanol, 2-ethanolamine, selenium, FGF-2, albumin, and oleic acid. It is preferable to prepare, and more preferably a protein kinase C inhibitor added.
  • a second medium (hereinafter also referred to as “second medium II”) can be prepared by adding the above supplement to the basal medium.
  • the second medium II is prepared by adding ethanolamine, selenium, FGF-2, albumin and oleic acid to the basal medium and further added with a protein kinase C inhibitor More preferred.
  • the first medium I is used, the second medium I is preferably used.
  • the second medium II is preferably used.
  • Each component constituting the activin-containing supplement and / or activin-free supplement is preferably an animal product-free grade, and the animal product-free grade component is not an animal-derived component but is similar to an animal-derived component.
  • Recombinant (recombinant) proteins, chemically synthesized products, plant-derived components, etc. that are artificially prepared and purified by genetic recombination technology, and have a tag as the above-mentioned recombinant protein. Proteins that are not structurally identical to animal-derived components, such as those, can be included, and chemically synthesized products can include derivatives and their salts and hydrates thereof.
  • the fibronectin is known as a kind of extracellular matrix (extracellular tramatrix: ECM), naturally derived fibronectin such as porcine-derived fibronectin, bovine-derived fibronectin, human-derived fibronectin, and animal product free grade fibronectin. Examples thereof include fibronectin, which is a gene recombinant such as a type, a pig type, and a human type.
  • ECM extracellular tramatrix
  • naturally derived fibronectin such as porcine-derived fibronectin, bovine-derived fibronectin, human-derived fibronectin, and animal product free grade fibronectin.
  • fibronectin which is a gene recombinant such as a type, a pig type, and a human type.
  • a solution containing fibronectin in the culture vessel is, for example, 0.5 to 5 ⁇ g / cm 2 , preferably 1 to 3 ⁇ g / cm 2 , and more preferably. Is added to a concentration of 1.5 to 2.5 ⁇ g / cm 2 and is not dried at 1 to 12 hours, preferably 2 to 8 hours, more preferably 3 to 5 hours, for example at 37 ° C.
  • the solution can be removed by aspiration immediately before seeding the pluripotent stem cells, and the basal medium for pluripotent stem cells is activated on the coated fibronectin.
  • the basal medium for pluripotent stem cells is activated on the coated fibronectin.
  • the concentration is 1.0 to 100 ⁇ g / mL, preferably 5 to 75 ⁇ g / mL, preferably 10 to 50 ⁇ g / mL, more preferably 25 to 45 ⁇ g / mL.
  • the first medium and / or the second medium used in the present invention is added to the basal medium for human pluripotent stem cells. Can be prepared.
  • the insulin examples include naturally-derived insulin such as porcine-derived insulin, bovine-derived insulin and human-derived insulin, and animal product free grade insulin such as bovine, porcine, or human-type recombinant insulin.
  • human-type recombinant insulin recombinant human insulin
  • the first medium and / or the second medium used in the present invention It can be prepared.
  • transferrin examples include naturally occurring transferrin such as porcine-derived transferrin, bovine-derived transferrin, and human-derived transferrin, and animal product-free grade insulin such as bovine, porcine, or human-type recombinant transferrin.
  • human-type recombinant transferrin recombinant human transferrin
  • iron-containing apo-type transferrin is more preferable than hol-type transferrin bound to iron.
  • 0.1 to 50 ⁇ g / mL preferably 1 to 20 ⁇ g / mL, more preferably 2 to 10 ⁇ g / mL, and even more preferably 3 to 7 ⁇ g / mL.
  • Chibin as a constituent of-free supplements, and added to the basal medium for the human pluripotent stem cells can be prepared a first medium and / or the second medium used in the present invention.
  • a chemically synthesized product synthesized by a conventional method can be suitably exemplified as an animal product free grade. 1 to 20 ⁇ M, preferably 5 to 15 ⁇ M, more preferably 7.5 to 12.2.
  • the basal medium for human pluripotent stem cells as a component of the activin-containing supplement and / or activin-free supplement to a final concentration of 5 ⁇ M, more preferably 9-11 ⁇ M
  • the first medium and / or the second medium used in the above can be prepared.
  • ethanolamine a chemically synthesized product synthesized by a conventional method, also called 2-aminoethanol or monoethanolamine, can be suitably exemplified as an animal product free grade. 1 to 20 ⁇ M, preferably 5 to 15 ⁇ M As a component of the activin-containing supplement and / or activin-free supplement, the final concentration of 7.5 to 12.5 ⁇ M, more preferably 9 to 11 ⁇ M is more preferable.
  • the basal medium the first medium and / or the second medium used in the present invention can be prepared.
  • the selenium can include selenium and its derivatives and their salts and hydrates thereof, and is chemically synthesized by ordinary methods, such as selenate, sodium selenate, sodium selenite, sodium hydrogen selenite, etc. Can be exemplified as an animal product free grade, and the activin is adjusted so that the final concentration is 1 to 40 ⁇ M, preferably 10 to 30 ⁇ M, more preferably 15 to 25 ⁇ M, and still more preferably 18 to 22 ⁇ M in terms of sodium selenate.
  • Preparing the first medium and / or the second medium used in the present invention by adding to the basal medium for human pluripotent stem cells as a component of the supplement containing and / or the activin-free supplement Can do.
  • FGF-2 as a basic fibroblast growth factor (FibroblastFiGrowth Factor-2) also known as bFGF, natural origin such as swine-derived FGF-2, bovine-derived FGF-2, human-derived FGF-2, etc.
  • FibroblastFiGrowth Factor-2 also known as bFGF
  • natural origin such as swine-derived FGF-2, bovine-derived FGF-2, human-derived FGF-2, etc.
  • FGF-2 and animal product free grade FGF-2 may include recombinant human FGF-2, such as bovine, porcine or human recombinants, particularly human recombinants FGF-2 (recombinant human FGF-2 (rhFGF-2)) can be suitably exemplified, and 0.1 to 50 ng / mL, preferably 1 to 20 ng / mL, more preferably 3 to 7 ng / mL, As a component of the activin-containing supplement and / or activin-free supplement, preferably at a final concentration of 4 to 6 ng / mL, By adding the preparative pluripotent stem cell basal medium for, it can be prepared a first medium and / or the second medium used in the present invention.
  • human FGF-2 recombinant human FGF-2
  • the oleic acid examples include plant-derived oleic acid and oleic acid chemically synthesized by a conventional method. 0.1 to 50 ⁇ g / mL, preferably 5 to 15 ⁇ g / mL, more preferably 7.5 to Added to the basal medium for human pluripotent stem cells as a component of the activin-containing supplement and / or activin-free supplement to a final concentration of 11.5 ⁇ g / mL, more preferably 9-10 ⁇ g / mL Thus, the first medium and / or the second medium used in the present invention can be prepared.
  • albumin examples include naturally-derived albumin such as ovalbumin, porcine-derived albumin, bovine-derived albumin, and human-derived albumin, and animal product free grade albumin such as bovine, porcine, or human-type recombinants.
  • examples thereof include albumin and the like, and human type recombinant albumin (recombinant human albumin (rHSA)) can be preferably exemplified, and is 0.1 to 5 mg / mL, preferably 0.5 to 2.
  • rHSA recombinant human albumin
  • One of the above activin-containing supplements and / or activin-free supplements to a final concentration of 5 mg / mL, more preferably 0.75 to 1.5 mg / mL, and still more preferably 0.9 to 1.1 mg / mL.
  • an albumin and an oleic acid can be prepared. It is desirable to add in the form of a complex, that is, as oleic acid-conjugated albumin.
  • protein kinase C inhibitor examples include peptides and compounds capable of inhibiting protein kinase C.
  • myristoylated protein kinase C peptide inhibitor manufactured by Promega
  • staurosporine or The staurosporine derivative calphostin 4′-N-benzoylstaurosporine
  • bisindolylmaleimides such as bisindolylmaleimide I, isoquinolinesulfonyl) -2-methylpiperazine dihydrochloride (H-7), N- [2- (methylamino) ethyl] -5-isoquinolinesulfonamide (H-8), N- (2-aminoethyl) -5-isoquinolinesulfonamide (H-9) and the like can be exemplified.
  • the myristoylated protein kinase C peptide inhibitor (Promega) Is used as a component of the activin-containing supplement or activin-free supplement so that the concentration is 0.5 to 5 ⁇ M, preferably 1 to 2.5 ⁇ M.
  • the maintenance rate of undifferentiated human pluripotent stem cells can be further increased.
  • activins high homology is maintained in vertebrates such as humans, rats, mice, Xenopus, zebrafish and the like, and there are families such as activin A, activin B, activin AB, activin C and the like.
  • an animal product free grade activin there can be mentioned a human-type recombinant activin and the like.
  • a recombinant human activin A is preferably exemplified among human-type recombinant activins.
  • One of the above activin-containing supplements to a final concentration of 1 to 40 ng / mL, preferably 1 to 30 ng / mL, more preferably 1 to 10 ng / mL, and even more preferably 1 to 3 ng / mL.
  • the above-mentioned basal medium for human pluripotent stem cells The addition can be prepared a first culture medium used in the present invention.
  • the step (a) is a step of seeding and culturing human pluripotent stem cells in a first medium obtained by adding the activin-containing supplement to the basal medium for pluripotent stem cells, and is cryopreserved at a supply destination.
  • the pluripotent stem cells are preferably cultured after preparation by a known method.
  • Examples of the preparation method include release in EDTA dissolved in Dulbecco's Ca 2+ and Mg 2+ -free phosphate buffered saline, or trypsin, recombinant trypsin, trypsin / EDTA, collagenase, collagenase / trypsin , Dispase, actase, or mechanically exfoliate and collect the released cells in the first medium (solution) to prepare a cell suspension.
  • the cell suspension is about 300-1000 rpm.
  • a method of re-preparing the cell suspension one or more times, or on a gelatin-coated plate with fetal calf serum, DMEM or DM / F12, KSR (KnockOut Serum Replacement, GIBCO), L-glutamine, 2-mercaptoethanol, non-essential amino acid (s), and bFGF Charging the medium, and / or support cells (feeder cells) may be a method of culturing under the coexistence.
  • the first medium in which the first passage human pluripotent stem cells are cultured is replaced with a second medium supplemented with an activin-free supplement.
  • This is a step of culturing human pluripotent stem cells, and the timing of the medium exchange from the first medium to the second medium is 36 to 84 hours after the start of the culture in the first medium, preferably 48 to 72. Examples thereof include those within the time, more preferably 54 to 66 hours, particularly preferably 57 to 63 hours.
  • medium exchange can be performed by a conventional method.
  • Cells of the first passage cultured in the second medium in step (b) can be cultured while changing the medium to the second medium one or more times as necessary.
  • the first medium is inoculated and passage culture is performed.
  • Cells that have been cultured by passage become cells at the second passage, and the passage time is 1 to 20 days after the replacement of the medium from the first medium to the second medium, preferably 3 to 15
  • the treatment is performed on a day, more preferably 4 to 6 days, depending on the state of the cultured cells, it is 55 to 95% confluent, preferably 65 to 85% confluent, more preferably 67 to 73.
  • the period of medium exchange from the second medium to the second medium is performed every 6 hours to 9 days, preferably every 12 hours to 5 days, more preferably every 18 hours to 2 days, and particularly preferably every 24 hours. Can be illustrated.
  • step (b) and step (c) are repeated. That is, the second passage cell that has been subcultured to the first medium needs to be replaced with the second medium again at the first medium exchange. Human pluripotent stem cells cultured in the above medium need to be subcultured and cultured again in the first medium while substituting the medium in the second medium. The passaged cell becomes the third passage cell.
  • the pluripotent stem cell is obtained by repeating the two steps of the exchange from the first medium to the second medium and the passage to the first medium in order, While increasing one by one, the culture can be continued while maintaining the undifferentiated state.
  • a method using trypsin As a subculturing method when subculturing the human pluripotent stem cells, a method using trypsin, a method using trypsin / EDTA, a method using a mixed solution of trypsin / collagenase / calcium, or dispase is used.
  • Known methods such as a method, a method using collagenase, and a method of cutting out cultured cells as a small population of 100 to several hundred cells using a thin tip such as an injection needle or a plastic pasteur under a microscope. Specifically, after removing the medium in the culture vessel by aspiration, etc., 1 unit / mL dispase is allowed to act at 37 ° C.
  • the pluripotent stem cell cultured by the method of the present invention is 1 to 20%, preferably 3 to 3 at 33 to 40 ° C., preferably 34 to 39 ° C., particularly preferably 37 ° C. in any of the above steps.
  • it is preferably cultured under a high humidity of 75% or more, preferably 85% or more, more preferably 95%, particularly preferably 100%. .
  • the cells cultured by the method of the present invention are cells maintaining undifferentiation, detection of expression of undifferentiation markers using antibodies against various markers (proteins) and / Or a method of judging by non-detection of the expression of differentiation markers, a method of judging by detecting the expression of various markers (genes), a method of observing the morphological characteristics of cells, or a specific differentiation-inducing factor
  • a method for determining whether or not the ability to differentiate into the cells can be demonstrated.
  • the undifferentiated and / or differentiation marker at the protein level When confirming the expression of the undifferentiated and / or differentiation marker at the protein level, it can be confirmed by flow cytometry, immunostaining, ELISA, etc. using the specific antibody of each marker. Expression of the marker Can be confirmed at the gene level by RT-PCR using a specific primer pair, Northern blotting using a specific probe, etc. of each marker gene.
  • cells cultured by the method of the present invention were trypsinized in a PBS solution containing trypsin / EDTA for 30 minutes in 1 mL of 10% goat serum.
  • an anti-mouse antibody of the marker protein of interest After suspension, it is centrifuged and then incubated with an anti-mouse antibody of the marker protein of interest for 30 hours, after which the cultured cells are washed three times with PBS containing 1% goat serum, and AlexaFluor-conjugated goat anti-goat
  • An example is a method of reacting with a mouse IgG antibody for 30 minutes, washing 3 times with PBS containing 1% goat serum, and determining resuspended cells using an appropriate flow cytometry instrument.
  • cells cultured by the method of the present invention are fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS, washed with PBS several times, Triton X, etc. After increasing the permeability of cultured cells with 10% goat serum and blocking, immunostain with the target marker protein mouse antibody, reacted with AlexaFluor-labeled goat anti-mouse IgG, and determined by fluorescence microscopy A method can be illustrated.
  • PFA paraformaldehyde
  • alkaline phosphatase staining in which alkaline phosphatase is visualized using an appropriate kit such as FastRed substrate kit (manufactured by Sigma), which is fixed for 5 minutes and washed, can be exemplified.
  • the method of observing and confirming the morphological characteristics of the cells is that the boundary between the cells is unclear, the cells have almost no nuclei and almost no cytoplasm, and the outline of the cell population (colony) is clear and round.
  • the undifferentiated state is maintained with the indication that there are many colonies with slightly elevated cells and that no fibroblast-like cells or nerve-like cells appear from the margin of the colonies. Can be determined.
  • BMP4 bone morphogenetic factor 4
  • a method for determining whether or not cells cultured by the method of the present invention maintain undifferentiation depending on whether or not the ability to differentiate into specific cells can be exhibited by stimulation with the specific differentiation-inducing factor For example, when bone morphogenetic factor 4 (BMP4) is added to the medium, a method for determining that undifferentiation is maintained when the cells differentiate into epithelial cells can be mentioned.
  • BMP4 bone morphogenetic factor 4
  • the culture container used in the maintenance culture method of the present invention is not particularly limited as long as it is a container capable of maintaining and culturing the pluripotent stem cells used in the present invention.
  • flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes examples include tissue culture dishes, multi dishes, microplates, microwell plates, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and the like.
  • the present invention provides a kit for culturing human pluripotent stem cells while maintaining an undifferentiated state.
  • the kit of the present invention comprises an activin-containing supplement, an activin-free supplement, and a basal medium component for human pluripotent stem cells, and the components constituting each composition are individually or partially packaged Including mixing and packaging two or more compositions.
  • the kit for culturing human pluripotent stem cells further detects an antibody against undifferentiated and / or differentiation marker protein and an undifferentiated and / or differentiation marker gene for determining the undifferentiation of human pluripotent stem cells. Primers, probes, and the like can also be included.
  • ES cell lines and iPS cell lines which are pluripotent stem cells used in the examples, were distributed according to government guidelines and used for experiments. Other cell lines are also stored at the National Institute of Biomedical Innovation and can be distributed under certain conditions.
  • the human ES cell line KhES-1 had the strongest adhesion ability for laminin and fibronectin, and the adhesion ability of collagen and ceratin was weak regardless of the concentration (see FIG. 1 (a)).
  • bovine albumin Bovine serum albumin: BSA
  • BSA Bovine serum albumin
  • ES cells when bovine albumin or recombinant human albumin (manufactured by rHSA Millipore) and / or oleic acid are added using undifferentiated markers SSEA-4, TRA-1-60, Nanog and differentiation marker SSEA-1 We decided to examine how the maintenance of the undifferentiated state is affected. When oleic acid and albumin were added, they were added in the form of oleic acid-conjugated albumin.
  • BSA and oleic acid are replaced with oleic acid-conjugated BSA (medium condition 1), rHSA alone (medium condition 2), oleic acid-conjugated rHSA (medium condition 3), and the hESF9 medium.
  • the H9 strain (WA09) was cultured using a medium to which none of BSA, rHSA, and oleic acid was added as a negative control (medium condition 4).
  • the cultured H9 strain (WA09) was subcultured for 1 passage in hESF9 medium, fluorescent immunostaining was performed, and the positive rate of the expressed cells was analyzed.
  • the cells were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS at room temperature for 15 minutes, blocked with bovine serum, then anti-SSEA-4 antibody (Abcam) and AlexaFluor-labeled anti-mouse IgG (Invitrogen) Using anti-TRA-1-60 antibody (Abcam) and AlexaFluor-labeled anti-mouse IgM (manufactured by Invitrogen), anti-SSEA-1 antibody (manufactured by Abcam) and AlexaFluor-labeled anti-mouse IgM (manufactured by Invitrogen) After immunostaining and blocking with bovine serum containing Triton X, immunostaining was performed with anti-Nanog antibody (manufactured by Cell Signaling) and anti-OCT4 antibody (manufactured by Santa Cruz), and AlexaFluor labeled secondary It reacted with the antibody and observed under a fluorescence microscope.
  • PFA para
  • the H9 strain (WA09) cultured cells at the third passage were confirmed by fluorescent immunostaining using undifferentiated markers SSEA-4, Tra1-60, Nanog, and differentiation markers SSEA-1.
  • cryopreserved H9 strain (WA09) is a 0.1% gelatin (Embryomax, Millipore) coated flask (Corning) and Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal calf serum. Then, mouse embryo-derived fibroblasts (Millipore) whose cell growth was stopped with mitomycin C were seeded as feeder cells, 1 mM L-glutamine (21-51-016, GIBCO), 0.
  • the solution was aspirated and removed immediately before cell seeding, and (2) 10 ⁇ g / mL recombinant human insulin (19278-5ML, Sigma), (3) 5 ⁇ g / mL recombinant human transferrin (apo) ( (T 2252, Sigma), (4) 10 ⁇ M 2-mercaptoethanol (M 7522, Sigma), (5) 10 ⁇ M 2-ethanolamine (E 0135, Sigma), (6) 20 nM Sodium selenate (S 9133, manufactured by Sigma), (7) 9.4 ⁇ g / mL oleic acid (O-1383-5G, manufactured by Sigma) to 1 mg / mL recombinant human albumin Combined rHSA-conjugated oleic acid, (8) 8 ng / mL basic FGF (manufactured by Katayama Kagaku Co., Ltd.), a supplement consisting of 8 factors, and 2 ng / mL activin (N-338 AC / CF, manufactured by R & D
  • the H9 strain (WA09) maintained in the KSR-supplemented medium is removed, and after the medium is allowed to act, 1 unit / mL dispase is allowed to act at 37 ° C. for 2 minutes, and then the dispase is removed.
  • the medium solution collect the cell population using a scraper or the like, centrifuge at 300 rpm for 1 minute, disperse in the solution in the first medium, centrifuge again, disperse in the first medium, The first passage culture was started.
  • the medium was replaced with the second medium. Further, every 24 hours, the medium was changed to the second medium three times, and the medium of the cultured H9 strain (WA09) was cultured on the third day after the medium change from the first medium to the second medium. 1 unit / mL dispase was allowed to act at 37 ° C. for 2 minutes, and then the dispase was removed, and the cell population was collected with the above-mentioned first medium solution of the present invention using a scraper or the like at 300 rpm.
  • the mixture was dispersed with the first medium solution, centrifuged again, and then dispersed into the first medium to transfer (passage), and the second passage culture was performed.
  • the passage at the second passage is on the 3rd and 4th days, and after that, the passage is on the 5th day.
  • the second passage H9 strain (WA09) subcultured to the first medium was replaced with a second medium 60 hours after the start of the culture in the first medium. After the medium was changed 5 times with the second medium, on the 5th day after the medium change from the first medium to the second medium, the medium was subcultured to the first medium again, and the third culture was performed. Thereafter, the steps of subculture to the first medium and medium exchange to the second medium were repeated, and the culture was continued.
  • FIG. 6 is a photograph of cells in the 1st to 6th passages of H9 strain (WA09) cultured cells cultured by the above method, observed under a phase contrast microscope.
  • the cell-cell boundary which is a characteristic of undifferentiated cells, is unclear, the cells have almost no nucleus and almost no cytoplasm, and the outline of the cell population (colony) is round and clear.
  • colony the outline of the cell population
  • H9 strain (WA09) cultured cells obtained by culturing the H9 strain (WA09) by the above method SSEA-3, SSEA-4, TRA-2-54, TRA-1-60, TRA-1-80, And CD90 (manufactured by BD), SSEA-1, CD105 (manufactured by BD), CD56 (manufactured by BD), and A2B5 (manufactured by Millipore) as differentiation markers, and the flow cytometry method for undifferentiation.
  • HLA-abc manufactured by BD was used to confirm whether the cells were derived from human.
  • H9 strain (WA09) cultured cells at the fifth passage the cells on the fifth day from the last passage were dispersed in a PBS solution containing trypsin / EDTA, and the cells were treated with 1 mL of 10% bovine serum (high clone). And then centrifuged for 30 minutes, and then incubated with each marker mouse antibody (Abcam) for 30 minutes.
  • the cultured cells were washed 3 times with PBS containing 1% bovine serum and reacted with AlexaFluor-conjugated anti-rat IgM, goat anti-mouse IgG, IgM antibody (Invitrogen) for 15 minutes.
  • the cultured cells were washed three times with PBS containing 1% bovine serum, and the resuspended cells were analyzed using a BD FACSCanto TM flow cytometer (BD, NJ USA). The results are shown in FIG.
  • the fibronectin-containing first medium and the fibronectin-containing second medium are replaced with the fibronectin-containing first medium and the second medium described in the fibronectin coating section, and the fibronectin concentration is changed.
  • the cells were cultured in the same manner as the fibronectin coating except that the cells were cultured in each well.
  • the area of 1 well of the used plate was 9.6 cm 2 , and 3 mL of the medium was added.
  • FIG. 8 shows a photomicrograph after passage of the cultured cells of the strain H9 (WA09) to a serum-free medium. From the appearance of the cells, it was judged that undifferentiation was most maintained when 80 ⁇ g / well of fibronectin was added. It was confirmed that fibronectin is effective in the method of the present invention even if it is added to the basal medium together with other supplement components instead of coating the culture vessel. From these results, it was confirmed that the human pluripotent stem cells maintained undifferentiated state even after repeated passage by using the culture method of the present invention.
  • the human iPS cell Tic strain (JCRB1331) was dispersed in the first medium containing the protein kinase C inhibitor and cultured. Sixty hours after the start of cultivation of the Tic strain, the medium was replaced with the second medium containing the protein kinase C inhibitor. Furthermore, the medium was changed twice every 24 hours, and fixed with 4.5 mM citric acid, 2.25 mM sodium citrate, 3 mM sodium chloride, 65% methanol and 4% paraformaldehyde for 5 minutes on the 4th day after the start of the culture. Thereafter, alkaline phosphatase staining was performed using a FastRed substrate kit (manufactured by Sigma) according to the manufacturer's guidelines. The results are shown in FIG.
  • FIG. 1 A photograph on the fourth day after the start of the cultivation of the Tic strain is shown in FIG.
  • PLC myristoylated protein kinase C

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Abstract

　本発明の課題は、従来方法より効率のよい、未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養する方法やそのためのキットを提供することにあり、（ａ）アクチビンを含む多能性幹細胞用培地である第一の培地でヒト多能性幹細胞を培養し、（ｂ）前記第一の培地を、アクチビンを含まない多能性幹細胞用培地である第二の培地に交換してヒト多能性幹細胞を培養し、（ｃ）前記第一の培地でヒト多能性幹細胞を継代培養し、その後順次上記（ｂ）及び（ｃ）を繰り返した場合に、実験者の培養技術の習熟度にかかわらず幹細胞の多能性が高率で維持されることが確認された。

Description

ヒト多能性幹細胞の培養方法
　本発明は、未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養する方法やそのためのキット、詳しくは、多能性幹細胞用基礎培地にアクチビン含有サプリメントを添加した第一の培地でヒト多能性幹細胞を培養するステップ（ａ）の後に、前記第一の培地を、多能性幹細胞用基礎培地にアクチビン不含サプリメントを添加した第二の培地に交換してヒト多能性幹細胞を培養するステップ（ｂ）と、前記第一の培地にヒト多能性幹細胞を継代培養するステップ（ｃ）とを、（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｂ）（ｃ）・・・と繰り返すことで、未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養する方法やそのためのキットに関する。
　ＥＳ細胞等の多能性幹細胞は様々な組織に分化することが可能であるため、組織分化過程の解明モデルや再生医療などへの応用が考えられている。分化誘導因子の機能・影響を正確に解析するためには、細胞の分化を制御することが重要である。
　幹細胞の未分化性の維持方法に関しては、多能性幹細胞をｎ軸回転（ｎは２以上の整数）して前記多能性幹細胞の分化を抑制しながら前記多能性幹細胞を培養するステップを備えた多能性幹細胞の培養方法（例えば特許文献１参照）や、ＴＧＦ－βを含有することを特徴とする間葉系幹細胞の多分化能維持用培地（例えば特許文献２参照）や、幹細胞の初代培養及び継代培養を無血清で行うことを可能にする基礎培地に、５～１０％濃度のパネキシンと、１～１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦと、１～１００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、１～１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、１～１０００μｇ／ｍＬのビタミンＣとを混合してなる無血清培地（例えば特許文献３参照）や、フィーダー細胞の非存在下、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含有し、且つ動物由来アルブミンを含有しない無血清培地中で胚性幹細胞を浮遊培養することを特徴とする、胚性幹細胞の維持方法（例えば特許文献４参照）や、低分子化合物又はその塩化物を有効成分として含有する組織幹細胞増殖剤（例えば特許文献５参照）や、インドール誘導体等の低分子化合物を有効成分とする幹細胞分化抑制剤（例えば特許文献６参照）や、（ａ）標準培地、（ｂ）血清アルブミン、（ｃ）トランスフェリン、（ｄ）脂質及び脂肪酸源、（ｅ）コレステロール、（ｆ）還元剤、（ｇ）ピルビン酸塩、（ｈ）ＤＮＡ及びＲＮＡ合成用ヌクレオシド、（ｉ）基質細胞、組織細胞又は器官細胞の増殖及び発生を刺激する少なくとも１種の成長因子、及び（ｊ）少なくとも１種の細胞外マトリックス材料を細胞の培養に効果的な量を含んでおり、無血清又は低血清である胚性幹細胞系を含む細胞の長期増殖及び発生用培地（例えば特許文献７参照）が提案されている。また、脱落膜由来細胞又は該細胞由来の細胞外マトリクスの存在下で多能性幹細胞を培養することを特徴とする、多能性幹細胞の培養方法（例えば特許文献８参照）も提案されているが、フィブロネクチン上では細胞増殖は僅かに認められたものの脱落膜由来間葉系細胞の細胞外マトリクス上での細胞増殖に比べるとその程度は著しく低かったことが報告されている。
　本発明者らは、フィーダー細胞なしで、ＥＳ細胞をタイプＩコラーゲン被覆フラスコで、無血清条件下で未分化性を維持したままＥＳ細胞を長期に培養しうる無血清培地用の培地、及びこのような培地を製造するための基礎培地（例えば特許文献９参照）や、ｉ）タンパク質より成る基礎的な培養支持体にてコートした培養容器を用い、該培養容器の中でウシインスリン、ヒトトランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、２－メルカプトエタノール、脂肪酸除去したウシアルブミンと複合させたオレイン酸より構成され、更に線維芽細胞増殖因子、ヘパリンやアスコルビン酸又はリン酸化アスコルビン酸、又はこれらの誘導体を添加した細胞培養培地により霊長類胚性幹細胞を調製する工程、及びii）該霊長類胚性幹細胞を未分化状態で維持する工程、より構成される、フィーダー細胞や血清のない細胞培養条件で、霊長類の胚性幹細胞を維持するための方法（例えば特許文献１０参照）を開発してきた。また、無血清培地の開発に当たって各種マトリックス成分については、ラミニンやフィブロネクチンがマウスＥＳ細胞の未分化維持状態に対して抑制的に働き、分化を促進する方向へと働くことが確認されていた（例えば非特許文献１参照）。
　さらに、本発明者らは、Ｓｈｅｆ系のヒトＥＳ細胞とＨＵＥＳ－１株を用いてヒトＥＳ細胞において、Ｉ型コラーゲンをコートした場合に維持培養できることを確認し、また、ＨＥＰＥＳを無血清培地に添加すると非常にヒトＥＳ細胞の維持に悪影響を与えることを確認し（例えば非特許文献２参照）、また、ＥＳ細胞の増殖作用を促進するＦＧＦ－２の作用を補佐することが知られているヘパリンを、ＦＧＦ－２の非存在下で添加してもＥＳ細胞の増殖作用を促進することを報告し（例えば非特許文献３参照）、アクチビンを入れると、ＥＲＫ（extracellular signal-regulated kinases）が活性化され、神経又は中内胚葉への分化誘導が促進されるが、ＥＲＫの抑制剤を入れると未分化な状態を維持することができることを確認し（例えば非特許文献４参照）、さらにヒトＥＳ細胞についての基本的な培養方法についてまとめている（例えば非特許文献５参照）。
特開２０１０－１９３９１０号公報 特開２０１０－０９４０６２号公報 特開２００８－１４８６４３号公報 特開２００７－２２８８１５号公報 特開２００６－１８０７６３号公報 特開２００５－０１３１５２号公報 特表平８－５０８８９１号公報 特開２０１０－１６６９０１号公報 国際公開ＷＯ２００５／０６３９６８号パンフレット 特表２００９－５４２２４７号公報
第５２回マトリックス研究会大会２００５年大分Ｏ－０７　マウスＥＳ細胞の分化制御におけるマトリックス成分の機能解析 PNAS, vol.105, no.36, 13409-13414 In Vitro Cell.Dev. Biol.- Animal (2010) 46:573-576 Stem Cell Res．2010 Tiss. Cult. Res Commun.27;139-147(2008)
　本発明の課題は、従来方法より効率のよい、未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養する方法やそのためのキットを提供することにある。
　上記の通り、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞を長期に培養しうる無血清培地等の開発は、多方面において進められてきたが、多能性幹細胞をこれらの培地で増殖させることは、細胞死が高い頻度で起こったり、多能性が培養過程で失われたりすることがあり、実験者の勘やノウハウに頼ることも多く、不可能ではないものの高度の培養技術を要するものとなっていた。
　また、従来の培地には、動物由来の原料が通常含まれており、例えば、ウシ血清アルブミン、ブタ由来Ｉ型コラーゲン等を使用することは供給量が限られ高コストである点で問題があった。また上記動物由来の原料は通常非加熱製剤であることから、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の原因とされるプリオンや、ウイルス等の病原体や異種成分混入の可能性があるので安全性や免疫原性に問題があり、また、作製された培地のロットごとにばらつきが生じるので、未分化状態を維持したまま培養できる確率を低くする原因の一つであると考えられてきた。
　これらの知見に基づき、本発明者らは、動物由来の成分を代替又は削除することにより、安全性が高く、ロットによるばらつきがない多能性幹細胞を、未分化状態を維持したまま培養できる培地の調製を試みてきた。例えば、動物由来の成分を遺伝子組換え技術により作製された組換え体（リコンビナント）に代替する場合には、リコンビナントの成分が従来の動物由来成分とは異なる構造を有する可能性があることや、免疫原性においても従来の動物由来の原料とは異なる挙動を示す可能性があることが知られていたため、一つひとつの成分について慎重に検討を行ってきた。上記の通り、アクチビンが添加された培地にＥＲＫの抑制剤を入れると未分化な状態を維持することができることが確認されていたため、アクチビンと他の成分との関係において詳細な検討を続けていたところ、驚くべきことに、（ａ）多能性幹細胞用基礎培地にアクチビン含有サプリメントを添加した第一の培地でヒト多能性幹細胞を培養し、（ｂ）前記第一の培地を、多能性幹細胞用基礎培地にアクチビン不含サプリメントを添加した第二の培地に交換してヒト多能性幹細胞を培養し、（ｃ）前記第一の培地でヒト多能性幹細胞を継代培養し、その後順次上記（ｂ）及び（ｃ）を繰り返した場合には、実験者の培養技術の習熟度にかかわらず幹細胞の多能性が高率で維持されることを見いだした。これまで実験室で５～６人中１人しか従来公知の方法で多能性幹細胞の維持培養ができるものがいなかったのに対し、かかる方法を用いた場合５～６人中４～５人以上の確率で、多能性幹細胞の未分化性を維持して長期継代することができるようになったことを確認した。本発明者らは、さらに多能性幹細胞の未分化性の維持率を高める成分について引き続き検討を進めたところ、培地にプロテインキナーゼＣ阻害剤を添加すると、細胞の未分化性がより高い確率で維持され、一部の分化した細胞を機械的に除去する作業をする必要がほとんどなくなった。以上の知見をもとに本発明のヒト多能性幹細胞を培養する方法を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、［１］（ａ）多能性幹細胞用基礎培地にアクチビン含有サプリメントを添加した第一の培地でヒト多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）前記第一の培地を、多能性幹細胞用基礎培地にアクチビン不含サプリメントを添加した第二の培地に交換してヒト多能性幹細胞を培養するステップ；（ｃ）前記第一の培地にヒト多能性幹細胞を継代培養するステップ；を（ａ）ステップの後、（ｂ）及び（ｃ）ステップを順次繰り返すことを特徴とする未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養する方法や、［２］サプリメントが、フィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及びオレイン酸抱合アルブミンを含むことを特徴とする上記［１］記載の方法や、［３］フィブロネクチンが、培養容器の内側にコートすることなく用いられることを特徴とする上記［２］記載の方法や、［４］さらに、プロテインキナーゼＣ阻害剤が、サプリメントに含まれることを特徴とする上記［２］又は［３］記載の方法や、［５］基礎培地が、１又は２種類以上の糖、１又は２種類以上の無機塩、１又は２種類以上のアミノ酸、１又は２種類以上のビタミン、及び微量成分を含む化学合成培地であることを特徴とする上記［１］～［４］のいずれか記載の培養方法や、［６］基礎培地が以下の表１に示されるｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地であることを特徴とする上記［１］～［４］のいずれか記載の培養方法に関する。
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　また、本発明は、［７］アクチビン含有サプリメント、アクチビン不含サプリメント及びヒト多能性幹細胞用基礎培地成分を備えた、未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養するためのキットや、［８］サプリメントが、フィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及びオレイン酸抱合アルブミンを含むことを特徴とする上記［７］記載のキットや、［９］フィブロネクチンが、サプリメントに添加されていることを特徴とする上記［７］又は［８］記載のキットや、［１０］さらに、プロテインキナーゼＣ阻害剤が、サプリメントに含まれることを特徴とする上記［７］～［９］いずれか記載のキットや、［１１］基礎培地が、１又は２種類以上の糖、１又は２種類以上の無機塩、１又は２種類以上のアミノ酸、１又は２種類以上のビタミン、及び微量成分を含む化学合成培地であることを特徴とする上記［７］～［１０］いずれか記載のキットや、［１２］基礎培地が上記表１に示されるｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地であることを特徴とする上記［７］～［１０］いずれか記載のキットや、［１３］さらに、未分化及び／又は分化マーカーに対する抗体、プローブ、又はプライマーを備えた上記［７］～［１２］いずれか記載のキットに関する。
　本発明の方法を用いることにより、未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養・増殖することができ、かかる未分化状態を維持した多能性幹細胞を適当な条件下で処理を行った場合には、目的の細胞に分化させることができる。
コラーゲンＩ、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチンに対する各細胞の接着能を測定した結果を示した図である。ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ－１株（ａ）、ヒトｉＰＳ細胞Ｔｉｃ株(ＪＣＲＢ１３３１)（ｂ）、と胚性がん細胞ＰＡ－１株（ＪＣＲＢ９０６１）（ｃ）の結果をそれぞれ示す。 ｈＥＳＦ９培地に、ＢＳＡ若しくはｒＨＳＡ、及び／又はオレイン酸を添加した培地でＥＳ細胞Ｈ９株（ＷＡ０９）株を培養した細胞を蛍光免疫染色して、ＴＲＡ－１－６０、ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－４、Ｎａｎｏｇ発現細胞の陽性率を解析したグラフである。培養条件（１）で培養した場合の値を「１」として、その値に対しての変化率を示した。 オレイン酸抱合ｒＨＳＡを添加した培地でＥＳ細胞Ｈ９株（ＷＡ０９）を培養し、ＴＲＡ－１－６０、ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－４、Ｎａｎｏｇで免疫染色した場合の顕微鏡写真である。 ｈＥＳＦ-９からヘパリンを除いた培地で、培養を行ったＨ９株（ＷＡ０９）の２継代目の細胞の様子を示す。 ＥＳ細胞Ｈ９株（ＷＡ０９）を、アクチビン含有培地で培養をした場合（ａ）とアクチビン不含培地に培地交換した場合（ｂ）の顕微鏡写真である。 本発明の方法により培養されたＥＳ細胞Ｈ９株（ＷＡ０９）の１～６継代目の細胞の顕微鏡写真を示す図である。 本発明の方法により培養されたＥＳ細胞Ｈ９株（ＷＡ０９）の５継代目における未分化・分化マーカーの発現を示す図である。ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－２－５４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８０、ＣＤ９０は未分化マーカーの発現を示し、ＳＳＥＡ－１、ＣＤ１０５、ＣＤ５６、Ａ２Ｂ５は分化マーカーの発現を示す。 培地に０、２０、４０、８０、１６０、３２０μｇ／ウェルのフィブロネクチンを添加して本発明の方法にて培養した場合の細胞の状況を示す。 ０、１、２．５、５、１０μＭのミリストイル化プロテインキナーゼＣペプチドインヒビターを添加した培地で培養した細胞の状況を示す。
　本発明の未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養する方法としては、（ａ）多能性幹細胞用基礎培地にアクチビン含有サプリメントを添加した第一の培地でヒト多能性幹細胞を培養するステップ；（ｂ）前記第一の培地を、多能性幹細胞用基礎培地にアクチビン不含サプリメントを添加した第二の培地に交換してヒト多能性幹細胞を培養するステップ；（ｃ）前記第一の培地にヒト多能性幹細胞を継代培養するステップ；を（ａ）ステップの後、（ｂ）及び（ｃ）ステップを順次繰り返す方法であれば特に制限されず、また、本発明の未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養するためのキットとしては、サプリメント及び多能性幹細胞用基礎培地成分を備えたキットであれば特に制限されず、ここで「培地」とは、細胞を培養できる「培地成分」に水を添加した状態のものをいう。また、ここで「未分化状態を維持したまま」とは、自己複製能を維持し、生体に存在する全ての種類の細胞へと分化できる能力を有するという多能性細胞の特徴を維持した状態をいう。
　本発明においてはヒトの多能性幹細胞を対象とし、多能性幹細胞としては、初期胚より単離される胚性幹細胞（embryonic stem cells：ＥＳ細胞）や、胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（embryonic germ cells：ＥＧ細胞）（例えばProc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95:13726-31参照）や、出生直後の精巣から単離される生殖細胞系列幹細胞（germline stem cells：ＧＳ細胞）（例えば、Nature. 2008, 456:344-9参照）や、腸骨骨髄、顎骨骨髄等の骨髄由来の幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞などの間葉系幹細胞、及び皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入することで、被検体自身の体細胞の脱分化を誘導し、ＥＳ細胞同様の多能性を有する体細胞由来人工多能性幹細胞（若しくは、誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell; ｉＰＳ細胞））を挙げることができるが、具体的には、ヒトＥＳ細胞Ｈ９株（ＷＡ０９）、ヒトＥＳ細胞Ｈ１（ＷＡ０１）株（National Stem Cell bank、WISC Bank）や、ＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３（いずれも京大再生研付属幹細胞医学研究センター）や、ＨＥＳ３、ＨＥＳ４、及びＨＥＳ６（National Stem Cell bank、モナッシュ大学）などのヒトＥＳ細胞や、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ－Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（理研バイオリソースセンター、京都大学）や、Ｔｉｃ(ＪＣＲＢ１３３１株)、Ｄｏｔｃｏｍ（ＪＣＲＢ１３２７株)、Ｓｑｕｅａｋｙ(ＪＣＲＢ１３２９株)、及びＴｏｅ（ＪＣＲＢ１３３８株)、 Ｌｏｌｌｉｐｏｐ（ＪＣＲＢ１３３６株)（以上成育医療センター、医薬基盤研究所難病・疾患資源研究部・ＪＣＲＢ細胞バンク）や、ＵＴＡ－１株及びＵＴＡ－１－ＳＦ－２－２株（いずれも東京大学）や、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106）等のｉＰＳ細胞を例示することができる。
　本発明に用いられる多能性幹細胞用基礎培地としては、本発明のサプリメントを添加して、未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養できる培地であれば特に制限されないが、調製が容易であり、ロットごとのばらつきを防ぐ点から化学合成培地が好ましく、１又は２種類以上の糖（類）と、１又は２種類以上の無機塩（類）、１又は２種類以上のアミノ酸（類）、１又は２種類以上のビタミン（類）、及び１又は２種類以上の微量成分（類）を含むことが好ましく、また、薬剤感受性試験に使用するためにカナマイシン等の抗生物質を適宜含むこともできる。
　上記糖類としては、具体的には、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類や、スクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類を挙げることができるが、中でもグルコースが特に好ましく、これら糖類は、１又は２以上組み合わせて添加することもできる。
　上記無機塩類としては、具体的には、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸銅五水和物、硝酸鉄(III)九水和物、硫酸鉄(II)七水和物、塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム二水和物、硫酸亜鉛七水和物から選ばれる１種又は２種以上の無機塩（類）を挙げることができるが、多能性幹細胞の未分化状態の維持に有利に作用する成分であればいずれの無機塩類又はその組合せも用いることができる。
　上記アミノ酸類としては、具体的には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン等から選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸（類）、好ましくはＬ－体のアミノ酸とそれらの誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができる。例えば、上記アルギニンとしては、Ｌ－塩酸アルギニン、Ｌ－アルギニン一塩酸塩等のアルギニンの派生物を挙げることができ、上記アスパラギン酸としては、Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物、Ｌ－アスパラギン酸一水和物、Ｌ－アスパラギン酸カリウム、Ｌ－アスパラギン酸マグネシウム等のアスパラギン酸の派生物を挙げることができ、上記システインとしては、Ｌ－システイン二塩酸塩、Ｌ-システイン塩酸塩一水和物等のシステインの派生物や、Ｌ－リジン塩酸塩等のリジンの派生物を挙げることができ、上記グルタミン酸としては、Ｌ－グルタミン酸一ナトリウム塩等のグルタミンの派生物を挙げることができ、上記アスパラギンとしては、Ｌ－アスパラギン一水和物等のアスパラギンの派生物を挙げることができ、上記チロシンとしては、Ｌ－チロシン二ナトリウム二水和物等のチロシンの派生物を挙げることができ、上記ヒスチジンとしては、ヒスチジン塩酸塩、ヒスチジン塩酸塩一水和物等のヒスチジンの派生物を挙げることができ、上記リジンとしては、Ｌ－リジン塩酸塩等のリジンの派生物を挙げることができる。
　上記ビタミン類としては、具体的には、アスコルビン酸、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ナイアシン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）から選択される１種又は２種以上のビタミン（類）と、これらの成分各々の誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができる。例えば、上記アスコルビン酸としては、アスコルビン酸２－リン酸エステル（Ascorbic acid 2-phosphate）、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム、リン酸アスコルビルアミノプロピル、アスコルビン酸リン酸ナトリウム等のアスコルビン酸の派生物を挙げることができ、コリンとしては、塩化コリン等のコリンの派生物を挙げることができ、ナイアシンとしては、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ニコチニックアルコール等のナイアシンの派生物を挙げることができ、パントテン酸としては、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、パンテノール等のパントテン酸の派生物を挙げることができ、ピリドキシンとしては、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、リン酸ピリドキサール、ピリドキサミン等のピリドキシンの派生物を挙げることができ、チアミンとしては、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硫酸エステル塩、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミン、ベンフォチアミン等のチアミンの派生物等を挙げることができ、また、上記アスコルビン酸は添加されることが好ましい。
　上記微量成分としては、多能性幹細胞の未分化状態の維持に有利に作用する成分であることが好ましく、グルタチオン、ヒポキサンチン、リポ酸、リノレン酸、フェノールレッド、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、ＮａＨＣＯ３等通常培地成分として用いられている成分及びその誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができ、例えば、プトレシン二塩酸、ピルビン酸ナトリウム等を挙げることができる。
　上記ヒト多能性幹細胞用基礎培地の具体例としては、市販のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆ１２培地等の公知の化学合成培地などの培地、及びＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭとＦ１２培地を１：１で混合した培地）等のこれらの培地のいずれか２以上を適当な割合で混合した培地や、これらの培地に上記アスコルビン酸、好ましくはアスコルビン酸２－リン酸エステルを添加した培地を例示することができ、特にアニマルプロダクトフリーの基礎培地として、上記表１に示される組成の基礎培地（以下、「ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地」ともいう）を好適に例示することができる。
　また上記の個々の培地成分の濃度（含量）は、ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地の個々の成分を例にとると、上記ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地組成に記載されている濃度を１００とした場合に、各成分について０～２００の範囲内の濃度、好ましくは４０～１６０の範囲内の濃度、より好ましくは８０～１２０の範囲内の濃度、さらにより好ましくは９０～１１０の範囲内の濃度を例示することができる。例えば、Ｌ－アルギニンの場合、０～１００ｍｇ／Ｌの濃度、好ましくは２０～８０ｍｇ／Ｌの濃度、より好ましくは４０～６０ｍｇ／Ｌの濃度、さらにより好ましくは４５～５５ｍｇ／Ｌの濃度を好適に例示することができる。
　本発明の方法に用いられるサプリメントとしては、上記多能性幹細胞用基礎培地に添加することで、未分化性を維持したままヒト多能性幹細胞を培養することができる培地となるものであれば特に制限されず、具体的には、フィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、セレン、ＦＧＦ－２、オレイン酸抱合アルブミン、プロテインキナーゼＣ阻害剤等の成分を含むものを例示することができる。また、サプリメントの使用形態としては、１又は２以上の上記成分からなるサプリメントを複数個に分別しておいてもよいし、多数の上記成分を含む一つのサプリメントとしてまとめておくこともできる。
　本発明の方法に用いられる第一の培地としては、上記多能性幹細胞用基礎培地にアクチビン含有サプリメントを添加して、ヒト多能性幹細胞を培養することができる培地であれば特に制限されず、本発明の方法に用いられる第二の培地としては、上記多能性幹細胞用基礎培地にアクチビン不含サプリメントを添加して、ヒト多能性幹細胞を培養することができる培地であれば特に制限されない。上記アクチビン含有サプリメントとしては、アクチビンを含むサプリメントであれば特に制限されないが、フィブロネクチンを含有するものが好ましい。上記サプリメントとしては、フィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、セレン、ＦＧＦ－２、アルブミン、オレイン酸、プロテインキナーゼＣ阻害剤から選ばれる１又は２以上の成分を含むサプリメントや、フィブロネクチンと；インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、セレン、ＦＧＦ－２、アルブミン、オレイン酸、プロテインキナーゼＣ阻害剤から選ばれる１又は２以上の成分と；の組合せを含むサプリメントを挙げることができる。例えば、フィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、セレン、ＦＧＦ－２、アルブミン、及びオレイン酸を含むサプリメントや、これらにさらにプロテインキナーゼＣ阻害剤を含むサプリメントを好適に例示することができる。
　上記第一の培地において、フィブロネクチンは、上記多能性幹細胞用基礎培地に添加するサプリメントを構成する一成分として、細胞と培養容器との接着性を高めるために培養容器の内側にコートして用いることができ、あるいは、培養容器の内側にコートすることなく、他のサプリメント成分と共に基礎培地に添加して用いることもできる。具体的には、フィブロネクチンを培養容器にコート後に、アクチビンと；フィブロネクチンを除く上記サプリメントと；を基礎培地に添加することにより、第一の培地（以下、「第一の培地Ｉ」ともいう）を調製することができるが、フィブロネクチンを培養容器にコート後に、アクチビンと；インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、セレン、ＦＧＦ－２、アルブミン、及びオレイン酸を合わせ含むものと；の組合せとを基礎培地に添加することにより第一の培地Ｉを調製することが好ましく、さらにプロテインキナーゼＣ阻害剤が添加されているものがより好ましい。また、フィブロネクチンを培養容器の内側にコートすることなく用いる場合、アクチビンと上記サプリメントとを共に基礎培地に添加することにより、第一の培地（以下、「第一の培地II」ともいう）を調製することができる。
　第二の培地は、フィブロネクチンを培養容器の内側にコートした後に、基礎培地にフィブロネクチンを除く上記サプリメントを添加することにより、第二の培地（以下、「第二の培地Ｉ」ともいう）を調製することができるが、フィブロネクチンを培養容器にコート後に、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、セレン、ＦＧＦ－２、アルブミン、及びオレイン酸を添加することにより第二の培地Ｉを調製することが好ましく、さらにプロテインキナーゼＣ阻害剤が添加されているものがより好ましい。また、上記サプリメントを基礎培地に添加することにより、第二の培地（以下、「第二の培地II」ともいう）を調製することができるが、フィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、セレン、ＦＧＦ－２、アルブミン、及びオレイン酸を合わせて基礎培地に添加することにより第二の培地IIを調製することが好ましく、さらにプロテインキナーゼＣ阻害剤が添加されているものがより好ましい。そして、上記第一の培地Ｉを用いる場合は上記第二の培地Ｉを用いることが、上記第一の培地IIを用いる場合は上記第二の培地IIを用いることが好ましい。
　上記アクチビン含有サプリメント及び／又はアクチビン不含サプリメントを構成する各成分は、アニマルプロダクトフリーグレードであることが好ましく、アニマルプロダクトフリーグレードの成分としては、動物由来の成分でないが動物由来の成分と同様の作用を有する、遺伝子組換え技術によって人工的に作製・精製された組換え（リコンビナント）タンパク質、化学合成品、植物由来の成分等を挙げることができ、上記リコンビナントタンパク質としては、タグが付加されたもの等、動物由来の成分とは構造が同一でないタンパク質も含めることができ、化学合成品はその誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物を含めることができる。
　上記フィブロネクチンとしては、細胞外マトリックス（extracellular matrix: ＥＣＭ）の一種として知られている、ブタ由来フィブロネクチン、ウシ由来フィブロネクチン、ヒト由来フィブロネクチン等の天然由来のフィブロネクチンや、アニマルプロダクトフリーグレードのフィブロネクチンとして、ウシ型、ブタ型、又はヒト型等の遺伝子組換え体のフィブロネクチンなどを挙げることができる。
　上記フィブロネクチンをコートして用いる場合には、物理的に吸着させたり、培養容器の細胞接着領域に反応性の官能基を導入して化学結合により容器表面（容器の内側）に細胞接着因子を固定化する等の周知の方法を用いることができるが、具体的には、培養容器にフィブロネクチンを含む溶液を、例えば、０．５～５μｇ／ｃｍ２、好ましくは１～３μｇ／ｃｍ２、より好ましくは１．５～２．５μｇ／ｃｍ２の濃度になるように添加し、１時間から１２時間、好ましくは２時間から８時間、より好ましくは３時間から５時間、例えば３７℃にて乾燥させないように静置し、多能性幹細胞を播種する直前に上記溶液を吸引除去する方法を例示することができ、コートされたフィブロネクチン上に、上記多能性幹細胞用基礎培地にアクチビン含有サプリメント又はアクチビン不含サプリメントのフィブロネクチン以外の成分を添加して調製することにより、本発明の第一の培地及び／又は第二の培地を調製することができる。
　上記フィブロネクチンを培地成分として用いる場合には、例えば、１．０～１００μｇ／ｍＬ、好ましくは５～７５μｇ／ｍＬ、好ましくは１０～５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは２５～４５μｇ／ｍＬの濃度になるように、上記アクチビン含有サプリメント及び／又はアクチビン不含サプリメントの一構成成分として、上記ヒト多能性幹細胞用基礎培地に添加することで、本発明に用いられる第一の培地及び／又は第二の培地を調製することができる。
　上記インスリンとしては、ブタ由来インスリン、ウシ由来インスリン、ヒト由来インスリン等の天然由来のインスリンや、アニマルプロダクトフリーグレードのインスリンとしてウシ型、ブタ型、又はヒト型等の遺伝子組換え体のインスリンなどを挙げることができ、特にヒト型の遺伝子組換え体インスリン（リコンビナントヒトインスリン）を好適に例示することができ、１～２０μｇ／ｍＬ、好ましくは５～１５μｇ／ｍＬ、より好ましくは７．５～１２．５μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは９～１１μｇ／ｍＬの終濃度になるように、上記アクチビン含有サプリメント及び／又はアクチビン不含サプリメントの一構成成分として、上記ヒト多能性幹細胞用基礎培地に添加することで、本発明に用いられる第一の培地及び／又は第二の培地を調製することができる。
　上記トランスフェリンとしては、ブタ由来トランスフェリン、ウシ由来トランスフェリン、ヒト由来トランスフェリン等の天然由来のトランスフェリンや、アニマルプロダクトフリーグレードのインスリンとしてウシ型、ブタ型、又はヒト型等の遺伝子組換え体のトランスフェリンなどを挙げることができ、特にヒト型の遺伝子組換え体トランスフェリン（リコンビナントヒトトランスフェリン）を好適に例示することができ、鉄低含有のａｐｏ型のトランスフェリンが鉄と結合しているｈｏｌｏ型のトランスフェリンよりも好ましく、０．１～５０μｇ／ｍＬ、好ましくは１～２０μｇ／ｍＬ、より好ましくは２～１０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは３～７μｇ／ｍＬの終濃度になるように、上記アクチビン含有サプリメント及び／又はアクチビン不含サプリメントの一構成成分として、上記ヒト多能性幹細胞用基礎培地に添加することで、本発明に用いられる第一の培地及び／又は第二の培地を調製することができる。
　上記２－メルカプトエタノールとしては、常法により合成された化学合成品をアニマルプロダクトフリーグレードとして好適に例示することができ、１～２０μＭ、好ましくは５～１５μＭ、より好ましくは７．５～１２．５μＭ、さらに好ましくは９～１１μＭの終濃度になるように、上記アクチビン含有サプリメント及び／又はアクチビン不含サプリメントの一構成成分として、上記ヒト多能性幹細胞用基礎培地に添加することで、本発明に用いられる第一の培地及び／又は第二の培地を調製することができる。
　上記エタノールアミンとしては、２－アミノエタノール、又はモノエタノールアミンとも呼ばれる、常法により合成された化学合成品をアニマルプロダクトフリーグレードとして好適に例示することができ、１～２０μＭ、好ましくは５～１５μＭ、より好ましくは７．５～１２．５μＭ、さらに好ましくは９～１１μＭの終濃度になるように、上記アクチビン含有サプリメント及び／又はアクチビン不含サプリメントの一構成成分として、上記ヒト多能性幹細胞用基礎培地に添加することで、本発明に用いられる第一の培地及び／又は第二の培地を調製することができる。
　上記セレンとしては、セレンとその誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物を含むことができ、常法により化学合成されたセレン酸、セレン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、亜セレン酸水素ナトリウム等をアニマルプロダクトフリーグレードとして例示することができ、セレン酸ナトリウム換算で１～４０μＭ、好ましくは１０～３０μＭ、より好ましくは１５～２５μＭ、さらに好ましくは１８～２２μＭの終濃度になるように、上記アクチビン含有サプリメント及び／又はアクチビン不含サプリメントの一構成成分として、上記ヒト多能性幹細胞用基礎培地に添加することで、本発明に用いられる第一の培地及び／又は第二の培地を調製することができる。
　上記ＦＧＦ-２としては、ｂＦＧＦとしても知られる塩基性の繊維芽細胞成長因子（Fibroblast Growth Factor-2）として、ブタ由来ＦＧＦ-２、ウシ由来ＦＧＦ-２、ヒト由来ＦＧＦ-２等の天然由来のＦＧＦ-２や、アニマルプロダクトフリーグレードのＦＧＦ-２としてウシ型、ブタ型、又はヒト型等の遺伝子組換え体のリコンビナントヒトＦＧＦ-２を挙げることができ、特にヒト型の遺伝子組換え体ＦＧＦ-２（リコンビナントヒトＦＧＦ-２(ｒｈＦＧＦ－２)）を好適に例示することができ、０．１～５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１～２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３～７ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは４～６ｎｇ／ｍＬの終濃度になるように、上記アクチビン含有サプリメント及び／又はアクチビン不含サプリメントの一構成成分として、上記ヒト多能性幹細胞用基礎培地に添加することで、本発明に用いられる第一の培地及び／又は第二の培地を調製することができる。
　上記オレイン酸としては、植物由来のオレイン酸や常法により化学合成されたオレイン酸を挙げることができ、０．１～５０μｇ／ｍＬ、好ましくは５～１５μｇ／ｍＬ、より好ましくは７．５～１１．５μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは９～１０μｇ／ｍＬの終濃度になるように、上記アクチビン含有サプリメント及び／又はアクチビン不含サプリメントの一構成成分として、上記ヒト多能性幹細胞用基礎培地に添加することで、本発明に用いられる第一の培地及び／又は第二の培地を調製することができる。
　上記アルブミンとしては、卵白アルブミン、ブタ由来アルブミン、ウシ由来アルブミン、ヒト由来アルブミン等の天然由来のアルブミンや、アニマルプロダクトフリーグレードのアルブミンとしてウシ型、ブタ型、又はヒト型等の遺伝子組換え体のアルブミンなどを挙げることができ、特にヒト型の遺伝子組換え体アルブミン（リコンビナントヒトアルブミン（ｒＨＳＡ））を好適に例示することができ、０．１～５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５～２．５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．７５～１．５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．９～１．１ｍｇ／ｍＬの終濃度になるように、上記アクチビン含有サプリメント及び／又はアクチビン不含サプリメントの一構成成分として、上記ヒト多能性幹細胞用基礎培地に添加することで、本発明に用いられる第一の培地及び／又は第二の培地を調製することができ、上記オレイン酸の培地への溶解度を増加させ、本発明の作用効果を増大させるために、アルブミンが上記オレイン酸と複合体を形成した形態、すなわちオレイン酸抱合アルブミンとして添加されることが望ましい。
　上記プロテインキナーゼＣ阻害剤としては、プロテインキナーゼＣを阻害することができるペプチドや化合物を挙げることができ、具体的には、ミリストイル化プロテインキナーゼＣペプチドインヒビター（プロメガ社製）や、スタウロスポリン又はスタウロスポリン誘導体であるカルホスチン、４’－Ｎ－ベンゾイルスタウロスポリンや、ビスインドリルマレイミド類、例えば、ビスインドリルマレイミドＩ、イソキノリンスルホニル)－２－メチルピペラジン二塩酸塩 (Ｈ－７)、Ｎ－[２－(メチルアミノ)エチル]－５－イソキノリンスルホンアミド（Ｈ－８）、Ｎ－(２－アミノエチル)－５－イソキノリンスルホンアミド(Ｈ－９)などを例示することができ、上記ミリストイル化プロテインキナーゼＣペプチドインヒビター（プロメガ社製）を用いる場合は、０．５～５μＭ、好ましくは１～２．５μＭの濃度となるように、上記アクチビン含有サプリメントやアクチビン不含サプリメントの一構成成分として、上記ヒト多能性幹細胞用基礎培地に添加することで、ヒト多能性幹細胞の未分化性の維持率をさらに高めることができる。
　上記アクチビンとしては、ヒト、ラット、マウス、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ等の脊椎動物において高い相同性が保たれていることや、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ等ファミリーが存在することが知られているが、アニマルプロダクトフリーグレードのアクチビンとしてヒト型等の遺伝子組換え体のアクチビンなどを挙げることができ、特にヒト型の遺伝子組換え体のアクチビンのうちリコンビナントヒトアクチビンＡを好適に例示することができ、１～４０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１～３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１～１０ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１～３ｎｇ／ｍＬの終濃度になるように、上記アクチビン含有サプリメントの一構成成分として、上記ヒト多能性幹細胞用基礎培地に添加することで、本発明に用いられる第一の培地を調製することができる。
　上記ステップ（ａ）は、上記多能性幹細胞用基礎培地に上記アクチビン含有サプリメントを添加した第一の培地に、ヒト多能性幹細胞を播種して培養するステップであり、供給先で凍結保存された多能性幹細胞は公知の方法により調製後に培養することが好ましい。前記調製方法としては、例えば、ダルベッコのＣａ２＋及びＭｇ２＋不含リン酸緩衝生理食塩水に溶解したＥＤＴＡ中で遊離され、あるいは、トリプシン、遺伝子組換体トリプシン、トリプシン/ＥＤＴＡ、コラゲナーゼ、コラゲナーゼ/トリプシン、ディスパーゼ、アキュターゼ、あるいは、機械的に剥離させ、該遊離された細胞を上記第一の培地（溶液）に回収して細胞懸濁液を調製し、かかる細胞懸濁液を３００～１０００ｒｐｍ程度にて細胞を沈降させて回収後、細胞懸濁液を再び調製することを１又は複数回繰り返す方法や、ゼラチン被覆プレート上に、ウシ胎仔血清、ＤＭＥＭ又はＤＭ／Ｆ１２に、ＫＳＲ（KnockOut Serum Replacement、GIBCO社製）、Ｌ－グルタミン、２－メルカプトエタノール、非必須アミノ酸（類）、及びｂＦＧＦを補充した培地、及び／又は支持細胞（フィーダー細胞）共存下で培養する方法を挙げることができる。本発明の方法を用いることにより、上記、ウシ胎仔血清、ＦＧＦ、フィーダー細胞等の動物由来の成分に含まれうる不純物が、長期継代を続けるうちに除外されうるという効果を有する。
　上記ステップ（ｂ）は、１継代目のヒト多能性幹細胞が培養されている第一の培地の一回目の培地交換の際に、アクチビン不含サプリメントを添加した第二の培地に交換してヒト多能性幹細胞を培養するステップであり、かかる第一の培地から第二の培地への培地交換の時期としては、第一の培地での培養開始後３６～８４時間、好ましくは４８～７２時間以内、より好ましくは５４～６６時間、特に好ましくは５７～６３時間経過後を例示することができる。本発明において、培地交換は常法により行うことができる。
　ステップ（ｂ）において第二の培地で培養されている１継代目の細胞は、必要に応じて１又は２回以上第二の培地に培地交換を行いながら培養を続けることができるが、培養されている細胞の状態が継代するに適しているとされる時期に達した場合には、ステップ（ｃ）において、上記第一の培地に植え継いで、継代培養が行われる。継代することにより培養されている細胞は２継代目の細胞となり、かかる継代の時期としては、第一の培地から第二の培地への培地交換後１～２０日、好ましくは３～１５日、より好ましくは４～６日に行うことを例示することができるが、培養されている細胞の状況によっては、５５～９５％コンフルエント、好ましくは６５～８５％コンフルエント、さらに好ましくは６７～７３％コンフルエントに達した場合等、コンフルエンシーによって判断することもできる。また、コロニーの中心部あるいは辺縁部が分化し始めた際には、コンフルエンシーいかんに関わらず、継代することが望ましく、細胞の分化状態においても判断することができる。第二の培地から第二の培地への培地交換の時期としては、６時間～９日毎、好ましくは１２時間～５日毎、より好ましくは１８時間～２日毎、特に好ましくは２４時間毎に行うことを例示することができる。
　以後、ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）が繰り返し行われる。すなわち、上記第一の培地に継代して培養されている上記２継代目の細胞は、一回目の培地交換の際には、再び第二の培地に交換されることが必要となり、第二の培地で培養されているヒト多能性幹細胞は第二の培地に培地交換を行いながら、継代の際には、再び第一の培地に継代して培養する工程（ステップ）が必要となり、継代された細胞は、３継代目の細胞となる。本発明の方法において、多能性幹細胞は、かかる第一の培地から第二の培地への交換と第一の培地への継代という、２つのステップを順次繰り返して、継代時に継代数を一ずつ増加させながら、未分化状態を維持しつつ培養を続けることができる。
　上記ヒト多能性幹細胞を継代培養する際の継代の方法としては、トリプシンを用いる方法や、トリプシン・ＥＤＴＡを用いる方法や、トリプシン・コラゲナーゼ・カルシウムの混合液を用いる方法や、ディスパーゼを用いる方法や、コラゲナーゼを用いる方法や、顕微鏡下で注射針又はプラスチックパスツールなど細い先端を用いて、培養細胞を１００～数百個の細胞小集団として切りだす方法等の公知の方法を挙げることができ、具体的には、培養容器内の培地を吸引等により除いたのち、１ｕｎｉｔ／ｍＬのディスパーゼを３７℃にて１分から１０分作用させ、ディスパーゼをのぞき、本発明の第一の培地を加えて細胞集団（コロニー）を剥離させ、１回から数回遠心分離後、本発明の多能性幹細胞用基礎培地（溶液）で細胞を集めて遠心分離後、多能性幹細胞用基礎培地溶液で分散して再度遠心分離し、第一の培地に分散させる方法を例示することができる。
　本発明の方法で培養される多能性幹細胞は、上記いずれのステップにおいても、３３～４０℃、好ましくは３４～３９℃、特に好ましくは３７℃にて、１～２０％、好ましくは３～１５％、特に好ましくは８～１０％の二酸化炭素の存在下で、７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは１００％の高湿度下で培養されることが好ましい。
　本発明の方法により培養される細胞が未分化性を維持している細胞であるか否かを確認する方法としては、各種マーカー（タンパク質）に対する抗体を用いて、未分化マーカーの発現の検出及び／又は分化マーカーの発現の不検出により判定する方法や、各種マーカー（遺伝子）の発現の検出により判定する方法、細胞の形態学的特徴を観察する方法や、特定の分化誘導因子の刺激により特定の細胞に分化する能力を発揮できるか否かを判定する方法を例示することができる。
　上記マーカーを用いて判定する方法においては、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－２－５４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８０、ＣＤ９０、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ－３、Ｏｃｔ－４、アルカリホスファターゼ等の未分化マーカーが発現している場合は、本発明の方法で培養した細胞が未分化性を維持していると判断することができ、ＳＳＥＡ－１、ＣＤ１０５、ＣＤ５６、Ａ２Ｂ５等の分化マーカーが発現していない場合にも、本発明の方法で培養した細胞が未分化性を維持していると判断することができる。
　上記未分化及び／又は分化マーカーの発現をタンパク質レベルで確認する場合には各マーカーの特異抗体を用いて、フローサイトメトリー法、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ等により確認することができ、上記マーカーの発現を遺伝子レベルで確認する場合には、各マーカー遺伝子の、特異的プライマー対を用いたＲＴ－ＰＣＲ、特異的プローブを用いたノーザンブロッティング等によって確認することができる。
　上記フローサイトメトリー法によりマーカー発現の有無を確認する方法としては、本発明の方法で培養した細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液中でトリプシン処理した細胞を１ｍＬの１０％ヤギ血清中に３０分間懸濁後遠心分離し、次に対象のマーカータンパク質の抗マウス抗体とともに３０時間インキュベートし、その後上記培養細胞を、１％ヤギ血清を含有するＰＢＳで３回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、１％ヤギ血清を含有するＰＢＳで３回洗浄し、再懸濁した細胞を適切なフローサイトメトリー用機器を用いて判定する方法を例示することができる。
　上記免疫染色法によりマーカー発現の有無を確認する方法としては、本発明の方法で培養した細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定後、複数回ＰＢＳにて洗浄後、トライトンＸなどで培養細胞の透過性を増加させ、１０％ヤギ血清でブロッキングを行った後、対象マーカータンパク質のマウス抗体を用いて免疫染色し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと反応させ、蛍光顕微鏡観察により判定する方法を例示することができる。
　上記アルカリホスファターゼの発現の有無を確認する方法としては、本発明の方法で培養した細胞を、４．５ｍＭクエン酸、２．２５ｍＭクエン酸ナトリウム、３ｍＭ塩化ナトリウム、６５％メタノール及び４％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、洗浄し、次にＦａｓｔＲｅｄ基質キット（シグマ社製）等の適当なキットを用い、アルカリホスファターゼを可視化する、いわゆるアルカリホスファターゼ染色を行う方法を例示することができる。
　上記細胞の形態学的特徴を観察して確認する方法としては、細胞と細胞の境界が不明瞭で、細胞は核がほとんどをしめて細胞質がほとんどないこと、細胞集団（コロニー）の輪郭が丸くはっきりしており、細胞がやや盛り上がっているコロニーが多くなっていることや、また、コロニーの辺縁から線維芽細胞様細胞や神経様細胞が現れてないこと等を指標として未分化性が維持されているかを判断することができる。
　上記特定の分化誘導因子の刺激により特定の細胞に分化する能力を発揮できるか否かにより、本発明の方法により培養された細胞が未分化性を維持しているか否かを判定する方法としては、例えば、骨形成因子４（ＢＭＰ４）を培地に添加した場合に、上記細胞が上皮様細胞へ分化したときに未分化性が維持されていると判断する方法を挙げることができる。
　本発明の維持培養方法において用いられる培養容器としては、本発明に用いられる多能性幹細胞を維持培養できる容器であれば特に制限されず、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック等を挙げることができる。
　本発明は、未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養するためのキットを提供する。本発明のキットは、アクチビン含有サプリメント、アクチビン不含サプリメント及びヒト多能性幹細胞用基礎培地成分を備え、上記各組成物を構成する成分は、一部の又は全部の成分を個別に包装されることも含み、２以上の組成物を混合して包装することも含む。上記ヒト多能性幹細胞培養用のキットは、さらにヒト多能性幹細胞の未分化性を判定するための、未分化及び／又は分化マーカータンパク質に対する抗体や、未分化及び／又は分化マーカー遺伝子を検出するためのプライマー、プローブ等を含むこともできる。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。なお、実施例において用いられる多能性幹細胞であるＥＳ細胞株・ｉＰＳ細胞株については、政府指針に従い分与を受け実験に供した。他の細胞株についても（独）医薬基盤研究所に保管されており、一定条件下で分譲可能である。
［サプリメントの検討］
（基礎培地）
　従来の動物由来の原料をアニマルフリープロダクトに代替することを検討した。従来培地として以下の表２に示すｈＥＳＦ９培地を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［サプリメント成分；フィブロネクチンの検討］
　発明者らは、フィーダー細胞に代わる細胞支持体として近年用いられている、コラーゲンＩ、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン等のＥＣＭについて、動物由来原料からアニマルプロダクトフリー成分への代替の検討を行うこととした。ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ－１株（京大再生研付属幹細胞医学研究センター）、ヒトｉＰＳ細胞Ｔｉｃ株（ＪＣＲＢ１３３１）（医薬基盤研・ＪＳＣＢ細胞バンク）、及び、比較例として胚性癌細胞ＰＡ－１株（JCRB９０６１）（医薬基盤研・ＪＳＣＢ細胞バンク）を用いて検討した。
　９６ウェルマイクロプレート（コーニング社製）を用いて、コラーゲンＩ（新田ゼラチン社製）、ゼラチン（シグマ社製）、ラミニン（シグマ社製）、フィブロネクチン（シグマ社製）それぞれを３７℃にて３時間乾燥させないように処理し、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、及び１０μｇ／ｃｍ２にてそれぞれコートした。上記ｈＥＳＦ９培地を添加後、ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ－１株、及びヒトｉＰＳ細胞Ｔｉｃ株（ＪＣＲＢ１３３１）、胚性がん細胞ＰＡ－１株（ＪＣＲＢ９０６１）は、細胞数をカウント後、３×１０６細胞／ｃｍ２で播種した。２日間の培養後（胚性がん細胞ＰＡ－１株（ＪＣＲＢ９０６１）は１時間の培養後）、メタノールに溶解した０．４％のクリスタルバイオレット（シグマ社製）で３０分間染色し接着した細胞の核を固定染色した。上記マイクロプレートを洗浄後乾燥し、５０％メタノールに溶解した０．１Ｍクエン酸ナトリウムを用いて可溶化してマイクロプレートリーダー（モデル５５０、バイオラッド社製）にて５９５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１（ａ）～（ｃ）に示す。
（結果）
　ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ－１株は、ラミニンとフィブロネクチンについて接着能が一番強く、コラーゲンとセラチンの接着能は濃度にかかわらず弱かった（図１（ａ）参照）。ヒトｉＰＳ細胞Ｔｉｃ株（ＪＣＲＢ１３３１）は、ラミニンについては、１０～３０μｇ／ｃｍ２程度の濃度において、またフィブロネクチンについては３～９μｇ／ｃｍ２程度の濃度において接着能が一番強く、コラーゲンとセラチンの接着能は濃度にかかわらず弱かった（図１（ｂ）参照）。
（比較例）
　胚性がん細胞ＰＡ－１株（ＪＣＲＢ９０６１）について、上記種々のＥＣＭに対する接着能を検討したところ、１０μｇ／ｃｍ２程度の濃度においては、コラーゲンやゼラチンが接着能は強かった（図１（ｃ）参照）。
（考察）
　上記結果では多能性幹細胞はラミニンとフィブロネクチンに対する接着能が強いことが示されたが、ラミニン上で培養した細胞では、サイトケラチン（cytokeratin）が強く発現するので、ウシあるいはヒト由来フィブロネクチンを本発明のサプリメントの一成分として用いることとした。
［サプリメント成分；オレイン酸抱合ウシアルブミンの代替成分の検討］
　上記ｈＥＳＦ９培地等、多くの従来の培地では、ウシアルブミン（Bovine serum albumin：ＢＳＡ）が用いられてきたが、動物由来原料であることから、アニマルプロダクトフリー成分への代替の検討を行った。発明者によるこれまでの検討により、アルブミン１ｍｇ／ｍＬ、オレイン酸９．４μｇ／ｍＬ（シグマ社製）の濃度で、細胞増殖や未分化性維持が高い傾向があることが確認されていたが、未分化マーカーＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、Ｎａｎｏｇ及び分化マーカーＳＳＥＡ－１を用いて、ウシアルブミン若しくはリコンビナントヒトアルブミン（ｒＨＳＡ・ミリポア社製）及び／又はオレイン酸を添加した場合に、ＥＳ細胞の未分化性維持がどのような影響を受けるかについて検討することとした。なお、オレイン酸とアルブミンを添加する場合は、オレイン酸抱合アルブミンの態様で添加した。上記ｈＥＳＦ９培地の成分のうち、ＢＳＡとオレイン酸について、オレイン酸抱合ＢＳＡ（培地条件１）、ｒＨＳＡのみ（培地条件２）、オレイン酸抱合ｒＨＳＡ（培地条件３）で代替し、また、上記ｈＥＳＦ９培地にＢＳＡ、ｒＨＳＡ、オレイン酸のいずれも添加しない培地をネガティブコントロール（培地条件４）として、Ｈ９株（ＷＡ０９）の培養を行った。培養されているＨ９株（ＷＡ０９）をｈＥＳＦ９培地にて１継代培養し、蛍光免疫染色を行い、発現細胞の陽性率を解析した。細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で室温にて１５分固定し、ウシ血清でブロッキングを行った後、抗ＳＳＥＡ－４抗体（Abcam社製）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ標識抗マウスＩｇＧ（インビトロジェン社製）、抗ＴＲＡ－１－６０抗体（Abcam社製）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ標識抗マウスＩｇＭ（インビトロジェンより社製）、抗ＳＳＥＡ－１抗体（Abcam社製）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ標識抗マウスＩｇＭ（インビトロジェン社製）を用いて免疫染色を行い、また、トライトンＸを含むウシ血清でブロッキングを行った後、抗Ｎａｎｏｇ抗体（セルシグナリング社製）及び抗ＯＣＴ４抗体（サンタクルーズ社製）で免疫染色処理をし、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ標識二次抗体と反応させ、蛍光顕微鏡下に観察を行った。上記各培地条件の詳細について以下の表３に、結果を図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（結果）
　培地条件（１）～（４）の違いによる、１継代培養したＨ９株（ＷＡ０９）における、未分化性マーカーＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、Ｎａｎｏｇ発現細胞の陽性率に有意差は見られなかった（図２参照）。一方、分化性マーカーであるＳＳＥＡ－１発現細胞の陽性率は、ｒＨＳＡのみを添加した培地条件（２）において有意に（＊印）増加していることがわかった。以上の結果から、ｒＨＳＡは未分化性マーカーの発現に影響を与えないものの、オレイン酸抱合ｒＨＳＡを添加することで、分化マーカーの発現を減少させ、分化を抑制する効果があることが示された。
（蛍光免疫染色）
　培地条件（３）において３継代目のＨ９株（ＷＡ０９）培養細胞を未分化マーカーＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ１－６０、Ｎａｎｏｇ、分化マーカーＳＳＥＡ-１を用いて蛍光免疫染色により確認した。
（結果）
　未分化マーカーＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ１－６０、Ｎａｎｏｇの各抗体を用いて免疫染色されたＨ９株（ＷＡ０９）培養細胞は、各抗体が高発現していることを確認できるが、分化マーカーＳＳＥＡ-１は低発現であることが確認された。以上の結果からオレイン酸抱合ｒＨＳＡを含むサプリメントが多能性幹細胞の未分化性維持に有効であることが確認された。
［サプリメント成分；ブタ由来ヘパリンの除去］
　従前、本発明者らは、霊長類の胚性幹細胞を維持するために、ヘパリンを含んだ培地を開発してきたが（例えば、上記特表２００９－５４２２４７参照）、ヘパリンは供給源の大部分がブタ等の動物であるため、ｈＥＳＦ-９からヘパリンを削除した培地にアクチビンを添加した培地で、Ｈ９株（ＷＡ０９）の培養を試みた。２継代目の培養細胞について抗Ｔｒａ－１－６０抗体で染色したＨ９株（ＷＡ０９）を顕微鏡で観察したところ、細胞と細胞との境界が不明瞭で細胞質を核がほとんど占める細胞の形態や、コロニーの丸い輪郭や、細胞がやや盛り上がっている様子を読み取ることができ、多能性が維持されていることが確認された（図４参照）。かかる結果より、ブタ由来ヘパリンを培地成分から除くこととした。
［基礎培地；ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地の調製］
　発明者らは、従前の培地（例えば、上記国際公開ＷＯ２００５／０６３９６８号パンフレット参照）に、ＨＥＰＥＳを添加していたが、ＨＥＰＥＳを無血清培地に添加すると非常にヒトＥＳ細胞の維持に悪影響を与える（例えば上記PNAS, vol.105, no.36, 13409-13414参照）との知見から、ＨＥＰＥＳを除き、アスコルビン酸を添加すると未分化性が維持される（特表２００９－５４２２４７号公報）という知見をもとに、アニマルプロダクトフリーの基礎培地として、以下の表４に示される組成の基礎培地（ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地）を作製し、常法にしたがって滅菌した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　発明者らの知見及び上記検討に基づき、ヒト多能性幹細胞の未分化性維持培養に用いられるサプリメントとして、ウシフィブロネクチン、リコンビナントヒトインスリン、リコンビナントヒトトランスフェリン（ａｐｏ)、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、セレン酸ナトリウム、リコンビナントヒトＦＧＦ－２、オレイン酸抱合リコンビナントヒトアルブミン、及びリコンビナントヒトアクチビンを適宜組み合わせて、上記ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地に添加して調製した培地を用いて、多能性幹細胞の培養を試みることとした。
　以下の検討において、凍結保存されているＨ９株（ＷＡ０９）は、０．１％ゼラチン（Embryomax、ミリポア社製）被覆フラスコ（コーニング社製）で、１０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を用いて、マイトマイシンＣにて細胞増殖を停止させたマウス胎仔由来線維芽細胞（ミリポア社製）をフィーダー細胞として播種し、１ｍＭのＬ－グルタミン（21-51-016、GIBCO社製）、０．１ｍＭの２－メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸(11140-035、GIBCO社製)、２０％ＫＳＲ(10828-028、GIBCO社製)及び４ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ(13256-029、片山科学社製)を補充したＤＭ／Ｆ１２(GIBCO社製)を添加したＫＳＲ添加培地にて維持することで播種前の調製を行った。
（培地の調製１）
　２５ｃｍ２フラスコ（コーニング社製）に、（１）ヒト血漿フィブロネクチン（Ｆ０８９５、シグマ社製）を２μｇ／ｃｍ２になるようにＰＢＳに溶解して入れ、乾燥させないように３時間３７℃にて処理し、細胞播種直前に溶液を吸引除去し、その上に、（２）１０μｇ／ｍＬのリコンビナントヒトインスリン（19278-5ML、シグマ社製）、（３）５μｇ／ｍＬのリコンビナントヒトトランスフェリン（ａｐｏ)（T 2252、シグマ社製）、（４）１０μＭの２－メルカプトエタノール（M 7522、シグマ社製）、（５）１０μＭの２－エタノールアミン（E 0135、シグマ社製）、（６）２０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム（S 9133、シグマ社製）、（７）１ｍｇ／ｍＬのリコンビナントヒトアルブミンに９．４μｇ／ｍＬのオレイン酸（O-1383-5G、シグマ社製）を複合体化したｒＨＳＡ抱合オレイン酸、（８）５ｎｇ／ｍＬのｂａｓｉｃＦＧＦ (片山科学社製)の８因子からなるサプリメントと、２ｎｇ／ｍＬのアクチビン（N-338 AC/CF、Ｒ＆Ｄ社製）とを、アクチビン含有サプリメントとして上記ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地に添加した培地を、アクチビン含有サプリメント＋ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地として調製した。
（培地の調製２）
　上記（１）～（８）の８因子からなるサプリメントを、アクチビン不含サプリメントとして上記ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地に添加した培地を、アクチビン不含サプリメント＋ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地として調製した。
（アクチビン含有培地での培養）
　上記アクチビン含有サプリメント＋ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地でＨ９株（ＷＡ０９)の培養を開始して６０時間後に、上記アクチビン含有サプリメント＋ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地への培地交換を行った。培養開始から７日後に細胞を観察した。細胞の顕微鏡写真を図５（ａ）に示す。コロニーの形状が扁平で形が崩れたものとなっており、未分化性が失われている可能性が高いことが確認された。
（アクチビン不含培地への培地交換）
　上記アクチビン含有サプリメント＋ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地でＨ９株（ＷＡ０９)の培養を開始して６０時間後に、上記アクチビン不含サプリメント＋ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地への培地交換を行った。培養開始から５日後に細胞を観察した。細胞の顕微鏡写真を図５（ｂ）に示す。コロニーの形状が丸く盛り上がっており、未分化性が失われていない可能性が高いことが確認された。
［ヒト多能性幹細胞の未分化性維持培養］
（フィブロネクチンコーティング）
　これ以降、上記アクチビン含有サプリメント＋ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地を第一の培地として用い、上記アクチビン不含サプリメント＋ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地を第二の培地として用いて検討を続けることとした。
　前記ＫＳＲ添加培地にて維持されているＨ９株（ＷＡ０９)を、培地をのぞいたのち、１unit／ｍＬのディスパーゼを３７℃にて２分作用させた後、ディスパーゼをのぞき、本発明の上記第一の培地溶液で、スクレーパーなどを用いて細胞集団を集めて、３００ｒｐｍで１分遠心分離後、上記第一の培地の溶液で分散して再度遠心分離し、上記第一の培地に分散させて、１継代目の培養を開始した。
　上記第一の培地でＨ９株（ＷＡ０９)の培養開始後６０時間後に、上記第二の培地への培地交換を行った。さらに、２４時間毎に、第二の培地への培地交換を３回行い、第一の培地から第二の培地への培地交換後３日目に、培養されていたＨ９株（ＷＡ０９)の培地をのぞいたのち、１ｕｎｉｔ／ｍＬのディスパーゼを３７℃にて２分 作用させた後、ディスパーゼをのぞき、本発明の上記第一の培地溶液で、スクレーパーなどを用いて細胞集団を集めて、３００ｒｐｍで遠心分離後、上記第一の培地溶液で分散して再度遠心分離後、第一の培地へ分散することにより植継ぎ（継代）をして、２継代目の培養を行った。１継代目に使用した細胞の使用するタイミングが最適な場合、２継代目はおよそ３、４日目、それ以降は５日目で継代となる。
　上記第一の培地へ継代された２継代目のＨ９株（ＷＡ０９)は、第一の培地での培養開始６０時間後に、第二の培地への培地交換を行った。第二の培地で培地交換を５回行った後、第一の培地から第二の培地への培地交換後５日目に、再び第一の培地へ継代し３継代目の培養を行い、これ以降第一の培地への継代と第二の培地への培地交換の工程を繰り返し行い、培養を続けた。
（形態学的観察）
　図６は、上記方法で培養したＨ９株（ＷＡ０９)培養細胞の１～６継代目の細胞を位相差顕微鏡下に観察した写真である。いずれの時期においても未分化細胞の特徴である細胞と細胞の境界が不明瞭で、細胞は核がほとんどをしめて細胞質がほとんどないこと、細胞集団（コロニー）の輪郭が丸くはっきりしており、細胞がやや盛り上がっているコロニーが多くなっていることや、また、コロニーの辺縁から線維芽細胞様細胞や神経様細胞が現れてないこと等の様子を読み取ることができ、多能性が維持されていることを確認した。
（フローサイトメトリー法による解析）
　Ｈ９株（ＷＡ０９)を上記方法で培養したＨ９株（ＷＡ０９)培養細胞について、未分化マーカーとしてＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－２－５４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８０、及びＣＤ９０（ＢＤ社製）を用い、分化マーカーとしてＳＳＥＡ－１、ＣＤ１０５（ＢＤ社製）、ＣＤ５６（ＢＤ社製）、及びＡ２Ｂ５（ミリポア社製）を用い、未分化性についてフローサイトメトリー法にて解析を行った。ＨＬＡ－ａｂｃ（ＢＤ社製）は、細胞がヒト由来であるかを確認するために用いた。５継代目の上記Ｈ９株（ＷＡ０９)培養細胞について、直近の植継ぎから５日目の細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液にて細胞を分散させ、細胞を１ｍＬの１０％ウシ血清（ハイクローン社製）中に３０分間懸濁後遠心分離し、次に各マーカーのマウス抗体（Abcam社製）とともに３０分インキュベートした。上記培養細胞を、１％ウシ血清を含有するＰＢＳで３回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－コンジュゲート化抗ラットＩｇＭ、ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ抗体（インビトロジェン社）と１５分間反応させた。上記培養細胞を、１％ウシ血清を含有するＰＢＳで３回洗浄した後、再懸濁した細胞をＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏTM フローサイトメーター（ＢＤ社製, NJ USA）を用いて解析した。結果を図７に示す。
（結果）
　図７から明らかなとおり、未分化マーカーであるＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－２－５４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８０、及びＣＤ９０については、高発現をしている細胞が６６．３％～９９．５％であることが示された。分化マーカーであるＳＳＥＡ－１、ＣＤ１０５、ＣＤ５６、Ａ２Ｂ５は、１．１２％～１２．５％の発現にとどまった。ＨＬＡ－ａｂｃは９９％であることから、ヒト由来細胞であることが示されている。これらの結果から、フィブロネクチンをコーティングした場合において、上記Ｈ９株（ＷＡ０９)培養細胞は、５継代を経た後においても未分化性を維持している多能性幹細胞であることが示された。
［ヒト多能性幹細胞の未分化性維持培養］
（フィブロネクチン含有第一の培地の調製）
　６穴プレート（ＢＤ社製）に、上記ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地に１０μｇ／ｍＬのリコンビナントヒトインスリン、５μｇ／ｍＬのリコンビナントヒトトランスフェリン（ａｐｏ)、１０μＭの２－メルカプトエタノール、１０μＭの２－エタノールアミン、２０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍＬのリコンビナントヒトアルブミンと複合体化した９．４μｇ／ｍＬのオレイン酸、及び２ｎｇ／ｍＬのリコンビナントヒトアクチビンを添加し、さらに０、２０、４０、８０、１６０、３２０μｇ／ウェルのウシフィブロネクチンをそれぞれのウェルに添加した培地をフィブロネクチン含有の第一の培地として調製した。
（フィブロネクチン含有第二の培地の調製）
　６穴プレート（ＢＤ社製）に、上記ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地に５μｇ／ｍＬのリコンビナントヒトトランスフェリン（ａｐｏ)、１０μＭの２－メルカプトエタノール、１０μＭの２－エタノールアミン、２０ｎＭのセレン酸ナトリウム、及び１ｍｇ／ｍＬのリコンビナントアルブミンと複合体化した９．４μｇ／ｍＬのオレイン酸を添加し、さらに０、２０、４０、８０、１６０、３２０μｇ／ウェルのウシフィブロネクチンをそれぞれのウェルに添加した培地をフィブロネクチン含有の第二の培地として調製した。
　上記Ｈ９株（ＷＡ０９)について、前記フィブロネクチンコーティングの項記載の第一の培地と第二の培地を、上記フィブロネクチン含有第一の培地とフィブロネクチン含有第二の培地に代替し、フィブロネクチンの濃度を変えてそれぞれのウェルにおいて培養したこと以外は、前記フィブロネクチンコーティングと同様の方法で培養した。使用したプレートの1ウェルの面積は９．６ｃｍ２であり、培地は３ｍＬ添加した。
（結果）
　上記Ｈ９株（ＷＡ０９)培養細胞の無血清培地への継代後の顕微鏡写真を図８に示す。細胞の外観より、８０μｇ／ウェルのフィブロネクチンを添加した場合に未分化性が最も維持されると判断した。フィブロネクチンは、培養容器にコートするのではなく、他のサプリメント成分と共に基礎培地に添加しても本発明の方法において有効であることが確認された。これらの結果により、本発明の培養方法を用いることにより、繰り返し継代した後においてもヒト多能性幹細胞は未分化性を維持していることが確認された。
［ヒトｉｐｓ細胞の未分化性維持培養］
　（プロテインキナーゼＣペプチドインヒビターを含有する培地による培養）
　実施例３記載のフィブロネクチンコーティングのアクチビン含有サプリメント＋ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地及びアクチビン不含サプリメント＋ｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地に、それぞれ０、１、２．５、５、１０μＭのミリストイル化プロテインキナーゼＣペプチドインヒビター（Myr. RFARKGALRQKNV）（プロメガ社製）を添加した培地を調製して、プロテインキナーゼＣ阻害剤含有第一の培地、及び、プロテインキナーゼＣ阻害剤含有第二の培地として用いた。
　ヒトｉＰＳ細胞Ｔｉｃ株（ＪＣＲＢ１３３１）について、上記プロテインキナーゼＣ阻害剤含有第一の培地に分散させて培養を開始した。上記Ｔｉｃ株の培養開始後６０時間後に、上記プロテインキナーゼＣ阻害剤含有第二の培地への培地交換を行った。さらに、２４時間毎に培地交換を２回行い、培養開始後４日目に、４．５ｍＭクエン酸、２．２５ｍＭクエン酸ナトリウム、３ｍＭ塩化ナトリウム、６５％メタノール及び４％パラホルムアルデヒドで５分間固定後、ＦａｓｔＲｅｄ基質キット（シグマ社製）を用いて、製造元の指針に従いアルカリホスファターゼ染色を行った。結果を図９に示す。
（結果）
　上記Ｔｉｃ株の培養開始後４日目の写真を図９に示す。ミリストイル化プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ペプチドインヒビターを１～５μＭ添加した培地で培養すると、添加濃度が０の場合と比較して、さらに分化が抑制されていることが観察され、また、１～２．５μＭ添加した培地では、増殖性が高まっている様子が観察された。
　最近、複数の方向に分化する能力を有すると考えられる幹細胞を人為的に分化誘導して、組織・器官の作製を行い、欠損組織の補填を行う再生医療が、従来の臓器移植の欠点を補う治療法として注目されている。本発明の方法により、未分化性を維持している多能性幹細胞を供給できることになり、目的とする組織や臓器を体外又は体内で構築する再生医療へ応用できるようになることで、自家移植を含む移植治療が抱える様々な問題を解決できる。

Claims (13)

  1. 以下の（ａ）～（ｃ）ステップを、（ａ）ステップの後、（ｂ）及び（ｃ）ステップを順次繰り返すことを特徴とする未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養する方法。
    （ａ）多能性幹細胞用基礎培地にアクチビン含有サプリメントを添加した第一の培地でヒト多能性幹細胞を培養するステップ；
    （ｂ）前記第一の培地を、多能性幹細胞用基礎培地にアクチビン不含サプリメントを添加した第二の培地に交換してヒト多能性幹細胞を培養するステップ；
    （ｃ）前記第一の培地にヒト多能性幹細胞を継代培養するステップ；
  2. サプリメントが、フィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及びオレイン酸抱合アルブミンを含むことを特徴とする請求項１記載の培養方法。
  3. フィブロネクチンが、培養容器の内側にコートすることなく用いられることを特徴とする請求項２記載の方法。
  4. さらに、プロテインキナーゼＣ阻害剤が、サプリメントに含まれることを特徴とする請求項２又は３記載の方法。
  5. 基礎培地が、１又は２種類以上の糖、１又は２種類以上の無機塩、１又は２種類以上のアミノ酸、１又は２種類以上のビタミン、及び微量成分を含む化学合成培地であることを特徴とする請求項１～４のいずれか記載の培養方法。
  6. 基礎培地が以下の表１に示されるｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地であることを特徴とする請求項１～４のいずれか記載の培養方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  7. アクチビン含有サプリメント、アクチビン不含サプリメント及びヒト多能性幹細胞用基礎培地成分を備えた、未分化状態を維持したままヒト多能性幹細胞を培養するためのキット。
  8. サプリメントが、フィブロネクチン、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール、２－エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、及びオレイン酸抱合アルブミンを含むことを特徴とする請求項７記載のキット。
  9. フィブロネクチンが、サプリメントに添加されていることを特徴とする請求項７又は８記載のキット。
  10. さらに、プロテインキナーゼＣ阻害剤が、サプリメントに含まれることを特徴とする請求項７～９いずれか記載のキット。
  11. 基礎培地が、１又は２種類以上の糖、１又は２種類以上の無機塩、１又は２種類以上のアミノ酸、１又は２種類以上のビタミン、及び微量成分を含む化学合成培地であることを特徴とする請求項７～１０いずれか記載のキット。
  12. 基礎培地が以下の表２に示されるｈＥＳＦ－ｇｒｏｗ培地であることを特徴とする請求項７～１０いずれか記載のキット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  13. さらに、未分化及び／又は分化マーカーに対する抗体、プローブ、又はプライマーを備えた請求項７～１２いずれか記載のキット。
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