CN108865987A - 一种人关节液间充质干细胞用的培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人关节液间充质干细胞用的培养基，该人关节液间充质干细胞用的培养基的配方包括以下组份：胎牛血清9％‑11％、青霉素12％‑15％、链霉素4％‑7％、氨基酸2％‑6％、葡萄糖3％‑5％、无水氯化钙4％‑6％、亮氨酸1％‑4％、氯化钾5％‑9％、次黄嘌呤1％‑3％、胸苷2％‑4％、核黄素3％‑5％、苯丙氨酸2％‑5％、荧光抗体3％‑8％，其余为水，本发明还公开了一种人关节液间充质干细胞用的培养基及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：S1：定量称取,S2：倒入培养基，S3：干细胞清洗，S4：观测培养，S5：染色标记；本发明制备出的间充质干细胞用的培养基在显微镜下可见干细胞呈纺锤形，有集落形成，符合关节液间充质干细胞的外观特征。
Description
技术领域
本发明涉及培养基制备技术领域，具体为一种人关节液间充质干细胞用的培养基及其制备方法。
背景技术
骨关节炎是最常见的关节疾病之一，它的显著病例特征是进展性的关节软骨破坏，从而导致关节疼痛和活动受限，严重影响患者的生活质量，间充质干细胞是来源于间质组织，具有增殖和多向分化能力的细胞，广泛参与体内损伤修复过程，既往有研究发现关节液中含有间充质干细胞，而且早期骨关节炎比正常人的关节液充质干细胞数量有所增加；
现有技术中，对于人关节液间充质干细胞用的培养基培养效果不佳，成长速度较慢，且经图像流式细胞仪分离出的充质干细胞的单细胞图像和荧光染色照片质量欠佳；为此，本发明提出一种人关节液间充质干细胞用的培养基及其制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人关节液间充质干细胞用的培养基及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种人关节液间充质干细胞用的培养基，该人关节液间充质干细胞用的培养基的配方包括以下组份：胎牛血清9％-11％、青霉素12％-15％、链霉素4％-7％、氨基酸2％-6％、葡萄糖3％-5％、无水氯化钙4％-6％、亮氨酸1％-4％、氯化钾5％-9％、次黄嘌呤1％-3％、胸苷2％-4％、核黄素3％-5％、苯丙氨酸2％-5％、荧光抗体3％-8％，其余为水。
优选的，包括胎牛血清9％、青霉素12％、链霉素4％、氨基酸2％、葡萄糖3％、无水氯化钙4％、亮氨酸1％、氯化钾5％、次黄嘌呤1％、胸苷2％、核黄素3％、苯丙氨酸2％、荧光抗体3％，其余为水。
优选的，包括胎牛血清10％、青霉素13％、链霉素5％、氨基酸3％、葡萄糖4％、无水氯化钙5％、亮氨酸2％、氯化钾6％、次黄嘌呤2％、胸苷3％、核黄素4％、苯丙氨酸3％、荧光抗体4％，其余为水。
优选的，包括胎牛血清11％、青霉素14％、链霉素6％、氨基酸4％、葡萄糖5％、无水氯化钙6％、亮氨酸3％、氯化钾7％、次黄嘌呤3％、胸苷4％、核黄素5％、苯丙氨酸4％、荧光抗体5％，其余为水。
优选的，包括胎牛血清10％、青霉素15％、链霉素7％、氨基酸6％、葡萄糖5％、无水氯化钙6％、亮氨酸4％、氯化钾9％、次黄嘌呤3％、胸苷4％、核黄素5％、苯丙氨酸5％、荧光抗体8％，其余为水。
优选的，所述荧光抗体选用PE-CD44、FITV-CD90、APC-CD73、PerCP-Cy5.5-CD105的一种或多种混合物。
一种如上所述的人关节液间充质干细胞用的培养基的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
S1：定量称取,将所有的原料按照上述的组份进行称取；
S2：倒入培养基，将氨基酸、葡萄糖、无水氯化钙、亮氨酸、氯化钾、次黄嘌呤、胸苷、核黄素、苯丙氨酸全部倒入一容器中，用少量注射用水将盛有这些物质的袋内残留培养基洗下，并入容器中，加注射用水(水温20℃～30℃)到950毫升，轻微搅拌溶解；
S3：干细胞清洗，将采集的人关节液间充质干细胞转移至生物安全柜内，倒入装有含青霉素和链霉素的胎牛血清中，使用胎牛血清对人关节液间充质干细胞进行清洗；
S4：观测培养，将人关节液间充质干细胞放入培养基中，在5％CO2和37℃的恒温箱中培养25-28天，直至细胞铺满培养瓶的底部；
S5：染色标记，使用荧光抗体标记细胞，应用FlowSight流式细胞仪鉴定关节液间充质干细胞，并观察其单细胞形态和荧光染色情况。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所采用的配方均为国标规定原料，且本发明制备出的间充质干细胞用的培养基在显微镜下可见干细胞呈纺锤形，有集落形成，符合间充质干细胞的外观特征，并结合图像流式细胞仪可见分离出的间充质干细胞的单细胞图像和荧光染色照片更为清晰，因此本发明提出的人关节液间充质干细胞用的培养基具有较好的推广价值。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本发明提供一种技术方案：一种人关节液间充质干细胞用的培养基，该人关节液间充质干细胞用的培养基的配方包括以下组份：胎牛血清9％、青霉素12％、链霉素4％、氨基酸2％、葡萄糖3％、无水氯化钙4％、亮氨酸1％、氯化钾5％、次黄嘌呤1％、胸苷2％、核黄素3％、苯丙氨酸2％、荧光抗体3％，其余为水。
其中，荧光抗体选用PE-CD44。
一种如上所述的人关节液间充质干细胞用的培养基的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
S1：定量称取,将所有的原料按照上述的组份进行称取；
S2：倒入培养基，将氨基酸、葡萄糖、无水氯化钙、亮氨酸、氯化钾、次黄嘌呤、胸苷、核黄素、苯丙氨酸全部倒入一容器中，用少量注射用水将盛有这些物质的袋内残留培养基洗下，并入容器中，加注射用水(水温23℃)到950毫升，轻微搅拌溶解；
S3：干细胞清洗，将采集的人关节液间充质干细胞转移至生物安全柜内，倒入装有含青霉素和链霉素的胎牛血清中，使用胎牛血清对人关节液间充质干细胞进行清洗；
S4：观测培养，将人关节液间充质干细胞放入培养基中，在5％CO2和37℃的恒温箱中培养25天，直至细胞铺满培养瓶的底部；
S5：染色标记，使用荧光抗体标记细胞，应用FlowSight流式细胞仪鉴定关节液间充质干细胞，并观察其单细胞形态和荧光染色情况。
实施例二
本发明提供一种技术方案：一种人关节液间充质干细胞用的培养基，该人关节液间充质干细胞用的培养基的配方包括以下组份：包括胎牛血清10％、青霉素13％、链霉素5％、氨基酸3％、葡萄糖4％、无水氯化钙5％、亮氨酸2％、氯化钾6％、次黄嘌呤2％、胸苷3％、核黄素4％、苯丙氨酸3％、荧光抗体4％，其余为水。
其中，荧光抗体选用APC-CD73。
一种如上所述的人关节液间充质干细胞用的培养基的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
S1：定量称取,将所有的原料按照上述的组份进行称取；
S2：倒入培养基，将氨基酸、葡萄糖、无水氯化钙、亮氨酸、氯化钾、次黄嘌呤、胸苷、核黄素、苯丙氨酸全部倒入一容器中，用少量注射用水将盛有这些物质的袋内残留培养基洗下，并入容器中，加注射用水(水温25℃)到950毫升，轻微搅拌溶解；
S3：干细胞清洗，将采集的人关节液间充质干细胞转移至生物安全柜内，倒入装有含青霉素和链霉素的胎牛血清中，使用胎牛血清对人关节液间充质干细胞进行清洗；
S4：观测培养，将人关节液间充质干细胞放入培养基中，在5％CO2和37℃的恒温箱中培养26天，直至细胞铺满培养瓶的底部；
S5：染色标记，使用荧光抗体标记细胞，应用FlowSight流式细胞仪鉴定关节液间充质干细胞，并观察其单细胞形态和荧光染色情况。
实施例三
本发明提供一种技术方案：一种人关节液间充质干细胞用的培养基，该人关节液间充质干细胞用的培养基的配方包括以下组份：包括胎牛血清11％、青霉素14％、链霉素6％、氨基酸4％、葡萄糖5％、无水氯化钙6％、亮氨酸3％、氯化钾7％、次黄嘌呤3％、胸苷4％、核黄素5％、苯丙氨酸4％、荧光抗体5％，其余为水。
其中，荧光抗体选用FITV-CD90。
一种如上所述的人关节液间充质干细胞用的培养基的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
S1：定量称取,将所有的原料按照上述的组份进行称取；
S2：倒入培养基，将氨基酸、葡萄糖、无水氯化钙、亮氨酸、氯化钾、次黄嘌呤、胸苷、核黄素、苯丙氨酸全部倒入一容器中，用少量注射用水将盛有这些物质的袋内残留培养基洗下，并入容器中，加注射用水(水温26℃)到950毫升，轻微搅拌溶解；
S3：干细胞清洗，将采集的人关节液间充质干细胞转移至生物安全柜内，倒入装有含青霉素和链霉素的胎牛血清中，使用胎牛血清对人关节液间充质干细胞进行清洗；
S4：观测培养，将人关节液间充质干细胞放入培养基中，在5％CO2和37℃的恒温箱中培养27天，直至细胞铺满培养瓶的底部；
S5：染色标记，使用荧光抗体标记细胞，应用FlowSight流式细胞仪鉴定关节液间充质干细胞，并观察其单细胞形态和荧光染色情况。
实施例四
本发明提供一种技术方案：一种人关节液间充质干细胞用的培养基，该人关节液间充质干细胞用的培养基的配方包括以下组份：包括胎牛血清10％、青霉素15％、链霉素7％、氨基酸6％、葡萄糖5％、无水氯化钙6％、亮氨酸4％、氯化钾9％、次黄嘌呤3％、胸苷4％、核黄素5％、苯丙氨酸5％、荧光抗体8％，其余为水。
其中，荧光抗体选用PerCP-Cy5.5-CD105。
一种如上所述的人关节液间充质干细胞用的培养基的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
S1：定量称取,将所有的原料按照上述的组份进行称取；
S2：倒入培养基，将氨基酸、葡萄糖、无水氯化钙、亮氨酸、氯化钾、次黄嘌呤、胸苷、核黄素、苯丙氨酸全部倒入一容器中，用少量注射用水将盛有这些物质的袋内残留培养基洗下，并入容器中，加注射用水(水温28℃)到950毫升，轻微搅拌溶解；
S3：干细胞清洗，将采集的人关节液间充质干细胞转移至生物安全柜内，倒入装有含青霉素和链霉素的胎牛血清中，使用胎牛血清对人关节液间充质干细胞进行清洗；
S4：观测培养，将人关节液间充质干细胞放入培养基中，在5％CO2和37℃的恒温箱中培养28天，直至细胞铺满培养瓶的底部；
S5：染色标记，使用荧光抗体标记细胞，应用FlowSight流式细胞仪鉴定关节液间充质干细胞，并观察其单细胞形态和荧光染色情况。
通过对四组实施例进行成分检测，并且从市场上挑选了一组人关节液间充质干细胞用的培养基进行对比，检测结果如下：
关节液中的干细胞进行培养后，本方案的第四组培养基在显微镜下可见干细胞呈纺锤形，有集落形成，符合间质干细胞的外观特征，并结合图像流式细胞仪可见第四组分离出的间充质干细胞的单细胞图像和荧光染色照片更为清晰，因此第四组培养基具有较好的推广价值。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种人关节液间充质干细胞用的培养基，其特征在于；该人关节液间充质干细胞用的培养基的配方包括以下组份：胎牛血清9％-11％、青霉素12％-15％、链霉素4％-7％、氨基酸2％-6％、葡萄糖3％-5％、无水氯化钙4％-6％、亮氨酸1％-4％、氯化钾5％-9％、次黄嘌呤1％-3％、胸苷2％-4％、核黄素3％-5％、苯丙氨酸2％-5％、荧光抗体3％-8％，其余为水。
2.根据权利要求1所述的一种人关节液间充质干细胞用的培养基，其特征在于：包括胎牛血清9％、青霉素12％、链霉素4％、氨基酸2％、葡萄糖3％、无水氯化钙4％、亮氨酸1％、氯化钾5％、次黄嘌呤1％、胸苷2％、核黄素3％、苯丙氨酸2％、荧光抗体3％，其余为水。
3.根据权利要求1所述的一种人关节液间充质干细胞用的培养基，其特征在于：包括胎牛血清10％、青霉素13％、链霉素5％、氨基酸3％、葡萄糖4％、无水氯化钙5％、亮氨酸2％、氯化钾6％、次黄嘌呤2％、胸苷3％、核黄素4％、苯丙氨酸3％、荧光抗体4％，其余为水。
4.根据权利要求1所述的一种人关节液间充质干细胞用的培养基，其特征在于：包括胎牛血清11％、青霉素14％、链霉素6％、氨基酸4％、葡萄糖5％、无水氯化钙6％、亮氨酸3％、氯化钾7％、次黄嘌呤3％、胸苷4％、核黄素5％、苯丙氨酸4％、荧光抗体5％，其余为水。
5.根据权利要求1所述的一种人关节液间充质干细胞用的培养基，其特征在于：包括胎牛血清10％、青霉素15％、链霉素7％、氨基酸6％、葡萄糖5％、无水氯化钙6％、亮氨酸4％、氯化钾9％、次黄嘌呤3％、胸苷4％、核黄素5％、苯丙氨酸5％、荧光抗体8％，其余为水。
6.根据权利要求1所述的一种人关节液间充质干细胞用的培养基，其特征在于：所述荧光抗体选用PE-CD44、FITV-CD90、APC-CD73、PerCP-Cy5.5-CD105的一种或多种混合物。
7.一种如权利要求1-6任意一条所述的人关节液间充质干细胞用的培养基的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：
S1：定量称取,将所有的原料按照上述的组份进行称取；
S2：倒入培养基，将氨基酸、葡萄糖、无水氯化钙、亮氨酸、氯化钾、次黄嘌呤、胸苷、核黄素、苯丙氨酸全部倒入一容器中，用少量注射用水将盛有这些物质的袋内残留培养基洗下，并入容器中，加注射用水(水温20℃～30℃)到950毫升，轻微搅拌溶解；
S3：干细胞清洗，将采集的人关节液间充质干细胞转移至生物安全柜内，倒入装有含青霉素和链霉素的胎牛血清中，使用胎牛血清对人关节液间充质干细胞进行清洗；
S4：观测培养，将人关节液间充质干细胞放入培养基中，在5％CO2和37℃的恒温箱中培养25-28天，直至细胞铺满培养瓶的底部；
S5：染色标记，使用荧光抗体标记细胞，应用FlowSight流式细胞仪鉴定关节液间充质干细胞，并观察其单细胞形态和荧光染色情况。
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