CN104662148A - 含有间充质干细胞的条件培养基的角膜内皮细胞培养用培养基 - Google Patents
含有间充质干细胞的条件培养基的角膜内皮细胞培养用培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的目的在于，为了制造对角膜内皮不全患者进行移植用的细胞，提供一种用于培养从人角膜组织得到的角膜内皮细胞，并维持作为角膜内皮细胞的形态，同时使细胞增殖的培养基。本发明提供一种含有间充质干细胞的条件培养基的培养基，及使用该培养基的角膜内皮细胞的培养法。
Description
技术领域
本发明涉及一种移植用角膜内皮细胞的培养法，具体而言，涉及一种用于培养移植用角膜内皮细胞的添加了间充质干细胞的条件培养基。
背景技术
角膜是透明组织，其从外侧向内侧由角膜上皮、前弹力层、角膜基质层、后弹力层、角膜内皮5层细胞层构成，其没有血管但有神经分布。角膜透明度通过角膜基质层和角膜内皮来维持。
角膜内皮功能不全是失明的主要原因之一，即，用于维持角膜透明度的角膜内皮功能丧失，从而引起视野受损。角膜内皮功能不全是由角膜内皮变性、坏死或物理脱落等引起的疾病。作为由角膜内皮细胞功能不全引起的疾病，有大泡性角膜病变。大泡性角膜病变是重度的角膜内皮功能不全，即，作为角膜内皮细胞功能之一的调节角膜内水分量的泵功能受损，其结果无法排出角膜内的水分，角膜浑浊呈浮肿状。另外，由于浮肿，角膜上皮有时会剥落。
正常角膜上的角膜内皮细胞的密度为约2500-3000个/mm2，但角膜内皮功能不全时，其角膜内皮细胞的密度减小。若细胞密度变为约500个/mm2以下，则角膜内皮细胞的泵功能及屏障功能下降，导致产生浮肿。
角膜内皮细胞一旦受到一次损害就不具有再生的能力。因此，作为这种角膜内皮功能不全的治疗，通过全层角膜移植，即移植具有上皮、基质及内皮的完整3层结构的健康角膜，来实现恢复角膜内皮功能，并恢复角膜的透明度。但是，由于全层角膜移植存在因角膜全层切开而引起的眼球的脆弱性等问题，因此近年来，正在普及仅移植角膜内皮的DSAEK(Descemet’s Stripping Automated EndothelialKeratoplasty)、同时移植后弹力层和角膜内皮的DMEK(Descemet’sMembrane Endothelial Keratoplasty)(非专利文献1)。对于需要这种角膜移植的由角膜内皮功能不全引起的疾病，除了大泡性角膜病变，还可以列举角膜浮肿、角膜白斑、圆锥角膜等。但是，在日本，等待角膜移植的患者约5500人，与此相对，一年在日本国内进行角膜移植件数为2700件左右。即现状为，由于捐赠者不足而不能对患者采取充分的措施。
作为解决这种捐赠者不足的方法之一，研究了培养角膜内皮细胞，并将其移植给角膜内皮功能不全患者，从而恢复角膜内皮功能的方法。例如，报告了在羊膜上培养角膜内皮细胞而制造移植用角膜内皮样片的方法(专利文献1及2)。在这些报告中，作为角膜内皮细胞培养用培养基，使用添加了10％FCS、2ng/mL b-FGF及抗生素的DMEM培养基(专利文献1)，或者使用含有10％FCS的DMEM培养基(专利文献2)。另外，还报告了在纤连蛋白包覆的胶原蛋白片上培养角膜内皮细胞而制造移植用角膜内皮样片的方法(专利文献3)、在纤维素基材上培养角膜内皮细胞而制造移植用角膜内皮样片的方法(专利文献4)。在这些报告中，作为角膜内皮细胞培养用培养基，使用添加了15％FCS、2ng/mL b-FGF及抗生素的低葡萄糖浓度DMEM培养基。另外，公开了可以在培养基中添加透明质酸及EGF等生长因子。此外，还报告了各种作为角膜内皮细胞培养用培养基的培养基(非专利文献2)。
角膜内皮细胞的培养中存在这样的问题：角膜内皮细胞在培养中发生形态变化，变为成纤维细胞样细胞(专利文献4及非专利文献3)。
因此，报告了如下方法：即，通过在存在Rho激酶抑制剂的状态下培养角膜内皮细胞，从而防止角膜内皮细胞的形态变化并且促进角膜内皮细胞的附着，进而制造具有高细胞密度的移植用角膜内皮细胞层的方法(专利文献5)。在这里，作为角膜内皮细胞培养用培养基，使用添加了15％FCS、2ng/mL b-FGF及抗生素的低葡萄糖浓度DMEM培养基，作为基础培养基(非专利文献4)。此外，已知当人ES细胞在培养中发生细胞死亡时，Rho激酶活化，并且已知，抑制Rho激酶的ROCK抑制剂((+)-反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲酰)环己烷、1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪等)抑制这种细胞死亡(非专利文献5)。
此外，作为培养角膜内皮细胞的方法，已知有如下角膜内皮细胞的培养法：使用添加了20ng/mL NGF、5ng/mL EGF、20μg/mL抗坏血酸、200μg/mL CaCl2、100μg/mL下垂体提取物、及0.08％(w/v)硫酸软骨素及抗生素的Opti-MEM-1(Gibco公司制)的培养法(非专利文献6)。但是，使用了培养角膜内皮细胞所得到的细胞的、用于改善角膜内皮功能不全患者的角膜内皮功能的移植治疗，还没有达到实用化。
现有技术文献：
专利文献
专利文献1:日本国特开2004-24852号公报
专利文献2:日本国特开2006-187281号公报
专利文献3:日本国特开2005-229869号公报
专利文献4:日本国特开2006-204527号公报
专利文献5:WO2009/028631
非专利文献
非专利文献1:Price FW.Jr.et al.,J Refract Surg.21,339-45(2005)
非专利文献2:Peh GSL.et al.,Transplantation 91,811-9(2011)
非专利文献3:Koizumi N.et.al.,The science Engineering Reviewof Doshisha Univ.52,31-36(2012)
非专利文献4:Miyata K.et al.,Cornea 20,59-63(2001)
非专利文献5:Watanabe K.et al.,Nat Biotechnol.25,681(2007)
非专利文献6:Joyce NC.Et al.,Cornea 23,S8-19(2004)
发明内容
发明要解决的课题
基于上述背景，本发明的目的在于，提供一种细胞的培养方法，其可用于改善角膜内皮功能不全患者的角膜内皮功能的移植治疗。
解决课题的方法
在针对上述目的的研究中发现，通过用间充质干细胞的条件培养基(MSC条件培养基)或含有MSC条件培养基的培养基来培养角膜内皮细胞，能够使几乎不含成纤维样细胞并且在形态学上不变成角膜内皮细胞的细胞增殖，从而完成本发明。即，本发明提供以下。
(1)一种角膜内皮细胞培养用培养基，其由间充质干细胞的条件培养基构成，或者含有所述条件培养基，
(2)根据上述(1)所记载的角膜内皮细胞培养用培养基，其以0.5-50％(v/v)的比率含有所述条件培养基，
(3)根据上述(1)所记载的角膜内皮细胞培养用培养基，其以1-10％(v/v)的比率含有所述条件培养基，
(4)根据上述(1)-(3)中任一项所记载的培养基，所述条件培养基是通过将所述间充质干细胞在w培养基中培养而得到，所述培养基以0.04-0.12％(w/v)浓度含有硫酸软骨素，
(5)根据上述(4)所记载的培养基，其中，所述硫酸软骨素的浓度为0.08％(w/v)，
(6)一种角膜内皮细胞培养用培养基，其含有浓缩液，所述浓缩液是通过将间充质干细胞的条件培养基过滤浓缩而得到的，
(7)根据上述(6)所记载的角膜内皮细胞培养用培养基，其中，所述过滤浓缩进行的浓缩倍率为2-30倍，
(8)根据上述(6)所记载的角膜内皮细胞培养用培养基，其中，所述过滤浓缩进行的浓缩倍率为15-20倍，
(9)根据上述(6)-(8)中任一项所记载的角膜内皮细胞培养用培养基，其以0.5-50％(v/v)的比率含有所述浓缩液，
(10)根据上述(6)-(8)中任一项所记载的角膜内皮细胞培养用培养基，其以1-10％(v/v)的比率含有所述浓缩液，
(11)根据上述(6)-(10)中任一项所记载的角膜内皮细胞培养用培养基，所述条件培养基是通过将所述间充质干细胞在培养基中培养而得到的，所属培养基以0.04-0.12％(w/v)浓度含有硫酸软骨素，
(12)根据上述(11)所记载的角膜内皮细胞培养用培养基，其中，所述硫酸软骨素的浓度为0.08％(w/v)，
(13)根据上述(1)-(12)中任一项所记载的培养基，其中，所述间充质干细胞为人间充质干细胞，
(14)根据上述(1)-(12)中任一项所记载的培养基，其中，所述间充质干细胞为来自人骨髓的间充质干细胞，
(15)一种角膜内皮细胞的培养方法，其包括从角膜组织分离角膜内皮细胞的步骤、及使用上述(1)-(14)中任一项所记载的培养基，对所述分离的角膜内皮细胞进行培养增殖的步骤，
(16)一种细胞，其通过上述(15)所记载的培养方法而得到，
(17)根据上述(16)所记载的细胞，其以80％以上的比率含有Na+/K+-ATPase及ZO-1均表达的细胞，
(18)根据上述(16)或(17)所记载的细胞，其中，成纤维细胞样细胞的混合比率不足0.2％，
(19)根据上述(16)-(18)中任一项所记载的细胞，其以10％以上的比率含有Ki-67阳性细胞，
(20)一种角膜内皮功能不全的治疗药，其含有上述(16)-(19)中任一项所记载的细胞，
(21)根据上述(20)所记载的治疗药，所述角膜内皮功能不全为大泡性角膜病变。
发明的效果
根据本发明，可以稳定供给可移植给角膜内皮功能不全患者的、质量稳定的角膜内皮细胞，因此可以解决角膜移植的捐赠者不足。
附图说明
图1是示出人角膜内皮培养细胞的外观形状的细胞放大图。(A)示出用MSC条件培养基培养的细胞的外观形状，(B)示出用基本培养基培养(对照培养)的细胞的外观形状。
图2是示出，通过实时PCR法测定的，用MSC条件培养基培养的细胞(MSC)及用基本培养基培养(对照培养)的细胞(Control)的，TGF相关基因表达量的图。(A)示出TGFβ1的表达量，(B)示出TGFβ2的表达量，(C)示出TGFβ1受体的表达量，(D)示出TGFβ2受体的表达量。表达量表示以对照培养的细胞的表达量作为1.0时的相对量(纵轴)。
图3是示出通过实时PCR法测定的，用MSC条件培养基培养的细胞(MSC)及用基本培养基培养(对照培养)的细胞(Control),的，成纤维细胞相关基因的表达量的图。(A)示出I型胶原蛋白的表达量，(B)示出纤连蛋白的表达量，(C)示出IV型胶原蛋白的表达量。表达量表示以对照培养的细胞的表达量作为1.0时的相对量(纵轴)。
图4是示出关于用MSC条件培养基培养的细胞(MSC)及用基本培养基培养(对照培养)的细胞(Control)，基于BrdU摄取率测定细胞增殖的结果的图。BrdU摄取率表示以对照培养的细胞的BrdU摄取量作为1.0时的相对量(纵轴)。星号(*)表示t检验中的统计学的显著性差异(p＜0.05)(n＝3)。
图5是示出关于用MSC条件培养基培养的细胞(MSC)及用基本培养基培养(对照培养)的细胞(Control)的，Ki-67蛋白质的阳性细胞比率(％)的图。星号表示t检验中的统计学的显著性差异(p＜0.05)(n＝3)。
图6是示出MSC条件培养基浓缩液的添加试验结果的图。BrdU摄取率表示以在MSC条件培养基中培养的细胞的BrdU摄取量作为1.0时的相对量(纵轴)。
具体实施方式
在本发明中，间充质干细胞(MSC)是指来自间充质的干细胞或其前体细胞，其可在未分化的状态下增殖并分化为至少2种细胞。由间充质干细胞分化诱导的细胞为，例如成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞。
本发明中所使用的间充质干细胞优选为人间充质干细胞(hMSC)。已知MSC可以从骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带血、胎盘、及羊膜等各种组织获取。本发明中使用的MSC与这些获取来源的组织无关，全部可以使用，但优选来自骨髓的MSC。另外，间充质干细胞可以通过各种方法来获取，例如在来自骨髓的MSC的情况下，可以用专利文献(特表平7-500001)等记载的方法来获取。
本发明中所使用的人间充质干细胞可以利用表面抗原的表达规律来进一步指定，在使用特异性抗体进行流式细胞仪分析的情况下，优选地，CD29、CD44及CD105为阳性，CD34及CD45为阴性，更优选地，CD29、CD44、CD73、CD90及CD105为阳性，CD34及CD45为阴性，进一步优选地，CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105及CD166为阳性，CD34及CD45为阴性，进一步更优选地，CD13、CD29、CD44、CD49a、CD49e、CD73、CD90、CD105及CD166为阳性，CD34及CD45为阴性。
在本发明中，间充质干细胞的条件培养基(MSC条件培养基)是指，在培养基中培养间充质干细胞后，除去细胞而得到的培养基。
在本发明中，为了调制MSC条件培养基，MSC的培养所使用的MSC培养用培养基只要是能够培养MSC的培养基，就没有特别限制，例如，可以使用含有胎牛血清(FCS)的Fitton-Jackson ModificationBGJb培养基、添加了胎牛血清(FCS)的F-12营养混合物培养基(Ham)、添加了胎牛血清(FCS)的DMEM培养基、添加了胎牛血清(FCS)的Dulbecco/Ham F12为1:1的混合培养基、添加了胎牛血清(FCS)及4mM丙氨酰谷氨酰胺的Dulbecco/Ham F121:1混合培养基、添加了胎牛血清(FCS)的Opti-MEM I减血清培养基，液体(Opti-MEM I Reduced-Serum Medium,Liquid)(Gibco公司制)、添加了胎牛血清(FCS)、200μg/mL CaCl2·2H2O及0.08％(w/v)硫酸软骨素的Opti-MEMI减血清培养基，液体(Gibco公司制)等。上述培养基中所含有的胎牛血清的浓度优选为5-20％(v/v)，更优选为6-12％(v/v)，进一步优选为7.5-10.5％(v/v)，特别是在使用Opti-MEMI减血清培养基，液体的情况下，约为8％(v/v)，在使用其他基础培养基的情况下，约为10％(v/v)。此外，Opti-MEM I减血清培养基，液体(Gibco公司制)为，在Eagle基础培养基中添加了HEPES、重碳酸钠、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、胰岛素、及转铁蛋白等的培养基。
添加胎牛血清前，MSC培养用培养基含有氨基酸、维生素、无机盐类及其他成分。MSC培养用培养基中含有的氨基酸的种类及浓度，可以从表1中适当地选择。
[表1]
表1 MSC培养用培养基中含有的氨基酸的种类及浓度
(添加胎牛血清前的浓度)
| mM | |
| 甘氨酸 | 0-12.8 |
| L-丙氨酸 | 0-3.4 |
| L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 | 0-1.2 |
| L-谷氨酰胺 | 0-5 |
| L-精氨酸 | 0.48-1.2 |
| L-天冬酰胺 | 0-1.2 |
| L-天冬氨酸 | 0-1.4 |
| L-胱氨酸 | 0.08-0.7 |
| L-谷氨酸 | 0-0.12 |
| L-组氨酸 | 0.12-1.2 |
| L-异亮氨酸 | 0.028-1.0 |
| L-亮氨酸 | 0.08-1.0 |
| L-赖氨酸 | 0.16-2.0 |
| L-蛋氨酸 | 0.025-0.4 |
| L-苯丙氨酸 | 0.025-0.5 |
| L-脯氨酸 | 0-4.2 |
| L-丝氨酸 | 0-0.3 |
| L-苏氨酸 | 0.08-0.96 |
| L-色氨酸 | 0.008-0.095 |
| L-酪氨酸 | 0.024-0.48 |
| L-缬氨酸 | 0.08-1.0 |
| L-半胱氨酸 | 0.08-0.12 |
MSC培养用培养基中含有的维生素的种类及浓度，可以从表2中适当地选择。
[表2]
表2 MSC培养用培养基中含有的维生素的种类及浓度
(添加胎牛血清前的浓度)
| mM | |
| 生物素 | 0-0.001 |
| 氯化胆碱 | 0.0056-0.12 |
| D-泛酸钙 | 0.00032-0.01 |
| 叶酸 | 0.00036-0.011 |
| 烟酰胺 | 0.00023-0.2 |
| 吡哆醇 | 0-0.024 |
| 磷酸吡哆醛 | 0-0.00098 |
| 盐酸吡哆醛 | 0-0.006 |
| 核黄素 | 0-0.0007 |
| 盐酸硫胺 | 0.0011-0.015 |
| 维生素B-12 | 0-0.015 |
| i-肌醇 | 0.0014-0.12 |
| 抗坏血酸 | 0-0.35 |
| DL-α-生育酚 | 0-0.0018 |
| 对氨基苯甲酸 | 0-0.018 |
MSC培养用培养基中含有的无机盐类的种类及浓度，可以从表3中适当地选择。
[表3]
表3 MSC培养用培养基中含有的无机盐的种类及浓度
(添加胎牛血清前的浓度)
| mM | |
| CaCl2·2H2O | 0-2.2 |
| CuSO4·5H2O | 0-0.000012 |
| FeSO4·7H2O | 0-0.0018 |
| Fe(NO3)3·9H2O | 0-0.00015 |
| MgCl2·6H2O | 0-0.85 |
| MgSO4 | 0-0.98 |
| KCl | 2.4-6.4 |
| KH2PO4 | 0-1.45 |
| NaHCO3 | 1.1-54 |
| NaCl | 70-140 |
| Na2HPO4 | 0-1.2 |
| NaH2PO4 | 0-1.2 |
| ZnSO4·7H2O | 0-0.0036 |
MSC培养用培养基中含有的其他成分的种类及浓度，可以从表4中适当地选择。
[表4]
表4 MSC培养用培养基中含有的其他成分的种类及浓度
(添加胎牛血清前的浓度)
| mM | |
| D-葡萄糖 | 4.5-67 |
| 次黄嘌呤 | 0-0.036 |
| 亚油酸 | 0-0.00036 |
| 硫辛酸 | 0-0.0012 |
| 酚红 | 0-0.0035 |
| 腐胺(Putrescine 2HCl) | 0-0.0012 |
| 丙酮酸钠 | 0-1.2 |
| 胸腺嘧啶 | 0-0.0035 |
| 乳酸钙 | 0-3.1 |
| 乙酸钠 | 0-0.072 |
| IIEPES | 0-18 |
在本发明中，表5示出可以适合用作MSC培养用培养基的培养基，在添加胎牛血清前的组成。在表5中，培养基A为Fitton-JacksonModification BGJb培养基，培养基B为F-12营养混合物培养基(Ham)，培养基C为DMEM培养基，培养基D为Dulbecco/Ham F12为1:1的混合培养基，培养基E为EMEM培养基。
在培养基中，可以适当地添加一种或两种其他成分，所述其他成分选自上皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、胰岛素、转铁蛋白、胰岛素样生长因子(IGF)等生长因子、抗坏血酸、硫酸软骨素、庆大霉素等抗生素、及酚红等pH指示剂等。向培养基中添加EGF时，其浓度优选为1-50ng/mL，更优选为5-40ng/mL，进一步优选为约20ng/mL。向培养基中添加bFGF时，其浓度优选为1-20ng/mL，更优选为3-7ng/mL，进一步优选为约5ng/mL。向培养基中添加NGF时，其浓度优选为1-25ng/mL，更优选为3-7ng/mL，进一步优选为约5ng/mL。添加胰岛素时，其浓度优选为1-200μg/mL。添加转铁蛋白时，其浓度优选为1-200μg/mL。向培养基中添加抗坏血酸(或其盐)时，其浓度为：作为抗坏血酸优选为5-40μg/mL，更优选为10-30μg/mL，进一步优选为约20μg/mL。添加硫酸软骨素(或其盐)时，其浓度优选为0.04-0.12％(W/V)，更优选为0.06-0.10％(w/v)，进一步优选为约0.08％(w/v)。
另外，在不优选使用作为来自生物的成分的FCS的情况下，可以使用无血清培养基作为MSC培养用培养基。
[表5]
表5 MSC培养用培养基的组成
(浓度为添加胎牛血清前的浓度，全部用mM单位表示)
[表6]
表5 MSC培养用培养基的组成(续)
在本发明中，就用于调制MSC条件培养基的MSC的培养而言，在细胞培养用烧瓶中，优选以1×103至2×104个/cm2的密度，更优选以2×103至1×104个/cm2的密度，进一步优选以3×103至5×103个/cm2的密度接种MSC而开始。另外，此时，每1cm2培养面积所添加的MSC培养用培养基的量，优选为0.15-0.5mL，更优选为0.2-0.3mL。另外，此时所使用的细胞培养用烧瓶，优选为底面由胶原蛋白、纤连蛋白等涂覆的烧瓶；底面由带负电荷的官能团等修饰的烧瓶，例如为原代培养皿(BD公司制)。培养开始后，培养MSC，直到细胞占据细胞培养用烧瓶的底面的，优选30-80％，更优选50-70％。然后回收培养基(第1次回收)，并更换成新的培养基，进一步培养细胞。此时每1cm2培养面积所添加的培养基的量优选为0.15-0.5mL，进一步优选为0.2-0.3mL。更换培养基后，优选地，将细胞培养8-24小时后，进一步优选地，将细胞培养12-18小时后，回收培养基(第2次回收)。进一步地，以同样方式反复进行培养基的更换和回收，优选进行3-7次，进一步优选进行3-5次(第3次以后的回收)。
在第1次回收、第2次回收及第3次以后的回收中所回收的培养基，均可用作MSC条件培养基，也可以将这些混合，作为MSC条件培养基，但在第2次回收以后中所回收的培养基，特别适合用作MSC条件培养基。另外，此时MSC条件培养基的回收，优选通过将培养液离心并回收上清液来进行。回收后的MSC条件培养基还可以通过适当的膜过滤等除菌。另外，由于MSC条件培养基可以冷冻，因此可以在冷冻状态下长期保存、运输等。但是，MSC条件培养基在4℃下也可以保存10-14天。
在本发明中，MSC条件培养基可以直接用作人角膜内皮细胞培养用的培养基，也可以适当添加一种或者两种以上其他成分而使用，所述其他成分选自上皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、胰岛素、转铁蛋白、胰岛素样生长因子(IGF)等生长因子、抗坏血酸、硫酸软骨素、抗生素等。向培养基中添加EGF时，其浓度优选为1-50ng/mL，更优选为5-40ng/mL，进一步优选为约20ng/mL。向培养基中添加bFGF时，其浓度优选为1-20ng/mL，更优选为3-7ng/mL，进一步优选为约5ng/mL。向培养基中添加NGF时，其浓度优选为1-25ng/mL，更优选为3-7ng/mL，进一步优选为约5ng/mL。添加胰岛素时，其浓度优选为1-200μg/mL。添加转铁蛋白时，其浓度优选为1-200μg/mL。向培养基中添加抗坏血酸(或其盐)时，其浓度为：作为抗坏血酸优选为5-40μg/mL，更优选为10-30μg/mL，进一步优选为约20μg/mL。添加硫酸软骨素(或其盐)时，其浓度优选为0.04-0.12％(W/V)，更优选为0.06-0.10％(w/v)，进一步优选为约0.08％(w/v)。
MSC条件培养基可以直接用作人角膜内皮细胞培养用的培养基，也可以将MSC条件培养基添加至其他培养基，将所得培养基用作人角膜内皮细胞培养用的培养基。在这种情况下，在其他培养基中添加的MSC条件培养基的量，相对于其他培养基的液体量，优选为10-98％(v/v)，更优选为50-98％(v/v)，进一步优选为80-98％(v/v)的液体量。
另外，也可以使用一种如下的培养基作为人角膜内皮细胞培养用的培养基：将MSC条件培养基浓缩，作为人间充质干细胞的条件培养基浓缩液(MSC条件培养基浓缩液)，将所述浓缩液添加到其他培养基而得到的培养基。条件培养基浓缩液可以通过使用了超滤膜的过滤浓缩、减压浓缩、冷冻干燥等方法，浓缩MSC条件培养基来调制。过滤浓缩中所使用的超滤膜，优选细胞色素C的浓缩回收率为90％以上的膜，例如为10kDa截留膜(Millipore公司制)，更优选细胞色素C的浓缩回收率为95％以上的膜，例如为3kDa截留膜(Millipore公司制)。另外，浓缩倍率([浓缩前的液量]/[浓缩后的液量])优选为2-30倍，更优选为10-25倍，进一步优选为15-20倍。在这种情况下，在其他培养基中添加的MSC条件培养基浓缩液的量，相对于其他培养基的液体量，优选为1-20％(v/v)，更优选为2-15％(v/v)，进一步优选为3-10％(v/v)的液体量。
就添加MSC条件培养基或MSC条件培养基浓缩液的其他培养基而言，优选现有文献(Peh GSL.et al.,Transplantation 91,811-9(2011)等)中公开的人角膜内皮细胞培养用的培养基，例如，添加了8％(v/v)FCS、200μg/mL CaCl2·2H2O、0.08％(w/v)硫酸软骨素、20μg/mL抗坏血酸、及5ng/mL EGF的Opti-MEM I减血清培养基，液体培养基(Gibco公司制)。但是，不限定于此，也可以使用添加了5-15％(v/v)浓度的FCS的、上述表5中示出了组成的培养基，或者适当调整了这些培养基组成的培养基。另外，也可以在培养基中适当添加一种或两种以上其他成分而使用，所述其他成分选自上皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、胰岛素、转铁蛋白、胰岛素样生长因子(IGF)等生长因子、抗坏血酸、硫酸软骨素、抗生素等。向培养基中添加EGF时，其浓度优选为1-50ng/mL，更优选为5-40ng/mL，进一步优选为约20ng/mL。向培养基中添加bFGF时，其浓度优选为1-20ng/mL，更优选为3-7ng/mL，进一步优选为约5ng/mL。向培养基中添加NGF时，其浓度优选为1-25ng/mL，更优选为3-7ng/mL，进一步优选为约5ng/mL。添加胰岛素时，其浓度优选为1-200μg/mL。添加转铁蛋白时，其浓度为1-200μg/mL。向培养基中添加抗坏血酸(或其盐)时，其浓度为：作为抗坏血酸优选为5-40μg/mL，更优选为10-30μg/mL，进一步优选为约20μg/mL。添加硫酸软骨素(或其盐)时，其浓度优选为0.04-0.12％(W/V)，更优选为0.06-0.10％(w/v)，进一步优选为约0.08％(w/v)。另外，还可以在培养基中适当地添加庆大霉素等抗生素、酚红等pH指示剂。另外，在不优选使用作为来自生物的成分的FCS的情况下，也可以使用无血清培养基。
在本发明中，作为人角膜内皮细胞培养用培养基，也可以使用添加了六氢-1-(5-异喹啉基磺酰基)-1H-1,4-二氮杂卓(法舒地尔)、1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪(Y-27632)、氨基乙酰基H-1152二盐酸盐、3-(4-吡啶基)吲哚、N-(4-吡啶基)-N’-(2,4,6-三氯苯基)脲等Rho激酶抑制剂(包括它们的盐、水和物)的培养基。添加Y-27632作为Rho激酶抑制剂时，其浓度优选为0.5-2.0μmol/L，更优选为1.0-1.8μmol/L，进一步优选为约1.5μmol/L。
另外，作为人角膜内皮细胞培养用培养基，也可以使用添加了SB431542、A-83-01等ALK-5抑制剂(包括它们的盐、水和物)的培养基。添加SB431542作为ALK-5抑制剂时，其浓度优选为0.5-1.5μmol/L，更优选为0.7-1.2μmol/L，进一步优选为约1μmol/L。ALK-5抑制剂可以单独使用，或者也可以与Rho激酶抑制剂组合使用。
在本发明中，供原代培养的人角膜内皮细胞为从人角膜组织分离的细胞。这种人角膜组织可以使用市售的产品作为研究用人角膜组织，但以遵守赫尔辛基宣言、各国法令、由各国管理当局的通知等规定的基准、以及基于这些而制作的伦理规定为条件，也可以使用捐赠到眼库中的人角膜组织。
在本发明中，人角膜内皮细胞的培养通过如下方式进行：即，将MSC条件培养基、含有MSC条件培养基(或其浓缩液)的培养基、或者在这些培养基中添加了一种或两种以上选自EGF、bFGF、NGF、IGF、胰岛素等生长因子、抗坏血酸、硫酸软骨素、抗生素，Rho激酶抑制剂、ALK-5抑制剂等其它成分的培养基，作为人角膜内皮细胞培养用培养基。另外，人角膜内皮细胞培养中所使用的细胞培养用烧瓶，优选为底面由胶原蛋白、纤连蛋白等涂覆的烧瓶，底面由带负电荷的官能基修饰的烧瓶，例如为原代培养皿(BD公司制)。
在本发明中，接种从人角膜组织分离的人角膜内皮细胞，使其占据细胞培养用烧瓶的底面的优选20-50％，更优选25-40％，进一步优选约三分之一，从而进行原代培养。在原代培养中，培养人角膜内皮细胞，优选直到其占据细胞培养用烧瓶的底面的70％以上，更优选直到成为融合状态。
人角膜内皮细胞可以在原代培养后继续进行继代培养。在继代培养中，接种人角膜内皮细胞，使其占据细胞培养用烧瓶的底面的优选20-50％，更优选25-40％，进一步优选约三分之一，继代培养中所使用的人角膜内皮细胞培养用培养基可以是与原代培养相同的培养基，也可以是组成与原代培养基不同的培养基。在继代培养中，培养人角膜内皮细胞，优选地，直到其占据细胞培养用烧瓶的底面的70％以上，更优选地，直到成为融合状态。就继代培养而言，用显微镜观察细胞时，只要细胞的形态等未出现变化，就可以不特别限定地重复进行，其次数优选为1-5次。通过原代培养及其后继续进行的继代培养，可以使从人角膜组织分离的人角膜内皮细胞增加200倍以上。
此外，在本发明中，人角膜内皮细胞除了指构成人角膜内皮的人角膜内皮细胞，还指对人角膜内皮细胞进行原代培养或继代培养而得到的、在显微镜下观察时在细胞培养用烧瓶的内表面上显示一层多边形形状的细胞。
已知人角膜内皮细胞在体外培养时通常产生成纤维样细胞。本发明中，在显微镜下观察时，通过原代培养或继代培养得到的细胞中，成纤维样细胞的存在比率(成纤维样细胞的个数/总细胞数×100％)优选为不足0.5％，更优选为不足0.2％，进一步优选为不足0.1％。成纤维样细胞的存在比率超过1％的，不能够用作移植用细胞。另外，达到融合状态时，细胞培养用烧瓶的内表面上的细胞密度优选为1500个/mm2以上，更优选为1800个/mm2以上。
另外，在通过原代培养或继代培养得到的人角膜内皮细胞中，Na+/K+-ATPase及ZO-1均为阳性(双阳性)的细胞的存在比率(双阳性的细胞数/总细胞数×100％)优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上。双阳性的存在比率不足50％的，不能用作移植用细胞。
在本发明中，用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等酶，将通过原代培养或继代培养得到的人角膜内皮细胞从细胞培养用烧瓶剥离后，用PBS等洗净，从而除去酶，然后使其以所期望的浓度悬浊于所期望的缓冲液中，其可以用作移植给患有大泡性角膜病变等角膜内皮功能不全的患者的移植用细胞。此时使用的缓冲液可以适当使用醋酸林格氏液、重碳酸林格氏液。对患者的细胞的移植，通过用注射器将含有所期望数量的细胞的细胞悬浊液注入到患者眼球内而进行。注入到患者眼球内的细胞，植入到患者的角膜组织，并可以作为角膜内皮细胞起作用。
另外，人角膜内皮细胞也可以冷冻保存直到使用时。人角膜内皮细胞的冷冻保存，是通过将细胞悬浊至细胞保存液并将其分注至管中，在液氮中进行的。作为细胞保存液，可以使用含有20％DMSO及8.8％白蛋白的醋酸林格氏液或重碳酸林格氏液。这样冷冻保存的细胞能够作为细胞药物流通于市场并供给至医疗机构。
实施例1
下面，参照实施例进一步详细地说明本发明，但本发明无意限定于实施例。
〔人间充质干细胞的条件培养基(hMSC条件培养基)的制作〕
在150mm细胞培养板(Corning公司制)接种来自人骨髓的人间充质干细胞，使其成为5,000-10,000cells/cm2的密度，用10％FCS/DMEM培养基培养直到成为亚融合状态。用PBS(-)将细胞洗净2次后，进行胰蛋白酶处理，从而将细胞从细胞培养板剥下来，然后添加10％FCS/DMEM培养基并悬浊后，进行离心(1200rpm，5分钟)，回收细胞。用10％FCS/DMEM培养基悬浊细胞，并在150mm细胞培养板(Corning公司制)中接种，使其成为3,000-5,000cells/cm2的密度，培养直到细胞密度成为50-70％。弃掉培养基，加40mL添加了8％FCS、200μg/mL CaCl2·2H2O、0.08％(w/v)硫酸软骨素C钠(WAKO)及50μg/mL庆大霉素的Opti-MEM I减血清培养基,液体(Gibco公司制)培养基，培养约16小时。培养后，回收培养基并离心(1500rpm，5分钟)，用0.2μm薄膜过滤器过滤得到的上清液。在板中添加40mL新的培养基，进一步培养细胞，以后以3-5天的间隔，每12-24小时重复进行回收培养基和添加新培养基。将回收的培养基离心(1500rpm，5分钟)，用0.2μm薄膜过滤器过滤得到的上清液。过滤后的培养基作为人间充质干细胞的条件培养基(hMSC条件培养基)。hMSC条件培养基在4℃或冷冻(-30℃)保存，在4℃保存的情况下，保存期限为10天。
〔人角膜内皮细胞的原代培养〕
用镊子将人角膜内皮细胞和基底膜(后弹力层)一起从研究用人角膜组织(Seattle Eye Bank公司制)剥离。在剥离的人角膜内皮细胞中添加胶原蛋白酶溶液(以1mg/mL的浓度添加了胶原蛋白酶的Opti-MEM I减血清培养基)并静置，使人角膜内皮细胞从基底膜剥离。然后轻轻振荡混合使细胞悬浊，在其中添加人角膜内皮细胞培养用基本培养基(添加了8％FCS、200μg/mL CaCl2·2H2O、0.08％(w/v)硫酸软骨素、20μg/mL抗坏血酸、50μg/mL庆大霉素、5ng/mL EGF及1μmol/L SB431542(TOCRIS公司制)的Opti-MEM I减血清培养基,液体培养基，以下记作“基本培养基”)，进行离心(1200rpm，5分钟)，回收细胞。
用hMSC条件培养基悬浊细胞，在细胞培养板(Corning公司制)接种细胞，使其密度成为细胞占据烧瓶的底面的三分之一被，在37℃、存在5％CO2的状态下培养。作为对照培养，用基本培养基同样地培养细胞。此外，人角膜内皮细胞培养用基本培养基(基本培养基)是如下这种培养基：在现有文献(Joyce NC.Et al.,Cornea 23,S8-19(2004))公开的人角膜内皮细胞培养用培养基中，进行去除NGF及下垂体提取物等改变的培养基。原代培养进行直到细胞达到融合状态，此期间，每2天交换培养基。
〔人角膜内皮细胞的继代培养〕
在上述原代培养中，除去培养基，用PBS(-)将培养直到融合状态的人角膜内皮细胞洗净2次后，进行胰蛋白酶处理，从而剥离。添加基本培养基使细胞悬浊，然后进行离心，回收细胞。用hMSC条件培养基使细胞悬浊，在细胞培养用培养皿中接种细胞，使其占据培养皿底面约三分之一，培养直到成为融合状态。关于对照培养，使用基本培养基同样地进行继代培养。
〔细胞的形态学评价〕
在上述人角膜内皮细胞的原代培养中，在细胞达到融合状态的时间点，用相差显微镜观察细胞的形态。其结果为，在用hMSC条件培养基培养的细胞中，没有看到成纤维细胞样细胞，几乎全部的细胞显示为与正常的人视网膜内皮细胞相同的一层多边形形状，因为在显微镜下观察的全部细胞(约500个)显示为多边形形状，所以推算成纤维细胞样的存在比率不足五百分之一(图1A)。另一方面，在对照培养的细胞中，半数以上的细胞显示为纺锤形的成纤维细胞样的形态(图1B)。可以认为，在作为人角膜内皮细胞而移植的情况下，成纤维细胞样的细胞是导致角膜的非透明化的原因。因此，作为人角膜内皮细胞而移植的细胞，不含有这种成纤维细胞样的细胞是必要条件。可以说，用hMSC条件培养基培养而得到的细胞，满足所述必要条件。
另外，用角膜内皮细胞密度测定用软件(Konan Medical Inc.KSS-400EB software)，测定达到融合状态的时间点时时的细胞培养板上的细胞密度，就对照培养的细胞而言，烧瓶底面的细胞密度为1202个/mm2，与此相对，用hMSC条件培养基培养的细胞的密度为1845个/mm2。鉴于角膜功能不全患者的角膜内皮细胞密度减小，将用hMSC条件培养基培养的可以增殖到高细胞密度的细胞，作为用于移植给该疾病的细胞，可期待较高的临床效果。
〔通过实时PCR法进行的TGF相关基因表达量的测定〕
用RNeasy(QIAGEN公司制)从原代培养开始240天后(继代次数为7次)的角膜内皮细胞中提取全部mRNA，以提取的全部mRNA作为模板，用ReverTra Ace(TOYOBO公司制)进行逆转录反应(42℃,60分钟)，用寡聚dT法合成单链DNA。以所述单链DNA作为模板，通过用TaqManFastAdvanced Master Mix(Applied Biosystems公司制)的实时PCR法，在分别使用基本培养基及hMSC条件培养基培养的细胞间，比较TGFβ1、TGFβ2、TGFβI型受体(TGFβR1)、及TGFβⅡ型受体(TGFβR2)的基因表达量。此外，作为实时PCR法的内标，使用GAPDH基因。另外，用StepOne(注册商标)实时PCR系统(Applied Biosystems公司制)，PCR反应进行40次循环(95℃15秒+60℃30秒)。另外，PCR反应中使用如下所示的引物(TaqMan(注册商标)引物,Invitrogen公司制)。即，对于TGFβ1使用Hs99999918_m1，对于TGFβ2使用Hs00234244_m1，对于TGFβR1使用Hs00610320_m1，对于TGFβR2使用Hs00234253_m1。对于GAPDH使用Hs00266705_g1。
在用hMSC条件培养基培养的细胞中，与用基本培养基培养(对照培养)的细胞相比，TGFβ1、TGFβ2、TGFβR1及TGFβR2的基因表达量均较少(图2)。已知TGFβ1及TGFβ2介由受体诱导角膜内皮细胞的分化。因此认为用hMSC条件培养基培养的细胞与对照培养的细胞相比，可以抑制介由这些TGF的分化诱导，从而具有更接近干细胞的性质。
〔通过实时PCR法进行的成纤维细胞相关基因表达量的测定〕
然后，通过实时PCR法，在分别用基本培养基及hMSC条件培养基培养的人角膜内皮细胞间，比较I型胶原蛋白、纤连蛋白、IV型胶原蛋白基因表达量。此外，作为实时PCR法的内标，使用GAPDH基因。此时，PCR反应中使用如下所述的引物(TaqMan(注册商标)引物,Invitrogen公司制)。即，对于I型胶原蛋白使用Hs00164004_m1，对于纤连蛋白使用Hs01549976_m1，对于IV型胶原蛋白使用Hs00266237_m1，对于GAPDH使用Hs00266705_g1。
在用hMSC条件培养基培养的细胞中，与用基本培养基培养(对照培养)的细胞相比，I型胶原蛋白、纤连蛋白的基因表达量明显较低(图3A、B)。I型胶原蛋白及纤连蛋白是在成纤维细胞中强表达、但相反在正常人角膜内皮细胞中的表达量低的分子。如图1(A)所示，就使用hMSC条件培养基培养的细胞而言，几乎全部的细胞在形态学上显示与正常人视网膜内皮细胞相同的一层多边形形状，没有看到存在成纤维细胞样的细胞，但这些基因的表达量明显低的情况在基因水平上表示：在用hMSC条件培养基培养人角膜内皮细胞的情况下，几乎不产生成纤维细胞样细胞。此外，IV型胶原蛋白的基因表达量在两细胞间没有显著的差异(图3C)。
〔角膜内皮细胞的功能性标记的表达量的测定〕
对用上述对照培养及hMSC条件培养基培养的原代培养开始210天后(继代次数为4次)的人角膜内皮细胞，进行胰蛋白酶处理，使其从培养烧瓶剥离，进行离心并回收剥离的细胞后，使其分别悬浊于基础培养基及hMSC条件培养基中，在48孔板(Corning公司制)中以300个/mm2的密度接种并培养一夜。将培养基更换为新的相同的培养基，进一步将细胞培养6天后，在室温下在4％多聚甲醛中浸泡10分钟从而固定，用酸醇溶液进行渗透化处理。然后，将细胞在封闭液(含有10％胎牛血清的PBS)中在室温下静置1小时，然后，添加抗人Na+/K+-ATPase抗体或抗人ZO-1抗体，在室温下静置1小时。除去抗体溶液，用PBS(-)将细胞洗净3次后，添加ALEXA488抗体(Molecular Probes公司制)或ALEXA594羊抗小鼠IgG抗体(Molecular Probes公司制)作为二次抗体，在室温下静置1小时。除去抗体溶液，用PBS(-)将细胞洗净3次后，用荧光显微镜(TCSSP2AOBS,Leica Microsystems公司制)拍摄细胞。其结果为，在用hMSC条件培养基培养的细胞中，几乎全部的细胞(至少80％以上的细胞)为Na+/K+-ATPase及ZO-1阳性。
Na+/K+-ATPase为担任泵功能的蛋白质之一，所述泵功能为角膜内皮细胞功能之一，其调节角膜内的水分量。另外，ZO-1为形成角膜内皮细胞的紧密连接(tight junction)的蛋白质之一，并与角膜内皮细胞的屏障功能有关。因此，就用hMSC条件培养基培养而得到的细胞而言，由于同时表达Na+/K+-ATPase和ZO-1，从而可以认为同时具有作为内皮细胞的主要功能，即泵功能和屏障功能，因此可以期待，通过移植给角膜功能不全患者，能够改善角膜内皮的功能。
〔通过BrdU摄取率进行的细胞增殖测定〕
对用上述对照培养及hMSC条件培养基培养的原代培养开始240天后(继代次数为5次)的人角膜内皮细胞，进行胰蛋白酶处理，使其从培养烧瓶剥离，进行离心并回收剥离的细胞后，分别悬浊于基础培养基及hMSC条件培养基，在96孔培养板中以5,000个/孔的接种密度接种并培养一夜。将培养基更换为新的相同的培养基，进一步将细胞培养5天后，在培养基中添加5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)，培养一夜。除去培养基，加固定溶液(Amersham cell proliferation biotrakELISA system,ver2,GE公司制)，室温下孵育30分钟。然后，除去固定溶液，加封闭液(Amersham cell proliferation biotrak ELISAsystem,ver2,GE公司制)，室温下静置30分钟。然后，除去封闭液，添加过氧化物酶结合抗BrdU抗体，室温下静置2小时。用洗净缓冲器将板洗净3次，加TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)底物(Amershamcell proliferation biotrak ELISA system,ver2,GE公司制)，静置5-30分钟。用1M硫酸停止反应，用酶标仪测定在450nm的吸光度。结果表示为5次测定的平均值±SEM。
其结果为，与用基础培养基培养的细胞相比，用hMSC条件培养基培养的细胞显示约1.5倍的BrdU摄取率，从而可知细胞增殖活跃(图4)。
〔Ki-67蛋白质表达量的测定〕
对用上述对照培养及hMSC条件培养基培养的原代培养开始240天后(继代次数为5回)的人角膜内皮细胞，进行胰蛋白酶处理，使其从培养烧瓶剥离，进行离心并回收剥离的细胞后，分别悬浊于基础培养基及hMSC条件培养基，在96孔培养板中以5,000细胞/孔的接种密度接种并培养一夜。将培养基更换为新的相同的培养基，进一步将细胞培养5天后，在室温下在4％多聚甲醛中浸泡10分钟从而固定，用酸醇溶液进行渗透化处理。然后，添加封闭液(含有10％胎牛血清的PBS)，使细胞在室温下静置1小时后，除去封闭液，然后添加抗人Ki-67抗体(DAKO公司制)，室温下静置1小时。除去抗体溶液，用PBS(-)将细胞洗净3次后，添加ALEXA488抗体(Molecular Probe公司制)作为二次抗体，室温下静置1小时。除去抗体溶液，用PBS(-)将细胞洗净3次后，在含有DAPI核染色的Vector Shield(VectorLaboratories公司制)中浸泡，将Ki-67阳性细胞染色。用荧光显微镜(BZ-9000,KEYENCE公司制)拍摄染色后的细胞，观察约300个细胞，从而算出Ki-67阳性细胞的比例(n＝3)。
其结果为，在用hMSC条件培养基培养的细胞中，Ki-67阳性细胞的比率为15.8％，与用基础培养基培养的细胞的该比率(10.8％)相比，明显较高(图5)。Ki-67蛋白质为与溶酶体RNA的合成有关并促进细胞增殖的核蛋白质。因此，其结果在基因水平上显示，用hMSC条件培养基培养的细胞的增殖活跃。
若将通过上述实时PCR法进行的TGF相关基因表达量及BrdU摄取率的测定结果合起来考虑，则可以说，用hMSC条件培养基培养的细胞与对照培养的细胞相比，是具有更接近干细胞的性质、并且增殖活跃的细胞。因此，当将用hMSC条件培养基培养得到的细胞移植给角膜内皮细胞密度减小的角膜内皮功能不全的患者时，可以期待：在移植目标的组织内，更长期地维持其性质，维持角膜内皮细胞的密度为高值，并改善角膜内皮的功能，其中，所述角膜内皮细胞的密度为临床上最重要的角膜内皮的指标。
〔hMSC条件培养基浓缩液的添加试验〕
对研究用人角膜(Seattle Eye Bank公司制)进行机械处理，使人角膜内皮细胞和基底膜(后弹力层)一起从角膜剥离。向剥离的人角膜内皮细胞添加胶原蛋白酶溶液并静置，使人角膜内皮细胞从基底膜剥离。然后轻轻振荡混合细胞使其悬浊，在其中添加基本培养基(添加了8％FCS、200μg/mL CaCl2·2H2O、0.08％(w/v)硫酸软骨素、20μg/mL抗坏血酸、50μg/mL庆大霉素、5ng/mL EGF及1μmol/LSB431542(TOCRIS公司)的Opti-MEM I减血清培养基,液体培养基)，进行离心(1200rpm，5分钟)，回收细胞。
在细胞培养用培养皿中接种细胞，使其密度为培养皿的底面的三分之一被细胞占据，用基本培养基培养细胞，所述基本培养基中添加了通过下述方法制作的hMSC条件培养基浓缩液。基本培养基中的hMSC条件培养基浓缩液的添加量相对于基本培养基为1％(v/v)、3％(v/v)及10％(v/v)。
通过上述BrdU摄取率测定细胞增殖。其结果为细胞的BrdU摄取率对添加的hMSC条件培养基浓缩液的浓度呈依赖性的上升，从而可知hMSC条件培养基浓缩液具有促进人角膜内皮细胞增殖的效果(图6)。另外，用添加了10％(v/v)hMSC条件培养基浓缩液的培养基培养的细胞表现了与用hMSC条件培养基培养的细胞相同的BrdU摄取率(图6)。
〔人间充质干细胞的条件培养基浓缩液(hMSC条件培养基浓缩液)的制作〕
在150mm细胞培养用培养皿中接种2×106个人间充质干细胞，加入添加了8％FCS、200μg/mL CaCl2·2H2O、0.08％(w/v)硫酸软骨素及50μg/mL庆大霉素的Opti-MEM I减血清培养基,液体培养基，培养一夜。然后，将培养基更换为添加了无血清培养基(添加了200μg/mL CaCl2·2H2O、0.08％(w/v)硫酸软骨素及50μg/mL庆大霉素的Opti-MEM I减血清培养基,液体培养基)，培养48小时。培养后，离心培养液(1500rpm，5分钟)并回收培养上清液。用超滤装置(3kDa截留,Amicon Ultra-PL 3,Millipore公司制)将回收的培养上清液浓缩约17倍，其作为hMSC条件培养基浓缩液。
〔基于人角膜内皮细胞的继代培养的大量制造〕
在上述原代培养中，培养人角膜内皮细胞直到成为融合状态。用PBS(-)将人角膜内皮细胞洗净2次后，进行胰蛋白酶处理，从而剥离。在细胞中加基本培养基使其悬浊，离心，回收细胞。使细胞悬浊在hMSC条件培养基中，在细胞培养用培养皿中接种细胞，以使培养皿底面约三分之一被细胞占据，在37℃下培养直到成为融合状态。重复进行5次这种继代培养。其结果可知，用hMSC条件培养基培养的细胞能够进行至少5次继代培养，并且通过继代培养细胞数量能够增加至少270倍。即，可以说用hMSC条件培养基的人角膜内皮细胞的培养法是大量制造移植用角膜内皮细胞的有效方法。由于通过使用这种培养法可以给医疗机构供给充足量的移植用角膜内皮细胞，因此可以期待解决角膜内皮功能不全患者的治疗中的捐赠者不足。
产业上的可利用性
根据本发明，能够稳定地供给可移植给角膜内皮功能不全患者的质量稳定的角膜内皮细胞。
Claims (21)
1.一种角膜内皮细胞培养用培养基，其由间充质干细胞的条件培养基构成，或含有所述条件培养基。
2.根据权利要求1所述的角膜内皮细胞培养用培养基，其以0.5-50％(v/v)的比率含有所述条件培养基。
3.根据权利要求1所述的角膜内皮细胞培养用培养基，其以1-10％(v/v)的比率含有所述条件培养基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的角膜内皮细胞培养用培养基，所述条件培养基是通过将所述间充质干细胞在培养基中培养而得到的，所述培养基以0.04-0.12％(w/v)浓度含有硫酸软骨素。
5.根据权利要求4所述的角膜内皮细胞培养用培养基，其中，所述硫酸软骨素的浓度为0.08％(w/v)。
6.一种角膜内皮细胞培养用培养基，其含有浓缩液，所述浓缩液是通过将间充质干细胞的条件培养基过滤浓缩而得到的。
7.根据权利要求6所述的角膜内皮细胞培养用培养基，其中，所述过滤浓缩进行的浓缩倍率为2-30倍。
8.根据权利要求6所述的角膜内皮细胞培养用培养基，其中，所述过滤浓缩进行的浓缩倍率为15-20倍。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的角膜内皮细胞培养用培养基，其以0.5-50％(v/v)的比率含有所述浓缩液。
10.根据权利要求6-8中任一项所述的角膜内皮细胞培养用培养基，其以1-10％(v/v)的比率含有所述浓缩液。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的角膜内皮细胞培养用培养基，所述条件培养基是通过将所述间充质干细胞在培养基中培养而得到的，所述培养基以0.04-0.12％(w/v)浓度含有硫酸软骨素。
12.根据权利要求11所述的角膜内皮细胞培养用培养基，其中，所述硫酸软骨素的浓度为0.08％(w/v)。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的培养基，其中，所述间充质干细胞为人间充质干细胞。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的培养基，其中，所述间充质干细胞为来自人骨髓的间充质干细胞。
15.一种角膜内皮细胞的培养方法，其包括从角膜组织分离角膜内皮细胞的步骤、及使用权利要求1-14中任一项所述的培养基，对所述分离的角膜内皮细胞进行培养增殖的步骤。
16.一种细胞，其通过权利要求15所述的培养方法而得到。
17.根据权利要求16所述的细胞，其以80％以上的比率含有Na+/K+-ATPase及ZO-1均表达的细胞。
18.根据权利要求16或17所述的细胞，其中，成纤维细胞样细胞的混合比率不足0.2％。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的细胞，其以10％以上的比率含有Ki-67阳性细胞。
20.一种角膜内皮功能不全的治疗药，其含有权利要求16-19中任一项所述的细胞。
21.根据权利要求20所述的治疗药，所述角膜内皮功能不全为大泡性角膜病变。
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