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WO2011024763A1 - 糖尿病の予防もしくは治療剤、または、摂食抑制剤 - Google Patents

糖尿病の予防もしくは治療剤、または、摂食抑制剤 Download PDF

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Publication number
WO2011024763A1
WO2011024763A1 PCT/JP2010/064195 JP2010064195W WO2011024763A1 WO 2011024763 A1 WO2011024763 A1 WO 2011024763A1 JP 2010064195 W JP2010064195 W JP 2010064195W WO 2011024763 A1 WO2011024763 A1 WO 2011024763A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
diabetes
lysine
poly
polylysine
polypeptide
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/064195
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
博 原
徹 比良
譲 江藤
礼子 安田
Original Assignee
味の素株式会社
国立大学法人北海道大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 味の素株式会社, 国立大学法人北海道大学 filed Critical 味の素株式会社
Publication of WO2011024763A1 publication Critical patent/WO2011024763A1/ja

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for diabetes or an antifeedant containing a polypeptide having a calcium receptor activating action as an active ingredient.
  • pancreatic ⁇ cells The body's energy metabolism is controlled by insulin produced by pancreatic ⁇ cells.
  • Insulin acts on peripheral tissues and cells and plays an important role in controlling blood sugar levels by promoting the uptake of sugar from the blood.
  • pancreatic ⁇ cells become exhausted and dysfunctional, resulting in diabetes and obesity.
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • GLP-1 is a peptide hormone having a molecular weight of about 4000 and is produced mainly by L cells in the small intestine.
  • GLP-1 has the effect of promoting insulin secretion of ⁇ cells, the action of suppressing gastric peristalsis and digestion and absorption, the appetite, the action of suppressing bulimia, etc., and is clearly effective for the treatment and prevention of diabetes and obesity (Non-Patent Documents 8 and 9).
  • GLP-1 secretion ability is reduced in diabetes and obesity, and if GLP-1 secretion can be promoted in these pathological conditions, it is expected to lead to treatment and prevention of diabetes and obesity.
  • the secretion of GLP-1 in L cells is promoted by ingestion of various nutrients such as carbohydrates, lipids, and proteins.
  • nutrients such as carbohydrates, lipids, and proteins.
  • rare examples of utilizing compounds such as peptides of specific components as GLP-1 secretion promoters are rare. is there.
  • Cholecystokinin is a peptide hormone having a molecular weight of about 1000 to 4000, and is produced mainly by I cells in the duodenum and jejunum, and promotes secretion of bile and pancreatic digestive juice.
  • CCK Cholecystokinin
  • GLP-1 and CCK are peptides
  • GLP-1 and CCK are administered into the blood by injection or the like for application to treatment.
  • a calcium receptor is also called a calcium sensing receptor (Calcium Sensing Receptor: CaSR), and is a receptor consisting of 1078 amino acids classified into class C of a seven-transmembrane receptor (G protein-coupled receptor). Is the body. This calcium receptor was reported to have cloned a gene in 1993 (Non-patent Document 5), and when activated by calcium or the like, it is known to cause various cellular responses through an increase in intracellular calcium or the like. . The gene sequence of the human calcium receptor is registered as GenBank Accession No NM_000388 and is well conserved among animals.
  • Calcium receptor activators include calcium, cations such as gadolinium, polypeptides composed of basic amino acids such as polyarginine and polylysine, polyamines such as spermine, proteins such as protamine, and amino acids such as phenylalanine. (Non-Patent Document 6).
  • Non-patent document 7 reports that glutathione ( ⁇ -Glu-Cys-Gly), which is a low molecular weight peptide, is a calcium receptor activator (ie, has an activating effect). Has not been shown to be effective in the prevention or treatment of diabetes and appetite regulation.
  • Patent Document 1 shows that a dipeptide or tripeptide having a specific sequence is effective as a calcium receptor activator, and describes the possibility of various disease therapeutic agents. It has not been shown to be effective in controlling diabetes or appetite.
  • Patent Document 2 shows that ⁇ -polylysine has an effect of suppressing weight gain, but does not show that it is effective for diabetes or appetite regulation.
  • lifestyle-related diseases are major social problems.
  • the present inventor has been studying an activator of a calcium receptor.
  • the calcium receptor activator promotes CCK secretion from STC-1 cells derived from the intestinal tract and GLP-1 secretion from GLUTag cells. I found that there is a work to do. Further, the present inventors have found that a calcium receptor activator has a function of promoting the secretion of GLP-1 by cecal-derived NCI-H716 cells.
  • a basic amino acid polypeptide having a calcium receptor activating action that is, a polypeptide consisting essentially of a basic amino acid is secreted from the cecum-derived cells by GLP-1.
  • a polypeptide consisting essentially of a basic amino acid such as polylysine is used for the prevention or treatment of diabetes. And the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows. (1) A preventive or therapeutic agent for diabetes or an antifeedant containing a polypeptide consisting essentially of basic amino acids (basic amino acid polypeptide) as an active ingredient. (2) The preventive or therapeutic agent for diabetes or an antifeedant, wherein the polypeptide is polylysine. (3) The polylysine is one or two selected from the group consisting of ⁇ -poly-L-lysine, ⁇ -poly-D-lysine, ⁇ -poly-L-lysine, and ⁇ -poly-D-lysine The agent for preventing or treating diabetes or an antifeedant, which is a species or more. (4) The diabetes preventive or therapeutic agent or feeding inhibitor, wherein the polylysine has an average molecular weight of 650 to 300,000.
  • a food for preventing or treating diabetes or suppressing feeding comprising 0.000001% by mass or more of a polypeptide consisting essentially of basic amino acids (basic amino acid polypeptide).
  • the food for preventing or treating diabetes or suppressing feeding wherein the polypeptide is polylysine.
  • the polylysine is one or two selected from the group consisting of ⁇ -poly-L-lysine, ⁇ -poly-D-lysine, ⁇ -poly-L-lysine, and ⁇ -poly-D-lysine
  • a food for the prevention or treatment of diabetes or suppression of eating which is a species or more.
  • the food for preventing or treating diabetes or suppressing feeding, wherein the polylysine has an average molecular weight of 650 to 300,000.
  • a preventive or therapeutic activity-imparting agent for diabetes comprising polylysine.
  • the polylysine is one or two selected from the group consisting of ⁇ -poly-L-lysine, ⁇ -poly-D-lysine, ⁇ -poly-L-lysine, and ⁇ -poly-D-lysine
  • the prophylactic or therapeutic activity-imparting agent for diabetes which is a species or more.
  • the agent for imparting preventive or therapeutic activity for diabetes, wherein the polylysine has an average molecular weight of 650 to 300,000.
  • the diabetes preventive or therapeutic activity-imparting agent is added to the food so that the content of the activity-giving agent is 1 mass ppb to 99.9 mass% with respect to the food for diabetes prevention or treatment.
  • a method for producing a food for the prevention or treatment of diabetes characterized by comprising: (13) The diabetes preventive or therapeutic activity imparting agent is added to a pharmaceutical carrier so that the content of the activity imparting agent is 1 mass ppb to 99.9 mass% with respect to diabetes preventive or therapeutic agent.
  • a method for producing a prophylactic or therapeutic agent for diabetes is produced.
  • a method for preventing or treating diabetes comprising administering a polypeptide consisting essentially of basic amino acids (basic amino acid polypeptide) to a subject in need of prevention or treatment of diabetes.
  • the method for preventing or treating diabetes wherein the polypeptide is polylysine.
  • the polylysine is one or two selected from the group consisting of ⁇ -poly-L-lysine, ⁇ -poly-D-lysine, ⁇ -poly-L-lysine, and ⁇ -poly-D-lysine
  • the method for preventing or treating diabetes which is more than a species.
  • the method for preventing or treating diabetes, wherein the polylysine has an average molecular weight of 650 to 300,000.
  • (22) A polypeptide consisting essentially of a basic amino acid (basic amino acid polypeptide) used for suppression of eating.
  • (23) Polylysine used for the prevention or treatment of diabetes or suppression of eating.
  • (24) ⁇ -poly-L-lysine, ⁇ -poly-D-lysine, ⁇ -poly-L-lysine, and ⁇ -poly-D-lysine used for the prevention or treatment of diabetes or suppression of eating
  • FIGS. The figure which shows promotion of GLP-1 secretion of NCI-H716 cell by polylysine. From the left, ⁇ -poly-D-lysine (molecular weight 30000-70000), ⁇ -poly-L-lysine (molecular weight 30000-70000), ⁇ -poly-D-lysine (molecular weight 1000-4000), ⁇ -GLP-1 secretion by poly-L-lysine (molecular weight 1000-5000), ⁇ -polylysine (molecular weight 3650-5120), Hepes buffer. Sample concentration indicates the final concentration in the well. The same applies to FIGS. The figure which shows the blood glucose level after polylysine oral administration in an oral glucose tolerance test.
  • the value indicates the average value and standard error of 4 individuals in each group. * Indicates that there is a significant difference from the control group.
  • P ⁇ 0.05, Student t-test The figure which shows the CCK secretion promotion of STC-1 cell by (gamma) -Glu-Cys-Gly, (gamma) -Glu-Val-Gly, and a cinacalcet.
  • Blk, ⁇ EVG, GSH, and CCT indicate blank (control), ⁇ -Glu-Val-Gly, ⁇ -Glu-Cys-Gly, and cinacalcet.
  • ⁇ EC represents ⁇ -Glu-Cys.
  • the figure which shows the change of GLP-1 secretion from a rat intestine by (gamma) -Glu-Cys (EC). Values are mean and standard error (n 8). + Is statistically significant for 0 minutes, * is significantly different for the water-administered group (Tukey's test, P ⁇ 0.05)
  • the figure which shows the blood glucose rise inhibitory effect by (gamma) -Glu-Cys (EC) in a rat. Values are mean and standard error (n 8). * Is significantly different from the glucose solution administration group (Student t-test, P ⁇ 0.05)
  • the agent for preventing or treating diabetes or an antifeedant of the present invention contains a basic amino acid polypeptide, that is, a polypeptide consisting essentially of a basic amino acid as an active ingredient.
  • Basic amino acid polypeptide In the present invention, at least 5 residues of basic amino acids (lysine, arginine, ornithine) are linked to a basic amino acid polypeptide, that is, a polypeptide consisting essentially of basic amino acids.
  • Polypeptide hereinafter referred to as “basic amino acid polypeptide”.
  • the basic amino acid polypeptide is a polypeptide containing 95% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably substantially 100% of a basic amino acid in terms of the number of monomers.
  • the basic amino acid polypeptide is known to have a calcium receptor activating action, and the action can be confirmed in the same manner as in, for example, the detection method for oligopeptides described below.
  • the present inventors have found that substances having a calcium receptor activating action commonly cause CCK secretion from intestinal tract-derived STC-1 cells and GLP-1 secretion from GLUTag cells. It has been found to show a promoting action. Furthermore, based on the results of Examples 1 and 2 described later, it can be understood that the basic amino acid polypeptide of the present invention is effective for the prevention or treatment of diabetes and is also useful as an antifeedant.
  • the size of the basic amino acid polypeptide varies depending on the number of basic amino acids to be linked, but preferably has an average molecular weight of 650 to 300,000, particularly preferably 1,000 to 70,000.
  • Preferred examples of basic amino acid polypeptides include polylysine and polyarginine. Of these, polylysine is particularly preferable.
  • polylysine is a polymer in which at least 5 residues of lysine are linked, and is a polypeptide containing 95% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 100% of lysine in terms of the number of monomers. And the definition for the number ratio of monomers also applies in the case of polyarginine and polyornithine).
  • the lysine constituting polylysine may be L-form or D-form, and polylysine includes poly-L-lysine linked with L-lysine and poly-D-lysine linked with D-lysine.
  • Polylysine includes ⁇ -polylysine in which ⁇ -amino group and carboxyl group of lysine are peptide-bonded, and ⁇ -polylysine in which ⁇ -amino group and carboxyl group of lysine are peptide-bonded.
  • polylysine of the present invention examples include ⁇ -poly-L-lysine, ⁇ -poly-D-lysine, ⁇ -poly-L-lysine, and ⁇ -poly-D-lysine.
  • ⁇ -poly-L-lysine and ⁇ -poly-L-lysine are preferred.
  • the size of polylysine varies depending on the number of lysines to be linked, but an average molecular weight of 650 to 300,000 is preferable, and 1,000 to 70,000 is particularly preferable.
  • ⁇ -polylysine an average molecular weight of 1000 to 5000 is preferable, and in the case of ⁇ -polylysine, 3500 to 5500 is preferable. Of these, ⁇ -poly-L-lysine having an average molecular weight of 1,000 to 5,000 is preferred.
  • Polylysine has a calcium receptor activating action and is particularly suitable for use as a preventive or therapeutic agent for diabetes.
  • a prophylactic or therapeutic agent for diabetes containing ⁇ -polylysine as an active ingredient
  • Diabetes preventive or therapeutic agent containing ⁇ -polylysine as an active ingredient a preventive or therapeutic activity-imparting agent for diabetes comprising ⁇ -polylysine
  • a preventive or therapeutic activity-imparting agent for diabetes comprising ⁇ -polylysine
  • a prophylactic or therapeutic agent for diabetes comprising polylysine in the prophylactic or therapeutic agent, only polylysine is contained as an active ingredient.
  • Polylysine also has a calcium receptor activating effect and is suitable for use as a prophylactic or therapeutic agent for obesity.
  • polylysine has GLP-1 secretion promotion and CCK secretion promotion action, and suppresses gastric emptying. Therefore, polylysine is also preferably used as an antifeedant and satiety enhancer. .
  • a method of weight management or weight-loss comprising administering polylysine to a subject, A food for weight management or weight loss containing polylysine in an amount of 0.000001% by mass or more, more preferably 0.00001% by mass or more, particularly preferably 0.1% by mass or more and 95% by weight or less, A prophylactic or therapeutic agent for obesity comprising polylysine (in the prophylactic or therapeutic agent, only polylysine is contained as an active ingredient).
  • a commercially available product can be used as the polypeptide.
  • the polypeptide can be obtained by appropriately using a known method such as (1) a method of chemically synthesizing, or (2) a method of synthesizing by an enzymatic reaction.
  • the above-mentioned polypeptide used in the present invention is easily synthesized chemically, particularly when the number of amino acid residues contained is relatively short.
  • the polypeptide can be synthesized or semi-synthesized using a peptide synthesizer. Examples of the chemical synthesis method include a peptide solid phase synthesis method.
  • the peptide thus synthesized can be purified by conventional means such as ion exchange chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, affinity chromatography and the like. Such peptide solid-phase synthesis methods and subsequent peptide purification are well known in the art.
  • the peptide used in the present invention can also be produced by an enzymatic reaction.
  • the method described in International Publication Pamphlet WO2004 / 011653 can be used. That is, an amino acid or dipeptide in which the carboxyl terminus of one amino acid or dipeptide is esterified or amidated, and an amino acid in which the amino group is free (for example, an amino acid in which the carboxyl group is protected) are combined in the presence of a peptide-forming enzyme. It can also be produced by reacting in step 2 and purifying the resulting polypeptide.
  • the peptide-producing enzyme is derived from a culture of a microorganism (for example, actinomycetes) capable of producing a peptide, a microbial cell separated from the culture, or a treated product of the microorganism, or the microorganism.
  • a microorganism for example, actinomycetes
  • Peptide producing enzymes are mentioned.
  • the polypeptide used in the present invention may be present in plants such as vegetables and fruits, fungi, and the like. If the polypeptide exists in nature, it may be extracted from these and used. The polypeptide need not be isolated and used, and a fraction containing a large amount of the polypeptide may be used.
  • the polypeptide used in the present invention includes a salt form.
  • the salt may be pharmacologically acceptable.
  • an acidic group such as a carboxyl group of an amino acid, an ammonium salt, sodium A salt with an alkali metal such as potassium, a salt with an alkaline earth metal such as calcium or magnesium, an aluminum salt, a zinc salt, an organic amine such as triethylamine, ethanolamine, morpholine, pyrrolidine, piperidine, piperazine or dicyclohexylamine
  • salts with basic amino acids such as arginine and lysine.
  • salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, hydrobromic acid, acetic acid, citric acid, benzoic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, succinic acid Acid, tannic acid, butyric acid, hybenzic acid, pamoic acid, enanthic acid, decanoic acid, teocric acid, salicylic acid, lactic acid, oxalic acid, mandelic acid, salt with organic carboxylic acid such as malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid And salts with organic sulfonic acids such as p-toluenesulfonic acid.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, hydrobromic acid, acetic acid, citric acid, benzoic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid,
  • Preventive or therapeutic agent for diabetes or obesity, or feeding inhibitor The basic amino acid polypeptide is used as an active ingredient for preventing or treating diabetes or obesity, or an eating inhibitor.
  • the basic amino acid polypeptide may be used alone, or any two or more of them may be used in combination. Is possible.
  • Examples of the preventive or therapeutic agent for diabetes or obesity or the antifeedant of the present invention include pharmaceuticals, quasi drugs, foods and the like.
  • the method for applying the preventive or therapeutic agent for diabetes or obesity of the present invention or the antifeedant is not particularly limited, and adopts invasive administration or suppository administration or transdermal administration using oral administration or injection. I can do it.
  • the active ingredient can be mixed with a solid or liquid pharmaceutical carrier suitable for administration methods such as oral and injection, and administered in the form of a conventional pharmaceutical preparation.
  • oral administration is particularly preferable. Examples of such preparations include solid forms such as tablets, granules, powders and capsules, liquid forms such as solutions, suspensions and emulsions, and lyophilized forms. These preparations can be prepared by conventional means on the preparation.
  • Examples of the pharmaceutical carrier include glucose, lactose, sucrose, starch, mannitol, dextrin, fatty acid glyceride, polyethylene glycol, hydroxyethyl starch, ethylene glycol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, gelatin, albumin, amino acid, water, Examples thereof include physiological saline. Further, if necessary, conventional additives such as a stabilizer, a wetting agent, an emulsifier, a binder, and an isotonic agent can be appropriately added.
  • Administration or intake of the agent for preventing or treating diabetes or obesity of the present invention or an antifeedant may be an amount effective for the treatment or prevention of diabetes or obesity, or suppression of feeding, and the age of the patient.
  • the dose of the basic amino acid polypeptide used in the present invention is 0.01 g per kg body weight in a single administration. ⁇ 10 g is preferred, and 0.1 g to 1 g per kg body weight is more preferred.
  • the frequency of administration is not particularly limited, and can be administered once to several times per day.
  • the content of the basic amino acid polypeptide in the preventive or therapeutic agent for diabetes or obesity of the present invention and the antifeedant is not particularly limited as long as it is suitable for the above dose, and preferably 0 per dry weight. 0.000001% by mass to 99.9% by mass, more preferably 0.00001% by mass to 99.9% by mass, and particularly preferably 0.0001% by mass to 99.9% by mass. Further, 0.00001% by mass to 10% by mass is also preferable.
  • the preventive or therapeutic agent for diabetes or obesity of the present invention is also a food for treatment or prevention of diabetes or obesity, suppression of eating, or a feeling of fullness, such as diabetes or obesity in a container or package. It can also be used as a food displaying that it has a prophylactic effect or a therapeutic effect on diseases, as well as an eating suppression effect and a satiety-sustaining effect.
  • the food preferably contains 0.000001% by mass or more, more preferably 0.000001% by mass to 99.9% by mass, and further preferably 0.00001% by mass to 99.9% by mass of the basic amino acid polypeptide.
  • the basic amino acid polypeptide is contained in an amount of 0.00001% by mass to 98% by mass, and preferably 0.00001% by mass to 10% by mass. It does not restrict
  • the food include seasonings, beverages, health foods, processed agricultural products, processed marine products, processed livestock products, and the like.
  • the preventive or therapeutic agent for diabetes or obesity and the antifeedant of the present invention may contain one or more other calcium receptor activators in addition to the basic amino acid polypeptide. .
  • calcium receptor activator refers to a substance that binds to calcium receptor, activates calcium receptor, and regulates the function of cells expressing calcium receptor.
  • calcium receptor activation means that a ligand binds to a calcium receptor and activates a guanine nucleotide-binding protein to transmit a signal. The calcium receptor transmitting this signal is called “calcium receptor activity”.
  • action are mentioned.
  • An oligopeptide and a low molecular weight compound having a calcium receptor activating action can be obtained, for example, by reacting a calcium receptor with a test substance and detecting the calcium receptor activity. It is preferable to confirm that the oligopeptide and the low molecular weight compound thus obtained have GLP-1 or CCK secretion promoting action or diabetes prevention or treatment effect.
  • a test substance is added to a calcium receptor activity measurement system for measuring calcium receptor activity, and the calcium receptor activity is measured.
  • the calcium receptor activity is measured using, for example, a measurement system using cells expressing the calcium receptor.
  • the cell may be a cell that endogenously expresses a calcium receptor or a recombinant cell into which an exogenous calcium receptor gene has been introduced.
  • the above calcium receptor activity measurement system is a combination of an activator and a calcium receptor when an extracellular ligand (activator) specific to the calcium receptor is added to a cell expressing the calcium receptor.
  • an extracellular ligand (activator) specific to the calcium receptor is added to a cell expressing the calcium receptor.
  • the test substance has a calcium receptor stimulating activity, and has a preventive or therapeutic effect on diabetes or obesity or an antifeeding effect Is determined.
  • the effect of calcium receptor activator on the prevention or treatment of diabetes or obesity and the suppression of food intake are, for example, tests for examining the GLP-1 or CCK secretion promoting action described in Examples and Reference Examples, etc. Can be confirmed. Moreover, the preventive or therapeutic effect of diabetes can also be confirmed by the test etc. which investigate the blood glucose rise inhibitory effect under the glucose load described in the Example.
  • the oligopeptide and low-molecular compound used as the test substance are not particularly limited, but the oligopeptide is preferably a peptide consisting of 2 to 10 amino acid residues or a derivative thereof, and a peptide consisting of 2 or 3 amino acid residues. Or its derivative
  • guide_body is more preferable.
  • the amino acid residue on the N-terminal side of the oligopeptide is preferably ⁇ -glutamic acid.
  • cinacalcet ((R) -N- (3- (3- (trifluoromethyl) phenyl) propyl) -1- (1-naphthyl) ethylamine) and its related compounds are preferable.
  • the related compounds of cinacalcet will be described later.
  • the origin of the calcium receptor is not particularly limited, and examples include not only the human calcium receptor but also animal-derived calcium receptors including mice, rats, dogs and the like.
  • preferred examples of the calcium receptor include human calcium receptors encoded by the human calcium receptor gene registered in GenBank Accession No No NM_00388.
  • the calcium receptor is not limited to the protein encoded by the gene of the above sequence, and as long as it encodes a protein having a calcium receptor function, it is 60% or more, preferably 80% or more, more preferably It may be a protein encoded by a gene having 90% or more homology.
  • GPRC6A receptor and 5.24 receptor are also known as subtypes of calcium receptor and can be used in the present invention.
  • the calcium receptor function can be examined by expressing these genes in cells and measuring changes in current and intracellular calcium ion concentration upon addition of calcium.
  • the calcium receptor activity utilizes a living cell expressing a calcium receptor or a fragment thereof, a cell membrane expressing a calcium receptor or a fragment thereof, an in vitro system including a protein of the calcium receptor or a fragment thereof, and the like. Can be confirmed.
  • An example using living cells is shown below, but is not limited to this example.
  • Calcium receptors are expressed in cultured cells such as Xenopus oocytes, hamster ovary cells, and human fetal kidney cells. This can be achieved by introducing a cloned calcium receptor gene into a plasmid carrying a foreign gene and introducing the plasmid state or cRNA using it as a template. For the detection of the reaction, an electrophysiological technique or a fluorescent indicator reagent for increasing intracellular calcium can be used.
  • Calcium receptor expression is first confirmed by a response with calcium or a specific activator.
  • An oocyte in which an intracellular current is observed or a cultured cell in which fluorescence of a fluorescent indicator reagent is observed is used for calcium having a concentration of about 5 mM.
  • the concentration dependence is measured by changing the calcium concentration.
  • a test substance such as a peptide is prepared to about 1 ⁇ M to 1 mM, and added to an oocyte or a cultured cell, whereby the calcium receptor activity of the test substance such as the peptide is measured.
  • oligopeptides having calcium receptor activity examples include ⁇ -Glu-X-Gly (X represents an amino acid or amino acid derivative), ⁇ -Glu-Val-Y (Y represents an amino acid or amino acid derivative).
  • X is Cys, Cys (SNO), Cys (S-allyl), Gly, Cys (S-Me), Abu or Ser
  • Y is Gly, Val, Glu, A compound that is Lys, Phe, Ser, Pro, Arg, Asp, Met, Thr, His, Orn, Asn, Cys, or Gln.
  • amino acids constituting each oligopeptide are L-isomers unless otherwise specified.
  • amino acids are Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Asn, Gln, Pro, Hyp and other neutral amino acids, Asp, Glu and other acidic amino acids, Lys, Arg, It also contains basic amino acids such as His, aromatic amino acids such as Phe, Tyr, Trp, homoserine, citrulline, ornithine, ⁇ -aminobutyric acid, norvaline, norleucine, taurine and the like.
  • an amino group residue means the following amino acids.
  • amino acid derivatives are various derivatives of the above amino acids.
  • amino acids side chains such as special amino acids, unnatural amino acids, amino alcohols, terminal carbonyl groups, amino groups, and cysteine thiol groups are substituted with various substituents. Substituted ones are mentioned.
  • substituents include an alkyl group, an acyl group, a hydroxyl group, an amino group, an alkylamino group, a nitro group, a sulfonyl group, and various protective groups.
  • Arg (NO 2 ) N- ⁇ -nitroarginine
  • Cys (SNO) S-nitrocysteine
  • Cys (S-Me) S-methylcysteine
  • Cys (S-allyl) S-allylcysteine
  • Val-NH 2 Valinamide
  • Val-ol Valinol (2-amino- 3-methyl-1-butanol) and the like.
  • the ⁇ -Glu-Cys (SNO) -Gly (S-nitrosoglutathione (GNSO)) has the following structural formula, and the ⁇ -Glu-Met (O) and ⁇ -Glu-Cys (S -Me) (O) in formula (O) means a sulfoxide structure.
  • ( ⁇ ) in ⁇ -Glu means that another amino acid is bonded via a carboxy group at the ⁇ -position of glutamic acid.
  • ⁇ -Glu-X-Gly (X represents an amino acid or amino acid derivative), ⁇ -Glu-Val-Y (Y represents an amino acid or amino acid derivative), ⁇ -Glu-Ala, ⁇ -Glu-Gly, ⁇ - Glu-Cys, ⁇ -Glu-Met, ⁇ -Glu-Thr, ⁇ -Glu-Val, ⁇ -Glu-Orn, Asp-Gly, Cys-Gly, Cys-Met, Glu-Cys, Gly-Cys, Leu- Asp, ⁇ -Glu-Met (O), ⁇ -Glu- ⁇ -Glu-Val, ⁇ -Glu-Val-NH 2 , ⁇ -Glu-Val-ol, ⁇ -Glu-Ser, ⁇ -Glu-Tau, ⁇ -Glu-Cys (S-Me) (O), ⁇ -Glu-Leu, ⁇ -Glu-Ile, ⁇ -Glu-t-Leu and ⁇ -Glu-Cys (S-Me) activate calcium receptors Turn into (WO 2007
  • ⁇ -Glu-X-Gly (X represents an amino acid or amino acid derivative), ⁇ -Glu-Val-Y (Y represents an amino acid or amino acid derivative), ⁇ -Glu-Ala, ⁇ -Glu-Gly, ⁇ -Glu-Cys, ⁇ -Glu-Met, ⁇ -Glu-Thr, ⁇ -Glu-Val, ⁇ -Glu-Orn, Asp-Gly, Cys-Gly, Cys-Met, Glu-Cys, Gly-Cys, Leu-Asp, ⁇ -Glu-Met (O), ⁇ -Glu- ⁇ -Glu-Val, ⁇ -Glu-Val-NH 2 , ⁇ -Glu-Val-ol, ⁇ -Glu-Ser, ⁇ -Glu- Tau, ⁇ -Glu-Cys (S-Me) (O), ⁇ -Glu-Glu-Ala, ⁇ -Glu-Gly, ⁇ -Glu-Cys, ⁇ -Glu-Met, ⁇ -Glu-Thr, ⁇ -Glu-Val, ⁇
  • particularly preferred compounds are ⁇ -Glu-Val-Gly, ⁇ -Glu-Cys-Gly and cinacalcet.
  • ⁇ -Glu-Cys is also particularly preferable.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly, ⁇ -Glu-Cys-Gly and cinacalcet are particularly suitable for use as a component of a prophylactic or therapeutic agent for obesity
  • ⁇ -Glu-Cys, ⁇ -Glu-Cys- Gly and cinacalcet are particularly suitable for use as components of a preventive or therapeutic agent for diabetes.
  • Commercially available products can be used as the oligopeptide.
  • the oligopeptide can be obtained by appropriately using a known method such as (1) a method of chemically synthesizing, or (2) a method of synthesizing by an enzymatic reaction.
  • a chemical synthesis method is convenient.
  • oligopeptides can be synthesized or semi-synthesized using a peptide synthesizer.
  • the chemical synthesis method include a peptide solid phase synthesis method.
  • the oligopeptide thus synthesized can be purified by conventional means such as ion exchange chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, affinity chromatography and the like. Such peptide solid-phase synthesis methods and subsequent peptide purification are well known in the art.
  • the oligopeptide can be produced by an enzymatic reaction.
  • the method described in International Publication WO2004 / 011653 pamphlet can be used. That is, an amino acid or dipeptide in which the carboxyl terminus of one amino acid or dipeptide is esterified or amidated, and an amino acid in which the amino group is free (for example, an amino acid in which the carboxyl group is protected) are combined in the presence of a peptide-forming enzyme.
  • the peptide-producing enzyme is derived from a culture of a microorganism (for example, actinomycetes) capable of producing a peptide, a microbial cell separated from the culture, or a treated product of the microorganism, or the microorganism.
  • a microorganism for example, actinomycetes
  • Peptide producing enzymes are mentioned.
  • oligopeptides that can be used in the present invention may be present in plants such as vegetables and fruits, microorganisms such as yeast, yeast extracts, and the like. If it exists in nature, it may be extracted from these and used.
  • the oligopeptide does not need to be isolated and used, and a fraction containing a large amount of oligopeptide may be used.
  • examples thereof include a yeast extract containing glutathione ( ⁇ -Glu-Cys-Gly) or a fraction thereof.
  • Preparation of yeast extract and the like may be performed in the same manner as normal yeast extract preparation.
  • the yeast extract may be one obtained by treating a yeast cell extracted with hot water, or one obtained by digesting a yeast cell.
  • the fraction of yeast extract is not particularly limited as long as it contains glutathione.
  • yeast extract containing ⁇ -Glu-Cys or a fraction thereof can be mentioned.
  • Preparation of yeast extract and the like may be performed in the same manner as normal yeast extract preparation.
  • the yeast extract may be one obtained by treating a yeast cell extracted with hot water, or one obtained by digesting a yeast cell.
  • the fraction of yeast extract is not particularly limited as long as it contains ⁇ -Glu-Cys.
  • Oligopeptides that can be used in the present invention include salt forms.
  • the salt may be pharmacologically acceptable.
  • an acidic group such as a carboxyl group in the peptide
  • salts with organic amines such as aluminum salts, zinc salts, triethylamine, ethanolamine, morpholine, pyrrolidine, piperidine, piperazine, dicyclohexylamine
  • salts with basic amino acids such as arginine and lysine.
  • salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, hydrobromic acid, acetic acid, citric acid, benzoic acid, maleic acid , Salts with organic carboxylic acids such as fumaric acid, tartaric acid, succinic acid, tannic acid, butyric acid, hibenzic acid, pamoic acid, enanthic acid, decanoic acid, teocric acid, salicylic acid, lactic acid, oxalic acid, mandelic acid, malic acid, Mention may be made of salts with organic sulfonic acids such as methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid.
  • low molecular weight compounds having calcium receptor activity examples include cinacalcet and cinacalcet-related compounds.
  • cinacalcet related compounds U.S. Pat.Nos. 6111244, 6213146, 568938, 5763569, 5858684, 5962314, 6001884, 6011068, 6031003, International Publication WO1995 / Examples thereof include compounds described in No. 011221, WO 1996/012687, WO 2002/059102 and the like.
  • the low molecular weight compound that can be used in the present invention includes a salt form as in the case of the peptide.
  • calcium receptor activators include cations such as calcium and cadolinium, polyamines such as putrescine, spermine and spermidine, proteins such as protamine, and amino acids such as phenylalanine.
  • these calcium receptor activators may be used alone or in combination of any two or more.
  • cations such as calcium and gadolinium are preferable, and calcium is more preferable. That is, it is preferable that at least one of the other calcium receptor activators to be added is a cation.
  • the ratio of the total content of polypeptides consisting essentially of basic amino acids and the total content of other calcium receptor activators in the preventive or therapeutic agent for diabetes or obesity of the present invention and the antifeedant is calcium
  • the mass ratio of the total of other calcium receptor activators and the total of polypeptides and low-molecular compounds consisting essentially of basic amino acids Is preferably 1: 100 to 100: 1.
  • the preventive or therapeutic activity-providing agent for diabetes or obesity of the present invention comprises polylysine having a calcium receptor activating action. In the activity imparting agent, only polylysine is contained as an active ingredient. The preferred form of polylysine used is as described above.
  • the method for using the activity-imparting agent of the present invention is not particularly limited, and can be used by adding to foods or pharmaceutical carriers.
  • the amount of the activity-imparting agent of the present invention used for foods, pharmaceutical carriers and the like may be an amount effective for imparting preventive or therapeutic activity for diabetes or obesity, and is appropriately adjusted according to the use.
  • the food contains 1 mass ppb to 99.9 mass%, preferably 10 mass ppb to 99.9 mass%, more preferably about 10 mass ppm to 10 mass% of polylysine. used. Therefore, the content of the activity-imparting agent of the present invention is 1 mass ppb to 99.9 mass%, preferably 10 mass ppb to 99 mass based on the food (target product) for the prevention or treatment of diabetes or obesity. It is possible to produce a food for the prevention or treatment of diabetes or obesity by adding the activity-imparting agent to the food so as to be about 9 mass%, more preferably about 10 mass ppm to 10 mass%. it can.
  • the content of the activity-imparting agent of the present invention is 1 mass ppb to 99.9 mass%, preferably 10 mass ppb to 99.9 mass based on the preventive or therapeutic agent (target product) for diabetes or obesity.
  • % More preferably about 10 mass ppm to 10 mass%, by adding the activator to a pharmaceutical carrier, a prophylactic or therapeutic agent for diabetes or obesity can be produced.
  • Example 1 GLP-1 secretion promoting action
  • a human caecal-derived GLP-1 producing cell line NCI-H716 (ATCC No CCL-251) was obtained at 37 ° C in DMEM / HamF-12 medium containing 10% FBS. Culturing was performed in the presence of 5% CO 2 . NCI-H716 cells were seeded at 100000 cells / well in poly-D-lysine-coated 96-well plates and cultured for 2 days.
  • Hepes buffer (20 mM Hepes, 146 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl 2 , 1 mM MgSO 4 , 5.5 mM D-glucose, 0.2% BSA, pH 7.4) 50 ⁇ l of a sample solution in which various polylysines were dissolved in the same buffer was added and incubated at 37 ° C. for 60 minutes.
  • Polylysine used and its concentration were ⁇ -poly-D-lysine (molecular weight 30000-70000, Sigma-Aldrich, 2008-2009 catalog number P7886), 25 ⁇ g / ml; ⁇ -poly-D-lysine (molecular weight 1000-4000).
  • the sample solution was collected and centrifuged (5000 xg, 1 minute) to precipitate the cells and obtain a supernatant.
  • the concentration of GLP-1 in the filtrate was measured with an Enzyme immuno assay kit (Yanauchi Laboratories) using GLP-1 antibody.
  • Collect tail vein blood before sample administration sample ⁇ glucose solution only (2 g / kg body weight) or polylysine ( ⁇ -poly-D-lysine, molecular weight 30000-70000, Sigma-Aldrich, 2008-2009 Catalog No. P7886)
  • sample ⁇ glucose solution only (2 g / kg body weight) or polylysine ( ⁇ -poly-D-lysine, molecular weight 30000-70000, Sigma-Aldrich, 2008-2009 Catalog No. P7886)
  • a glucose solution containing 0.1-50 mg / kg body weight ⁇ was orally administered via a feeding tube.
  • tail vein blood was collected at 15, 30, 60, 90, and 120 minutes, and the glucose concentration in plasma was measured using a commercially available kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
  • the blood glucose concentration showed a tendency to decrease 15 minutes after administration of glucose in the polylysine 10 mg / kg administration than in the control group (administration of glucose solution only), and in the polylysine 50 mg / kg administration group, 15 to 30 minutes after administration.
  • the value was significantly lower than that of the control group (FIG. 2). Therefore, it was confirmed that polylysine has an inhibitory effect on blood glucose elevation in rats.
  • a substance having a calcium receptor activating action has a function of commonly promoting CCK secretion from STC-1 cells derived from intestinal tract and GLP-1 secretion from GLUTag cells. It shows that it shows a raise inhibitory effect by a reference example.
  • the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the residue was dissolved in ethyl acetate (200 ml).
  • the solution was washed with water (50 ml), 5% aqueous citric acid solution (50 ml ⁇ 2 times), saturated brine (50 ml), 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution (50 ml ⁇ 2 times), and saturated brine (50 ml).
  • the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, magnesium sulfate was removed by filtration, and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • the residue was recrystallized from ethyl acetate-n-hexane to obtain Boc-Val-Gly-OBzl (13.2 g, 36.2 mmol) as white crystals.
  • Boc-Val-Gly-OBzl (5.47 g, 15.0 mmol) was added to a 4N HCl / dioxane solution (40 ml), and the mixture was stirred at room temperature for 50 minutes. Dioxane was removed by concentration under reduced pressure, n-hexane (30 ml) was added to the residue, and the mixture was concentrated under reduced pressure. This operation was repeated three times to obtain H-Val-Gly-OBzl ⁇ HCl quantitatively.
  • H-Val-Gly-OBzl.HCl and Z-Glu-OBzl (5.57 g, 15.0 mmol) were dissolved in methylene chloride (50 ml), and the solution was kept at 0 ° C.
  • methylene chloride 50 ml
  • HOBt 1-Hydroxybenzotriazole
  • WSC ⁇ HCl
  • Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride 3.16g, 16.5mmol
  • the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the residue was dissolved in heated ethyl acetate (1500 ml).
  • the solution was washed with water (200 ml), 5% aqueous citric acid solution (200 ml ⁇ 2 times), saturated brine (150 ml), 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution (200 ml ⁇ 2 times), and saturated brine (150 ml).
  • the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, magnesium sulfate was removed by filtration, and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • the precipitated crystals were collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain Z-Glu (Val-Gly-OBzl) -OBzl (6.51 g, 10.5 mmol) as white crystals.
  • HepesB buffer 140 mM NaCl, 4.5 mM KCl , 20 mM Hepes, 1.2 mM CaCl 2, 1.2 mM MgCl 2, 10 mM D-glucose, 0.1% BSA, pH 7.4
  • 100 ⁇ l of a sample solution in which the sample was dissolved in the same buffer was added and incubated at 37 ° C. for 60 minutes.
  • samples ⁇ -Glu-Cys-Gly (Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.), ⁇ -Glu-Val-Gly, and cinacalcet were used.
  • HepesB buffer was used. After collecting the supernatant, the cells were precipitated by centrifugation (800 ⁇ g, 5 minutes, 4 ° C.), and 80 ⁇ l of the supernatant was collected and stored frozen.
  • the supernatant was pretreated with an OASIS cartridge (C18), and the CCK concentration in the supernatant was measured with a commercially available Enzyme immunoassay kit (Phoenix Pharmaceuticals).
  • GLP-1 secretion promoting action (1) A mouse large intestine-derived GLP-1-producing cell line GLUTag was cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% FBS in the presence of 37 ° C. and 5% CO 2 . GLUTag cells were cultured in 48-well plates for 2-3 days until sub-confluent.
  • HepesB buffer 140 mM NaCl, 4.5 mM KCl , 20 mM Hepes, 1.2 mM CaCl 2, 1.2 mM MgCl 2, 10 mM D-glucose, 0.1% BSA, pH 7.4
  • the wells at, 80 ⁇ l of a sample solution in which the sample was dissolved in the same buffer was added and incubated at 37 ° C. for 60 minutes.
  • samples ⁇ -Glu-Cys-Gly and cinacalcet were used.
  • HepesB buffer was used.
  • the cells were precipitated by centrifugation (800 ⁇ g, 5 minutes, 4 ° C.), and 70 ⁇ l of the supernatant was recovered and stored frozen.
  • the concentration of GLP-1 in the supernatant was measured with a commercially available Enzyme immuno assay kit (Yanaihara Laboratory).
  • Tail vein blood before sample administration was collected, and the sample ⁇ glucose solution alone (2 g / kg body weight) / glucose solution containing ⁇ -Glu-Cys (160 mg / kg body weight) ⁇ was orally administered via a feeding tube.
  • tail vein blood was collected at 15, 30, 60, 90, and 120 minutes, and the glucose concentration in plasma was measured using a commercially available kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries). The results are shown in FIG.
  • the blood glucose concentration was significantly lower in rats administered with ⁇ -Glu-Cys than in the group administered with only the glucose solution at 15 and 30 minutes after glucose administration. Was confirmed to have an inhibitory effect on blood sugar elevation. It is understood that a calcium activator having GLP-1 secretion promoting activity has a blood glucose elevation inhibitory action.
  • the present invention provides a preventive or therapeutic agent for diabetes that is highly safe for living bodies.
  • the antifeedant of the present invention is useful for, for example, prevention or treatment of obesity.

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Abstract

ポリリジン等の実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチドを糖尿病の予防若しくは治療剤、または摂食抑制剤の有効成分とする。

Description

糖尿病の予防もしくは治療剤、または、摂食抑制剤
　本発明は、カルシウム受容体活性化作用を有するポリペプチドを有効成分として含有する糖尿病の予防もしくは治療剤、または摂食抑制剤に関する。
　近代社会においては、高脂肪食や高カロリー食の浸透により、肥満、高血圧、耐糖能異常、中性脂肪が４大疾患といわれている。その結果、心疾患や動脈硬化の発症率が高くなり、生命の危機に及ぶことから、有効な糖尿病又は肥満病の予防又は治療方法の開発が望まれている。
　体内のエネルギー代謝は、膵臓β細胞で作られるインシュリンによってコントロールされている。インシュリンは末梢組織や細胞に作用し、血中から糖分の取込を促進することで血糖値のコントロールに重要な役割を果たしている。しかし、継続的に高カロリー食を摂取し、細胞のインシュリン感受性が低下すると、血糖値の上昇とインシュリンの過剰分泌が同時に進む。その結果、膵臓のβ細胞が疲弊して機能不全となり、糖尿病、肥満症が発症する。
　インシュリンの分泌は種々のホルモンにより調節されており、特に、消化管で産生、分泌されるグルカゴン様ペプチド－１（Glucagon-like peptide-1、ＧＬＰ－１）が重要と考えられている。ＧＬＰ－１は分子量約４０００のペプチドホルモンであり、主に小腸のＬ細胞で産生される。ＧＬＰ－１は、β細胞のインシュリン分泌促進作用、胃嬬動運動と消化吸収の抑制作用、食欲、過食抑制作用、等を有し、糖尿病や肥満症の治療や予防に有効であることが明らかにされてきた（非特許文献８、９）。糖尿病や肥満症ではＧＬＰ－１分泌能が低下していることが知られており、これら病態においてＧＬＰ－１分泌を促進することができれば、糖尿病や肥満症の治療と予防につながるものと期待される。Ｌ細胞におけるＧＬＰ－１の分泌は、糖質、脂質、蛋白質など様々な栄養分の摂取により促進されるが、特定の成分のペプチド等の化合物をＧＬＰ－１分泌促進剤として活用した例は稀である。
　コレシストキニン（ＣＣＫ）は、分子量約１０００～４０００のペプチドホルモンであり、主に十二指腸と空腸のI細胞で産生され、胆汁の分泌と膵臓消化液の分泌を促進する。ＣＣＫの生理作用で特に注目されるのは、食品の胃排出を抑制する作用、膵酵素分泌を促進する作用、満腹感により摂食を抑制する作用、である（非特許文献１、２）。更に、血糖調節ホルモンであるインスリンの分泌を促進する作用も知られている（非特許文献３、４）。ＣＣＫは、このような作用を有することから、糖尿病や肥満症や膵炎等の生活習慣病の治療または予防に有望と考えられている。
　ＧＬＰ－１およびＣＣＫはペプチドであることから、治療に応用するには、ＧＬＰ－１およびＣＣＫを注射等で血中投与することになるが、毎日の投与の煩雑さと多額の費用から現実的とはいえない。一方で、食品成分のタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸等によって、小腸粘膜にあるＧＬＰ－１又はＣＣＫ産生細胞から内因性のＧＬＰ－１又はＣＣＫが分泌される機構を利用することが考えられる。すなわち、ＧＬＰ－１又はＣＣＫ分泌促進作用を持った化合物や食品素材の開発が望まれていた。
　ところで、カルシウム受容体は、カルシウムセンシング受容体（Calcium Sensing Receptor:CaSR）とも呼ばれ、７回膜貫通型受容体（Ｇ蛋白質結合型受容体）のクラスＣに分類されるアミノ酸１０７８個からなる受容体である。このカルシウム受容体は、１９９３年に遺伝子のクローニングが報告され（非特許文献５）、カルシウム等で活性化されると細胞内カルシウム上昇等を介して様々な細胞応答を引き起こすことが知られている。ヒトカルシウム受容体の遺伝子配列はGenBank Accession No NM_000388として登録されており、動物間でよく保存されている。
　カルシウム受容体活性化剤としてはカルシウムの他に、ガドリニウムなどのカチオン、ポリアルギニン、ポリリジンなどの塩基性アミノ酸からなるポリペプチド、スペルミンなどのポリアミン、プロタミンなどのタンパク質、フェニルアラニンなどのアミノ酸、などが報告されている（非特許文献６）。
　非特許文献７には、低分子ペプチドであるグルタチオン（γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ）がカルシウム受容体活性化剤であること（すなわち、活性化作用を有すること）が報告されているが、グルタチオンが糖尿病の予防又は治療、および食欲調節に有効である可能性は示されていない。
　一方、特許文献１には、特定の配列を有するジペプチドもしくはトリペプチドがカルシウム受容体活性化剤として有効であることが示されており、種々の疾患治療薬の可能性を記述しているが、糖尿病や食欲調節に有効であることは示されていない。
　また、特許文献２には、ε－ポリリジンが体重増加抑制作用を有することが示されているが、糖尿病や食欲調節に有効であることは示されていない。
国際公開第WO2007/055388号パンフレット 特開２００７－３９４２８号公報
Science, vol.247, p.1589-1591, 1990 American Journal of Physiology, vol.276, R1701-R1709, 1999 Diabetes, vol.36, p.1212-1215, 1987 Journal of Clinical Endocrinological Metabolism, vol.65, p.395-401, 1987 Nature, 1993, Vol.366(6455), p.575-580 Cell Calcium, 2004, Vol.35(3), p.209-216 J. Biol. Chem, 2006, Vol.281(13), p.8864-8870 Regulatory Peptides, 2008, vol.151, p.123-129 Endocrinology, 2005, vol.146, p.3748-3756
　前記のとおり、生活習慣病、特に、糖尿病および肥満症が大きな社会問題となっている。これらの生活習慣病を予防または治療するためには、生体への安全性の高い医薬品、あるいは食品や食品に準ずる有用物質の開発が必要である。本発明は、消化管組織におけるＧＬＰ－１、ＣＣＫ、又はその両方の分泌を促進する、生体への安全性が高い糖尿病の予防若しくは治療剤、または、摂食抑制剤を提供することを課題とする。
　本発明者は、カルシウム受容体の活性化剤について研究を行っていたところ、カルシウム受容体活性化剤に腸管由来のＳＴＣ－１細胞からのＣＣＫ分泌、およびＧＬＵＴａｇ細胞からのＧＬＰ－１分泌を促進する働きがあることを見出した。又、カルシウム受容体活性化剤に、盲腸由来のＮＣＩ－Ｈ７１６細胞のＧＬＰ－１の分泌を促進する働きがあることを見出した。本発明者らは、更に研究を重ねた結果、カルシウム受容体活性化作用を有する塩基性アミノ酸ポリペプチド、すなわち、実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチドが、盲腸由来細胞のＧＬＰ－１の分泌を促進すること、および経口糖負荷試験において血糖上昇を抑制すること、特に、ポリリジンがそれらの作用に優れることから、ポリリジンなどの実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチドが、糖尿病の予防又は治療剤、および摂食抑制剤となりうることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチド（塩基性アミノ酸ポリペプチド）を有効成分として含有する、糖尿病の予防もしくは治療剤、又は、摂食抑制剤。
（２）前記ポリペプチドがポリリジンである、前記糖尿病の予防若しくは治療剤、又は摂食抑制剤。
（３）前記ポリリジンが、α－ポリ－L－リジン、α－ポリ－D－リジン、ε－ポリ－L－リジン、およびε－ポリ－D－リジンからなる群から選択される１種または２種以上である、前記糖尿病の予防若しくは治療剤、又は摂食抑制剤。
（４）前記ポリリジンの平均分子量が６５０～３０００００である、前記糖尿病の予防若しくは治療剤、又は、摂食抑制剤。
（５）実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチド（塩基性アミノ酸ポリペプチド）を０．０００００１質量％以上含む、糖尿病の予防若しくは治療、または摂食抑制のための食品。
（６）前記ポリペプチドがポリリジンである、前記糖尿病の予防若しくは治療、又は摂食抑制のための食品。
（７）前記ポリリジンが、α－ポリ－L－リジン、α－ポリ－D－リジン、ε－ポリ－L－リジン、およびε－ポリ－D－リジンからなる群から選択される１種または２種以上である、前記糖尿病の予防若しくは治療、又は摂食抑制のための食品。
（８）前記ポリリジンの平均分子量が６５０～３０００００である、前記糖尿病の予防若しくは治療、又は摂食抑制のための食品。
（９）ポリリジンからなる糖尿病の予防又は治療活性付与剤。
（１０）前記ポリリジンが、α－ポリ－L－リジン、α－ポリ－D－リジン、ε－ポリ－L－リジン、およびε－ポリ－D－リジンからなる群から選択される１種または２種以上である、前記糖尿病の予防又は治療活性付与剤。
（１１）前記ポリリジンの平均分子量が６５０～３０００００である、前記糖尿病の予防又は治療活性付与剤。
（１２）前記糖尿病の予防又は治療活性付与剤を、該活性付与剤の含有量が糖尿病の予防又は治療のための食品に対して１質量ｐｐｂ～９９．９質量％となるように、食品に添加することを特徴とする、糖尿病の予防又は治療のための食品の製造方法。
（１３）前記糖尿病の予防又は治療活性付与剤を、該活性付与剤の含有量が糖尿病の予防又は治療剤に対して１質量ｐｐｂ～９９．９質量％となるように、医薬用担体に添加することを特徴とする、糖尿病の予防又は治療剤の製造方法。
（１４）実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチド（塩基性アミノ酸ポリペプチド）を、糖尿病の予防又は治療が必要な対象に投与することを含む、糖尿病の予防又は治療方法。
（１５）前記ポリペプチドがポリリジンである、前記糖尿病の予防又は治療方法。
（１６）前記ポリリジンが、α－ポリ－L－リジン、α－ポリ－D－リジン、ε-ポリ-L-リジン、およびε-ポリ-D-リジンからなる群から選択される１種または２種以上である、前記糖尿病の予防又は治療方法。
（１７）前記ポリリジンの平均分子量が６５０～３０００００である、前記糖尿病の予防又は治療方法。
（１８）糖尿病の予防又は治療のために用いられる実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチド（塩基性アミノ酸ポリペプチド）。
（１９）糖尿病の予防又は治療のために用いられるポリリジン。
（２０）糖尿病の予防又は治療のために用いられるα－ポリ－L－リジン、α－ポリ－D－リジン、ε－ポリ－L－リジン、およびε－ポリ－D－リジンからなる群から選択される１種または２種以上の化合物。
（２１）糖尿病の予防又は治療のために用いられる平均分子量が６５０～３０００００であるポリリジン。
（２２）摂食抑制のために用いられる実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチド（塩基性アミノ酸ポリペプチド）。
（２３）糖尿病の予防もしくは治療、または摂食抑制のために用いられるポリリジン。
（２４）糖尿病の予防もしくは治療、または摂食抑制のために用いられるα－ポリ－L－リジン、α－ポリ－D－リジン、ε－ポリ－L－リジン、およびε－ポリ－D－リジンからなる群から選択される１種または２種以上の化合物。
（２５）糖尿病の予防もしくは治療、または摂食抑制のために用いられる平均分子量が６５０～３０００００であるポリリジン。
ポリリジンによる、ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞のＧＬＰ－１分泌促進を示す図。図中、左からそれぞれ、α－ポリ－D－リジン（分子量30000-70000）、α－ポリ－L－リジン（分子量30000-70000）、α－ポリ－D－リジン（分子量1000-4000）、α－ポリ－L－リジン（分子量1000-5000）、ε-ポリリジン（分子量3650-5120）、ＨｅｐｅｓバッファーによるＧＬＰ－１分泌を示す。サンプル濃度は、ウェル中の終濃度を示す。図２～４においても同様。 経口糖負荷試験におけるポリリジン経口投与後の血糖値を示す図。値は各群４個体の平均値と標準誤差を示す。＊はコントロール群に対して有意差があることを示す。（Ｐ＜０．０５、Student t-test） γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ、及びシナカルセットによる、STC-1細胞のＣＣＫ分泌促進を示す図。図中、Blk、γEVG、GSH、CCTは、ブランク（対照）、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ、及びγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ、シナカルセットを示す。 γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ、及びシナカルセットによる、GLUTag細胞のＧＬＰ－１分泌促進を示す図。 γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、及びプロタミンによる、GLUTag細胞のＧＬＰ－１分泌促進を示す図。図中、γECはγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓを示す。 γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（ＥＣ）によるラット腸管からのＧＬＰ－１分泌の変化を示す図。値は平均値と標準誤差（ｎ＝８）。＋は０分に対して統計的に有意差あり、＊は水投与群に対して有意差有り（Ｔｕｋｅｙ'ｓ ｔｅｓｔ、Ｐ＜０．０５） ラットにおけるγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（ＥＣ）による血糖上昇抑制作用を示す図。値は平均値と標準誤差（ｎ＝８）。＊はグルコース溶液投与群に対して有意差有り（Student t-test、Ｐ＜０．０５）
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の糖尿病の予防若しくは治療剤、または摂食抑制剤は、塩基性アミノ酸ポリペプチド、すなわち、実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチドを有効成分として含む。
＜１＞塩基性アミノ酸ポリペプチド
　本発明において、塩基性アミノ酸ポリペプチド、すなわち、実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチドとは、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、オルニチン）が少なくとも５残基連結したポリペプチドをいう（以下、「塩基性アミノ酸ポリペプチド」という。）。加えて、本発明において、塩基性アミノ酸ポリペプチドとは、塩基性アミノ酸を、モノマー数割合で９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは実質的に１００％含むポリペプチドである。
　塩基性アミノ酸ポリペプチドは、カルシウム受容体活性化作用を有することが知られており、又、例えば後述のオリゴペプチド等についての検出方法等と同様にして該作用を確認することができる。
　後述の参考例に示すように、本発明者らは、カルシウム受容体活性化作用を有する物質が、共通して腸管由来のＳＴＣ－１細胞からのＣＣＫ分泌およびＧＬＵＴａｇ細胞からのＧＬＰ－１分泌を促進する働きを示すことを見出している。更に、後述する実施例１、２の結果に基づいて、本発明の塩基性アミノ酸ポリペプチドが糖尿病の予防若しくは治療に有効であり、さらに摂食抑制剤としても有用であることが理解できる。
　塩基性アミノ酸ポリペプチドの大きさは連結する塩基性アミノ酸の数により異なるが、平均分子量６５０～３０００００が好ましく、特に１０００～７００００が好ましい。
　塩基性アミノ酸ポリペプチドとして、ポリリジン、ポリアルギニン等が好ましく挙げられる。
　このうち、特にポリリジンが好ましい。ここでポリリジンとは、リジンが少なくとも５残基連結したポリマーであり、リジンをモノマー数割合で９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは１００％含むポリペプチドである（このモノマー連結個数及びモノマー数割合についての定義は、ポリアルギニン及びポリオルニチンの場合にも適用される）。ポリリジンを構成するリジンはL体であってもD体であってもよく、ポリリジンには、L-リジンが連結したポリ－L－リジン、D－リジンが連結したポリ－D－リジンが含まれる。また、ポリリジンには、リジンのαアミノ基とカルボキシル基がペプチド結合したα－ポリリジン、リジンのεアミノ基とカルボキシル基がペプチド結合したε-ポリリジンが含まれる。本発明のポリリジンには、例えば、α-ポリ-L-リジン、α-ポリ-D-リジン、ε-ポリ-L-リジン、ε-ポリ-D-リジンなどが含まれる。特にα－ポリ－L－リジン、ε－ポリ－L－リジンが好ましい。
　ポリリジンの大きさは連結するリジンの数により異なるが、平均分子量６５０～３０００００が好ましく、特に１０００～７００００が好ましい。特に、α－ポリリジンの場合は、平均分子量１０００～５０００が好ましく、ε－ポリリジンの場合は３５００～５５００が好ましい。中でも、平均分子量１０００～５０００のα－ポリ－L－リジンが好ましく挙げられる。
　ポリリジンはカルシウム受容体活性化作用を有し、糖尿病の予防又は治療剤として用いるのに特に好適であり、本発明には例えば以下の態様も好ましいものとして挙げられる：
　α－ポリリジンを有効成分として含有する糖尿病の予防又は治療剤、
　ε-ポリリジンを有効成分として含有する糖尿病の予防又は治療剤、
　α－ポリリジンからなる糖尿病の予防又は治療活性付与剤、
　ε-ポリリジンからなる糖尿病の予防又は治療活性付与剤、
　ポリリジンからなる糖尿病の予防又は治療剤（該予防又は治療剤において、有効成分として含まれるのはポリリジンのみである）。
　又、ポリリジンはカルシウム受容体活性化作用を有し、肥満病の予防又は治療剤として用いるのにも好適である。また、ポリリジンは後述の実施例で確認したように、ＧＬＰ－１分泌促進ならびにＣＣＫ分泌促進作用を有し、胃排出を抑制することから、摂食抑制剤、満腹感増強剤として用いることも好ましい。本発明には例えば以下の態様も好ましいものとして挙げられる：
　ポリリジンを対象に投与することを含む、体重管理又は減量（weight-loss）の方法、
　ポリリジンを０．０００００１質量％以上より好ましくは０．００００１質量％以上、特に好ましくは０．１質量％以上かつ９５重量％以下含む体重管理または減量のための食品、
　ポリリジンからなる肥満症の予防又は治療剤（該予防又は治療剤において、有効成分として含まれるのはポリリジンのみである）。
　上記ポリペプチドは、市販品を用いることが可能である。また、上記ポリペプチドは、（１）化学的に合成する方法、又は（２）酵素的な反応により合成する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。本発明において用いられる上記ポリペプチドは、含まれるアミノ酸の残基数が比較的短い場合は特に、化学的に合成する方法が簡便である。化学的に合成する場合は、ポリペプチドをペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。化学的に合成する方法としては、例えばペプチド固相合成法が挙げられる。そのようにして合成したペプチドは通常の手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製することができる。このようなペプチド固相合成法、およびそれに続くペプチド精製はこの技術分野においてよく知られたものである。
　また、本発明において用いられるペプチドを、酵素的な反応により生産することも出来る。例えば、国際公開パンフレットWO2004/011653号に記載の方法を用いることが出来る。即ち、一方のアミノ酸又はジペプチドのカルボキシル末端をエステル化又はアミド化したアミノ酸又はジペプチドと、アミノ基がフリーの状態であるアミノ酸（例えばカルボキシル基が保護されたアミノ酸）とを、ペプチド生成酵素の存在下において反応せしめ、生成したポリペプチドを精製することによっても生産することもできる。ペプチド生成酵素としては、ペプチドを生成する能力を有する微生物（例えば放線菌）の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、又は、該微生物の菌体処理物、又は、該微生物に由来するペプチド生成酵素が挙げられる。
　尚、上述した様な酵素的な方法や化学的合成法以外にも本発明において用いられるポリペプチドが、野菜や果物等の植物、菌類等に存在する場合がある。ポリペプチドが天然に存在する場合には、これらから抽出して用いてもかまわない。上記ポリペプチドは、単離して用いる必要はなく、ポリペプチドを多く含んでいる画分を用いてもかまわない。
　本発明において用いられるポリペプチドは塩の形態をも包含する。本発明のポリペプチドが塩の形態を成し得る場合、その塩は薬理学的に許容されるものであればよく、例えば、アミノ酸のカルボキシル基等の酸性基に対しては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロへキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩を挙げることができる。また、アミノ酸の塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸などの無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。
＜２＞糖尿病若しくは肥満病の予防若しくは治療剤、又は、摂食抑制剤
　上記塩基性アミノ酸ポリペプチドは、糖尿病又は肥満病の予防又は治療剤、または摂食抑制剤の有効成分として使用される。本発明の糖尿病若しくは肥満病の予防若しくは治療剤、または、摂食抑制剤において、塩基性アミノ酸ポリペプチドは単独で用いてもよく、また任意の２種又は３種以上を混合して用いることも可能である。本発明の糖尿病若しくは肥満病の予防若しくは治療剤、または摂食抑制剤の形態としては、医薬、医薬部外品、食品等が挙げられる。
　本発明の糖尿病若しくは肥満病の予防若しくは治療剤、又は、摂食抑制剤の適用方法としては、特に制限されず、経口投与あるいは注射等を利用した侵襲的投与あるいは座薬投与あるいは経皮投与を採用することが出来る。有効成分を経口、注射などの投与方法に適した固体または液体の医薬用担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することが出来る。本発明においては、特に経口投与が好ましい。このような製剤としては例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤の形態、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤の形態、凍結乾燥剤などの形態が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。
　上記医薬用担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ゼラチン、アルブミン、アミノ酸、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
　本発明の糖尿病若しくは肥満病の予防若しくは治療剤、または、摂食抑制剤の投与又は摂取量は、糖尿病又は肥満病の治療や予防、摂食抑制に有効な量であればよく、患者の年齢、性別、体重、症状などに応じて適宜調節されるが、例えば、経口投与の場合、本発明に用いられる塩基性アミノ酸ポリペプチドの投与量として、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、０．０１ｇ～１０ｇが好ましく、１ｋｇ体重あたり、０．１ｇ～１ｇがより好ましい。投与回数は特に制限されず、１日あたり１回～数回投与することができる。
　本発明の糖尿病又は肥満病の予防又は治療剤、摂食抑制剤中の塩基性アミノ酸ポリペプチドの含有量は、上記投与量に適したものであれば特に制限されず、好ましくは乾燥重量当り０．０００００１質量％～９９．９質量％、より好ましくは０．００００１質量％～９９．９質量％、特に好ましくは０．０００１質量％～９９．９質量％である。又、０．００００１質量％～１０質量％も好ましい。
　本発明の糖尿病又は肥満病の予防又は治療剤、摂食抑制剤はまた、糖尿病又は肥満病の治療や予防、摂食抑制、満腹感持続のための食品、例えば、容器や包装に糖尿病又は肥満病の予防効果又は治療効果、さらには摂食抑制効果や満腹感持続効果がある旨を表示した食品として用いることもできる。食品としては、塩基性アミノ酸ポリペプチドを０．０００００１質量％以上、より好ましくは０．０００００１質量％～９９．９質量％、更には０．００００１質量％～９９．９質量％含むことが好ましい。特に好ましくは、塩基性アミノ酸ポリペプチドを０．００００１質量％以上９８質量％以下含むことが好ましく、又、０．００００１質量％～１０質量％も好ましい。食品の形態としては特に制限されず、塩基性アミノ酸ポリペプチドを配合する以外は、通常の食品と同様の材料を用いて、同様の製法で製造することができる。食品としては、例えば、調味料、飲料、健康食品、農産物加工品、水産物加工品、畜産物加工品等が挙げられる。
　本発明の糖尿病又は肥満病の予防又は治療剤、摂食抑制剤は、塩基性アミノ酸ポリペプチドに加えて、他のカルシウム受容体活性化剤を１種または２種以上含むものであってもよい。
　本明細書中において「カルシウム受容体活性化剤」とは、カルシウム受容体に結合し、カルシウム受容体を活性化し、カルシウム受容体を発現している細胞の機能を調節するものをいう。また、本明細書中において「カルシウム受容体活性化」とは、カルシウム受容体にリガンドが結合し、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を活性化して、シグナルを伝達することを意味する。また、カルシウム受容体がこのシグナルを伝達することを「カルシウム受容体活性」という。
　上記他のカルシウム受容体活性化剤としては、カルシウム受容体活性化作用を有するオリゴペプチド及び低分子化合物が挙げられる。
　カルシウム受容体活性化作用を有するオリゴペプチド及び低分子化合物は、例えば、カルシウム受容体と被検物質とを反応させ、カルシウム受容体活性を検出することにより取得することができる。このようにして得られるオリゴペプチド及び低分子化合物について、ＧＬＰ－１又はＣＣＫの分泌促進作用、あるいは糖尿病の予防又は治療効果を有することを確認することが好ましい。
　以下に、カルシウム受容体活性化作用を有するオリゴペプチド及び低分子化合物をスクリーニングする方法を具体的に示すが、これらのステップに限定されるものではない。
１）カルシウム受容体活性を測定するためのカルシウム受容体活性測定系に被検物質を添加して、カルシウム受容体活性を測定する。
２）被験物質を添加したときのカルシウム受容体活性と、被験物質を添加しなかったときのカルシウム受容体活性を比較する。
３）被験物質を添加したときに高いカルシウム受容体活性を示す被験物質を選択する。
　カルシウム受容体活性の測定は、例えば、カルシウム受容体を発現する細胞を用いた測定系を用いて行われる。上記細胞はカルシウム受容体を内在的に発現している細胞であっても、外来のカルシウム受容体遺伝子が導入された組み換え細胞であってもよい。上記カルシウム受容体活性測定系は上記カルシウム受容体を発現する細胞に、カルシウム受容体に特異的な細胞外リガンド（活性化剤）を加えたときに、活性化剤とカルシウム受容体との結合（反応）を検出することができるか、又は、活性化剤とカルシウム受容体との結合（反応）に応答して細胞内に検出可能なシグナルを伝達するものであれば、特に制限なく使用することができる。被検物質との反応によりカルシウム受容体活性が検出された場合、当該被検物質はカルシウム受容体刺激活性を有し、糖尿病又は肥満病の予防又は治療効果や摂食抑制効果を有する物質であることが判別される。
　一方、カルシウム受容体活性化剤の持つ、糖尿病又は肥満病の予防又は治療効果や摂食抑制効果は、例えば、実施例、参考例に記載したＧＬＰ－１又はＣＣＫの分泌促進作用を調べる試験等により確認することができる。又、糖尿病の予防又は治療効果は、実施例に記載したグルコース負荷下の血糖上昇抑制効果を調べる試験等により確認することもでき得る。また、被験物質として用いるオリゴペプチド及び低分子化合物は特に制限はないが、オリゴペプチドとしては２～１０のアミノ酸残基からなるペプチド又はその誘導体が好ましく、２又は３個のアミノ酸残基からなるペプチド又はその誘導体がより好ましい。また、オリゴペプチドのＮ末端側のアミノ酸残基は、γ－グルタミン酸であることが好ましい。低分子化合物としてはシナカルセット（(R)-N-(3-(3-(trifluoromethyl)phenyl)propyl)-1-(1-naphthyl)ethylamine）及びその類縁化合物が好ましい。シナカルセットの類縁化合物については後述する。
　上記カルシウム受容体は、その由来は特に制限されず、上記ヒトのカルシウム受容体のみならず、マウス、ラット、イヌなど含めた動物由来のカルシウム受容体が挙げられる。具体的には、上記カルシウム受容体としては、GenBank Accession No NM_00388で登録されているヒトカルシウム受容体遺伝子によってコードされるヒトカルシウム受容体が好ましく例示できる。尚、カルシウム受容体は、上記配列の遺伝子によってコードされるタンパク質に制限されず、カルシウム受容体機能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有する遺伝子によってコードされるタンパク質であってもよい。GPRC6A受容体や5.24受容体もまたカルシウム受容体のサブタイプとして知られており、本発明において利用可能である。なお、カルシウム受容体機能はこれらの遺伝子を細胞に発現させ、カルシウム添加時の電流の変化や細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定することによって調べることができる。
　上述の如く、カルシウム受容体活性は、カルシウム受容体又はその断片を発現した生きた細胞、カルシウム受容体又はその断片を発現した細胞膜、カルシウム受容体又はその断片のタンパク質を含むインビトロの系などを利用して確認することが出来る。
　以下に生きた細胞を用いた一例を示すが、この一例に限定されるものではない。
　カルシウム受容体は、アフリカツメガエル卵母細胞やハムスター卵巣細胞やヒト胎児腎臓細胞等の培養細胞に発現させる。これは外来遺伝子を保持するプラスミドにカルシウム受容体遺伝子をクロ－ニングしたものを、プラスミドの状態もしくはそれを鋳型にしたｃＲＮＡを導入することで可能となる。反応の検出には電気生理学的手法や細胞内カルシウム上昇の蛍光指示試薬を用いることができる。
　カルシウム受容体の発現は、初めにカルシウムもしくは特異的活性化剤による応答で確認する。５ｍＭ程度の濃度のカルシウムに対して、細胞内電流が見られた卵母細胞もしくは蛍光指示試薬の蛍光が見られた培養細胞を使用する。カルシウムの濃度を変えて濃度依存性を測定する。次に、ペプチド等の被験物質を１μＭ～１ｍＭ程度に調製し、卵母細胞もしくは培養細胞に添加することで、上記ペプチド等の被験物質のカルシウム受容体活性を測定する。
　本発明に使用するカルシウム受容体活性を有するオリゴペプチドとしては、例えば、γ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ－Ｇｌｕ－Ａｌａ、γ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ、γ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｏｒｎ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｍｅｔ、Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、Ｇｌｙ－Ｃｙｓ、Ｌｅｕ－Ａｓｐ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ＮＨ2、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ｏｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｔａｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ、γ－Ｇｌｕ－ｔ－Ｌｅｕおよびγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）（以下、本発明のペプチド等ともいう）が挙げられる。
　前記化合物のうち、好ましい化合物は、前記ＸがＣｙｓ、Ｃｙｓ（ＳＮＯ）、Ｃｙｓ（Ｓ－ａｌｌｙｌ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）、ＡｂｕまたはＳｅｒであり、前記ＹがＧｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、Ａｓｎ、ＣｙｓまたはＧｌｎである化合物である。
　尚、本明細書中において各オリゴペプチドを構成するアミノ酸は、特に断わらない限りいずれもＬ－体である。ここで、アミノ酸とは、Ｇｌｙ, Ａｌａ, Ｖａｌ, Ｌｅｕ, Ｉｌｅ, Ｓｅｒ, Ｔｈｒ, Ｃｙｓ, Ｍｅｔ, Ａｓｎ, Ｇｌｎ, Ｐｒｏ, Ｈｙｐなどの中性アミノ酸、Ａｓｐ, Ｇｌｕなどの酸性アミノ酸、Ｌｙｓ, Ａｒｇ, Ｈｉｓなどの塩基性アミノ酸、Ｐｈｅ, Ｔｙｒ, Ｔｒｐなどの芳香族アミノ酸や、ホモセリン、シトルリン、オルニチン、α-アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、タウリンなども含有する。
　本明細書においてアミノ基残基の略号は以下のアミノ酸を意味する。
（１）Ｇｌｙ：グリシン
（２）Ａｌａ：アラニン
（３）Ｖａｌ：バリン
（４）Ｌｅｕ：ロイシン
（５）Ｉｌｅ：イソロイシン
（６）Ｍｅｔ：メチオニン
（７）Ｐｈｅ：フェニルアラニン
（８）Ｔｙｒ：チロシン
（９）Ｔｒｐ：トリプトファン
（１０）Ｈｉｓ：ヒスチジン
（１１）Ｌｙｓ：リジン
（１２）Ａｒｇ：アルギニン
（１３）Ｓｅｒ：セリン
（１４）Ｔｈｒ：トレオニン
（１５）Ａｓｐ：アスパラギン酸
（１６）Ｇｌｕ：グルタミン酸
（１７）Ａｓｎ：アスパラギン
（１８）Ｇｌｎ：グルタミン
（１９）Ｃｙｓ：システイン
（２０）Ｐｒｏ：プロリン
（２１）Ｏｒｎ：オルニチン
（２２）Ｓａｒ：サルコシン
（２３）Ｃｉｔ：シトルリン
（２４）Ｎ－Ｖａｌ：ノルバリン
（２５）Ｎ－Ｌｅｕ：ノルロイシン
（２６）Ａｂｕ：α－アミノ酪酸
（２７）Ｔａｕ：タウリン
（２８）Ｈｙｐ：ヒドロキシプロリン
（２９）ｔ－Ｌｅｕ：ｔｅｒｔ－ロイシン
　また、アミノ酸誘導体とは、上記アミノ酸の各種誘導体であって、例えば、特殊アミノ酸や非天然アミノ酸、アミノアルコール、或いは末端カルボニル基やアミノ基、システインのチオール基などのアミノ酸側鎖が各種置換基により置換したものが挙げられる。置換基としては、アルキル基、アシル基、水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基、ニトロ基、スルフォニル基や各種保護基などが挙げられ、例えば、Ａｒｇ（ＮＯ2）：Ｎ－γ－ニトロアルギニン、Ｃｙｓ（ＳＮＯ）：Ｓ－ニトロシステイン、Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）：Ｓ－メチルシステイン、Ｃｙｓ（Ｓ－ａｌｌｙｌ）：Ｓ－アリルシステイン、Ｖａｌ－ＮＨ2：バリンアミド、Ｖａｌ－ｏｌ：バリノール（２－アミノ－３－メチル－１－ブタノール）などが含まれる。
　尚、上記γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（ＳＮＯ）－Ｇｌｙ（Ｓ－ニトロソグルタチオン（ＧＮＳＯ））は下記の構造式を有するものであり、上記γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ（Ｏ）およびγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）（Ｏ）式中の（Ｏ）はスルフォキシド構造であることを意味する。γ-Ｇｌｕの(γ)とは、グルタミン酸のγ位のカルボキシ基を介して他のアミノ酸が結合していることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　γ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ－Ｇｌｕ－Ａｌａ、γ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ、γ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｏｒｎ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｍｅｔ、Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、Ｇｌｙ－Ｃｙｓ、Ｌｅｕ－Ａｓｐ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ＮＨ2、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ｏｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｔａｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ、γ－Ｇｌｕ－ｔ－Ｌｅｕおよびγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）がカルシウム受容体を活性化することが示された（国際公開第WO2007/055388号パンフレット、国際公開第WO2007/055393号パンフレット、国際公開第WO2008/139945号パンフレット、国際公開第WO2008/139946号パンフレット、国際公開第WO2008/139947号パンフレット）。そして、実施例、参考例に示すように、カルシウム受容体活性化作用を有する複数種の化合物がＧＬＰ－１又はＣＣＫの分泌促進作用を有することが確認された。したがって、γ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ－Ｇｌｕ－Ａｌａ、γ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ、γ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｏｒｎ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｇｌｙ、Ｃｙｓ－Ｍｅｔ、Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、Ｇｌｙ－Ｃｙｓ、Ｌｅｕ－Ａｓｐ、γ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ＮＨ2、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－ｏｌ、γ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ、γ－Ｇｌｕ－Ｔａｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）（Ｏ）、γ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ、γ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ、γ－Ｇｌｕ－ｔ－Ｌｅｕおよびγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ｓ－Ｍｅ）は、本発明の糖尿病又は肥満病の予防又は治療剤、摂食抑制剤の他の有効成分として、上記塩基性アミノ酸ポリペプチドと組み合わせて用いることができる。本発明において、これらのオリゴペプチド又は低分子化合物は単独で用いてもよく、また任意の２種又は３種以上を混合して用いることもできる。
　上記の化合物のうち、特に好ましい化合物は、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ及びシナカルセットである。又、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓも特に好ましい。
　γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ及びシナカルセットは肥満病の予防又は治療剤の成分として用いるのに特に好適であり、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ及びシナカルセットは、糖尿病の予防又は治療剤の成分として用いるのに特に好適である。
　上記オリゴペプチドは、市販品を用いることが可能である。また、上記オリゴペプチドは、（１）化学的に合成する方法、又は（２）酵素的な反応により合成する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。オリゴペプチドに含まれるアミノ酸の残基数が２～３残基と特に短い場合には、化学的に合成する方法が簡便である。化学的に合成する場合は、オリゴペプチドをペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。化学的に合成する方法としては、例えばペプチド固相合成法が挙げられる。そのようにして合成したオリゴペプチドは通常の手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製することができる。このようなペプチド固相合成法、およびそれに続くペプチド精製はこの技術分野においてよく知られたものである。
　また、前記オリゴペプチドを、酵素的な反応により生産することも出来る。例えば、国際公開WO2004/011653号パンフレットに記載の方法を用いることが出来る。即ち、一方のアミノ酸又はジペプチドのカルボキシル末端をエステル化又はアミド化したアミノ酸又はジペプチドと、アミノ基がフリーの状態であるアミノ酸（例えばカルボキシル基が保護されたアミノ酸）とを、ペプチド生成酵素の存在下において反応せしめ、生成したジペプチド又はトリペプチドを精製することによっても生産することもできる。ペプチド生成酵素としては、ペプチドを生成する能力を有する微生物（例えば放線菌）の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、又は、該微生物の菌体処理物、又は、該微生物に由来するペプチド生成酵素が挙げられる。
　尚、上述した様な酵素的な方法や化学的合成法以外にも本発明において用いられ得るオリゴペプチドが、野菜や果物等の植物、酵母等の微生物、酵母エキス等に存在する場合がある。天然に存在する場合には、これらから抽出して用いてもかまわない。
　また、オリゴペプチドは、単離して用いる必要はなく、オリゴペプチドを多く含んでいる画分を用いてもかまわない。例えば、グルタチオン（γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ）を含む酵母エキス又はその分画物が挙げられる。酵母エキス等の調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。酵母エキスの分画物としては、グルタチオンを含む限り、特に制限されない。又、例えば、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓを含む酵母エキス又はその分画物も挙げられる。酵母エキス等の調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。酵母エキスの分画物としては、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓを含む限り、特に制限されない。
　本発明において用いられ得るオリゴペプチドは塩の形態をも包含する。オリゴペプチドが塩の形態を成し得る場合、その塩は薬理学的に許容されるものであればよく、例えば、ペプチド中のカルボキシル基等の酸性基に対しては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロへキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩を挙げることができる。ペプチド中に塩基性基が存在する場合の塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸などの無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。
　本発明に用いられ得るカルシウム受容体活性を有する低分子化合物としては、シナカルセット、及びシナカルセット類縁化合物が挙げられる。シナカルセット類縁化合物としては、米国特許第6211244号、第6213146号、第5688938号、第5763569号、第5858684号、第5962314号、第6001884号、第6011068号、第6031003号、国際公開WO1995/011221号、WO1996/012687号、WO2002/059102号等に記載された化合物が挙げられる。なお、本発明において用いられ得る低分子化合物は、上記ペプチドの場合と同様に、塩の形態をも包含する。
　また、他のカルシウム受容体活性化剤として、カルシウム及びカドリニウムなどのカチオン、プトレッシン、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミン、プロタミンなどのタンパク質、フェニルアラニンなどのアミノ酸なども挙げられる。本発明において、これらのカルシウム受容体活性化剤は単独で用いてもよく、また任意の２種又は３種以上を混合して用いることも可能である。これらのうち、カルシウム及びガドリニウムなどのカチオンが好ましく、カルシウムがより好ましい。すなわち、更に加えられる他のカルシウム受容体活性化剤の少なくとも１種はカチオンであることが好ましい。
　上記他のカルシウム受容体活性化剤が、前記実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチドと共存することによって、カルシウム受容体のより強い活性化が見られる。本発明の糖尿病又は肥満病の予防又は治療剤、摂食抑制剤における実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチドの合計含有量と他のカルシウム受容体活性化剤の合計含有量の割合は、カルシウム受容体のより強い活性化が可能である限り特に制限されないが、例えば、他のカルシウム受容体活性化剤の合計と、実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチド及び低分子化合物の合計の質量比が、１：100～100：1であることが好ましい。
＜３＞糖尿病又は肥満病の予防又は治療活性付与剤
　本発明の糖尿病又は肥満病の予防又は治療活性付与剤は、カルシウム受容体活性化作用を有するポリリジンからなる。該活性付与剤において、その有効成分として含まれるのはポリリジンのみである。使用するポリリジンの好ましい形態については、上述したとおりである。
　本発明の活性付与剤の使用方法としては、特に制限されず、食品や医薬用担体等に添加して用いることができる。
　本発明の活性付与剤の、食品や医薬用担体等に対する使用量は、糖尿病又は肥満病の予防又は治療活性の付与に有効な量であればよく、用途に応じて適宜調節される。
　例えば、食品の場合、食品中に１質量ｐｐｂ～９９．９質量％、好ましくは１０質量ｐｐｂ～９９．９質量％、より好ましくは１０質量ｐｐｍ～１０質量％程度のポリリジンが含有されるように使用される。従って、本発明の活性付与剤の含有量が、糖尿病又は肥満病の予防又は治療のための食品（目的製造物）に対して１質量ｐｐｂ～９９．９質量％、好ましくは１０質量ｐｐｂ～９９．９質量％、より好ましくは１０質量ｐｐｍ～１０質量％程度となるように、該活性付与剤を食品に添加することで、糖尿病又は肥満病の予防又は治療のための食品を製造することができる。
　又、医薬用担体の場合、例えば、予防又は治療剤中に１質量ｐｐｂ～９９．９質量％、好ましくは１０質量ｐｐｂ～９９．９質量％、より好ましくは１０質量ｐｐｍ～１０質量％程度のポリリジンが含有されるように使用される。従って、本発明の活性付与剤の含有量が、糖尿病又は肥満病の予防又は治療剤（目的製造物）に対して１質量ｐｐｂ～９９．９質量％、好ましくは１０質量ｐｐｂ～９９．９質量％、より好ましくは１０質量ｐｐｍ～１０質量％程度となるように、該活性付与剤を医薬用担体に添加することで、糖尿病又は肥満病の予防又は治療剤を製造することができる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕　GLP-1分泌促進作用
　ヒト盲腸由来のGLP-1産生細胞株NCI-H716（ATCC No CCL-251）を、10% FBSを含むDMEM/HamF-12 mediumにて、37℃、5% CO2存在下で培養した。NCI-H716細胞をポリ-D-リジンコート96ウェルプレートに、100000 cells/wellで播種し、2日間培養した。サンプル添加前に、Hepesバッファー（20 mM Hepes, 146 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5.5 mM D-glucose, 0.2% BSA, pH 7.4）にてウェルを洗浄し、各種ポリリジンを同バッファーに溶解したサンプル溶液を50μl添加し、37℃にて60分間インキュベーションした。使用したポリリジンとその濃度は、α-ポリ-D-リジン（分子量30000-70000, Sigma-Aldrich、2008-2009年 カタログ番号P7886）、25μg/ml；α-ポリ-D-リジン（分子量1000-4000, Sigma-Aldrich、2008-2009年 カタログ番号P0296）、1.25μg/ml；　α-ポリ-L-リジン（分子量30000-70000, Sigma-Aldrich、2008-2009年 カタログ番号P2636）、25μg/ml；　α-ポリ-L-リジン（分子量1000-5000, Sigma-Aldrich、2008-2009年 カタログ番号P0879）、1.25μg/ml；　ε-ポリリジン（25～35残基、分子量約3650-5120、商品名ガードエース GA-22；チッソ株式会社（東京）製）、3μg/mlである。また、対照として、Hepesバッファーを用いた。
　サンプル溶液を回収して、それを遠心分離（5000 x g、1分）にかけ、細胞を沈殿させて上清を得た。この上清をAmicon Microcon（Ultracel YM-10、分子量cut off＝10000 ；Milipore社）を用いてろ過し、ろ液を回収した。ろ液中のGLP-1濃度をEnzyme immuno assay kit (矢内原研究所)によりＧＬＰ－１抗体を用いて測定した。
　結果を図１に示す。各種ポリリジンにＧＬＰ－１分泌促進作用が確認された。したがって、各種ポリリジンが、胃排出抑制作用を示し、摂食抑制剤、満腹感持続剤として有用であることが示された（Regulatory Peptides, 2009, vol.156, p9-12; Gastroenterology, 2007, vol.132, p.2141-2157; Nature, 1996, vol.379, p.69-72, Am J Physiol Endocrinol Metab, 1997, vol.273, p.981-988; Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 1997, vol.273, p.920-927; J. Clin. Invest., 1998, vol.101, p.515-520）。
〔実施例２〕ラットにおけるグルコース負荷試験
　ＳＤ系雄ラット（７週齢）を予備飼育（３～４日）後に、一夜絶食し、経口グルコース負荷試験を行った。試料投与前の尾静脈血を採取し、試料｛グルコース溶液のみ（２g／kg体重）またはポリリジン（α-poly-D-lysine、分子量30000-70000, Sigma-Aldrich、2008-2009年 カタログ番号P7886）０．１～５０ｍｇ／kg体重を含むグルコース溶液｝を、フィーディングチューブにより経口投与した。試料投与後、１５、３０、６０、９０、１２０分の尾静脈血を採取し、血漿中のグルコース濃度を市販のキット（和光純薬工業製）を用いて測定した。
　血中グルコース濃度は、ポリリジン１０ｍｇ／kg投与により、コントロール群（グルコース溶液のみ投与）よりも、グルコース投与後１５分において低下傾向が見られ、ポリリジン５０ｍｇ／kg投与群では、投与後１５、３０分においてコントロール群に比べ有意に低い値を示した（図２）。したがって、ラットにおいてポリリジンが血糖上昇抑制作用を有することが確認された。
　以下、カルシウム受容体活性化作用を有する物質が、共通して腸管由来のＳＴＣ－１細胞からのＣＣＫ分泌、およびＧＬＵＴａｇ細胞からのＧＬＰ－１分泌を促進する働きを示すこと、同物質が、血糖上昇抑制作用を示すことを、参考例により示す。
〔製造例１〕γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙの合成
　Ｂｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ（8.69g, 40.0mmol）とＧｌｙ－ＯＢｚｌ・ＨＣｌ（8.07g, 40.0 mmol）を塩化メチレン（100ml）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（6.13ml, 44.0mmol）、ＨＯＢｔ（1-Hydroxybenzotriazole, 6.74 g, 44.0 mmol）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride, 8.44g, 44.0mmol）を溶液に加え、室温で一夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル（200ml）に溶解した。溶液を水（50ml）、５％クエン酸水溶液（50ml×２回）、飽和食塩水（50ml）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（50ml×２回）、飽和食塩水（50ml）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル－ｎ－ヘキサンから再結晶してＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－ＯＢｚｌ（13.2g, 36.2mmol）を白色結晶として得た。
　Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－ＯＢｚｌ（5.47g, 15.0mmol）を４Ｎ－ＨＣｌ／ジオキサン溶液（40ml）に加え、室温で５０分撹拌した。ジオキサンを減圧濃縮で除き、残渣にｎ－ヘキサン（30ml）を加え減圧濃縮した。この操作を３回繰り返し、Ｈ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－ＯＢｚｌ・ＨＣｌを定量的に得た。
　上記Ｈ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－ＯＢｚｌ・ＨＣｌ及びＺ－Ｇｌｕ－ＯＢｚｌ（5.57g, 15.0mmol）を塩化メチレン（50ml）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（2.30ml, 16.5mmol）、ＨＯＢｔ（1-Hydroxybenzotriazole, 2.53g, 16.5mmol）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride, 3.16g, 16.5mmol）を溶液に加え、室温で二夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を加熱した酢酸エチル（1500ml）に溶解した。溶液を水（200ml）、５％クエン酸水溶液（200ml×２回）、飽和食塩水（150ml）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（200ml×２回）、飽和食塩水（150ml）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。析出した結晶を濾取、減圧乾燥してＺ－Ｇｌｕ（Ｖａｌ－Ｇｌｙ－ＯＢｚｌ）－ＯＢｚｌ（6.51g,10.5mmol）を白色結晶として得た。
　上記Ｚ－Ｇｌｕ（Ｖａｌ－Ｇｌｙ－ＯＢｚｌ）－ＯＢｚｌ（6.20g, 10.03mmol）をエタノール（200ml）に懸濁し、１０％パラジウム炭素（1.50g）を加え、水素雰囲気下に５５℃で５時間還元反応を行った。この間、全量で100mlの水を徐々に加えた。触媒を桐山ロートで濾過して除き、濾液を半分に減圧濃縮した。反応液を更にメンブランフィルターで濾過し、濾液を減圧濃縮した。残渣を少量の水に溶かした後にエタノールを加えて結晶を析出させ、結晶を濾過して集め減圧乾燥してγ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙの白色粉末（2.85g, 9.40mmol）を得た。
ESI-MS:(M+H)+=304.1
1H-NMR(400MHz, D2O）δ(ppm):0.87 (3H, d, J=6.8 Hz), 0.88 (3H, d, J=6.8 Hz), 1.99-2.09 (3H, m), 2.38-2.51 (2H, m), 3.72 (1H, t, J=6.35 Hz), 3.86 (1H, d, J=17.8 Hz), 3.80 (1H, d, J=17.8 Hz), 4.07 (1H, d, J=6.8 Hz)
〔参考例１〕ＣＣＫ分泌促進作用
　マウス小腸由来のＣＣＫ産生細胞株STC-1を10% FBSを含むDulbecco's modified Eagle's medium にて、37℃、5% CO2存在下で培養した。STC-1細胞を48ウェルプレートに、サブコンフルエントになるまで2-3日間培養した。サンプル添加前に、HepesBバッファー（140 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 20 mM Hepes, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 0.1% BSA, pH 7.4）にてウェルを洗浄し、サンプルを同バッファーに溶解したサンプル溶液を100μl添加し、37℃にて60分間インキュベーションした。サンプルとして、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、及び、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ、シナカルセットを用いた。また、対照として、HepesBバッファーを用いた。上清を回収後、遠心分離（800 x g、５分、4℃）により細胞を沈殿させ、その上清80μlを回収し、凍結保存した。
　前記上清をOASISカートリッジ(C18)にて前処理した後、上清中のCCK濃度を、市販のEnzyme immuno assay kit (Phoenix Pharmaceuticals)にて測定した。
　結果を図３に示す。γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ、シナカルセットにＣＣＫ分泌促進作用が確認された。
〔参考例２〕ＧＬＰ－１分泌促進作用（１）
　マウス大腸由来のＧＬＰ－１産生細胞株GLUTagを、10% FBSを含むDulbecco's modified Eagle's mediumにて、37℃、5% CO2存在下で培養した。GLUTag細胞を48ウェルプレートに、サブコンフルエントになるまで2-3日間培養した。サンプル添加前に、HepesBバッファー（140 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 20 mM Hepes, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 0.1% BSA, pH 7.4）にてウェルを洗浄し、サンプルを同バッファーに溶解したサンプル溶液を80μl添加し、37℃にて60分間インキュベーションした。サンプルとして、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ、及びシナカルセットを用いた。また、対照として、HepesBバッファーを用いた。上清を回収後、遠心分離（800 x g、５分、 4℃）により細胞を沈殿させ、その上清70 μlを回収、凍結保存した。上清中のＧＬＰ－１濃度を市販のEnzyme immuno assay kit (矢内原研究所)にて測定した。
　結果を図４に示す。γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ、シナカルセットにＧＬＰ－１分泌促進作用が確認された。
〔参考例３〕ＧＬＰ－１分泌促進作用（２）
　参考例２と同様にＧＬＰ－１産生細胞株GLUTagを用いてＧＬＰ－１分泌促進作用を調べた。サンプルとして、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、及びプロタミンを用いた。
　結果を図５に示す。γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、プロタミンにＧＬＰ－１分泌促進作用が確認された。
〔参考例４〕ラットにおけるＧＬＰ－１分泌試験
　ＳＤ系雄ラット（８週齢）を予備飼育後、一夜絶食しケタミン・キシラジン麻酔下で開腹した。ＧＬＰ－１産生細胞は主に回腸部位に分布することから、回腸結紮ループ（３０ｃｍ）を作成後、回腸腸管膜静脈にカテーテルを留置し、このカテーテルより０分時の採血（０ ｔｉｍｅ）を行った。回腸結紮ループ内へ試料（２ｍＬ脱イオン水、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ　２０ｍｇ／脱塩水２ｍＬ）を投与し、３０、６０、９０、１２０分後にそれぞれ採血を行い、血漿中のＧＬＰ－１濃度をEnzyme immuno assay kit（矢内原研究所製）にて測定した。
　結果を図６に示す。γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓを投与したラットにおいて、水投与群よりも有意に高い血中ＧＬＰ－１濃度の上昇が認められたことから、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓはラットに対するＧＬＰ－１分泌促進活性を有することが確認された。
〔参考例５〕ラットにおけるグルコース負荷試験
　ＳＤ系雄ラット（７週齢）を予備飼育（３～４日）後に、一夜絶食し、経口グルコース負荷試験を行った。試料投与前の尾静脈血を採取し、試料｛グルコース溶液のみ（２g／kg体重）／γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（１６０mg／kg体重）を含むグルコース溶液｝を、フィーディングチューブにより経口投与した。試料投与後、１５、３０、６０、９０、１２０分の尾静脈血を採取し、血漿中のグルコース濃度を市販のキット（和光純薬工業製）を用いて測定した。
　結果を図７に示す。血中グルコース濃度は、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓを投与したラットにおいて、グルコース投与後１５、３０分後においてグルコース溶液のみを投与した群よりも有意に低い値を示したことから、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓが血糖上昇抑制作用を有することが確認された。ＧＬＰ－１分泌促進活性を有するカルシウム活性化剤が血糖上昇抑制作用を有することが理解される。
　本発明により、生体への安全性が高い糖尿病の予防又は治療剤が提供される。又、本発明の摂食抑制剤は、例えば、肥満症の予防又は治療に有用である。

Claims (25)

  1. 　実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチドを有効成分として含有する、糖尿病の予防若しくは治療剤、又は摂食抑制剤。
  2. 　前記ポリペプチドがポリリジンである、請求項１に記載の糖尿病の予防若しくは治療剤、又は摂食抑制剤。
  3. 　前記ポリリジンが、α－ポリ－L－リジン、α－ポリ－D－リジン、ε－ポリ－L－リジン、およびε－ポリ－D－リジンからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項２に記載の糖尿病の予防若しくは治療剤、又は摂食抑制剤。
  4. 　前記ポリリジンの平均分子量が６５０～３０００００である、請求項２又は３に記載の糖尿病の予防若しくは治療剤、又は、摂食抑制剤。
  5. 　実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチドを０．０００００１質量％以上含む、糖尿病予防若しくは治療、または摂食抑制のための食品。
  6. 　前記ポリペプチドがポリリジンである、請求項５に記載の糖尿病の予防若しくは治療、又は摂食抑制のための食品。
  7. 　前記ポリリジンが、α－ポリ－L－リジン、α－ポリ－D－リジン、ε－ポリ－L－リジン、およびε－ポリ－D－リジンからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項６に記載の糖尿病の予防若しくは治療、又は、摂食抑制のための食品。
  8. 　前記ポリリジンの平均分子量が６５０～３０００００である、請求項６又は７に記載の糖尿病の予防若しくは治療、又は、摂食抑制のための食品。
  9. 　ポリリジンからなる糖尿病の予防又は治療活性付与剤。
  10. 　前記ポリリジンが、α－ポリ－L－リジン、α－ポリ－D－リジン、ε－ポリ－L－リジン、およびε－ポリ－D－リジンからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項９に記載の糖尿病の予防又は治療活性付与剤。
  11. 　前記ポリリジンの平均分子量が６５０～３０００００である、請求項９又は１０に記載の糖尿病の予防又は治療活性付与剤。
  12. 　請求項９～１１のいずれか一項に記載の糖尿病の予防又は治療活性付与剤を、該予防又は治療活性付与剤の含有量が糖尿病の予防又は治療のための食品に対して１質量ｐｐｂ～９９．９質量％となるように、食品に添加することを特徴とする、糖尿病の予防又は治療のための食品の製造方法。
  13. 　請求項９～１１のいずれか一項に記載の糖尿病の予防又は治療活性付与剤を、該予防又は治療活性付与剤の含有量が糖尿病の予防又は治療剤に対して１質量ｐｐｂ～９９．９質量％となるように、医薬用担体に添加することを特徴とする、糖尿病の予防又は治療剤の製造方法。
  14. 　実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチドを、糖尿病の予防又は治療が必要な対象に投与することを含む、糖尿病の予防又は治療方法。
  15. 　前記ポリペプチドがポリリジンである、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記ポリリジンが、α－ポリ－L－リジン、α－ポリ－D－リジン、ε-ポリ-L-リジン、およびε-ポリ-D-リジンからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記ポリリジンの平均分子量が６５０～３０００００である、請求項１５に記載の方法。
  18. 　糖尿病の予防又は治療のために用いられる実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチド。
  19. 　糖尿病の予防又は治療のために用いられるポリリジン。
  20. 　糖尿病の予防又は治療のために用いられるα－ポリ－L－リジン、α－ポリ－D－リジン、ε－ポリ－L－リジン、およびε－ポリ－D－リジンからなる群から選択される１種または２種以上の化合物。
  21. 　糖尿病の予防又は治療のために用いられる平均分子量が６５０～３０００００であるポリリジン。
  22. 　摂食抑制のために用いられる実質的に塩基性アミノ酸からなるポリペプチド。
  23. 　前記ポリペプチドがポリリジンである、請求項１８または２２記載のポリペプチド。
  24. 　前記ポリペプチドが、α－ポリ－L－リジン、α－ポリ－D－リジン、ε－ポリ－L－リジン、およびε－ポリ－D－リジンからなる群から選択される１種または２種以上の化合物である、請求項１８または２２記載のポリペプチド。
  25. 　前記ポリペプチドが、平均分子量が６５０～３０００００であるポリリジンである、請求項１８または２２記載のポリペプチド。
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