JP5716791B2 - 下痢の予防又は治療剤 - Google Patents

Description

本発明は、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物を有効成分として含有する下痢の予防又は治療剤に関する。

カルシウム受容体は、カルシウムセンシング受容体（Calcium Sensing Receptor:CaSR
）とも呼ばれ、７回膜貫通型受容体（Ｇ蛋白質結合型受容体）のクラスＣに分類されるアミノ酸１０７８個からなる受容体である。このカルシウム受容体は、１９９３年に遺伝子のクローニングが報告され（非特許文献１）、カルシウム等で活性化されると細胞内カルシウム上昇等を介して様々な細胞応答を引き起こすことが知られている。ヒトカルシウム受容体の遺伝子配列はGenBank Accession No NM_000388として登録されており、動物間でよく保存されている。

上記カルシウム受容体は、生体内機能に促進的にはたらく場合もあれば、抑制的にはたらく場合もある。このため、現在、神経疾患、肝臓疾患、循環器疾患、消化器疾患、その他の疾患において、カルシウム受容体に対する活性化剤作用を利用した治療薬と抑制剤作用を利用した治療薬が病態に応じて使い分けられている。例えば、カルシウム受容体は、副甲状腺において血中カルシウム濃度の上昇を感知し、副甲状腺ホルモン（PTH）の分泌
を抑制し、血中カルシウム濃度を是正する働きを有する。従って、カルシウム受容体活性化剤は血中カルシウム濃度を低下させる効果が期待される。実際に、カルシウム受容体活性化剤を血液透析患者の続発性副甲状腺機能亢進症の治療に用いたとき、カルシウム濃度やリン濃度は上昇させずに副甲状腺ホルモン濃度を低下させることが明らかになっている。

カルシウム受容体の機能解析は、主としてカルシウムホメオスタシスに関して行われてきたため、今日までの応用研究もカルシウム調節が関わる骨代謝性疾患が中心であった。

しかし、遺伝子発現解析などの結果から、カルシウム受容体が副甲状腺や腎臓以外の生体内に広く分布していることが明らかになり（非特許文献２、３）、様々な生体機能、疾患病因に関わっている可能性が提起された。例えば、カルシウム受容体が、肝臓、心臓、肺、消化管、リンパ球、膵臓、の機能に関わることが推測されている。本発明者もラットの各組織から抽出したＲＮＡを材料とした、ＲＴ−ＰＣＲによる解析から、生体内において広範囲の組織に発現していることを確認した。上記観点から、現在、カルシウム受容体の活性化剤や阻害剤の応用価値が急速に高まっている。

また、カルシウム受容体活性化剤としてはカルシウムの他に、ガドリニウムなどのカチオン、ポリアルギニンなどの塩基性ペプチド、スペルミンなどのポリアミン、フェニルアラニンなどのアミノ酸、などが報告されている（非特許文献４）。

非特許文献５には、低分子ペプチドであるグルタチオン（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）がカルシウム受容体活性化剤であること（すなわち、活性化作用を有すること）が報告されているが、グルタチオンが下痢の治療に有効である可能性は示されていない。

これまでカルシウム受容体活性化剤として、上記の如く多くの特異的活性化剤が開発されているが、生体内に存在する化合物は少なく、また、生体内に存在する化合物である場合はその活性が極めて低かった。そのため、これらの活性化剤を含有してなる各種疾患に対する治療薬は、副作用、透過性及び活性の点で大きな問題があった。例えば、カルシウ
ム受容体にアミノ酸が作用することが知られているが、活性が極めて弱いので活性化剤として具体的な応用は困難と考えられていた。また、上述の如くポリアルギニンのような巨大分子が活性化剤として報告されているが、不定構造である多価カチオンとしての作用によるものと推測されている。すなわち、特定の構造を持ったペプチドがカルシウム受容体活性化剤として有用であることは知られていない。

一方、下痢とは、排便中の水分が増加し、泥状あるいは液状の便を排泄（はいせつ）する状態をいう。下痢は、腸粘膜の障害による水分の吸収阻害、腸の活発な蠕動運動（ぜんどううんどう）による腸内容物の迅速な通過、腸粘膜からの腸液分泌作用の活発化などにより発生する。

下痢は発生機序から浸透圧性下痢、分泌性下痢、滲出性下痢、腸管運動異常に伴う下痢、active transport異常による下痢、その他の６型に分類され、下痢の発症機序を類推することは、診断、治療方針を決定する上で重要である。

下痢治療の現状では、有害物質（化学物質、毒素、感染性細菌）が原因で下痢が生じた場合は有害物質を吸着する吸着剤（カオリン‐ペクチン）が使用される。また、消化管運動の亢進に基づく下痢治療には中枢あるいは末梢神経に作用して消化管運動を停止させる薬剤が用いられる。また、有害菌が進入し下痢が発症した場合には、抗生物質や抗菌剤を使用するが細菌の特定が必要である。

現在までに下痢の発症メカニズムに基づいて治療薬が開発されているが、消化管内の電解質バランスメカニズムに基づいた治療薬は現在までは報告されていない。消化管本来の生理機能に基づいた下痢治療薬は機能面、安全性面から有望な新規治療薬となり、安全な下痢治療薬を提供することが可能となる。

非特許文献６では、カルシウム受容体活性化剤が下痢治療薬となりうる可能性を述べているが、実際の下痢の予防又は治療効果の有無については示していない。また、安全性の点から、カルシウム受容体活性化剤が体内に吸収されないことが望ましいと述べているが、そのような化合物の構造を予測するには至っていない。

Nature, 1993, Vol.366(6455), p.575-580 J. Endocrinol., 2000, Vol.165(2), p.173-177 Eur. J. Pharmacol., 2002, Vol.447(2-3), p.271-278 Cell Calcium, 2004, Vol.35(3), p.209-216 J. Biol. Chem., 2006, Vol.281(13), p.8864-8870 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, Vol.103(25), p.9390-9397

本発明は、生体への安全性が高い下痢の予防又は治療剤を提供することを課題とする。

本発明者は、カルシウム受容体の活性化剤を探索した結果、ペプチドにカルシウム受容体を活性化する働きがあることを見出した。また、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物が下痢治療薬となりうることを見出した。これらの知見に基づいて本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）カルシウム受容体活性化作用を有する化合物を含む下痢の予防又は治療剤。
（２）前記化合物が、ペプチド、ペプチド誘導体、シナカルセットまたは下記式（１）もしくは（２）の構造を有する化合物から選択される、前記下痢の予防又は治療剤。

（３）前記ペプチドが、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｓｐ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ₂、γ−Ｇｌ
ｕ−Ｖａｌ−ｏｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ、γ−Ｇｌｕ−ｔ−Ｌｅｕおよびγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）、からなる群から選択される１種または２種以上である、前記下痢の予防又は治療剤。
（４）前記ＸがＣｙｓ（ＳＮＯ）、Ｃｙｓ（Ｓ−ａｌｌｙｌ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）、Ｃｙｓ、Ａｂｕ、ｔＬｅｕ、Ｃｌｅ、Ａｉｂ、ＰｅｎまたはＳｅｒであり、前記ＹがＧｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、Ａｓｎ、ＣｙｓまたはＧｌｎである、前記下痢の予防又は治療剤。
（５）前記ペプチドが、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙまたはγ-Ｇｌｕ−ｔＬｅｕ−Ｇｌ
ｙである、前記下痢の予防又は治療剤。
（６）前記ペプチド誘導体が、下記式（３）の構造を有するペプチド誘導体である、前記下痢の予防又は治療剤。
γ−Ｇｌｕ−Ｘ−ＯＣＨ（Ｚ）ＣＯ₂Ｈ ・・・（３）
（式中、Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表し、ＺはＨ又はＣＨ₃を表す。）
（７）下記式（３）の構造を有する化合物。
γ−Ｇｌｕ−Ｘ−ＯＣＨ（Ｚ）ＣＯ₂Ｈ ・・・（３）
（式中、Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表し、ＺはＨ又はＣＨ₃を表す。）
（８）前記式（３）において、ＸがｔＬｅｕまたはＡｂｕである、（７）記載の化合物。（９）γ−Ｇｌｕ−ｔＬｅｕ−Ｇｌｙで表される化合物。

カルシウム受容体に対するカルシウムの作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にヒトのカルシウム受容体cRNAをマイクロインジェクションした。任意の濃度の塩化カルシウム溶液を添加した時に、流れる細胞内応答電流値を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値（最大応答値）とした。コントロールとして、蒸留水をマイクロインジェクションした卵母細胞では応答しないことを確認した。 カルシウム受容体に対するＬ型アミノ酸の作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にヒトのカルシウム受容体cRNAをマイクロインジェクションした。１０ｍMのL型アミノ酸溶液を添加した時に、流れる細胞内応答電流値を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。コントロールとして、蒸留水をマイクロインジェクションした卵母細胞では応答しないことを確認した。 カルシウム受容体に対するＤ型アミノ酸の作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にヒトのカルシウム受容体cRNAをマイクロインジェクションした。１０ｍMのD型アミノ酸溶液を添加した時に、流れる細胞内応答電流値を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。コントロールとして、蒸留水をマイクロインジェクションした卵母細胞では応答しないことを確認した。 カルシウム受容体に対するペプチドの作用を示す図。アフリカツメガエル卵母細胞にヒトのカルシウム受容体cRNAをマイクロインジェクションした。任意の濃度のペプチド溶液を添加した時に、流れる細胞内応答電流値を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。コントロールとして、蒸留水をマイクロインジェクションした卵母細胞では応答しないことを確認した。 カルシウム受容体活性化作用を有するペプチドによる下痢治療効果を示す図。マウス５−HTP誘発排便モデルに対し、0.1, 1 %のカルシウム受容体活性作用を有するペプチドγEVGにより、便性状スコアは用量依存的に改善した。 大腸ループ法におけるγEVGの水分吸収に対する効果を示す図。 大腸ループ法におけるGSHおよびγ-Glu-t-Leu-Glyの水分吸収に対する効果を示す図。 大腸ループ法におけるシナカルセットの効果を示す図。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の下痢の予防又は治療剤は、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物を含む。

本明細書中において「カルシウム受容体」とは、カルシウムセンシング受容体もしくはCalcium Sensing Receptor（ＣａＳＲ）と呼ばれる、７回膜貫通型受容体のクラスＣに属するものを指す。本明細書中において「カルシウム受容体活性化剤」とは、上記カルシウム受容体に結合し、カルシウム受容体を活性化するものをいう。また、本明細書中において「カルシウム受容体を活性化する」とは、カルシウム受容体にリガンドが結合し、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を活性化して、シグナルを伝達することを意味する。また、カルシウム受容体がこのシグナルを伝達することを「カルシウム受容体活性」という。

＜１＞カルシウム受容体活性化作用を有する化合物
カルシウム受容体活性化作用を有する化合物は、ペプチドもしくはこれらの誘導体、又は各種低分子化合物を含む。あるいは、カルシウム受容体と被検物質とを反応させ、カルシウム受容体活性を検出することにより取得することもできる。このようにして得られるペプチドや低分子化合物について、下痢の予防又は治療効果を有することを確認することが好ましい。

以下に、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物をスクリーニングする方法を具体的に示すが、これらのステップに限定されるものではない。
１）カルシウム受容体活性を測定するためのカルシウム受容体活性測定系に被検物質を添加して、カルシウム受容体活性を測定する。
２）被験物質を添加したときのカルシウム受容体活性と、被験物質を添加しなかったときのカルシウム受容体活性を比較する。
３）被験物質を添加したときに高いカルシウム受容体刺激活性を示す被験物質を選択する。

カルシウム受容体活性の測定は、例えば、カルシウム受容体を発現する細胞を用いた測定系を用いて行われる。上記細胞はカルシウム受容体を内在的に発現している細胞であっても、外来のカルシウム受容体遺伝子が導入された組み換え細胞であってもよい。上記カルシウム受容体活性測定系は上記カルシウム受容体を発現する細胞に、カルシウム受容体に特異的な細胞外リガンド（活性化剤）を加えたときに、活性化剤とカルシウム受容体との結合（反応）を検出することができるか、又は、活性化剤とカルシウム受容体との結合（反応）に応答して細胞内に検出可能なシグナルを伝達するものであれば、特に制限なく使用することができる。被検物質との反応によりカルシウム受容体活性が検出された場合、当該被検物質はカルシウム受容体刺激活性を有し、下痢の予防又は治療効果を有する物質であることが判別される。

一方、下痢の予防又は治療効果は、例えば、実施例に記載した抗癌剤誘発性下痢モデル、又はマウス5-HTP誘発排便モデル等を利用した試験等により確認することができる。ま
た、被験物質として用いる化合物は特に制限はないが、ペプチドの場合、ペプチドとしては２〜１０のアミノ酸残基からなるペプチド又はその誘導体が好ましく、２又は３個のアミノ酸残基からなるペプチド又はその誘導体がより好ましい。また、ペプチドのＮ末端側のアミノ酸残基は、γ−グルタミン酸であることが好ましい。

上記カルシウム受容体は、その由来は特に制限されず、上記ヒトのカルシウム受容体のみならず、マウス、ラット、イヌなど含めた動物由来のカルシウム受容体が挙げられる。具体的には、上記カルシウム受容体としては、GenBank Accession No NM_000388で登録されているヒトカルシウム受容体遺伝子によってコードされるヒトカルシウム受容体が好ましく例示できる。尚、カルシウム受容体は、上記配列の遺伝子によってコードされるタンパク質に制限されず、カルシウム受容体機能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有する遺伝子によってコードされるタンパク質であってもよい。GPRC6A受容体や5.24受容体もまたカルシウム受容体のサブタイプとして知られており、本発明において利用可能である。なお、カルシウム受容体機能はこれらの遺伝子を細胞で発現させ、カルシウム添加時の電流の変化や細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定することによって調べることができる。

上述の如く、カルシウム受容体活性は、カルシウム受容体又はその断片を発現した生きた細胞、カルシウム受容体又はその断片を発現した細胞膜、カルシウム受容体又はその断片のタンパク質を含むインビトロの系などを利用して確認することが出来る。
以下に生きた細胞を用いた一例を示すが、この一例に限定されるものではない。

カルシウム受容体は、アフリカツメガエル卵母細胞やハムスター卵巣細胞やヒト胎児腎臓細胞等の培養細胞で発現させる。これは外来遺伝子を保持するプラスミドにカルシウム受容体遺伝子をクロ−ニングしたものを、プラスミドの状態もしくはそれを鋳型にしたｃＲＮＡを導入することで可能となる。反応の検出には電気生理学的手法や細胞内カルシウム上昇の蛍光指示試薬を用いることができる。

カルシウム受容体の発現は、初めにカルシウムもしくは特異的活性化剤による応答で確
認する。５ｍＭ程度の濃度のカルシウムに対して、細胞内電流が見られた卵母細胞もしくは蛍光指示試薬の蛍光が見られた培養細胞を使用する。カルシウムの濃度を変えて濃度依存性を測定する。次に、ペプチド等の被験物質を１μＭ〜１ｍＭ程度に調製し、卵母細胞もしくは培養細胞に添加することで、上記ペプチド等の被験物質のカルシウム受容体活性を測定する。

本発明に使用するカルシウム受容体活性化作用を有する化合物の具体例としては、各種ペプチドもしくはこれらの誘導体、又は各種低分子化合物が挙げられる（以下、単に「ペプチド」というときは、ペプチドおよびペプチド誘導体のいずれをも含有する意味に用いられる場合もある）。ペプチドとしては、例えば、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｓｐ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ₂、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ｏｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕ
、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ、γ−Ｇｌｕ−ｔ−Ｌｅｕおよびγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（以下、下記のペプチド誘導体と合わせて、本発明のペプチドともいう）などが挙げられる。

また、ペプチドは、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−ＯＣＨ（Ｚ）ＣＯ₂Ｈの構造を有するペプチド誘
導体であってもよい。ここで、式中Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表し、ＺはＨ（水素原子）又はＣＨ₃（メチル基）を表す。具体例としては、γ-Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＧｌｙＡ、γ-Ｇｌｕ−ｔＬｅｕ−ＧｌｙＡ、γ-Ｇｌｕ−Ａｂｕ−ＧｌｙＡ、γ-Ｇｌｕ−Ｖａｌ
−ＬａｃＡ、γ-Ｇｌｕ−ｔＬｅｕ−ＬａｃＡ、及びγ-Ｇｌｕ−Ａｂｕ−ＬａｃＡ等が好適に挙げられる。なお、ＧｌｙＡとは、グリコール酸を表し、ＬａｃＡとは、酪酸を表す。酪酸はＳ体とＲ体のいずれでも良いが、好ましくはＳ体である。これらの化合物の構造式を以下に記す。

前記化合物γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）のうち、好ましい化合物は、前記ＸがＣｙｓ（ＳＮＯ）、Ｃｙｓ（Ｓ−ａｌｌｙｌ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）、Ｃｙｓ、Ａｂｕ、ｔ−Ｌｅｕ、Ｃｌｅ、Ａｉｂ、ＰｅｎまたはＳｅｒであり、前記ＹがＧｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、ＧｌｙＡまたはＬａｃＡである化合物である。これらのうち、特に好ましい化合物は、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、及びγ-Ｇｌｕ−ｔＬｅｕ−Ｇｌｙである。

尚、本明細書中において各ペプチドを構成するアミノ酸は、特に断わらない限りいずれもＬ−体である。ここで、アミノ酸とは、Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Asn, Gln, Pro, Hypなどの中性アミノ酸、Asp, Gluなどの酸性アミノ酸、Lys, Arg, Hisなどの塩基性アミノ酸、Phe, Tyr, Trpなどの芳香族アミノ酸や、ホモセリン、シトル
リン、オルニチン、α-アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、タウリンなども含有す
る。また、各ペプチドを構成するアミノ酸は、tert−ロイシン、シクロロイシン、α−アミノイソブチル酸、Ｌ−ペニシラミンなどの非天然（非タンパク質構成）アミノ酸であっても良い。尚、ペプチドγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙにおいて、Ｘは上記のようなアミノ酸又はその誘導体のいずれでもよいが、Cys以外のアミノ酸又はその誘導体が好ましい。

本明細書においてアミノ基残基の略号は以下のアミノ酸を意味する。
（１）Ｇｌｙ：グリシン
（２）Ａｌａ：アラニン
（３）Ｖａｌ：バリン
（４）Ｌｅｕ：ロイシン
（５）Ｉｌｅ：イソロイシン
（６）Ｍｅｔ：メチオニン
（７）Ｐｈｅ：フェニルアラニン
（８）Ｔｙｒ：チロシン
（９）Ｔｒｐ：トリプトファン
（１０）Ｈｉｓ：ヒスチジン
（１１）Ｌｙｓ：リジン
（１２）Ａｒｇ：アルギニン
（１３）Ｓｅｒ：セリン
（１４）Ｔｈｒ：トレオニン
（１５）Ａｓｐ：アスパラギン酸
（１６）Ｇｌｕ：グルタミン酸
（１７）Ａｓｎ：アスパラギン
（１８）Ｇｌｎ：グルタミン
（１９）Ｃｙｓ：システイン
（２０）Ｐｒｏ：プロリン
（２１）Ｏｒｎ：オルニチン
（２２）Ｓａｒ：サルコシン
（２３）Ｃｉｔ：シトルリン
（２４）Ｎ−Ｖａｌ：ノルバリン
（２５）Ｎ−Ｌｅｕ：ノルロイシン
（２６）Ａｂｕ：α−アミノ酪酸
（２７）Ｔａｕ：タウリン
（２８）Ｈｙｐ：ヒドロキシプロリン
（２９）ｔ−Ｌｅｕ：ｔｅｒｔ−ロイシン
（３０）Ｃｌｅ：シクロロイシン
（３１）Ａｉｂ：α−アミノイソブチル酸（α-aminoisobutyric acid、2−メチルアラニン）
（３２）Ｐｅｎ：Ｌ−ペニシラミン（penicillamine）

また、アミノ酸誘導体とは、上記アミノ酸の各種誘導体であって、例えば、特殊アミノ酸や非天然アミノ酸、アミノアルコール、或いは末端カルボニル基やアミノ基、システインのチオール基などのアミノ酸側鎖が各種置換基により置換したものが挙げられる。置換基としては、アルキル基、アシル基、水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基、ニトロ基、スルフォニル基や各種保護基などが挙げられ、例えば、Ａｒｇ（ＮＯ₂）：Ｎ−γ−ニト
ロアルギニン、Ｃｙｓ（ＳＮＯ）：Ｓ−ニトロシステイン、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）：Ｓ−メチルシステイン、Ｃｙｓ（Ｓ−ａｌｌｙｌ）：Ｓ−アリルシステイン、Ｖａｌ−ＮＨ₂：
バリンアミド、Ｖａｌ−ｏｌ：バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）などが含まれる。

尚、上記γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（ＳＮＯ）−Ｇｌｙは下記の構造式を有するものであり、上記γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）およびγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）式中の（Ｏ）はスルフォキシド構造であることを意味する。

γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｓｐ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ₂、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ｏｌ、γ
−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ、γ−Ｇｌｕ−ｔ−Ｌｅｕおよびγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）がカルシウム受容体を活性化することが本発明者らによって示された。したがって、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｓｐ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ₂、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
ｏｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ、γ−Ｇｌｕ−ｔ−Ｌｅｕおよびγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）は下痢治療薬として用いることができる。本発明において、本発明に用いられるペプチドは単独で用いてもよく、また任意の２種又は３種以上を混合して用いることもできる。

上記ペプチドは、市販品を用いることが可能である。また、ペプチドは、（１）化学的に合成する方法、又は（２）酵素的な反応により合成する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。本発明において用いられるペプチドは、含まれるアミノ酸の残基数が２〜３残基と比較的短いので、化学的に合成する方法が簡便である。化学的に合成する場合は、該オリゴペプチドをペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。化学的に合成する方法としては、例えばペプチド固相合成法が挙げられる。そのようにして合成したペプチドは通常の手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製することができる。このようなペプチド固相合成法、およびそれに続
くペプチド精製はこの技術分野においてよく知られたものである。

また、本発明において用いられるペプチドを、酵素的な反応により生産することも出来る。例えば、国際公開パンフレットWO2004/011653号に記載の方法を用いることが出来る
。即ち、一方のアミノ酸又はジペプチドのカルボキシル末端をエステル化又はアミド化したアミノ酸又はジペプチドと、アミノ基がフリーの状態であるアミノ酸（例えばカルボキシル基が保護されたアミノ酸）とを、ペプチド生成酵素の存在下において反応せしめ、生成したジペプチド又はトリペプチドを精製することによっても生産することもできる。ペプチド生成酵素としては、ペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、又は、該微生物の菌体処理物、又は、該微生物に由来するペプチド生成酵素が挙げられる。

本発明において用いられる低分子化合物としてはシナカルセット（(R)-N-(3-(3-(トリ
フルオロメチル)フェニル)プロピル)-1-(1-ナフチル)エチルアミン）及びその類縁化合物が挙げられる。シナカルセットの類縁化合物としては、前記化学式（１）で示される化合物（(R)-N-[(４-エトキシ-３-メチルフェニル)メチル]-1-(1-ナフチル)エチルアミン））または前記化学式（２）で示される化合物（(R)-N-(3-フェニルプロプ-2-エニル)-1-(3-
メトキシフェニル)エチルアミン）等が挙げられる。これらの化合物は、例えば、米国特
許第6211244号公報に記載されるような公知の方法により合成することができる。また、
市販品を用いることもできる。

本発明において用いられる化合物は塩の形態をも包含する。本発明のペプチドが塩の形態を成し得る場合、その塩は薬理学的に許容されるものであればよく、例えば、式中のカルボキシル基等の酸性基に対しては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロへキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩を挙げることができる。式中に塩基性基が存在する場合の塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸などの無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。

＜２＞下痢の予防又は治療剤
カルシウム受容体活性化作用を有する化合物は、下痢の予防又は治療剤の有効成分として使用することができる。本発明の下痢の予防又は治療剤の形態としては、医薬、医薬部外品、食品等が挙げられる。

本発明の下痢の予防又は治療剤の適用方法としては、特に制限されず、経口投与あるいは注射等を利用した浸襲的投与あるいは座薬投与あるいは経皮投与を採用することが出来る。有効成分を経口、注射などの投与方法に適した固体または液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することが出来る。このような製剤としては例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤の形態、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤の形態、凍結乾燥剤などの形態が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。

上記医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ゼラチン
、アルブミン、アミノ酸、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。

本発明の下痢の予防又は治療剤に用いるカルシウム受容体活性化作用を有する化合物は、本発明のペプチド又は低分子化合物が好ましいが、既知のカルシウム受容体活性化作用を有する化合物であってもよい。また、本発明の下痢の予防又は治療剤は、本発明のペプチド及び／又は低分子化合物に加えて、更に、既知のカルシウム受容体活性化剤を１種または２種以上含むものであってもよい。
上記既知のカルシウム受容体活性化剤としては、カルシウム及びカドリニウムなどのカチオン、ポリアルギニン、ポリリジンなどの塩基性ペプチド、プトレッシン、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミン、プロタミンなどのタンパク質、フェニルアラニンなどのアミノ酸、グルタチオンなどのペプチド、シナカルセットの類縁化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、上記既知のカルシウム受容体活性化剤は単独で加えてもよく、また任意の２種又は３種以上を混合して加えることも可能である。上記既知のカルシウム受容体活性化剤のうち、カルシウム及びガドリニウムなどのカチオンが好ましく、カルシウムがより好ましい。すなわち、更に加えられる既知のカルシウム受容体活性化剤の少なくとも１種はカチオンであることが好ましい。

本発明のペプチド又は低分子化合物に加えて、上記既知のカルシウム受容体活性化剤が共存することによって、カルシウム受容体のより強い活性化が見られる。カルシウム受容体活性化剤として本発明のペプチドを用いる場合は、本発明のペプチドの合計と既知のカルシウム受容体活性化剤の合計の割合は、カルシウム受容体のより強い活性化が可能である限り特に制限されないが、例えば、既知のカルシウム受容体活性化剤の合計と、本発明のペプチドの合計の質量比が、１：100〜100：1とすることが好ましい。

本発明の下痢の予防又は治療剤の投与又は摂取量は、治療や予防に有効な量であればよく、患者の年齢、性別、体重、症状などに応じて適宜調節されるが、例えば、経口投与の場合、本発明に用いられるペプチドの合計量として、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、0.01g〜10gが好ましく、１ｋｇ体重あたり、0.1g〜1gがより好ましい。投与回数は特に制限されず、１日あたり１回〜数回投与することができる。

本発明の下痢の予防又は治療剤中のカルシウム受容体活性化作用を有する化合物の含有量は、上記投与量に適したものであれば特に制限されず、好ましくは乾燥重量当り0.000001質量％〜99.9999質量％、より好ましくは0.00001質量％〜99.999質量％、特に好ましくは0.0001質量％〜99.99質量％である。

本発明の下痢の予防又は治療剤はまた、下痢の治療や予防に効果を有する飲食品として用いることもできる。例えば、容器や包装に下痢に対する治療効果や予防効果がある旨を表示した飲食品とすることができる。飲食品の形態としては特に制限されず、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物を配合すること以外は、通常の食品と同様の材料を用いて、同様の製法で製造することができる。食品としては、例えば、調味料；ジュース、牛乳等の飲料；菓子；ゼリー；健康食品；農産物加工品；水産物加工品；牛乳等の畜産物加工品；食品補助剤等が挙げられる。また、本発明の下痢とは、過敏性腸症候群、機能性下痢、炎症性腸疾患、鼓室炎、細菌性下痢、消化不良などを含む。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕カルシウム受容体遺伝子（ｃＲＮＡ）の調製
カルシウム受容体の遺伝子の調製は以下のように行った。ＮＣＢＩに登録されたＤＮＡ配列（カルシウム受容体：NM_000388）を元に、ＰＣＲに使う合成オリゴＤＮＡ（フォワ
ードプライマー（配列番号１）、及びリバースプライマー（配列番号２））を合成した。

ヒト腎臓由来のｃＤＮＡ（Clontech社製）を材料として、前記プライマー、及びPfu ultra DNA Polymerase（Stratagene社製）を用い、以下の条件でＰＣＲを実施した。９４℃で３分の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分を３５回繰り返した後、７２℃で７分反応させた。ＰＣＲによって増幅がなされたか否かをアガロ−ス電気泳動を行い、ＤＮＡ染色試薬で染色した後、紫外線照射によって検出した。同時に電気泳動したサイズ既知のＤＮＡマ−カ−と比較することで、ＰＣＲ産物の鎖長を確認した。プラスミドベクタ−ｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＶ（Takara社製）によって切断した。その切断部位にＰＣＲによって増幅された遺伝子断片をLigation Kit（Promega社製）を用いて連
結した。この反応溶液でエシェリヒア・コリＤＨ５α株を形質転換し、ＰＣＲ増幅産物がクロ−ニングされたプラスミドを保持する形質転換体を選抜した。ＰＣＲ増幅産物をＤＮＡ塩基配列解析によって確認した。この組換えプラスミドを鋳型とし、ｃＲＮＡ作製キット（Ambion社）を用いてカルシウム受容体遺伝子のｃＲＮＡを作製した。

〔実施例２〕各種試料の調製
Ｌ型アミノ酸試料として、各々特級グレードのアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン（上記、味の素株式会社）、ヒドロキシプロリン（ナカライテスク株式会社）の２３種類を用いた。Ｄ−ＣｙｓおよびＤ−Ｔｒｐ（ナカライテスク株式会社）及び塩化カルシウムは特級グレードのものを用いた。

また、ペプチド試料として、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（ＳＮＯ）−Ｇｌｙ（株式会社同仁化学研究所）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ）、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉ
ｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ）、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ（Ａｂｕ：α−アミノ
酪酸、Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ）、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（国産化学株式会社）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（国産化学株式会社）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ（国産化学株式会社）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ（受託合成品）、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（受託合成品）、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ（受託合成品）、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（受託合成品）、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（受託合成品）、Ｌｅｕ−Ａｓｐ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｏｒｎ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（受託合成品）γ−Ｇｌｕ−Ｐｅｎ−Ｇｌｙ（受託合成品）を用いた。グルタミン、システインは用事調製し、他の試料は調製後、−２０℃に保存した。ペプチドは純度９０％以上のものを用いた。γ−Ｇｌｕ−
Ｃｙｓのみ純度８０％以上のものを用いた。

各試料を溶解した後、ｐＨが酸性、アルカリ性のものについては、ＮａＯＨ、ＨＣｌを用いて中性前後に調整した。アミノ酸、ペプチドの溶解液、アフリカツメガエル卵母細胞の調製用の溶液、卵母細胞の培養用の溶液は、以下の組成のものを使用した。９６ｍＭ
ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１．８ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２。

〔実施例３〕γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの合成
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（８．６９ ｇ， ４０．０ ｍｍｏｌ）とＧｌｙ−ＯＢｚｌ・Ｈ
Ｃｌ（８．０７ ｇ， ４０．０ ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１００ ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（６．１３ ｍｌ， ４４．０ ｍｍｏｌ）、ＨＯＢ
ｔ（１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ， ６．７４ ｇ， ４４．０ ｍｍｏｌ）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， ８．４４ ｇ， ４４．０ ｍｍｏｌ）を溶液に加え、室温で一夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢
酸エチル（２００ ｍｌ）に溶解した。溶液を水（５０ ｍｌ）、５％クエン酸水溶液（５０ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（５０ ｍｌ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０
ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（５０ ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム
で乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンから再結晶してＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（１３．２ ｇ， ３６．２ ｍｍｏｌ）を白色結晶として得た。

Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（５．４７ ｇ， １５．０ ｍｍｏｌ）を４Ｎ−Ｈ
Ｃｌ／ジオキサン溶液（４０ ｍｌ）に加え、室温で５０分撹拌した。ジオキサンを減圧
濃縮で除き、残渣にｎ−ヘキサン（３０ ｍｌ）を加え減圧濃縮した。この操作を３回繰
り返し、Ｈ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌを定量的に得た。
上記Ｈ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌ及びＺ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ（５．５７ ｇ， １５．０ ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５０ ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（２．３０ ｍｌ， １６．５ ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１−Ｈｙｄｒｏｘｙ
ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ， ２．５３ ｇ， １６．５ ｍｍｏｌ）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， ３．１６ ｇ， １６．５ ｍｍｏｌ）を溶
液に加え、室温で二夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を加熱した酢酸エチル（１５００ ｍｌ）に溶解した。溶液を水（２００ ｍｌ）、５％クエン酸水溶液（２００ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（１５０ ｍｌ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（２００ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（１５０ ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。析出した結晶を濾取、減圧乾燥してＺ−Ｇｌｕ（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ）−ＯＢｚｌ（６．５１ ｇ，１０．
５ ｍｍｏｌ）を白色結晶として得た。

上記Ｚ−Ｇｌｕ（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ）−ＯＢｚｌ（６．２０ ｇ， １０．０３
ｍｍｏｌ）をエタノール（２００ ｍｌ）に懸濁し、１０％パラジウム炭素（１．５０
ｇ）を加え、水素雰囲気下に５５℃で５時間還元反応を行った。この間、全量で１００
ｍｌの水を徐々に加えた。触媒を桐山ロート（桐山製作所）で濾過して除き、濾液を半分に減圧濃縮した。反応液を更にメンブランフィルターで濾過し、濾液を減圧濃縮した。残渣を少量の水に溶かした後にエタノールを加えて結晶を析出させ、結晶を濾過して集め減圧乾燥してγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの白色粉末（２．８５ ｇ， ９．４０ ｍｍｏｌ
）を得た。

ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝３０４．１．
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ₂Ｏ）δ（ｐｐｍ）：０．８７ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．８ Ｈｚ）， ０．８８ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．８ Ｈｚ）， １．９９−２．０９ （３Ｈ， ｍ）， ２．３８−２．５１ （２Ｈ， ｍ）， ３．７２ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝６．３５
Ｈｚ）， ３．８６ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１７．８ Ｈｚ）， ３．８０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１７．８ Ｈｚ）， ４．０７ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．８ Ｈｚ）．

〔実施例４〕γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）−Ｇｌｙの合成［Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）：Ｓ−メチルシステイン］
還元型グルタチオン（１５．０ ｇ， ４８．８ ｍｍｏｌ）を水（４５ ｍｌ）に加え、窒素を吹き込みながら水酸化ナトリウム（４．５２ ｇ， ２．２当量， １０７ ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。ヨウ化メチル（４．５６ ｍｌ， １．５当量， ７３ ｍｍｏｌ）を加え、密栓して室温で２時間撹拌した。濃塩酸で反応液のｐＨを２〜３に調整し、エタノール（１５０ ｍｌ）を加え冷蔵庫に一夜保存した。油状物が分離したので、上澄みを除
いた。残った油状物を水に溶かしエタノールを徐々に加えると、一部結晶を伴う油状物が析出したので再度上澄みを除いた。残渣を水（３００ ｍｌ）に溶解し、イオン交換樹脂
（Ｄｏｗｅｘ １−ａｃｅｔａｔｅ， ４００ ｍｌ）を充填したカラムに吸着させ、水洗
した後に１Ｎ−酢酸水溶液で溶出した。溶出液を減圧濃縮し、水−エタノールから再沈殿させ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）−Ｇｌｙの白色粉末（５．０８ ｇ， １５．８
ｍｍｏｌ）を得た。

ＦＡＢ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝３２２．
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ₂Ｏ）δ（ｐｐｍ）：２．１４ （３Ｈ， ｓ）， ２．１５−２．２２ （２Ｈ， ｍ）， ２．５０−２．５８ （２Ｈ， ｍ）， ２．８６ （１Ｈ
， ｄｄ， Ｊ＝９．０ Ｈｚ， Ｊ＝１４．０ Ｈｚ）， ３．０３ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝
５．０ Ｈｚ， Ｊ＝１４．０ Ｈｚ）， ３．８４ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝６．５ Ｈｚ），
３．９９ （２Ｈ， ｓ）， ４．５９ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝５．０ Ｈｚ， Ｊ＝９．０
Ｈｚ）．

〔実施例５〕その他ペプチドの合成
γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ₂、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ｏｌ
、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−ｔ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−ａｌｌｙｌ）−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｌｅ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ａｉｂ−Ｇｌｙは実施例３および実施例４に準じて合成した。

〔実施例６〕γ-Ｇｌｕ−ｔＬｅｕ−Ｇｌｙの合成
Ｂｏｃ−ｔＬｅｕ−ＯＨ（９．２６ ｇ， ４０．０ ｍｍｏｌ）とＧｌｙ−ＯＢｚｌ・
ＨＣｌ（８．０６ ｇ， ４０．０ ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（６０ ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（５．６０ ｍｌ， ４０．０ ｍｍｏｌ）、ＨＯＢ
ｔ（１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ， ６．７５ ｇ， ４４．０ ｍｍｏｌ）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， ８．４７ ｇ， ４４．０ ｍｍｏｌ）を溶液に加え、室温で一夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢
酸エチル（２００ ｍｌ）に溶解した。溶液を水（５０ ｍｌ）、５％クエン酸水溶液（５０ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（５０ ｍｌ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０
ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（５０ ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム
で乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンから再結晶してＢｏｃ−ｔＬｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（１５．２０ ｇ， ４０．１ ｍｍｏｌ）を粘性の油状物として得た。

Ｂｏｃ−ｔＬｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（１５．２０ ｇ， ４０．１ ｍｍｏｌ）に４Ｎ
−ＨＣｌ／ジオキサン溶液（２００ ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。ジオキサン
を減圧濃縮で除き、残渣にｎ−ヘキサン（３０ ｍｌ）を加え減圧濃縮した。この操作を
３回繰り返し、Ｈ−ｔＬｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌを定量的に得た。

上記Ｈ−ｔＬｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌ及びＺ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ（１４．９３
ｇ， ４０．２ ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（８０ ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（５．６０ ｍｌ， ４０．２ ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６．７９ ｇ，
４４．２ ｍｍｏｌ）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（８．４８ ｇ， ４４．２ ｍｍｏｌ）を溶液
に加え、室温で二夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を加熱した酢酸エチル（３００
ｍｌ）に溶解した。溶液を水（１００ ｍｌ）、５％クエン酸水溶液（１００ ｍｌ ｘ
２回）、飽和食塩水（１００ ｍｌ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（１００ ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥
し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製してＺ−Ｇｌｕ（ｔＬｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ）−ＯＢｚｌ（１６．１０ ｇ，２５．５ ｍｍｏｌ）を粘性の油状物として得た。

上記Ｚ−Ｇｌｕ（ｔＬｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ）−ＯＢｚｌ（１６．１０ ｇ， ２５．５ ｍｍｏｌ）をエタノール（３００ ｍｌ）に懸濁し、１０％パラジウム炭素（２．００
ｇ）を加え、水素雰囲気下に室温で５時間還元反応を行った。この間、全量で１００ ｍｌの水を徐々に加えた。触媒を桐山ロート（桐山製作所）で濾過して除き、濾液を半分に減圧濃縮した。反応液を更にメンブランフィルターで濾過し、濾液を減圧濃縮した。残渣を少量の水に溶かした後にエタノールを加えて結晶を析出させ、結晶を濾過して集め凍結乾燥してγ−Ｇｌｕ−ｔＬｅｕ−Ｇｌｙの白色粉末（６．７０ ｇ， ２１．１ ｍｍｏｌ
）を得た。

ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝３１８．１０．
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ₂Ｏ）δ（ｐｐｍ）：０．９５ （９Ｈ， ｓ）， ２．０４−２．０８ （２Ｈ， ｍ）， ２．４５−２．４８ （２Ｈ， ｍ）， ３．７３ （１Ｈ
， ｔ）， ３．８７−３．９０ （２Ｈ， ｍ）， ４．０７ （１Ｈ， ｓ）．

〔実施例７〕γ-Ｇｌｕ−Ａｂｕ−ＧｌｙＡの合成
Ｂｏｃ−Ａｂｕ−ＯＨ（６．１０ ｇ， ３０．０ ｍｍｏｌ）とＢｅｎｚｙｌ Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ（Ｈ−ＧｌｙＡ−ＯＢｚｌ，４．３９ ｇ， ３０．０ ｍｍｏｌ）を塩化メチ
レン（４０ ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に保った。ＤＭＡＰ（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａ
ｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，１．１０ｇ， ９．０ ｍｍｏｌ）とＷＳＣ・ＨＣｌ（６．３３ ｇ， ３３．０ ｍｍｏｌ）を溶液に加え、室温で一夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し
、残渣を酢酸エチル（１５０ ｍｌ）に溶解した。溶液を水（５０ ｍｌ）、５％クエン酸水溶液（５０ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（５０ ｍｌ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（５０ ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮してＢｏｃ−Ａｂｕ−ＧｌｙＡ−ＯＢｚｌ（９．４７ ｇ， ２８．１ ｍｍｏｌ）を粘性の油状物として得
た。

上記残渣に４Ｎ−ＨＣｌ／ジオキサン溶液（１４１ ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌
した。ジオキサンを減圧濃縮で除き、残渣にｎ−ヘキサン（３０ ｍｌ）を加え減圧濃縮
した。この操作を３回繰り返し、Ｈ−Ａｂｕ−ＧｌｙＡ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌを定量的に得た。
上記Ｈ−Ａｂｕ−ＧｌｙＡ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌ及びＺ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ（１０．４７
ｇ， ２８．１ ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１００ ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（４．３０ ｍｌ， ３０．９ ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（４．７４ ｇ， ３０．９ ｍｍｏｌ）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（５．９５ ｇ， ３０．９ ｍｍｏｌ）を溶
液に加え、室温で二夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を加熱した酢酸エチル（２００ ｍｌ）に溶解した。溶液を水（５０ ｍｌ）、５％クエン酸水溶液（１５０ ｍｌ ｘ
２回）、飽和食塩水（５０ ｍｌ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（５０ ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫
酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製してＺ−Ｇｌｕ（Ａｂｕ−ＧｌｙＡ−ＯＢｚｌ）−ＯＢｚｌ（１１．２０ ｇ
，１９．０ ｍｍｏｌ）を粘性の油状物として得た。

上記Ｚ−Ｇｌｕ（Ａｂｕ−ＧｌｙＡ−ＯＢｚｌ）−ＯＢｚｌ（１１．２０ ｇ， １９．０ ｍｍｏｌ）をエタノール（１５０ ｍｌ）に懸濁し、１０％パラジウム炭素（２．００
ｇ）を加え、水素雰囲気下に室温で５時間還元反応を行った。この間、全量で５０ ｍｌの水を徐々に加えた。触媒を桐山ロート（桐山製作所）で濾過して除き、濾液を半分に減圧濃縮した。反応液を更にメンブランフィルターで濾過し、濾液を減圧濃縮した。残渣を水に溶かして凍結乾燥し、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−ＧｌｙＡの白色粉末（５．００ ｇ， １７．２ ｍｍｏｌ）を得た。

ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝２９１．１０．
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ₂Ｏ）δ（ｐｐｍ）：０．８６ （３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．４０ Ｈｚ）， １．６０−１．７４ （１Ｈ， ｍ）， １．８２−１．８８ （１Ｈ， ｍ
）， ２．０４−２．１２ （２Ｈ， ｍ）， ２．４５ （２Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．４０ Ｈｚ）， ３．７９ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝６．３６ Ｈｚ）， ４．３１−４．４５ （１Ｈ， ｍ）， ４．５７ （２Ｈ， ｓ）．

〔実施例８〕γ-Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＧｌｙＡの合成
Ｂｏｃ−Ａｂｕ−ＯＨの代わりにＢｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨを用いる以外は、実施例７と同様にしてγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＧｌｙＡを白色粉末として７７．５％の収率で得た。

ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ−Ｈ）―＝３０３．２０．
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ₂Ｏ）δ（ｐｐｍ）：０．９０ （６Ｈ， ｔ， Ｊ＝６．５２ Ｈｚ）， ２．０５−２．１５ （２Ｈ， ｍ）， ２．１５−２．２５ （１Ｈ， ｍ
）， ２．４５−２．５０ （２Ｈ， ｍ）， ３．８０ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝６．５２ Ｈｚ）， ４．３６ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝５．６４ Ｈｚ）， ４．６１（２Ｈ， ｓ）．

〔実施例９〕γ-Ｇｌｕ−ｔＬｅｕ−ＧｌｙＡの合成
Ｂｏｃ−Ａｂｕ−ＯＨの代わりにＢｏｃ−ｔＬｅｕ−ＯＨを用いる以外は、実施例７と同様にしてγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＧｌｙＡを白色粉末として７３．４％の収率で得た。

ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝３１９．２０．
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ₂Ｏ）δ（ｐｐｍ）：０．９４ （９Ｈ， ｓ）， ２．０３−２．１０ （２Ｈ， ｍ）， ２．４５−２．５０ （２Ｈ， ｍ）， ３．７８ （１Ｈ
， ｔ）， ４．２６ （１Ｈ， ｓ）， ４．６０ （２Ｈ， ｓ）．

〔実施例１０〕γ-Ｇｌｕ−Ａｂｕ−ＬａｃＡの合成
Ｂｅｎｚｙｌ Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ（Ｈ−ＧｌｙＡ−ＯＢｚｌ）の代わりにＢｅｎｚｙ
ｌ （Ｓ）−Ｌａｃｔａｔｅ（Ｈ−ＬａｃＡ−ＯＢｚｌ）を用いる以外は、実施例７と同
様にしてγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−ＬａｃＡを白色粉末として９９．０％の収率で得た。

ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝３０５．１０．
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ₂Ｏ）δ（ｐｐｍ）：０．９１ （３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．４０ Ｈｚ）， １．４０ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝７．０８ Ｈｚ）， １．６０−１．７５ （１Ｈ， ｍ）， １．８０−１．９０ （１Ｈ， ｍ）， ２．００−２．１２ （２Ｈ， ｍ
）， ２．４０−２．４５ （２Ｈ， ｍ）， ３．７４−３．７８ （１Ｈ， ｍ）， ４．
２５−４．２９ （１Ｈ， ｍ）， ４．８９−４．９５ （１Ｈ， ｍ）．

〔実施例１１〕γ-Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＬａｃＡの合成
Ｂｏｃ−Ａｂｕ−ＯＨの代わりにＢｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨを、Ｂｅｎｚｙｌ Ｇｌｙｃｏ
ｌａｔｅ（Ｈ−ＧｌｙＡ−ＯＢｚｌ）の代わりにＢｅｎｚｙｌ （Ｓ）−Ｌａｃｔａｔｅ
（Ｈ−ＬａｃＡ−ＯＢｚｌ）を用いる以外は、実施例７と同様にしてγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＬａｃＡを白色粉末として７８．０％の収率で得た。

ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝３１９．２０．
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ₂Ｏ）δ（ｐｐｍ）：０．８５−０．９２ （６Ｈ， ｍ
）， １．４２ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝７．０８ Ｈｚ）， ２．０２−２．１１ （３Ｈ， ｍ）， ２．１８−２．２５ （１Ｈ， ｍ）， ２．４２−２．５０ （２Ｈ， ｍ）， ３．
７８ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝６．３６ Ｈｚ）， ４．２０−４．３１ （１Ｈ， ｍ）， ４．９１−４．９７ （１Ｈ， ｍ）．

〔実施例１２〕γ-Ｇｌｕ−ｔＬｅｕ−ＬａｃＡの合成
Ｂｏｃ−Ａｂｕ−ＯＨの代わりにＢｏｃ−ｔＬｅｕ−ＯＨを、Ｂｅｎｚｙｌ Ｇｌｙｃ
ｏｌａｔｅ（Ｈ−ＧｌｙＡ−ＯＢｚｌ）の代わりにＢｅｎｚｙｌ （Ｓ）−Ｌａｃｔａｔ
ｅ（Ｈ−ＬａｃＡ−ＯＢｚｌ）を用いる以外は、実施例７と同様にしてγ−Ｇｌｕ−ｔＬｅｕ−ＬａｃＡを白色粉末として５５．０％の収率で得た。

ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝３３３．２０．
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ₂Ｏ）δ（ｐｐｍ）：０．９６ （９Ｈ， ｓ）， １．４２ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝７．０８ Ｈｚ）， ２．０５−２．１０ （２Ｈ， ｍ）， ２．４０−２．５０ （２Ｈ， ｍ）， ３．７３−３．７８ （１Ｈ， ｍ）， ４．１９ （１Ｈ
， ｓ）， ４．９０−５．００ （１Ｈ， ｍ）．

〔実施例１３〕カルシウム受容体の活性化作用の評価
カルシウム受容体の活性化作用の評価には、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いたＣａ濃度イオン依存性Ｃｌイオン電流測定法を用いた。カルシウム受容体を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞に、各活性化剤を添加すると、細胞内のＣａイオンが増加する。次にＣａ濃度イオン依存性Ｃｌチャネルが開き、イオン電流として細胞内電流値が変化する。この細胞内電流値の変化を測定することで、カルシウム受容体の活性化作用の有無を知り得ることができる。

具体的には、アフリカツメガエル腹部を切開し、卵塊を取り出した後、１％コラゲナ−ゼ溶液により２０℃で２時間処理することで個々の卵母細胞を得た。１個あたりの卵母細胞に、マイクロガラスキャピラリ−を用いて５０ｎｌの１μｇ／μｌ受容体ｃＲＮＡもしくは５０ｎｌの滅菌水を導入し、１８℃で２〜３日培養した。培養時には、実施例２で示した溶液に２ｍＭピルビン酸と１０Ｕ／ｍｌペニシリンと１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたものを使用した。培養後、ｃＲＮＡを注入した卵母細胞もしくは滅菌水を注入した卵母細胞に対し、試験溶液を添加した。電気生理学的測定は、増幅器Ｇｅｎｅｃｌａｍｐ５００（Ａｘｏｎ社製）および記録用ソフトＡｘｏＳｃｏｐｅ９．０（Ａｘｏｎ社製）を用いて行った。卵母細胞を２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌイオンを介した細胞内電流を測定した。細胞内電流の最大値を
応答電流値とした。

〔実施例１４〕カルシウム受容体に対するカルシウムの活性化作用の評価
実施例１３に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するカルシウムの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のｃＲＮＡもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、カルシウム（２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。結果は図１に示した。この結果より、卵母細胞に注入したカルシウム受容体のｃＲＮＡが機能的に発現していることが確認された。また、水を注入した卵母細胞は、高い濃度のカルシウムにも反応していないことから、卵母細胞自身にはカルシウム受容体が発現していないことが確認された。

〔実施例１５〕カルシウム受容体に対するＬ型アミノ酸の活性化作用の評価
実施例１３に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するＬ型アミノ酸の活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のｃＲＮＡもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、アラニン（１０ｍＭ）、アルギニン（１０ｍＭ）、アスパラギン（１０ｍＭ）、アスパラギン酸（１０ｍＭ）、システイン（１０ｍＭ）、グルタミン（１０ｍＭ）、グルタミン酸（１０ｍＭ）、グリシン（１０ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ）、イソロイシン（１０ｍＭ）、ロイシン（１０ｍＭ）、リジン（１０ｍＭ）、メチオニン（１０ｍＭ）、フェニルアラニン（１０ｍＭ）、プロリン（１０ｍＭ）、セリン（１０ｍＭ）、トレオニン（１０ｍＭ）、トリプトファン（１０ｍＭ）、チロシン（１０ｍＭ）、バリン（１０ｍＭ）、オルニチン（１０ｍＭ）、タウリン（１０ｍＭ）、又はヒドロキシプロリン（１０ｍＭ）を添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。結果は図２に示した。この結果より、システイン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンがカルシウム受容体に対する明瞭な活性化作用を有することが示された。なお、上記アミノ酸についてはＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０００ Ａｐｒ
２５；９７（９）：４８１４−９で活性化作用が報告されている。

〔実施例１６〕カルシウム受容体に対するＤ−システインの活性化作用の評価
実施例１３に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するＤ−システインの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のｃＲＮＡもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、Ｄ−システイン（１０ｍＭ）、Ｌ−システイン（１０ｍＭ）、Ｄ−トリプトファン（１０ｍＭ）又はＬ−トリプトファン（１０ｍＭ）を添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。結果は図３に示した。この結果より、Ｄ−システインがカルシウム受容体に対する明瞭な活性化作用を有することが示された。

〔実施例１７〕カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用の評価
実施例１３に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のｃＲＮＡもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（ＳＮＯ）−Ｇｌｙ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（５００μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（５００μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ（５００μＭ）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ（１ｍＭ）、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（１ｍＭ）、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ（１ｍＭ）、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（５０μＭ）、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（５００μＭ）、Ｌｅｕ−Ａｓｐ（１ｍＭ）を添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。結果は図４に示した。この結果より、上記ペプチドは、カルシウム受容体に対する活性化作用を有することが
示された。

〔実施例１８〕カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用の評価
実施例１７と同様に、カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用を評価した。膜に電位固定された卵母細胞に、表１の各ペプチドについて、１０００μＭ、３００μＭ、１００μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭを添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。電流が検出された最低濃度を表１に活性として示した。この結果より、これら３２種類のペプチドは、カルシウム受容体に対する活性化作用を有することが明らかとなった。

〔実施例１９〕抗癌剤誘発性下痢モデルに対するカルシウム受容体活性化作用を有するペプチドの下痢治療効果
Balb/cマウスに抗癌剤を投与して下痢を誘導し、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（以下、「γEVG」という）の下痢抑制効果を検討した。低蛋白質栄養食（４% Casein食）を一週
間与えた6週齢のBalb/cマウスに対して、5-FU（1mg/匹/日）を3日間連続で腹腔内投与し
た。下痢症状は3回目の抗癌剤投与から5日目頃から発症し、7日目には全例下痢症状を呈
した。下痢の有無は尾根部の便の付着の有無で判定した。統計検定は、コントロール群に対するχ²検定（下痢の有無）を用い、p<0.05を有意差ありとした。

0.01%γEVGは自由飲水にてそれぞれ一回目の抗癌剤投与と同時に投与を開始し、実験終了まで継続した。
コントロール群では全例(10/10)のマウスで下痢症状が認められたのに対し、0.01%γEVG投与群では5匹中2匹のマウスに下痢症状が見られなかった。以上の結果は、γEVGが抗癌剤誘発下痢モデルにおいて有意な下痢治療効果を有することを示す。

〔実施例２０〕マウス5-HTP誘発排便モデルに対するカルシウム受容体活性化作用を有す
るペプチドの下痢治療効果
雄性ICRマウス（５週齢）を用いた。マウスに0.5 %カルボキシメチルセルロース水溶液に溶解させたγEVGを経口投与し、1時間後に5-HTP（５−ヒドロキシトリプトファン、10mg/kg, 5ml/kg）を皮下投与した。30分後、便性状のスコア（0：正常便あるいは便なし、1：下痢あるいは軟便）を測定した。対照として、薬物を含まないビークル（vehicle; 0.5
%カルボキシメチルセルロース水溶液）をマウスに投与した。

γEVGは、1%（w/v、以下同様）および0.1 %になるように調製した。

統計検定は、ビークル投与群に対するχ²検定（下痢・軟便の有無）を用い、p<0.05を
有意差ありとした。

結果を図５に示した。ビークル投与群は、便性状スコアが健常群に対して有意に増加した。0.1%, 又は1%のγEVGの投与により、便性状スコアは用量依存的に改善した。さらに
、1%γEVGは有意に下痢を改善した。

〔実施例２１〕ラット大腸ループ法における水分吸収に対するCaSR活性化剤の影響
＜方法＞
ペントバルビタール麻酔下にて雄性SD(IGS)ラットの腹部より盲腸、大腸を取り出し、
盲腸直下から5cmを結紮し大腸ループを作製した。ループ作製直後にPGE2（4μg/ml/kg、SIGMA）を腹腔内投与し、30分後に作製したループ内へ2mlのタイロード溶液（NaCl 136.9m
M、KCl 2.7mM、CaCl₂・2H₂O 1.8mM、MgCl₂・6H₂O 1.04mM、NaH₂PO₄・2H₂O 0.04mM、NaH₂PO₄・2H₂O 0.04mM、Glucose 5.55mM、NaHCO₃ 11.9mM）に溶解させた薬物を注入した（薬液はpH6.5〜7.5に調整）。対照として、薬物を含まないタイロード溶液（ビークル）を投与した。１時間後にループ重量、ループ内の液を除いた重量とループ面積を測定することで、ループ内に残存した単位面積当たりの液重量を算出した。。

単位面積当たりの残存液量は、次の式により算出した。
単位面積当たりの残存液量（g/cm²）＝（ループ重量−液を除去したループ重量） / ループの面積

水分吸収は、次の式から抑制率を算出し評価をした。
抑制率（％）＝100−（薬物投与下の単位面積当たりの残存液量−ベースの単位面積当た
りの残存液量（平均））/（ビークル投与下の単位面積当たりの残存液量（平均）−ベー
スの単位面積当たりの残存液量（平均））×100。
（ベース＝無刺激時（PGE2無処置）

結果を図６〜８に示した。γEVGは用量依存的に水分吸収を促進した。また、GSH、γGlu-tLeu-Glyやシナカルセットも水分吸収を促進した。したがって、これらの化合物群により水分吸収促進によって下痢の抑制効果が得られることが見出された。

〔実施例２２〕抗癌剤誘発性下痢モデルに対するカルシウム受容体活性化剤の下痢抑制作用
Balb/cマウスに抗癌剤を投与して下痢を誘導し、カルシウム受容体活性化剤（以下、「CaSRアゴニスト」という）の下痢抑制効果を検討した。低蛋白質栄養食（４% Casein食）を一週間与えた6週齢のBalb/cマウスに対して、5-FU（1mg/匹/日）を3日間連続で腹腔内
投与した。下痢症状は3回目の抗癌剤投与から5日目頃から発症し、7日目には全例下痢症
状を呈した。下痢の有無は尾根部の便の付着の有無で判定した。統計検定は、コントロール群に対するχ²検定（下痢の有無）を用い、p<0.05を有意差ありとした。
CaSRアゴニストは自由飲水にて低蛋白質栄養食と同時に投与を開始し、実験終了まで継続した。

コントロール群では全例(9/9)のマウスで下痢症状が認められたのに対し、0.05%シナカルセット投与群ならびに0.5％γ-Glu-Cys-Gly投与群では5匹中2匹のマウスに下痢症状が
見られなかった。以上の結果は、CaSRアゴニストが抗癌剤誘発下痢モデルにおいて有意な下痢抑制効果を有することを示す。

〔実施例２３〕ＣａＳＲアゴニストペプチドの活性測定
実施例２、実施例６〜１０で合成した各種ペプチドについて、活性を以下のように測定した。特許文献ＷＯ２００７／０５５３９３Ａ１の実施例１に記載の方法で得られたヒト
ＣａＳＲのｃＤＮＡをＣＭＶプロモーターを有する動物細胞用発現ベクターに組み込み、最大細胞密度の約７０％に増殖したＨＥＫ２９３細胞にＦｕＧＩＮＥ６（ロシュ社）を用いて遺伝子導入した。４〜４８時間培養した後、９６ウェルプレートに０．６〜１．０×１０⁵細胞／ウェルの細胞を播種し、１日培養した後、細胞をＣａｌｃｉｕｍ ３ アッセ
イキットで染色し、ＦＬＥＸＳＴＡＴＩＯＮ（モレキュラーデバイス社、インストラクションマニュアル）を用いたカルシウムイメージング法でＣａＳＲアゴニストペプチドの活性の有無を確認した。更に、用量特性曲線から最大活性の５０％を与える濃度をＥＣ５０として求めた。

本発明により、生体への安全性が高い下痢の予防又は治療剤が提供される。

Claims (1)

1. 下記いずれかから選択される、化合物。
   

   

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