WO2011000309A1

WO2011000309A1 - 葛根素在制备治疗p2x3介导的疼痛/神经系统疾病药物中的应用

Info

Publication number: WO2011000309A1
Application number: PCT/CN2010/074729
Authority: WO
Inventors: 梁尚栋; 徐昌水; 高云; 李桂林; 林加日; 刘双梅; 刘晗; 张君; 李欣
Original assignee: 南昌大学
Priority date: 2009-06-29
Filing date: 2010-06-29
Publication date: 2011-01-06
Also published as: US20110152205A1; CN101627990A; US8362070B2

Description

葛根素在制备治疗 P2X3介导的疼痛 /神经系统疾病药物中的应用技术领域

本发明涉及镇痛药物用途发明领域，尤其是涉及可用于防治疼痛的葛根素在制备 P2X₃介导疼痛 /神经系统疾病药物中的应用。背景技术

疼痛是大多数疾病具有的共同症状，是人类共有而个体差异很大的一种不愉快的感觉。由于疼痛给人们造成极大痛苦，据 2001年第二期《国际疼痛学会通迅》报道：美国 106次国会通过一项决议，宣布从 2001年元月一日起的十年为"疼痛控制和研究的十年" （Decade of Pain Control and Research)„ 由此说明各国对疼痛研究的重视。根据疼痛时程可将疼痛分为急性痛（生理性痛）和慢性痛（病理性痛）。其中：慢性痛包括炎症痛、神经病理痛、癌症痛，是临床上常见主诉之一。由于慢性痛机理复杂，其治疗成为临床上的难题。神经病理痛是指由神经系统损伤或疾病所引起的疼痛综合征，常常表现为自发性的疼痛，对机械、冷、热等伤害性剌激产生痛觉过敏；对非伤害性剌激产生触诱发痛、痛觉倒错和烧灼痛等神经病理性痛觉过敏。由于慢性痛持续时间长，对人身心健康危害较大，其研究成为疼痛领域的热点和重点。烧伤是严重的创伤，烧伤疼痛也是最严重的急性痛之一，烧伤后伴随炎症反应导致炎症痛。疼痛往往是烧伤患者的第一反应，一般在烧伤后最初 1 小时内，创面出现不同程度的疼痛或者没有明显的疼痛，此后的疼痛往往受以下因素的影响：如烧伤深度、病程进展阶段、治疗措施和患者的个体因素等。烧伤后疼痛是由于烧伤部位皮肤的伤害性感受器受刺激，并伴随着炎症反应和神经损伤所引起的，因此它的治疗需要结合伤害性感受处理和神经病理处理。

嘌呤类物质三磷酸腺苷（ ΓΡ) 作为重要的信使物质参与痛觉信息传递。嘌呤 (Purine) 受体分为嘌吟 1和嘌呤 2 (Purine 1 , Purine 2； PI , P2) 受体， ATP及其类似物作用于 P2受体。 P2受体分为配体门控性离子通道型受体（P2X受体）和 G 蛋白偶联型受体（P2Y受体）。 P2X受体有七种亚型（P2Xw)。英国"自然"杂志报道 ATP作用的 P2X₃受体（P2X受体的一种亚型）特异性地在感觉传入的背根神经节神经元克隆表达。疼痛、伤害性剌激使损伤细胞、应激细胞以及感觉神经末梢本身释放大量 ATP， ATP及其作用的 P2X受体涉及痛觉及伤害性信息在初级感觉神经元的传递，其中主要是同聚性 P2X₃受体参与初级感觉神经元的痛觉及伤害性信息传递。基因敲除 P2X₃受体的小鼠减小了对福尔马林致痛试验的两相反应。 P2X₃受体介导神经病理痛的痛觉传递。神经病理痛剌激时， P2X₃受体和 P2X₃mR A表达增加，感觉神经元 P2X₃受体介导 ATP激活的门控通道电流明显增强。应用 P2X₃受体反义寡核苷酸及 RNA干扰技术可使炎性痛大鼠模型背根神经节的 P2X₃受体水平下调，进而明显减轻 P2X₃受体激动剂 α,β-meATP和福尔马林所致的足底伤害性反应。这些发现为神经病理痛的发病机理提供了新的依据。申请人实验室以前的研究也显示烧伤可导致背根感觉神经元 P2X₃受体表达增加。目前国外己有研究生产 P2¾受体拮抗剂（如 R03 ) 用于临床治疗疼痛的报道。

目前化学药物镇痛仍是最主要的疼痛治疗手段，主要包括阿片类镇痛药、中枢作用的非阿片类镇痛药、作用于外周的抗炎镇痛药和复方抗炎镇痛药。但阿片类等镇痛药物的副作用如呼吸抑制、恶心、呕吐、嗜睡、尿潴留等发生率较高，而且长期应用易产生药物耐受与依赖以及突然停药导致的戒断综合征。消炎痛 (Indometacin, 吲哚美辛）为非甾体类抗炎药，具有解热、镇痛及抗炎等作用，其作用机理为通过对环氧酶的抑制而减少前列腺素的合成，制止炎症组织痛觉神经冲动的形成，抑制炎性反应，包括抑制白细胞的趋化性及溶酶体酶的释放等。由于消炎痛有多种严重的副作用，影响其使用范围。因此，寻找以新的分子靶标为基础的镇痛药物成为目前的研究热点和面临的首要任务。

葛根素是从豆科植物野葛及甘葛藤根中提取的一种黄酮苷，临床上主要用于心血管疾病和糖尿病的治疗。文献报道 [周军，方素萍,齐云,等.葛根汤对佐剂性关节炎大鼠关节炎液炎症介质的影响.中国实验方剂学杂志，2001，7(3):29-31.]以葛根为主药的葛根汤具有抗炎作用。该文献提示从葛根中提取的葛根素可能具有抗伤害性反应和影响痛觉的作用，但目前尚无葛根素直接具有镇痛作用的报道，临床上也无葛根素通过镇痛作用机制进行疼痛治疗的报道。发明内容

本发明的第一个目的在于提供葛根素的第一个新用途，即葛根素在制备治疗慢性痛（优选神经病理痛）的药物中的应用。

本发明的第二个目的在于提供葛根素的第二个新用途，即葛根素在制备治疗急性痛（优选烧伤痛）的药物中的应用。

本发明的第三个目的在于提供葛根素的第三个新用途，即葛根素作为 P2X₃嘌吟受体拮抗剂在制备涉及 P2X₃受体介导的神经系统疾病的病理生理机制防治药物中的应用。

葛根素可减轻神经病理痛（慢性痛）及烫伤大鼠的痛（急性痛）行为反应。葛根素治疗急性痛 /慢性痛的作用机理为：阻断 P2¾受体介导的疼痛信息传递，产生防治疼痛的作用。为了更好地理解本发明的实质，下面结合附图以实验和结果来证明葛根素的用途。

附图说明

图 1为葛根素神经病理痛大鼠热痛敏的影响图；图 2为葛根素神经病理痛大鼠机械痛敏的影响图；

图 3为葛根素对神经病理痛大鼠背根神经节 P2X₃受体免疫反应性的影响图，其中 A: 假手术组； B: 单独葛根素组； C: 坐骨祌经慢性压迫性损伤组； D: 坐骨神经慢性压迫性损伤 +葛根素处理组; E: 正常组； F: 坐骨神经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组；

图 4为葛根素对神经病理痛大鼠背根神经节 P2X₃受体 mRNA表达的影响图，其中 A: 假手术组； B: 单独葛根素组； C: 坐骨神经慢性压迫性损伤组； D: 坐骨神经慢性压迫性损伤 +葛根素组; E: 正常组; F:坐骨神经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组；图 5为各组大鼠 DRG神经元 P2X受体激动剂 -激活电流图，其中 A: 假手术组; B: 单独葛根素组； C: 坐骨神经慢性压迫性损伤组； D: 坐骨神经慢性压迫性损伤 +葛根素组; E: 正常组； F: 坐骨神经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组；

图 6为浅 II度烧伤皮肤 HE染色病理切片 x40的示意图；

图 7为大鼠皮肤标本连续切片 S-100和 P2X₃免疫组织化学照片，其中 A为神经末梢 S-100免疫阳性表达照片； B为神经末梢 P2X₃免疫阳性表达照片，箭头所指为免疫阳性神经末梢；

图 8为烧伤大鼠皮肤神经末梢 P2X₃受体免疫组化表达照片，其中 A为背部皮肤假烫组; B为葛根素注射十背部皮肤浅 II °C烫伤组; C为生理盐水十背部皮肤浅 II °C 烫伤组，箭头所指为免疫组化阳性神经末梢；

图 9为葛根素烫伤痛大鼠热痛敏的影响图；

图 10为葛根素烫伤痛大鼠机械痛敏的影响图；

图 11为葛根素对烫伤痛大鼠背根神经节 P2X₃受体免疫反应性的影响图，其中 A: 假烫组; B: 单独葛根素组; C: 浅 II °C烫伤组; D: 浅 II°C烫伤 +葛根素组; E: 正常组： F: 坐骨神经慢性压迫性损伤十消炎痛处理组：

图 12为葛根素对烫伤痛大鼠背根神经节 P2¾受体 mRNA表达的影响图，其中 A: 假烫组; B: 单独葛根素组; C: 浅 II °C烫伤组; D: 浅 II°C烫伤 +葛根素组; E: 正常组； F: 坐骨神经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组；

图 13为葛根素对烫伤痛大鼠背根神经节 P2X₃受体蛋白表达的影响图，其中实验分组顺序：假烫组；正常对照组；浅 IPC烫伤 +葛根素组；浅 II °C烫伤组；单独葛根素组；坐骨神经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组；

图 14为葛根素对烫伤痛大鼠背根神经节 P2X₃受体 mRNA表达的影响图，其中实验分组顺序：正常对照组；浅 II °C烫伤 +葛根素组；浅 II °C烫伤组；单独葛根素组; 假烫组；坐骨神经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组。具体实施方式：

本发明以葛根素对神经病理痛（作为慢性痛的代表）作用和烧伤痛（作为急性痛的代表）作用为例来进行说明。

一、材料和方法

(一）葛根素对 P2X₃受体介导祌经病理痛作用研究

1.1 动物和分组：

雄性 SD大鼠， 220-250g，南昌大学医学院实验动物科学部提供。将大鼠随机分成 5组，每组 12只。实验分组： I (假手术组） (sham); II (单独葛根素组）（； Puerarin); III (坐骨神经慢性压迫性损伤组）（Chronic constriction injury ， CCD; IV 〔坐骨神经慢性压迫性损伤 +葛根素处理组）（CCI + puerarin); V (正常组）（control); VI (坐骨神经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组）（CCI+Indo;)。葛根素注射液溶解于生理盐水，浓度为 50 mg/ml。 I组每天腹腔注射生理盐水（4ml/kg); II组每天腹腔注射葛根素注射液（4ml/kg); ΙΠ组（假手术组）切开皮肤暴露坐骨神经，不结扎神经即缝合皮肤。 IV组 CCI术后第 1天开始每天腹腔注射葛根素注射液（4ml/kg)。 VI组实验大鼠于术前半小时和术后每天腹腔注射消炎痛 4mg/kg/d，每天一次至实验结束。

1.2 药物与试剂：

葛根素，山东方明药业股份有限公司（生产批号： 0804171 ); 硫喷妥钠，上海新亚药业有限公司（生产批号： 050101 ); SP试剂盒，原位杂交试剂盒及 DAB试剂盒（北京中山生物技术有限公司）； P2X₃ 抗体购自美国 CHEMICON INTERNATIONAL公司。三磷酸腺苷（adenosine 5-triphophate, ATP) , sigma, D G 细胞外液配制， ρΗ7.4。 α、 β亚甲三磷酸腺苷（<x,pmethyleneATP, oi，P-meATP) sigma, DRG细胞外液配制， pH7.4。三硝基三磷酸腺苷（TNP— ATP), sigma, DRG细胞外液配制， pH7.4。玻璃微电极所充内液（internal solution)成份为 (mmol'L-l): KC1 140， CaCl₂ 1, MgCb 2, HEPES 10, EGTA 11, ATP 4。电极电阻 2〜5ΜΩ。灌流用之 DRG细胞外液 (external solution)成份为 (mmol'L-l): NaCl 150, KC1 5, CaCl₂ 2.5, MgCl₂ 1, HEPES 10, D-Glucose 10。

1.3 主要仪器：

BME-403 Von Frey细丝 (中国医学科学院生物医学工程研究所；)； BME-410C型全自动热痛刺激仪 (中国医学科学院生物医学工程研究所；)；消毒纱布、手巾、棉签等，碘酒及 75%酒精，手术器械包：剪刀、眼科小弯镊、血管钳、丝线、有齿镊、神经剥离子等。

膜片钳实验装置及相关配件： CEZ-2400 型全细胞膜片钳放大器（日本 Nihon-Kohden), SBR— I型二线示波器（汕头超声电子仪器厂）， 95-B玻璃微电极拉制仪〔华中科技大学同济医学院分子及细胞神经生物学研究室），分析天平（上海天平仪器厂），刺激器 (SEN-7203 , Mhon-Kohden,日本),隔离器（SS-202J, Nihon-Kohden, 日本）， LMS 2B型二道生理记录仪（成都仪器厂），玻璃微电极（GG-17, 华西医科大学仪器修造厂），倒置显微镜（Olympus, 日本）， HY Z 调速多用恒温振荡器 (国华电器有限公司）。

1.4 慢性神经病理痛模型制作：

用硫喷妥钠麻醉大鼠（30mg/kg，腹腔注射），在无菌条件下于大鼠右大腿后外侧切开皮肤，钝性分离出坐骨神经，以 4-0含铬肠线轻度结扎坐骨神经，共结扎 4 道，每个结之间间隔约 lmm。结扎过程中可见坐骨神经被结扎处直径略减小，并伴有右后肢一过性抽动，并注意不要结扎太紧以至于完全阻断神经外周的血流。大鼠术后单笼饲养，分别于术前 (0d)及术后 1， 3， 5， 7， 9， 11， 14 d测量机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期 (测定时间恒定于每日 10： 00-14： 00，室温维持在 22±0.5 °C) 。

1.5 神经病理痛大鼠机械痛敏检测：

用 BME-403 Von Frey 细丝（中国医学科学院生物医学工程研究所）测定机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold, MWT) 。置大鼠于透明的有机玻璃箱 (22x l2x22cm³ ) 中，有机玻璃箱底为 l xlcm² 的铁丝网。术后大鼠放置于实验室饲养，测试前将大鼠放在有机玻璃箱中适应 15 min。折力分别为 0.13, 0.20， 0.33, 0.60, 1.30, 3+60, 5.00， 7.30, 9.90, 20.1g，折力≥20.1g时均记为 20.1g。从最小折力开始，每根试验 10次，直至出现缩足反射次数大于 5 /10，即 50%反应闲值 (即引起 10次试验中 5次反应的值。重复三次，取其平均值)。每次剌激间隔时间至少大于 15s，并待剌激引起的反应（如舔足、甩腿等）完全消失。

1.6 神经病理痛大鼠热痛敏检测：

将有机玻璃箱置于 3mm厚的玻璃板上，用 BME-410C型全自动热痛剌激仪（中国医学科学院生物医学工程研究所）照射大鼠足底。热辐射剌激仪照射大鼠足底至出现抬腿回避时间为热缩足反射潜伏期（thermal withdrawal latency, TWL)。切断时间为 30秒，以防止组织灼伤。

1.7 大鼠背根神经节 (DRG)P2X₃受体的表达：

五组实验大鼠于术后第 14天腹腔注射硫喷妥钠 30mg/kg)深麻醉,经升主动脉灌注 4%多聚甲醛0.1mol/L PB, pH7.4)，分离出大鼠 L4、 L5段 DRG，取出固定,放入 4 %多聚甲醛 /O. lmPBS (含 0.1 %DEPC)中固定 2小时，用 20%蔗糖脱水，在恒冷箱切片机上行冰冻切片，厚度为 15μιη.放入 4%的多聚甲醛中保存。每只大鼠的 DRG切片隔 5张取一张二歩法免疫组织化学染色测定 DRG神经元细胞 Ρ2Χ₃受体的表达, DAB显色。与此同时对 DRG切片进行原位杂交测定 P2X₃受体 mRNA的表达，杂交前所用液体和器皿都经 0.1 %的 DEPC严格处理。冰冻切片在 0.05 %的 H₂0₂室温下作用 30分钟，以去除内源性过氧化物酶，胃蛋白酶消化 1一 2分钟， 37 °C预杂交液中孵育 2小时，弃去预杂交液，转入杂交液于水浴中 37 °C过夜。次日，用梯度枸橼酸盐水（2XSSC,0.5XSSC和 0.2XSSC) 冲洗切片各 15分钟。入 37 °C封闭液 30分钟，转入生物素化的地高辛中 37 °C孵育 30分钟， 0.05 %的 PBS冲洗 15分钟，相继在 SABC-POD和生物素化的过氧化物酶中各孵育 30分钟, DAB显色。结果用图像分析系统软件 (武汉天平影像技术有限公司, HMIAS-2000高清晰彩色医学图文分析系统) 对 P2X₃阳性神经元进行平均光密度值分析。

1.8 葛根素对 CCI大鼠 DRG祌经元 ATP或 α,β-meATP激活电流的影响：

1.8.1 标本制备：

大鼠 DRG神经元标本的分离方法概述如下：将大鼠击昏、断头后迅速切开背部皮肤，沿脊柱两侧剪断与之相连的肋骨，取出胸腰段脊柱，由脊柱正中剖开成两半，置 0₂饱和之 DMEM液（Dubecco's Modified Eagle's medium) 内， pH值 7.40，溶液渗透压为 340mOsm/kg。由剖开的椎管内侧取出 L4、 L5神经节及相连的神经根（腹、背根）和脊神经，在解剖显微镜下用精细角膜剪及游丝镊仔细剪除相连神经和周围结締组织被膜，将清除干净的 DRG尽可能地剪碎，置培养瓶内并加入 trypsin (type III, sigma) 0.5 g/L, collagenase (type IA, sigma) l .Og/L在恒温振荡水浴器（35 °C， 80次 /分）中孵育 20— 30分钟，完成后加入适量的 Soya beam trypsin inhibitor (type II -s， sigma)以终止酶的消化作用。将上述酶和机械分离的 DRG细胞转移至 35 mm培养皿内，放在倒置显微镜的载物台上换液静置 30min。然后应用全细胞式膜片钳技术记录葛根素对 ATP或 oi，p-meATP激活电流的影响。

1.8.2 全细胞膜片钳实验操作程序：

( 1 ) 仔细检査实验系统各仪器间的连接和初始设置。

(2)打开电源开关。

(3)电极安装：接好参比电极，充灌玻璃电极，然后将其装于电极夹持器上。注意：电极充灌不要过满；装电极之前将手接触屏蔽罩排出身体上的静电。

(4)相界电位补偿和电极电阻的测量：在"搜索"方式下将微电极入液，调节相界电位补偿，并根据脉冲电压方波引起的电流响应幅值测量电极电阻。

(5)细胞封接：调节微操纵器使微电极尖端接近细胞表面，并对微电极内施一负压，形成吉欧封接。

(6)快电容补偿：调节快电容补偿，使输出信号中不含快电容电流成分。

(7)吸破细胞膜：将工作方式切换到"钳压"挡。在电极与细胞之间形成高阻 ( 1— ΙΟΘΩ) 封接后，进一歩将膜吸穿。置钳制电压（Η.Ρ) 于一 60mV，膜电流应用低通波（lkHz,-3dB)。

(8)慢电容补偿：调节慢电容补偿，使输出信号中不含慢电容电流成分。

串联电阻补偿：调节串联电阻补偿至不产生震荡为止。

全细胞膜片钳记录所用的仪器为 CEZ-2400型膜片钳放大器（Mhon-Kohden, 日本）。在电极与细胞膜之间形成高阻（1〜10GQ )封接后进一步将膜吸穿，调节电容和串联电阻补偿。置保持电压（holding potential, HP) 于一 60mV，膜电流应用低通滤波（lkHz，-3dB )。实验结果由二道记录仪 (LMS-2B，成都)描记。 ATP浓度-效应曲线按照下列公式绘制。 I=Imax /[1+(EC₅₀/C)n] 式中 C为 ΑΓΡ浓度， I为标准化后的 ATP激活电流， Imax为标准化后的 ATP激活电流最大值， EC₅₀或 Kd为 ATP产生最大效应的半效浓度， n为 Hill 系数。给药系通过微操纵器移动快速换药装置的排管进行，每管直径为 0.2 mm, 管口距记录的细胞约 100μηι。实验中需进行药物胞内透析时系通过插入玻璃微电极里的微管注入药物。实验在室温 20〜30 °C范围进行。

1.9 实验数据的统计处理：

各组数据以一 X ± sem表示。多组间比较用单因素方差分析,继以最小显著差法 (； LSD)行两两比较。用 SPSS11.0 软件包进行数据处理。为差异有显著性。

(二）葛根素对 P2X₃受体介导烧伤痛作用研究

2.1 动物和分组：

雄性 SD大鼠， 220-250g, 60只，南昌大学医学院实验动物科学部提供，随机分组。 I组为足部皮肤假烫组； II组为葛根素注射 +足部皮肤 I度或浅 II度烧伤组； III组为生理盐水 +足部皮肤 I度或浅 II度烧伤组； IV组为背部皮肤假烫组， V组为葛根素注射 +背部皮肤 I度或浅 II度烧伤组； VI组为生理盐水 +背部皮肤 I度或浅 II度烧伤组。葛根素注射液溶解于生理盐水，浓度为 50mg/ml。 ΙΠ组和 VI组在烫伤前 0.5h 尾静脉注射 4ml/kg生理盐水，每天 1次至实验结束； II组和 V组烫伤前 0.5h尾静脉注射葛根素注射液 4ml/kg,每天一次至实验结束； I组和 IV组（假烫组）分别将足部或背部皮肤浸在 37 °C温水中 8s。

2.2 药物与试剂：

葛根素，山东方明药业股份有限公司（生产批号： 0804171 ); 乙醚，天津市大茂化学试剂厂（生产批号： 050801 ); 硫喷妥钠，上海新亚药业有限公司（生产批号： 050101 )； SP 试剂盒， DAB 试剂盒（北京中山生物技术有限公司）； P2X₃抗体 (CHEMICON INTERNATIONAL, 美国）； S100抗体（武汉博士德公司）。

2.3 主要仪器：

BME-403 Von Frey细丝 (；中国医学科学院生物医学工程研究所 )； BME-410C型全自动热痛剌激仪 (中国医学科学院生物医学工程研究所; 膜片钳装置及相关配件： CEZ-2400型全细胞膜片钳放大器（Nihon-Kohden, 日本）， SBR— I型二线示波器（汕头超声电子仪器厂）， 95-B玻璃微电极拉制仪（华中科技大学同济医学院分子及细胞神经生物学研究室），分析天平（上海天平仪器厂），刺激器 (SEN-7203 , Nihon-Kohden, 曰本),隔离器（SS-202J, Nihon-Kohden, 日本）， LMS— 2B型二道生理记录仪（成都仪器厂），玻璃微电极（GG-17, 华西医科大学仪器修造厂），倒置显微镜（Olympus, Japan), HY— Z调速多用恒温振荡器（国华电器有限公司）等。

2.4 烧伤模型制作与确定

2.4.1 烧伤模型制作：

2.4.1.1 足部浅 Π度烫伤大鼠模型：

用乙醚麻醉大鼠后，将大鼠右后足部浸入 70 °C水中 5s或 8s,烫伤后单笼饲养，分别于烫伤前 (Oh)及烫伤后 1， 24, 48， 72, 96, 120， 144h测量右后足部机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期 (室温维持在 22±0.5 °C)。

2.4.1.2 背部浅 II度皮肤烧伤大鼠模型：

用乙醚麻醉大鼠后，将大鼠背部皮肤剪去毛发后浸入 70 °C水中 5s或 8s,烫伤面积大约 30 %，形成背部皮肤浅 II度烧伤大鼠模型，烫伤后单笼饲养,创面暴露,不做任何处理。

2.4.2 I度和浅 II度烧伤大鼠的确定：

I度烧伤大鼠的皮肤浸入 70 °C水中 5s后 , 15分钟左右可以观察到有红斑和轻微水肿形成，病理切片 HE染色证实为 I度烧伤。浅 II度烧伤大鼠皮肤浸入 7CTC水中 8s 后， 15分钟左右可以观察到有红斑和轻微水肿形成, 3小时后可以看到有水疱形成，病理切片 HE染色证实为浅 II度烧伤。烧伤大鼠在处死之前没有明显感染发生。

2.5 足部烧伤大鼠机械痛敏测定：

用 BME-403 Von Frey 细丝测定机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold, MWT) 。置大鼠于透明的有机玻璃箱 (22 χ 12 χ22 cm³ )中，有机玻璃箱底为 l x l cm² 的铁丝网。术后大鼠放置于实验室饲养，测试前将大鼠放在有机玻璃箱中适应 15 min„ 折力分别为 0.13,0.20,0.33,0.60, 1.30,3.60,5.00, 7.30,9+90,20. lg。从最小折力开始，每根试验 10次，直至出现缩足反射次数大约 5 110,即 50%反应阈值 (；即引起 10 次试验中 5 次反应的值）。最大折力为 20. lg，大于此值时记为 20.1g。每次试验至少间隔 15s，并待剌激引起的反应 (如舔足、甩腿等)完全消失。

2.6 足部烧伤大鼠热痛敏测定：

将有机玻璃箱置于 3mm厚的玻璃板上，用 BME-410C型全自动热痛剌激仪照射大鼠足底。热辐射剌激仪照射大鼠足底至出现抬腿回避时间为热缩足反射潜伏期 ( thermal withdrawal latency, TWL) 。切断时间为 25秒,以防止组织灼伤。

2.7 背部烧伤大鼠皮肤神经末梢 P2X₃受体表达实验：

烫伤大鼠每天尾静脉注射葛根素或生理盐水 5ml/kg，连续 3天后，各组大鼠腹腔注射硫喷妥钠 (30mg/kg)深麻醉，剪取大鼠背部烧伤皮肤，大小为 1.5-2cm²，取出固定，石蜡包埋。免疫组化测定时横断切片,片厚 4μιη。二歩法免疫组织化学染色, DAB 显色。每只大鼠的皮肤隔 5 张取连续二张切片，一张切片做皮肤神经末梢 P2X₃受体表达测定，另一张切片做皮肤神经末梢 S 100表达测定。结果用图像分析系统软件 (武汉天平影像技术有限公司, HMIAS-2000高清晰彩色医学图文分析系统）分析 P2X₃阳性神经元平均光密度值。

2.8 实验数据的统计处理：

各组数据以—X ± sem 表示。多组间比较用单因素方差分析,继以最小显著差法 (LSD)行两两比较。用 SPSS11.0 软件包进行数据处理。为差异有显著性。

二、结果 (一 ) 葛根素对 P2X₃受体介导的神经病理痛作用的研究结果各组大鼠术后均未见肢体运动障碍和自残现象。

1.1行为学研究-

1.1.1 神经病理痛大鼠热痛敏检测：

坐骨神经被结扎 4天后神经病理通模型基本形成， III组（坐骨神经慢性压迫性损伤组； Chronic constriction injury, CCD 和 IV组（坐骨神经慢性压迫性损伤 +葛根素处理组； CCI+ puerarin) 和 VI组（坐骨神经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组， CCI+Indocin) 的热缩足反射潜伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)较 I组 (假手术组， sham)、 II组 (单独葛根素组， puerarin)和 V组（正常对照组， control) 显著性下降 (p<0.01)，而 I组 (sham；)、 II组 (puerarin)和 V组（control) 之间相比较无显著性差异 (p>0.05)。 IV组（CCI+ puerarin) 热缩足反射潜伏期与 I组 (sham)、 Π组 (puerarin) 和 V组（control) 之间相比较仍下降（p<0.01)，但与 III组（CCI) 之间比较显著性增加（p<0.01 )。 14d后， IV组（CCI+ puerarin) 热缩足反射潜伏期与 V组（control) 之间相比较无显著性意义 φ>0.05) ，而 III组（CCI)仍较低（ρ<0.01 )。坐骨神经被结扎 7d后， VI组（坐骨神经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组， CCI+Indocin) 与 CCI 组实验大鼠比较其热缩足反射潜伏期增大，有明显差异（p<0.01 )，与 IV组相比无明显差异性（p>0.05 )。见图 1。

1.1.2 神经病理痛大鼠机械痛敏检测：

坐骨神经被结扎 4d 后神经病理通模型基本形成， ΙΠ组（Chronic constriction injury , CCI). IV组（CCI+ puerarin) 和 VI组（坐骨神经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组， CCI+Indocin) 与 I组 (sham)、 II组 (puerarin)和 V组（control) 相比，其机械缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)显著性下降 (p<0.01)，而 I组 (sham), II组 (puerarin)和 V组（control) 之间相比较无显著性差异 (p>0.05)。坐骨神经被结扎 7d后，虽 IV组（CCI + puerarin) 与 V组（control) 相比，其机械缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)仍低（p<0.01 )，但 III组（CCI) 比 V组 (control) 的械缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)更低（p<0,01 )，而 IV组（CCI + puerarin) 与 III组（CCI) 之间比较，机械缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)显著性增加（p<0.01 )。坐骨神经被结扎 7d后， VI组（坐骨神经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组， CCI+Indocin) 与 CCI组实验大鼠比较其机械缩足反射阈值增大，有明显差异（p<0.01 )，与 IV组相比无明显差异性（p>0.05 )。见图 2。

1.1.3 大鼠背根神经节 (DRG)P2X₃受体的表达变化：

术后 14d, 用免疫组织化学方法测定大鼠 L₄、 L₅手术侧背根神经节 (DRG)P2X₃ 受体的表达。每只大鼠背根神经节 L₄、 L₅段切片中隔 5 张取一张切片，用图像分析系统软件分析 P2X₃阳性神经元的灰度变化。 I组（假手术组， sham)、 II组（单独葛根素组， Puerarin)、 III组（坐骨神经慢性压迫性损伤组， CCI)、 IV组（坐骨神经慢性压迫性损伤 +葛根素处理组， CCI + puerarin), V组（正常组， control) 和 VI组 (坐骨祌经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组， CCI+Indocin) 的平均光密度值分别为 1.18±0.03、 1.07±0.03、 1.64土 0.05、 1.28±0.04> 1.15±0.03和 1.34±0.04。 I组、 II组、 V组之间 P2X₃受体表达无显著性差异（p>0.05 ); III组 DRG的 P2X₃受体的表达较 I组、 II组、 V组明显增加（p<0.01 ); IV组 DRG的 P2X₃受体的表达较 I组、 II组、 V组高（p<0.05 )，但和 III组相比仍较低（p<0.05; VI组（坐骨神经慢性压迫性损伤 + 消炎痛处理组， CCI+Indocin) 与 CCI 组实验大鼠比较 P2X₃受体表达明显降低 (p<0.01 ), VI组 DRG的 P2X₃受体表达较 I组、 II组、 V组明显增高（p<0.01 )，但和 IV组相比稍增高（p<0.05 )。见图 3。

1.1.4 大鼠背根神经节 (DRG)P2X₃受体 m NA的表达变化：

术后 14d, 釆用原位杂交方法测定大鼠 L₄、 L₅段手术侧背根神经节 0)RG;IP2X₃ 受体 mRNA的表达。每只大鼠 L₄、 L₅背根神经节切片中隔 5 张取一张切片,用图像分析系统软件分析 P2X₃阳性神经元的灰度变化。与免疫组织化学实验结果非常相似， I组（假手术组， sham)、 II组（单独葛根素组， Puerarin)、 III组（坐骨神经慢性压迫性损伤组， CCI)、 IV组（坐骨神经慢性压迫性损伤 +葛根素组， CCI + puerarin)、 V组（正常组， control ) 和 VI组（坐骨神经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组， CCI+Indocin)的平均光密度值分别为： 0.84士 0.01、 0.82±0.03、 1.33士 0.02、 0.98± 0.05、 0.82±0.02禾 D 1.14士 0.01。 I组、 II组、 IV组、 V组之间 P2X₃受体 mRNA表达无显著性差异（ρ>0.05)_; ΠΙ组组 DRG的 P2X₃受体 mRNA的表达较 I组、 Π组、 V组明显增加（p<0.01 ); IV组 DRG的 P2X₃受体 mRNA的表达较 V组高（p<0.05); VI组与 III组比较 P2X₃受体 mRNA表达下降（p<0.05 )，与 I组、 Π组、 IV组、 V组比较表达升高（p<0.05 )。见图 4。

1.1.5 葛根素对大鼠 DRG神经元 ATP或 α,β-meATP激活电流的影响：实验在各实验组大鼠新鲜分离的 L4/L5手术侧即右侧 DRG细胞上进行，分离的细胞呈圆形或椭圆形，实验细胞胞体直径在 25-40 μιη之间。多数细胞的胞体一侧可见到卷曲的轴突残根。

实验分为 I组（假手术组， sham)、 II组（单独葛根素组， puerarin)、 III组（坐骨神经慢性压迫性损伤组， CCI)、 IV组（坐骨神经慢性压迫性损伤 +葛根素处理组， CCI + puerarin), V组（正常组， control) 和 VI组（坐骨神经慢性压迫性损伤 +消炎痛处理组， CCI+Indocin)。实验共检测 I组 36个细胞， II组 37个细胞， ΙΠ组 39个细胞， IV组 40个细胞， V组 38个细胞，其中 I组 88.9% (32/36)， II组 89.2%(33/37)， ΙΠ组 87.2%(34/39)， IV组 87.5%(35/40)， V组 86.8% (33/38) ， VI组 89.7%(35/39)DRG 神经元对细胞外加 ATP ( 1-1000 μηιοΙ L)敏感。 ATP-激活电流（I_ATP)显示快失敏和慢失敏两种形式的内向电流（即尽管激动剂持续存在且浓度不变，但激活电流上升到达顶峰之后，其幅值随时间呈指数性的逐步衰减直至一稳定值）。六组 DRG神经元 I_ATP的完全恢复时间均约为 4-6 min, 但 CCI组较其它四组 DRG神经元对同一浓度的 ATP产生的 I_ATP明显增加，且随着 ATP浓度增加 ATP-激活电流增加更明显 (P<0.05), 其它四组之间没有显著性差异（p>0.05 )。 CCI+Indocin组较 CCI组电流降低（p<0.05 ); CCI+Indocin组和 CCI + puerarin组相比电流较大，有显著差异（p<0,05); P2X₃受体激动剂 a, p-meATP( ΙΟμιηοΙ/L )-激活电流在 I、 II、 IV、 V、 VI组产生极小的内向电流，而在 CCI组为一具有明显去敏感的内向电流 (； ρ<0.01)。各组 DRG神经元 ΑΤΡ激活电流效应也表明神经病理痛大鼠 DRG神经细胞 ΑΤΡ激活电流和 I、 II、 V、 VI组比明显增强， CCI模型大鼠葛根素用药组和 I、 II、 V组相比较虽然有所增加，但无显著性差异 (； ρ>0.05)，与消炎痛处理组比较电流降低（ρ<0.05 )。见图 5。

(二 ) 葛根素对 Ρ2Χ₃受体介导的烧伤痛作用的研究结果

2.1.1 浅 II度烧伤大鼠的确定：

浅 II度烧伤大鼠皮肤浸入 70 °C水中 8s后， 15分钟左右可以观察到有红斑和轻微水肿形成， 3小时后可以看到有水疱形成，病理切片 HE染色证实为浅 II度烧伤，见图 6。烧伤大鼠在处死之前没有明显感染现象。

2.1.2烧伤大鼠皮肤神经末梢 P2X₃受体表达的变化：

应用二步法进行皮肤神经末梢免疫组化，连续切片显示， S-100显色阳性神经末梢，同时具有 P2X₃免疫阳性表达。在镜下观察，可以看到皮肤真皮层的神经末梢主要分布在乳头层靠近表皮层，呈散在分布，或在毛囊、腺体附近分布，见图 7。用图象分析软件对 P2X₃免疫阳性皮肤神经末梢平均光密度值进行分析，结果表明背部皮肤假烫组、葛根素注射 +背部皮肤浅 II度组和生理盐水 +背部皮肤浅 II度组的灰度值分别为： 118.76±18.48、 130.42±13.35、 152.63士 22.62。生理盐水十背部皮肤浅 Π度组烧伤后，皮肤神经末梢 P2 表达明显升高，与背部皮肤假烫组相比较具有显著性差异（p<0.05;i，葛根素注射 +背部皮肤浅 II度组虽然仍高于背部皮肤假烫组，但显著性低于生理盐水 +背部皮肤浅 II度组（p<0.05)。表明葛根素可减少烫伤皮肤神经末梢 P2X₃的增强表达，见图 8。

2.1.3 足部烧伤大鼠热痛敏测定：

将有机玻璃箱置于 3 mm厚的玻璃板上，用 BME-410C型全自动热痛剌激仪照射大鼠足底。热辐射剌激仪照射大鼠足底至出现抬腿回避时间为热缩足反射潜伏期 (thermal withdrawal latency, TWL；)。切断时间为 30秒，以防止组织灼伤。

烧伤后 1、 24、 48、 72h III (足部浅 II°C烫伤组， superficial second degree foot burn)、 IV (足部浅 II °C樊伤 +葛根素组， superficial second degree foot burn + puerarin) 和 VI (足部浅 II °C烫伤 +消炎痛处理组， superficial second degree foot burn +Indocin) 与 I (足部假烫组， sham foot burn )、 II (单独葛根素组， intraperitoneal injection of puerarin), V (正常组， control)之间相比较， ΠΙ (浅 II°C烫伤组）、 IV (浅 II。C烫伤 +葛根素组）热缩足反射潜伏期 (： thermal withdrawal latency, TWL)显著性下降 (p<0.01), I (足部假烫组）、 II (单独葛根素组）、 V (正常组)之间相比较无显著性差异 (p>0.05)。烧伤后 24h后， IV (足部浅 II °C烫伤 +葛根素组）和 VI (足部浅 II °C 烫伤 +消炎痛处理组）热缩足反射潜伏期与 I (足部假烫组)、 II (单独葛根素组）、 V (正常组）之间相比较仍下降（p<0.01)，但与 ΙΠ (足部浅 II °C 烫伤组）之间比较显著性增加（p<0.01 )。 144h后， IV (足部浅 II °C烫伤 +葛根素组）和 VI (足部浅 II °C烫伤 +消炎痛处理组）热缩足反射潜伏期基本恢复正常（； p>0.05) ，而 III (足部浅 II°C烫伤组）仍较低（p<0.01 )。见图 9。

2.1.4 足部烧伤大鼠机械痛敏测定：

用 BME-403 Von Frey 细丝测定机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold, MWT)。置大鼠于透明的有机玻璃箱22x l2x22cm³ ) 中，有机玻璃箱底为 I X l cm² 的铁丝网。术后大鼠放置于实验室饲养，测试前将大鼠放在有机玻璃箱中适应 15 min。折力分别为 0.13, 0.20, 0.33, 0.60, 1.30, 3.60, 5.00, 7.30, 9.90, 20. lg, 折力 ≥20.1g时均记为 20.1g。从最小折力开始，每根试验 10次，直至出现缩足反射次数大于 5 /10，即 50%反应阈值引起 10 次试验中 5 次反应的值。重复三次，取其平均值)。每次剌激间隔时间至少大于 15s，并待剌激引起的反应（如舔足、甩腿等）完全消失。

烧伤后 lh始， III (足部浅 II °C烫伤组）、 IV (足部浅 II °C烫伤 +葛根素组）与 I (足部假烫组）、 II (单独葛根素组）、 V (正常组）和 VI (足部浅 II °C 烫伤 +消炎痛处理组）之间相比较， III (浅 II °C烫伤组）、 IV (浅 n °c烫伤 +葛根素组）和 W (足部浅 II°C烫伤 +消炎痛处理组）机械缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)显著性下降 (p<0.01)，而 I (足部假烫组）、 II (单独葛根素组）、 V (正常组) 之间相比较无显著性差异 Cp>0.05)。 24h后， IV (足部浅 II °C烫伤十葛根素组）和 VI (足部浅 II °C烫伤 +消炎痛处理组）与 III (足部浅 II°C烫伤组）之间比较，机械缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)显著性增加（p<0.01 )。 72h或 96h 后 W (足部浅 II°C烫伤 +葛根素组）和 VI 〔足部浅 IPC烫伤 +消炎痛处理组）的机械缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)与 I、 II、 V组之间相比较基本恢复正常 (p>0.05;>，而 III (足部浅 II °C 烫伤组）的机械缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)仍较低 (p<0.01)。见图 10。

2.1.5 免疫组化检测大鼠背根神经节 (DRG)P2X₃表达变化：

SD大鼠（体重 200 ±20g) 随机分为 I (背部假烫组， sham back burn)、 II (单独葛根素组， Puerarin, intraperitoneal injection)、 III (背部浅 II °C烫伤组， superficial second degree back burn)、 IV (背部浅 II°C ¾伤+葛根素组， superficial second degree back burn + puerarin). V(正常对照组， control) 和 I (背部浅 II °C烫伤 +消炎痛处理组， superficial second degree back burn + Indocin)。 IV (背部浅 II。C烫伤 +葛根素组）大鼠，烫伤前 30min和烫伤后每天腹腔注射葛根素（Puerarin, 100mg/kg) ，连续 3天。用免疫组织化学方法测定大鼠烫伤部背根神经节 (DRG)P2X₃受体的表达。

免疫组化结果经 Himas-2000高清晰彩色医学图文分析系统分析，结果显示 I组、 II组、 ΙΠ组、 IV组、 V组和 VI组的平均光密度值分别为: 1.04±0.04 (n=10)、 1.01±0.02 (n=10)、 1.21±0.04 ( n=10)、 1.10±0.02 (n=10)、 1.03±0.02和 1.16士 0.03 (n=10)。

III (背部浅 II°C烫伤组）明显高于 I组、 II组、 IV组、 V组（p<0.01 )， VI (背部浅 II °C烫伤 +消炎痛处理组）与 III (背部浅 II °C烫伤组）比较 P2X₃ mRNA表达降低 (p<0.05 ), I、 II、 V组之间 P2X₃受体表达无显著性差异（p>0.05 ); IV (背部浅 II°C烫伤 +葛根素组）与 I、 II、 V组之间 P2X₃受体表达相比稍偏高，但无统计学意义（p>0.05 )，与 ΙΠ (背部浅 II °C烫伤组）比较 DRG的 P2X₃受体的表达量明显下降（p<0.01 )，与 VI (背部浅 II °C烫伤+消炎痛处理组）比较 DRG的 P2X₃受体的表达量下降（p<0.05 )。见图 11。

2.1.6 原位杂交检测大鼠背根神经节 (DRG)P2X₃的 mRNA表达变化：

SD大鼠 (；体重 200 ±20g)随机分为 I (背部假烫组， sham back burn；)、 II (单独葛根素组， puerarin, intraperitoneal injection)、IIK背部浅 II °C资伤组， superficial second degree back burn)、 IV (背部浅 II °C燹伤十葛根素组， superficial second degree back burn + puerarin). V (正常对照组， control) 和 I (背部浅 II °C 烫伤+消炎痛处理组， superficial second degree back burn + Indocin)。 IV (背部浅 IPC烫伤+葛根素组），烫伤前 30min和烫伤后，大鼠每天腹腔注射葛根素 (puerarin 100mg/kg)，连续 3天。 VI 组实验大鼠于烫伤前 30min和烫伤后，每天腹腔注射消炎痛 4mg/kg/d，连续 3天。

原位杂交结果经 Hmias-2000高清晰彩色医学图文分析系统测定大鼠烫伤部背根神经节 (DRG)P2X₃受体的表达。结果显示， I组、 Π组、 ΙΠ组、 IV组、 V组和 VI组的平均光密度值分别为： 1.01±0.03 (n=10)、 0.97±0.01 (n=10)、 1.15±0.04 (n=10)、 1.01士0.03 (n=10)、 0.99±0.02 (n=10) 和 1 ,06±0.05 (n=10) _D。 III (背部浅 II°C烫伤组） P2X₃ mRNA表达明显高于 I组、 II组、 IV组、 V组（p<0.05 )， I、 II、 V组之间 P2X₃ mRNA表达无显著性差异（p>0.05 ); VI (背部浅 IPC烫伤 +消炎痛处理组）与 ΙΠ (背部浅 II°C烫伤组）比较 P2X₃ mRNA表达下降（p<0.05 )， IV (背部浅 IPC烫伤 +葛根素组）与 ΠΙ (背部浅 II°C烫伤组）比较， DRG的 P2X₃ mRNA的表达量显著性下降（ρ<ο.οι )， IV (背部浅 n°c烫伤 +葛根素组）与 (背部浅 II °c烫伤 +消炎痛处理组）比较， DRG的 P2X₃ mRNA的表达量下降（p<0.05 )，与 I、 II、

V组之间比较无明显差异（p>0.05)。见图 12。

2丄 7 蛋白印迹检测大鼠背根神经节 (DRG)P2X₃蛋白表达变化：

SD大鼠 (体重 200 ±20g)随机分为 I (背部假烫组， sham back burn；)、 II (单独葛根素组， puerarin, intraperitoneal injection)、IIK背部浅 II °C资伤组， superficial second degree back burn)、 IV (背部浅 II °C烫伤 +葛根素组， superficial second degree back burn + puerarin) , V (正常对照组， control) 和 VI (背部浅 II °C 烫伤 +消炎痛处理组， superficial second degree back burn + Indocin)。 IV (背部浅 II °C烫伤 +葛根素组），大鼠烫伤前 30min和烫伤后每天腹腔注射葛根素 puerarm, 100mg/kg), 连续 3天。 VI 组实验大鼠于烫伤前 30min和烫伤后，每天腹腔注射消炎痛 4mg/kg/d，连续 3天。

结果通过 Alpha Imager 2200图像分析软件读取目的条带在 X光胶片上测得的光密度扫描值，以各组 β-actin条带的扫描值标化其相应组 P2X₃的蛋白表达量。结果显示， I组、 II组、 III组、 IV组、 V组和 VI组的 P2X₃的蛋白表达量（经对应的 β-actin 标化后）分别为： 0.99±0.07 (n=3 )、 0.97±0.02 (n=3 )、 1.23±0.06 ( n=3 )、 0.93±0.02 (n=3 )、 0.98±0.02 ( n=3 ) 和 1.14±0.03 ( n=3 )。。 III (背部浅 II。C烫伤组） P2X₃ 蛋白的表达明显高于 I组、 II组、 IV组、 V组（p<0.01 )，； VI (背部浅 II °C烫伤 +消炎痛处理组） P2X₃ 蛋白的表达低于 III (背部浅 II °C烫伤组）（p<0.05 ); I 、 Π、 V组之间 Ρ2Χ₃ 蛋白的表达无显著性差异（ρ>0.05 )，而 IV (背部浅 II °C烫伤 +葛根素组）与 I 、 II、 V组之间相比， DRG的 P2X₃ 蛋白的表达相对量更低，但无显著性差异 (p>0.05 ) , 与 ΙΠ (背部浅 II °C烫伤组）比较， DRG的 P2X₃ 蛋白的表达相对量明显下降（p<0.01 )，与 VI (背部浅 II °C烫伤 +消炎痛处理组）比较， DRG的 P2X₃ 蛋白的表达相对量下降（p<0.05 )。。见图 13。

2.1.8 RT-PCR检测大鼠背根神经节 (DRG)P2X₃的 mRNA表达变化：

SD大鼠 (体重 200 ±20g)随机分为 I (背部假烫组， sham back burn；)、 II (单独葛根素组， puerarin, intraperitoneal injection). Ill (背部浅 II。C烫伤组， superficial second degree back burn)、 IV (背部浅 II °C ¾伤+葛根素组， superficial second degree back burn + puerarin) V OE常对照组， control) 和 VI (背部浅 II °C烫伤 +消炎痛处理组， superficial second degree back burn + Indocin)。 IV (背部浅 II。C烫伤十葛根素组），大鼠烫伤前 30min和烫伤后每天腹腔注射葛根素 (puerarin, 100mg/kg), 连续 3 天。 VI组实验大鼠于烫伤前 30min和烫伤后，每天腹腔注射消炎痛 4mg/kg/d，连续 3天。

引物设计：选用 β-actin作为内参，引物序列如下：

Primer P2X₃ (产物长度为 519bp )

S 5' -CAACTTCAGGTTTGCCAAA-3 '

A 5' - TGAAC AGTGAGGGCCTAGAT - 3 '

Primer β-actin (产物长度为 240bp)

S 5' - TAAAGACCTCTATGCC AAC AC AGT - 3 '

A 5' - CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC - 3 '

采用凝胶成像系统读取目的电泳条带的斑点密度（平均光密度）扫描值，将 P2X₃ 条带与其对应的 β-actin条带的比值作为 P2X₃ mRNA表达的相对量。结果显示， I 组、 II组、 III组、 IV组、 V组和 VI组 P2X₃ mRNA表达相对量（经对应的 β-actin标化后）分别为： 0.88±0.02 (n=3 )、 0.89± 0.02 (n=3 )、 1.04± 0.03 ( n=3 )、 0.90± 0.02

(n=3 )、 0.91± 0.03 (n=3 )和 0.97± 0.02 (n=3 )„ III (背部浅 II。C烫伤组） P2X₃ mRNA 的表达明显高于 I组、 II组、 IV组、 V组（p<0.01 )， VI (背部浅 II °C烫伤 +消炎痛处理组） P2X₃ mRNA的表达低于 III (背部浅 II。C烫伤组）〔p<0.05 )， I、 II、 V组之间 P2 mRNA的表达无显著性差异（p>0.05 )，而 IV (背部浅 II °C烫伤+葛根素组）与 ΙΠ (背部浅 II °C烫伤组）比较 DRG的 P2X₃ mRNA的表达明显下降（p<0.01 )，与 VI (背部浅 II °C烫伤 +消炎痛处理组）比较 DRG的 P2X₃ mRNA的表达量较低

(p<0.05 ), 与 I、 II、 V组之间相比无明显差异（p>0.05 )。。见图 14。

申请人实验室的研究发现葛根素可减轻神经病理痛及烫伤痛大鼠的痛行为反应。非体类抗炎镇痛药消炎痛处理组可明显减轻 CCI模型大鼠及烫伤痛大鼠的机械和热痛敏反应，但对 CCI模型大鼠及烫伤痛大鼠背根初级感觉神经细胞 P2X₃受体表达的影响低于葛根素处理组。根据葛根素减小神经病理痛和烧伤痛大鼠背根神经节神经元 P2X₃受体的表达、抑制 P2X₃受体激动剂 ATP和 α， β-meATP在正常大鼠背根祌经节神经元的激活电流的研究结果，表明葛根素减轻疼痛的作用机理是阻断 Ρ2Χ₃受体介导的疼痛信息传递，具有防治疼痛的作用。此外，由于 Ρ2Χ嘌呤受体涉及体内许多生理功能和病理作用，探寻出新的嘌吟受体特异性阻断剂，将极大地推动嘌呤信息系统在体内各种生理功能和病理作用的研究工作。实施例 1 :

用本技术领域公知的方法，制成适用于急性痛 /慢性痛治疗的口服、注射或局部应用（如局敷）的葛根素制剂。与非甾体类抗炎镇痛药消炎痛处理组大鼠实验结果相比表明葛根素是作用于 Ρ2Χ₃受体产生镇痛效应。相对于阿片类等镇痛药物的副作用大易产生药物耐受与依赖以及戒断综合征，消炎痛等抗炎镇痛药毒副作用大等不足之处，中药有效成份毒副作用小，葛根素为心血管疾病临床上已经应用的药物，更利于其作为镇痛药物的开发应用。

实施例 2:

用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及 Ρ2Χ₃受体介导神经系统疾病治疗的口服、注射或局部应用（如局敷）的葛根素制剂。 CCI模型大鼠及烫伤痛大鼠非甾体类抗炎镇痛药消炎痛处理组显示可明显减轻大鼠的机械和热痛敏反应，但对 CCI 模型大鼠及烫伤痛大鼠背根初级感觉神经细胞 Ρ2Χ₃受体表达的影响低于葛根素处理组，显示葛根素的镇痛作用机理与消炎痛不同，葛根素可通过降低 Ρ2Χ₃受体表达产生作用。进而表明葛根素可能成为 Ρ2Χ₃受体介导神经系统疾病防治的药物。

Claims

权利要求书

、葛根素在制备用于治疗涉及 P2X₃受体介导的慢性痛的药物中的应用。、根据权利要求 1所述的应用，其中所述慢性痛为神经病理痛。

、葛根素在制备用于治疗涉及？2 ₃受体介导的急性痛的药物中的应用。、根据权利要求 3所述的应用，其中所述急性痛为烧伤痛。

、葛根素在制备涉及 P2X₃受体介导的神经系统疾病防治药物中的应用。