CN102743739A

CN102743739A - 一种蟑螂多肽类物质的制备方法及其抗疱疹病毒医药用途

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Publication number: CN102743739A
Application number: CN2012101374224A
Authority: CN
Inventors: 戴志明; 杨荣新; 张成桂; 巫秀美; 赵昱
Original assignee: Dali University
Current assignee: Dali University
Priority date: 2012-05-06
Filing date: 2012-05-06
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2032-05-06
Also published as: CN102743739B

Abstract

本发明涉及一种蟑螂多肽类物质的制备方法及其抗疱疹病毒医药用途。具体而言，本发明涉及一种具有防治单纯疱疹病毒感染类疾病功能的蟑螂提取物有效部位及其制备方法和医药用途。本发明的美洲大蠊提取物有效部位是分子量小于5000道尔顿的多肽类物质，由蜚蠊科美洲大蠊（Periplaneta americana）虫体鲜品或干品经水或有机溶剂和缓冲液提取后再经膜分离法精制而成，该有效部位多肽类活性物质具有明显的抗单纯疱疹病毒HSV-1和HSV-2活性，可制备成水凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂形式，用于制备预防和治疗单纯疱疹病毒感染的药物、日化用品或医疗器械。

Description

一种蟑螂多肽类物质的制备方法及其抗疱疹病毒医药用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种具有防治单纯疱疹病毒感染疾病功能的蟑螂提取物有效部位及其制备方法和医药用途。该有效部位为分子量小于5000道尔顿的多肽类活性物质，其可制备成水凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂等形式，用于制备防治抗病毒的药物、日化用品和/或医疗器械。

背景技术

单纯疱疹病毒直径约为120-150微米，含有DNA的核位于中间，向外依次由包膜、体被、衣壳三种同心结构组成，衣壳表面为162个壳微粒组成的3∶3∶2轴对称的20面体，在低温下可生存数月，湿热50℃或干燥90℃条件下30分钟灭活。单纯疱疹病毒可分为I型和II型二种，I型单纯疱疹病毒（HSV-1）主要感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官。HSV-1主要通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，99%的口唇粘膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹，以及口和口周围发生的疱疹都是由HSV-1感染引起的。II型单纯疱疹病毒（HSV-2）主要存在于女性宫颈、阴道、外阴皮肤及男性的阴茎、尿道等处，是引起泌尿生殖器发炎和疱疹的罪魁祸首。HSV-2感染引起的生殖器疱疹临床表现中可分为原发和复发两种，患病部位先有烧灼感，很快在红斑基础上发生3-10个成群的红色丘疹，伴有瘙痒，丘疹很快变成小水疱，3-5天后变为脓疱，破溃后形成大片的糜烂和溃疡，自觉疼痛，最后结痂愈合。整个病程可持续20天左右。男性好发于龟头、冠状沟、尿道口、阴茎、阴囊、大腿和臂部等处。女性好发于阴唇、阴阜、阴蒂、肛周或阴道，约90%的病人，病毒可同时侵犯子宫颈，出现阴道分泌物增多或下腹痛，并可并发宫颈炎和子宫炎。大多数男女病人双侧腹股沟淋巴结肿大。后期炎症波及尿道、膀胱时，可出现排尿困难、尿痛、尿频、严重者可发生尿潴留等现象。此外，还可能有其它症状同时出现，如发热、全身不适、头痛、颈项强直、脑膜炎和骶部神经系统功能不全。

HSV-2经性器官接触后，潜伏约2-20天(平均6天)，有免疫缺陷或免疫功能不全的人，如应用免疫抑制剂、肾移植、严重烧伤、重度营养不良、血液淋巴系统恶性肿瘤病人等感染后症状加重，可出现疱疹性湿疹、复发性角膜溃疡，甚至全身播散性疱疹而致命。感染1-3周后体内产生中和抗体及补体结合抗体，残存的病毒向周围神经沿神经轴转入骶神经节，并长期潜伏，进入静止状态。当某种诱发因素如焦虑、精神创伤、受凉、日晒、吹风、创伤、感染、药物过敏、高热、月经、妊娠等破坏身体生理平衡时，神经细胞中出现病毒增殖所需的特异性转录酶，激活病毒而引起复发，体液抗体不能制止疱疹病毒复发，细胞免疫减弱对复发有重大影响。

生殖器疱疹与生殖器恶性肿瘤关系密切，引起生殖器疱疹的HSV-2可能是宫颈癌的潜在致癌因子。研究发现，患过生殖器疱疹的妇女比未患过者得宫颈癌的危险性大5-10倍，并且，在宫颈癌组织、剥脱细胞或癌前期细胞中发现了HSV-2特异抗原，从而表明II型单纯疱疹病毒在宫颈癌的发生过程中起了重要作用。另外，从阴茎癌病人的活检材料中也观察到单纯疱疹病毒样颗粒。此外，近年来人们也注意到孕妇与HSV-2感染的严重性。对妊娠的患者或无症状排毒来说，最严重的是传染给新生儿，孕妇患生殖器疱疹可导致胎儿畸形、流产、死产。

对单纯疱疹病毒感染引起的病毒性疾病目前尚无特效治疗方法，临床上主要的治疗措施为采用阿昔洛韦等抗病毒药物。此外，人白细胞干扰素也可抑制病毒繁殖，减少生殖器疱疹的复发率。然而使用此类激素类药品、抗菌素类药品药物存在较大的毒副作用和易使病人产生耐药性和菌群失调等不足之处。

中医将单纯疱疹病毒感染疾病称为“阴疮”，其病性早期属热证、实证，为湿热、毒火阻滞肝脉；后期则伴有肝肾不足。中药外用药包括外用1%氯锌油，紫草油等方法，但治疗效果不十分理想；常用方药为清毒神圣汤加减、牛黄解毒丸、六味地黄丸加减和龙胆泻肝汤等，但对本病症无显著的针对性。因此，应用现代病毒药理学技术、利用现代分离纯化手段，从中医药宝库中发掘出新的抑制单纯疱疹病毒感染和防治疱疹疾病的天然药物，尤其是创新型中药是迫在眉睫的。

蟑螂，为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，最常见为美洲大蠊（Periplanetaamericana Linn.）。蟑螂入药始载于《神农本草经》，其中把它列为中品，谓“味：咸、寒；治：血瘀症坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”（孙星衍等，《神农本草经》，商务印书馆，1955:90）。“蟑螂”为其俗名首见于《本草纲目拾遗》，也称其为石姜、滑虫；各地方有其不同的称法，如：偷油婆、茶婆子、灶蚂子等。蜚蠊科（Blattidae）是一个庞大的昆虫家族，在地球上已生存了3.2亿年，与恐龙属同一时代出现的生物。无疑它是世界上生命力最强、最古老、至今繁衍最成功的昆虫类群之一。1960年Princis曾报道蜚蠊在世界范围内约有3500种，我国已有记录的共253种（冯平章，郭予元，吴福祯，中国蟑螂种类及防治，北京:中国科学技术出版社，1997年4月）。其主要分布于热带、亚热带地区的室内或野外，美洲大蠊是其中少数几种家居蜚蠊品种之一。主要栖息于厨房、食堂、仓库等处损害食物、衣服、书籍等，美洲大蠊作为室内害虫，取食并污染人的食物，传播痢疾、伤寒、蛔虫、蛲虫等多种疾病。从厨房和仓库等收集到的226只蟑螂体表及肠道内检出致病菌25种，感染率高达99.9%（Pai H.H.等，Isolation ofbacteria with antibiotic resistance fromhousehold cockroaches(Periplaneta americana and Blattella germanica)，Acta Tropica，2005，93(3):259）。蟑螂作为害虫是城市卫生防疫部门和海关检疫部门重点防治对象之一。然而，在科技日新月异的今天，面对上千种针对它的各种杀灭剂，这一昆虫群体依然十分活跃，这表明其体内具有某些特殊的物质和其特有的作用机制，此引起了国内外一些学者的关注。

近几年来随着我国对传统中医药资源研究开发的重视，有些学者对这一几千年来无法根绝的害虫进行了应用开发方面的研究，并取得了可喜的成就，发掘出了这一传统意义上的害虫的正面价值。以美洲大蠊醇提物制成的产品“康复新”，在烧伤、烫伤等外伤创面的良好疗效；从美洲大蠊醇提物中精制而成的“心脉龙注射液”，具强心升压，改善微循环，兴奋呼吸，利尿，增加心、脑、肺、肾的血流量。“心脉龙注射液”主治：右心衰，也可治急慢性心衰、失血性休克、低血压、室性早博、病窦性综合症、心脑缺血性疾病，为2004年通过中国国家食品药品监督管理局（SFDA）审批的国家二类新药（中药）。

蓝江林等利用大肠杆菌、溴氢菊酯、昆虫生理盐水、紫外线、超声波作为诱导源进行诱导，获得具有抗菌活性的血淋巴，在经诱导的美洲大蠊血淋巴中提取分离得到抗菌肽成分。对经大肠杆菌诱导的美洲大蠊的血淋巴进行抑菌作用测试，结果发现大肠杆菌的数量在一定的测试时间内逐渐减少。该研究还通过电镜观察表明：经诱导的美洲大蠊学血淋巴中的抗菌肽首先使细菌的外层及细胞质膜损伤，形成开口，导致内容物外泄而死亡，最后菌体崩解成碎片。因此认为美洲大蠊抗菌肽对大肠杆菌不是一般的抑菌作用，而是直接杀灭作用。（蓝江林，周先治，卓侃等，美洲大蠊(Periplaneta americana L.)抗菌肽杀菌作用初步观察，福建农林大学学报(自然科学版)，2004，33(2):166）。对蜚蠊科昆虫澳洲大蠊（Periplaneta australasie Fabricus）全虫（去翅及足）的油状醇提取物进行的体内筛选证明：澳洲大蠊提取物对S-180及人食管癌小鼠异种移植均有显著的抗癌作用（黄厚聘，程才芬，李淑芳，蟑螂油的抗癌作用，中草药，1981，12(1):35）。陈利铭发现蟑螂提取物AT2能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，并能使脾脏重量增加，在体外可增加T淋巴细胞对刀豆蛋白A（Con A）的转化反应（陈利铭，蟑螂提取物AT2抗癌作用的临床及实验研究，中西医结合杂志，1986，(11):648）。AT2治疗原发性肝癌49例，临床观察表明：其具有缓解症状、使甲胎蛋白下降、延长患者生存期的功效。在临床应用方面，蟑螂活虫提取物治疗原发性肺癌有良好效果。廖剑英以“康复新”治疗恶性纤维组织细胞瘤，取得良好效果（廖剑英，康复新治疗恶性纤维组织细胞瘤1例，大理学院学报，2003，2(3):92）。有相关报道表明蟑螂提取物在抗肿瘤的同时具有一定的增强免疫功能的作用（罗志宏，占汉章，李艳红等，中药康复新在头颈部恶性肿瘤治疗中的作用观察，中国中西医结合耳鼻咽喉科杂，1998，6(3):132；严奉祥等，中药康复新的在体免疫药理学特征，大理医学院学报，1991，3(1):21）。

对美洲大蠊在制药方面的研究多集中于美洲大蠊中的粗提物，李树楠等从美洲大蠊的醇提物中除去油脂，用二氧化碳吸附后除去色素和过敏成分，用于治疗心血管疾病（国家发明专利CN 1067243C）；刘耀北等用乙酸提取蟑螂提取物，对肝癌细胞BEL7404和BEL7721进行癌细胞增殖抑制试验，发现粗提物可以有明显抑制癌细胞生长的作用（国家发明专利CN 1199991C）；廖吉等报道了用6号提取液从蜚蠊虫体中制备降脂、调节胆固醇、调节血糖、防治肿瘤和预防心血管疾病、抗风湿作用的保健食品（国家发明专利CN1230183C）；严少宏等阐述了一种美洲大蠊粗浸膏的优化提取方式（国家发明专利CN1255117C）；徐燕和公开了一种类似的粗浸膏制备方法（国家发明专利CN 1548058A）；严少宏等公开了一种美洲大蠊粗浸膏综合利用的的提取方式（国家发明专利CN 1593467A）。以上专利都未涉及美洲大蠊在制备抗单纯疱疹病毒药用方面的用途。

发明人所在研究团队对蟑螂进行了十余年的研究，所研发的“康复新”、“心脉隆注射液”、“肝龙注射液”取得了3只国家新药证书，产品已经上市销售。在我们对美洲大蠊的后续研究中发现：用醇水混合溶剂提取美洲大蠊虫体具有体外抗单纯疱疹病毒的功效（王晓雨，刘光明，宋丽艳等，国家发明专利ZL 200810060885.9）。但是，该专利公开的是以大孔树脂作为分离材料得到的有效部位，对于多肽类分子量并无选择性。而对于药物的质量控制，希望得到分子量在一定范围内的多肽，以便利于质量控制。而全新设计的提取工艺，也有望发现新的抗病毒活性部位。基于此，我们为了寻找质量更易于控制的新的抗病毒活性物质，应用了先进的膜分离法对美洲大蠊提取物进行了活性筛选下的抗单纯疱疹病毒有效部位研究；并发现了用滤孔小于5000道尔顿（即<5KDa）的超滤膜进行分离，能得到新的抗单纯疱疹病毒活性部位。其产率比用大孔树脂法得到提高，且质量控制更为精准。查新结果显示，以往均无由美洲大蠊醇提物经膜分离法得到的提取物作为主药进行配制的药物制剂的相关报道，更无运用此活性物质于防治病毒感染疾病的文献报道。从而构成本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种从蟑螂中提取的分子量小于5000道尔顿（<5KDa）的活性物质有效部位；

本发明的另一目的是提供一种制备蟑螂中分子量<5KDa的活性物质有效部位的方法；

本发明的另一目的是提供了从蟑螂中提取的分子量<5KDa的活性物质有效部位用于制备防治单纯疱疹病毒感染类疾病药物、日化用品和/或医疗器械的用途；

本发明的又一目的是提供了一种含有从蟑螂中提取的分子量<5KDa的活性物质有效部位用于制备防治单纯疱疹病毒感染的多种制剂形式，包括水凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂。

根据本发明人深入的研究，发现蟑螂的抗病毒活性成分可以通过工艺优化得到富集，本发明人采用水或水醇溶剂提取得到的美洲大蠊醇提物辅以孔径大小一定的超滤膜进行超滤，得到分子量小于5000道尔顿的有效部位（<5KDa部位）。具体而言，本发明中美洲大蠊具抗单纯疱疹病毒活性的有效部位提取物的制备方法如下：用水或有机溶剂和缓冲溶剂提取经粉碎或未粉碎的美洲大蠊虫体，浓缩提取回收溶剂，特定浓缩比/特定转速和pH值下进行超滤膜分离纯化；得到的分子量小于5KDa的多肽类活性有效部位经减压浓缩至无醇味，减压浓缩或冷冻干燥，粉碎得产品。

本发明中的动物药材可以是蟑螂任一部位，即可以是美洲大蠊（Periplaneta americana）头、身、翅，也可以是它们的混合物，优选全虫。可以是干燥全虫，也可以是未经干燥的全虫或活体全虫。

本发明得到的美洲大蠊醇提物经超滤膜分离得到的分子量小于5KDa的多肽类有效部位具有重要的生物活性，体外具有明显的抑制单纯疱疹病毒（HSV-1和HSV-2）感染的Vero细胞载体复制活性。其抑制单纯疱疹病毒的活性高于粗提物，并略优于ZL 200810060885.9专利中公开的由大孔树脂制备得到的美洲大蠊醇提物有效部位（I-60与II-60）的抗单纯疱疹病毒活性；而根据本发明的制备方法制备<5KDa部位的收率为I-60的2倍多，为II-60的6倍。急性毒性试验进一步证实，ICR小鼠口服该有效部位具有相当的安全性。以上说明本发明所提供的以超滤膜分离制备方法得到分子量小于5000道尔顿的多肽类有效部位与现有技术相比，具有开发成为创新型抗病毒天然药物的新颖性及巨大潜力，据此完成本发明。

美洲大蠊醇提物经超滤膜分离得到的分子量小于5KDa的多肽类有效部位可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有抗病毒功效的水凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。

本发明的美洲大蠊醇提物经超滤膜分离得到的分子量小于5KDa的多肽类有效部位或其可药用盐还可以与现已上市的治疗单纯疱疹病毒感染的常用药物联合或交叉使用，制备得到具有治疗单纯疱疹病毒感染、口腔溃疡的组合物或复方制剂。可组合的药剂例子包括阿昔络韦（ACV）及其衍生物伐昔洛韦（万乃洛韦，VCV）、泛昔络韦（FCV）、喷昔洛韦（PCV）、阿糖腺苷（ara-T）、溴乙烯去氧鸟苷（BVDU）、膦甲酸（PFA）、更昔络韦（GCV），还有人白细胞干扰素等。此外，其还可以与神经痛镇痛药物以及解热镇痛药物合并用药。

本发明的有益之处在于：本发明使用超滤膜分离法制备出美洲大蠊醇提物中分子量小于5KDa的多肽类有效部位，其原料来源方便易得、制备步骤简便、利于产业化。超滤膜分离法产率较用大孔树脂法大大提高，能有效降低生产成本，得到的产物具有显著的抑制HSV-1、HSV-2病毒的药效活性，对于开发市场广大的抑制病毒感染类疾病药物、日化用品、医疗器械提供了新的物质基础，通过规范化养殖蟑螂又能给连片特困地区的农民增加收入、脱贫，具有潜在的社会效益和经济效益。

具体实施方案

为了更好地理解本发明的实质，下面分别用超滤膜分离法富集美洲大蠊醇提物中分子量小于5KDa的多肽类有效部位的实施例及对单纯疱疹病毒HSV-1和HSV-2抑制作用的药理实验结果，说明其在抗单纯疱疹病毒、抑制口腔溃疡、防治生殖器疱疹领域中的新用途。本发明人还测试了其对Vero细胞的半数细胞毒活性数据TD50，用以说明该化合物的毒性，从而评价其治疗指数（TI），并采用该活性物质（<5KDa有效部位）进行了ICR小鼠的口服灌胃急性毒性试验，说明该有效部位对动物的毒性，由此来反映在人体使用时的安全性。若无特别说明，本发明的百分比指的是重量百分比。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：美洲大蠊水提物经超滤膜分离法富集分子量小于5KDa的多肽类有效部位（样品A）的制备

1.1美洲大蠊水提物的制备

美洲大蠊药材3公斤，加双蒸水10000毫升，45°C浸泡提取1次，24小时；50°C浸泡提取1次，24小时；55°C浸泡提取1次，24小时。合并提取液，减压浓缩至干，真空干燥，即得美洲大蠊水提物。

1.2采用5KDa超滤膜过滤正交试验制备样品A

经对影响膜分离效果的因素进行单因素试验，确定影响因素是转速、时间、pH值、浓缩比，并最终确定影响因素范围。根据单因素实验结果，设计正交实验方案，确定最佳工艺。

1.2.1不同pH值对超滤效果的影响

将1.2项下制备得到的美洲大蠊水提物溶解，采用一定浓度的氢氧化钠或盐酸溶液调节其pH值分别为8、9、10和11四个梯度，浓度为0.3毫克/毫升（mg/mL），转速为2500转/分钟（r/min），时间分别为10、20、30、40、50和60分钟（min）、考察对超滤效果的影响。

1.2.2不同浓缩比对超滤效果的影响

将1.2项下制备得到的美洲大蠊水提物溶解，采用不同量溶解，使其浓缩比分别为0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL四个梯度，转速为2500r/min，pH值为9，时间分别为10、20、30、40、50和60min、考察对超滤效果的影响。

1.2.3不同转速对超滤效果的影响

将1.2项下制备得到的美洲大蠊水提物溶解，使其转速分别为1500、2500、3500和4500r/min四个梯度，浓度为0.3mg/mL，pH值为9，时间分别为10、20、30、40、50和60min、考察对超滤效果的影响。

1.2.4不同时间对超滤效果的影响

将1.2项下制备得到的美洲大蠊水提物溶解，使其时间分别为10、20、30、40、50和60min六个梯度，浓度为0.3mg/mL，pH值为9，转速为2500r/min，考察对超滤效果的影响。

通过以上单因素试验，确定其主要影响因素及其范围分别是：浓缩比（0.2、0.3和0.4mg/mL）、转速（2500、3500和4500r/min）和pH值（9、10和11）。

1.2.5用三因素三水平正交实验验证出最佳提取参数

通过三因素三水平正交实验，推断出超滤提取最佳组合是：转速4500r/min、pH=11和浓度为0.3mg/mL。

1.2.6分子量<5KDa多肽样品制备

美洲大蠊水提物300毫克，用水1000毫升溶解；调制其pH值为11后，倾入置有孔径为5KDa的超滤膜的超滤装置中，以4500r/min转速超滤30分钟。滤液真空干燥，即得分子量<5KDa多肽样品（65毫克），收率：21.7%。

1.2.7SDS-PAGE电泳检测样品A的分子量

部分仪器与试剂：三羟甲基氨基甲烷(Tris)：Solarbio公司；十二烷基硫酸钠(SDS)：Sigma公司；甘氨酸：Solarbio公司；丙烯酰胺：Amresco公司；N,N′-亚甲基双丙烯酰胺：Amresco公司；TEMED：Bio Basic Inc.公司；N-三羟甲基甲基甘氨酸(Tricine)：Solarbio公司；β-巯基乙醇：Bio Basic Inc.公司；溴酚蓝：生工生物工程（上海）有限公司；超低分子量标准蛋白标记(Marker，3.3-20.1KDa)：Solarbio公司；考马斯亮蓝G-250：Solarbio公司；考马斯亮蓝R-250：Solarbio公司；3-(环己胺)-1-丙磺酸钠(CAPS）：Solarbio公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF）：Solarbio公司；HD-3型紫外检测仪：上海沪西分析仪器厂有限公司；HD-A型电脑采集器：上海沪西分析仪器厂有限公司；QL-866型旋涡混合器：海门其林贝尔仪器制造有限公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell电泳系统：Bio-Rad公司；TS-1型脱色摇床：海门其林贝尔仪器制造有限公司；In Genius LHR型凝胶成像分析系统：Gene公司。

采用SDS-PAGE法，双垂直电泳槽，分离胶的质量分数为15%，浓缩胶的质量分数为3.5%，供试品上样量为10微升，浓缩胶电压为10mA，分离胶电压为20mA。采用考马斯亮蓝染色法。与标准低分子量蛋白质marker比较，确认由上述方法制备而得的美洲大蠊水提物超滤膜分离后得到的样品95%以上为分子量<5KDa的物质。

1.2.8SDS-PAGE电泳检测样品A的性质

采用Folin-酚试剂法（Lowry法）测定样品A中蛋白质的含量为65%。将样品A按照标准方法水解后与标准氨基酸以HPLC法比对后确定，该分子量<5KDa多肽样品由17种常见氨基酸组成。

1.3与用D-101大孔树脂法得到的活性部位之收率比较

1.3.1按照专利ZL200810060885.9公开的内容制备样品B

（1）美洲大蠊药材3公斤，加55％乙醇10000毫升，室温浸泡提取，提取3次，每次24小时。合并提取液，减压浓缩至干，真空干燥，即得美洲大蠊醇提物。（2）取得到的美洲大蠊醇提物20克，用30克D-101大孔吸附树脂吸附拌样，上200克D-101大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至无色，续用30％乙醇-水溶液洗脱至无色，取洗脱液10毫升减压浓缩至干，冷冻真空干燥，即得提取物（II-30）[美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附树脂柱层析30％醇洗液]；续用60％乙醇–水溶液洗脱至无色，取洗脱液10毫升减压浓缩至干，冷冻真空干燥，得提取物（II-60）[美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附树脂柱层析60％醇洗液]，即样品B。

1.3.2样品B收率

将上述方法制备得到的提取物II-30与II-60称重，分别为2.96克和724.9毫克。针对美洲大蠊醇提物20克而言，提取物II-60（即样品B）的收率为3.6%。而按照本实施例之超滤膜法，300毫克美洲大蠊粗提物经超滤膜操作后得到65毫克有效部位，收率为21.7%；显而易见，以超滤膜法进行对多肽部位的富集，损失小，收率大大提高（为大孔树脂方法制备得到的样品之6倍）。

1.4与用D-101大孔树脂法得到的活性部位的分子量之比较

1.4.1将上述1.3项制备得到的样品B（II-60[美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附树脂柱层析60％醇洗液]）按照本实施例1.2.7项所描述之SDS-PAGE电泳法检测分子量，以超低分子量标准蛋白Marker（3.3-20.1KDa）为对照，可知样品B中分子量<5KDa的物质占52%；而5-15KDa者为38%；>15KDa者占10%。与美洲大蠊水提物超滤膜分离后得到的有效部位样品95%以上为分子量<5KDa的物质相比，用D-101大孔树脂法得到的活性部位分子量分布较为分散，质量控制上不如用超滤膜方法得到的分子量集中的多肽部位容易受到控制。

实施例2：美洲大蠊醇提物经超滤膜分离法富集分子量小于5KDa的多肽类有效部位（样品C）的制备

2.1美洲大蠊醇提物的制备

美洲大蠊药材3公斤，加55％乙醇10000毫升，室温浸泡提取，提取3次，每次24小时。合并提取液，减压浓缩至干，真空干燥，即得美洲大蠊醇提物。

2.2分子量<5KDa多肽活性物质（样品C）的制备

依照实施例1中正交试验优选出的提取参数，取2.1制备得到的美洲大蠊醇提物300毫克，用温水1000毫升溶解；调制其pH值为11后，倾入置有孔径为5KDa的超滤膜的超滤装置中，以4500rpm转速超滤30分钟。滤液真空干燥，即得分子量<5KDa多肽样品（69毫克），收率：23%。

2.3SDS-PAGE电泳检测样品C的分子量

仪器与试剂：同实施例1。采用SDS-PAGE法，双垂直电泳槽，分离胶的质量分数为15%，浓缩胶的质量分数为3.5%，供试品上样量为10微升，浓缩胶电压为10mA，分离胶电压为20mA。采用考马斯亮蓝染色法。与标准低分子量蛋白质marker比较，确认由2.2方法制备而得的样品C其93%以上为分子量<5KDa的物质。

2.4SDS-PAGE电泳检测样品C的性质

采用Folin-酚试剂法（Lowry法）测定2.2方法所制备出之样品C中蛋白质的含量为66%。将样品C按照标准方法水解后与标准氨基酸以HPLC法比对后确定，该分子量<5KDa多肽样品由17种常见氨基酸组成。

实施例3：美洲大蠊丙酮-水提物经超滤膜分离法富集分子量小于5KDa的多肽类有效部位（样品D）的制备

3.1美洲大蠊丙酮-水提物的制备

美洲大蠊药材3公斤，加70％丙酮水溶液10000毫升，室温浸泡提取，提取3次，每次24小时。合并提取液，减压浓缩至干，真空干燥，即得美洲大蠊丙酮-水提物。

3.2分子量<5KDa多肽样品（样品D）的制备

依照实施例1中正交试验优选出的提取参数，取2.1制备得到的美洲大蠊丙酮-水提物300毫克，用温水1000毫升溶解；调制其pH值为11后，倾入置有孔径为5KDa的超滤膜的超滤装置中，以4500rpm转速超滤30分钟。滤液真空干燥，即得分子量<5KDa多肽样品（67毫克），收率为22.3%。

3.3SDS-PAGE电泳检测样品D的分子量

仪器与试剂：同实施例1。采用SDS-PAGE法，双垂直电泳槽，分离胶的质量分数为15%，浓缩胶的质量分数为3.5%，供试品上样量为10微升，浓缩胶电压为10mA，分离胶电压为20mA。采用考马斯亮蓝染色法。与标准低分子量蛋白质marker比较，确认由3.2方法制备而得的样品D其90%以上为分子量<5KDa的物质。

3.4SDS-PAGE电泳检测样品D的性质

采用Folin-酚试剂法（Lowry法）测定3.2方法所制备的样品D中蛋白质的含量为61%。将样品D按照标准方法水解后与标准氨基酸以HPLC法比对后确定，该分子量<5KDa多肽样品由17种常见氨基酸组成。

实施例4：微量细胞病变抑制（CPE）法研究从美洲大蠊提取的各种样品对单纯疱疹病毒HSV-2的抑制作用

4.1实验目的

以HSV-2病毒感染的Vero细胞为模型，筛选抗单纯疱疹病毒药物，其中样品来自实施例1-3中制得的四种样品（样品A：1.2.6所述之美洲大蠊水提物经超滤膜制备的分子量<5KDa多肽样品；样品B：1.3.1所述之美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附树脂柱层析60％醇洗液（II-60）；样品C：实施例2中制得的美洲大蠊醇提物中分子量<5KDa多肽样品；样品D：实施例3中制得的美洲大蠊丙酮-水提物中分子量<5KDa多肽样品）。

4.2材料和仪器

4.2.1病毒和细胞

4.2.1.1病毒：HSV-2病毒由南通市疾控中心提供；

4.2.1.2细胞：Vero细胞购自中科院上海细胞生物学研究所。

4.2.2试剂

4.2.2.1RPMI 1640培养基：Gibco公司产品；

4.2.2.2L-谷胺酰氨：AMRESCO产品，上海生工生物工程技术服务有限公司分装；

4.2.2.3MTT：AMRESCO产品，上海生工生物工程技术服务有限公司分装；

4.2.2.4胎牛血清：Gibco公司产品；

4.2.2.5青霉素钠：江西东风药业股份有限公司产品；

4.2.2.6硫酸链霉素：华北制药股份有限公司产品；

4.2.2.7阳性对照药：阿昔洛韦（ACV），湖北科益药业股份有限公司，0.25克/支。

4.2.3仪器

4.2.3.1CO₂培养箱：美国Shellab公司产品；

4.2.3.2XD-2倒置显微镜：重庆光电仪器有限公司产品；

4.2.3.3生物安全柜：美国LABCONCO公司产品；

4.2.3.4Synergy HT酶标仪：美国BIO-TEK公司产品；

4.2.3.5LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂产品。

4.3方法

4.3.1病毒毒力测定：在长成单层的细胞中加入10倍连续倍比稀释的病毒液，从10^-1到10^-9等共9个浓度，在37℃、5％二氧化碳、100％相对湿度条件下培养48小时，然后用MTT法比色，测定病毒的毒力，以TCID₅₀表示。

4.3.2样品毒性测定：用培养基将药物连续稀释成4个浓度（200微克/毫升，100微克/毫升，10微克/毫升，1微克/毫升），分别加入细胞已长成单层的96孔培养板中，每孔200微升，置于37℃、5％二氧化碳、100％相对湿度的培养箱中培养，培养72小时后用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]法测定样品对细胞的毒性，计算半数中毒浓度（TD₅₀）。

4.3.3细胞病变抑制法测定样品对病毒生长抑制作用：细胞接种96孔培养板，37℃、5％二氧化碳、100％相对湿度培养24小时，加入2×100TCID₅₀的病毒100微升，吸附2小时，倾出病毒，分别加入最大浓度为无毒浓度的不同浓度样品，每浓度3孔，同时设正常细胞对照和病毒感染对照，37℃、5％二氧化碳、100％相对湿度培养72小时后在倒置显微镜下观察细胞病变。以五级标准作为判断细胞病变的标准：“－”指细胞无变化，分值为8分；“＋”指25％以下细胞出现病变，分值为6分；“＋＋”指25％～50％细胞出现病变，分值为4分；“＋＋＋”指50％～75％细胞出现病变，分值为2分；“＋＋＋＋”指75％以上细胞出现病变，分值为0分。计算半数抑制浓度（IC₅₀），同时用阿昔洛韦（ACV）作为阳性对照药。计算样品治疗指数：TI＝半数中毒浓度(TD₅₀)/半数抑制浓度（IC₅₀）。

4.4实验结果

样品A-D及阳性对照药物阿昔洛韦对HSV-2复制的半数抑制浓度和治疗指数如表一所示。

表一.样品A-D及阳性对照药物阿昔洛韦对HSV-2的抑制作用

注:TD₅₀：样品对细胞生长的半数抑制浓度(微克/毫升)；IC₅₀：样品对病毒复制的半数抑制浓度(微克/毫升)；TI：治疗指数，TI=TD₅₀/IC₅₀。

4.5结论

上述试验结果说明，美洲大蠊水提物经超滤膜制备的分子量<5KDa多肽样品（样品A）、美洲大蠊醇提物中分子量<5KDa多肽样品（样品C）、美洲大蠊丙酮-水提物中分子量<5KDa多肽样品（样品D）对II型单纯疱疹病毒HSV-2有强效的的抑制作用，且三者对HSV-2的抑制强度略优于美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附树脂柱层析60％醇洗液（样品B），而其治疗指数则明显高于样品B；说明美洲大蠊中抑制单纯疱疹病毒HSV-2的有效成分极可能集中在分子量<5KDa多肽样品范围中，从而可以预期其进一步开发成为治疗生殖器疱疹疾病的天然药物，或与已上市之治疗HSV-2病毒感染药物联合使用。

根据实施例1-3中对<5KDa多肽样品及大孔树脂制备的样品之收率和质量控制难易程度等可知：用超滤法对水或有机溶剂提取的美洲大蠊提取物中分子量<5KDa多肽样品比D-101大孔树脂提取的抗HSV-2活性部位的抑制活性强、收率更高，有效克服了D-101大孔树脂提取物质量控制不易的难题，从而具有显著的优越性。此说明用超滤法制备的美洲大蠊提取物中分子量<5KDa多肽样品更有希望发展成为质量可控、安全有效的抗HSV-2和防治生殖器疱疹病毒的药品、日化用品和/或医疗器械。

实施例5：微量细胞病变抑制（CPE）法研究从美洲大蠊中制备得到的各样品对HSV-1的抑制作用

5.1实验目的

以HSV-1病毒感染的Vero细胞为模型，筛选抗HSV药物，其中样品来自实施例1-3中制得的四种样品（样品A：1.2.6所述之美洲大蠊水提物经超滤膜制备的分子量<5KDa多肽样品；样品B：1.3.1所述之美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附树脂柱层析60％醇洗液（II-60）；样品C：实施例2中制得的美洲大蠊醇提物中分子量<5KDa多肽样品；样品D：实施例3中制得的美洲大蠊丙酮-水提物中分子量<5KDa多肽样品）。

5.2细胞培养和病毒传代：

5.2.1HSV-1病毒由南通市疾控中心提供；材料和仪器：同实施例4。

5.3实验方法：

5.3.1采用MTT法测定样品A-D及阳性对照对Vero细胞生长的抑制作用

（1）将Vero细胞培养于含10%灭活小牛血清、100U/毫升青霉素和100微克/毫升的RPMI 1640培养基中，置37℃、5％二氧化碳、100％相对湿度的培养箱中培养。将HSV-1加入长有的Vero的细胞瓶中，置37℃、5％二氧化碳、100％相对湿度的培养箱中培养，收集培养上清，置低温下保存。

（2）取对数生长期的Vero细胞，用培养基将细胞稀释成1×10⁵/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37℃、5％二氧化碳、100％相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的实施例1-3制备得到的样品A-D及阳性对照阿昔洛韦（ACV），浓度分别为400微克/毫升，200微克/毫升，40微克/毫升和8微克/毫升。置于培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入MTT试剂10微升，继续培养4小时，弃去培养基，每孔加入二甲亚砜200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD值，以只加培养基的培养孔为空白对照。实验重复三次，根据不同浓度下对细胞生长的抑制率，计算对细胞生长的半数中毒浓度（TD₅₀）。

抑制率(%)=（空白对照OD值-实验组OD值）/空白对照OD值×100%。

5.3.2用微量细胞病变抑制法测定样品对病毒生长抑制作用：

取对数生长期的Vero细胞，用培养基将细胞稀释成1×10⁵/毫升，接种于96孔细胞培养板，37℃，5％二氧化碳，100％相对湿度培养24小时，加入100TCID₅₀的病毒100微升，倾出病毒，分别加入最大浓度为无毒浓度的不同浓度的实施例1-3制备得到的样品A-D，同时设正常细胞对照和病毒感染对照，37℃，5％二氧化碳，100％相对湿度培养48小时后在倒置显微镜下观察细胞病变。以五级标准作为判断细胞病变的标准，－：细胞无变化，分值为8分；＋：25％以下细胞出现病变，分值为6分；＋＋：25％～50％细胞出现病变，分值为4分；＋＋＋：50％～75％细胞出现病变，分值为2分；＋＋＋＋：75％以上细胞出现病变，分值为0分。计算半数抑制浓度（IC₅₀），同时用阿昔洛韦作为阳性对照药。计算样品治疗指数：TI＝半数中毒浓度(TD₅₀)/半数抑制浓度（IC₅₀）。

5.4实验结果：

实施例1-3制备得到的样品A-D均能显著抑制HSV-1的复制，其对HSV-1的半数抑制浓度和治疗指数如表二所示。

表二.样品A-D及阳性对照药物阿昔洛韦对HSV-1的抑制作用

5.5结论

上述试验结果说明，美洲大蠊水提物经超滤膜制备的分子量<5KDa多肽样品（样品A）、美洲大蠊醇提物中分子量<5KDa多肽样品（样品C）、美洲大蠊丙酮-水提物中分子量<5KDa多肽样品（样品D）对I型单纯疱疹病毒HSV-1有确切的抑制作用，且三者对HSV-1的抑制强度和治疗指数都优于美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附树脂柱层析60％醇洗液（样品B）；说明美洲大蠊中抑制HSV-1的有效成分极可能集中在分子量<5KDa多肽样品范围中。从而可以预期其进一步开发成为预防或治疗HSV-1感染类疱疹疾病和口腔溃疡的天然药物，或与已上市之治疗HSV-1病毒感染药物联合使用。

根据实施例1-3中对<5KDa多肽样品及大孔树脂制备的样品之收率和质量控制难易程度等可知：用超滤法对水或有机溶剂提取的美洲大蠊提取物中分子量<5KDa多肽样品比D-101大孔树脂提取的抗HSV-1活性部位的抑制活性强、收率更高，有效克服了D-101大孔树脂提取物质量控制不易的难题，从而具有显著的优越性。此说明用超滤法制备的美洲大蠊提取物中分子量<5KDa多肽样品更有希望发展成为质量可控、安全有效的抗HSV-1和防治HSV-1感染类疱疹和口腔溃疡的药品、日化用品和/或医疗器械。

实施例6：超滤膜分离法制备出美洲大蠊中分子量小于5KDa的多肽类有效部位的急性毒性（LD₅₀）试验

6.1实验材料：

6.1.1待试样品：实施例1中得到的超滤膜分离法制备出美洲大蠊中分子量小于5KDa的多肽类有效部位（样品A）；

6.1.2溶媒：0.5%CMC-Na；

6.1.3动物：ICR小鼠，雌雄兼用，体重19.0～20.9克，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

6.2实验方法：

6.2.1制备样品混悬液：称取样品A制成浓度为50毫克/毫升的混悬液。

6.2.2给药：将12只小鼠（雌雄各半），灌胃给予美洲大蠊分子量小于5KDa的多肽类样品混悬液；给药容积为40毫升/公斤，给药剂量为2000毫克/公斤。

6.2.3观察记录：观察并记录给药后小鼠的反应情况。

6.3实验结果：连续观察给药后10天的动物进食与活动情况，未见小鼠呈任何异常反应，未有死亡现象发生。

6.4实验结论：一般来说，治疗肿瘤药物急性毒性测试中，半数致死剂量>2.0克/公斤者一半视为毒性较小，或者基本无毒。美洲大蠊分子量小于5KDa的多肽类样品满足这一要求，所以属于低毒或基本无毒的有效部位，可以预期临床使用具有较高的安全系数。

实施例7：制备含有分子量小于5000道尔顿的蟑螂多肽抗病毒男用肛门给药凝胶推射剂

取10.0克的Carbopol-940（卡波姆940），加水约900毫升，充分浸泡使其溶胀完全。在机械搅拌下滴加10%氢氧化钠溶液适量，将其调整为pH值为7.0，再加入30克的甘露醇，0.3克的EDTA-Na，0.8克的尼泊金乙酯，搅拌至全部溶解后，放置入烧杯中，高压流通蒸汽灭菌30分钟（120℃，115Pa），室温下充分冷却，制成空白基质。另于无菌条件下取5.0克赖氨酸，加入注射用水直至溶解完全，完全溶解后，将其在搅拌条件下加入到上述空白基质中，制成混合液。然后称取按照实施例2方法制备的美洲大蠊提取物<5KDa的多肽类物质（样品C）200毫克，加入注射用水搅拌至完全溶解，在不断搅拌条件下，将多肽水溶液加入上述混合液中，调整溶液总体积为1000毫升。将其按照制剂规格要求装入注射器中，灭菌后备用。由此制成男用肛门给药推射剂。

本品以美洲大蠊提取物<5KDa的多肽类分子为主药，还可以与多种辅料配方制备出不同剂型的男用肛门推射剂水凝胶产品，并不限于本实施例所述之辅料配方。

实施例8：制备含有分子量小于5000道尔顿的蟑螂多肽抗病毒温敏性女用阴道给药凝胶推射剂

取聚卡波非500毫克、卡波莫1.0克、加入去离子水300毫升，充分浸泡使其溶胀完全。搅拌下用氢氧化钠调pH值为5.0，在机械搅拌下加入15.0克的泊洛沙姆F127、5.0克泊洛沙姆F68、3.0毫克十二烷基硫酸钠，5.0克甘油，搅拌至全部溶解后，放置入烧杯中，高压流通蒸汽灭菌30分钟（120℃，115Pa），室温下充分冷却，制成空白基质。然后称取按照实施例2方法制备的200毫克的美洲大蠊提取物<5KDa的多肽类物质（样品C），加入注射用水搅拌至完全溶解，在不断搅拌条件下，将多肽水溶液加入上述混合液中，调整溶液总体积为600毫升。将其按照制剂规格要求装入注射器中，灭菌后备用。由此制成温敏性女用阴道给药凝胶推射剂。

本品以美洲大蠊提取物<5KDa的多肽类分子为主药，还可以与多种辅料配方制备出不同剂型的温敏性女用阴道给药凝胶推射剂产品，并不限于本实施例所述之辅料配方。

实施例9：制备含有分子量小于5000道尔顿的蟑螂多肽抗病毒泡沫凝胶

取椰子油脂肪酸单乙醇酰胺12.0克、聚乙二醇1.5克，十二烷基硫酸钠3.0毫克，加去离子水500毫升，在机械搅拌下滴加氢氧化钠溶液适量，将其调整为pH值为4.3，搅拌下滴加甘油5.0克，至全部溶解后，放置入烧杯中，灭菌30分钟，室温下充分冷却。另称取按照实施例3方法制备的200毫克的美洲大蠊提取物<5KDa的多肽类物质（样品D），加入注射用水搅拌至完全溶解。在不断搅拌条件下，将该多肽水溶液加入上述已制备好的基质混合液中，调整溶液总体积为600毫升。将其按照制剂规格要求装入喷雾器中，灭菌后备用。由此制成泡沫凝胶剂。

本品以美洲大蠊提取物<5KDa的多肽类分子为主药，还可以与多种辅料配方制备出不同剂型的泡沫凝胶剂型产品，并不限于本实施例所述之辅料配方。

实施例10：制备含有分子量小于5000道尔顿的蟑螂多肽抗病毒人体可吸收外伤敷料

取5.0克的甘油、50毫克转化生长因子、3.0克止血环酸，常温下搅拌，使其溶解完全。然后称取按照实施例1方法制备的2.0克的美洲大蠊提取物<5KDa的多肽类物质（样品A），在机械搅拌下加入该溶液，超声分散10分钟。另取100毫升水中加入按照实施例1方法提取的2.0克的美洲大蠊提取物<5KDa的多肽类物质（样品A），以及7.0克聚乙烯醇、3.0克胶原，于60℃下充分搅拌使其完全溶解。将上述两种溶液在40℃下充分混合，搅拌均匀后，置入烧杯中，灭菌后迅速冷却至-20℃。完全冷却后，将得到的粘稠状物置于-80℃冷冻干燥机内，干燥48小时。取出后将其按照制剂规格要求分割包装，灭菌后备用。由此制成皮肤外用敷料。

本品以美洲大蠊提取物<5KDa的多肽类分子为主药，还可以与多种辅料配方制备出不同剂型的人体可吸收外伤敷料抗病毒产品，并不限于本实施例所述之辅料配方。

实施例11：制备含有分子量小于5000道尔顿的蟑螂多肽抗病毒巴布剂

取0.2克的酒石酸、0.2克的EDTA加入45克水中；搅拌下使其溶解，制成水相。将15.0克丙二醇、100毫克甘羟铝、5.0克聚丙烯酸钠、2.0克聚维酮K-90、1.0克交联聚维酮依次、少量多次加入甘油中，水浴加热下搅拌使其溶解完全，制成油相。然后称取按照实施例2方法制备的3.0克的美洲大蠊提取物<5KDa的多肽类物质（样品C），并在机械搅拌下加入油相中，再在油相中加入3.0克氮酮，超声分散10分钟。将上述两种溶液（水相和油相）在40℃下充分混合，搅拌均匀后，将得到的膏体均匀涂布于无纺布上，灭菌后盖上聚乙烯薄膜。剪切制成皮肤外用抗病毒巴布剂。

巴布膏剂的特征为制备使用方便、揭帖自如，本品以美洲大蠊提取物<5KDa的多肽类分子为主药。其亦可以与多种辅料配方制备出不同剂型的外用巴布膏剂抗病毒产品，并不限于本实施例所述之辅料配方。

实施例12：制备含有分子量小于5000道尔顿的蟑螂多肽抗病毒饲料添加剂

取根据实施例1的方法制得的美洲大蠊提取物<5KDa的多肽类物质（样品A）15.0克，与粉碎为20-50目的玉米200克、稻谷200克、大麦200克、小麦200克、高粱200克、麦麸100克、米糠100克、豆饼200克、豆粕100克、鱼粉50克、蚕蛹粉60克、草粉80克、贝壳粉60克、骨粉70克和食盐6克，充分混合后，制成猪用饲料。用于生猪喂养中的预防病毒感染疾病。

在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。

Claims

1.一种从蟑螂中提取的活性物质，其特征是：所述活性物质是分子量小于5000道尔顿的多肽。

2.权利要求1所述之从蟑螂中提取的活性物质用于制备防治单纯疱疹病毒感染性疾病的药物用途，其特征是：所述药物用途通过药物制剂、日化用品、医疗器械形式体现；所述单纯疱疹病毒是指I型单纯疱疹报病毒HSV-1和/或II型单纯疱疹病毒HSV-2。

3.根据权利要求2的药物用途，其特征是：所述药物制剂、日化产品、医疗器械的形式是水凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂。

4.一种制备权利要求1所述活性物质的方法，其特征是：用超滤膜分离法截取蟑螂提取物中分子量小于5000道尔顿的物质；其中蟑螂提取物是指蜚蠊科昆虫蟑螂虫体经溶剂及缓冲溶液提取而得，溶剂是指水或有机溶剂。

5.一种具有抗单纯疱疹病毒感染的药物组合物，其特征是：该药物组合物含有根据权利要求1的活性物质、药用辅料及可药用载体。