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WO2006137514A1 - シノビオリンの発現もしくは機能阻害物質を有効成分とする癌治療剤、および癌治療剤のスクリーニング方法 - Google Patents

シノビオリンの発現もしくは機能阻害物質を有効成分とする癌治療剤、および癌治療剤のスクリーニング方法 Download PDF

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Publication number
WO2006137514A1
WO2006137514A1 PCT/JP2006/312582 JP2006312582W WO2006137514A1 WO 2006137514 A1 WO2006137514 A1 WO 2006137514A1 JP 2006312582 W JP2006312582 W JP 2006312582W WO 2006137514 A1 WO2006137514 A1 WO 2006137514A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
synoviolin
compound
gene
expression
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/312582
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshihiro Nakajima
Yukihiro Kato
Tadayuki Yamadera
Tetsuya Amano
Original Assignee
Locomogene, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Locomogene, Inc. filed Critical Locomogene, Inc.
Priority to US11/993,774 priority Critical patent/US20080305102A1/en
Priority to JP2007522378A priority patent/JPWO2006137514A1/ja
Publication of WO2006137514A1 publication Critical patent/WO2006137514A1/ja

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    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints

Definitions

  • the present invention relates to a p53 protein activator comprising a synoviolin protein expression or function inhibitor as an active ingredient, a cancer therapeutic agent comprising a p53 protein activator as an active ingredient, and a method for screening a cancer therapeutic agent About.
  • the present invention also relates to an anti-rheumatic agent comprising a substance that controls self-ubiquitination of synoviolin protein as an active ingredient, and a method for screening an anti-rheumatic agent.
  • Synoviolin is a novel protein discovered as a membrane protein that is overexpressed in synovial cells derived from rheumatic patients (see Patent Document 1). Research using genetically modified animals revealed that Synoviolin is an essential molecule for the development of rheumatoid arthritis.
  • the p53 gene is located on chromosome 17 pl3 and is a very important tumor suppressor gene in the development and proliferation of cancer cells.
  • the p53 protein recognizes a specific base sequence [5 '-(A / T) GPyPyPy-3')] on DNA and promotes transcriptional activation of specific genes such as p21, GADD45, and BAX.
  • specific genes such as p21, GADD45, and BAX.
  • physiological functions such as specific binding to DNA containing mismatch are known.
  • Patent Document 1 WO02 / 052007 Disclosure of the invention
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems.
  • a detailed analysis of synoviolin homozygous animals revealed that a larger number of apoptotic cells were observed compared to the wild type, and the p53 protein, which is deeply involved in the induction of apoptosis, was localized in the nucleus. And was found to be strongly expressed. It was also found that by inhibiting the function of Synoviolin, the P53 tumor suppressor gene or p53 tumor suppressor protein is activated and the growth of cancer cells is blocked.
  • Compound X and Y increase the expression level of p53 protein by inhibiting p53 ubiquitination by Synoviolin! It is considered that it exhibits an anticancer effect. It is expected to be clinically applied as part of multidisciplinary treatment by stabilizing p53 and intensive localization in the nucleus, thereby increasing sensitivity to radiation and increasing treatment efficiency.
  • the present inventors have provided a P53 protein activator containing a substance that inhibits the expression or function of synoviolin protein, a cancer therapeutic agent containing the activator, and a method for treating the cancer therapeutic agent. Successful development of a screening method has completed the present invention.
  • the present invention relates to an activator of p53 protein, a cancer therapeutic agent containing the activator as an active ingredient, and a screening method for the cancer therapeutic agent, more specifically, [1] Synoviolin A P53 protein activator comprising, as an active ingredient, a protein expression and Z or function inhibitor,
  • a cancer therapeutic agent comprising the p53 protein activator according to any one of [1] to [7] as an active ingredient
  • a method for screening a cancer therapeutic agent comprising the following steps (a) to (c):
  • a screening method for a cancer therapeutic agent comprising the following steps (a) to (c):
  • a screening method for a therapeutic agent for cancer comprising the following steps (a) to (c):
  • a screening method for a therapeutic agent for cancer comprising the following steps (a) to (c):
  • a screening method for a therapeutic agent for cancer comprising the following steps (a) to (c):
  • a cancer therapeutic agent screening kit comprising the following (a) and (b) as components:
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising the step of administering a p53 protein activator or a cancer therapeutic agent comprising the p53 protein activator according to the present invention as an active ingredient, and the present invention.
  • a method for preventing or treating cancer comprising the step of administering a p53 protein activator or a cancer therapeutic agent comprising the p53 protein activator according to the present invention as an active ingredient, and the present invention.
  • the present inventors constructed a system for evaluating the autobiquitin ⁇ reaction of Synoviolin protein by ELISA, and obtained two low molecular weight compounds No. 32 (Compound X) and No.38 (Compound Y) proliferates rheumatoid synovial cells (RASC) at low concentrations I found it to suppress.
  • RASC rheumatoid synovial cells
  • an anti-rheumatic agent comprising a substance that controls the self-ubiquitin activity of synoviolin protein as an active ingredient and a screening method for the anti-rheumatic agent.
  • the present invention further provides
  • an anti-rheumatic agent comprising a substance having a function of controlling self-ubiquitination of synoviolin protein as an active ingredient
  • a method for screening an anti-rheumatic agent comprising the following steps (a) to (c):
  • a screening method for an anti-rheumatic agent comprising the following steps (a) to (c):
  • a screening method for an anti-rheumatic agent comprising the following steps (a) to (c):
  • the present invention provides a method for preventing or treating rheumatic diseases comprising the step of administering an anti-rheumatic agent comprising as an active ingredient a substance having a function of controlling autobiubilation of the synoviolin protein according to the present invention, and
  • the present invention provides use of a substance having a function of controlling self-ubiquitin described in the present invention in the production of an anti-rheumatic agent.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of fluorescent immunohistochemical staining in synoviolin homo knockout mouse fetal fibroblasts (MEF).
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of immunohistochemical staining with anti-p53 antibody in syno-/-embryos.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of Western blotting for p53.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of identifying the phosphorylation site of p53 in syno-/-MEF cultured cells.
  • FIG. 5 is a photograph of Western blotting investigating how Serl5 phosphorylation enhanced by siRNA treatment against Synoviolin is affected by force-fein supplementation.
  • FIG. 6 is a photograph of Western blotting showing that p53 and p21 expression is increased by siRNA treatment against Synoviolin.
  • FIG. 7 is a diagram showing the observation results of the cell cycle with a flow cytometer.
  • FIG. 8 is a photograph showing the result of immunostaining the Tissue array with an anti-sinoviolin antibody (lODa).
  • FIG. 9 is a photograph showing the result of immunostaining the Tissue array with an anti-sinoviolin antibody (lODa).
  • FIG. 10 is a photograph observing the localization of p53 in cells transfected with GFP wild type p53.
  • FIG. 11 is a photograph of GFP wild-type p53 and FLAG wild-type synoviolin co-expressed in Saos-2 cells and observing the localization of both transgene products.
  • FIG. 12 is a photograph of GFP wild type p53 and FLAG Synoviolin C307S co-expressing in Saos-2 cells and observing the localization of both transgene products.
  • FIG. 13 is a photograph showing the in vitro ubiquitination reaction of GST-p53 by MBP-Synoviolin ⁇ -His.
  • FIG. 14 is a graph showing the amount of p53 mRNA in RA synovial cells by Synoviolin RNAi.
  • FIG. 15 is a schematic diagram of the p53-binding domain deletion product produced and the results of the binding assay.
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of GST pull-down assay for p53-binding domain-deficient and 35 S-p53.
  • FIG. 17 is a diagram showing a structural formula of A: Compound X, Y.
  • B Compound X, Y p
  • FIG. 18 is a graph showing the effect of Compound X and Y on cytotoxicity.
  • FIG. 19 is a photograph showing the effect of Compound Y on the expression level of p53 protein in cultured cells.
  • FIG. 20 is a graph showing the influence of antibody concentration when detecting in vitro self-ubiquitination using ELISA.
  • FIG. 21 is a graph showing the effect of synoviolin concentration in an in vitro self-ubiquitination reaction system using ELISA.
  • FIG. 22 is a diagram showing the influence of ubiquitination reaction time on in vitro self-ubiquitination reaction using ELISA.
  • FIG. 23 is a view showing a cell growth inhibitory effect of low molecular compound No. 32.
  • FIG. 24 is a view showing a cell growth inhibitory effect of low molecular compound No. 38.
  • p53 When normal cells are exposed to ultraviolet rays or the like, the intracellular p53 is activated, and as a result, cell growth is blocked. Therefore, by increasing the concentration of p53, the growth of cancer cells can be stopped. In other words, if p53 does not function, cancer cell growth cannot be stopped and cancer progresses Will be. In fact, p53 mutations are rarely found in cells of normal individuals, but about half of the cells from cancer patients have this p53 deletion or point mutation. Even when such a mutation has not occurred, some mutation has occurred in the regulatory mechanism of p53, and the tumor suppressor function has been lost. Therefore, it is necessary to make p53 function effectively in order to suppress the progression of cancer.
  • the present inventors focused on the function of synoviolin in order to make the activity of p53 protein an effective method for cancer treatment.
  • Synoviolin homo-knockout animals were prepared and analyzed in detail. As a result, a large number of apoptotic cells were observed in comparison with the wild type. That is, it was found that inhibition of the function of synoviolin promotes the activity of the p53 protein that is deeply involved in apoptosis, and inhibition of the function of synoviolin contributes to cancer suppression.
  • the present inventors have found that the p53 protein is activated by inhibiting (suppressing) the expression and Z or function (activity) of Synoviolin protein. That is, the present invention provides a p53 protein activator comprising a synoviolin protein expression and Z or function inhibitor as an active ingredient.
  • the Synoviolin protein of the present invention is preferably a human Synoviolin protein, but the species from which it is derived is not particularly limited, and is a protein equivalent to Synoviolin in non-human organisms (Synoviolin homolog. Ortholog. Etc.) are also included in the “sinoviolin protein” in the present invention.
  • the present invention can be carried out if the organism has a protein corresponding to human p53 and has a protein equivalent to human synoviolin.
  • Organism Official name mRNA accession number Protein accession number ⁇ ⁇ Synoviolin AB024690. BAC57449 1
  • accession number in the public gene database Genbank of human Synoviolin gene is AB024690 (SEQ ID NO: 1).
  • the nucleotide sequence of a gene encoding Synoviolin in human is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the base sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Even proteins other than those described above exhibit high homology (usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more) with the sequences described in the sequence listing, for example.
  • a protein having a function of synoviolin protein for example, a function of binding to p53 protein, a function of inhibiting the activity of p53 phosphorylated protein, a function of promoting p53 ubiquitin, etc.
  • the protein is, for example, a protein having an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are added, deleted, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and the number of amino acids that usually change varies. It is within 30 amino acids, preferably within 10 amino acids, more preferably within 5 amino acids, and most preferably within 3 amino acids.
  • synoviolin gene for example, an endogenous gene in another organism corresponding to DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (homolog of human synoviolin gene, etc.) Is included.
  • the endogenous DNA of other organisms corresponding to the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 generally has high homology with the DNA set forth in SEQ ID NO: 1.
  • High homology means 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more (e.g., 95% or more, further 96%, 97%, 98% or 99% or more).
  • Homology means. This homology is determined by the mBLAST algorithm (Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
  • synoviolin protein a protein (gene) corresponding to a synoviolin protein (gene) in a non-human organism or a protein (gene) functionally equivalent to the above-mentioned synoviolin is simply referred to as “synoviolin protein. (Gene) Sometimes described as J.
  • Synoviolin protein of the present invention can be prepared not only as a natural protein but also as a recombinant protein using a gene recombination technique. Natural proteins can be prepared, for example, by a method using affinity chromatography using an antibody against synoviolin protein on a cell (tissue) extract that is thought to express synoviolin protein. is there. On the other hand, recombinant proteins can be prepared by culturing cells transformed with DNA encoding synoviolin protein. The “Synoviolin protein” of the present invention is suitably used, for example, in the screening method described below.
  • “expression” includes “transcription” from a gene or “translation” into a polypeptide and “degradation inhibition” of a protein.
  • “Expression of Synoviolin protein” means that transcription and translation of a gene encoding Synoviolin protein occurs, or Synoviolin protein is generated by these transcription and translation.
  • “Synoviolin protein function” refers to, for example, the function of synoviolin binding to p53, the function of inhibiting the activity of p53 phosphate protein, the function of promoting p53 ubiquitination, or the activity of p53 And the like.
  • inhibiting synoviolin protein expression and Z or function refers to reducing or eliminating the amount, function or activity of a wild-type synoviolin gene or protein as compared to the amount, function or activity. That means.
  • the “inhibition” includes both inhibition of both function and expression, and inhibition of either one.
  • Synoviolin promotes ubiquitination of p53, and thus inhibition of synoviolin-p53 binding can inhibit p53 ubiquitination. Moreover, by inhibiting p53 ubiquitination, P53 is activated and cancer is suppressed.
  • the "p53 protein activator" can be more specifically a drug having a function of enhancing (raising) the expression and Z or function of p53 protein.
  • Preferred examples of the inhibitor of the present invention include low molecular weight compounds.
  • a P53 protein activator containing, as an active ingredient, a low molecular weight compound that inhibits the expression and Z or function of Synoviolin protein.
  • the present inventors have found that by inhibiting the expression or function of Synoviolin protein, the ubiquitin of p53 protein is inhibited, and as a result, p53 protein is activated.
  • Ubiquitination refers to a post-translational modification reaction of a protein by ubiquitin, a protein degradation marker molecule.
  • the physiological significance of ubiquitin was previously recognized as a tag modification to be sent to the proteosomal proteolytic mechanism. In subsequent studies, the significance of ubiquitin is currently positioned as a reversible protein modification system that controls protein function.
  • E1 ubiquitin-active enzyme
  • E2 ubiquitin-conjugating enzyme
  • E3 ubiquitin ligase
  • This polyubiquitin chain is formed through the ⁇ -amino group of the 48th lysine residue in the ubiquitin molecule, and becomes a degradation signal to the 26S proteanome, leading to degradation of the target protein.
  • the present invention is characterized in that ⁇ 53 is activated by inhibiting synoviolin expression and ⁇ or function, and such ⁇ 53 activity ⁇ is independent of the above-mentioned phosphorylation mechanism of ⁇ 53. It focuses on the mechanism by which ubiquitin is inhibited.
  • Low-molecular compound that inhibits the expression and ⁇ or function of synoviolin protein in the present invention are preferably, it spoon compound having a function of inhibiting the Yubikichini spoon of [rho 53 protein.
  • the present inventors have succeeded in identifying a low molecular weight compound (Compound X, Y) that inhibits the activity of promoting ⁇ 53 ubiquitin by synoviolin.
  • Specific examples of the low molecular weight compound in the present invention include compounds represented by the following general formula (iXCompound X) or general formula (II) (Compound Y) identified by the present inventors.
  • the compounds represented by the above general formulas (I) and (II) can be obtained from Namiki Shoji (AMBINTER). (Catalog Nos. Are A0420 / 0019436 and A1328 / 0060050, respectively.) Further, the compound of the general formula (I) or (II) which is an active ingredient in the present invention is a pharmaceutically acceptable salt of the compound. It may be. Furthermore, examples include hydrates, solvates, isomers, and the like of the compounds in addition to the salts of the compounds. These compounds are also expected to have a P53 activity or tumor suppressor effect.
  • the “salt” means that it forms a salt with the compound of the present invention (the compound of general formula (I) or (II)) and is pharmacologically acceptable. It is not particularly limited, and examples thereof include inorganic acid salts, organic acid salts, inorganic base salts, organic base salts, acidic or basic amino acid salts, and the like. In the present invention, “salt” usually refers to a pharmaceutically acceptable salt.
  • Preferable inorganic acid salts include, for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate and the like.
  • Preferred examples of organic acid salts include, for example, acetate, succinate. Examples include acid salts, fumarate, maleate, tartrate, citrate, lactate, stearate, benzoate, methanesulfonate, and p-toluenesulfonate.
  • inorganic base salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts, aluminum salts, and ammonium salts.
  • organic base salt include, for example, a jetylamine salt, a diethanolamine salt, a meglumine salt, N, N, monodibenzylethylenediamine salt and the like.
  • Preferred examples of the acidic amino acid salt include aspartate and glutamate.
  • Preferable examples of the basic amino acid salt include arginine salt, lysine salt, and ortine salt.
  • Isolation and purification of the compound according to the present invention can be carried out by applying ordinary chemical operations such as extraction, concentration, distillation, crystallization, filtration, recrystallization, and various chromatography.
  • the structural formula of a compound may represent a certain isomer for convenience, but in the present invention, all geometrical isomers generated in the structure of the compound, optical differences based on asymmetric carbons. Isomers such as isomers, stereoisomers and tautomers, and mixtures of isomers, and are not limited to the description of the formula for convenience, and may be any one isomer or mixture. Therefore, the compound of the present invention may have an asymmetric carbon atom in the molecule, and an optically active substance and a racemate may exist. However, the present invention is not limited and includes both.
  • various isomers for example, geometric isomers, optical isomers based on asymmetric carbon, rotational isomers, stereoisomers, tautomers, etc.
  • Purified and isolated using conventional separation means such as recrystallization, diastereomeric salt method, enzyme resolution method, various chromatographies (eg thin layer chromatography, column chromatography, gas chromatography, etc.) Can do.
  • synoviolin has a function of binding to p53 and inhibiting the function of p53. That is, by inhibiting the expression and Z or function of Synoviolin, the binding of Synoviolin and p53 is inhibited, and the function of p53 is activated.
  • the low molecular weight compound that inhibits the expression and Z or function of Synoviolin protein in the present invention is preferably a compound having a function of inhibiting the binding (interaction) between Synoviolin protein and p53 protein.
  • p53 binding domain of Synoviolin protein for example, several types of p53 binding domain deletion forms in which a specific region of the amino acid sequence of Synoviolin has been deleted were prepared, and 35 S-p53 was subjected to GST pull-down assay. Can be determined by Specifically, the P53 binding domain deletion form of Synoviolin is expressed in E. coli as a GST-fusion protein, and protein-protein binding with 35 S-p53 protein is confirmed by the GST pull-down assay method.
  • the p53 binding domain in Synoviolin is converted into Synoviolin protein. It was found to be 35 amino acid residues from the 236th to the 270th of the contained amino acid sequence (SEQ ID NO: 2).
  • examples of the above compound include compounds that inhibit the binding to p53 by targeting the 35 amino acid region from position 236 to position 270 of the synoviolin protein.
  • the present inventors have found that by inhibiting the expression or function of Synoviolin protein, a part of the amino acid residue of p53 protein is phosphorylated by a phosphorylase and activated. It was.
  • the low molecular weight compound that inhibits the expression and Z or function of Synoviolin protein in the present invention is preferably a compound having a function of activating the p53 phosphate protein.
  • the 15th serine residue (preferably the serine residue in the amino acid sequence of p53) is the target amino acid residue of phosphate that leads to the activity of p53 protein ( Serl5) is more preferred.
  • examples of the compound include compounds having a function of increasing the activity of a phosphoprotein using a serine residue at position 15 of p53 as a substrate.
  • ATR is a member of the ATM family, but it is induced by a wide range of chemotherapeutic drugs, UV irradiation, or inhibition of protein phosphate enzymes and is involved in the activity of p53 that does not involve ATM It is a phosphate enzyme.
  • the functions of ATM and ATR are known to be inhibited by caffeine.
  • caffeine is used in experiments for inhibiting synoviolin expression and / or function.
  • Synoviolin was found to modulate ATM and ATR activity. That is, p53 is activated when the expression and / or function of Synoviolin is inhibited in the absence of caffeine.
  • inhibition of synoviolin expression and / or function in the presence of caffeine suppresses the activity of p53. It is also known that caffeine inhibits ATM and ATR activity (p53 phosphorylation).
  • Inhibiting the expression and / or function of Synoviolin by inhibiting the activity of ATM and ATR by caffeine does not activate P53. Therefore, the expression and / or function of Synoviolin Inhibition of p53 induces p53 activity by ATM and ATR. Then, it can be said that the activity of these phosphate enzymes is enhanced by inhibiting the expression and / or function of Synoviolin. Therefore, the present invention is characterized in that the activation of phosphorylase is promoted by inhibiting the expression and / or function of Synoviolin.
  • the enzyme having the same activity as ATM and ATR (such as an enzyme that phosphorylates p53) may be DNA-PK or GSK3 ⁇ .
  • the “ ⁇ 53 phosphate protein” is not particularly limited as long as it can be phosphorylated using ⁇ 53 as a substrate, but usually refers to ATM, ATR, DNA-PK, GS K3 ⁇ , etc. More preferred is ATM or ATR.
  • p21 functions as an inhibitor of cyclin-dependent kinase (CDK) activity, and is a protein responsible for cell cycle regulation by inhibiting CDK activity.
  • CDK plays a key role in the suppression of the cell cycle and works with its partner cyclin protein.
  • the G1 phase force which is the resting state of the cell, controls the smooth transition to the S phase, which is the DNA replication phase.
  • S phase which is the DNA replication phase.
  • the present invention suppresses cancer by inhibiting the expression and / or function of Synoviolin, thereby increasing the activation of p53, inducing the expression of p21, and causing the inhibition of CDK. It is characterized by that.
  • the low molecular weight compound in the present invention may be either a naturally derived compound or an artificially synthesized compound. Usually, it is a compound that can be produced or obtained by using methods known to those skilled in the art. Further, the compound of the present invention has a script described below. It is also possible to obtain it by means of a pinning method.
  • examples of the Synoviolin protein expression and Z or function inhibitor in the present invention include the following compounds (a) or (b).
  • Antibodies that bind to Synoviolin protein and Z or P53 protein can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a polyclonal antibody can be obtained as follows. Recombinant (recombinant) synoviolin protein and Z or P53 protein, or partial peptides expressed in natural microorganisms such as E. coli as a fusion protein with natural synoporin protein and Z or P53 protein or GST Serum is obtained by immunizing small animals such as rabbits. This is prepared by, for example, purification using ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, synoviolin protein and / or affinity column coupled with p53 protein or synthetic peptide. To do.
  • a monoclonal antibody for example, a small animal such as a mouse is immunized with Synoviolin protein and Z or P53 protein or a partial peptide thereof, and the spleen is removed from the mouse and ground to isolate cells. Then, the cells and mouse myeloma cells are fused using a reagent such as polyethylene glycol to produce antibodies that bind to synoviolin protein and Z or P53 protein from the resulting fused cells (hybridoma). Select a clone.
  • a reagent such as polyethylene glycol
  • the obtained iridoma was transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites was collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody was purified by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, synovi. Orintanpaku matter and / or P 53 protein or the synthetic peptides purification by coupling the ⁇ Fiyu tea column, etc., can be prepared.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it binds to the Synoviolin protein and Z or P53 protein of the present invention.
  • a human antibody, a humanized antibody by genetic recombination, and further an antibody fragment thereof may be an antibody modification product.
  • the antibody is preferably an antibody that recognizes amino acids 236 to 270 of the synoviolin protein involved in binding to p53. The antibody is expected to effectively inhibit the binding between Synoviolin and P53.
  • the synoviolin protein and Z or p53 protein of the present invention used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is not limited by the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal such as a mouse or a human. Especially preferred are human-derived proteins.
  • a human-derived protein can be appropriately obtained by those skilled in the art using the gene sequence or amino acid sequence disclosed in the present specification.
  • the protein used as the sensitizing antigen may be a complete protein or a partial peptide of the protein.
  • the partial peptide of the protein include an amino group (N) terminal fragment and a carboxy (C) terminal fragment of the protein.
  • antibody means an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein.
  • human lymphocytes such as human lymphocytes infected with EB virus are sensitized in vitro with proteins, protein-expressing cells or lysates thereof. And fusion of sensitized lymphocytes with human-derived permanent mitotic cells, such as U266, to produce a hyperidoma that produces the desired human antibody with protein-binding activity. .
  • a human antibody or a humanized antibody is preferred in order to reduce immunogenicity.
  • Synoviolin protein mutant (Synoviolin dominant negative protein) having a dominant negative property with respect to Synoviolin protein can be mentioned. It can.
  • Synoviolin protein with dominant negative properties for Synoviolin protein ⁇ Quality mutant '' refers to a protein having a function of eliminating or reducing the activity of an endogenous wild-type protein by expressing a gene encoding the protein.
  • Synoviolin dominant negative protein examples include Synoviolin protein mutants that competitively inhibit the binding to p53 with wild-type Synoviolin. More specifically, a partial fragment peptide of Synoviolin protein containing a binding domain with p53 can be mentioned. A fragment peptide comprising the amino acid region of positions 236 to 270 in the amino acid sequence of Synoviolin protein is a preferred example of the dominant negative protein.
  • the substance that inhibits the expression and Z or function of Synoviolin protein includes, for example, a substance that inhibits transcription of Synoviolin gene or translation of the transcription product force.
  • a compound (nucleic acid) selected from the group consisting of the following (a) to (c) can be mentioned.
  • Nucleic acid in the present invention means RNA or DNA.
  • Chemically synthesized nucleic acid analogs such as so-called PNA (peptide nucleic acid) are also included in the nucleic acid of the present invention.
  • PNA peptide nucleic acid
  • PNA replaces the pentose / phosphate skeleton, which is the basic skeleton structure of nucleic acid, with a polyamide skeleton with glycine as a unit, and has a three-dimensional structure very similar to nucleic acid.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • antisense nucleic acids inhibit the expression of target genes by inhibiting various processes such as transcription, splicing or translation (Hirashima and Inoue, Shinsei Kagaku Kenkyusho 2 Nucleic acid IV gene replication and expression, Japan Biochemical Society, Tokyo Chemical Doujin, 1993, 319-347.).
  • the antisense nucleic acid used in the present invention may inhibit the expression and Z or function of the Synoviolin gene by any of the above-mentioned actions.
  • an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the Synoviolin gene mRNA is designed, it is considered effective for inhibiting translation of the gene.
  • a sequence complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used.
  • the nucleic acid containing the antisense sequence of the sequence of the untranslated region connected only by the translated region of the Synoviolin gene is also included in the antisense nucleic acid used in the present invention.
  • the antisense nucleic acid used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
  • the nucleic acid thus prepared can be transformed into a desired animal (cell) using a known method.
  • the sequence of the antisense nucleic acid is preferably a sequence complementary to the endogenous synoviolin gene or a part thereof possessed by the animal (cell) to be transformed. However, as long as the gene expression can be effectively suppressed, It does not have to be complementary to.
  • the transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, most preferably 95% or more, to the transcript of the target gene.
  • the length of the antisense nucleic acid is preferably at least 15 bases and less than 25 bases.
  • the antisense nucleic acid is not necessarily limited to this length, and may be, for example, 100 bases or more, or 500 bases or more.
  • the antisense nucleic acid of the present invention is not particularly limited, but is based on, for example, the base sequence of the synoviolin gene (SEQ ID NO: 1) obtained with GenBank accession number AB024690. Can be created.
  • Ribozyme refers to an RNA molecule that has catalytic activity.
  • research focused on ribozymes as enzymes that cleave RNA has enabled the design of ribozymes that cleave RNA in a site-specific manner.
  • Some ribozymes have a size of 400 nucleotides or more, such as the group I intron type and Ml RNA contained in RNase P, but the hammerhead type has an active domain of about 40 nucleotides called the hairpin type. (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, protein nucleic acid enzyme, 1990, 35, 2191.).
  • the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme has the ability to cleave the 3 'side of C15 in the sequence G13U14C15.
  • base pairing between U14 and A9 is important. It has been shown that A15 or U15 can also be cleaved (Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.) 0 Designing a ribozyme whose substrate binding site is complementary to the RNA sequence near the target site
  • a restriction enzyme-like RNA cleavage ribozyme that recognizes the sequence UC, UU, or UA in the target RNA can be generated (Koizumi, M.
  • Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention.
  • This ribozyme is found, for example, in the minus strand of satellite RNA of tobacco ring spot virus (Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.). It has been shown that target-specific RNA cleavage ribozymes can also be generated from hairpin ribozymes (Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751., Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology, 1992, 30, 112.). In this way, expression of the gene can be inhibited by specifically cleaving the synoviolin gene transcript in the present invention using a ribozyme.
  • RNA interference RNA interference
  • double-stranded RNA having the same or similar sequence as the target gene sequence. It can be carried out.
  • RNAi is a sense RNA that has a sequence power that is homologous to the mRNA of the target gene, a complementary double-stranded antisense RNA, and a short double-stranded RNA that is powerful (hereinafter abbreviated as “dsRNA”). This is a phenomenon that induces destruction by specifically and selectively binding to the target gene mRNA, and efficiently inhibiting (suppressing) the expression of the target gene by cleaving the target gene.
  • RNAi when dsRNA is introduced into a cell, the expression of the gene homologous to the RNA is suppressed (knocked down). Since RNAi can suppress the expression of target genes in this way, it can be applied as a simple gene knockout method instead of the conventional complicated and low-efficiency gene disruption method by homologous recombination, or for gene therapy. It is attracting attention as a method.
  • the RNA used for RNAi does not necessarily need to be completely identical to the Synoviolin gene or a partial region of the gene, but it is preferable that the RNA has perfect homology.
  • the siRNA can be designed as follows.
  • any region that is not particularly limited as long as it is a gene encoding synoviolin can be used as target candidates.
  • any region of GenBank accession number AB024690 (SEQ ID NO: 1) can be a candidate.
  • a sequence starting with AA is selected from the selected region, and the length of the sequence is 19 to 25 bases, preferably 19 to 21 bases.
  • the GC content of the sequence should be selected, for example, 40-60%.
  • DNA containing at least one sequence selected from the following base sequences among the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be used as a target sequence of siRNA. Specifically, targeting (0 (SEQ ID NO: 3), GO (SEQ ID NO: 4), (vi) (SEQ ID NO: 8), (vii) (SEQ ID NO: 9), (viii) (SEQ ID NO: 10) It is preferable that
  • siRNA synthesized in vitro can be linked to plasmid DNA and introduced into cells, or two RNAs can be annealed.
  • RNA is an RNA molecule having the following structure.
  • RNA molecule may be a molecule having one end closed, for example, a siRNA (shRNA) having a hairpin structure.
  • shRNA is an RNA molecule called a short hairpin RNA (short hairpin RNA), which has a stem loop structure in which a part of a single strand forms a complementary strand with another region. That is, molecules capable of forming a double-stranded RNA structure in the molecule are also included in the siRNA of the present invention.
  • an RNA capable of suppressing the expression of a synoviolin gene by an RNAi effect, which is a DNA sequence specifically shown by the present specification (SEQ ID NO :) In the siRNA targeting 3 to 16), or in the siRNA base sequence formed by SEQ ID NOs: 18 and 19, for example, a double-stranded RNA having a structure in which one or a few RNAs are added or deleted. However, it has a function to suppress the expression of Synoviolin gene. If included, it is included in the siRNA of the present invention.
  • RNA used for RNAi does not need to be completely identical (same as the synoviolin gene or a partial region of the gene), but preferably has the same identity).
  • the power of DICER comes into contact with double-stranded RNA, and the double-stranded RNA is small iterfering RNA or It is thought to be broken down into small fragments called siRNA! /
  • the double-stranded RNA having the RNAi effect in the present invention includes double-stranded RNA before being digested by DICER as described above. That is, even a long-chain RNA that does not have an RNAi effect with the same length is expected to be decomposed into siRNA having an RNAi effect by the cell.
  • the length of the double stranded RNA is not particularly limited.
  • RNA corresponding to the full-length or almost full-length region of the synoviolin gene mRNA of the present invention is decomposed in advance with, for example, DICER, and the degradation product is used as the drug of the present invention. It is possible.
  • This degradation product is expected to contain double-stranded RNA molecules (siRNA) having the RNAi effect. According to this method, it is not necessary to particularly select a region on mRNA that is expected to have an RNAi effect. That is, the region on the mRNA of the Synoviolin gene of the present invention having an RNAi effect does not necessarily have to be accurately defined.
  • double-stranded RNA having an RNAi effect can be appropriately prepared by those skilled in the art based on the base sequence of the synoviolin gene of the present invention which is a target of the double-stranded RNA. it can.
  • the double-stranded RNA of the present invention can be prepared based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. That is, based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, selecting an arbitrary continuous RNA region of mRNA that is a transcription product of the sequence, and preparing a double-stranded RNA corresponding to this region, Those skilled in the art will be able to do so within the ordinary trial.
  • siRNA sequences having a stronger RNA i effect from mRNA sequences which are transcripts of the sequences
  • selection of siRNA sequences having a stronger RNA i effect from mRNA sequences, which are transcripts of the sequences can be appropriately performed by those skilled in the art by known methods. If one strand (for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1) is found! /, It will be easy for those skilled in the art! The base sequence of the other strand (complementary strand) Can know. Those skilled in the art can appropriately produce siRNA using a commercially available nucleic acid synthesizer. In addition, for synthesis of a desired RNA, a general contracted synthesis service can be used.
  • RNA ribonucleotides
  • one or more ribonucleotides constituting siRNA may be a corresponding deoxyribonucleotide.
  • This “corresponding” refers to the same base species (adenine, guanine, cytosine, thymine (uracil)) although the structures of the sugar moieties are different.
  • a deoxyribonucleotide corresponding to a ribonucleotide having adenine refers to a deoxyribonucleotide having adenine.
  • the “plurality” is not particularly limited, but preferably refers to a small number of about 2 to 5
  • a DNA (vector) capable of expressing the RNA of the present invention is also included in a preferred embodiment of the compound capable of suppressing the expression of the synoviolin gene of the present invention.
  • the DNA (vector) capable of expressing the double-stranded RNA of the present invention includes a DNA encoding one strand of the double-stranded RNA and a DNA force encoding the other strand of the double-stranded RNA, respectively.
  • This DNA has a structure linked to a promoter so that it can be expressed.
  • the expression vector of the present invention can be prepared by appropriately inserting DNA encoding the RNA of the present invention into various known expression vectors.
  • a DNA (vector) capable of expressing the RNA of the present invention is also included in a preferred embodiment of the compound capable of suppressing the expression of the synoviolin gene of the present invention.
  • the DNA (vector) capable of expressing the double-stranded RNA of the present invention includes a DNA encoding one strand of the double-stranded RNA and a DNA force encoding the other strand of the double-stranded RNA, respectively.
  • This DNA has a structure linked to a promoter so that it can be expressed.
  • the expression vector of the present invention can be prepared by appropriately inserting DNA encoding the RNA of the present invention into various known expression vectors.
  • the expression inhibitory substance of the present invention includes, for example, a synoviolin expression regulatory region (for example, And a compound that inhibits the expression of Synoviolin by binding to the promoter region).
  • the compound can be obtained by, for example, a screening method using a synoviolin promoter DNA fragment and using the DNA fragment binding activity as an index.
  • those skilled in the art can appropriately determine whether or not a desired compound has the ability to inhibit the expression of synoviolin of the present invention by a known method such as the reporter assay method.
  • a DNA (vector) capable of expressing the RNA of the present invention is also included in a preferred embodiment of the compound capable of inhibiting the expression of the synoviolin gene of the present invention.
  • the DNA (vector) capable of expressing the above double-stranded RNA of the present invention is a DNA that encodes one strand of the double-stranded RNA and a DNA force that encodes the other strand of the double-stranded RNA.
  • Each DNA has a structure linked to a promoter so that it can be expressed.
  • the expression vector of the present invention can be prepared by appropriately inserting DNA encoding the RNA of the present invention into various known expression vectors.
  • a preferred embodiment of the vector of the present invention includes a vector expressing siRNA that inhibits the expression of Synoviolin.
  • the expression inhibitory substance of the present invention includes a compound that inhibits the expression of Synoviolin by binding to, for example, a Synopioline expression regulatory region (for example, a plug motor region).
  • the compound can be obtained, for example, by a screening method using a synoviolin promoter DNA fragment and the activity of binding to the DNA fragment as an index.
  • those skilled in the art can appropriately determine whether or not a desired compound has the ability to inhibit the expression of synoviolin of the present invention by a known method such as the reporter assay method.
  • the p53 protein activator of the present invention has an action of inhibiting the growth of cancer cells by activating p53, which is a tumor suppressor protein. Accordingly, the present invention provides a cancer therapeutic agent comprising the p53 protein activator of the present invention as an active ingredient.
  • a drug containing the p53 protein activator of the present invention can be a p21 protein activator or a cell cycle (especially transition from G1 phase to S phase) inhibitor.
  • the p53 protein activator of the present invention can be a therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
  • cancer therapeutic agent of the present invention is expressed as “cancer cell growth inhibitor”, “cancer cell generation inhibitor”, “tumor growth inhibitor”, “anticancer agent”, or “anticancer agent”. It is also possible. Further, in the present invention, “therapeutic agent” is expressed by “medicine”, “pharmaceutical composition”, “therapeutic drug”, and the like.
  • the "treatment" in the present invention includes a preventive effect that can suppress the occurrence of cancer in advance. Further, it is not necessarily limited to having a complete therapeutic effect on cancer cells (tissues), and may have a partial effect.
  • the drug of the present invention can be mixed with physiologically acceptable carriers, excipients, diluents and the like, and can be administered orally or parenterally as a pharmaceutical composition.
  • oral preparations dosage forms such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions can be used.
  • parenteral preparation a dosage form such as an injection, a drip infusion, an external medicine, or a suppository can be selected. Examples of injections include subcutaneous injections, intramuscular injections, and intraperitoneal injections.
  • the topical drug may be a nasal agent or an ointment.
  • the preparation technique of the above dosage form so as to include the drug of the present invention as the main component is known.
  • a tablet for oral administration can be produced by adding an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, and the like to the drug of the present invention, mixing, and compression-molding.
  • an excipient lactose, starch, mannitol or the like is generally used.
  • disintegrant calcium carbonate or carboxymethyl cellulose calcium is generally used.
  • Binders include gum arabic, carboxymethylcellulose, or polyvinylpyrrolidone Is used.
  • talc magnesium stearate and the like are known.
  • the tablet containing the drug of the present invention may be subjected to a known coating for masking or enteric preparation.
  • a coating agent ethyl cellulose, polyoxyethylene glycol or the like can be used.
  • an injection can be obtained by dissolving the agent of the present invention, which is the main component, together with an appropriate dispersant, or dissolving or dispersing in a dispersion medium.
  • aqueous solvent distilled water, physiological saline, Ringer's solution, or the like is used as a dispersion medium.
  • oil-based solvents various vegetable oils such as propylene glycol are used as dispersion media.
  • a preservative such as paraben can be added as necessary.
  • a known isotonic agent such as sodium chloride or glucose can be added.
  • a soothing agent such as salt benzalcoum can be added.
  • an external preparation can be obtained by making the agent of the present invention into a solid, liquid, or semi-solid composition.
  • a solid or liquid composition it can be set as an external preparation by setting it as the composition similar to what was described previously.
  • a semi-solid composition can be prepared by adding a thickener to an appropriate solvent as required.
  • the solvent water, ethyl alcohol, polyethylene glycol, or the like can be used.
  • the thickener bentonite, polybutyl alcohol, acrylic acid, methacrylic acid, polyvinylpyrrolidone, or the like is generally used.
  • a preservative such as salt benzalkonium.
  • a suppository can also be obtained by combining an oily base material such as cacao butter or an aqueous gel base material such as cellulose derivative as a carrier.
  • a method of administering a vector incorporating a nucleic acid can be mentioned.
  • the above-mentioned vectors include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes vinores vectors, vaccinia winores betaters, retro winores betaters, and lentivirus vectors. Can be invested well.
  • the agent of the present invention is introduced into a phospholipid vesicle such as a ribosome, and the vesicle is injected. It is also possible to give.
  • the endoplasmic reticulum retaining siRNA or shRNA is introduced into a predetermined cell by the lipofusion method.
  • the obtained cells are then administered systemically, for example, intravenously or intraarterially. It can also be administered locally to a cancer tissue or the like.
  • the necessary amount (effective amount) of the drug of the present invention is administered to mammals including humans within the safe dose range.
  • the dosage of the drug of the present invention can be appropriately determined finally based on the judgment of a doctor or veterinarian in consideration of the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptoms, and the like.
  • the power varies depending on age, sex, symptoms, administration route, number of administrations, and dosage forms.
  • the dose in the case of adenovirus is about 10 6 to 10 13 per day, 1 week to 8 It is administered at weekly intervals.
  • the application site or cancer type is not particularly limited, and brain tumor, tongue cancer, pharyngeal cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, stomach cancer, spleen cancer, biliary tract cancer, gallbladder Cancer, duodenal cancer, colon cancer, liver cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, renal cancer, bladder cancer, rhabdomyosarcoma, fibrosarcoma, osteosarcoma, chondrosarcoma, skin cancer, various leukemias (eg acute myeloid leukemia) , Acute lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, adult T-cell leukemia, acute lymphoma), etc.
  • the cancer may be the primary lesion, metastasis, or other disease! /.
  • the present invention also provides a method for screening a cancer therapeutic agent using the expression level of synoviolin gene as an index.
  • Compounds that reduce (suppress) the expression level of the Synoviolin gene are expected to be drugs for cancer treatment.
  • a cancer therapeutic agent or a candidate compound for a cancer therapeutic agent can be efficiently obtained.
  • a preferred embodiment of the method of the present invention is a method for screening a cancer therapeutic agent comprising the following steps (a) to (c).
  • a test compound is contacted with a cell expressing a Synoviolin gene.
  • a cell expressing a Synoviolin gene examples include cells derived from humans, mice, rats, etc., but are not particularly limited to cells derived from these, and Escherichia coli, yeast, etc. transformed to express synoviolin. It is also possible to use other microbial cells.
  • a “cell that expresses a synoviolin gene” a cell expressing an endogenous synoviolin gene or a cell into which an exogenous synoviolin gene has been introduced and the gene is expressed can be used.
  • a cell in which an exogenous synoviolin gene is expressed can be usually produced by introducing an expression vector into which the synoviolin gene has been inserted into a host cell.
  • the expression vector can be produced by a general genetic engineering technique.
  • test compound used in the present method is not particularly limited, and examples thereof include single compounds such as natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides, and expression products of compound libraries and gene libraries. , Cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts and the like.
  • Contact of a test compound to a cell expressing a synoviolin gene is usually performed by adding the test compound to a culture medium of a cell expressing a synoviolin gene, but is not limited to this method.
  • the test compound is a protein or the like
  • the “contact” can be performed by introducing a DNA vector expressing the protein into the cell.
  • the expression level of the Synoviolin gene is measured.
  • gene expression includes both transcription and translation.
  • the gene expression level can be measured by methods known to those skilled in the art.
  • mRNA is extracted from cells expressing the Synoviolin gene according to a conventional method, and the gene is obtained by performing Northern hybridization method, RT-PCR method, DNA array method, etc. using this mRNA as a saddle type. Can be measured.
  • the amount of translation of the gene can be measured by recovering the protein fraction from cells expressing the synoviolin gene and detecting the expression of synoviolin protein by electrophoresis such as SDS-PAGE.
  • using antibodies against Synoviolin protein It is also possible to measure the translation amount of a gene by detecting the expression of the protein by carrying out a tapping method.
  • the antibody used for the detection of synoviolin protein is not particularly limited as long as it is a detectable antibody. For example, both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.
  • a compound that reduces the expression level as compared with the case (control) is selected in the following, when the test compound is not contacted.
  • Another embodiment of the screening method of the present invention is a method using the activity of Synoviolin protein as an indicator.
  • the above method is a method for screening a cancer therapeutic agent, for example, including the following steps (a) to (c).
  • testoviolin protein or a cell expressing the protein or a cell extract is contacted.
  • Synoviolin protein activities include, for example, p53 protein binding activity (interaction activity), p53 protein ubiquitin activity, p53 phosphate protein activity activity, etc. Is mentioned.
  • the measurement of the activity can be appropriately carried out by those skilled in the art by known methods such as immunoprecipitation, pull-down assay, yeast two-hybrid method and the like.
  • a compound that reduces (suppresses) the activity of the protein is selected as compared with the case where the test compound is not contacted (control).
  • a compound that lowers (suppresses) becomes a drug for cancer treatment.
  • Another embodiment of the screening method of the present invention is a method of selecting a compound that decreases the expression level of the synoviolin gene of the present invention using reporter gene expression as an indicator.
  • a preferred embodiment of the above method of the present invention is a method for screening a cancer therapeutic agent comprising the following steps (a) to (c).
  • a test compound is brought into contact with a cell or a cell extract containing DNA having a structure in which a transcription regulatory region of a synoviolin gene and a reporter gene are functionally linked.
  • “functionally linked” means that the transcriptional regulatory region of the synoviolin gene and the reporter gene are linked so that expression of the reporter gene is induced by binding of a transcription factor to the transcriptional regulatory region of the synoviolin gene. Join and do things. Therefore, even when the reporter gene is bound to another gene and forms a fusion protein with another gene product, the transcription factor binds to the transcriptional regulatory region of the synoviolin gene. Any expression that induces the expression of the fusion protein is included in the meaning of “functionally linked”. Based on the cDNA base sequence of the synoviolin gene, those skilled in the art can obtain the transcriptional regulatory region of the synoviolin gene present in the genome by a well-known method.
  • the reporter gene used in the present method is not particularly limited as long as its expression can be detected, for example, CAT gene, lacZ gene, luciferase gene, GFP gene and the like.
  • Examples of the “cell containing DNA having a structure in which the transcriptional regulatory region of the synoviolin gene and the reporter gene are functionally linked” include a cell into which a vector having such a structure inserted is introduced. Such vectors can be prepared by methods well known to those skilled in the art. Introduction of the vector into the cells can be carried out by a general method, for example, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method, lipofection method, microinjection method and the like.
  • a cell containing DNA having a structure in which a transcriptional regulatory region of a synoviolin gene and a reporter gene are functionally linked also includes a cell having the structure inserted into a chromosome.
  • the insertion of the DNA structure into the chromosome It can be performed by a method generally used by a trader, for example, a gene introduction method using homologous recombination.
  • a cell extract containing DNA having a structure in which a transcription regulatory region of a synoviolin gene and a reporter gene are functionally linked refers to, for example, a cell extract contained in a commercially available in vitro transcription translation kit.
  • a DNA having a structure in which a transcription regulatory region of a synoviolin gene and a reporter gene are functionally linked can be used.
  • Contact in the present method includes adding a test compound to a culture solution of "a cell containing DNA having a structure in which a transcription regulatory region of a synoviolin gene and a reporter gene are functionally linked", or This can be done by adding the test compound to the above-mentioned commercially available cell extract containing DNA.
  • the test compound is a protein, for example, it can also be carried out by introducing a DNA vector that expresses the protein into the cell.
  • the expression level of the reporter gene is then measured.
  • the expression level of the reporter gene can be measured by methods known to those skilled in the art depending on the type of the reporter gene.
  • the reporter gene is a CAT gene
  • the expression level of the reporter gene can be measured by detecting the chloramfecole acetylene by the gene product.
  • the reporter gene is the lac Z gene
  • the expression level of the reporter gene can be measured by detecting the fluorescence of the GFP protein.
  • a compound that lowers (suppresses) the selected reporter gene expression level in the absence of the test compound (control) is then selected.
  • a compound that lowers (suppresses) becomes a drug for cancer treatment or a candidate compound for cancer treatment.
  • a method using as an index the binding activity between Synoviolin protein and p53 protein can be mentioned.
  • Synoviol of the present invention The protein is a protein having a binding (interaction) activity to the p53 protein. Therefore, by selecting a substance that decreases (suppresses) the binding activity using the binding activity of synoviolin protein and p53 protein as an index, it is possible to screen a drug for cancer treatment.
  • the above-described method of the present invention is a method for screening a cancer therapeutic agent, including, for example, the following steps (a) to (c).
  • step (b) Usually, measuring the binding (interaction) activity between Synoviolin protein and p53 protein is a simple and easy process for those skilled in the art, and the measurement of the binding activity in the above step (b) is It can be carried out as appropriate using general methods such as immunoprecipitation and pull-down assay.
  • synoviolin protein and p53 protein used in the above method are preferably wild-type proteins, including mutations, but if they have binding (interaction) activity, some of these proteins will be used. It is also possible to use a protein (polypeptide) from which the amino acids are substituted and deleted.
  • the synoviolin protein used in the above method is preferably a wild-type protein (full-length protein) that does not contain a mutation. However, as long as it retains the binding activity to the p53 protein, its partial fragment It may be a peptide, or may be a protein (polypeptide) from which a part of the amino acid sequence of the protein has been substituted and deleted.
  • the region in Synoviolin protein involved in binding to p53 protein is a region at positions 236 to 270 in the amino acid sequence of Synoviolin protein (SEQ ID NO: 2). Therefore, in this screening method, Synoviolin containing the amino acid region at positions 236 to 270 is used.
  • a protein fragment polypeptide can be preferably used.
  • Another aspect of the screening method of the present invention includes a method using ubiquitination of p53 protein as an index.
  • the synoviolin protein of the present invention is a protein having a function of promoting the ubiquitination of the p53 protein. Therefore, by selecting a substance that reduces (suppresses) ubiquitination using p53 protein ubiquitin as an index, it is possible to screen for drugs for cancer treatment.
  • the above-described method of the present invention is a method for screening a cancer therapeutic agent including, for example, the following steps (a) to (c).
  • in vitro ubiquitination is measured using GST-p53 and MBP-Synoviolin ⁇ ⁇ -His.
  • GST-p53 was purified from the Escherichia coli (BL21) extract containing pGEX / p53 using GSH-Sepharose resin, and after dialysis, MBP-Synoviolin ⁇ ⁇ -His and other in vitro
  • the reaction is carried out by combining the compositions used for the ubiquitination reaction (ATP, PK-His-HA-Ub, yeast El, His-UbcH5c). After reaction, proteins are separated by SDS-PAGE, transferred onto PVDF membrane, and in vitro ubiquitin assay is performed by detecting p53 protein on the membrane with anti-p53 antibody (FL393 or DO-1). It is possible to perform.
  • the above method is as follows. When the test compound is not contacted, compared to the case (control), Select a compound that reduces (suppresses) the degree of oxidation. A compound that lowers (suppresses) becomes a drug for cancer treatment or a candidate compound for cancer treatment.
  • a method using as an index the phosphoric acid activity of p53 phosphate protein using p53 protein as a substrate there can be mentioned a method using as an index the phosphoric acid activity of p53 phosphate protein using p53 protein as a substrate.
  • Synoviolin protein inhibits the activity of p53 by inhibiting the phosphate activity of p53 phosphate protein. Therefore, a substance that increases the activity of p53 phosphate protein is expected to have a function of activating p53.
  • the present invention is a method for screening a cancer therapeutic agent, comprising the following steps (a) to (c).
  • the "p53 phosphorylated protein” is not particularly limited as long as it is a protein that can be phosphorylated using p53 as a substrate, as described above.
  • ATM, ATR, DNA-PK or the like can be used.
  • GSK3 ⁇ or the like more preferably ATM or ATR.
  • the p53-phosphorylated protein used in the above method is preferably a wild-type protein containing no mutation, but if it has an activity to phosphorylate p53 protein.
  • the p53 phosphate protein may be a protein (polypeptide) in which a part of the amino acids of the protein is substituted or deleted.
  • the p53 protein serving as a substrate is also preferably a wild-type protein (full-length protein) that does not contain mutations. However, as long as the p53 protein is subjected to phosphorylation by the p53 phosphate protein, its partial fragment peptide (peptide Or a protein (polypeptide) from which a part of the amino acid sequence of the protein has been replaced or deleted. More preferably, It may be a partial polypeptide containing a site for receiving phosphate or a mutant polypeptide containing the site.
  • the site on the p53 protein that receives the phosphate by the p53 phosphate protein is not particularly limited, but preferably the amino acid sequence of the P53 protein (eg, SEQ ID NO: The serine residue at position 15 in the amino acid sequence described in (17). Therefore, in the present method, a p53 fragment polypeptide containing a serine residue at position 15 can be preferably used.
  • the phosphate enzyme activity of the p53 phosphate protein can be measured, for example, by a Western plot method using a phosphate-specific antibody.
  • a compound that increases the phosphate activity of the p53 phosphate protein is selected as compared with the case where the test compound is not contacted. Usually, it can be selected as appropriate using the state of phosphate in the p53 or p53 fragment peptide to be used as an index.
  • the compound selected in this way promotes the phosphorylation activity of the p53 phosphate protein p53 protein as a substrate, and as a result, inhibits the growth of cancer cells and has a cancer therapeutic effect. There is expected.
  • the present invention also provides a kit containing various drugs, reagents and the like used for carrying out the screening method of the present invention.
  • the kit of the present invention can be appropriately selected from, for example, the above-mentioned various reagents of the present invention according to the screening method to be performed.
  • the kit of the present invention can comprise at least (a) Synoviolin protein and (b) p53 protein of the present invention as components.
  • the kit of the present invention can further contain various reagents, containers and the like used in the method of the present invention.
  • an anti-sinoviolin antibody, an anti-phosphorylated Ser antibody, a probe, various reaction reagents, cells, a culture solution, a control sample, a buffer solution, instructions describing the usage method, and the like can be appropriately included.
  • a preferred embodiment of the present invention is a method for screening a cancer therapeutic agent, which comprises the step of detecting whether the expression and Z or function of Synoviolin protein is inhibited. Therefore, in the screening method, a probe for the synoviolin gene or any region of the gene that can be used for detection of synoviolin protein. Oligonucleotides such as primers for amplifying the region or antibodies that recognize synoviolin proteins (anti-sinoviolin protein antibodies) can also be included in the components of the cancer therapeutic agent screening kit of the present invention.
  • the oligonucleotide specifically hybridizes, for example, to the DNA of the synoviolin gene of the present invention.
  • “specifically hybridize” means that under normal hybridization conditions, preferably under stringent hybridization conditions (column X ⁇ is Samfnoretz et al., Molecular Cloning, old In the condition of Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2nd edition 1989), it means that DNA encoding other proteins and cross-hybridization do not occur significantly. If specific hybridization is possible, the oligonucleotide need not be completely complementary to the base sequence of the Synoviolin gene.
  • hybridization conditions include, for example, "2 X SSC, 0.1% SDS, 50.C”, “2 X SSC, 0.1% SDS, 42. C", "1 X SSC. , 0.1% SDS, 37 ° C '' and more stringent conditions as ⁇ 2 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C '', ⁇ 0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C '' and ⁇ 0.2 X SSC, 0.1 % SDS, 65 ° C. ”.
  • Rapid-hyb buffer Amersham Life Science
  • a probe after pre-hybridization at 68 ° C for 30 minutes or more, add a probe and keep at 68 ° C for 1 hour or more to hybridize. And then washed 3 times for 20 minutes at room temperature in 2 X SSC, 0.1% SDS, followed by 3 times 20 minutes at 37 ° C in 1 X SSC, 0.1% SDS. Can be washed twice in 1 X SSC, 0.1% SDS at 50 ° C for 20 minutes.
  • Prehybrid Hybrid Solution (CLONTECH)
  • prehybridization at 55 ° C for 30 minutes or more, add labeled probe, and incubate at 37-55 ° C for 1 hour or more. It is also possible to wash 3 times for 20 minutes at room temperature in 2 X SSC, 0.1% SDS, and once for 20 minutes at 37 ° C in 1 X SSC, 0.1% SDS.
  • the temperature at the time of pre-hybridization, hybridization, or the second washing to be higher, more stringent conditions can be obtained.
  • the temperature of the prehybridization and the hybridization can be set to 60 ° C
  • the stringent condition can be set to 68 ° C.
  • probe concentration in addition to conditions such as salt concentration and temperature of the buffer. The conditions can be set in consideration of other conditions such as the temperature, the length of the probe, the base sequence configuration of the probe, and the reaction time.
  • the oligonucleotide can be used as a probe or primer in the above-described screening kit of the present invention.
  • its length is usually 15 bp 100 bp, preferably 17 bp 30 bp.
  • the primer is not particularly limited as long as it can amplify at least a part of the DNA of the synoviolin gene of the present invention.
  • Synoviolin homo knockout mouse fetus MEF showed high radiosensitivity or UV sensitivity. Therefore, in the present invention, when the expression and / or function of synopioline in a cancer cell is inhibited to transfer P53 to the nucleus of the cancer cell, then the cancer cell is irradiated with radiation or ultraviolet rays, Cell proliferation can be effectively suppressed.
  • the radiation irradiation means is not particularly limited, for example, ⁇ rays can be irradiated with l 10 Gy.
  • ultraviolet irradiation (wavelength 100 400, preferably 290 400 nm) can be performed using an appropriate ultraviolet irradiation device (Funakoshi, Delmaray, Keyence, etc.).
  • cancer can be efficiently suppressed by further contacting an anticancer agent with cells containing p53 localized in the nucleus (particularly cancer cells).
  • cancer can be suppressed by embolizing the blood vessels (for example, blood vessels or lymph vessels) around cancer cells containing P53 localized in the nucleus.
  • Anticancer agents include alkylating agents, antimetabolites, microtubule inhibitors, platinum complex compounds, molecules Includes targeted therapeutics. Specific examples of these anticancer agents include the following strengths. However, the present invention is not limited to these.
  • Anolequinoresnorehon system Busunorefan etc.
  • Nitrosourea Nimustine, Mouth Mustine, etc.
  • Purine derivatives mercaptopurine, azathioprine, etc.
  • Pyrimidine derivatives 5-Fluorouracil, tegafur, carmofur, etc.
  • Vinca norekaloid Vincristine, Vinblastine, etc.
  • Taxane Paclitaxel, docetaxel, etc.
  • Cisplatin Cisplatin, carpoplatin, etc.
  • Imatinib Imatinib, rituximab, gefitinib, etc.
  • the method for bringing an anticancer drug into contact with a cancer cell is a method of adding an anticancer drug to a cell or tissue (cancer cell or cancer tissue) containing cells in which p53 is localized in the nucleus, or a cancer-bearing patient or cancer-bearing cell.
  • a method of administering an anticancer agent to animals is employed.
  • the treatment amount of the anticancer agent in this case is not particularly limited, but when added, it is 100 pM to 100 / ⁇ /, preferably 1 ⁇ to 10 / ⁇ .
  • When administered into an animal body for example, when endoxane is used as an anticancer agent, it is 0.1 to 100 mg / kg / day, preferably 2 to 25 mg / kg / day.
  • a thrombus is created in a blood vessel around a cell population or tissue containing cancer cells localized in the nucleus. Blood vessels or lymphatic vessels that may be formed may be embolized with fat or with air or gas.
  • the present invention is characterized by administering a p53 protein activator or a cancer therapeutic agent comprising the p53 protein activator of the present invention as an active ingredient to an individual (for example, a patient), which prevents cancer Or it relates to a method of treatment.
  • the individual in the prevention or treatment method of the present invention is preferably a human force and is not particularly limited, and may be a non-human animal.
  • Administration to an individual can be generally performed by methods known to those skilled in the art, such as intraarterial injection, intravenous injection, and subcutaneous injection.
  • the dosage varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dosage.
  • the present invention relates to the use of the p53 protein activator of the present invention in the manufacture of a therapeutic agent for cancer.
  • the present invention also provides an anti-rheumatic agent comprising as an active ingredient a substance having a function of controlling self-ubiquitination of synoviolin protein.
  • Preferred examples of the substance of the present invention include low molecular compounds. That is, in a preferred embodiment of the present invention, there is provided an anti-rheumatic agent comprising as an active ingredient a low molecular weight compound having a function of controlling the self-ubiquitination of synoviolin protein.
  • the present inventors have succeeded in constructing an atsy system that evaluates the self-ubiquitination reaction of a synoviolin protein, and the atse mosquito also functions to control the self-ubiquitination of a synoviolin protein.
  • the present inventors have succeeded in obtaining two low-molecular compounds represented by the above general formula (I) (Compound X) or general formula ( ⁇ ) (Compound Y).
  • an anti-rheumatic agent comprising the compound described in the above general formula (I) or (II) as an active ingredient.
  • the present invention is represented by the general formula (I) or (II) which is an active ingredient in an antirheumatic agent.
  • the listed compound may be a pharmaceutically acceptable salt of the compound.
  • the salt of the compound for example, hydrates, solvates, isomers and the like of the compound are included. These compounds are also expected to have antirheumatic activity as well.
  • salt refers to any salt that forms a salt with the compound of the present invention (the compound described in the general formula (I) or (II)) and is pharmacologically acceptable. Without being limited, for example, organic salts, organic acid salts, inorganic base salts, organic base salts, acidic or basic amino acids and the like can be mentioned. In the present invention, “salt” usually refers to a pharmaceutically acceptable salt. In addition, the above-mentioned salt is preferably as described above.
  • the present inventors have found that the compounds described in the above general formula (I) or (II) each have an inhibitory effect on the proliferation of rheumatoid synovial cells (RASC). That is, in the preferred embodiment of the present invention, there is provided an anti-rheumatic agent characterized in that the compound represented by the above general formula (I) or (II) has an effect of suppressing the growth of rheumatoid synovial cells.
  • the anti-rheumatic agent of the present invention has an effect of suppressing the proliferation of rheumatoid synoviocytes as described above.
  • RA rheumatoid arthritis
  • hyperproliferation and activity of rheumatoid synovial cells are known as the main lesions. Therefore, if the growth of rheumatoid synovial cells can be suppressed, it is considered useful for the treatment of rheumatic diseases including rheumatoid arthritis.
  • Rheumatism in the present invention includes so-called rheumatic diseases, and specifically includes rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis and the like. It can be illustrated. The above rheumatic diseases may be combined with other diseases.
  • the "anti-rheumatic agent” of the present invention includes “rheumatic synovial cell proliferation inhibitor”, “rheumatic synovial cell generation inhibitor”, “rheumatic therapeutic agent”, “rheumatic disease therapeutic agent”, “anti-rheumatic agent”. It can also be expressed as “drug” or “anti-rheumatic disease drug”.
  • the "treatment" in the present invention includes a prophylactic effect capable of suppressing the onset of rheumatic diseases in advance. Moreover, it is not necessarily limited to the case where it has a complete therapeutic effect on a tissue in which rheumatoid synoviocytes are proliferating, and it may be a case where it has a partial effect.
  • the drug of the present invention is as described above. When the drug of the present invention is used, the application site or the type of rheumatic disease is not particularly limited.
  • rheumatism rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, etc. Applies as a target.
  • the rheumatic disease may be concurrent with other diseases.
  • the present invention also provides a method for screening an anti-rheumatic agent using the expression level of the synoviolin gene as an index.
  • Compounds that reduce (suppress) the expression level of the synoviolin gene are expected to be drugs for the treatment of rheumatic diseases.
  • candidate compounds for anti-rheumatic agents or anti-rheumatic agents can be efficiently obtained.
  • a preferred embodiment of the method for screening an anti-rheumatic agent of the present invention is a method comprising the following steps (a) to (c).
  • Each step of the screening method is as described above.
  • the compound selected by this screening method is an anti-rheumatic agent or a candidate compound for anti-rheumatic agents.
  • Another embodiment of the method for screening an anti-rheumatic agent of the present invention is a method for selecting a compound that decreases the expression level of a synoviolin gene using the expression of a reporter gene as an index.
  • a preferred embodiment of the screening method of the present invention is a method for screening an anti-rheumatic agent, comprising the following steps (a) to (c).
  • Each step of the screening method is as described above.
  • the compound selected by this screening method is an anti-rheumatic agent or a candidate compound for anti-rheumatic agents.
  • another embodiment of the method for screening an anti-rheumatic agent of the present invention is a method using autobiubilation of synoviolin protein as an index. By selecting a substance that controls the self-ubiquitin of the synoviolin protein of the present invention, it is possible to screen an anti-rheumatic agent.
  • the above-described method of the present invention is a method for screening an anti-rheumatic agent, including, for example, the following steps (a) to (c).
  • synoviolin protein and a test compound are contacted.
  • the degree of autobiquity of the synoviolin protein is then measured.
  • Those skilled in the art can measure the degree of synoviolin protein self-ubiquitin, for example, by the methods described in the following Examples.
  • a compound that controls the degree of self-ubiquitination is selected as compared with the case (control) when the test compound is not contacted.
  • the compound to be controlled is an anti-rheumatic agent or a candidate compound for an anti-rheumatic agent.
  • control means upward control (for example, promotion) or downward control (for example, acceleration). For example, suppression) is included.
  • the present invention also provides a kit containing various drugs, reagents and the like used for carrying out the screening method for an anti-rheumatic agent of the present invention.
  • the kit of the present invention can be appropriately selected according to, for example, the screening method of the above-described various reagents of the present invention.
  • the screening kit for an anti-rheumatic agent of the present invention can contain at least the synoviolin protein of the present invention as a component.
  • the kit of the present invention can further contain various reagents, containers and the like used in the method of the present invention.
  • the present invention is characterized in that an anti-rheumatic agent comprising a substance having a function of controlling the self-ubiquitin function of the synoviolin protein of the present invention as an active ingredient is administered to an individual (for example, a patient).
  • the present invention relates to a method for preventing or treating rheumatic diseases.
  • the individual in the prevention or treatment method of the present invention is preferably a human, but is not particularly limited and may be a non-human animal.
  • the administration to an individual is as described above.
  • the present invention relates to the use of a substance having a function of controlling the self-ubiquitin of the synoviolin protein of the present invention in the production of an anti-rheumatic agent.
  • MEF was immobilized on a slide glass according to a conventional method, and immunostaining was performed using an anti-p53 antibody (mouse monoclonal antibody BD: Becton, Dickinson).
  • Anti-p53 antibody (BD: 10 ⁇ g / mL) was immunoreacted at room temperature for 60 minutes. After the reaction, the specimen was washed with PBS and immunoreacted with TRITC-labeled anti-mouse IgG antibody (Dako) as a secondary antibody. Confirmation of the antigen immunoreactive with the anti-P53 antibody was performed with a fluorescence microscope.
  • syno-/-MEF cultured cells showed increased expression of p53 and nuclear translocation (Fig. 1, “MEF-/-” panel). ).
  • the examination of p53 activity in syno-/-mice was performed by immunostaining using embryos. That is, immunostaining in syno-/-fetuses was performed using a Vectorstain ABC kit (VECTOR) after fixing the tissue on a glass slide according to a conventional method. A sample blocked with a blocking reagent for 30 minutes was immunoreacted with anti-p53 antibody FL393 diluted to 5 g / mL at room temperature for 60 minutes. After the reaction, the specimen was washed with PBS and immunoreacted with HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody as a secondary antibody.
  • VECTOR Vectorstain ABC kit
  • Antigens that immunoreacted with the anti-p53 antibody were confirmed by color development of 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride based on HRP activity. Methyldarin staining was performed as a counterstaining.
  • cell disruption solution 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP40, 1 mM PMSF, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 2 ⁇ g / mL Leupeptin, 2 ⁇ g / mL Aprotinin, 2 ⁇ g / mL Pepstatin
  • SDS-PAGE SDS polyacrylamide electrophoresis
  • This NC membrane was blocked with Tris buffered saline (TBS) containing 5% skim milk at room temperature for 1 hour, and then anti-p53 antibody c-terminal aa; 195-393 or FL393 was added with TBS with 5% skim milk added. Dilute and immunoreact for 1 hour at room temperature. After the reaction, the NC membrane was washed with 0.1% Tween20 / TBS, horse radish peroxidase (HRP) -labeled anti-rabbit IgG antibody was used as a secondary antibody for 1 hour at room temperature, washed with 0.1% Tween20 / TBS, and HRP activity The target antigen was detected by detecting.
  • the ECL kit (Amersham) was used to detect HRP activity (Clinical Chemistry. 25, pi 531, 1979) 0
  • the phosphorylation site of p53 was identified by Western blotting using an anti-p53 antibody.
  • RKO human colorectal cancer-derived cell line
  • RKO human colorectal cancer-derived cell line
  • RKO cells were treated with siRNA against synoviolin and the changes in the expression of p21, a transcription product of p53, were examined by Western blotting.
  • wild-type p53 is expressed as a cell line, and RKO (human colorectal cancer-derived cell line) is placed in a 60 mm plate, l.OxlO 5 cells / plate / 2 mL. Seeding and transfecting siRNA oligonucleotides to GFP and Synoviolin using Oligofectamine. Cells were harvested and prepared after 72 hours. The prepared protein was separated by SDS-PAGE, and Western blotting was performed using an anti-p21 polyclonal antibody (Santa Cruz). The Western blotting procedure is the same as described in Example 3 except that anti-p21 polyclonal antibody is used as the primary antibody and anti-mouse IgG Hedge-HRP is used as the labeled antibody.
  • the RA synovial cells were seeded at 9.0Xl0 4 cells 10 cm dish, after synoviolin siRNA (final concentration 25 nM) were transfected Hue Tato was observed cell cycle by flow cytometer.
  • siRNA 25 nM (h589) showed a cell cycle delay in the G0 / G1 phase (FIG. 7).
  • h589 was used as the siRNA.
  • H589 means a double-stranded RNA in which the following sense strand and antisense strand are annealed.
  • Sense strand h589 GGU GUU CUU UGG GCA ACU G TT (SEQ ID NO: 18)
  • Antisense strand h589 CAG UUG CCC AAA GAA CAC C TT (SEQ ID NO: 19)
  • [0206] [Example 8] Synopioline in cancer tissue Examination of expression
  • Tissue array (CHEMICON: 10 common human cancer tissue with normal human tissue) was immunostained using an anti-sinoviolin antibody (lODa).
  • the antibody concentration used for immunostaining was 8 g / mL, and the kit used was Simplestain MAX (M).
  • synoviolin expression in normal tissues was observed in the large intestine, kidney, lung, ovary, testis, skin and mammary gland, but not in nerves and lymph nodes.
  • the expression of synopioline was confirmed in each tumor tissue, and in particular, the tissue whose expression was clearly enhanced and judged to be V was a nerve 'lymph node (FIGS. 8 and 9).
  • Each plasmid is as follows.
  • GFP-p53 Fusion protein expression of green fluorescence protein and wild-type p53 FLAG-synoviolin: Expression of wild-type synoviolin with FLAG tag
  • FLAG-synoviolin C307S (without ubiquitin (Ub) activation): Inactivated synoviolin expression with FLAG tag
  • GST-p53 A fraction obtained by purifying p53 fused with GST on the N-terminal side in E. coli.
  • MBP-Synoviolin ⁇ ⁇ -His A fraction obtained by purifying synopioline expressed in E. coli with MBP fused to the N-terminal side and His tag fused to the C-terminal side.
  • Escherichia coli (BL21) retaining pGEX / p53 was cultured in 500 mL of LB medium, induced with IPTG (1 mM, 30 ° C, 6 h), and buffer containing 0.5% NP-40 from the culture solution An Escherichia coli extract was prepared using the solution.
  • GST-p53 was purified from the E. coli extract using GSH-Sepharose resin in the presence of 0.1% NP-40. Using the dialysis sample, MBP-Synoviolin ⁇ ⁇ -His and other in vitro ubiquitination compositions (ATP, PK-His-HA-Ub, yeast El, His-UbcH5c) are combined. (Fig. 13). After the reaction, the protein was separated by 7.5% SDS-PAGE, transferred onto a PVDF membrane, and the p53 protein on the membrane was detected with an anti-p53 antibody (FL393 or DO-1). The same reaction and detection were performed by changing the amount of GST-p53 added.
  • RA synovial cells are seeded in 30000 cells / 10 cm dish and 25 nM siRNA (No. 589) was transfected and cells were collected over time for 4 days of cell culture to obtain mRNA.
  • Reverse transcription was performed using 1 ⁇ g of mRNA as a template and random primers to obtain cDNA.
  • the obtained cDNA was quantified using ABI TaqMan Gene expression assay (GEX). The amount of mRNA was calculated using the control gene as 18S rRNA.
  • the GEX reagent target assembly No. (Atsei ID) is Hs00381211_ml for Synoviolin and Hs00153340_ml for p53.
  • PepstatinA (Final 0.5 ⁇ g / mL) 2 ⁇ L
  • Each sample was sonicated (Power Level 7, 15 seconds, 3 times). Each time, it was cooled in ice water for 30 seconds. Next, 500 ⁇ L of 2 X GST Buffer / Z (2% TritonX-100, 720 mM NaCl, 1 x PBS (-), ⁇ ⁇ ⁇ ZnCl, 10 mM j8-Mercaptoethaol, 2 mM PMSF ⁇ 0.1% aprot
  • the beads were washed 4 times with ercaptoethanoU 1 mM PMSF, 0.05% aprotinin). Centrifugation was performed at 2000 rpm, lmin, 4 ° C. After all the remaining supernatant had been blotted clean, 60 L of 1 x GST-Buffer IZ was removed and scraped for a total of 100 ⁇ U. 10 ⁇ L of this was mixed with an equal volume of 2 X SDS Sample Buffer, heated in a heat block at 100 ° C for 5 min, and 10 L was applied to 10% gel. At the same time, 0.25 to 4 ⁇ g of BSA was also applied.
  • RKO cells human colorectal cancer-derived cell line, ATCC: CRL-2577
  • KFALCON 96-well microtiter plate KFALCON, non coated
  • 1000 cells / 100 L / well with Eagle's Minimum Essential Medium containing 10% fetal bovine serum Cultured for 24 hours.
  • Compound X and Y were dissolved in Eagle's Minimum Essential Medium containing 10% fetal bovine serum, and 10 ⁇ L each well was added and cultured for 24-72 hours.
  • RKO cells were treated with Compound Y, and changes in p53 protein expression were detected by Western blotting. It was examined by Ing. Specifically, RKO cells were seeded on a 10 cm plate at 5.0 ⁇ 10 5 cells / plate, cultured for 24 hours, and Compound Y was added at final concentrations of 5, 10, and 20 ⁇ ⁇ . After 24 hours, cells were collected and a cell lysate was prepared. Proteins were separated by SDS-PAGE and Western blotting was performed using an anti- ⁇ 53 antibody (FL393, Santa Cruz). The operation of the Western blotting method is as described in Example 3, except that anti-p53 antibody is used as the primary antibody and anti-HgG Usagi-HRP is used as the labeled antibody. As a result, the compound expression level of p53 was increased by Compound Y (FIG. 19).
  • the purpose of this study was to construct a simple assembly system for self-ubiquitination by ELISA and to evaluate compounds that inhibit self-ubiquitination.
  • His-El human, 125 ng
  • His-PK-HA-Ub 1.6 ⁇ g
  • His-UBE2G2 0.8 ⁇ g
  • GST—Syno in the presence or absence of ATP (10 mM) ⁇ ⁇ (0.4 ⁇ g) was mixed and in vitro ubiquitin reaction (30 / z 1) was performed at 37 ° C for 1 hour.
  • in vitro ubiquitin reaction (30 / z 1) was performed at 37 ° C for 1 hour.
  • After stopping the reaction by adding 70 1 of 0.5 M EDTA to the reaction solution, mix the mixture after stopping the reaction on a glutathione co-ELISA plate (Reacti-Bind, PIERCE) previously blocked with PBST / 10% skim milk for 2 hours.
  • the solution was added and shaken at room temperature for 1 hour.
  • Anti-HA antibody (1/2000) diluted with PBST was dispensed 100 1 by 1 and shaken at room temperature for 1 hour. After the waste liquid, it was washed 3 times with 13 ⁇ 43 of 2001.
  • Anti-rabbit IgG antibody (1/2000) diluted with PBST was dispensed 100 1 at a time and shaken at room temperature for 30 minutes. After the effluent, it was washed 3 times with 13 ⁇ 43 of 2001. Add 100 1 OPD coloring solution, shake at room temperature for 15 minutes, add 50 1 2N sulfuric acid 501, stop the reaction, and then measure the absorbance at 492 using a plate reader (Fig. 21). ).
  • Anti-HA antibody (1/1000) diluted with PBST was dispensed 100 by 1 and shaken at room temperature for 1 hour. After the waste liquid, it was washed 3 times with 200 1 PBST.
  • Anti-rabbit IgG antibody (1/2000) diluted with PBST was dispensed 100 1 at a time and shaken at room temperature for 30 minutes. After the waste liquid, it was washed 3 times with 200 1 PBST. Add 100 1 OPD coloring solution, shake at room temperature for 15 minutes, add 50 1 2 N sulfuric acid 50 1 and stop the reaction, then measure absorbance at 492 using a plate reader ( Figure 22). .
  • the IC50 value after time culture was 20 M for No.32 and about 6 M for No.38 (Figs. 23 and 24). These low molecular weight compounds were effective in inhibiting RASC cell proliferation at low concentrations, and were considered to have antirheumatic effects.
  • SEQ ID NO: 18 Synthetic oligonucleotide (DNA / RNA mixture)
  • SEQ ID NO: 19 Synthetic oligonucleotide (DNA / RNA mixture)
  • the present invention contains as an active ingredient an inhibitor of the expression or function of synoviolin protein, P 53 protein activation agent. This drug is useful as a cancer therapeutic agent.
  • the p53 protein activator of the present invention has been used to elucidate the cancer suppressive action related to p53. It is also useful as a research reagent.
  • the present invention also provides an anti-rheumatic agent containing a substance that controls the self-ubiquitination of Synoviolin protein as an active ingredient.
  • an anti-rheumatic agent containing a substance that controls the self-ubiquitination of Synoviolin protein as an active ingredient.

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Abstract

　シノビオリンの機能を阻害することにより、p53癌抑制タンパク質が活性化されることを見出した。シノビオリンの機能を阻害する物質は癌治療剤として有用である。また、シノビオリンの機能を阻害することにより、p53のユビキチン化が阻害されること、p53リン酸化タンパク質の活性が上昇すること等を見出した。当該知見に基づいて、効率的に癌治療剤をスクリーニング可能な方法が提供された。さらにシノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御することにより、リウマチ滑膜細胞の増殖が抑制されることを見出した。シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する物質は、抗リウマチ剤として有用である。また効率的に抗リウマチ剤をスクリーニングする方法が提供された。

Description

明 細 書
シノビォリンの発現もしくは機能阻害物質を有効成分とする癌治療剤、お よび癌治療剤のスクリーニング方法
技術分野
[0001] 本発明は、シノビオリンタンパク質の発現または機能阻害物質を有効成分とする p5 3タンパク質活性化剤、および p53タンパク質活性化剤を有効成分とする癌治療剤、 並びに、癌治療剤のスクリーニング方法に関する。
また本発明は、シノビォリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する物質を有効 成分とする抗リウマチ剤、および抗リウマチ剤のスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] シノビオリンは、リウマチ患者由来滑膜細胞で過剰発現している膜タンパク質として 発見された新規タンパク質である (特許文献 1参照)。そして、遺伝子改変動物を用 いた研究により、シノビオリンは関節リウマチの発症に必須の分子であることが判明し た。
[0003] タンパク質構造予測システムにより、シノビオリンは RING fingerモチーフを有するこ とが示唆されている。このモチーフはタンパク質のュビキチンィ匕に重要な役割を果た す E3ュビキチンライゲースという酵素に多く見出されている力 実際、シノビォリンが E 3ュビキチンライゲースの特徴のひとつである自己ュビキチンィ匕活性を有することが 証明されている (特許文献 1参照)。
[0004] ところで、 p53遺伝子は、第 17染色体 pl3に位置しており、癌細胞の発生および増殖 においてきわめて重要な癌抑制遺伝子である。 p53タンパク質は、 DNA上の特異的 塩基配列 [5'-(A/T)GPyPyPy-3')]を認識し、 p21、 GADD45、 BAX等の特定の遺伝子 の転写活性化を促す。また、（0その他の多くの遺伝子の転写を抑制すること、 G0SV4 0ラージ T抗原、アデノウイルス EIBタンパク質、パピローマウィルス E6などのウィルス性 癌遺伝子産物、あるいは mdm2等の細胞性癌遺伝子産物と結合すること、（iii)ミスマツ チを含む DNAと特異的に結合すること等の生理機能が知られている。
特許文献 1： WO02/052007 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、癌を抑制する薬剤の提供を目的とする。より具体的には、 p53タンパク質 の活性化剤、および該活性化剤を有効成分とする癌治療剤、並びに、該癌治療剤 のスクリーニング方法の提供を課題とする。また、シノビォリンタンパク質の自己ュビ キチン化を制御する物質を有効成分とする抗リウマチ剤、および抗リウマチ剤のスクリ 一二ング方法の提供を課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、シノビオリン ホモノックアウト動物を詳細に解析したところ、野生型に比し、アポトーシスを起こして いる細胞が多数観察され、また、アポトーシスの誘導に深く関与している p53タンパク 質が核内に局在し、強く発現していることが判明した。そして、シノビォリンの機能を 阻害することにより、 P53癌抑制遺伝子または p53癌抑制タンパク質が活性化されて癌 細胞の増殖が阻止されることを見出した。
また本発明者らは、シノビォリンの機能阻害による P53タンパク質の活性ィ匕のメカ- ズムを解明すベぐさらに詳細な研究を行った。
[0007] そして本発明者らは、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害することによ つて、リン酸ィ匕酵素により P53力 Sリン酸化されて P53が活性化されることを見出した。 また、シノビォリンの発現もしくは機能を阻害することにより、 p53タンパク質のュビキ チンィ匕が阻害され、その結果、 p53タンパク質が活性化されることが見出された。
[0008] さらに本発明者らによって、シノビォリンの発現もしくは機能を阻害することにより、 シノビォリンと P53タンパク質との結合が阻害され、その結果、 p53が活性ィ匕されること が示された。また、シノビォリンにおける p53タンパク質との結合部位を決定することに 成功した。
[0009] 本発明者らによって見出された上述の知見から、シノビオリンタンパク質の発現もし くは機能を阻害する物質は、 p53タンパク質の活性化剤として有用であり、また、該活 性化剤は癌治療剤となり得ることが示された。
[0010] さらに本発明者らは、本願によって見出された種々の知見を基に、新規癌治療薬 の開発を目指し、 p53タンパク質のシノビオリンによるュビキチンィ匕を阻害する物質の 取得を試みた。その結果、 p53タンパク質のュビキチンィ匕を阻害する物質として、低 分子化合物 Compound X、 Yを実際に取得することに成功した。
[0011] 次に、 Compound X、 Yの培養癌細胞に対する細胞増殖への影響を調べたところ細 胞増殖が抑制され、また、 Compound Yでは、細胞内の p53のタンパク発現量の増加 がみられた。 Compound X、 Yが培養癌細胞においてシノビオリンによる p53のュビキ チンィ匕反応阻害により P53のタンパク発現量を増加させることが示唆された。
[0012] 即ち、 Compound X、 Yがシノビォリンによる p53のュビキチン化を阻害することにより p53タンパク発現量を増力！]させ、抗癌作用を発揮すると考えられる。 p53の安定化、核 内への集中的な局在を引き起こすことにより、放射線への感受性を高め治療効率を 上げる、集学的治療の一環としての臨床応用も期待される。
[0013] 上述の知見は、該低分子化合物が癌治療剤として有用であることを示すとともに、 本発明者らによって見出された知見に基づいて、癌治療剤を効率的にスクリーニン グすることが可能であることを示すものである。
[0014] 上述の如く本発明者らは、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害する物 質を含有する P53タンパク質活性化剤、および該活性化剤を含む癌治療剤、並びに 、該癌治療剤のスクリーニング方法を開発することに成功し、本発明を完成させた。
[0015] 即ち本発明は、 p53タンパク質の活性化剤、および該活性化剤を有効成分とする癌 治療剤、並びに、該癌治療剤のスクリーニング方法に関し、より詳しくは、 〔1〕 シノビォリンタンパク質の発現および Zまたは機能阻害物質を有効成分として 含有する、 P53タンパク質活性化剤、
〔2〕 前記発現および Zまたは機能阻害物質が、シノビオリンタンパク質と p53タンパ ク質との結合を阻害する活性を有する低分子化合物である、〔1〕に記載の p53タンパ ク質活性化剤、
〔3〕 前記発現および Zまたは機能阻害物質が P53タンパク質のュビキチン化を阻害 する機能を有する低分子化合物である、〔1〕に記載の p53タンパク質活性化剤、 〔4〕 前記発現および Zまたは機能阻害物質が、 P53リン酸化タンパク質を活性化す る機能を有する低分子化合物である、〔1〕に記載の p53タンパク質活性化剤、 [5] 前記 p53リン酸ィ匕タンパク質力 ATMまたは ATRである、〔4〕に記載の p53タン パク質活性化剤、
〔6〕 前記発現および Zまたは機能阻害物質が、以下の (a)〜 (c)力もなる群より選 択される化合物である、〔1〕に記載の p53タンパク質活性化剤、
(a)シノビオリン遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)シノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する核酸
(c)シノビオリン遺伝子の発現を RNAi効果により阻害する作用を有する核酸
〔7〕 前記発現および Zまたは機能阻害物質が、以下の (a)または (b)の化合物であ る、〔1〕に記載の p53タンパク質活性化剤、
(a)シノビオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質と結合する抗体
(b)シノビオリンタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するシノビオリンタ ンパク質変異体
〔8〕 〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の p53タンパク質活性化剤を有効成分とする、癌 治療剤、
〔9〕 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、
(a)シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞におけるシノビオリンタンパク質の発現量または活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、発現量または活性を低下させる化 合物を選択する工程
〔10〕 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、
(a)シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構 造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物を接触させな 、場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レべ ルを低下させる化合物を選択する工程
〔11〕 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、
(a)シノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
(b)シノビオリンタンパク質と p53タンパク質との結合活性を測定する工程 (c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物 を選択する工程
〔12〕 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、
(a)シノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
(b) p53タンパク質のュビキチン化を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな 、場合と比較して、前記ュビキチンィ匕を低下させる化合 物を選択する工程
〔13〕 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、
(a)シノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、 p53リン酸化タンパク質、および被検化合 物を接触させる工程
(b) p53タンパク質を基質とする p53リン酸ィ匕タンパク質のリン酸ィ匕活性を測定するェ 程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記リン酸ィ匕活性を上昇させる化合 物を選択する工程
〔14〕 p53リン酸化タンパク質が ATMまたは ATRである、〔13〕に記載のスクリー- ング方法、
〔15〕 以下の（a)および (b)を構成要素として含む、癌治療剤スクリーニング用キット
(a)シノビオリンタンパク質
(b) p53タンパク質
を、提供するものである。
[0016] さらに本発明は、本発明に記載の p53タンパク質活性化剤あるいは p53タンパク質 活性化剤を有効成分とする癌治療剤を投与する工程を含む癌を予防もしくは治療す る方法、および本発明に記載の p53タンパク質活性化剤の癌治療剤の製造における 使用を提供するものである。
[0017] また本発明者らは、 ELISAによるシノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕反応を 評価する系を構築し、それによつて得られた 2種の低分子化合物である No.32 (Comp ound X)および No.38 (Compound Y)が低濃度でリウマチ滑膜細胞（RASC)の増殖を 抑制することを見出した。
[0018] 上述の知見は、該低分子化合物が抗リウマチ剤として有用であることを示すとともに
、本発明者らによって見出された知見に基いて、抗リウマチ剤を効率的にスクリー- ングすることが可能であることを示すものである。
[0019] 上述の如く本発明者らは、シノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕を制御する 物質を有効成分とする抗リウマチ剤、および抗リウマチ剤のスクリーニング方法を開 発することに成功した。
[0020] 即ち本発明は、さらに
〔16〕 シノビォリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有する物質を有 効成分として含有する、抗リウマチ剤、
〔17〕 前記シノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有する物質 が低分子化合物である、〔16〕に記載の抗リウマチ剤、
〔18〕 前記低分子化合物が、以下の一般式 (I)または (II)に記載の化合物である、〔1 7]に記載の抗リウマチ剤、
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
〔19〕 リウマチ滑膜細胞増殖抑制効果を有することを特徴とする、〔18〕に記載の抗 リウマチ剤、
〔20〕 以下の工程 (a)〜（c)を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法、
(a)シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞におけるシノビオリンタンパク質の発現量または活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、発現量または活性を低下させる化 合物を選択する工程
〔21〕 以下の工程 (a)〜（c)を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法、
(a)シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構 造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物を接触させな 、場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レべ ルを低下させる化合物を選択する工程
[22] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法、
(a)シノビオリンタンパク質および被検化合物を接触させる工程
(b)シノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、前記自己ュビキチンィ匕を制御する 化合物を選択する工程
〔23〕 シノビオリンタンパク質を構成要素として含む、抗リウマチ剤のスクリーニング 用3 rット、 を提供する。
さらに本発明は、本発明に記載のシノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を制 御する機能を有する物質を有効成分とする抗リウマチ剤を投与する工程を含むリウマ チ性疾患を予防もしくは治療する方法、および本発明に記載のの自己ュビキチンィ匕 を制御する機能を有する物質の抗リウマチ剤の製造における使用を提供するもので ある。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、シノビオリンホモノックアウトマウス胎仔線維芽細胞 (MEF)における蛍光 免疫組織染色の結果を示す写真である。
[図 2]図 2は、 syno-/-の embryoにおける抗 p53抗体による免疫組織染色の結果を示 す写真である。
[図 3]図 3は、 p53に関するウェスタンブロッテイングの結果を示す写真である。
[図 4]図 4は、 syno-/-の MEF培養細胞における p53のリン酸ィ匕部位を同定した結果を 示す写真である。
[図 5]図 5は、シノビォリンに対する siRNA処理によって亢進した Serl5のリン酸化が力 フェイン添カ卩によりどのように影響するかを調べたウェスタンブロッテイングの写真であ る。
[図 6]図 6は、シノビオリンに対する siRNA処理による、 p53および p21の発現が高まる ことを示すウェスタンブロッテイングの写真である。
[図 7]図 7は、フローサイトメーターによる細胞周期の観察結果を示す図である。
[図 8]図 8は、 Tissue arrayを、抗シノビオリン抗体 (lODa)を用いて免疫染色した結果を 示す写真である。
[図 9]図 9は、 Tissue arrayを、抗シノビオリン抗体 (lODa)を用いて免疫染色した結果を 示す写真である。
[図 10]図 10は、 GFP野生型 p53を導入した細胞における p53の局在を観察した写真 である。
[図 11]図 11は、 GFP野生型 p53および FLAG野生型シノビオリンを Saos-2細胞に共発 現させ、両導入遺伝子産物の局在を観察した写真である。 [図 12]図 12は、 GFP野生型 p53および FLAGシノビオリン C307Sを Saos-2細胞に共発 現させ、両導入遺伝子産物の局在を観察した写真である。
[図 13]図 13は、 MBP-Synoviolin Δ ΤΜ- Hisによる GST- p53の in vitroュビキチン化反 応を示す写真である。
[図 14]図 14は、シノビオリン RNAiによる RA滑膜細胞での p53 mRNA量を示すグラフ である。
[図 15]図 15は、作製した p53結合ドメイン欠失体の概略図、および結合アツセィを行 つた結果を示す図である。
[図 16]図 16は、 p53結合ドメイン欠失体と35 S-p53について GSTプルダウンアツセィを 行った結果を示す図である。
[図 17]図 17は、 A： Compound X、 Yの構造式を示す図である。 B: Compound X、 Yの p
53タンパク質ュビキチンィ匕反応阻害活性を示す写真である。
[図 18]図 18は、 Compound X、 Yの細胞毒性への影響を示す図である。
[図 19]図 19は、培養細胞における p53タンパク発現量に対する Compound Yの作用を 示す写真である。
[図 20]図 20は、 ELISAを用いた in vitro自己ュビキチン化反応検出時における抗体 濃度の影響を示す図である。
[図 21]図 21は、 ELISAを用いた in vitro自己ュビキチン化反応系におけるシノビオリ ン濃度の影響を示す図である。
[図 22]図 22は、 ELISAを用いた in vitro自己ュビキチン化反応におけるュビキチン 化反応時間の影響を示す図である。
[図 23]図 23は、低分子化合物 No.32の細胞増殖抑制効果を示す図である。
[図 24]図 24は、低分子化合物 No.38の細胞増殖抑制効果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
正常細胞を紫外線等にさらすと、細胞内の p53が活性ィ匕して、その結果細胞増殖が 阻止されることから、 p53の濃度を上昇させることにより、癌細胞の増殖を止めることが できる。つまり、 p53が機能しない場合は、癌細胞の増殖が止められず、癌が進行す ることになる。事実、 p53変異は正常な個体の細胞にはほとんど見られないが、癌患 者由来の細胞の約半数においてはこの p53の欠損又は点変異が起こっている。また 、このような変異が起こっていない場合でも、 p53の制御機構に何らかの変異が生じ て癌抑制機能が失われている。従って、癌の進行を抑えるには p53を有効に機能さ せることが必要である。
[0023] 本発明者らは、 p53タンパク質の活性ィ匕を癌治療の有効な方法の一つとするため、 シノビオリン (synoviolin)の機能に着目した。そして、シノビオリンホモノックアウト動物 を作製し、詳細に解析したところ、野生型に比してアポトーシスを起こしている細胞が 多数観察された。即ち、シノビォリンの機能を阻害すると、アポトーシスに深く関与し ている p53タンパク質の活性ィ匕が促進され、シノビオリンの機能阻害が癌抑制につな 力 ¾ことを見出した。
[0024] 本発明者らは、シノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能 (活性)を阻害（ 抑制）することによって、 p53タンパク質が活性ィ匕することを見出した。即ち本発明は、 シノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能阻害物質を有効成分として含有す る、 p53タンパク質活性化剤を提供する。
[0025] 本発明のシノビオリンタンパク質は、ヒトのシノビオリンタンパク質であることが好まし いが、その由来する生物種は特に制限されず、ヒト以外の生物におけるシノビオリン と同等なタンパク質 (シノビォリンのホモログ.オルソログ等)も本発明における「シノビ ォリンタンパク質」に含まれる。例えば、ヒト p53に相当するタンパク質を有し、かつ、ヒ トのシノビォリンと同等なタンパク質を有する生物であれば、本発明を実施することは 可能である。
[0026] シノビオリン、および p53のヒト並びにその他の生物における「相当するタンパク質」 の名称、 mRNA、アミノ酸配列のァクセッション番号を、表 1に示す。
[0027] [表 1]
Figure imgf000012_0001
シノビオリン
生物種 正式名称 mRNAのァクセッション番号 Proteinのァクセッション番号 ヒ卜 Synoviolin AB024690. BAC57449 1
マウス Hrd1 NM 023249 NP 075738.1
ラッ卜 synoviolinl XM 341999 XP 342000.2
ゼブラフィッシュ MGC : 55735 BC044465 AAH44465.1
キイ口ショウジヨウ/くェ sip3 NM 143637 NP 651894.3
線虫 5M249 NM 073568 NP 505969.1
[0028] ヒトのシノビオリン遺伝子の公共遺伝子データベース Genbankにおけるァクセッショ ン番号は、 AB024690 (配列番号： 1)である。
[0029] ヒトにおけるシノビオリンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号： 1に示す。また 該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。上 記以外のタンパク質であっても、例えば配列表に記載された配列と高い相同性 (通 常 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上 )を有し、かつ、シノビオリンタンパク質が有する機能 (例えば p53タンパク質と結合す る機能、 p53リン酸化タンパク質の活性を阻害する機能、 p53のュビキチンィ匕を促進す る機能等）を持つタンパク質は、本発明のシノピオリンに含まれる。上記タンパク質と は、例えば、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が付加、 欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列力もなるタンパク質であって、通常変化するアミ ノ酸数が 30アミノ酸以内、好ましくは 10アミノ酸以内、より好ましくは 5アミノ酸以内、最 も好ましくは 3アミノ酸以内である。
[0030] 本発明における「シノビオリン遺伝子」には、例えば、配列番号： 1に記載の塩基配 列からなる DNAに対応する他の生物における内在性の遺伝子 (ヒトのシノビオリン遺 伝子のホモログ等）が含まれる。
[0031] また、配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAに対応する他の生物の内在性 の DNAは、一般的に、配列番号： 1に記載の DNAと高い相同性を有する。高い相同 性とは、 50%以上、好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 80%以上、より好ましくは 90 %以上 (例えば、 95%以上、さらには 96%、 97%、 98%または 99%以上)の相同性を 意味する。この相同性は、 mBLASTアルゴリズム (Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 87: 2264—8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また、該 DNAは、生体内から単離した場合、 配列番号： 1に記載の DNAとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズすると考えられ る。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2 X SSC、 0.1%SDS、 50°C」、 「2 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」、 「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」、よりストリンジェントな条件とし て「2 X SSCゝ 0.1%SDSゝ 65°C」、 「0.5 X SSC、 0.1%SDSゝ 42°C」および「0.2 X SSC、 0.1 %SDS、 65°C」の条件を挙げることができる。当業者においては、他の生物における シノビオリン遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、シノビオリン遺伝子の塩基配列を 基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物に おけるシノビオリンタンパク質 (遺伝子）に相当するタンパク質 (遺伝子）、あるいは、 上述のシノビォリンと機能的に同等なタンパク質 (遺伝子）を、単に「シノビオリンタン パク質 (遺伝子) Jと記載する場合がある。
[0032] 本発明の「シノビオリンタンパク質」は、天然のタンパク質のほか、遺伝子組み換え 技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、 例えばシノビオリンタンパク質が発現して 、ると考えられる細胞 (組織)の抽出液に対 し、シノビオリンタンパク質に対する抗体を用いたァフィユティークロマトグラフィーを 用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、シノビオリ ンタンパク質をコードする DNAで形質転換した細胞を培養することにより調製すること が可能である。本発明の「シノビオリンタンパク質」は、例えば、後述のスクリーニング 方法において好適に用いられる。
[0033] 本発明にお 、て「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」 及びタンパク質の「分解抑制」によるものが含まれる。「シノビオリンタンパク質の発現」 とは、シノビオリンタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること、また はこれらの転写 ·翻訳によりシノビオリンタンパク質が生成されることを意味する。また 、「シノビォリンタンパク質の機能」とは、例えば、シノビォリンが p53と結合する機能、 p 53リン酸ィ匕タンパク質の活性を抑制する機能、 p53のュビキチン化を促進する機能、 または p53の活性ィ匕を抑制する機能等を挙げることができる。 [0034] 上述の各種機能は、当業者においては、一般的な技術を用いて、適宜、評価 (測 定)することが可能である。具体的には、後述の実施例に記載の方法、あるいは該方 法を適宜改変して実施することができる。
[0035] 従って、「シノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能を阻害する」とは、野生 型シノビォリン遺伝子またはタンパク質の量、機能または活性と比較して、その量、機 能または活性を低下または消失させることをいう。上記「阻害」には、機能と発現の両 者を阻害すること、およびどちらか一方を阻害することのいずれもが含まれる。
[0036] シノビオリンは p53のュビキチン化を促進するため、シノビォリンと p53との結合を阻 害することにより、 p53のュビキチンィ匕を阻害することができる。また、 p53のュビキチン 化を阻害することにより、 P53が活性化され癌が抑制される。
[0037] 本発明において「p53タンパク質活性化剤」とは、より具体的には p53タンパク質の発 現および Zまたは機能を亢進 (上昇)させるような機能を有する薬剤と 、うことができ る。
[0038] 本発明の上記阻害物質としては、好ましくは、低分子化合物を挙げることができる。
従って、本発明の好ましい態様においては、シノビオリンタンパク質の発現および Z または機能を阻害する低分子化合物を有効成分として含有する、 P53タンパク質活性 化剤を提供する。
[0039] 本発明者らによって、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害することによ り、 p53タンパク質のュビキチンィ匕が阻害され、その結果、 p53タンパク質が活性ィ匕さ れることが見出された。
シノビオリンは、 p53のュビキチンィ匕を促進するものと考えられる。ュビキチン化とは 、タンパク質の分解マーカー分子であるュビキチンによるタンパク質の翻訳後の修飾 反応をいう。このュビキチンィ匕の生理的意義は、プロテオソーム系のタンパク質分解 機構へ送られるためのタグ修飾として、従来認識されていた。そして、その後の研究 により、現時点でのュビキチンィ匕の意義は、タンパク質機能を制御する可逆的タンパ ク質修飾システムとして位置づけられて 、る。
[0040] ュビキチンィ匕は、具体的には、ュビキチン活性ィ匕酵素（E1)、ュビキチン結合酵素（ E2)およびュビキチンリガーゼ (E3)などの酵素が協同したカスケード反応を繰り返す ことにより、基質となるタンパク質にュビキチン分子を枝状に結合させてポリュビキチ ン鎖を形成する過程をいう。このポリュビキチン鎖は、ュビキチン分子内の 48番目の リシン残基の ε -アミノ基を介して形成され、 26Sプロテアノームへの分解シグナルとな り、標的タンパク質を分解に導く。
[0041] 本発明は、シノビォリンの発現および Ζまたは機能を阻害することにより Ρ53を活性 化させることを特徴とし、このような ρ53の活性ィ匕は、上記 ρ53のリン酸化機構とは別に 、 ρ53のュビキチンィ匕が阻害されるという機構に着目したものである。
本発明におけるシノビオリンタンパク質の発現および Ζまたは機能を阻害する低分 子化合物は、好ましくは、 Ρ53タンパク質のュビキチンィ匕を阻害する機能を有するィ匕 合物である。
[0042] 本発明者らは、後述の実施例に示すように、シノビォリンによる ρ53のュビキチンィ匕 の促進活性を阻害する低分子化合物 (Compound X, Y)を同定することに成功した。 本発明における低分子化合物として、例えば、本発明者らによって同定された以下 の一般式 (iXCompound X)または一般式 (II)(Compound Y)で表される化合物を具体 的に示すことができる。
[0043]
Figure imgf000015_0001
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[0045] 上記一般式 (I)および (II)で表される化合物は、ナミキ商事 (AMBINTER)より取得可 能である。 （カタログ No.はそれぞれ、 A0420/0019436、 A1328/0060050である。） また、本発明において有効成分となる一般式 (I)または (II)の化合物は、該化合物 において薬学的に許容される塩であってもよい。さらに、該化合物の塩にカ卩えて、例 えば、該化合物の水和物、溶媒和物、異性体等が含まれる。これらの化合物も同様 に P53活性ィ匕作用もしくは癌抑制作用を有することが期待される。
[0046] 本発明にお 、て「塩」とは、本発明の化合物（一般式 (I)または（II)の化合物）と塩を 形成し、かつ薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、無機酸 塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩などがあげら れる。通常、本発明において「塩」とは、通常、薬学的に許容される塩を言う。
[0047] 無機酸塩の好ま 、例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、 リン酸塩などがあげられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸 塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クェン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安 息香酸塩、メタンスルホン酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩などがあげられる。
[0048] 無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金 属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、ァ ンモ -ゥム塩などがあげられ、有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジェチルァ ミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、 N, N，一ジベンジルエチレンジァミン塩 などがあげられる。
[0049] 酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばァスパラギン酸塩、グルタミン酸塩な どが挙げられ、塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン 塩、オル-チン塩などがあげられる。
本発明に係る化合物の単離，精製は、抽出、濃縮、留去、結晶化、ろ過、再結晶、 各種クロマトグラフィーなどの通常の化学操作を適用して行うことができる。
[0050] 本発明にお 、ては、化合物の構造式が便宜上一定の異性体を表すことがあるが、 本発明には化合物の構造上生ずるすべての幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異 性体、立体異性体、互変異性体等の異性体および異性体混合物を含み、便宜上の 式の記載に限定されるものではなぐいずれか一方の異性体でも混合物でもよい。従 つて、本発明の化合物には、分子内に不斉炭素原子を有し光学活性体およびラセミ 体が存在することがありうるが、本発明においては限定されず、いずれもが含まれる。
[0051] また、本発明に係る化合物にっ 、て得られる種々の異性体 (例えば幾何異性体、 不斉炭素に基づく光学異性体、回転異性体、立体異性体、互変異性体等)は、通常 の分離手段、例えば再結晶、ジァステレオマー塩法、酵素分割法、種々のクロマトグ ラフィー（例えば薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィ 一、等)を用いることにより精製し、単離することができる。
[0052] また本発明者らによって、シノビォリンが p53と結合し、 p53の機能を阻害する機能を 有することが分力つた。つまり、シノビォリンの発現および Zまたは機能を阻害するこ とにより、シノビォリンと p53との結合が阻害され、 p53の機能が活性ィ匕される。
従って、本発明におけるシノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能を阻害 する低分子化合物は、好ましくは、シノビオリンタンパク質と p53タンパク質との結合（ 相互作用）を阻害する機能を有する化合物である。
[0053] シノビオリンタンパク質の p53結合ドメインは、例えば、シノビォリンのアミノ酸配列の うち、特定の領域を欠失させた、 p53結合ドメイン欠失体を数種類作製して、 35S-p53 について GSTプルダウンアツセィを行うことにより決定することができる。具体的には、 上記のシノビォリンの P53結合ドメイン欠失体を GST-融合タンパク質として大腸菌等 で発現させて、 35S-p53タンパク質とのタンパク質-タンパク質間結合を GSTプルダウン アツセィ法により確認する。
[0054] 上記方法により、シノビォリンにおける p53結合ドメインは、シノビオリンタンパク質に 含まれるアミノ酸配列（配列番号： 2)の第 236から 270番目までの 35アミノ酸残基であ ることが判明した。
従って、上記の化合物として、例えば、シノビオリンタンパク質の 236位から 270位の 35アミノ酸領域をターゲットとして、 p53との結合を阻害する化合物が挙げられる。
[0055] また本発明者らによって、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害すること によって、 p53タンパク質のアミノ酸残基の一部がリン酸化酵素によりリン酸化され、活 性ィ匕することが見出された。
従って、本発明におけるシノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能を阻害 する低分子化合物は、好ましくは、 p53リン酸ィ匕タンパク質を活性ィ匕する機能を有する 化合物である。
[0056] p53タンパク質の活性ィ匕につながるリン酸ィ匕の対象となるアミノ酸残基は、 p53のアミ ノ酸配列のうちセリン残基であることが好ましぐ第 15番目のセリン残基 (Serl5)がさら に好ましい。
従って、上記の化合物として、例えば、 p53の 15位のセリン残基を基質とするリン酸 化タンパク質の活性を上昇させる機能を有する化合物を挙げることができる。
[0057] p53の Serl5がリン酸ィ匕されると、 p53の発現が高まり、転写活性が亢進し、その結果 転写産物が増加する。この p53の Serl5のリン酸化には、 ATM(ataxia-telangiectasia m utated)、 ATR(ataxia- telangiectasia related),等のリン酸化酵素が深く関与している。 ATMは、ヒトの常染色体性劣性遺伝疾患である毛細血管拡張性運動失調症の原因 タンパク質であり、 DNAの損傷を感知して癌抑制遺伝子 p53をリン酸ィ匕することで細 胞の増殖をコントロールする機能を有する。 ATRは、 ATMのファミリーの一つであるが 、広範囲にわたる化学療法薬、紫外線の照射、あるいはタンパクリン酸ィ匕酵素の抑制 により誘導され、かつ、 ATMが関与しない p53の活性ィ匕に関与するリン酸ィ匕酵素であ る。
[0058] ATMおよび ATRは、カフェインによりその機能が阻害されることが知られているが、 本発明にお 、ては、シノビォリンの発現および/または機能の阻害実験にカフェイン を用いることにより、シノビォリンが ATMおよび ATR活性ィ匕を調節して 、ることが判明 した。 [0059] 即ち、カフェイン非存在下にお 、て、シノビォリンの発現および/または機能を阻害 すると p53が活性ィ匕される。一方、カフェイン存在下でシノビォリンの発現および/また は機能を阻害すると、 p53の活性ィ匕は抑制される。また、カフェインにより ATMおよび ATRの活性 (p53のリン酸化）が阻害されることは知られて 、る。
[0060] カフェインにより ATMおよび ATRの活性を阻害することにより、シノビォリンの発現お よび/または機能を阻害しても P53は活性ィ匕されな 、ことから、シノビォリンの発現およ び/または機能を阻害すると、 ATMおよび ATRによる p53の活性ィ匕を誘導すると ヽぅメ 力-ズムが考えられる。そうすると、シノビォリンの発現および/または機能を阻害する ことによりこれらのリン酸ィ匕酵素活性が高められるといえる。従って、本発明は、シノビ ォリンの発現および/または機能を阻害することにより、リン酸化酵素の活性化を促進 することを特徴とする。 ATMおよび ATRと同様の活性を有する酵素等 (p53をリン酸ィ匕 する酵素等）は、 DNA-PKまたは GSK3 β等でも良い。
従って、本発明において「ρ53リン酸ィ匕タンパク質」とは、 ρ53を基質としてリン酸化し 得るタンパク質であれば特に制限されないが、通常、 ATM、 ATR、 DNA-PKまたは GS K3 β等を指し、より好ましくは、 ATMもしくは ATRである。
[0061] p53の Serl5がリン酸ィ匕されることにより発現が誘導される物質としては、 p21というタ ンパク質が知られている。 p21は、サイクリン依存性リン酸化酵素（CDK)活性の阻害 剤として機能し、 CDK活性を阻害することにより、細胞周期の調節を担うタンパク質で ある。 CDKは、細胞周期の抑制の要となり、そのパートナーであるサイクリンタンパク 質と共に機能し、例えば、細胞の休止状態である G1期力も DNAの複製期である S期 へのスムーズな移行を司る。癌細胞において、 p53が活性ィ匕されると、 CDK阻害剤で ある p21の発現が高まるため、癌細胞の G1期力も S期への移行が妨げられることにより 癌が抑制される。従って、本発明は、上記のように、シノビォリンの発現および/または 機能を阻害させることにより、 p53の活性化を高めて p21の発現を誘導させ、 CDKの阻 害を起こすことにより癌を抑制することを特徴とする。
[0062] なお本発明における、上記低分子化合物は、天然由来の化合物または人工的に 合成された化合物のいずれであってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いること によって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリ 一二ング方法によって、取得することも可能である。
[0063] さらに本発明におけるシノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能阻害物質 として、例えば以下の（a)または (b)の化合物を挙げることができる。
(a)シノビオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質と結合する抗体
(b)シノビオリンタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するシノビオリンタ ンパク質変異体
[0064] シノビオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質に結合する抗体は、当業者に 公知の方法により調製することが可能である。
[0065] ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然のシノ ピオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質、あるいは GSTとの融合タンパク質と して大腸菌等の微生物にぉ 、て発現させたリコンビナント (組み換え)シノビオリンタ ンパク質および Zまたは P53タンパク質、またはその部分ペプチドをゥサギ等の小動 物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム 、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、シノビオリンタンパク質および/または p53タン ノ ク質や合成ペプチドをカップリングしたァフィユティーカラム等により精製することに より調製する。
[0066] また、モノクローナル抗体であれば、例えばシノビオリンタンパク質および Zまたは P 53タンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウ スより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細 胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞 (ハイブリドーマ）の中から、シノビオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質に結 合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたノ、イブリドーマをマウス 腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば 、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 シノビォリンタンパク質および/または P53タンパク質や合成ペプチドをカップリングし たァフィユティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
[0067] 本発明の抗体は、本発明のシノビオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質に 結合するものであれば特に制限はなぐ上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗 体のほかにヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片ゃ抗 体修飾物であってもよい。上記抗体は、 p53との結合に関与するシノビオリンタンパク 質の第 236から 270番目のアミノ酸領域を認識する抗体であることが好ましい。該抗体 は、効果的にシノビォリンと P53との結合を阻害することが期待される。
[0068] 抗体取得の感作抗原として使用される本発明のシノビオリンタンパク質および Zま たは p53タンパク質はその由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例 えばマウスやヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ま 、。 ヒト由来のタンパク質は、当業者においては本明細書に開示される遺伝子配列また はアミノ酸配列を用いて適宜取得することができる。
[0069] 本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるい はタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例 えば、タンパク質のアミノ基 (N)末端断片やカルボキシ (C)末端断片が挙げられる。 本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長または断片に反応する抗体を意味す る。
[0070] また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球 、例えば EBウィルスに感染したヒトリンパ球を in vitroでタンパク質、タンパク質発現細 胞またはその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエ口 一マ細胞、例えば U266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗 体を産生するハイプリドーマを得ることもできる。
[0071] 本発明のシノビオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質に対する抗体は、シ ノビオリンタンパク質および/または p53タンパク質と結合することにより、シノビオリン タンパク質の発現もしくは機能を阻害し、例えば P53タンパク質の活性ィ匕する効果が 期待される。得られた抗体を人体に投与する目的 (抗体治療)で使用する場合には、 免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型化抗体が好ま 、。
[0072] さらに本発明のシノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害し得る物質として、 シノビォリンタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するシノビオリンタン ノ ク質変異体 (シノビオリンドミナントネガティブタンパク質)を挙げることができる。「シ ノビオリンタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するシノビオリンタンパク 質変異体」とは、該タンパク質をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性 の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す
。このようなシノビオリンドミナントネガティブタンパク質としては、例えば、 p53との結合 を野生型シノビォリンと競合阻害するようなシノビオリンタンパク質変異体を挙げること ができる。より具体的には、 p53との結合ドメインを含むシノビオリンタンパク質の部分 断片ペプチドを挙げることができる。シノビオリンタンパク質のアミノ酸配列にぉ 、て 2 36位〜 270位のアミノ酸領域を含む断片ペプチドは、上記ドミナントネガティブタンパ ク質の好まし 、一例である。
[0073] 本発明にお 、てシノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能阻害物質には、 例えばシノビオリン遺伝子の転写もしくは該転写産物力 の翻訳を阻害する物質が 含まれる。本発明の上記物質の好ましい態様として、例えば以下の（a)〜（c)からな る群より選択される化合物 (核酸)を挙げることができる。
(a)シノビオリン遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)シノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する核酸
(c)シノビオリン遺伝子の発現を RNAi効果により阻害する作用を有する核酸
[0074] 本発明における「核酸」とは RNAまたは DNAを意味する。また所謂 PNA (peptide nu cleic acid)等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。 PNAは、核酸の 基本骨格構造である五単糖 ·リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置 換したもので、核酸によく似た 3次元構造を有する。また所謂 LNA(Locked Nucleic Ac id)も本発明の核酸に含まれる。
[0075] 特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用す る方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害 する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転 写開始阻害、 RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位と のハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつある RNAとのハイブリッド形成に よる転写阻害、イントロンとエタソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプラ イシング阻害、スプライソソーム形成部位とのノ、イブリツド形成によるスプライシング阻 害、 mRNAとのハイブリッド形成による核力 細胞質への移行阻害、キヤッビング部位 やポリ (A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結 合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合 部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、 mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位 とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互 作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセ ンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標 的遺伝子の発現を阻害する (平島および井上，新生化学実験講座 2核酸 IV遺伝子 の複製と発現， 日本生化学会編，東京化学同人， 1993, 319-347.)。
[0076] 本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用によりシノビオリン 遺伝子の発現および Zまたは機能を阻害してもよい。一つの態様としては、シノビォ リン遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計す れば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは 3'側の非 翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、シノビオリン遺伝子の 翻訳領域だけでなぐ非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明 で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当な プロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が 連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動 物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される 動物 (細胞）が有する内在性のシノビオリン遺伝子またはその一部と相補的な配列で あることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補 的でなくてもよい。転写された RNAは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90% 以上、最も好ましくは 95%以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺 伝子 (シノビオリン)の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少な くとも 15塩基以上 25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は 必ずしもこの長さに限定されず、例えば 100塩基以上、または 500塩基以上であっても よい。
[0077] 本発明のアンチセンス核酸は特に制限されな 、が、例えば GenBankのァクセッショ ン番号 AB024690で取得されるシノビォリン遺伝子の塩基配列（配列番号： 1)等をもと に作成することができる。
[0078] また、シノビオリン遺伝子の発現の阻害は、リボザィム、またはリボザィムをコードす る DNAを利用して行うことも可能である。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子を 指す。リボザィムには種々の活性を有するものが存在する力 中でも RNAを切断する 酵素としてのリボザィムに焦点を当てた研究により、 RNAを部位特異的に切断するリ ボザィムの設計が可能となった。リボザィムには、グループ Iイントロン型や RNase Pに 含まれる Ml RNAのように 400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーへッ ド型ゃヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（ 小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素， 1990, 35, 2191.)。
[0079] 例えば、ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15という配列 の C15の 3'側を切断する力 その活性には U14と A9との塩基対形成が重要とされ、 C1 5の代わりに A15または U15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al.， FEBS Lett, 1988, 228, 228.) 0基質結合部位が標的部位近傍の RNA配列と相補的 なリボザィムを設計すれば、標的 RNA中の UC、 UUまたは UAという配列を認識する制 限酵素的な RNA切断リボザィムを作出することができる（Koizumi, M. et al.， FEBS Le tt, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素， 1990, 35, 2191. 、 Koizumi, M. et al, Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.)。
[0080] また、ヘアピン型リボザィムも本発明の目的に有用である。このリボザィムは、例え ばタバコリングスポットウィルスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.)。ヘアピン型リボザィムからも、標的特異的な RNA切断 リボザィムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋，化学と生物， 1992, 30, 112.)。このように、リボザィムを用い て本発明におけるシノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺 伝子の発現を阻害することができる。
[0081] 内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配 列を有する二本鎖 RNAを用いた RNA干渉（RNA interference,以下「RNAi」と略称す る）によっても行うことができる。
[0082] RNAi効果による阻害作用を有する核酸は、一般的に siRNAもしくは shRNAとも呼ば れる。 RNAiは、標的遺伝子の mRNAと相同な配列力もなるセンス RNAとこれと相補的 な配列力 なるアンチセンス RNAと力 なる短鎖二本鎖 RNA (以下、「dsRNA」と略称 する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子 mRNAに特異的かつ選択的に結合 して破壊を誘導し、当該標的遺伝子を切断することにより標的遺伝子の発現を効率 よく阻害する（抑制する）現象である。例えば、 dsRNAを細胞内に導入すると、その RN Aと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン)される。このように RNAiは、標的 遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺 伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療へ の応用可能な方法として注目されている。 RNAiに用いる RNAは、シノビオリン遺伝子 もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相 同性を有することが好まし 、。
[0083] siRNAの設計は、以下の通り行うことができる。
(a)シノビオリンをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなぐ任意の 領域を全てターゲット候補とすることが可能である。例えば、ヒトの場合では、 GenBan kァクセッション番号 AB024690 (配列番号： 1)の任意の領域を候補にすることができ る。
(b)選択した領域から、 AAで始まる配列を選択し、その配列の長さは 19〜25塩基、 好ましくは 19〜21塩基である。その配列の GC含量は、例えば 40〜60%となるものを選 択するとよい。具体的には、配列番号： 1に示される塩基配列のうち、以下の塩基配 列から選ばれる少なくとも 1つの配列を含む DNAを siRNAの標的配列として使用する ことができる。特に、（0 (配列番号: 3)、 GO (配列番号 :4)、(vi) (配列番号 : 8)、(vii) (配列番号: 9)、（viii) (配列番号 : 10)を標的とすることが好ましい。
[0084] (0 AA TGTCTGCATCATCTGCCGA GA (配列番号： 3)
(ii) AA GCTGTGACAGATGCCATCA TG (配列番号： 4)
(iii) AA AGCTGTGACAGATGCCATC AT (配列番号： 5)
(iv) AA GAAAGCTGTGACAGATGCC AT (配列番号： 6)
(v) AA GGTTCTGCTGTACATGGCC TT (配列番号： 7)
(vi) AA CAAGGCTGTGTACATGCTC TA (配列番号： 8) (vii) AA ATGTTTCCACTGGCTGGCT GA (配列番号： 9)
(viii) AA GGTGTTCTTTGGGCAACTG AG (配列番号： 10)
(ix) AA CATCCACACACTGCTGGAC GC (配列番号： 11)
(x) AA CACCCTGTATCCAGATGCC AC (配列番号： 12)
(xi) AA GGTGCACACCTTCCCACTC TT (配列番号： 13)
(xii) AA TGTTTCCACTGGCTGGCTG AG (配列番号： 14)
(xiii) AA GAGACTGCCCTGCAACCAC AT (配列番号： 15)
(xiv) AA CGTTCCTGGTACGCCGTCA CA (配列番号： 16)
[0085] siRNAを細胞に導入するには、 in vitroで合成した siRNAをプラスミド DNAに連結し てこれを細胞に導入する方法、 2本の RNAをァニールする方法などを採用することが できる。
[0086] また本発明の好ましい siRNAの一例として、配列番号： 18に記載されたセンス鎖と、 配列番号： 19に記載されたアンチセンス鎖とをァニールさせた 2本鎖 RNAを示すこと ができる。該 RNAは、より具体的には、以下のような構造の RNA分子である。
5' GGU GUU CUU UGG GCA ACU G TT 3' (配列番号 : 1 8 )
3' TT CCA CAA GAA ACC CGU 瞧 (配列番号 : 1 9 )
(上記「I」は水素結合を表す。）
[0087] なお、上記 RNA分子は、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を 有する siRNA(shRNA)であってもよい。 shRNAとは、ショートヘアピン RNA(short hairpin RNA)と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステム ループ構造を有する RNA分子である。即ち、分子内において二本鎖 RNA構造を形成 し得る分子もまた本発明の siRNAに含まれる。
[0088] また、本発明の好ま 、態様としては、シノビオリン遺伝子の発現を RNAi効果により 抑制し得る RNA (siRNA)であって、本明細書によって具体的に示された DNA配列（配 列番号： 3〜16)を標的とする siRNA、または配列番号： 18および 19によって形成さ れる siRNAの塩基配列において、例えば、 1もしくは少数の RNAが付加もしくは欠失さ れた構造の二本鎖 RNAであっても、シノビオリン遺伝子の発現を抑制する機能を有 するものであれば、本発明の siRNAに含まれる。
RNAi(siRNA)のために使用される RNAは、シノビオリン遺伝子もしくは該遺伝子の部 分領域と完全に同一湘同)である必要はないが、完全な同一湘同)性を有すること が好ましい。
[0089] RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もある力 DICERといわれる酵素（R Nase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖 RNAと接触し、二本鎖 RNAが small i nterfering RNAまたは siRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられて!/、る 。本発明における RNAi効果を有する二本鎖 RNAには、このように DICERによって分 解される前の二本鎖 RNAも含まれる。即ち、そのままの長さでは RNAi効果を有さない ような長鎖の RNAであっても、細胞にお!、て RNAi効果を有する siRNAへ分解されるこ とが期待されるため、本発明における二本鎖 RNAの長さは特に制限されない。
[0090] 例えば、本発明のシノビオリン遺伝子の mRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対 応する長鎖二本鎖 RNAを、例えば、予め DICERで分解させ、その分解産物を本発明 の薬剤として利用することが可能である。この分解産物には、 RNAi効果を有する二本 鎖 RNA分子 (siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、 RNAi効果を有 することが期待される mRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、 RNAi効果を 有する本発明のシノビオリン遺伝子の mRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される 必要はない。
[0091] 本発明の上記「RNAi効果を有する二本鎖 RNA」は、当業者においては、該ニ本鎖 RNAの標的となる本発明のシノビオリン遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製すること ができる。一例を示せば、配列番号： 1に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖 RNAを作製することができる。即ち、配列番号： 1に記載の塩基配列をもとに、該配列 の転写産物である mRNAの任意の連続する RNA領域を選択し、この領域に対応する 二本鎖 RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適 宜行ぃ得ることである。また、該配列の転写産物である mRNA配列から、より強い RNA i効果を有する siRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって 適宜実施することが可能である。また、一方の鎖 (例えば、配列番号： 1に記載の塩基 配列）が判明して!/、れば、当業者にお!、ては容易に他方の鎖 (相補鎖)の塩基配列 を知ることができる。 siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作 製することが可能である。また、所望の RNAの合成については、一般の合成受託サ 一ビスを利用することができる。
[0092] また、本発明における siRNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド (RN A)でなくともよい。即ち、本発明において、 siRNAを構成する 1もしくは複数のリボヌク レオチドは、対応するデォキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、 糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種 (アデニン、グァニン、シトシン、チミン（ ゥラシル)）であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応する デォキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデォキシリボヌクレオチドのことを言 う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは 2〜5個程度の少数を指す
[0093] さらに、本発明の上記 RNAを発現し得る DNA (ベクター)もまた、本発明のシノビオリ ン遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の 上記二本鎖 RNAを発現し得る DNA (ベクター）は、該ニ本鎖 RNAの一方の鎖をコード する DNA、および該ニ本鎖 RNAの他方の鎖をコードする DNA力 それぞれ発現し得 るようにプロモーターと連結した構造を有する DNAである。本発明の上記 DNAは、当 業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より 具体的には、本発明の RNAをコードする DNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜揷 入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
[0094] さらに、本発明の上記 RNAを発現し得る DNA (ベクター)もまた、本発明のシノビオリ ン遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の 上記二本鎖 RNAを発現し得る DNA (ベクター）は、該ニ本鎖 RNAの一方の鎖をコード する DNA、および該ニ本鎖 RNAの他方の鎖をコードする DNA力 それぞれ発現し得 るようにプロモーターと連結した構造を有する DNAである。本発明の上記 DNAは、当 業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より 具体的には、本発明の RNAをコードする DNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜揷 入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
[0095] また、本発明の発現阻害物質には、例えば、シノビォリンの発現調節領域 (例えば 、プロモーター領域）と結合することにより、シノビォリンの発現を阻害する化合物が 含まれる。該化合物は、例えばシノビォリンのプロモーター DNA断片を用いて、該 DN A断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能であ る。また、当業者においては、所望の化合物について、本発明のシノビォリンの発現 を阻害する力否かの判定を公知の方法、例えばレポーターアツセィ法等により適宜 実施することができる。
[0096] さらに、本発明の上記 RNAを発現し得る DNA (ベクター)もまた、本発明のシノビオリ ン遺伝子の発現を阻害し得る化合物の好ま 、態様に含まれる。例えば本発明の上 記二本鎖 RNAを発現し得る DNA (ベクター）は、該ニ本鎖 RNAの一方の鎖をコードす る DNA、および該ニ本鎖 RNAの他方の鎖をコードする DNA力 それぞれ発現し得る ようにプロモーターと連結した構造を有する DNAである。本発明の上記 DNAは、当業 者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具 体的には、本発明の RNAをコードする DNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入 することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
本発明の上記ベクターの好ま 、態様としては、シノビォリンの発現を阻害する siR NAを発現するベクターを挙げることができる。
[0097] また本発明の発現阻害物質には、例えばシノピオリンの発現調節領域 (例えば、プ 口モーター領域）と結合することにより、シノビォリンの発現を阻害する化合物が含ま れる。該化合物は例えばシノビォリンのプロモーター DNA断片を用いて、該 DNA断 片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。 また、当業者においては、所望の化合物について、本発明のシノビォリンの発現を阻 害する力否かの判定を公知の方法、例えばレポーターアツセィ法等により適宜実施 することができる。
[0098] 本発明の p53タンパク質活性化剤は、癌抑制タンパク質である p53を活性ィ匕すること により癌細胞の増殖を阻止する作用を有する。従って、本発明は、本発明の p53タン パク質活性化剤を有効成分とする、癌治療剤を提供する。
[0099] シノビォリンの発現もしくは機能を阻害すると、リン酸ィ匕酵素により p53がリン酸ィ匕さ れて p53が活性ィ匕し、サイクリン依存性リン酸ィ匕酵素阻害タンパク質である p21タンパ ク質の発現を高め、その結果、癌細胞の G1期から S期への移行を妨げることにより、 癌の発生または増殖を抑制するものと考えられる。
従って、本発明の p53タンパク質活性化剤を含有する薬剤は、 p21タンパク質活性 ィ匕剤、あるいは、細胞周期（特に G1期から S期への移行)阻害剤となり得る。
[0100] なお p53が関与する疾患については、上述の癌の他にも、例えば神経変性疾患が 知られている（実験医学、増刊号、 2001、 p53研究の新たな挑戦、 p.122-127)。その ため本発明の p53タンパク質活性化剤は、神経変性疾患に対する治療剤ともなり得る と考えられる。
[0101] また、本発明の「癌治療剤」は、「癌細胞増殖抑制剤」、「癌細胞発生抑制剤」、「腫 瘍増殖抑制剤」、「抗癌剤」、あるいは「制癌剤」と表現することも可能である。また、本 発明において「治療剤」は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現する ことちでさる。
[0102] なお、本発明における「治療」には、癌の発生を予め抑制し得る予防的な効果も含 まれる。また、癌細胞 (組織）に対して、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限 定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。
[0103] 本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合 し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤として は、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とする ことができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤 型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内 注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示 すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技 術は公知である。
[0104] 例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および 滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤に は、乳糖、デンプン、あるいはマン-トール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、 炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結 合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドン が用いられる。滑沢剤としては、タルクゃステアリン酸マグネシウム等が公知である。
[0105] 本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコー ティングを施すことができる。コーティング剤には、ェチルセルロースやポリオキシェ チレングリコール等を用いることができる。
[0106] また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒 に溶解、あるいは分散させること〖こより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶 剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生 理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油ゃプ ロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存 剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩ィ匕ナトリウムゃブドウ糖等の公知の 等張化剤をカ卩えることができる。更に、塩ィ匕ベンザルコ-ゥムゃ塩酸プロ力インのよう な無痛化剤を添加することができる。
[0107] また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外 用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたもの と同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当 な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、ェチル アルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、 一般にベントナイト、ポリビュルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビ -ルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩ィ匕ベンザルコ -ゥム等の保存剤 を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロー ス誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
[0108] 本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により 直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる 。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、ヘル ぺスゥイノレスベクター、ワクシニアウイノレスベタター、レトロウイノレスベタター、レンチウ ィルスべクタ一等が挙げられ、これらのウィルスベクターを用いることにより効率よく投 与することができる。
[0109] また、本発明の薬剤をリボソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投 与することも可能である。 siRNAや shRNAを保持させた小胞体をリポフエクシヨン法に より所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身 投与する。癌組織等に局所的に投与することもできる。
[0110] 本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物 に対して、必要量 (有効量)が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、 投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または 獣医師の判断により適宜決定することができる。一例を示せば、年齢、性別、症状、 投与経路、投与回数、剤型によって異なる力 例えばアデノウイルスの場合の投与量 は 1日 1回あたり 106〜1013個程度であり、 1週〜 8週間隔で投与される。
[Oil 1] また、 siRNAまたは shRNAを目的の組織または器官に導入するために、巿販の遺伝 子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社)を用いることもできる。
[0112] 本発明の薬剤を使用する場合は、適用部位もしくは癌種は特に限定されず、脳腫 瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、脾臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸 癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維 肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病（例えば急性骨髄性白血病、急性リ ンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型 T細胞白血病、悪 性リンパ腫)、等を対象として適用される。上記癌は、原発巣であっても、転移したも のであっても、他の疾患と併発したものであってもよ！/、。
[0113] また本発明は、シノビオリン遺伝子の発現量を指標とする、癌治療剤のスクリーニン グ方法を提供する。
シノビォリン遺伝子の発現量を低下 (抑制）させる化合物は、癌治療のための薬剤 となることが期待される。本発明のスクリーニング方法によって、癌治療剤もしくは癌 治療剤のための候補ィ匕合物を効率的に取得することができる。
[0114] 本発明の方法の好ましい態様は、以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌治療剤のスク リーニング方法である。
(a)シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を低下させる 化合物を選択する工程
[0115] 上記方法においてはまず、シノビォリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接 触させる。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来する細胞が 挙げられるが、これらに由来する細胞に特に制限されず、シノビオリンを発現するよう に形質転換された大腸菌、酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。「シノ ピオリン遺伝子を発現する細胞」としては、内在性のシノビオリン遺伝子を発現してい る細胞、または外来性のシノビオリン遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細 胞を利用することができる。外来性のシノビオリン遺伝子が発現した細胞は、通常シノ ピオリン遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製する ことができる。該発現べクタ一は、一般的な遺伝子工学技術によって作製することが できる。
[0116] 本方法に用いる被検化合物としては、特に制限されないが、例えば、天然化合物、 有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物 ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微 生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。
[0117] シノビオリン遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常シノビオリン 遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この 方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現 する DNAベクターを、該細胞へ導入することにより、上記「接触」を行うことができる。
[0118] 本方法においては次いで、該シノビオリン遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺 伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は、 当業者に公知の方法によって行うことができる。
[0119] 例えば、シノビオリン遺伝子を発現する細胞から mRNAを定法に従って抽出し、この mRNAを铸型としたノーザンハイブリダィゼーシヨン法、 RT-PCR法、 DNAアレイ法等 を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また、シノビオリ ン遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、シノビオリンタンパク質の発 現を SDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行 うこともできる。さらに、シノビオリンタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンプロ ッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の 翻訳量の測定を行うことも可能である。シノビオリンタンパク質の検出に用!、る抗体と しては、検出可能な抗体であれば特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、ま たはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
[0120] 本方法にお!、ては、次 、で、被検化合物を接触させな 、場合 (対照）と比較して、 該発現量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は癌治療のための薬 剤となる。
[0121] また本発明のスクリーニング方法の他の態様は、シノビオリンタンパク質の活性を指 標とする方法である。上記方法は、例えば以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌治療剤 のスクリ一二ング方法である。
(a)シノビオリンタンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液 と被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞におけるシノビオリンタンパク質の活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな ヽ場合と比較して、前記タンパク質の活性を低下させる 化合物を選択する工程
[0122] 本方法においてはまず、シノビォリンタンパク質または該タンパク質を発現する細胞 もしくは細胞抽出液と被検化合物を接触させる。
[0123] 次いで、シノビオリンタンパク質の活性を測定する。シノビォリンタンパク質の活性と しては、例えば p53タンパク質との結合活性 (相互作用活性）、 p53タンパク質のュビキ チンィ匕を促進させる活性、 p53リン酸ィ匕タンパク質の活性ィ匕を阻害する活性等が挙げ られる。該活性の測定は当業者においては公知の手法、例えば、免疫沈降法、プル ダウンアツセィ、酵母ツーハイブリッド法等によって適宜実施することができる。
[0124] さらに被検化合物を接触させない場合 (対照）と比較して、該タンパク質の活性を低 下 (抑制）させる化合物を選択する。低下 (抑制）させる化合物は癌治療のための薬 剤となる。
[0125] 本発明のスクリーニング方法の他の態様は、本発明のシノビオリン遺伝子の発現レ ベルを低下させる化合物をレポーター遺伝子の発現を指標として選択する方法であ る。 [0126] 本発明の上記方法の好ま 、態様は以下の (a)〜 (c)の工程を含む、癌治療剤の スクリーニング方法である。
(a)シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構 造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物を接触させな 、場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レべ ルを低下させる化合物を選択する工程
[0127] 本方法においてはまず、シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子と が機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合 物を接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、シノビォリン遺伝子の転写調節領 域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、 シノビォリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合して 、ることを 、う。 従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タ ンパク質を形成する場合であっても、シノビオリン遺伝子の転写調節領域に転写因 子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上 記「機能的に結合した」の意に含まれる。シノビオリン遺伝子の cDNA塩基配列に基 づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するシノビオリン遺伝子の転写調節領 域を周知の方法により取得することが可能である。
[0128] 本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制 限はなぐ例えば、 CAT遺伝子、 lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、および GFP遺 伝子等が挙げられる。「シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが 機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が 挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に 周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法 、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフエクシヨン法、マイクロ インジェクション法等によって実施することができる。「シノビオリン遺伝子の転写調節 領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞」には 、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体への DNA構造の挿入は、当 業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法 により行うことができる。
[0129] 「シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構 造を有する DNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キット に含まれる細胞抽出液に、シノビォリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子と が機能的に結合した構造を有する DNAを添加したものを挙げることができる。
[0130] 本方法における「接触」は、「シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝 子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を 添加する、または該 DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添カロ すること〖こより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タン ノ ク質を発現する DNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である
[0131] 本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポ 一ター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知 の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子が CAT遺伝子である 場合には、該遺伝子産物によるクロラムフエ-コールのァセチルイ匕を検出することに よって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子が lac Z遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色 を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現 産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、 GFP遺伝子 である場合には、 GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子 の発現量を測定することができる。
[0132] 本方法においては、次いで測定したレポーター遺伝子の発現レベルを被検化合物 の非存在下にお 、て測定した場合 (対照）と比較して、低下 (抑制）させる化合物を選 択する。低下 (抑制）させる化合物は、癌治療のための薬剤もしくは癌治療のための 候補化合物となる。
[0133] また本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、シノビオリンタンパク質と p53 タンパク質との結合活性を指標とする方法を挙げることができる。本発明のシノビオリ ンタンパク質は p53タンパク質に対して結合 (相互作用）活性を有するタンパク質であ る。従って、シノビオリンタンパク質と p53タンパク質の結合活性を指標として、該結合 活性を低下 (抑制）させる物質を選択することにより、癌治療のための薬剤のスクリー ニングを行うことが可能である。
[0134] 本発明の上記方法は例えば以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌治療剤のスクリー ニング方法である。
(a)シノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
(b)シノビオリンタンパク質と p53タンパク質との結合活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物 を選択する工程
[0135] 本方法においてはまずシノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、および被検化合物 を接触させる。次 ヽでシノビオリンタンパク質と p53タンパク質との結合活性を測定す る。
[0136] 通常シノビオリンタンパク質と p53タンパク質との結合 (相互作用）活性を測定するこ とは当業者にぉ 、ては簡便に行 、得ることであり、上記工程 (b)の結合活性の測定 は、一般的な方法、例えば免疫沈降法およびプルダウンアツセィ等を利用して、適宜 実施することが可能である。
[0137] また上記方法に使用するシノビオリンタンパク質および p53タンパク質は、変異を含 まな 、野生型タンパク質であることが好ま 、が、結合 (相互作用）活性を有するもの であれば、これらタンパク質の一部のアミノ酸が置換'欠失されたタンパク質 (ポリぺプ チド)であってもよい。
[0138] 上記方法において用いられるシノビオリンタンパク質は、変異を含まない野生型タ ンパク質 (全長タンパク質)であることが好ま ヽが、 p53タンパク質との結合活性を保 持している限り、その部分断片ペプチドであってもよぐまた、タンパク質の一部のアミ ノ酸配列が置換'欠失されたタンパク質 (ポリペプチド)であってもよい。
[0139] p53タンパク質との結合に関与するシノビオリンタンパク質における領域は、シノビォ リンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号： 2)における 236〜270位の領域である。従つ て、本スクリーニング方法において、 236〜270位のアミノ酸領域を含むシノビオリンタ ンパク質の断片ポリペプチドを好適に使用することができる。
[0140] 上記方法は次 ヽで、被検化合物を接触させな!/ヽ場合 (対照）と比較して、該結合活 性を低下 (抑制）させる化合物を選択する。低下 (抑制）させる化合物は癌治療のた めの薬剤となる。
[0141] また本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、 p53タンパク質のュビキチン 化を指標とする方法を挙げることができる。本発明のシノビオリンタンパク質は、 p53タ ンパク質のュビキチン化を促進させる機能を有するタンパク質である。従って p53タン ノ ク質のュビキチンィ匕を指標として、該ュビキチン化を低下 (抑制）させる物質を選択 することにより、癌治療のための薬剤のスクリーニングを行うことが可能である。
[0142] 本発明の上記方法は、例えば以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌治療剤のスクリー ニング方法である。
(a)シノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
(b) p53タンパク質のュビキチン化を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな 、場合と比較して、前記ュビキチンィ匕を低下させる化合 物を選択する工程
[0143] 本方法においてはまずシノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、および被検化合物 を接触させる。次 、で p53タンパク質のュビキチンィ匕の程度を測定する。
当業者においては、一般的な手法によって、 p53タンパク質のュビキチンィ匕の程度 を測定することが可能である。
[0144] 一例を示せば、 GST-p53および MBP-Synoviolin Δ ΤΜ- Hisを用いて in vitroュビキ チン化反応の測定を行う。まず pGEX/p53を保持した大腸菌 (BL21)抽出液より GST- p53を GSH-セファロース榭脂を用いて精製し、透析後の試料を用いて、 MBP-Synovi olin Δ ΤΜ- Hisおよび他の in vitroュビキチン化反応に用いる組成物（ATP、 PK- His- HA-Ub、 yeast El、 His-UbcH5c)を組み合わせて反応を行う。反応後、タンパク質を S DS-PAGEにより分離し、 PVDF膜上に転写して抗 p53抗体 (FL393あるいは DO- 1)によ り膜上の p53タンパク質を検出することによって、 in vitroュビキチンィ匕の測定を行うこ とがでさる。
[0145] 上記方法は次 、で、被検化合物を接触させな 、場合 (対照）と比較して、ュビキチ ン化の程度を低下 (抑制）させる化合物を選択する。低下 (抑制）させる化合物は癌 治療のための薬剤もしくは癌治療のための候補ィ匕合物となる。
[0146] また本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、 p53タンパク質を基質とする p 53リン酸ィ匕タンパク質のリン酸ィ匕活性を指標とする方法を挙げることができる。シノビ ォリンタンパク質は、 p53リン酸ィ匕タンパク質のリン酸ィ匕活性を阻害することにより、 p53 の活性を阻害する。従って、 p53リン酸ィ匕タンパク質の活性を上昇させる物質は、 p53 を活性化させる機能を有することが期待される。
[0147] 本発明は、以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。
(a)シノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、 p53リン酸化タンパク質、および被検化合 物を接触させる工程
(b) p53タンパク質を基質とする p53リン酸ィ匕タンパク質のリン酸ィ匕活性を測定するェ 程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記リン酸ィ匕活性を上昇させる化合 物を選択する工程
[0148] 本方法にお!、てはまず、シノビォリンタンパク質、 p53タンパク質、および被検化合 物を接触させる。次 、で p53タンパク質を基質とした p53リン酸化タンパク質のリン酸化 活性を測定する。
[0149] 本発明にお 、て「p53リン酸化タンパク質」とは、上述のように、 p53を基質としてリン 酸化し得るタンパク質であれば特に制限されないが、通常、 ATM、 ATR、 DNA-PKま たは GSK3 β等を指し、より好ましくは、 ATMもしくは ATRである。
[0150] 上記方法にお ヽて使用する p53リン酸化タンパク質は変異を含まな ヽ野生型タンパ ク質であることが好まし 、が、 p53タンパク質をリン酸ィ匕する活性を有するものであれ ば、 p53リン酸ィ匕タンパク質の一部のアミノ酸が置換'欠失されたタンパク質 (ポリぺプ チド)であってもよい。
[0151] また基質となる p53タンパク質も、変異を含まない野生型タンパク質 (全長タンパク質 )であることが好ましいが、 p53リン酸ィ匕タンパク質によってリン酸ィ匕を受ける限り、その 部分断片ペプチド (ペプチド断片）であってもよぐまた、タンパク質の一部のアミノ酸 配列が置換'欠失されたタンパク質 (ポリペプチド)であってもよい。さらに好ましくは、 リン酸ィ匕を受ける部位を含む、部分ポリペプチドもしくは該部位を含む変異ポリぺプ チドであってもよい。
[0152] 上記方法にお!、て p53リン酸ィ匕タンパク質によってリン酸ィ匕を受ける p53タンパク質 上の部位は特に制限されるものではないが、好ましくは P53タンパク質のアミノ酸配列 (例えば配列番号： 17に記載のアミノ酸配列）における 15位のセリン残基である。従つ て、本方法においては、 15位のセリン残基を含む p53の断片ポリペプチドを好適に使 用することができる。
p53リン酸ィ匕タンパク質のリン酸ィ匕酵素活性は、上述にように例えばリン酸ィ匕特異的 抗体を用いたウェスタンプロット法等により測定することができる。
[0153] 上記方法においてはさらに、被検化合物を接触させない場合と比較して、前記 p53 リン酸ィ匕タンパク質のリン酸ィ匕活性を上昇させる化合物を選択する。通常、使用する p 53もしくは p53の断片ペプチドにおけるリン酸ィ匕の状態を指標として、適宜選択するこ とができる。このようにして選択された化合物は、 p53リン酸ィ匕タンパク質の p53タンパ ク質を基質とするリン酸化活性を促進させ、その結果、癌細胞の増殖を阻害し、癌治 療効果を有することが期待される。
[0154] また本発明は、本発明のスクリーニング方法を実施するために用いられる、各種薬 剤 ·試薬等を含むキットを提供する。
[0155] 本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中から、実施するスクリー- ング方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明のキットは、少なくとも 本発明の（a)シノビオリンタンパク質、（b) p53タンパク質を構成要素とすることができ る。本発明のキットには、さらに、本発明の方法において使用される各種試薬、容器 等を含めることができる。例えば、抗シノビォリン抗体、抗リン酸化 Ser抗体、プローブ 、各種反応試薬、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示 書等を適宜含めることができる。
[0156] 本発明の好ま 、態様にぉ 、ては、シノビオリンタンパク質の発現および Zまたは 機能が阻害されているかどうかを検出する工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方 法である。従って、該スクリーニング方法において、シノビオリンタンパク質の検出の 際に利用可能な、シノビオリン遺伝子に対するプローブもしくは該遺伝子の任意の領 域を増幅するためのプライマー等のオリゴヌクレオチド、または、シノビオリンタンパク 質を認識する抗体 (抗シノビオリンタンパク質抗体)も、本発明の癌治療剤スクリー- ング用キットの構成要素に含めることができる。
[0157] 上記オリゴヌクレオチドは、例えば、本発明のシノビオリン遺伝子の DNAに特異的に ハイブリダィズするものである。ここで「特異的にハイブリダィズする」とは、通常のハイ ブリダィゼーシヨン条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件下 (ί列 X·は、サムフノレツグら, Molecular Cloning,し old Spring Harbour Laboratory Press, New York,USA,第 2版 1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードする DN Aとクロスハイブリダィゼーシヨンを有意に生じな 、ことを意味する。特異的なハイプリ ダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、シノビオリン遺伝子の塩基配列に対 し、完全に相補的である必要はない。
[0158] 本発明においてハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば「2 X SSC、 0.1 %SD S、 50。C」、「2 X SSC、 0.1%SDS、 42。C」、「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」、よりストリンジェ ントな条件として「2 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」、「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」および「 0.2 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」等の条件を挙げることができる。より詳細には、 Rapid- hy b buffer (Amersham Life Science)を用いた方法として、 68°Cで 30分間以上プレハイブ リダィゼーシヨンを行った後、プローブを添加して 1時間以上 68°Cに保ってハイブリツ ド形成させ、その後 2 X SSC、 0.1%SDS中、室温で 20分間の洗浄を 3回行い、続いて 1 X SSC、 0.1%SDS中、 37°Cで 20分間の洗浄を 3回行い、最後に 1 X SSC、 0.1%SDS中 、 50°Cで 20分間の洗浄を 2回行うことができる。その他、例えば Expresshyb Hybridizat ion Solution (CLONTECH)中、 55°Cで 30分間以上プレハイブリダィゼーシヨンを行つ た後、標識プローブを添カ卩して 37〜55°Cで 1時間以上インキュベートし、 2 X SSC、 0.1 %SDS中、室温で 20分間の洗浄を 3回、 1 X SSC、 0.1%SDS中、 37°Cで 20分間の洗浄 を 1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダィゼーシヨン、ハイブリダィゼー シヨンや 2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな 条件とすることができる。例えば、プレハイブリダィゼーシヨンおよびハイブリダィゼー シヨンの温度を 60°C、さらにストリンジヱントな条件としては 68°Cとすることができる。当 業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃 度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味 し、条件を設定することができる。
[0159] 該オリゴヌクレオチドは、上記本発明のスクリーニング用キットにおけるプローブや プライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場 合、その長さは、通常 15bp 100bpであり、好ましくは 17bp 30bpである。プライマー は、本発明のシノビオリン遺伝子の DNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、 特に制限されない。
[0160] 本発明にお 、て、胎児胚における p53の免疫染色を行ったところ、シノビォリンホモ ノックアウトマウス胎児胚では全身において P53が強く発現することが分力つた。また、 シノビォリンホモノックアウトマウス胎児胚カも単離した胎仔線維芽細胞 (MEF)も、野 生型から単離したものに比して強く発現しており、し力も p53は核内に強く局在した。 この核局在は野生型ではまったく観察されな力つた。また、シノビォリンと p53を強発 現させると、 p53は細胞質内にシノビォリンと共局在した。このことは、シノビオリンの発 現および/または機能を阻害することにより、 P53を核内へ移行させることができること を意味する。
[0161] さらに、シノビオリンホモノックアウトマウス胎仔 MEFでは、高い放射線感受性または 紫外線感受性を示した。従って、本発明において、癌細胞中のシノピオリンの発現お よび/または機能を阻害して P53を癌細胞の核に移行させた後に、癌細胞に対して放 射線照射または紫外線照射を行うと、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができ る。放射線照射手段は、特に限定されるものではないが、例えば γ線を l 10Gy照 射することができる。また、紫外線照射は、紫外線 (波長 100 400 好ましくは 290 400 nm)を、適当な紫外線照射装置 (フナコシ社、デルマレイ社、キーエンス社製 等)を用いて照射することができる。
[0162] さらに、核に局在化した p53を含む細胞 (特に癌細胞）に、さらに抗癌剤を接触させ ることにより、効率良く癌を抑制することが可能である。あるいは、上記核に局在化し た P53を含む癌細胞の周囲の脈管 (例えば血管またはリンパ管）に塞栓を施すことで 、癌を抑制することもできる。
[0163] 「抗癌剤」には、アルキル化剤、代謝拮抗薬、微小管阻害薬、白金錯化合物、分子 標的治療薬などが含まれる。これらの抗癌剤の具体例として以下のものを挙げること ができる力 これらに限定されるものではない。
ぐアルキル化剤 >
マスタード系：シクロホスフアミド (エンドキサン）、メルファラン等
アジリジン系：チォテパ等
ァノレキノレスノレホン系：ブスノレファン等
ニトロソ尿素系：ニムスチン、口ムスチン等
く代謝拮抗薬〉
葉酸誘導体：メトトレキセート等
プリン誘導体:メルカプトプリン、ァザチォプリン等
ピリミジン誘導体： 5—フルォロウラシル、テガフール、カルモフール等
く微小管阻害薬〉
ビンカァノレカロイド：ビンクリスチン、ビンブラスチン等
タキサン：パクリタキセル、ドセタキセル等
くホルモン類似薬〉
タモキシフェン、エストロゲン等
く白金錯化合物〉
シスプラチン、カルポプラチン等
く分子標的治療薬〉
イマ二チブ、リツキシマブ、ゲフィ二チブ等
抗癌剤を癌細胞に接触させるための方法は、 p53が核に局在化した細胞が含まれ る細胞または組織 (癌細胞または癌組織）に、抗癌剤を添加する方法、あるいは担癌 患者または担癌動物に抗癌剤を投与する方法などが採用される。この場合の抗癌剤 の処理量は、特に限定されるものではないが、添加する場合には 100 pM〜100 /ζ Μ 、好ましくは 1 ηΜ〜10 /ζ Μである。動物体内に投与するときは、例えば抗癌剤として エンドキサンを使用するときは、 0.1〜100 mg/kg/day、好ましくは 2〜25 mg/kg/dayで ある。エンドキサン以外の抗癌剤についても、当業者は投与量または添加量を適宜 設定することができる。 [0165] 核に局在化した p53を含む癌細胞の周囲の脈管に塞栓を施すには、 p53が核に局 在化した癌細胞が含まれる細胞集団または組織の周囲の血管に血栓を形成させて もよぐ血管またはリンパ管については脂肪による塞栓、空気やガスによる塞栓を形 成させてもよい。
[0166] また本発明は、本発明の p53タンパク質活性化剤あるいは p53タンパク質活性化剤 を有効成分とする癌治療剤を個体 (例えば、患者等)へ投与することを特徴とする、 癌を予防もしくは治療する方法に関する。本発明の予防もしくは治療方法における個 体とは、好ましくはヒトである力 特に制限されず非ヒト動物であってもよい。
[0167] 個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など 当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方 法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能 である。
[0168] さらに本発明は、本発明の p53タンパク質活性化剤の癌治療剤の製造における使 用に関する。
[0169] また本発明は、シノビォリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有す る物質を有効成分として含有する、抗リウマチ剤を提供する。本発明の上記物質とし ては、好ましくは低分子化合物を挙げることができる。即ち本発明の好ましい態様に おいては、シノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有する低分 子化合物を有効成分として含有する、抗リウマチ剤を提供する。
[0170] 具体的には本発明者らは、シノビォリンタンパク質の自己ュビキチン化反応を評価 するアツセィ系を構築することに成功し、そのアツセィ系カもシノビオリンタンパク質の 自己ュビキチン化を制御する機能を有する上記一般式 (I) (Compound X)または一般 式 (Π) (Compound Y)で表される 2種の低分子化合物を取得することに成功した。
[0171] 従って本発明の好ましい態様においては、上記一般式 (I)または (II)に記載の化合 物を有効成分として含有する抗リウマチ剤を提供する。
[0172] 上記一般式 (I)または (II)で表される化合物については、それぞれ上述した通りであ る。
[0173] また本発明において抗リウマチ剤における有効成分となる一般式 (I)または (II)に記 載の化合物は、該化合物において薬学的に許容される塩であってもよい。さらに該 化合物の塩に加えて、例えば該化合物の水和物、溶媒和物、異性体等が含まれる。 これらの化合物も同様に抗リウマチ作用を有することが期待される。
[0174] 本発明において「塩」とは、本発明の化合物（一般式 (I)または (II)に記載の化合物） と塩を形成し、かつ薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、無 機塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸などが挙げ られる。通常本発明において「塩」とは薬学的に許容される塩をいう。また上記塩の好 まし 、態様にっ 、ては上述した通りである。
[0175] また本発明者らは、上述の一般式 (I)または (II)に記載の化合物がそれぞれリウマチ 滑膜細胞 (RASC)の増殖抑制効果を有することを見出した。即ち本発明の好ま U、 態様においては、上記一般式 (I)または (II)に記載の化合物がリウマチ滑膜細胞増殖 抑制効果を有することを特徴とする、抗リウマチ剤を提供する。
[0176] 本発明の抗リウマチ剤は、上述のようにリウマチ滑膜細胞の増殖を抑制する効果を 有する。例えばリウマチ性疾患の一つである慢性関節リウマチ (RA)では、リウマチ滑 膜細胞の過増殖や活性ィ匕が主な病変として知られている。そのため、リウマチ滑膜細 胞の増殖を抑制することができれば、慢性関節リウマチを含むリウマチ性疾患の治療 に有用であると考えられる。
[0177] 本発明における「リウマチ」には、いわゆるリウマチ性疾患が含まれ、具体的には、リ ゥマチ：関節リウマチ、急性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、悪性関節リウマチ、若 年性関節リウマチなどを例示することができる。また上記リウマチ性疾患は、他の疾患 と併発したものであってょ 、。
[0178] 本発明の「抗リウマチ剤」は、「リウマチ滑膜細胞増殖抑制剤」、「リウマチ滑膜細胞 発生抑制剤」、「リウマチ治療剤」、「リウマチ性疾患治療剤」、「抗リウマチ薬」、あるい は「抗リウマチ性疾患薬」と表現することもできる。
[0179] なお本発明における「治療」には、リウマチ性疾患の発症を予め抑制し得る予防的 な効果も含まれる。またリウマチ滑膜細胞が増殖している組織に対して、必ずしも完 全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよ い。 [0180] 本発明の薬剤については上述した通りである。また本発明の薬剤を使用する場合 は、適用部位もしくはリウマチ性疾患の種類は特に限定されず、例えばリウマチ：関 節リウマチ、急性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、悪性関節リウマチ、若年性関節リ ゥマチなどが対象として適用される。上記リウマチ性疾患は、他の疾患と併発したもの であってよい。
[0181] また本発明は、シノビオリン遺伝子の発現量を指標とする、抗リウマチ剤のスクリー ユング方法を提供する。シノビオリン遺伝子の発現量を低下 (抑制）させる化合物は、 リウマチ性疾患の治療のための薬剤となることが期待される。本発明の抗リウマチ剤 のスクリーニング方法によって、抗リウマチ剤または抗リウマチ剤のための候補ィ匕合 物を効率的に取得することができる。
[0182] 本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法の好ましい態様は、以下の（a)〜（c)の 工程を含む方法である。
(a)シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞におけるシノビオリン遺伝子の発現量または活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下にお!、て測定した場合と比較して、発現量または活性を 低下させる化合物を選択する工程
[0183] 上記スクリーニング方法の各工程については、上述した通りである。本スクリーニン グ方法によって選択されたィ匕合物は、抗リウマチ剤もしくは抗リウマチ剤のための候 補ィ匕合物となる。
[0184] また本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法の他の態様は、レポーター遺伝子 の発現を指標として、シノビオリン遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択す る方法である。
[0185] 本発明の上記スクリーニング方法の好ましい態様は、以下の（a)〜（c)の工程を含 む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法である。
(a)シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構 造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物を接触させな 、場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レべ ルを低下させる化合物を選択する工程
[0186] 上記スクリーニング方法の各工程については、上述した通りである。本スクリーニン グ方法によって選択されたィ匕合物は、抗リウマチ剤もしくは抗リウマチ剤のための候 補ィ匕合物となる。
[0187] また本発明者らは、シノビォリンの自己ュビキチンィ匕反応を評価するアツセィ系を構 築することに成功した。詳しくは以下の実施例に示すように、 ELISAによる簡便なアツ セィ系を構築し、 ATP存在下の場合に、抗 HA抗体濃度および二次抗体濃度、 GST- Syno Δ ΤΜ濃度および反応時間に依存して、シノビォリンの自己ュビキチンィ匕反応を 示すシグナルが増強することを見出した。そして、当該アツセィ系によってスクリー- ングされた上記一般式 (I)または (II)に記載の低分子化合物力 Sリウマチ滑膜細胞の増 殖抑制効果を示し、抗リウマチ効果を有することを初めて見出した。
[0188] すなわち本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法の他の態様は、シノビオリンタ ンパク質の自己ュビキチン化を指標とする方法である。本発明のシノビオリンタンパク 質の自己ュビキチンィ匕を制御する物質を選択することにより、抗リウマチ剤のスクリー ユングを行うことが可能である。本発明の上記方法は例えば以下の（a)〜（c)の工程 を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法である。
(a)シノビオリンタンパク質および被検化合物を接触させる工程
(b)シノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、前記自己ュビキチンィ匕を制御する 化合物を選択する工程
[0189] 本方法においてはまず、シノビオリンタンパク質および被検化合物を接触させる。
次いで、シノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕の程度を測定する。当業者にお いては例えば以下の実施例に記載される手法によって、シノビオリンタンパク質の自 己ュビキチンィ匕の程度を測定することが可能である。
[0190] 上記方法は次 、で、被検化合物を接触させな 、場合 (対照）と比較して、 自己ュビ キチン化の程度を制御する化合物を選択する。制御する化合物は、抗リウマチ剤もし くは抗リウマチ剤のための候補ィ匕合物となる。
[0191] なお本発明にお 、て「制御する」とは、上方制御（例えば促進)あるいは下方制御（ 例えば抑制）が含まれる。
[0192] また本発明は、本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法を実施するために用い られる各種薬剤 ·試薬等を含むキットを提供する。
[0193] 本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中力 実施するスクリーニン グ方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明の抗リウマチ剤のスクリ 一-ング用キットは、少なくとも本発明のシノビオリンタンパク質を構成要素とすること ができる。本発明のキットには、さらに本発明の方法において使用される各種試薬、 容器等を含めることができる。例えば、抗シノビォリン抗体、プローブ、各種反応試薬 、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法等を記載した指示書等を含めるこ とがでさる。
[0194] また本発明は、本発明のシノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕を制御する機 能を有する物質を有効成分とする抗リウマチ剤を個体 (例えば患者等)へ投与するこ とを特徴とする、リウマチ性疾患を予防または治療する方法に関する。本発明の予防 もしくは治療方法における個体とは、好ましくはヒトであるが、特に制限されず非ヒト動 物であってもよい。個体への投与については、上述した通りである。
[0195] さらに本発明は、本発明のシノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕を制御する 機能を有する物質の抗リウマチ剤の製造における使用に関する。
[0196] なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0197] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施 例に限定されるものではない。
[0198] 〔実施例 1〕 MEF培養細胞における p53の活性ィ匕の検討
シノビオリンホモノックアウトマウス（syno-/-)胎児線維芽細胞 (MEF)における p53を 免疫蛍光染色により確認した。
すなわち、免疫染色法は、 MEFを常法に従いスライドガラス上に固定し、抗 p53抗体 (マウスモノクローナル抗体 BD : Becton, Dickinson社）を用いて免疫染色を行った。 3 %牛血清アルブミン（BSA)で 30分ブロッキングを行った標本に、 0.3% BSAで希釈した 抗 p53抗体 (BD： 10 μ g/mL)を室温で 60分免疫反応させた。反応後の標本を PBSで 洗浄後、 TRITC標識抗マウス IgG抗体 (Dako社)を 2次抗体として免疫反応させた。抗 P53抗体に免疫反応する抗原の確認は、蛍光顕微鏡で行った。
その結果、野生型に比し、 syno-/-の MEF培養細胞では p53の発現上昇、及び核内 移行を起こして 、る細胞が多数確認された（図 1、「MEF-/-」のパネル)。
[0199] 〔実施例 2〕 syno- /-マウスにおける p53活性ィ匕の検討
syno-/-マウスにおける p53活性ィ匕の検討を、 embryoを用い免疫染色により行った。 すなわち、 syno-/-の胎仔における免疫染色は、常法に従い組織をスライドガラス 上に固定し、ベクタスティン ABCキット (VECTOR社)を用いて行った。ブロッキング試 薬で 30分ブロッキングした標本に対して、 5 g/mLに希釈した抗 p53抗体 FL393を室 温で 60分間免疫反応させた。反応後の標本を PBSで洗浄し、 HRP標識抗ゥサギ IgG 抗体を 2次抗体として免疫反応させた。抗 p53抗体に免疫反応する抗原は、 HRP活性 に基づく 3,3'-ジァミノべンジジン四塩酸塩の発色により確認した。対比染色としてメ チルダリーン染色を行った。
この結果、 syno-/-の embryoにおける p53が安定化及び発現上昇して!/、ることが確 認された（図 2)。
[0200] 〔実施例 3〕 p53に対するシノビォリンの効果
syno-/-の MEF培養細胞における p53をウェスタンブロッテイングにより検出した。 すなわち、各種細胞を細胞破砕液（50 mM Tris- HCl (pH 8.0)、 150 mM NaCl、 1% NP40、 1 mM PMSF、 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS)、 2 μ g/mL Leupeptin、 2 μ g/ mL Aprotinin, 2 μ g/mL Pepstatin)を用いて細胞破砕画分を調製した。その後、 SDS ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE)により細胞破砕画分を分離した。 SDS-PAG E後、細胞由来タンパク質は、エレクトロブロッテイング法により-トロセルロース（NC) 膜に転写した。この NC膜に対し、 5%スキムミルクをカ卩えた Tris buffered saline (TBS)で 室温、 1時間ブロッキングした後、抗 p53抗体 c- terminal aa;195- 393または FL393を 5% スキムミルクを加えた TBSで希釈して室温、 1時間免疫反応させた。反応後の NC膜を 0.1% Tween20/TBSで洗浄し、 horse radish peroxidase (HRP)標識抗ゥサギ IgG抗体 を 2次抗体として室温、 1時間免疫反応させ、 0.1% Tween20/TBSで洗浄し、 HRP活性 を検出することにより目的抗原を検出した。 HRP活性の検出には ECLキット (Amersha m社）を用いた（Clinical Chemistry. 25, pi 531, 1979) 0
その結果、ウェスタンブロッテイングにより syno-/-の MEF培養細胞における p53発現 量が増加して 、ることが確認された（図 3)。
[0201] 〔実施例 4〕 syno-/-の MEF培養細胞における p53のリン酸ィ匕部位の同定
本実施例においては、抗 p53抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより p53のリン 酸ィ匕部位の同定を行った。
すなわち、 p53 (配列番号： 17)の異なるセリン残基のリン酸ィ匕を認識する 4種の抗リ ン酸化 p53モノクローナル抗体（Phospho- p53(serl5)、 Phospho- p53(ser20)、 Phospho -p53(ser37)および Phospho-p53(ser46) ; Cell Signaling社）を用いて、 MEF細胞のタン パク質を SDS-PAGEで分離し、ウェスタンブロッテイング法を行った。ウェスタンブロッ ティング法の操作は、一次抗体として抗リン酸化 p53モノクローナル抗体を、そして標 識抗体として抗マウス IgGヒッジ -HRPを用いる他は実施例 3に記載のとおりである。 その結果、 syno-/-の MEF培養細胞において、 p53のアミノ酸配列（配列番号： 17) 中、第 15番目のセリン残基のリン酸ィ匕が顕著であった（図 4)。図 4において、左上の パネル力 第 15番目のセリン残基がリン酸ィ匕されたものである。 53kDa付近のバンド が顕著に濃く表れている。
[0202] 〔実施例 5〕 Serl5のリン酸化亢進のメカニズムの解明
細胞株として野生型の P53を発現して 、ることが確認されて 、る RKO (ヒト大腸がん 由来細胞株)を 60 mmプレートに l.OxlO5細胞/プレート /2 mLで細胞を播種し、 Oligofe ctamineを用いて GFPおよびシノビオリンに対する siRNAオリゴヌクレオチドをトランスフ ェタトした後、 72時間後に Serl5のリン酸化に重要な ATM(ataxia-telangiectasia mutat ed)および ATR(ATM and Rad3 related)の阻害剤であるカフェイン (10 mM)を添カロし、 リン酸化 Serl5-p53に対する抗体 Phospho-p53(serl5)を用いてウェスタンブロッテイン グを行った。
その結果、シノビォリンに対する siRNAによって亢進した Serl5のリン酸ィ匕はカフエイ ン添加（添加後 12時間、 24時間）により、完全に阻害された（図 5)。シノビオリンの発 現を阻害すると、 ATMおよび ATRによる p53の活性ィ匕を誘導することが示唆された。 [0203] 〔実施例 6〕 p53により誘導される p21の発現にシノビォリンが及ぼす影響
RKO細胞をシノビォリンに対する siRNA処理し、 p53の転写産物である p21の発現の 変化をウェスタンブロッテイングで検討した。
すなわち、細胞株として野生型の p53を発現して 、ることが確認されて 、る RKO (ヒト 大腸がん由来細胞株)を 60 mmプレートに l.OxlO5細胞/プレート /2 mLで細胞を播種 し、 Oligofectamineを用いて GFPおよびシノビオリンに対する siRNAオリゴヌクレオチド をトランスフエタトした。 72時間後に細胞を回収し調製した。調製したタンパク質を SDS -PAGEで分離し、抗 p21ポリクローナル抗体（Santa Cruz社）を用いて、ウェスタンブ口 ッティング法を行った。ウェスタンブロッテイング法の操作は、一次抗体として抗 p21ポ リクローナル抗体を、そして標識抗体として抗マウス IgGヒッジ -HRPを用いる他は実 施例 3に記載のとおりである。
その結果、シノビォリンに対する siRNA処理によって、 p53の発現が高まると同時に、 p21の発現も増加した。この効果は 72時間で明確に示された（図 6)。
[0204] 〔実施例 7〕 シノビオリン発現阻害による、細胞周期への影響等の検討
本実施例においては、リウマチ患者由来滑膜細胞におけるシノビオリンを、 RNAi効 果により阻害した際の細胞周期への影響の検討を行った。
RA滑膜細胞を 10 cmディッシュに 9.0xl04細胞で播種し、シノビオリン siRNA (最終濃 度 25 nM)をトランスフエタトした後、フローサイトメーターにより細胞周期を観察した。 その結果、 siRNA 25 nM(h589)では、 G0/G1期における細胞周期の遅延が見られた（ 図 7)。
[0205] siRNAとしては h589を用いた。
なお、 h589とは、以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖をァニールさせた 2本鎖 RN Aを意味する。
センス鎖 h589 : GGU GUU CUU UGG GCA ACU G TT (配列番号： 18) アンチセンス鎖 h589 : CAG UUG CCC AAA GAA CAC C TT (配列番号： 19) [0206] 〔実施例 8〕 癌組織におけるシノピオリンの発現の検討
Tissue array (CHEMICON社： 10 common human cancer tissue with normal human tissue)を、抗シノビオリン抗体 (lODa)を用いて免疫染色した。 免疫染色に使用した抗体濃度は 8 g/mLであり、使用したキットはシンプルスティ ン MAX (M)である。
その結果、正常組織でのシノビォリンの発現は、大腸、腎、肺、卵巣、精巣、皮膚お よび乳腺で認められたのに対し、神経およびリンパ節では認められな力つた。また、 各腫瘍組織においてシノピオリンの発現が確認され、特に、発現が明らかに亢進して V、ると判断された組織は、神経'リンパ節であった（図 8および図 9)。
[0207] 〔実施例 9〕 培養細胞中でシノビオリンおよび p53を共発現させた場合の各々の局在 への影響
3種類のプラスミド、 GFP- p53、 FLAG- synoviolin、および FLAG- synoviolin C307S( ュビキチン (Ub)化活性なし)を Saos- 2細胞に導入した。
[0208] 各プラスミドは、以下の通りである。
GFP-p53 : Green fluorescence proteinと野生型 p53のフュージョン蛋白発現 FLAG-synoviolin： FLAGタグつき野生型シノビオリン発現
FLAG-synoviolin C307S (ュビキチン（Ub)化活性なし)： FLAGタグつき失活型シノビ ォリン発現
[0209] FuGene6 (Roche)によるトランスフエクシヨン処理して 24時間後に 10%ホルマリンで固 定し、 400倍希釈一次抗体 α -FLAG抗体、 200倍希釈二次抗体 α -mouse IgG-TRIT C、 1 M DAPIで核を染色して、その局在を観察した。
[0210] その結果、野生型 p53は強発現させると核に局在することが観察された（図 10)。野 生型シノビオリンは強発現すると細胞質 (特に核周辺）に局在した。また、野生型 P53 と野生型シノビオリンを強発現させると、本来核に局在する p53が核周辺に細力 、ドッ ト状に分布し、シノビォリンと共局在していることが観察された（図 11)。野生型 p53と シノビオリン C307S mutantを強発現させると、 p53が細胞質内に大きなドットを形成し、 シノビオリンと共局在して 、ることが観察された（図 12)。
以上のことから、シノビォリンと p53は一定条件下で共局在することが示された。ュビ キチンィ匕活性の有無でその局在の形態が変化することが考えられる。
[0211] 〔実施例 10〕 MBP- Synoviolin Δ ΤΜ- Hisによる GST- p53の in vitroュビキチン化の検 討 シノビォリンの細胞内における増減により P53の細胞内タンパク質量の変動が観察 されており、シノビォリンによる p53の制御が示唆されている。そこで、シノビォリンが直 接 p53をュビキチン化（Ub)するか否かを調べるために、 GST-p53および MBP-Synovi olin Δ ΤΜ- Hisを用いて in vitroュビキチン化反応の検討を行った。
[0212] GST-p53 :N末端側に GSTを融合させた p53を大腸菌内で発現させ、それを精製し て得た画分。
MBP-Synoviolin Δ ΤΜ- His :N末端側に MBP, C末端側に Hisタグを融合させたシノ ピオリンを大腸菌内で発現させ、それを精製して得た画分。
[0213] pGEX/p53を保持した大腸菌 (BL21)を 500 mLの LB培地で培養し、 IPTGによる誘導 後 (1 mM、 30°C、 6 h)、培養液より 0.5% NP-40を含む緩衝液を用いて大腸菌抽出液を 調製した。
大腸菌抽出液より GST- p53を GSH-セファロース榭脂を用いて 0.1% NP- 40存在下で 精製した。その透析後の試料を用いて、 MBP-Synoviolin Δ ΤΜ- Hisおよび他の in vit roュビキチン化反応に用いる組成物（ATP、 PK- His- HA- Ub、 yeast El、 His- UbcH5 c)を組み合わせて反応を行った（図 13)。反応後、タンパク質を 7.5% SDS-PAGEによ り分離し、 PVDF膜上に転写して抗 p53抗体 (FL393あるいは DO- 1)により膜上の p53タ ンパク質を検出した。また、 GST-p53の添加量を変化させて同様の反応および検出 を行った。
[0214] その結果、 GST-p53精製画分および MBP-Synoviolin Δ TM- Hisを含む全ての組成 物を添カ卩した場合に、約 90kDaの位置を中心として p53由来のラダー状のシグナルが 観察された（図 13)。これらの結果から、シノビォリンが直接 p53のュビキチンィ匕に関 与していると言える。従って、シノビォリンの発現および/または機能を阻害することに より、 p53のュビキチンィ匕を抑制できることが示された。
[0215] 〔実施例 11〕 RNAi下におけるシノビオリン、 p53 mRNA量の検討
本実施例では、シノビオリン RNAi条件下において、シノビォリンおよび関連遺伝子 について、経時的に mRNA量の変化を検討することでシノピオリンが細胞周期、アポト 一シスなどへ及ぼす影響を検討した。
RA滑膜細胞を 30000 cells/ 10 cmディッシュで播種し、定法に従い 25 nM siRNA(No . 589)をトランスフエクシヨンし、細胞培養 4日間の間、経時的に細胞を回収し、 mRNA を得た。 1 μ gの mRNAをテンプレートとし、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を 行い、 cDNAを得た。得られた cDNAについて、 ABI TaqMan Gene expression assay ( GEX)を用いて、定量を行った。対照遺伝子を 18S rRNAとして mRNA量を算出した。
GEX試薬ターゲットアツセィ No. (アツセィ ID)は、シノビォリンが Hs00381211_ml、 p5 3が Hs00153340_mlである。
その結果、シノビオリン siRNA存在下では、シノビオリン mRNA量が減少する力 p53 の mRNA量は変化して!/、な!/、ことが確認された（図 14)。
[0216] 〔実施例 12〕 シノビォリンの p53結合ドメインの決定
GST-Synoviolinと p53が in vitroプルダウンアツセィで結合し、それにはシノビオリン タンパク質のアミノ酸配列（配列番号： 2)の第 236から 270番目までの 35アミノ酸残基 が必要十分である。
そこで、本実施例では、さらに、シノビォリンカ ¾53に結合するために必要なドメイン を同定するために、図 15に示すように、シノビォリンの p53結合ドメイン欠失体を作製 して、 35S-p53につ!/、て以下の通り GSTプルダウンアツセィを行った（図 16)。
[0217] 100 μ Lの Competent cell (BL- 21株）を 1 μ Lの各 GSTタンパク質をコードしたプラスミ ドで形質転換した。各 GSTタンパク質とプラスミドの名前は以下のとおりであった。
GSTタンパク質：プラスミド
uST： pGEX-6P-l (Pharmacia Biotech)
GST-Syno A TM 236—617： pGEX— 5— 1 / S A TM
GST-Syno A TM 236-270： p6- 3
GST-Syno A TM 271-617： pST490
[0218] 4 mLの LB- Amp+に接種し、 37°Cでー晚培養した。翌日 Pre- cultureの OD600を測 定し、 15 mLの LB-Amp+に OD600=3.0相当を接種した（終濃度 0.2)。 25°C恒温槽 で約 2hr培養し、 OD600=0.6〜0.8になったことを確認した後、恒温槽に氷をカ卩えて 20 °Cに冷却し、培養容器を 10分つけて 20°Cまで冷却した。 0.1 M IPTGを 15 ja L (終濃 度 = 0.1 mM、通常の 1/1000)、 1 mM ZnClを 150 L (終濃度 =10 M)カロえて、 20°C
2
で 4hr震盪培養し GSTタンパク質の発現を誘導した。誘導後、遠心して細胞を回収し た（5000 rpm、 5min、 4°C) 0 1 mL PBS (-)に細胞を再懸濁し、エツペンドルフチューブ に移し、細胞を回収した（14000 rpm、 lmin、 4°C) 0上清を全て吸い取った後、 500 L の PBS (-) I Z (PBS (-) / lO ^ M ZnCl )に再懸濁し、液体窒素で凍結、 20°Cで保存
2
した。翌日—20°Cのサンプルを 37°Cの恒温槽に lOminつけて融かし、次に氷水中に つけて 0°Cまで冷却した。以下のプロテアーゼ阻害剤を混合し、 1サンプルあたり 6.5 μしカ口 た。
[0219] 100 mM PMSF (Final 1 mM) 20 μ L
Aprotinin (Final 0.1%) 2 μ L
0.5 mg/mL PepstatinA (Final 0.5 μ g/mL) 2 μ L
1 mg/mL Leupeptin (Pinal 1 μ g/mL) 2 μ L
[0220] 各サンプルを超音波破砕した（Power Level 7、 15秒、 3回）。一回ごとに氷水中に 3 0秒つけて冷却した。次に 500 μ Lの 2 X GST Buffer / Z (2% TritonX- 100、 720 mM N aCl、 1 x PBS (-)、 ΙΟ ^ Μ ZnCl、 10 mM j8 - Mercaptoethaol、 2 mM PMSFゝ 0.1% aprot
2
inin)を加え混合後、さらに超音波破砕した（Power Level 7、 15秒、 1回）。破砕した液 を 14000rpm 30min 4°Cで遠心した。この間に lmLの 1 x PBS (-)で 200 μ Lの 80%-slurry Glutathione Sepharoseビーズを 3回洗い、 160 Lの 1 x PBS (―)をカ卩え、 50%— slurryに 調整した。遠心後の上清 lmLに 80 Lの 50%- slurry Glutathione Sepharoseビーズを 加え、 4°Cで 2hr Rotationして GSTタンパク質をビーズに結合させた。 1 mLの 1 x GST- Buffer I Z (1% TritonX— 100、 360 mM NaCl、 0.5 x PBS (-)ゝ 5 ^ M ZnCl、 5 mM β—m
2
ercaptoethanoU 1 mM PMSF, 0.05% aprotinin)で 4回ビーズを洗った。遠心は 2000 rp m、 lmin、 4°Cで行った。残った上清を全てきれいに吸いとつた後、 60 Lの 1 x GST- Buffer I Zをカロえ、合計 100 μ Uこした。このうち 10 μ Lを等量の 2 X SDS Sample Buffer と混ぜ、 100°C、 5min、ヒートブロックで熱し、 10 Lずつ 10%ゲルに Applyした。同時に 0.25〜4 μ gの BSAも Applyした。泳動（150 V 50min)、 CBB染色（未使用のもので 30mi n)、脱色（lhrを 2回）、グリセロール水（30〜60min)、（ゲル乾（80°C、 lhr)して、 GSTタ ンパク質の発現、回収効率をチェックした。翌日、 35S-p53の In vitro Translationを行 つた。まず、以下の試薬を混合した。
[0221] TNT Reticulocyte Lysate 25 μ L TNT Reticulocyte Buffer 2 μ L
Amino Acids Mixture (-Met) 1 μ L
DEPC— treated Water 15 ^ L
RNase Inhibitor 1 μ L
TNT polymerase 1 μ L
35S- Met 4 μ L
Plasmid ρ53 · ΗΑ)_ 1 u_L
Total 50 (し
[0222] 30°C恒温槽で 1.5〜2.5hr保温し、 In vitro Translationした。この間に G-25カラムの ふたを緩めて軽く遠心（2500 rpm、 lmin、 4°C)し、 100 μ Lの PuU-down Buffer V (20 m M HEPES pH 7.9、 150 mM NaCl、 0.2% Triton X- 100)を乗せてさらに遠心し、カラム を洗った。このカラムに In vitro Translation溶液を 50 μ L全量乗せて遠心した（2500 r pm、 lmin、 4°C) 0さらに 200 μ Lの PuU- down Buffer Vを乗せて、再度遠心した（2500r pm、 lmin、 4°C) 0これを In vitro Translation Product (IvTL)として用いた。そのうち 4 μ Lを、 16 μ Lの Milli— Q、 20 μ Lの 2 x SDS Bufferと混ぜ、 On put 10%とした。 30 μ gの GSTタンパクが結合したビーズを含んだ 1 mLの PuU-down Buffer Vに 120 μ Lの IvTL を加え、 4°Cで lhr Rotationした。遠心（10000rpm、 lmin、 4°C)した後、上清を 370 L ずつ GST、各 GST- Synoviolinビーズを含んだ 1 mLの PuU- down Buffer Vにカロえ、 4°C で lhr Rotationした。このビーズを 1 mLの PuU-down Buffer Vで 4回洗った。この時上 清は必ず 100 Lぐらい残し、ビーズを吸い取らないようにした。遠心は 2500 rpm、 lmi n、 4°Cで行った。上清を吸いとつた後、 40 μ Lの 1 x SDS Sample Bufferをカ卩えて、 Pull -downサンプルとした。 On put 10%と PuU-downサンプルを 100°Cで 5min、熱し、 - 20°C で保存した。翌日サンプルを 37°Cの恒温槽で lOmin温め、 10 /z Lずつ 10%ゲルに Appl yした。泳動（150 V 50min)、 CBB染色（30min)、脱色（lhr x 2)、グリセロール水（30 〜60min)、ゲル乾（80°C、 lhr)した後、 IP Plateに露光させた。 14時間後、露光した IP Plateを BASで読み取り、 ImageGaugeで定量した。また C.B.B.染色したゲルはフィルム スキャナーで読み取った。
[0223] その結果、 p53結合ドメイン欠失体は結合活性をほぼ完全に失って 、た。また、図 1 5から、 p53結合ドメインは 236から 270アミノ酸の 35アミノ酸の一ヶ所のみであると考え られる。
[0224] 〔実施例 13〕 シノビォリンによる p53ュビキチン化活性に対する Compound X, Yの影 響
シノビォリンによる GST-p53の in vitroュビキチンィ匕反応を解析することを目的として 、同反応における Compound X、 Yの影響を調べた。 Compound X、 Yの化学構造式を 図 17Aに示す。
GST- p53存在下で、 MBP- Syno A TM- Hisを用いた in vitroュビキチン化反応系に、 Compound X、 Yの濃度を変化させて（75, 150,300,600 M)添カ卩した。反応後、タン パク質を 7.5% SDS-PAGEにより分離し、 PVDF膜上に転写して抗 p53抗体、 FL393 (Sa nta Cruz Biotechnology.Incjにより恢出し 7こ。
その結果、 Compound X、 Yは GST_p53のュビキチンィヒ反応に対して、濃度依存的 に阻害効果を示した (図 17B)。
[0225] 〔実施例 14〕 Compound X、 Yの細胞毒性への検討
RKO細胞（ヒト大腸癌由来細胞株、 ATCC:CRL-2577)を 96穴マイクロタイタープレ 一 KFALCON,non coated)に 1000 cells/100 L/wellで 10%牛胎児血清含 Eagle's Mi nimum Essential Medium播種し 24時間培養した。
Compound X、 Yを 10%牛胎児血清含 Eagle's Minimum Essential Mediumに溶解し、 各 well 10 μ Lずつ添カ卩し、 24〜72時間培養を行った。
培養後、各 wellにっき、 WST-8 (2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)- 5-(2,4-disulfophenyl)-2H- tetrazolium, monosodium salt)を添カ卩し、 2〜4時間後の 4 50 應における吸光度を測定し (参照波長 750 nm)細胞生存率を算出した（図 18)。 算出方法は以下の計算式による。
[0226] (検体) -（ブランク）
細胞生存率（0/0 ) = (陰性コントロール) - (ブランク）
[0227] その結果、 Compound X、 Yにより、細胞増殖が抑制された（図 18)。
[0228] 〔実施例 15〕 培養細胞における p53タンパク発現量に対する Compound X, Yの影響
RKO細胞を Compound Yで処理し、 p53の蛋白質発現量の変化をウェスタンブロッテ イングで検討した。すなわち、 RKO細胞を 10 cmプレートに 5.0 X 105細胞/プレートで 細胞を播種し、 24時間培養後、 Compound Yを終濃度 5、 10、 20 μ Μで添カ卩した。 24 時間後に細胞を回収し、細胞溶解液を調製した。タンパク質を SDS-PAGEで分離し、 抗 ρ53抗体（FL393, Santa Cruz社）を用いて、ウェスタンブロッテイング法を行った。ゥ エスタンブロッテイング法の操作は、一次抗体として抗 p53抗体を、そして標識抗体と して抗ヒ HgGゥサギ -HRPを用いる他は実施例 3に記載のとおりである。その結果、 Co mpound Yにより p53のタンパク質発現量が上昇した（図 19)。
[0229] 〔実施例 16〕 ELISAによるシノビォリンの自己ュビキチン（auto-Ub)化反応評価系の 構築
ELISAによる簡便な自己ュビキチン化反応のアツセィ系を構築し、自己ュビキチン 化反応を阻害する化合物を評価する事を目的とした。
まず、 ELISA法を用いたシノビオリン自己ュビキチン化反応検出系における抗体濃 度の検討を行った。
即ち、 ATP(10 mM)存在下あるいは非存在下で、 His- El(human, 125 ng), His- PK- HA-Ub(1.6 μ g), His-UBE2G2(0.8 μ g), GST— Syno Δ ΤΜ(0.4 μ g)と混合し、 in vitro ュビキチンィ匕反応 (30 /z 1)を 37°Cで 1時間行った。反応液に 70 1の 0.5 M EDTAを添 加して反応停止後、予め PBST/10% Skim milkで 2時間ブロッキングした glutathione co ated ELISA用プレート (Reacti- Bind, PIERCE)に、反応停止後の混合液を添加して室 温で 1時間振盪した。廃液後、 200 1の PBSTで 3回洗浄した。 PBSTで希釈した抗 HA 抗体（1/2000, 1/4000, 1/8000)を 100 1ずつ分注し、室温で 1時間振盪した。廃液 後、 200 1の PBSTで 3回洗浄した。 PBSTで希釈した抗ゥサギ IgG抗体（1/1000, 1/20 00, 1/4000)を 100 1ずつ分注し、室温で 30分間振盪した。廃液後、 200 1の PBST で 3回洗浄した。 100 1の OPD発色液を添カ卩し、室温で 15分間振盪後、 50 1の 2 N 硫酸を 50 1添加して反応停止後、プレートリーダーにより 492應における吸光度を 測定した（図 20)。
[0230] 次に、 ELISA法を用いたシノビオリン自己ュビキチン化反応検出系における GST-S yno Δ ΤΜ濃度の検討を行った。
即ち、 ATP(10 mM), His- El(human, 125 ng), His- PK- HA- ΙΛ)(1.6 g), His- UBE2 G2(0.8 μ g), GST-Syno Δ ΤΜ(0.83、 1.7、 3.3、 6.7、 13.3 ng/ μ 1)を混合し in vitroュビ キチン化反応 (30 /z 1)を 37°Cで 1時間行った。反応液に 70 1の 0.5 M EDTAを添カロし て反応停止後、予め PBST/10% Skim milkで 2時間ブロッキングした glutathione coated ELISA用プレート (Reacti- Bind,PIERCE)に、反応停止後の混合液を添加して室温で 1時間振盪した。廃液後、 200 1の1¾3丁で3回洗浄した。 PBSTで希釈した抗 HA抗体 (1/2000)を 100 1ずつ分注し、室温で 1時間振盪した。廃液後、 200 1の1¾3丁で3回 洗浄した。 PBSTで希釈した抗ゥサギ IgG抗体（1/2000)を 100 1ずつ分注し、室温で 3 0分間振盪した。廃液後、 200 1の1¾3丁で3回洗浄した。 100 1の OPD発色液を添カロ し、室温で 15分間振盪後、 50 1の 2 N硫酸を 50 1添加して反応停止後、プレートリ ーダ一により 492 應における吸光度を測定した（図 21)。
[0231] 最後に、 ELISA法を用いたシノビオリン自己ュビキチンィ匕反応検出系における反応 時間の検討を行った。
即ち、 ATP(10 mM), His- El(human, 125 ng), His- PK- HA- ΙΛ)(1.6 g), His- UBE2 G2(0.8 μ g), GST-Syno Δ ΤΜ(200 ng)を混合し in vitroュビキチン化反応 (30 μ 1)を 37 °Cで 15, 30, 60, 120分間行った。反応液に 70 μ 1の 0.5 M EDTAを添カ卩して反応停止 後、予め PBST/10% Skim milkで 2時間ブロッキングした glutathione coated ELISA用プ レート (Reacti-Bind, PIERCE)に、反応停止後の混合液を添加して室温で 1時間振盪 した。廃液後、 200 1の1¾3丁で3回洗浄した。 PBSTで希釈した抗 HA抗体（1/1000) を 100 1ずつ分注し、室温で 1時間振盪した。廃液後、 200 1の PBSTで 3回洗浄した 。 PBSTで希釈した抗ゥサギ IgG抗体（1/2000)を 100 1ずつ分注し、室温で 30分間振 盪した。廃液後、 200 1の PBSTで 3回洗浄した。 100 1の OPD発色液を添カ卩し、室温 で 15分間振盪後、 50 1の 2 N硫酸を 50 1添加して反応停止後、プレートリーダーに より 492 應における吸光度を測定した（図 22)。
その結果、今回構築した ELISA系では、 ATP存在下の場合に、抗 HA抗体濃度およ び二次抗体濃度（図 20)、 GST-Syno Δ ΤΜ濃度（図 21)および反応時間（図 22)に 依存してシグナルの増強が認められた。
[0232] 〔実施例 17〕 低分子化合物のリウマチ滑膜細胞 (RASC)に対する効果
シノビオリン自己ュビキチンィ匕を指標としたスクリーニングによりデザインされた 2種 の低分子化合物 (No.32 (Compound X)、 38 (Compound Y) )のリウマチ滑膜細胞 (RAS C)に対する効果を評価する為、まず、 RASCに対する増殖抑制効果を検討した。 検体は No. 32 (Compound X)、 38 (Compound Y)と命名した低分子化合物を使用し た。 RASCには HFLS- RA(Cell applications inc., Code CA40405)を用いた。 RASCを 96 well microtiter plateに 1000 cells I wellで播種し、 10%ゥシ胎児血清含 DMEM (KOH JIN BIO)により 24時間培養を行った。その後、検体を細胞に、終濃度 50 Mから 1/2 ずつ段階希釈して添カ卩し、 1、 24、 48時間後に 3- (4,5- dimethylthiazo卜 2- yl)- 2,5- diph enyltetrazoliumbromide(MTT)を終濃度 0.5 mg/mLとなるように添加し、 2時間後に培 地を吸引し、残ったフオルマザンを dimethyl sulfoxide 50 μ Lで溶解し、 540 nmにおけ る吸光度を測定した。細胞および検体を添加していない群を 0%、検体を添加してい ない群を 100%としたときの、検体を添加した群の吸光度を細胞生存率として算出した その結果、各化合物において、 72時間培養後の IC50値は No.32で 20 M、 No.38で 約 6 Mであった（図 23、 24)。これらの低分子化合物は低濃度で RASC細胞増殖抑 制効果を示し、抗リウマチ効果を有すると考えられた。
配列表フリーテキスト
[0233] 配列番号： 18：合成オリゴヌクレオチド (DNA/RNA混合物）
配列番号：19 :合成オリゴヌクレオチド (DNA/RNA混合物）
産業上の利用可能性
[0234] 本発明により、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能の阻害物質を有効成分と して含有する、 P53タンパク質活性化剤が提供される。この薬剤は癌治療剤として有 用である。
また本発明者らによって見出された知見に基づいて開発されたスクリーニング方法 を利用することにより、癌治療剤の候補ィ匕合物を効率的に取得することが可能である さらに、本発明者らによって見出された種々の知見は、 p53の癌抑制作用のメカ- ズムを解明するための学術的研究に対しても大いに貢献するものと期待される。 また、本発明の p53タンパク質活性化剤は、 p53に関連する癌抑制作用の解明のた めの研究用試薬としても有用である。
また本発明により、シノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する物質を有 効成分として含有する、抗リウマチ剤が提供される。本発明者らによって見出された 知見に基いて開発されたスクリーニング方法を利用することにより、抗リウマチ剤の候 補ィ匕合物を効率的に取得することが可能である。

Claims

請求の範囲
[1] シノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能阻害物質を有効成分として含有 する、 p53タンパク質活性化剤。
[2] 前記発現および Zまたは機能阻害物質が、シノビオリンタンパク質と P53タンパク質 との結合を阻害する活性を有する低分子化合物である、請求項 1に記載の p53タンパ ク質活性化剤。
[3] 前記発現および Zまたは機能阻害物質が P53タンパク質のュビキチン化を阻害す る機能を有する低分子化合物である、請求項 1に記載の p53タンパク質活性化剤。
[4] 前記発現および Zまたは機能阻害物質が、 P53リン酸ィ匕タンパク質を活性ィ匕する機 能を有する低分子化合物である、請求項 1に記載の p53タンパク質活性化剤。
[5] 前記 p53リン酸ィ匕タンパク質力 ATMまたは ATRである、請求項 4に記載の p53タ ンパク質活性化剤。
[6] 前記発現および Zまたは機能阻害物質が、以下の (a)〜 (c)からなる群より選択さ れる化合物である、請求項 1に記載の p53タンパク質活性化剤。
(a)シノビオリン遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)シノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する核酸
(c)シノビオリン遺伝子の発現を RNAi効果により阻害する作用を有する核酸
[7] 前記発現および Zまたは機能阻害物質が、以下の (a)または (b)の化合物である、 請求項 1に記載の p53タンパク質活性化剤。
(a)シノビオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質と結合する抗体
(b)シノビオリンタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するシノビオリンタ ンパク質変異体
[8] 請求項 1〜7のいずれかに記載の p53タンパク質活性化剤を有効成分とする、癌治 療剤。
[9] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。
(a)シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞におけるシノビオリンタンパク質の発現量または活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、発現量または活性を低下させる化 合物を選択する工程
[10] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。
(a)シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構 造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物を接触させな 、場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レべ ルを低下させる化合物を選択する工程
[11] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。
(a)シノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
(b)シノビオリンタンパク質と p53タンパク質との結合活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物 を選択する工程
[12] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。
(a)シノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、および被検化合物を接触させる工程
(b) p53タンパク質のュビキチン化を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな 、場合と比較して、前記ュビキチンィ匕を低下させる化合 物を選択する工程
[13] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。
(a)シノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、 p53リン酸化タンパク質、および被検化合 物を接触させる工程
(b) p53タンパク質を基質とする p53リン酸ィ匕タンパク質のリン酸ィ匕活性を測定するェ 程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記リン酸ィ匕活性を上昇させる化合 物を選択する工程
[14] p53リン酸ィ匕タンパク質が ATMまたは ATRである、請求項 13に記載のスクリーニン グ方法。
[15] 以下の（a)および (b)を構成要素として含む、癌治療剤スクリーニング用キット。
(a)シノビオリンタンパク質 (b) p53タンパク質
[16] シノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有する物質を有効成 分として含有する、抗リウマチ剤。
[17] 前記シノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有する物質が低 分子化合物である、請求項 16に記載の抗リウマチ剤。
[18] 前記低分子化合物が、以下の一般式 (I)または (II)に記載の化合物である、請求項
17に記載の抗リウマチ剤。
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000064_0002
リウマチ滑膜細胞増殖抑制効果を有することを特徴とする、請求項 18に記載の抗リ ゥマチ剤。
以下の工程 (a)〜（c)を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法。
(a)シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程 (b)前記細胞におけるシノビオリンタンパク質の発現量または活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、発現量または活性を低下させる化 合物を選択する工程
[21] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法。
(a)シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構 造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物を接触させな 、場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レべ ルを低下させる化合物を選択する工程
[22] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法。
(a)シノビオリンタンパク質および被検化合物を接触させる工程
(b)シノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、前記自己ュビキチンィ匕を制御する 化合物を選択する工程
[23] シノビオリンタンパク質を構成要素として含む、抗リウマチ剤のスクリーニング用キッ
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