WO2005061007A1

WO2005061007A1 - 癌の抑制方法

Info

Publication number: WO2005061007A1
Application number: PCT/JP2004/019797
Authority: WO
Inventors: Toshihiro Nakajima; Satoshi Yamasaki; Naoko Yagishita
Original assignee: St. Marianna University School Of Medicine
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2005-07-07
Also published as: JPWO2005061007A1

Abstract

本発明は、p53癌抑制遺伝子を活性化させて核に局在化させる方法、及びp53癌抑制遺伝子の活性を促進する物質を含む医薬組成物に関する。さらに、配列番号１に示される塩基配列のうち配列番号2～15に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的配列として設計されたsiRNAを含む医薬組成物、及び前記siRNAを用いて、シノビオリンの発現を阻害することを特徴とするp53癌抑制遺伝子の活性化方法である。

Description

明細書癌の抑制方法技術分野

本発明は、 p53癌抑制遺伝子を活性化させて核に局在化させる方法に関する。また、本発明は、 p53癌抑制遺伝子の活性を促進する物質を含む医薬組成物に関する。背景技術

シノピオリンは、リウマチ患者由来滑膜細胞で過剰発現している膜タンパク質として発見された新規タンパク質である（WO02/052007) 。そして、遺伝子改変動物を用いた研究により、シノビオリンは関節リウマチの発症に必須の分子であることが判明した。

タンパク質構造予測システムにより、シノビオリンは RING finger モチーフを有することが示唆されている。このモチーフはタンパク質のュピキチン化に重要な役割を果たす E3ュビキチンライゲースという酵素に多く見出されているが、実際、シオビオリンが E3ュビキチンライゲースの特徴のひとつである自己ュビキチン化活性を有することが証明されている（WO02/052007) 。

ところで、 p53は、第 17染色体 pl3に位置しており、癌細胞の発生及び増殖においてきわめて重要な癌抑制遺伝子である。 p53 は、 DNA 上の特異的塩基配列 [ 5'-(A/T)GPyPyPy-3')]を認識し、 wafl/cipl、 GADD45, BAX等の特定の遺伝子の転写活性化を促す。また、（i )その他の多くの遺伝子の転写を抑制すること、（i i ) SV40ラージ T抗原、アデノウイルス EIBタンパク質、パピローマウィルス E6 などのウィルス性癌遺伝子、あるいは mdm2 等の細胞性癌遺伝子と結合すること、（i i i )ミスマッチを含む DNAと特異的に結合すること等の生理機能が知られている。

従って、癌の抑制物質を見出すには、 p53の機能を解析することが重要である。発明の開示

本発明は、 p53癌抑制遺伝子の活性化を促進する方法、及び p53癌抑制遺伝子の活性化を促進する医薬組成物を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、シノビォリンホモノックアウト動物を詳細に解析したところ、野生型に比し、アポトーシスを起こしている細胞が多数観察され、また、アポトーシスの誘導に深く関与している p53が核内に局在し、強く発現していることが判明した。そして、シノビォリンの機能を抑制することにより、 p53が活性化され、癌細胞の増殖が阻止されることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。

(1) 配列番号 1に示される塩基配列のうち配列番号 2〜15に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも 1つの配列を標的配列として設計された siRNA を含む医薬組成物。

上記医薬組成物は、癌を治療するために使用される。

(2) 配列番号 1に示される塩基配列のうち配列番号 2〜： 15に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも 1つの配列を標的配列として設計された siRNA を用いて、シノビオリンの発現を阻害することを特徴とする p53癌抑制遺伝子の活性化方法。

(3) 配列番号 1に示される塩基配列のうち配列番号 2〜： 15に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも 1つの配列を標的配列として設計された siRNA を用いて、シノビオリンの発現を阻害することを特徴とする p53癌抑制遺伝子の核への局在化方法。

上記局在化方法は、核に局在化した p53癌抑制遺伝子に、さらに放射線照射を行うこともできる。

(4) p53の第 15番目のセリン残基をリン酸化することを特徴とする p53の活性化方法。図面の簡単な説明図 1は、シノビオリンホモノックァゥトマウス胎児線維芽細胞（MEFs)における免疫組織染色の結果を示す写真である。

図 2は、 syno-/ -の胚における抗 p53抗体による免疫組織染色の結果を示す写真である。

図 3 は、アポト一シス関連タンパク質に関するウェスタンブロッテイングの結果を示す写真である。

図 4は、 syno- の MEF培養細胞における p53 のリン酸化部位を同定した結果を示す写真である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。 '

本発明は、シノビォリンの機能を阻害して p53癌抑制遺伝子（単に p53ということもある）を核に局在化及び活性化させることにより、癌を抑制することを特徵とする。

1 . p53の活性化

正常細胞を紫外線等にさらすと、細胞内の p53が活性化して、その結果細胞増殖が阻止されることから、 p53の濃度を上昇させることにより、癌細胞の増殖を止めることができる。つまり、 p53が機能しない場合は、癌細胞の増殖が止められず、癌が進行することになる。事実、 p53は正常な個体の細胞にはほとんど見られないが、癌患者由来の細胞の約半数においてはこの p53の欠損変異が起こつている。また、このような変異が起こっていない場合でも、 p53の制御機構に何らかの変異が生じて癌抑制機能が失われている。したがって、癌の進行を抑えるには p53を有効に機能させることが必要である。

本発明においては、 p53の活性化を癌治療の有効な方法の一つとするため、シノビォリンの機能に着目した。そして、シノピオリンホモノックアウト動物を作製し、詳細に解析したところ、野生型に比してアポトーシスを起こしている細胞が多数観察された。すなわち、シノビォリンの機能を阻害すると、アポトーシスに深く関与している p53の活性化が促進され、シノビオリンの機能阻害が癌抑制につながることを見出した。なお、アポトーシスとは、細胞が自ら引き起こすプログラムされた細胞死を意味し、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表面微絨毛の消失、細胞質の凝集、カスパーゼの活性化、ミトコンドリア膜電位の消失等を特徴とする。細胞に上記特徴が生じたときに、アポト一シスが引き起こされたと判断する。

本発明において、胎児胚における p53の免疫染色を行うと、シノビオリンホモノックアウトマウス胎児胚では全身において p53が強く発現する。また、シノビオリンホモノックァゥトマウス胎児胚から単離した胎仔線維芽細胞（MEFs) も、野生型から単離したものに比して強く発現しており、しかも p53は核内に強く局在する。この核局在は野生型ではまったく観察されない。このことは、シノピオリンの発現を阻害することにより、 p53を核内へ移行させることができることを意味する。さらに、シノビオリンホモノックアウトマウス胎仔 MEFsでは、高い放射線感受性を示す。従って、本発明において、シノビォリンの発現を阻害して p53を核に移行させた後に放射線照射を行うと、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。

さらに、本発明においては、 p53 (p53タンパク質）のアミノ酸の一部をリン酸化することにより p53を活性化させることを特徴とする。 p53のリン酸化の対象は、 p53のアミノ酸配列のうちセリン残基であることが好ましく、第 15番目のセリン残基がさらに好ましい。

p53は ATRおよび ATM等のキナーゼによりリン酸化されることが知られており、リン酸化は、シノビオリンを阻害することによりこれらのキナーゼ活性を上昇させることが考えられる。

2 . シノピオリン発現阻害及び活性阻害

p53を活性化するためには、シノビオリンの発現を阻害する方法が採用される。

シノビォリンの発現阻害には、特に限定されるものではないが、例えば RNA 干渉（RNAi) を利用することができる。シノビオリン遺伝子に対する siRNA (s mall interfering RNA)を設計及び合成し、これを細胞内に導入させることによつて、 RNAiを引き起こすことができる。

RNAiとは、 dsRNA (double-strand RNA)が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、 dsRNAを細胞内に導入すると、その RNAと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。

siRNAの設計は、以下の通り行なうことができる。

(a) シノビオリンをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。例えば、ヒトの場合では、 Gen Bank Accession number AB024690 (配列番号 1 ) の任意の領域を候補にすることができる。

(b) 選択した領域から、 AAで始まる配列を選択し、その配列の長さは 19〜25 塩基、好ましくは 19〜21塩基である。その配列の GC含量は、例えば 40〜60%となるものを選択するとよい。具体的には、配列番号 1に示される塩基配列のうち、以下の塩基配列から選ばれる少なくとも 1つの配列を含む DNAを siRNAの標的配列として使用することができる。特に、（i) (配列番号 2) 、 (i i) (配列番号 3) 、 (v i ) (配列番号 7) 、 (v i i ) (配列番号 8) 、 (v i i i) (配列番号 9) を標的とすることが好ましい。

(i) AA TGTCTGCATCATCTGCCGA GA (配列番号 2)

(ii) AA GCTGTGACAGATGCCATCA TG (配列番号 3)

(iii) AA AGCTGTGACAGATGCCATC AT (配列番号 4)

(iv) AA GAAAGCTGTGACAGATGCC AT (配列番号 5)

(v) AA GGTTCTGCTGTACATGGCC TT (配列番号 6)

(vi) AA CAAGGCTGTGTACATGCTC TA (配列番号 7)

(vii) AA ATGTTTCCACTGGCTGGCT GA (配列番号 8)

(viii) AA GGTGTTCTTTGGGCAACTG AG (配列番号 9)

(ix) AA CATCCACACACTGCTGGAC GC (配列番号 10)

(x) AA CACCCTGTATCCAGATGCC AC (配列番号 11)

(xi) AA GGTGCACACCTTCCCACTC TT (配列番号 12)

(xii) AA TGTTTCCACTGGCTGGCTG AG (配列番号 13)

(xiii) AA GAGACTGCCCTGCAACCAC AT (配列番号 14)

(xiv) AA CGTTCCTGGTACGCCGTCA CA (配列番号 15) siRNAを細胞に導入するには、インビトロで合成した siRNAをプラスミド DN Aに連結してこれを細胞に導入する方法、 2本の RNAをァニールする方法などを採用することができる。

また、本発明は、 RNAi効果をもたらすために shRNAを使用することもできる。 shRNAとは、ショートヘアピン RNA(short hairpin RNA)と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有する RNA分子である。

shRNAは、その一部がステムループを構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列 Aとし、配列 Aに対する相補鎖を配列 B とすると、配列 A、スぺーサ一、配列 Bの順になるようにこれらの配列が一本の RNA鎖に存在するようにし、全体で 45〜60塩基の長さとなるように設計する。配列 Aは、標的となるシノビオリン遺伝子（配列番号 1) の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列 Aの長さは 19〜25塩基、好ましくは 19〜21塩基である。

3 . 医薬組成物

本発明において作製された shRNA、 siRNAは、シノビォリンの発現を抑制する物質であり、 p53を活性化させる医薬組成物（特に癌の遺伝子治療剤）として使用することができる。

本発明の医薬組成物を癌の遺伝子治療剤として使用する場合は、適用部位は特に限定されず、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膝臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病（例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型 T細胞白血病、悪性リンパ腫）、等を対象として適用される。

上記癌は、原発巣であっても、転移したものであっても、他の疾患と併発したものであってもよい。

本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の医薬組成物を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクタ一、ヘルぺスウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、レトロウイルスベクタ一、レンチウィルスベクタ一等が挙げられ、これらのゥィルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。

また、本発明の医薬組成物をリボソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。 siRNAや shRNAを保持させた小胞体をリポフエクシヨン法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等の全身投与する。脳等に局所投与することもできる。

本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は 1日 1回あたり 10⁶ 〜： !Ois個程度であり、 1週〜 8週間隔で投与される。

siRNA又は shRNAを目的の組織又は器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット (例えばアデノエクスプレス：クローンテック社) を用いることもできる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例 1〕

本実施例は、シノビオリンホモノックアウトマウス（syno ）胎児線維芽細胞 (MEFs)におけるアポトーシス関連タンパク質をウエスタンプロッティングにより検出し、さらに細胞を免疫組織染色により確認した。

すなわち、免疫染色法は、 MEFsを常法に従いスライドガラス上に固定し、 2 種類の抗 p53抗体（マウスモノクローナル抗体 BD： Becton， Dickinson 社、ゥサギポリクロ一ナル抗体 FL393： Santa cruz社）を用いて免疫染色を行った。 3 % 牛血清アルブミン（BSA) で 30分ブロッキングを行った標本に、 0.3%BSAで希釈した抗 p53抗体（BD： 10pg/ml、 FL393： 5 g/ml) を室温で 60分免疫反応させた。反応後の標本を PBSで洗浄後、フルォレセインイソチオシァネート標識抗ゥサギ IgG抗体または TRITC標識抗マウス IgG抗体（Dako社）を 2次抗体として免疫反応させた。抗 p53抗体に免疫反応する抗原の確認は、蛍光顕微鏡で行つた。

その結果、野生型に比し、 syno- の MEF培養細胞では p53の活性化を起こしている細胞が多数確認された（図 1 ) 。〔実施例 2〕

本実施例は、 syno マウスにおける p53活性化の検討である。

synoチマウスにおける p53活性化の検討を、胚を用いて免疫染色により行つた。

すなわち、 syno-/-の胎仔における免疫染色は、常法に従い組織をスライドガラス上に固定し、ベクタスティン ABCキット（VECTOR社）を用いて行った。ブロッキング試薬で 30分ブロッキングした標本に対して、 5pg/mlに希釈した抗 p 53 抗体 FL393を室温で 60分間免疫反応させた。反応後の標本を PBSで洗浄し、 HR P標識抗ゥサギ IgG抗体を 2次抗体として免疫反応させた。抗 p53抗体に免疫反応する抗原は、 HRP活性に基づく 3，3'-ジァミノべンジジン四塩酸塩の発色により確認した。対比染色としてメチルグリーン染色を行った。

この結果、 synoチの胚における p53が活性化していることが確認された（図 2 ) 。

〔実施例 3〕

本実施例では、 p53に対するシノビォリンの効果を検討した。

syno-/-の MEF培養細胞におけるアポトーシス関連タンパク質をウエスタンブロッティングにより検出した。

すなわち、各種細胞を細胞破砕液（15 mM Tris-HCl (pH7.5) 、 200 mM NaCL 0.5% NP40、 1 mM PMSF、 0.1%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS) 、 2 pg/mlロイぺプチン、 2pg/mlァプロチニン、 2pg/mlぺプス夕チン）を用いて細胞破碎画分を調製した。その後、 SDS ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAG E) により細胞破砕画分を分離した。 SDS-PAGE後、細胞由来タンパク質は、ェレクトロブロッテイング法によりニトロセルロース（NC) 膜に転写した。この NC膜に対し、 5%スキムミルクを加えたトリス塩酸（TBS) で室温、 1時間プロッキングした後、抗 p53抗体 C-tarminal aa;195_393または FL393を 5%スキムミルクを加えた TBSで希釈して室温、 1時間免疫反応させた。反応後の NC膜を 0. 1% Tween20/TBSで洗浄し、 horse radish peroxidase (HRP) 標識抗ゥサギ Ig G抗体を 2次抗体として室温、 1時間免疫反応させ、 0.1% Tween20/TBSで洗浄し、 HRP活性を検出することにより目的抗原を検出した。 HRP活性の検出には ECLキット（Amersham社）を用いた（Clinical Chemistry. 25, pl531， 197 9) 。

その結果、ウェスタンブロッティングにより syno の MEF培養細胞における p 53発現量が増加していることが確認された（図 3 ) 。

〔実施例 4〕

本実施例は、 syno- の MEF培養細胞における p53のリン酸化部位を同定した。

抗 p53抗体を用いたウエスタンプロッティングにより p53のリン酸化部位の同疋を行った。

すなわち、 p53 (配列番号 16) の異なるセリン残基のリン酸化を認識する 4種の抗リン酸化 p53モノクロ一ナル抗体（P53serl5-P 、 P53ser20-P 、 P53ser37- Pおよび P53ser46-P； Becton, Dickinson 社）を用いて、 MEF細胞の蛋白質を S DS-PAGEで分離し、ウエスタンブロッテイング法を行った。ウエスタンブロッティング法の操作は、一次抗体として抗リン酸化 p53モノクローナル抗体を、そして標識抗体として抗マウス IgGヒッジ -HRPを用いる他は実施例 3に記載のとおりである。図 4において、'左上のパネルが第 15番目のセリン残基がリン酸化されたものである。 53kDa付近のバンドが顕著に濃く表れている。

その結果、 syno- の MEF培養細胞において、 p53のアミノ酸配列（配列番号 1 6 ) 中、第 15番目のセリン残基のリン酸化が顕著であった（図 4 ) 。産業上の利用可能性

本発明により、 p53 癌抑制遺伝子の活性を促進する物質が提供される。この物質は、 p53 を活性化して p53 を核に移行させることができるため、癌の治療用医薬組成物として有用である。また、本発明によりシノビォリンの機能を抑制することにより、癌の治療が可能となる

Claims

1 . 配列番号 1に示される塩基配列のうち配列番号 2〜： 15に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも 1つの配列を標的配列として設計された _siR NAを含む医薬組成物。

2 . 癌を治療するための請求項 1記載の医薬組成物。

3 . 配列番号 1に示される塩基配列のうち配列番号 2〜： 15に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも 1つの配列を標的配列として設計された siRN

Aを用いて、シノビオリンの発現を阻害することを特徴とする p53癌抑制遺伝子の活性化方法。の

4. 配列番号 1に示される塩基配列のうち配列番号 2〜： 15に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも 1つの配列囲を標的配列として設計された siRN

Aを用いて、シノビオリンの発現を阻害することを特徴とする p53癌抑制遺伝子の核への局在化方法。

5 . 核に局在化した p53癌抑制遺伝子に、さらに放射線照射を行うことを特徴とする請求項 4記載の方法。

6 . p53の第 15番目のセリン残基をリン酸化することを特徴とする p53の活性化方法。'