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WO2006054689A1 - マイクロチップ - Google Patents

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Info

Publication number
WO2006054689A1
WO2006054689A1 PCT/JP2005/021231 JP2005021231W WO2006054689A1 WO 2006054689 A1 WO2006054689 A1 WO 2006054689A1 JP 2005021231 W JP2005021231 W JP 2005021231W WO 2006054689 A1 WO2006054689 A1 WO 2006054689A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
flow path
reaction
microchip
depth
region
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/021231
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shuichi Akaba
Yuichi Oku
Manabu Tokeshi
Takehiko Kitamori
Original Assignee
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
Kanagawa Academy Of Science And Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Kanagawa Academy Of Science And Technology filed Critical Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority to JP2006545160A priority Critical patent/JP4850072B2/ja
Priority to US11/791,102 priority patent/US20110038758A1/en
Priority to EP05806585A priority patent/EP1816187A4/en
Publication of WO2006054689A1 publication Critical patent/WO2006054689A1/ja

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B81—MICROSTRUCTURAL TECHNOLOGY
    • B81B—MICROSTRUCTURAL DEVICES OR SYSTEMS, e.g. MICROMECHANICAL DEVICES
    • B81B1/00—Devices without movable or flexible elements, e.g. microcapillary devices
    • B81B1/002—Holes characterised by their shape, in either longitudinal or sectional plane
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0825—Test strips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0877—Flow chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B81—MICROSTRUCTURAL TECHNOLOGY
    • B81B—MICROSTRUCTURAL DEVICES OR SYSTEMS, e.g. MICROMECHANICAL DEVICES
    • B81B2201/00—Specific applications of microelectromechanical systems
    • B81B2201/05—Microfluidics
    • B81B2201/058—Microfluidics not provided for in B81B2201/051 - B81B2201/054

Definitions

  • the present invention relates to a microchip that can significantly increase the reaction efficiency and is designed for a flow path that realizes highly stable and reproducible measurement, and is particularly suitable for highly sensitive diagnosis. Related to microchips.
  • TAS TAS micro total analysis system
  • This is a microchip in which a minute flow path with a cross-sectional width of several zm to several mm is made on a glass, silicon or plastic substrate of several centimeters square called a microchip, and the chemical analysis operation is performed.
  • This is an analytical system (hereinafter referred to as TAS).
  • TAS analytical system
  • This system is known to exhibit merits such as the efficiency of chemical reaction accompanying the increase in specific interface area, and a significant reduction in reaction time.
  • the specific interfacial area is represented by the solid-liquid interfacial area with respect to the liquid volume, and can be specifically represented by the surface area of the channel wall surface per sample volume in a microchip in which fine channels are formed.
  • the specific interface area is increased by employing a microchip having a fine flow path of several / z m to several mm.
  • / z TAS has a narrow space in the flow path in the microchip, so that the diffusion distance of the substance can be shortened, so that the reaction time in the microchip can be greatly shortened.
  • Non-Patent Document 1 a polystyrene bead in which a blocking structure is formed in the flow path of a microchip and an antibody is bound. And then filling the upstream side of the structure, and sequentially feeding the sample and labeled antibody to form an antigen-antibody complex on the surface of the bead, followed by anti-antibody using a thermal lens microscope.
  • Non-Patent Document 1 It has been reported to detect a labeled substance in the original antibody complex.
  • the immunoassay system of Non-Patent Document 1 is constructed by integrating an immunoassay system, which is usually performed using a microtiter plate, etc., in a micro space on a microphone mouth chip.
  • Non-patent document 1 reports that the reaction time has been significantly shortened and the detection sensitivity has been improved compared to the system that uses the system! RU
  • Non-patent Document 2 In Lab on a chip 2002, 2, 27-30 (Non-patent Document 2), an antibody is immobilized on the surface of the magnetic particles, and this is moved onto a magnet installed in the microchannel by feeding the solution. A measurement system that performs electrochemical detection by immobilizing magnetic particles and forming an immune complex on the surface of magnetic particles by sequentially feeding a sample and a labeled antibody has been reported.
  • the method of Non-Patent Document 2 is widely used and has a shorter reaction time than the conventional microtiter plate method, there is a disadvantage that an increase in detection sensitivity is not observed. This is probably because the electrochemical signal reaching the sensor is weak because the surface of the magnetic particle on which the antigen-antibody complex is formed and the electrochemical sensor for measurement are too far away. . In order to improve this, it may be possible to reduce the depth of the flow path, but the current technology has its limitations.
  • Non-patent Document 3 reports micromosaic immunoassay as a multi-item simultaneous measurement system.
  • an antibody is directly immobilized on a substrate, and a sample and a fluorescently labeled antibody are sequentially fed to the substrate, so that an immune complex is formed on the substrate and a labeled substance is detected by a fluorescence microscope. Yes.
  • the method of Non-Patent Document 3 is not recognized as being superior to the latex turbidimetric method generally used for immunological analysis.
  • Non-Patent Document 3 is formed using an adhesive polydimethylsiloxane for the fixed substrate and the flow path substrate, there is no need for thermal fusion or the like.
  • the material is rubbery and its shape retention is unstable. Therefore, it is not suitable for commercialization as a microchip that requires strict detection accuracy.
  • Non-Patent Document 1 Analytical chemistry 2001,73,1213-1218 Sato et al.
  • Non-Patent Document 2 Lab on a chip 2002,2,27-30
  • Non-Patent Document 3 Biosensors and Bioelectronics 19 (2004) 1193-1202
  • the detection technology used to detect the signal obtained by the reaction is limited due to the smallness of the reaction field.
  • the signal obtained in the reaction region is amplified, and the amplified signal is sent to a detection region different from the reaction region to detect it.
  • the detection area is naturally reduced, so that the optical path length is shortened and the detection is reproduced. It is difficult to ensure the property.
  • the detection sensitivity increases as the absolute amount of the substrate metabolite generated by the enzyme reaction increases in the detection region.
  • the optical path length in the flow path is long, the relative position of the focus in the flow path hardly changes even if the focal length is slightly deviated, so that stable reproducibility can be obtained.
  • the depth of the flow path from the irradiation direction corresponds to the optical path length, and the side surface of the flow path (flat plate microchip).
  • the width of the flow path becomes the optical path length.
  • An object of the present invention is a microchip used in a diagnostic device based on a microfluidic system, which can significantly increase the reaction efficiency and realizes measurement with high stability and reproducibility. It is providing the microchip which has this.
  • the first microchip of the present invention for achieving the above object, at least a flow path is formed at an interface between two substrates, and a reaction region and a downstream of the reaction region are formed in the flow channel.
  • the depth of the flow channel in the detection region is deeper than the depth of the flow channel in the reaction region.
  • the second microchip of the present invention at least a flow path is formed at the interface between two substrates, and a reaction area and a detection area downstream of the reaction area are formed in the flow path.
  • the width of the flow path in the reaction area is wider than the width of the flow path in the detection area, and the depth of the flow path in the detection area is deeper than the depth of the flow path in the reaction area.
  • the “depth of the channel” refers to the length in the channel in the same direction as the detection direction.
  • the depth is the inner dimension of the flow path in the detection direction perpendicular to the flat plate surface.
  • the depth of the channel is the inner dimension of the channel in the detection direction perpendicular to the side.
  • the “width of the flow path” refers to the internal dimension of the flow path in the microchip in the direction perpendicular to the detection direction.
  • the “detection direction” means a direction in which excitation light enters the flow path in the case of detection by a thermal lens microscope or detection by a fluorescence method, and in the case of detection by an absorption method, a measurement substance.
  • the "reaction region” has an interface to which a reaction contributes, and the interface is at least a part of the interface of the flow path, that is, a part or the whole.
  • an anti-biological substance having affinity for the biological substance for capturing the biological substance as the substance to be measured is fixed to the interface in the flow path. Those can be preferably used.
  • the first microchip of the present invention is a microchip with high detection stability and reproducibility because the depth of the flow channel in the detection region is deeper than the depth of the flow channel in the reaction region.
  • the specific interface area of the reaction area flow path increases, the reaction efficiency in the reaction area increases, and the sensitivity increases.
  • the microchip of the second aspect of the present invention is such that the width of the flow path in the reaction area is wider than the width of the flow path in the detection area and the depth of the flow path in the reaction area is Since it is shallower than the depth of the channel, the specific interface area in the flow channel in the reaction region increases, the reaction efficiency in the reaction region increases, the sensitivity increases, and the flow channel depth in the detection region is greater than the depth in the reaction region. Therefore, it becomes a microchip with high detection stability and reproducibility.
  • the microchip of the present invention has an affinity binding property to a biological substance for capturing the biological substance as a specific measurement substance at the interface of the flow path in the reaction region. Since the biological substance is fixed, the biological substance can be analyzed in addition to the effects described in 1 or 2 above, which is highly useful as a diagnostic microchip.
  • FIG. 1 shows a standard flow channel as a control, and the reaction region and the region force before and after the reaction region have the same shape (width 0.3 mm, depth 0.1 mm). Is a top view of the flow path, and FIG. 1B is a cross-sectional view of the flow path.
  • FIG. 2 shows one form of a flow path that is useful in the present invention
  • FIG. 2a is a top view of the flow path
  • FIG. 2b is a cross-sectional view.
  • FIG. 3 shows another form of the channel in the microchip of the present invention
  • FIG. 3a is a top view of the channel
  • FIG. 3b is a cross-sectional view of the channel.
  • FIG. 4 shows still another embodiment of the flow path in the microchip of the present invention
  • FIG. 4a is a top view of the flow path
  • FIG. 4b is a cross-sectional view of the flow path.
  • Example 2 while pumping SATBlue (trade name, manufactured by Dojin Chemical Research Laboratories), the excitation light is set to a wavelength of 633 nm and the probe light intensity is 88 nm in the detection region downstream of the reaction region. Then, a signal in the depth direction of the flow path is detected by a thermal lens microscope, and the obtained result is a graph in which the vertical axis indicates the thermal lens signal intensity and the horizontal axis indicates the concentration of the complementary sequence piotin-labeled oligonucleotide.
  • SATBlue trade name, manufactured by Dojin Chemical Research Laboratories
  • Example 3 while feeding SATBlue (trade name, manufactured by Dojin Chemical Research Laboratories), excitation light is set to a wavelength of 633 nm and probe light power of 88 nm in the detection region downstream of the reaction region. Then, a signal in the depth direction of the flow path is detected by a thermal lens microscope, and the obtained result is a graph in which the vertical axis indicates the thermal lens signal intensity and the horizontal axis indicates the concentration of HBsAg.
  • SATBlue trade name, manufactured by Dojin Chemical Research Laboratories
  • the specific interface area of the reaction region in the flow channel is larger than the detection region in the flow channel. That is, since the volume of the reaction region is smaller than that of the detection region in the flow path, the reaction efficiency increases in the reaction region by increasing the diffusion efficiency of the substance to the interface.
  • the reaction region in the microchip of the present invention has an interface to which a reaction contributes, and the interface is at least a part of the interface of the flow path, that is, a part or the whole.
  • the cross-sectional shape of the flow path of the microchip of the present invention is an interface such as a triangle, a square, a rectangle, a trapezoid, a parallelogram, another quadrangle, a polygon having five or more vertices, and a circular 'elliptical shape.
  • Examples include a shape that is entirely curved, and a shape in which one or more of the interfaces are flat and the other part is curved, such as a half-moon shape.
  • the specific interface area increases and the diffusion efficiency of the substance at the interface increases.
  • Response efficiency increases.
  • the specific interface area of the reaction surface increases by reducing the depth of the flow path.
  • the specific interface area of the reaction surface is increased by reducing the width of the flow path, so that the reactivity is increased.
  • the specific interface area is increased by reducing one or both of the width and depth of the channel, thereby increasing the reactivity. Therefore, it is preferable to reduce the volume of the reaction zone to such a level that liquid can be sent stably.
  • the lower surface of the flow path means that a microchip on a flat plate is placed horizontally. The bottom surface in the flow path.
  • the “upper surface of the flow path” refers to the ceiling surface in the flow path when the microchip on the flat plate is horizontally placed.
  • the “side surface of the channel” refers to a side surface of the inner surface of the channel that is parallel to the side surface of the microchip on the flat plate.
  • the “specific interface area” refers to the ratio of the surface area of the channel wall surface to the volume of the channel. For example, if the cross section with a width of 0.1 mm, a depth of 0.2 mm, and a length of 0.5 mm is rectangular, the specific interface area is
  • the specific interface area of the bottom surface of the channel (width 0.1 mm, length 0.5 mm) is:
  • linear flow velocity refers to the distance traveled by a liquid per unit time, and is a concept different from the flow velocity representing the amount of liquid fed per unit time. is there.
  • a cylindrical channel A with a width of 0.1 mm and a depth of 0.2 mm is compared with a cylindrical channel A with a width of 0.1 mm and a depth of 0.1 lm m.
  • the distance that the liquid travels in the channel in a certain time in the channel B is twice that in the channel A.
  • channel A has a volume twice that of channel B because channel A has a depth twice that of channel B.
  • the linear velocity of channel B is twice the linear velocity of channel A.
  • FIG. 2a and FIG. 2b show one form of the channel in the microchip of the present invention.
  • Figure 2a shows the flow
  • FIG. 2b is a cross-sectional view of the channel.
  • a reaction region 14 is formed in which an antibiotic substance for capturing the biological substance to be measured is fixed.
  • a liquid supply port 11 for supplying a reagent or a specimen sample is provided at one end of the flow path 12, and a liquid discharge port 13 for discharging the liquid in the flow path 12 is provided at the other end.
  • a detection region 15 is provided in the flow path 12 downstream of the reaction region 14.
  • the detection area 15 is an area for measuring a signal in the channel 12 using an optical analysis means such as a fluorescence method, a chemiluminescence method, or a thermal lens spectroscopy.
  • FIGS. 3a and 3b show another embodiment of the channel in the microchip of the present invention.
  • Fig. 3a is a top view of the channel
  • Fig. 3b is a cross-sectional view of the channel.
  • a liquid supply port 21 for supplying a reagent or a specimen sample is provided at one end of the flow path 22, and a liquid discharge port 23 for discharging the liquid in the flow path 22 is provided at the other end.
  • a detection region 25 is provided in the flow path 22 downstream of the reaction region 24.
  • the detection region 25 is a region for measuring a signal in the flow path 22 using an optical analysis means such as a fluorescence method, a chemiluminescence method, or a thermal lens spectroscopy.
  • the width W of the reaction region 24 is
  • the depth H of the flow path in the reaction region 24 is shallower than the depth H of the region before and after the reaction region 24.
  • FIG. 4a and FIG. 4b show still another form of the channel in the microchip of the present invention.
  • Fig. 4a is a top view of the channel
  • Fig. 4b is a cross-sectional view of the channel.
  • a reaction region 34 is formed in which an antibiotic substance for capturing a biological substance to be measured is fixed.
  • a liquid feed port 31 for supplying a reagent or a specimen sample is provided at one end of the flow channel 32, and a liquid discharge port 33 for discharging the liquid in the flow channel 32 is provided at the other end.
  • a detection region 35 is provided in the flow path 32 downstream of the reaction region 34.
  • the detection region 35 is a region for measuring a signal in the flow path using an optical analysis means such as a fluorescence method, a chemiluminescence method, or a thermal lens spectroscopy.
  • the width W of the reaction region 34 is The width W of the region before and after the reaction region 34, the depth H of the reaction region 34 wider than W is the reaction region
  • the depth of the region around 34 is smaller than H and H.
  • the flow path 32 upstream of the reaction zone 34 has a width W
  • the linear flow velocity in the flow path 32 can be controlled to be constant, and the linear flow velocity can be gradually increased or decreased.
  • the target flow rate is adjusted to the flow rate in the reaction region after the sample solution or chemical solution is transferred to the microchip, the flow rate of the solution after passing through the reaction region becomes slow, and the flow rate in the detection region is reduced. It may take a long time to reach and hinder rapid measurement.
  • the solution passes through the reaction region instantaneously, so that the amplification efficiency is lowered, and it may be difficult to achieve the purpose of signal amplification.
  • the width of the flow path is widened when the flow path depth in the reaction area is reduced, and the depth of the flow path is increased when the width of the flow path in the reaction area is reduced. It is preferable to design a flow path that controls the linear flow velocity of the entire flow path to be constant while increasing the specific interface area of the reaction surface in the reaction region.
  • the width of the flow path in the reaction region is preferably 1 ⁇ m or more and 2 mm or less, more preferably 500 m or less. If the width of the flow path is less than 1 ⁇ m, resistance due to the surface tension of the solution will increase, and very high pressure will be required to send the solution to the flow path, making stable liquid feeding difficult. . In addition, if the width of the flow path exceeds 2 mm, the flow of the solution is disturbed, and uniform liquid feeding into the flow path is difficult.
  • the depth of the flow path in the reaction region is preferably 1 ⁇ m or more and 2 mm or less, more preferably 500 m or less. If the depth of the flow path is less than L m, the resistance due to the surface tension of the solution increases, and the pressure is very high when the solution is sent to the flow path. Is necessary and stable liquid feeding is difficult. In addition, if the depth of the flow path exceeds 2 mm, the flow of the solution is disturbed, making it difficult to send liquid uniformly into the flow path.
  • the depth of the flow path in the detection region is preferably 10 ⁇ m or more and 2 mm or less. If the depth of the flow path is less than 10 m, it is difficult to measure with a microchip. If the depth of the flow path exceeds 2 mm, the flow of the solution is disturbed and it is difficult to send the liquid into the flow path.
  • the materials of the two substrates for producing the microchip of the present invention include polydimethylsiloxane (PDMS: abbreviation, Anal. Chem., Vol. 69, pp. 3451-3457, 1997), acrylic resin Fat (Anal. Chem., Vol. 69, pp. 2626, 1997), Polymethylmetatalylate (PMMA: Abbreviation, Anal. Chem., Vol. 69, pp.
  • the substrate may be transparent or opaque, but if it is opaque, at least the detection part is preferably transparent. Further, the substrate may be subjected to a hydrophilic treatment or a hydrophobic treatment.
  • the microchip of the present invention can be manufactured, for example, by the following method. First, a mold is prepared by etching a silicon wafer. The molten polymer is poured into this to transfer the structure and solidify the polymer. By transfer, one substrate on which a groove serving as a flow path is formed is formed. If it is joined to the other flat substrate, a microchip is manufactured.
  • the joining of two substrates is generally performed by heating. If PDMS is used as the material, the flow path can be easily sealed by natural adsorption with glass PDMS. Microchips using plastic are advantageous in terms of cost because they can be easily mass-produced. In the case of glass, the depth must be adjusted according to the reaction time of hydrogen fluoride. However, in the case of plastic, once the saddle is made, it can be produced with high reproducibility by injection molding technology. It becomes possible. For bonding two substrates, bonding with adhesive is generally used, and heat fusion You may join by. Examples of the adhesive include ionizing radiation curable adhesives such as ultraviolet rays, thermosetting adhesives, organic adhesives such as acrylic adhesives and epoxy adhesives, and inorganic adhesives.
  • the object to be detected by the microchip of the present invention is preferably a biological substance.
  • Biological substances include antigens, antibodies, sugar chains, glycoproteins, lectins, receptors, ligands, DNA, RNA, other substances that can specifically bind to substances in the body, and the molecular weight of the substances There are things that do not depend on.
  • Samples for analyzing these analytes include blood, plasma, serum, urine, saliva, other body fluids, DNA, RNA, chromosomes, DNA, RNA amplifications, antigens, antibodies, sugar chains
  • An object containing a receptor and a ligand can be a sample.
  • the antibiological substance immobilized on the interface to which the reaction of the reaction region of the microchip of the present invention contributes includes an antibody against the antigen, an antigen against the antibody, avidin against piotin, piotin against avidin, DNA against DNA, RNA DNA, ligands for receptors, receptors for ligands, and the like.
  • a method of immobilizing an antibiological substance on the interface of the reaction region a method of directly binding an antibiotic substance to the interface and a method of immobilizing indirectly via a connector are considered.
  • the Examples of the method of directly immobilizing an antibiological substance on the interface of the reaction region include a method of immobilizing an ionic bond, a hydrogen bond, a hydrophobic bond, or a chemically modified interface with a covalent bond.
  • Examples of the binder for fixing the antibiological substance to the interface of the reaction region include nucleic acids such as deoxyribonucleic acid having a property stable to heat and an organic solvent.
  • the nucleic acid was fixed in advance as a binder at the interface of the reaction region, and the fixed substrate on which the nucleic acid was fixed and the flow path substrate on which the groove to be the flow path was formed were bonded together by heating. Later, the antibiological substance is transferred to the reaction region by sending a nucleic acid having a complementary sequence to the nucleic acid immobilized on the fixed substrate to the flow path. It can be fixed to the interface.
  • nucleic acid having a sequence complementary to the nucleic acid may be fixed to the interface of the reaction region.
  • magnetic particles can be used in addition to the nucleic acid.
  • a magnet is disposed in advance in or outside the flow path of the reaction region, and a liquid containing a biological substance fixed on the surface of the magnetic particles is sent to the flow path of the microchip.
  • Antibiological substances can be immobilized at the interface of the reaction zone.
  • the microchip of the present invention is designed so that at least one interface itself in the flow path of the reaction region has reactivity. Since the microchip of the present invention designed as described above uses polystyrene beads that impede liquid feeding in a microchip in which polystyrene beads are dammed in a conventional flow path, The flow rate in the microchip flow path and the uniformity of the liquid delivery are not impaired.
  • Examples of the detection means in the detection region of the present invention include fluorescence, chemiluminescence, thermal lens spectroscopy, and absorption. Since the microchip of the present invention is deeper than the depth of the flow path in the detection region, it has a high detection stability and reproducibility. Since the microchip of the present invention has a deep flow path in the detection region, for example, in measurement using a thermal lens microscope, it is easy to focus the excitation light in the flow path, and at the same time, excitation is performed. The signal intensity hardly changes even if the focal position of the light is shifted by several tens of meters near the center of the optical path with respect to the depth direction in the flow path, so detection stability and reproducibility are high.
  • the excitation light when the excitation light is focused and irradiated in the flow channel, it is easy to focus on the flow channel, and the detection stability and reproducibility are improved.
  • the detection sensitivity increases because the absolute amount of the excited fluorescent substance increases.
  • the absolute amount of the luminescent substance increases, so that the detection sensitivity increases.
  • the depth of the flow path in the detection region is the same as the optical path length when light for detection is transmitted perpendicularly to the length direction of the flow path. . That is, in the present invention, the “optical path length” means the length of light passing through the flow path in the flow path.
  • Oligonucleotide with the amino acid sequence introduced at the end 5,-TTGCTAACCC AG AAC ACTAT-3 was synthesized, and the product of Gene Slide on Gene Slide (trade name, manufactured by Nihon Parkerizing Co., Ltd.) According to the instructions, the oligonucleotide was immobilized along the flow path direction at the position to be the reaction region.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • Fig. La and Fig. Lb show the standard flow channel as a control. Both the DNA fixation region (reaction region 4) and the region before and after the DNA fixation region (reaction region 4) have the same shape. It is.
  • Fig. La is a top view of the channel 2 and Fig. Lb is a cross-sectional view of the channel.
  • a channel 2 having a width of 0.3 mm and a depth of 0.1 mm is formed.
  • One end of the flow path is provided with a liquid supply port 1 for supplying a reagent and a specimen sample, and the other end is provided with a liquid discharge port 3 for discharging the liquid in the flow path 2.
  • the middle region of channel 2 is reaction region 4 to which oligonucleotides for capturing biological substances to be measured are immobilized.
  • a detection region 5 for detecting the captured biological material is provided on the downstream side of the reaction region 4.
  • the microchip having a flow path used in the first embodiment the microchip having the flow path having the shape shown in FIGS. 2a and 2b described above is used.
  • the flow path according to Example 1 is a reaction area 14 in which the middle area of the flow path 12 immobilizes DNA, and its dimensions are 1.5 mm in width and 0.02 in depth. mm.
  • the flow path 12 in the region before and after the reaction region 14 has a width of 0.3 mm and a depth of 0.1 mm.
  • the microchip formed with the flow path obtained in the above process (reaction area width 1.5 mm, depth 0.02 mm, detection area width 0.3 mm, depth 0.1 mm) is excited in the reaction area.
  • the optical path is arranged in the optical path so that the optical path is directed from the upper surface to the bottom surface.
  • the microchip was arranged in the optical path so that the optical path of the excitation light was directed toward the flow path upper surface force and the flow path bottom surface.
  • the focal position of the excitation light is moved at a pitch of 5 m toward the bottom surface of the flow channel, and for the detection region, the focal position of the excitation light is moved at a pitch of 10 m toward the bottom surface of the flow channel.
  • the signal intensity (signal intensity) at each focal position was measured with a thermal lens microscope.
  • Each flow path, sunset Yellow prepared to 10- 4 M in water was measured by the thermal lens microscope satisfies (trade name, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the thermal lens microscope used has an excitation light wavelength of 532 ⁇ m, which is the absorption wavelength of Sunset Yellow (trade name, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the probe light wavelength is Sunset Yellow (trade name, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The one with a low absorption of 633 nm was used.
  • Fig. 5 shows the measurement results obtained, with the vertical axis representing the signal intensity (signal intensity) of the thermal lens and the horizontal axis representing the distance of the upper surface force of the excitation light focus. Depth is 0.1mm) and the graph of Fig. 6 (reaction zone, channel depth 0.02mm). According to the graphs of FIGS. 5 and 6, in the detection region where the flow path depth is 0.1 mm, it is several tens of times near the center of the optical path in the flow channel compared to the reaction region where the flow path depth is 0.02 mm. It can be seen that the signal intensity hardly changes even if the position of the ⁇ m collecting point is shifted.
  • the excitation light focus is any position in the optical path length excluding the upper surface of the flow path and the vicinity of the lower surface of the flow path, the vibration of the instrument and the positioning of the measurement point This shows that the signal can be obtained with good reproducibility without being affected by the forceful change of the focal position due to inaccurate accuracy or errors in the flatness of the microchip.
  • a target nucleic acid an oligonucleotide having a sequence complementary to a fixed oligonucleotide having a 5 'end modified with thiotin was used, and the target nucleic acid was detected by a microfluidic system as follows.
  • Block Ace (2) diluted with PBS ( ⁇ ) hereinafter referred to as “washing buffer” containing ImM EDTA and 0.05% Tween20 (trade name of Atlas Powder) in the microchip flow path ( The inner wall of the flow channel was blocked by filling with a product name (manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) and incubating at room temperature (all subsequent reactions were performed at room temperature) for 1 hour.
  • reaction buffer containing 1% BSA, ImM EDTA, 0.05% Tween20 (trade name of Atlas Powder), 0, 0.2, 1,
  • the target nucleic acid prepared to a concentration of 5 nM was sent to different flow paths for 5 minutes, and then the washing buffer was sent for 2 minutes for washing.
  • peroxidase (POD) -labeled streptavidin (SA) diluted 10,000-fold with the reaction buffer was fed for 5 minutes, and the washing buffer was fed for 2 minutes.
  • Detection of the target nucleic acid was evaluated by detecting POD activity using SATBlue (trade name, manufactured by Dojindo Laboratories) as a substrate with a thermal lens microscope (TLM). That is, while pumping SATBlue (trade name, manufactured by Dojin Chemical Research Laboratories), in the detection region located downstream from the reaction region, the excitation light is set to a wavelength of 633 nm and the probe light power is set to 88 nm. Thus, a signal in the depth direction of the flow path was detected. Obtained
  • FIG. 7 shows a graph in which the vertical axis indicates the thermal lens signal intensity and the horizontal axis indicates the concentration of the complementary sequence piotin-labeled oligonucleotide.
  • Microchip with standard flow path reaction area flow depth 0.1 mm, detection area flow depth 0.1 mm
  • microchip with reaction flow path reaction area flow depth 0.
  • the detection sensitivity of the target protein was compared as follows using 02 mm and a detection area channel depth of 0.1 mm.
  • hepatitis B virus surface antigen (HBsAg, manufactured by Meiji Dairies) was detected. That is, by filling the inside of the microchip channel with Block Ace (trade name, manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) diluted 2-fold with a washing buffer and incubating at room temperature (all subsequent reactions are performed at room temperature) for 1 hour, The inner wall of the channel was blocked. Subsequently, an anti-HBsAg monoclonal antibody conjugated with an oligonucleotide of a sequence complementary to the immobilized oligonucleotide prepared in the reaction buffer to a concentration of 50 gZmL (prepared by the method of Oku et al. (J Immunol Method.
  • POD-labeled streptavidin SA diluted 10,000-fold was fed for 15 minutes, and the washing buffer was washed for 5 minutes.
  • the target protein was detected with a thermal lens microscope (TLM) for POD activity using SATBlue (trade name, manufactured by Dojinka Institute) as a substrate.
  • the microchip of the present invention which has a shallow reaction region depth of 0.02 mm, has a deep standard type channel with a reaction region depth of 0.1 mm as a control. Compared to other microchips, it can be seen that there is a dramatic increase in detection sensitivity with higher detection sensitivity.
  • sandwich ELISA using a microtiter plate was performed. That is, anti-HBsAg antibody prepared to 10 ⁇ g / mL with PBS was added to 96 uel microplates at 100 / zL per well, and reacted at room temperature (all reactions below this were performed at room temperature) for 1 hour. Thereafter, the plate was washed once with PBS, and 200 ⁇ L of Block Ace diluted twice with PBS (—) was added to perform blocking for 1 hour to obtain a plate for measurement.
  • FIG. 9 is a graph with the POD activity on the vertical axis and the HBsAg concentration on the horizontal axis.
  • the microchip of the present invention is suitable for analysis of biological substances, diagnosis of various diseases, analysis of genomes and proteins of animals and plants and microorganisms, safety inspection of genetically modified foods, harmful substances in the environment. It can be used for inspection.

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Abstract

　マイクロ流体システムによる診断装置に利用されるマイクロチップにおいて、反応効率を大幅に上昇させることが可能で、且つ、安定性及び再現性の高い測定を実現する流路を設計したマイクロチップを提供する。 　２枚の基板の界面に少なくとも流路１２が形成され、該流路１２内に、反応領域１４と、該反応領域１４の下流側に検出領域１５を有するマイクロチップにおいて、検出領域１５の流路１２の深さが、反応領域１４の流路１２の深さよりも深い。

Description

明 細 書
マイクロチップ
技術分野
[0001] 本発明は、反応効率を大幅に上昇させることが可能で、且つ、安定性及び再現性 の高い測定を実現する流路を設計したマイクロチップに関し、特に、高感度な診断用 に適したマイクロチップに関する。
背景技術
[0002」 近年、 ^t TAS micro total analysis system)、或 ヽは lab— on— a— chipと呼 ばれる化学システム '分析システムの開発が盛んに行われている。これはマイクロチッ プと呼ばれる数センチメートル角のガラス、シリコン或いはプラスチック基板に、断面 幅が数/ z m〜数 mmの微細な流路を作製し、化学分析操作^^積ィ匕したマイクロチ ップを用いたィ匕学システム '分析システム（以後、 TASと称すこと力ある。）である。 該システムは、比界面積の増大に伴う化学反応の効率化、反応時間の大幅な短縮 などのメリットが発揮されることが知られている。比界面積は、液量に対する固液界面 積で表され、微細な流路が形成されたマイクロチップにおいては、具体的には、試料 体積あたりの流路壁面の表面積で表すことができる。比界面積は、数/ z m〜数 mm の微細な流路を形成したマイクロチップを採用することにより増大する。
また、 /z TASは、マイクロチップにおける流路内の空間が狭いため、物質の拡散距 離が短くてすむことから、マイクロチップにおける反応時間の大幅な短縮が可能とな る。
[0003] μ TASを診断用分析システムに応用した、免疫測定システムが報告されて！ヽる。
μ TASを用いた免疫測定システムの構築では被測定物質を流路内に捕捉するため の抗体を何らかの手段で流路内に配置させる必要がある。佐藤らの報告 (Analytical chemistry 2001,73, 1213-1218 Sato et al.) (非特許文献 1)では、マイクロチップの流 路内に堰き止め構造を形成しておき、抗体を結合させたポリスチレンビーズを堰き止 め構造の上流側に充填し、続いて、試料及び標識抗体を順次送液することにより、該 ビーズ表面において抗原抗体複合体を形成させ、続いて、熱レンズ顕微鏡により抗 原抗体複合体中の標識物質を検出することが報告されている。非特許文献 1の免疫 測定システムは、通常マイクロタイタープレート等を用いて行う免疫測定系を、マイク 口チップ上の微小空間に集積ィ匕することにより構築したものであり、従来のマイクロタ イタ一プレートを用いたシステムに比較して、反応時間の大幅な短縮、検出感度の上 昇が実現されたことが、非特許文献 1に報告されて！、る。
[0004] 非特許文献 1の、流路を形成し、流路内にポリスチレンビーズを堰き止めたマイクロ チップを用いた免疫測定法において、感度を高めるためには流路内に高密度にビー ズを充填して反応表面積を大きくする必要があるので、送液の際の圧力が高くなり正 確な流速の維持、及び、ビーズ間の隙間での均一な送液の維持が困難であるという 問題がある。
[0005] Lab on a chip 2002,2,27-30 (非特許文献 2)に、磁性粒子表面に抗体を固定化し、 これを送液によりマイクロ流路内に設置した磁石上に移動させて該磁性粒子を固定 化し、試料及び標識抗体を順次送液することにより磁性粒子表面で免疫複合体を形 成させて電気化学的な検出を行う測定系が報告されている。非特許文献 2の方法は 、汎用されて 、る従来法であるマイクロタイタープレート法と比べ反応時間は短縮さ れるものの、検出感度の上昇は認められないという不都合がある。その原因は、恐ら ぐ抗原抗体複合体が形成されている磁性粒子表面と測定用の電気化学センサーと の距離が遠いため、センサーに到達する電気化学的信号が微弱であるからと考えら れる。これを改善するために流路の深さを浅くすることも考えられるが、現状の技術で は限界がある。
[0006] Biosensors and Bioelectronics 19(2004)1193-1202 (非特許文献 3)に、多項目同 時測定システムとして Micromosaic immunoassayが報告されている。非特許文献 3は 、抗体を基板に直接固定化し、そこに試料及び蛍光標識抗体を順次送液すること〖こ より、基板上で免疫複合体を形成させ、蛍光顕微鏡により標識物質を検出している。 非特許文献 3の方法は免疫学的分析に一般的に用いられているラテックス比濁法に 比較して優位性は認められていない。また、上記非特許文献 3のマイクロチップは、 固定ィ匕基板と流路基板を粘着性のあるポリジメチルシロキサンを用いて形成して 、る ため、熱融着等の必要は無いが、基板の材質がゴム状で形態保持性が不安定なた めに、厳密な検出精度が要求されるマイクロチップとしての製品化には不向きである
[0007] 非特許文献 1： Analytical chemistry 2001,73,1213-1218 Sato et al.
非特許文献 2 : Lab on a chip 2002,2,27-30
非特許文献 3 : Biosensors and Bioelectronics 19(2004)1193-1202
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] μ TASにおいてはその反応の場の微小性から、反応により得られたシグナルを検 出する際の検出技術において制限を受ける。例えば、高感度で安定した検出を目指 した/ z TASにおいては、反応領域で得られたシグナルの増幅を行い、増幅されたシ グナルを反応領域とは異なる検出領域に送り込んで検出する方法をとる場合がある。 このような場合に単純に流路全体の体積を縮小することにより反応効率が増大された マイクロチップを使用すると、当然に検出領域も縮小されるため、光路長が短くなり、 検出する際の再現性を確保することが困難となる。
[0009] μ TASにおける検出する際の再現性を確保することが困難であることについて、免 疫測定システムを例にして、次にさらに具体的に説明する。抗体の標識物質としてべ ルォキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースォキシダーゼ等の酵素を用い た場合 (ELISA法)、最終的に標識物質を測定するのに酵素基質を送液して、酵素 反応により変化した基質を反応領域より下流の検出領域で検出することが可能となる 。このときの基質としては発色基質、蛍光基質、化学発光基質等が使用されるが、こ れらの酵素反応基質を検出する検出領域は、マイクロ流体システムにおいては、ある 程度大きい方が検出感度の上昇や検出シグナルの安定性が期待できる。
例えば、蛍光基質や化学発光基質を用いて検出する場合には、検出領域におい て、酵素反応により生成した基質代謝物質の絶対量が多い程検出感度は上昇する。
[0010] また、発色基質を熱レンズ顕微鏡を用い励起光の焦点を流路内で絞り込んで検出 する場合には、光路長が長いほうがシグナルの検出の高い再現性が得られる。しか し、光路長が一定以下になるとシグナルが小さくなり、シグナルの検出の再現性が得 られない。即ち、熱レンズ顕微鏡では機械的な振動、測定位置合わせ精度の不備、 マイクロチップの作製精度誤差等の諸要因に起因する誤差が存在し、それらにより流 路内における焦点の相対的な位置が変化することは避けられない。誤差が光路長よ りも大きい場合は、例えば、光路長が余りにも短いために誤差が光路長よりも大きくな る場合には、熱レンズ顕微鏡の励起光の焦点が流路の外に位置してしまうこともあり 、このような場合には、測定ができない状態になってしまうこともある。これに対して流 路内の光路長が長ければ焦点距離が多少ずれても流路内での焦点の相対的な位 置はほとんど変化しないために安定した再現性が得られる。なお、励起光が流路の 上部（平板状マイクロチップの平板面)側力 照射される場合は、照射される方向から の流路の深さが光路長にあたり、流路の側面（平板状マイクロチップの側面)側から 照射される場合は流路の幅が光路長となる。
[0011] し力しながら、このような微小空間を測定できる検出技術は未だ発展途上であり、研 究開発レベルの実験で測定が可能であっても、臨床検査、環境検査、食品検査等に 代表される測定装置に求められる、検出感度、検出シグナルの安定性及び再現性を 確保することが難しい。
[0012] 本発明の目的は、マイクロ流体システムによる診断装置に利用されるマイクロチップ において、反応効率を大幅に上昇させることが可能で、且つ、安定性及び再現性の 高い測定を実現する流路を有するマイクロチップを提供することである。
課題を解決するための手段
[0013] 上記した目的を達成するための一番目の本発明のマイクロチップは、 2枚の基板の 界面に少なくとも流路が形成され、該流路内に、反応領域と、該反応領域の下流側 に検出領域を有するマイクロチップにおいて、検出領域の流路の深さが、反応領域 の流路の深さよりも深 ヽことを特徴とする。
[0014] また、二番目の本発明のマイクロチップは、 2枚の基板の界面に少なくとも流路が形 成され、該流路内に、反応領域と、該反応領域の下流側に検出領域を有するマイク 口チップにおいて、反応領域の流路の幅が、検出領域の流路の幅よりも広ぐ且つ、 検出領域の流路の深さが、反応領域の流路の深さよりも深いことを特徴とする。
[0015] 本発明において「流路の深さ」とは、検出方向と同一方向の流路内の長さをいう。例 えば平板状のマイクロチップにおいて、平板面に垂直に検出する場合には、流路の 深さは平板面に垂直の検出方向の流路の内寸である。また、側面から検出する場合 には、流路の深さは、側面に垂直の検出方向の流路の内寸である。
[0016] 本発明において「流路の幅」とは、検出方向に対して垂直方向のマイクロチップ内 の流路の内寸をいう。
[0017] 本発明において「検出方向」とは、熱レンズ顕微鏡による検出や蛍光法による検出 の場合は流路内へ励起光が入射する方向のことをいい、吸光法による検出の場合は 測定物質が吸収をもつ光が入射する方向のことをいい、発光法による検出の場合は 、発光した光を検出する検出器に検出される光が入射する方向をいう。
[0018] 本発明にお 、て「反応領域」は、反応が寄与する界面を有し、該界面は流路の界 面の少なくとも一部、即ち、一部又は全部である。反応領域には、例えば、被測定物 質である生物学的物質を捕捉するための、該生物学的物質に親和的結合性のある 抗生物学的物質が流路内の界面に固定されたものを好ましく用いることができる。 発明の効果
[0019] 1.一番目の本発明のマイクロチップは、検出領域の流路の深さが、反応領域の流 路の深さよりも深いので、検出の安定性、再現性が高いマイクロチップとなり、一方、 反応領域の流路の深さが検出領域における深さよりも相対的に浅くなるので、反応 領域の流路の比界面積が増大し、反応領域における反応効率が上昇し、高感度とな る。
[0020] 2.二番目の本発明のマイクロチップは、反応領域の流路の幅が、検出領域の流路 の幅よりも広ぐ且つ反応領域の流路の深さが、検出領域の流路の深さよりも浅いの で、反応領域の流路における比界面積が増大し、反応領域における反応効率が上 昇し、高感度となり、検出領域の流路の深さが反応領域における深さよりも相対的に 深くなるので、検出の安定性、再現性が高いマイクロチップとなる。
[0021] 3.本発明のマイクロチップは、反応領域の流路の界面において、比測定物質であ る生物学的物質を捕捉するための、該生物学的物質に親和的結合性のある抗生物 学的物質が固定されているので、前記 1.又は 2.の効果に加えて、生物学的物質の 分析が行え、診断用マイクロチップとしての利用価値が高い。
図面の簡単な説明 [図 1]図 1は、対照としての標準型流路を示し、反応領域及び、反応領域の前後の領 域力 共に同じ形状（幅 0. 3mm,深さ 0. 1mm)であり、図 laは流路の上面図、図 1 bは流路の断面図である。
[図 2]図 2は、本発明に力かる流路の 1形態を示し、図 2aは流路の上面図、図 2bは断 面図である。
[図 3]図 3は、本発明のマイクロチップにおける流路の別の形態を示し、図 3aは流路 の上面図、図 3bは流路の断面図である。
[図 4]図 4は、本発明のマイクロチップにおける流路のさらに別の形態を示し、図 4aは 流路の上面図、図 4bは流路の断面図である。
[図 5]流路の深さが 0. 1mmの時の励起光の各焦点位置での熱レンズ顕微鏡による 信号強度を、縦軸に熱レンズ信号をとり、横軸に励起光焦点の流路上面からの距離 をとつたグラフである。
[図 6]流路の深さが 0. 02mmの時の励起光の各焦点位置での熱レンズ顕微鏡による 信号強度を、縦軸に熱レンズ信号をとり、横軸に励起光焦点の流路上面からの距離 をとつたグラフである。
[図 7]実施例 2において、 SATBlue (商品名、同仁ィ匕学研究所製)を送液しながら、 反応領域の下流の検出領域で、励起光が 633nm、プローブ光力 88nmの波長に 設定し、熱レンズ顕微鏡により流路の深さ方向のシグナルを検出し、得られた結果を 、縦軸に熱レンズ信号強度、横軸に相補配列ピオチン標識オリゴヌクレオチドの濃度 をとつたグラフである。
[図 8]実施例 3において、 SATBlue (商品名、同仁ィ匕学研究所製)を送液しながら、 反応領域の下流の検出領域で、励起光が 633nm、プローブ光力 88nmの波長に 設定し、熱レンズ顕微鏡により流路の深さ方向のシグナルを検出し、得られた結果を 、縦軸に熱レンズ信号強度、横軸に HBsAgの濃度をとつたグラフである。
[図 9]比較例 1において、 SATBlue (商品名、同仁ィ匕学研究所製)の発色を 660nm の吸収により測定し、得られた結果を、縦軸に吸光度、横軸に HBsAgの濃度をとつ たグラフである。
符号の説明 1、 11、 21、 31 送液口
2、 12、 22、 32 流路
3、 13、 23、 33 排液口
4、 14、 24、 34 反応領域
5、 15、 25、 35 検出領域
発明を実施するための最良の形態
[0024] 本発明のマイクロチップによれば、流路における反応領域の比界面積が流路にお ける検出領域よりも増大している。即ち、反応領域の体積が流路における検出領域よ りも縮小しているので、反応領域においては、物質の界面への拡散効率が上昇する ことにより反応効率が増大する。
[0025] 本発明のマイクロチップにおける反応領域は、反応が寄与する界面を有し、該界面 は、流路の界面の少なくとも一部、即ち、一部又は全部である。
[0026] 本発明のマイクロチップの流路の断面形状は、三角形、正方形、長方形、台形、平 行四辺形、その他の四角形、 5個以上の頂点を持つ多角形、円形'楕円形など界面 の全部が曲面である形状、半月形のように界面のうち一面以上が平面でその他の部 分が曲面である形状などが挙げられる。
[0027] 流路内の界面における反応性について言えば、前記したように、流路の体積を小さ くするに従い、比界面積が増大し、物質の界面への拡散効率が上昇することにより反 応効率が増大する。例えば、長方形の断面を持つ流路で、流路上面から流路下面 に向力つて検出する場合を考えてみると、流路の下面又は上面、或いはその両方が 反応に寄与する界面となっている場合には流路の深さを浅くすることで反応面の比 界面積が増大するので反応性は増大する。また、流路の側面の一方もしくは両方が 反応面となっている場合には流路の幅を縮めることにより反応面の比界面積が増大 するので反応性は増大する。また、流路界面の全面が反応面である場合は、流路の 幅及び深さの一方又は両方を縮小することにより比界面積が増大するので反応性が 増大する。従って、反応領域の体積は、安定に送液できる程度に小さくすることが好 ましい。
[0028] この例において、「流路の下面」とは、平板上のマイクロチップを水平に載置したとき の流路内の底面をいう。
[0029] この例において、「流路の上面」とは、平板上のマイクロチップを水平に載置したとき の流路内の天井面をいう。
[0030] この例において、「流路の側面」とは、流路内面のうち平板上のマイクロチップの側 面と平行な側面をいう。
[0031] 本発明にお 、て「比界面積」とは、流路の体積に対する流路壁面の表面積の割合 のことをいう。例えば、幅 0. lmm、深さ 0. 2mm、長さ 0. 5mmの断面が長方形の場 合、比界面積は、
(流路壁面の表面積） ÷ (流路の体積） = { (0. 1mm X O. 5111111 2面）+ (0. 2mm X O. 5111111 2面）} ÷ (0. 1mm X O. 2mm X O. 5mm) = 30 となり比界面積は 30 と算出される。
[0032] さらに、上記流路の底面（幅 0. lmm、長さ 0. 5mm)の比界面積は、
(流路底面の表面積） ÷ (流路の体積） = (0. 1mm X O. 5mm) ÷ (0. 1mm X O. 2 mm X O. 5mm) = 5 となり、流路底面の比界面積は 5と算出される。
[0033] そして、上記流路の深さを 0. 2mmから 0. 1mmに縮小したときの流路底面の比界 面積を算出すると
(流路底面の比界面積） ÷ (流路の体積） = (0. 1mm X O. 5mm) ÷ (0. 1mm X O. lmm X O. 5mm) = 10 となり、上記のように流路の深さを縮小した場合に流路底面 の比界面積が 2倍になることが分かる。
[0034] 本発明にお 、て「線流速」とは、単位時間あたりに液体が進む距離のことを 、 、、単 位時間あたりに送液される液体の量を表す流速とは異なる概念である。例えば、幅 0 . lmm、深さ 0. 2mm、の断面が長方形の筒型の流路 Aと、幅 0. lmm、深さ 0. lm mの断面が正方形の筒型の流路 Bを比較した場合、同じ流速で液体を送液すると、 流路 Bにおける一定時間に流路内を液体が進む距離は、流路 Aにおけるそれに比 ベ 2倍になる。これは、流路 Aの深さが流路 Bの深さの 2倍であることにより、流路 Aは 流路 Bの 2倍の体積をもつことになるためである。つまり、流速が一定であっても、流 路 Bの線流速は流路 Aの線流速の 2倍になる。
[0035] 図 2a、図 2bは、本発明のマイクロチップにおける流路の 1形態を示す。図 2aは流 路の上面図、図 2bは流路の断面図である。流路 12の途中において、測定すべき生 体物質を捕捉するための抗生体物質が固定された反応領域 14が形成されている。 流路 12の一方の末端には試薬や検体試料を供給するための送液口 11、他方の末 端には、流路 12内の液体を排出するための排液口 13が設けられている。前記反応 領域 14の下流の流路 12において、検出領域 15が設けられている。検出領域 15は、 蛍光法、化学発光法、熱レンズ分光法等の光学的な分析手段を利用して流路 12〖こ おけるシグナルを測定するための領域である。反応領域 14の流路の幅 Wは、反応
1 領域 14の前後の領域の幅 W、Wよりも広ぐ反応領域 14の流路の深さ Hは、反
2 3 1 応領域 14の前後の領域の深さ H 、Hよりも浅い。
2 3
[0036] 図 3a、図 3bは、本発明のマイクロチップにおける流路の別の形態を示す。図 3aは 流路の上面図、図 3bは流路の断面図である。流路 22の途中において、測定すべき 生体物質を捕捉するための抗生体物質が固定された反応領域 24が形成されている 。流路 22の一方の末端には試薬や検体試料を供給するための送液口 21、他方の 末端には、流路 22内の液体を排出するための排液口 23が設けられている。前記反 応領域 24の下流の流路 22において、検出領域 25が設けられている。検出領域 25 は、蛍光法、化学発光法、熱レンズ分光法等の光学的な分析手段を利用して流路 2 2におけるシグナルを測定するための領域である。反応領域 24の流路の幅 Wは、
4 検出領域 25の幅 Wよりも広ぐ反応領域 24の上流の流路の幅 Wと同じであり、反
6 5
応領域 24の流路の深さ Hは、反応領域 24の前後の領域の深さ Hよりも浅ぐ反応
4 6
領域 24の上流の流路の深さ Hと同じである。
5
[0037] 図 4a、図 4bは、本発明のマイクロチップにおける流路のさらに別の形態を示す。図 4aは流路の上面図、図 4bは流路の断面図である。流路 32の途中において、測定す べき生体物質を捕捉するための抗生体物質が固定された反応領域 34が形成されて いる。流路 32の一方の末端には試薬や検体試料を供給するための送液口 31、他方 の末端には、流路 32内の液体を排出するための排液口 33が設けられている。前記 反応領域 34の下流の流路 32において、検出領域 35が設けられている。検出領域 3 5は、蛍光法、化学発光法、熱レンズ分光法等の光学的な分析手段を利用して流路 におけるシグナルを測定するための領域である。反応領域 34の流路の幅 Wは、反 応領域 34の前後の領域の幅 W、Wよりも広ぐ反応領域 34の深さ Hが反応領域
8 9 7
34の前後の領域の深さ H 、Hよりも小さい。反応領域 34の上流の流路 32は、幅 W
8 9
が漸次増大しており、且つ、深さ Hが漸次減少している。このような流路 32の形状
8 8
を漸次変化させることにより、流路 32における線流速を一定にコントロールしたり、線 流速を漸増、漸減したりコントロールすることができる。
[0038] マイクロチップへの試料液或いは薬液の送液にぉ 、て、目的とする流速を反応領 域の流速に合わせると、反応領域を通過した後の溶液の流速が遅くなり、検出領域 に到達するまでの時間が長くなり迅速な測定の障害となってしまうことがある。或いは 逆の場合には、反応領域を溶液が瞬時に通過することになるために、増幅効率が低 下し、シグナル増幅という目的の達成が困難となることがある。これらの不都合の解決 策として、反応領域の流路の深さを縮小した場合には流路の幅を広げ、反応領域の 流路の幅を縮小したときには流路の深さを増大させることにより、反応領域における 反応面の比界面積を大きくしつつ流路全体の線流速を一定にコントロールする流路 設計を行うことが好ましい。
[0039] さらに、意図的に反応領域の線流速を早くし、或いは遅くする流路の設計も当然に 可能である。例えば、反応領域の流路の深さを 2分の 1にしたときに線流速を一定に 保っためには、流路の幅を 2倍にする必要がある力 流路の幅を 4倍にすれば、反応 領域の線流速が 2分の 1となる。このような設計にすると測定時間は長くなる力 増幅 効率を 2倍に上げることができる。このように、目的に応じて反応領域での線流速をコ ントロールすることも可能である。
[0040] 本発明のマイクロチップにおいて反応領域の流路の幅が、 1 μ m以上 2mm以内が 好ましぐさらに好ましくは 500 m以内である。流路の幅が 1 μ m未満だと溶液の表 面張力に起因する抵抗が増大し、溶液を流路に送液する際に非常に高い圧力が必 要となり安定した送液が困難である。また、流路の幅が 2mmを超えると溶液の流れが 乱れ、流路内への均一な送液が困難である。
[0041] 本発明のマイクロチップにおいて反応領域の流路の深さは、 1 μ m以上 2mm以内 が好ましぐさらに好ましくは 500 m以内である。流路の深さが： L m未満だと溶液 の表面張力に起因する抵抗が増大し、溶液を流路に送液する際に非常に高い圧力 が必要となり安定した送液が困難である。また、流路の深さが 2mmを超えると溶液の 流れが乱れ、流路内への均一な送液が困難である。
[0042] 本発明のマイクロチップにおいて、検出領域の流路の深さが、 10 μ m以上 2mm以 内であることが好ましい。流路の深さが 10 m未満だとマイクロチップにおいて測定 することが困難と、流路の深さが 2mmを超えると溶液の流れが乱れ、流路内への送 液が困難である。
[0043] 本発明のマイクロチップを製造するための 2つの基板の材質としては、ポリジメチル シロキサン（PDMS :略語、 Anal.Chem.,Vol.69,pp.3451- 3457,1997 )、アクリル系榭 脂 (Anal.Chem.,Vol.69,pp.2626,1997)、ポリメチルメタタリレート（PMMA:略語、 Anal. Chem.,Vol.69,pp.4783, 1997)、ガラス、環状ォレフィンポリマー、あるいは、これらの部 材の表面にダイアモンドもしくはダイアモンドライクカーボン（特開 2002— 365293号 公報)、 cetyltrimethylammonium bromiae(CTAB)、 burmodics、 Reacti- Bind (Analytic al Biochemistry, 317 (2003) 76- 84 )、ポリ— L—リジン、カルボジイミド、アミノ基、ァ ルデヒド基、マレイミド基、デキストランなどで表面が修飾された物質等を用いてもよい 。基板は透明であっても、不透明であってもよいが、不透明な場合には少なくとも検 出部は透明であることが望ましい。また、該基板は、親水処理又は疎水処理が施され ていてもよい。
[0044] 本発明のマイクロチップは、例えば、次の方法により製造することができる。まず铸 型をシリコンウェハーのエッチングにより作成しておく。これに融解したポリマーを流し 込んで構造を転写し、ポリマーを固化させる。転写により、流路となる溝が形成された 一方の基板が形成される。他方の平板状の基板と接合すれば、マイクロチップが製 造される。
2枚の基板の接合は一般的には加熱により行われる。 PDMSを素材とすればガラ スゃ PDMSとの自然吸着により簡単に流路のシーリングが行える。プラスチックを用 いたマイクロチップは量産化が容易なので、コストの点で有利である。またガラスの場 合は、フッ化水素の反応時間によって深さを調整しなければならないが、プラスチック 製の場合は、一度铸型を作製してしまえば射出成型の技術により再現性高く生産す ることが可能となる。 2枚の基板の接合には、一般的に接着剤を用いた接合、熱融着 による接合を行ってもよい。接着剤には、例えば、紫外線等の電離放射線硬化型接 着剤、熱硬化型接着剤、アクリル系接着剤、エポキシ系接着剤等の有機系接着剤、 あるいは無機系接着剤が挙げられる。
[0045] 本発明のマイクロチップによる検出対象物は、生物学的物質が好適である。生物学 的物質としては、抗原、抗体、糖鎖、糖タンパク質、レクチン、受容体、リガンド、 DN A、 RNA、その他、生体中の物質と特異的に結合することができる物質、その物質の 分子量に依存しな 、ものが挙げられる。これらの分析対象物を分析するための試料 には、血液、血漿、血清、尿、唾液、その他体液や、 DNA、 RNA、染色体や、 DNA 、 RNAを増幅させたもの、抗原、抗体、糖鎖、受容体、リガンドを含む物体が試料と なりうる。
[0046] 本発明のマイクロチップの反応領域の反応が寄与する界面に固定される抗生物学 的物質としては、抗原に対する抗体、抗体に対する抗原、ピオチンに対するアビジン 、アビジンに対するピオチン、 DNAに対する DNA、 RNAにたいする DNA、受容体 に対するリガンド、リガンドに対する受容体などが挙げられる。
[0047] 抗生物学的物質を反応領域の界面に固定ィ匕する方法として、界面に直接抗生物 学的物質を結合させる方法と、結合子を介して間接的に固定化する方法が考えられ る。抗生物学的物質を反応領域の界面に直接固定化する方法としては、イオン結合 や、水素結合、疎水結合、或いは、化学修飾された界面に共有結合で固定化する方 法が挙げられる。
[0048] 抗生物学的物質を反応領域の界面に固定ィ匕するための結合子には、熱や有機溶 媒に安定な性質を持つデォキシリボ核酸等の核酸が挙げられる。核酸を結合子とし て反応領域の界面に予め固定ィ匕しておき、該核酸を固定ィ匕した固定ィ匕基板と、流路 となるべき溝部を形成した流路基板を加熱して張り合わせた後に、固定ィ匕基板に固 定された核酸と相補的な配列を持つ核酸を抗生物学的物質に結合させたものを、流 路に送液することにより、抗生物学的物質を反応領域の界面に固定ィ匕することができ る。上記のプロセスを経たマイクロチップは、比較的熱に強い核酸のみが加熱を受け るだけであり、抗生物学的物質に対する加熱が回避できるので、熱に弱い抗生物学 的物質、例えば、タンパク質等は変性を回避でき、活性を保持できる。また、検出した V、生物学的物質が核酸である場合には、該核酸と相補的な配列を持つ核酸を反応 領域の界面に固定しておけばよい。
[0049] 抗生物学的物質を反応領域の界面に固定ィ匕するための結合子の他の例には、前 記核酸以外に、磁性粒子を用いることができる。この場合、予め反応領域の流路内 又は流路外に磁石を配置しておき、マイクロチップの流路に磁性粒子表面に固定さ れた生物学的物質を含んだ液を送液することにより、抗生物学的物質を反応領域の 界面に固定ィ匕することができる。
[0050] 本発明のマイクロチップは反応領域の流路における少なくとも 1つの界面自体が反 応性を有するように設計されて 、る。このように設計されてなる本発明のマイクロチッ プは、従来の流路内にポリスチレンビーズを堰き止めたマイクロチップにおける、送液 に障害となるようなポリスチレンビーズを使用して ヽな 、ので、マイクロチップの流路 における流速及び送液の均一性を損なうことがない。
[0051] 本発明における検出領域における検出手段としては蛍光法、化学発光法、熱レン ズ分光法、吸光法が挙げられる。本発明のマイクロチップは、検出領域の流路の深さ 力 反応領域の流路の深さよりも深いので、検出の安定性、再現性が高い。本発明 のマイクロチップは、検出領域の流路の深さが深いことにより、例えば、熱レンズ顕微 鏡による測定では、励起光の焦点を流路内に合わせることが容易であると同時に、励 起光の焦点位置が流路内の深さ方向に関して、光路中心付近では数十 mずれて も信号強度がほとんど変化しないので、検出の安定性、再現性が高い。
[0052] また、例えば、蛍光法による測定では、励起光の焦点を絞って流路内に照射する 場合には、焦点を流路内に合わせることが容易であり検出の安定性、再現性が高く なり、励起光の焦点を絞らずに照射する場合であれば、励起される蛍光物質の絶対 量が増加するため検出感度が高くなる。
また、例えば、化学発光法による測定では、発光物質の絶対量が増加するため検 出感度が高くなる。
[0053] 上記の各光学的測定法では、検出領域の流路の深さが、検出のための光を流路 の長さ方向に対して垂直に透過したとき、光路長と同じ長さとなる。即ち、本発明にお いて「光路長」とは、流路を横断して通過する光の、流路内の長さをいう。 実施例 1
[0054] マイクロチップの調製
(l) DNAの固定化
5，末端にアミノ基を導入した 5， - TTGCTAACCC AG AAC ACTAT - 3，なる配 列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、ジーンスライド (商品名、株式会社日本パー カーライジング製)上にジーンスライドの商品説明書にしたがって、反応領域となるベ き位置に流路方向に沿って該オリゴヌクレオチドを固定ィ匕した。
[0055] (2)流路の作製及びマイクロチップの調製
厚さ lmmのポリジメチルシロキサン（PDMS)の平板に、下記 1)に示す対照の標準 型流路及び 2)に示す本発明の流路とするための溝を形成させて、溝を形成した 2種 類の平板を得た。溝の作製は、 Electrophoresis.2000 Jan;21(l):27-40Mcdonald JC e t al.に記載の方法に従った。
[0056] 得られた溝を形成した 2種類の平板を、上記工程（1)で得たオリゴヌクレオチド固定 ィ匕スライドグラスと流路が設置されるように圧着するように貼り合わせることにより接合 して、対照及び本実施例 1の各マイクロチップを作製した。
[0057] 1)対照の標準型流路
図 la、図 lbは、対照としての標準型流路を示し、 DNA固定領域 (反応領域 4)及 び、 DNA固定領域 (反応領域 4)の前後の領域が、共に同じ形状の標準型流路であ る。図 laは流路 2の上面図、図 lbは流路の断面図を示し、幅 0. 3mm、深さ 0. lmm の流路 2が形成されて ヽる。流路の一方の末端には試薬や検体試料を供給するため の送液口 1、他方の末端には、流路 2内の液体を排出するための排液口 3が設けら れて 、る。流路 2の中間領域が測定すべき生物学的物質を捕捉するためのオリゴヌ クレオチドを固定した反応領域 4である。該反応領域 4の下流側に、捕捉した生物額 的物質を検出するための検出領域 5が設けられている。
[0058] 2)本発明にかかる流路の 1形態
本実施例 1で使用する、流路を有するマイクロチップは、前記に説明した図 2a、図 2 bの形状の流路を有するものを使用する。本実施例 1にかかる流路は、流路 12の中 間領域が DNAを固定した反応領域 14であり、その寸法は、幅 1. 5mm、深さ 0. 02 mmである。該反応領域 14の前後の領域における流路 12は、幅 0. 3mm、深さ 0. 1 mmである。
[0059] +分な光路長を有する枪出領城でのシグナルの 定件の確認
前記工程で得られた流路 (反応領域の幅 1. 5mm、深さ 0. 02mm、検出領域の幅 0. 3mm、深さ 0. 1mm)が形成されたマイクロチップを、反応領域において励起光 の光路が流路上面から底面に向かうように、光路に配置した。一方、本実施例 1の流 路の検出領域においても同様に励起光の光路が流路上面力 流路底面に向力うよ うに、マイクロチップを光路に配置した。反応領域については励起光の焦点位置を流 路上面力も流路底面にかけて 5 mピッチで移動させていき、検出領域については 励起光の焦点位置を流路上面力も流路底面にかけて 10 mピッチで移動させてい き、それぞれの焦点位置での信号強度 (シグナル強度)を熱レンズ顕微鏡により測定 した。各流路には、水で 10— 4Mに調製したサンセットイェロー（商品名、和光純薬 (株 )製)を満たして熱レンズ顕微鏡により測定した。使用した熱レンズ顕微鏡は励起光 波長がサンセットイェロー（商品名、和光純薬 (株)製)が吸収をもつ波長である 532η m、プローブ光の波長がサンセットイェロー（商品名、和光純薬 (株)製)の吸収が低 い 633nmのものを使用した。
[0060] 得られた測定結果を、縦軸に熱レンズの信号強度 (シグナル強度)をとり、横軸に励 起光焦点の流路上面力 の距離をとつた図 5 (検出領域、流路深 0. 1mm)及び図 6 (反応領域、流路深 0. 02mm)のグラフに示す。図 5及び図 6のグラフによれば、流 路の深さが 0. 1mmの検出部位では、流路の深さが 0. 02mmの反応部位に比べて 流路内における光路中心付近では数十 μ m集点の位置がずれても信号強度がほと んど変化しないことがわかる。これは流路内に十分な光路長がある検出領域では流 路上面及び、流路下面の近傍を除いた光路長における任意の位置を励起光焦点と すれば、機器の振動、測定地点の位置決め精度の不備、マイクロチップの平面性の 誤差などによる焦点位置のわず力な変化には影響を受けずに再現性よくシグナルが 得られることを示している。
実施例 2
[0061] ^ tの いによる の 一 i の 標準型流路を持つマイクロチップ (反応領域の流路深 0. lmm,検出領域の流路 深 0. 1mm)と本発明に力かる流路を持つマイクロチップ (反応領域の流路深 0. 02 mm、検出領域の流路深 0. 1mm)を用いた標的核酸の検出感度の比較を次のよう にして行った。
[0062] 標的核酸として、 5'末端をピオチン修飾した固定ィ匕オリゴヌクレオチドと相補的な 配列をもつオリゴヌクレオチドを用い、マイクロ流体システムにより標的核酸の検出を 次のようにして行った.即ち、マイクロチップの流路内を ImM EDTA、0. 05%Tw een20 (Atlas Powder社の商品名）を含む PBS (―) (以下、「洗浄用バッファー」と呼 ぶ)で 2倍希釈したブロックエース (商品名、雪印乳業社製)で満たし、室温 (以後の 反応はすべて室温で反応)で 1時間インキュベーションすることにより、流路内壁をブ ロッキングした。続いて、 1%BSA、 ImM EDTA、 0. 05%Tween20 (Atlas Powde r社の商品名）を含む PBS (—）（以下、「反応用バッファー」と呼ぶ)で 0、 0. 2、 1、 5n Mの濃度になるように調製した標的核酸をそれぞれ異なる流路に 5分間送液後、洗 浄用バッファーを 2分間送液して洗浄した。続、て反応用バッファーで 10000倍に希 釈したペルォキシダーゼ (POD)標識ストレプトアビジン（SA)を 5分間送液し、洗浄 用バッファーを 2分間送液した。標的核酸の検出は、 SATBlue (商品名、同仁化学 研究所製)を基質とした POD活性を熱レンズ顕微鏡 (TLM)で検出することにより評 価した。即ち、 SATBlue (商品名、同仁ィ匕学研究所製)を送液しながら、反応領域よ り下流側に位置する検出領域で、励起光が 633nm、プローブ光力 88nmの波長に 設定し、 TLMにより流路の深さ方向のシグナルを検出した。得ら
れた結果を、下記の表 1、及び縦軸に熱レンズ信号強度、横軸に相補配列ピオチン 標識オリゴヌクレオチドの濃度をとつたグラフを図 7に示す。
[0063] [表 1] 相補配列ピオチン標識オリゴ 反応領域の深さ 100 μ πι 反応領域の深さ 20 μ ιη ヌクレオチド濃度（nM) での信号強度（ V) での信号強度（μ ν)
0 27.95 28.61
0.2 34.59 90.79
1 332.53
5 241.65 661.54 [0064] 表 1及び図 7によれば、反応領域の深さが 0. 02mmと浅い本発明のマイクロチップ の方が、対照としての反応領域の深さが 0. 1mmと深い標準型流路のマイクロチップ に比べて、検出感度が高ぐ飛躍的な検出感度の上昇が認められることがわ力る。 実施例 3
[0065] ^ tの;食いによる の比 タンパク の
標準型流路を持つマイクロチップ (反応領域の流路深 0. lmm,検出領域の流路 深 0. 1mm)と本発明に力かる流路を持つマイクロチップ (反応領域の流路深 0. 02 mm、検出領域の流路深 0. 1mm)を用いた標的タンパク質の検出感度の比較を次 のようにして行った。
[0066] 標的タンパク質として、 B型肝炎ウィルス表面抗原 (HBsAg、明治乳業株式会社製 )の検出を行った。即ち、マイクロチップの流路内を、洗浄バッファーで 2倍希釈した ブロックエース (商品名、雪印乳業社製)で満たし、室温 (以後の反応はすべて室温 で反応)で 1時間インキュベーションすることにより、流路内壁をブロッキングした。続 いて、反応用バッファーで 50 gZmLの濃度になるように調製した、固定化オリゴヌ クレオチドと相補的な配列のオリゴヌクレオチドを結合させた抗 HBsAgモノクロナー ル抗体（調製は Okuらの方法 (J Immunol Methods. 2001Dec 1 ; 258 (1— 2) : 73 -84. )で行った)を流路に 15分間送液後、洗浄用バッファーを 5分間送液して 洗浄した。続いて、反応用バッファーで 0, 0. 1, 0. 2ngZmLの濃度に調製した HB sAgをそれぞれ異なる流路に 15分間送液後、洗浄用バッファーを 5分間送液して洗 浄した。続いて、反応用バッファーで 1 μ gZmLの濃度に調製したピオチン標識抗 Η BsAg抗体 (上記のオリゴヌクレオチド結合抗体とは HBsAgとの結合部位が異なる） を 15分間送液し、洗浄用バッファーを 5分間送液して洗浄した。 10000倍に希釈し た POD標識ストレプトアビジン SAを 15分間送液し、洗浄用バッファーを 5分間洗浄 した。標的タンパク質の検出は、前記実施例 2と同様に、 SATBlue (商品名、同仁科 学研究所製)を基質とした POD活性を熱レンズ顕微鏡 (TLM)で検出した。
[0067] 得られた結果を、下記の表 2、及び縦軸に熱レンズ信号強度、横軸に HBsAgの濃 度をとつたグラフを図 8に示す。
[0068] [表 2] I IBsAg濃度（ng/mL) 反応領域の深さ 100 μ πι 反応領域の深さ 20
での信号強度 V) での信号強度（ a V)
0 31 29
0.1 31 40.255
0.2 34 95.15
[0069] 表 2及び図 8によれば、反応領域の深さが 0. 02mmと浅い本発明のマイクロチップ の方が、対照としての反応領域の深さが 0. 1mmと深い標準型流路のマイクロチップ に比べて、検出感度が高ぐ飛躍的な検出感度の上昇が認められることがわ力る。
[0070] [比較例 1]
マイクロタイタープレートを用いた ELISAでの HBsAg検出感度
前記実施例 3の測定で用いた抗体と同じ HBsAg抗体の組み合わせを使用して、マ イクロタイタ一プレートによるサンドイッチ ELISAを行った。即ち 96ゥエルノマイクロプ レートに PBSで 10 μ g/mLに調製した抗 HBsAg抗体をゥエル当たりそれぞれ 100 /z L加え、室温 (これ以下の反応はすべて室温で反応)で 1時間反応させた。その後 PBSで 1回洗浄し、 PBS (—）で 2倍希釈したブロックエースを 200 μ L入れて 1時間 ブロッキングを行い測定用のプレートとした。これらのゥエルに反応用バッファーで 0, 0. 1 , 0. 2ngZmLの濃度に調製した HBsAgを 100 L加え、 1時間反応させた。 P BSで洗浄した後、反応用バッファーで 1 μ gZmLの濃度に調製したピオチン標識抗 HBsAg抗体を 100 Lカ卩え、 1時間反応させた。 PBSで洗浄した後、反応用バッフ ァ一で 10000倍希釈した POD標識ストレプトアビジンを 100 Lを加え、 1時間反応 させた。引き続き洗浄した後， SATBlueを基質とした発色反応により POD活性を 66 Onmの吸収で測定した。
[0071] 得られた結果を、下記の表 3、及び縦軸に POD活性、横軸に HBsAgの濃度をとつ たグラフを図 9に示す。
[0072] [表 3] HBsAg濃度（ng/mL) OD660nm
0 0.0495
0.1 0.043
0.2 0.0485
[0073] 図 9に示すようにマイクロタイタープレート法では 0. 2ngZmLの HBsAgでも全く検 出できず、前記実施例 3で示したように本発明にかかわる流路を用いたマイクロ流体 システムによる免疫測定系がマイクロタイタープレート法と比較して高感度であること が示された。
産業上の利用可能性
[0074] 本発明のマイクロチップは、生物学的物質の分析に適しており、各種疾病診断、動 植物や微生物のゲノムやタンパク質の解析、遺伝子組み換え食品の安全性検査、環 境中の有害物質の検査に利用可能である。

Claims

請求の範囲
[1] 2枚の基板の界面に少なくとも流路が形成され、該流路内に、反応領域と、該反応領 域の下流側に検出領域を有するマイクロチップにおいて、検出領域の流路の深さが
、反応領域の流路の深さよりも深 、ことを特徴とするマイクロチップ。
[2] 2枚の基板の界面に少なくとも流路が形成され、該流路内に、反応領域と、該反応領 域の下流側に検出領域を有するマイクロチップにおいて、反応領域の流路の幅が、 検出領域の流路の幅よりも広ぐ且つ、検出領域の流路の深さが、反応領域の流路 の深さよりも深 ヽことを特徴とするマイクロチップ。
[3] 前記反応領域は反応に寄与する界面を有し、該界面は流路の界面の少なくとも一部 である請求項 1又は 2記載のマイクロチップ。
[4] 前記反応が寄与する界面は、被測定物質である生物学的物質を捕捉するための、 該生物学的物質に親和的結合性のある抗生物学的物質が固定された界面である請 求項 1又は 2記載のマイクロチップ。
[5] 前記抗生物学的物質は、流路内の界面に固定された核酸に結合されている請求項
4記載のマイクロチップ。
[6] 前記抗生物学的物質は磁性粒子表面に固定され、該磁性粒子は、流路内又は流路 外に設置された磁石の磁力により流路内の界面に固定されている請求項 4記載のマ イク口チップ。
[7] 反応領域の流路の幅が、 1 μ m以上 2mm以内である請求項 1、 2、 3、 4、 5又は 6記 載のマイクロチップ。
[8] 反応領域の流路の幅が、 1 μ m以上 500 m以内である請求項 1、 2、 3、 4、 5又は 6 記載のマイクロチップ。
[9] 検出領域の流路の深さが、 10 μ m以上 2mm以内である請求項 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 又は 8記載のマイクロチップ。
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