WO2006025276A1

WO2006025276A1 - ナットウキナーゼを含む眼科疾患の治療・予防剤

Info

Publication number: WO2006025276A1
Application number: PCT/JP2005/015528
Authority: WO
Inventors: Hidenobu Tanihara; Akira Hirata; Akiomi Takano
Original assignee: Kumamoto University
Priority date: 2004-08-31
Filing date: 2005-08-26
Publication date: 2006-03-09
Also published as: JPWO2006025276A1

Abstract

　本発明の目的は、抽出や精製が容易な物質を用いた、眼科疾患（特に網膜・硝子体疾患）の新規な治療・予防剤を提供することである。本発明によれば、ナットウキナーゼを含む、眼科疾患の治療・予防剤又は手術補助剤が提供される。

Description

明細書

ナツトウキナーゼを含む眼科疾患の治療 ·予防剤

技術分野

[0001] 本発明は、ナツトウキナーゼ (subtilisin NAT)を含む、眼科疾患の治療 ·予防剤又は手術補助剤に関する。より詳細には、本発明は、硝子体の液化、増殖膜の脆弱化ならびに後部硝子体剥離等を誘導するナツトウキナーゼを含む、眼科疾患の治療 · 予防剤又は手術補助剤に関する。

背景技術

[0002] 発明の普晋、眼の解剖

硝子体は水晶体の後面力網膜の表面までを満たす透明なゲル状の構造物であり、ニ大構成要素であるコラーゲンとヒアルロン酸のネットワーク構造の中に、多量の水と僅かな低分子物質などが存在し成り立つている。一方、網膜は硝子体の後方に接し眼球内壁を覆う膜状の神経組織である。この網膜と硝子体の界面には、様々な原因によって増殖膜が発生し、網膜剥離や硝子体出血を惹起して、失明の原因となつている。現在ではその治療法として硝子体手術が導入され、外科的にその増殖膜の切除ならびにその足場となる硝子体を網膜表面力剥がすこと（「後部硝子体剥離」）が行われているが、そのような機械的切除術では、術中に元来脆弱である正常な網膜組織を牽引し損傷する危険を常に伴っている。そこで、酵素を用いて後部硝子体剥離を誘導し、あるいは病的な増殖膜等の組織を酵素によって化学的に処理し、術中合併症を低下せしめること、さらには酵素の投与のみで外科手術を行うことなく治療することが切望されて、た。

[0003] 他の P まのの gg での

硝子体の固形成分には、コラーゲンとヒアルロン酸の 2種があり、コラーゲン線維の中にコイル状のヒアルロン酸分子が存在して、る。ヒアルロニダーゼ（Vitrase登録商標、イスタフアーマス一ティカルズインコーポレイテッド）は、ヒアルロン酸を分解することによって硝子体の液ィ匕を促し、硝子体出血の吸収を促進するとして、硝子体腔内注入が提案されている。しかしながら、ヒアル口-ダーゼは硝子体の骨格成分であるコラーゲン繊維は分解せず、治療上重要である後部硝子体剥離は誘導しな!、と考えられる。一方、プラスミンは、硝子体の骨格成分といえるコラーゲン線維を分解し、硝子体の液化のみならず後部硝子体剥離をも誘導すると考えられ、一部の眼科施設で臨床使用されている。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 現在まで網膜硝子体疾患に対する硝子体手術の際に、機械的牽引による硝子体剥離が行われてきた。し力しながら、一定の頻度で網膜裂孔などの術中合併症が見られるのも事実である。近年、術中合併症の発生率を軽減させ、また後部硝子体剥離を簡便におこさせることを目的として、自己血清力精製したプラスミンを使用することが米国の一部の施設力も報告され、熊本大学医学部附属病院眼科においても、倫理委員会の承認のもと、適応疾患でありかつ本人の同意が得られた症例に対し手術補助剤として使用している。その結果、硝子体の液化ならびに後部硝子体剥離の誘導を認め、また病的組織である網膜硝子体界面の増殖膜剥離を容易にする等、網膜硝子体疾患の治療に有用であることが確認された。し力しながら、プラスミンは自家血力抽出、精製する必要があり、そのための特殊な設備ならびに技術 '技術者を必要とすることにより広く多施設で臨床応用されることが困難であること、プラスミンの精製に数日間にわたる時間を要するため、即日に手術を要する症例には応用できないこと、さらには抽出、精製したプラスミンの活性量に個人差が生じうることなどが挙げられ、一般的な治療法となるのは困難である。

[0005] 即ち、本発明は、抽出や精製が容易な物質を用いた、眼科疾患 (特に網膜 '硝子体疾患)の新規な治療 ·予防剤を提供することを解決すべき課題とした。さらに詳細には、本発明は、硝子体の液ィ匕及び後部硝子体剥離を誘導できる物質であって、かつ抽出や精製が容易な物質を用いた、眼科疾患 (特に網膜 ·硝子体疾患)の新規な治療 ·予防剤を提供することを解決すべき課題とした。

課題を解決するための手段

[0006] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、硝子体腔内にナツトウキナーゼを投与することによって、硝子体の液化、及び後部硝子体剥離を誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。

[0007] 即ち、本発明によれば、ナツトウキナーゼを含む、眼科疾患の治療'予防剤又は手術補助剤が提供される。

[0008] 好ましくは、ナツトウキナーゼは、納豆菌培養エキス由来のものである。

好ましくは、眼科疾患は網膜 ·硝子体疾患である。

好ましくは、本発明の薬剤は、硝子体の液化及び Z又は後部硝子体剥離の誘導作用を有する。

好ましくは、本発明の薬剤は、硝子体腔内に投与される。

[0009] 本発明の別の側面によれば、ナツトウキナーゼをヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、眼科疾患を治療又は予防する方法又は眼科疾患の手術を補助する方法が提供される。

本発明の別の側面によれば、眼科疾患の治療'予防剤又は手術補助剤の製造ためのナツトウキナーゼの使用が提供される。

発明を実施するための最良の形態

[0010] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

本発明による眼科疾患の治療 ·予防剤又は手術補助剤 (本書中、本発明の薬剤とも言う）においては、ナツトウキナーゼを有効成分として用いる。ナツトウキナーゼ (subt ilisin NAT)は、 275個のアミノ酸力もなる一本鎖構造の蛋白であり、これまで強力な血栓溶解作用 [Sumi et al. Experientia, 1987]、プラスミノーゲン活性化因子の効果増強 [Sumi et al.Hematologica, 1990]、ならびにプラスノーゲン活性化因子阻害因子の抑制作用 [Urano et al. J Biol Chem, 2001]を有することが報告されている。

[0011] また、ナツトウキナーゼは経口投与で血栓溶解作用を有することも報告され [S醒 i e t al. Hematologica, 1990]、ナツトウキナーゼ高含有納豆菌培養エキス等を利用した加工食品が、近年健康食品として広く普及している。

[0012] 本発明では、従来使用されてきたプラスミンの代替薬として、このナツトウキナーゼを使用するものである。これまでプラスミンで行ってきた手術法と同様、硝子体腔内にナツトウキナーゼを投与し、一定時間の後、硝子体切除を開始することにより、硝子体手術における機械的吸引、切除による合併症を軽減させることができる。 [0013] 本明細書中の実施例に示す通り、家兎眼を用いた実験結果では、硝子体の液化、後部硝子体剥離の誘導が確認され、プラスミンと同等以上の効果が期待できる結果が得られている。ナツトウキナーゼを網膜'硝子体疾患等の眼科疾患の治療'予防薬ならびに手術補助薬として提供することにより、プラスミンを用いた場合の欠点を克服することができる。

[0014] 本発明で用いるナツトウキナーゼは、例えば、納豆菌培養エキス由来のものでもよ Vヽし、ナツトウキナーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターを宿主に形質転換し、当該遺伝子を発現させることにより得られる組み換え体のナツトウキナーゼでもよヽし、あるいはペプチド合成機でィ匕学合成したタンパク質の何れでもよ!/、。

[0015] 納豆菌培養エキス由来のものを使用する場合は、例えば、大豆を主原料とした液体培地に納豆菌を摂取し培養することで、ナツトウキナーゼを高含有する培養液を製造することができる。納豆菌培養エキスの製造方法については、特開 2001— 2992 77号公報に記載されており、本発明においても特開 2001— 299277号公報に記載の方法で作製した納豆菌培養エキスを用いることができる。

[0016] 例えば、納豆菌培養エキスの製造に用いられる微生物は、納豆菌に分類され、ナツトウキナーゼを生産できる微生物であれば、いずれの微生物も使用できる。市販の納豆力も分離した納豆菌を用いてもよい。また、納豆菌の培養に用いる培地の種類は特に限定されず、澱粉 (例えば、コーンスターチ）、グルコース、ショ糖などの炭素源、脱脂大豆、肉エキスなどの窒素源、炭酸カルシウム、塩ィ匕マグネシウムなどの無機塩などを培地成分として用いて、納豆菌を培養することができる。納豆菌の培養方法も特に限定されず、例えば、通気攪拌培養で培養することができる。培養温度も特に限定されないが、通常は 30〜45°C程度であり、 32〜42°Cが特に好ましい。培養期間も特に限定されず、例えば、 3〜4日間程度培養することができる。

[0017] また、培養終了後の培養物上清中には、ナツトウキナーゼのほかにビタミン K2が含まれているので、この培養物をキトサンと接触させて、ビタミン K2をキトサンに吸着させて除去することができる。得られた濾液を濃縮機等で処理することにより納豆菌培養液の濃縮液が得られる。

[0018] 本発明に使用されるナツトウキナーゼは、納豆、納豆菌の液体又は固体培養物並びにこれら加工品を出発原料として、一般の酵素蛋白質の分離'精製に使用されている方法、即ち、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ一等により得る事が出来る。分離'精製法に付いては、須見らの方法 (特開昭 61— 162184号公報、 Experientia, 43, 1110 (1987》、 Ichishimaらの方法 (Biochimi ca et Biophysica Acta, 869, 178-184 (1986))、中西らの方法 (特開平 3— 168082号公報)、三沢らの方法 (特開平 6— 153977号公報)、 Uranoらの方法 (J. Biol. Chem., 276, 24690-24696 (2001))を始めとして多数の学術文献'総説等に収載されている。これら各々の方法若しくはこれらを組合わせた方法により精製品を得る事が出来る。

[0019] 納豆力の精製例を参考例として以下に示す。

市販納豆 500 gに 2倍量の水を加え暫く撹拌させた後、ガーゼでろ過した。ろ液の半分量のエタノールを加え緩やかに撹拌させた後ガーゼでろ過した。このろ液に硫酸アンモニゥムを 80%飽和量加え溶解し、一晩放置後遠心分離により沈殿物を回収した。得られた沈殿物を 100 mmol/Lリン酸緩衝液（pH 7.0)に再溶解した後、 2 mmol/ Lリン酸緩衝液中（pH 7.0)でー晚透析した。この透析液を、予め 10 mmol/Lリン酸緩衝液 (pH 7.0)で平衡化しておいた DEAE- Sephadex A- 50 (Amersham Biosciences) に通し、非吸着画分を回収した。 10 mmol/L酢酸緩衝液（pH 6.0)で一晩透析し、同緩衝液で予め平衡化しておいた CM- Sephadex (Amersham Biosciences)に吸着させ、同緩衝液で洗浄後、 1 mol/L塩ィ匕ナトリウムを含む 10 mmol/L酢酸緩衝液（pH 6.0) のリニアグラジェントにより溶出させた。最後に 100 mmol/L塩ィ匕ナトリウムを含む 10 m mol/Lリン酸緩衝液（pH 7.5)で平衡化させた Sephacryl S- 200 HR (Amersham Biosci ences)でゲルろ過を行い、活性画分を得た。活性画分は SDS-ポリアクリルアミド電気泳動上で単一バンドである事を確認した。本工程の活性収率は約 30%であった。

[0020] また、上記の通り、ナツトウキナーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターを宿主に形質転換し、当該遺伝子を発現させることにより得られる組み換え体のナットゥキナーゼを用いることもできる。ナツトウキナーゼは 275個のアミノ酸力もなる一本鎖構造の蛋白であり、そのアミノ酸配列及び塩基配列は公知である [Nakamura et al. Bios ci.Biotech.Biochem., 56(11), 1869-1871, 1992]。上記したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて、当業者であれば、ナツトウキナーゼをコードする遺伝子を入手し、それを含む発現ベクターを構築し、その発現ベクターを宿主に形質転換し、得られた形質転換体を培養して当該遺伝子を発現させることにより組み換え体のナツトウキナーゼを製造することができる。

[0021] 本発明の薬剤は、以下の実施例で示す通り、注入後早期より後部硝子体剥離を示す所見が認められ、また網膜表面の硝子体線維は薬剤濃度に依存的に消失した。即ち、本発明の薬剤は、硝子体の液化及び Z又は後部硝子体剥離の誘導作用を有し、これにより、眼科疾患の治療 ·予防剤又は手術補助剤として使用されるものである。眼科疾患の種類は特に限定されるものではないが、好ましくは網膜'硝子体疾患である。眼科疾患の具体例としては、網膜剥離、硝子体出血、 HYPERLINK〃http：〃 w ww.matsuda-eye-clinic.com/ganteil-2.htm"網膜静脈閉塞症、 HYPERLINK "http: //www.matsuda— eye— clinic.com/ganteil— 4.htm"力卩齢黄斑変'性、 HYPERLINK "http ://www.matsuda- eye- clinic.com/ganteil- 5.htm〃黄斑円孑し、黄斑下血腫、増殖性硝子体網膜症、網膜出血、網膜血管異常、高血圧または腎疾患による網膜症、糖尿病網膜症、黄斑浮腫、および光凝固による眼球後眼部合併症 (例えば、黄斑部浮腫、網膜剥離等）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

[0022] 本ィ匕合物の投与は経口、非経口のどちらでもよいが、非経口が好ましぐ眼局所投与が特に好ましい。眼局所用剤としては、例えば硝子体内投与剤、眼内灌流液、点眼剤、眼軟膏、眼内インプラント等が挙げられ、上記の中でも硝子体内投与剤が特に好ましい。

[0023] 硝子体内投与剤、眼内還流液又は点眼剤として製剤化する場合、緩衝剤 (例えばホウ酸、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クェン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤等）、等張ィ匕剤（例えばグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、ソルビトール、マン-トールなど）、 pH調整剤（例えば塩酸、クェン酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど）、安定化剤 (例えばェデト酸ナトリウムなど）、無痛化剤（例えば、ベンジルアルコールなど）、又は保存剤（例えば、塩ィ匕ベンザルコ-ゥム、塩ィ匕べンゼトニゥム、ノラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウム、クロロブタノールなど）などを適宜選択して製剤化できる。その他の投与剤型についても汎用の技術を用いて製剤化することができる。 [0024] 本発明にお、ては、ナツトウキナーゼを含む眼科疾患の治療 ·予防剤又は手術補助剤を温血動物 (好ましくは哺乳動物であり、特に好ましくはヒト）に投与することにより、眼科疾患を治療することができ、また眼科疾患の手術補助のために投与することができる。

[0025] 本発明の薬剤の投与量は、投与対象となる疾患、症状やその他の条件、又は投与方法などに応じて適宜選択することができる。ナツトウキナーゼを成人患者に投与する場合、一回あたりの投与量は、眼への局所投与の場合、通常 1回当たり、 0. 001F U〜100FU程度の量で投与することができる。

[0026] なお、ナツトウキナーゼ活性については、日本生物科学研究所で開発された、再現性があり且つ正確に数値ィ匕できるナツトウキナーゼ測定方法を用いて測定することができる。具体的には以下のとおりである。

[0027] ナツトウキナーゼは Bacillus属の産生するアルカリセリンプロテアーゼの一種類であり、蛋白質及び Z又はペプチドを基質とした活性測定法で評価できる。一般的には、乳性カゼイン分解法、合成ペプチド分解法、フイブリン平板溶解法、フイブリンゲル分解法等により測定されている。本発明者らは、株式会社日本生物.科学研究所が開発したフイブリン分解法によりナツトウキナーゼの活性を測定した。該法は、社団法人日本健康 ·栄養食品協会が定める所の、納豆菌培養エキス食品中のナツトウキナーゼ活性測定法としても採用されており、その再現性と的確性が立証されている。該法は、フイブリンにナツトウキナーゼが作用する時、ペプチド結合の分解に伴って増加する酸可溶性低分子分解産物量を紫外部（275 nm)における吸光度を測定して定量ィ匕する方法である。活性度の定義は、該法に従って試験するとき、酸不溶性物質を除いた反応液の 275應における吸光度を 1分間に 0.01増加させる酵素量を 1単位 ( FU)とする。該反応は以下の如くである。フイブリノ一ゲン（SIGMA社製フイブリノ一ゲンフラクション I Type I-S、 PRODUCT NUMBER F8630) 96 mgを 0.9 %塩ィ匕ナトリウムを含む 50 mmol/Lホウ砂緩衝液（pH 8.5) 10 mLに溶解させた。溶けきらない物をガラス棒で磨り潰し完全に溶解させた後、ろ紙（ADVANTEC, No. 6)でろ過した。本溶液 0.4 mLと 0.9 %塩化ナトリウムを含む 50 mmol/Lホウ砂緩衝液（pH 8.5) 1.4 mL を試験管（15 mm ID X 150 mm L)〖こ量り取り、 37±0.3 °Cの恒温水槽中で 5分間加温後、 0.9 %塩化ナトリウムを含む 50 mmol/Lホウ砂緩衝液（pH 8.5)で 20 U/mLに調製したトロンビン（SIGMA社製、 PRODUCT NUMBER T6634)溶液 0.1 mLを力卩ぇ撹拌した。この液を 37±0.3 °Cで正確に 10分間放置した後、試料溶液 0.1 mLをカ卩え、 5 秒間撹拌し、 37 ±0.3 °Cで放置した。試料溶液を添加してカゝら 20分後及び 40分後に各 5秒間撹拌し、正確に 60分後、 200 mmol/Lトリクロ口酢酸溶液 2 mLを加えて撹拌し、更に 37±0.3 °Cで 20分間放置した。この液をマイクロテストチューブに入れ 15,000 X gで 5分間遠心分離した。上清 1 mLを回収し、 275 nmにおける吸光度 (A )を測定し

T

た。別に、試験管に 0.9 %塩化ナトリウムを含む 50 mmol/Lホウ砂緩衝液（pH 8.5) 1.4 mL及びフイブリノ一ゲン溶液 0.4 mLを量り取り、 37 ±0.3 °Cの恒温水槽で 5分間加温した後、トロンビン溶液 0.1 mLをカ卩ぇ撹拌した。この液を 37±0.3 °Cで正確に 10分間放置した後、 200 mmol/Lトリクロ口酢酸溶液 2 mLをカ卩ぇ撹拌し、更に試料溶液 0.1 m Lを加え撹拌した。この液を 37±0.3 °Cで 20分間放置し、以下同様に操作して吸光度 (A )を測定した。ナツトウキナーゼ活性度は次式により求めた。

B

[0028] ナツトウキナーゼ活性度（FU/g) = (A -A )/0.01 X 1/60 X 1/0.1 X D

Τ Β

D：試料の希釈倍数

[0029] 尚、試料溶液の調製には、 2 mmol/L硫酸カルシウム、 10 mmol/L塩化ナトリウム、 0.

005 %トリトン X- 100を含む 2 mmol/L酢酸緩衝液（pH 6.0)を使用した。

[0030] 又、該法で使用する基質（フイブリノ一ゲン）は天然物由来であり、製造ロット毎の品質の差が激しぐ酵素活性の絶対値を定めることが困難である。それ故、該法による測定時には、株式会社日本生物.科学研究所が供給する標準酵素を必ず測定し、その測定値を標準酵素表記力価で除した値を補正係数とした。全ての測定値に補正係数を乗じて測定値とした。

[0031] この方法ではその単位を「FU (フイブリン分解ユニット）」としている（厚生労働省の外郭団体、財団法人日本健康 ·栄養食品協会は 2003年 1月 15日にナットゥ菌培養エキス食品の規格基準を公示し、「FU」をナツトウキナーゼ活性測定の単位として認定している）。

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。実施例

[0032] (1)実験の材料'方法

動物： 12週齢の体重 2. Okgの日本白色家兎 [九動株式会社]を使用した。ゥサギ飼育用のケージに個々に収容し、自由に利用可能な十分量の水と飼料を与えた。

[0033] ナツトウキナーゼ (subtilisin NAT) : ナツトウキナーゼは、日本生物.科学研究所においてナツトウキナーゼ高含有納豆菌培養エキス [NSK-SD登録商標、日本生物.科学研究所]を用いて下記の通り精製、下記の方法によってその活性を測定したものを使用した。

[0034] 精製：食品及び健康食品原料として市販されている、納豆菌培養エキス NSK-SD ( 株式会社日本生物.科学研究所） 1 gを 10 mLの 2 mmol/L酢酸カルシウム溶液に溶解した。 10 mmol/L酢酸緩衝液（pH 6.0)でー晚透析し、同緩衝液で予め平衡ィ匕しておいた CM- Sephadex (Amersham Biosciences)に吸着させ、同緩衝液で洗浄後、 0.5 mol/L塩化ナトリウムを含む 10 mmol/L酢酸緩衝液（pH 6.0)のリニアグラジェントにより溶出させた。最後に 150 mmol/L塩ィ匕ナトリウムを含む 10 mmol/Lリン酸緩衝液（pH 7.5)で平衡化させた Sephacryl S- 100 HR (Amersham Biosciences)でゲルろ過を行い、活性画分を得た。活性画分は SDS-ポリアクリルアミド電気泳動上で単一バンドである事を確認した。本工程の活性収率は約 60%であった。

[0035] ナツトウキナーゼ活性：日本生物科学研究所で開発された、再現性があり且つ正確に数値ィヒできるナツトウキナーゼ測定方法 (詳細は本明細書中上記の通り）を用いた。この方法ではその単位を「FU (フイブリン分解ユニット）」としている。（厚生労働省の外郭団体、財団法人日本健康 ·栄養食品協会は 2003年 1月 15日にナットゥ菌培養エキス食品の規格基準を公示し、「FU」をナツトウキナーゼ活性測定の単位として認定している。 )

[0036] 麻酔：各処置施行の際、白色家兎はペントバルビタール（20mg/kg静注）と塩酸ケタミン（20mg/kg筋注）にて麻酔した。

[0037] ナツトウキナーゼの投与：白色家兎の処置眼に 0. 5%トロピカミドと 0. 5%塩酸フエ二レフリン混合液を点眼し散瞳した。眼科手術用眼内灌流液 [BSSplus登録商標、ァルコン]にて溶解し活性を調整したナツトウキナーゼ溶液（3FU/0. lml、 1FU/0. 1 ml、0. lFU/0. lml、0. OlFU/0. 1ml)を lmlシリンジに準備し、硝子体手術用コンタクトレンズを角膜上に設置後、眼科手術用顕微鏡下に角膜輪部から 2mm離れた場所よりシリンジに接続した 30ゲージ針を刺入して、注意深く 0. lmlを硝子体腔内中央へゆっくりと注入した。また対照眼には、眼科手術用眼内灌流液 0. lmlを同様に注入した。注入直後は眼圧の上昇が生じたため、 20ゲージの眼科用ナイフにて前房穿刺を施行し、眼圧を正常化した。なお、硝子体腔内に注入する溶液はすべて 0. 2 2 μ mのフィルタ一にて濾過滅菌した。

[0038] 超音波画像診断検査：ナツトウキナーゼ溶液 3 FUZO. lmlならびに眼科手術用眼内灌流液 0. lmlを、それぞれ上記の方法により硝子体腔内に注入し、 30分後に Bモード超音波画像診断装置 [UD- 1000、 TOMEY]にて観察した。

[0039] 走査電子顕微鏡検査：眼科手術用眼内灌流液 0. lmlおよびナツトウキナーゼ溶液

(0. OlFU/0. lml、0. 1FU/0. lml, lFU/0. lml)をそれぞれ上記の方法により確子体腔内に注入し、 30分後に眼球を摘出。 4°Cの固定液（2%パラホルム、 2. 5%グルタール）中に入れ、その 1時間後に毛様体扁平部に半周切開を加えた後、再び同固定液中でー晚静置。その後、スプリング剪刀にて毛様体扁平部を全周切開しアイカップを作製。アイカップを剃刀で髄翼と垂直方向に半割し、走査電子顕微鏡検査用の試料とした。同試料を 4°Cの 2%タンニン酸 [Wako]中でー晚静置した後、 PBSにて 20分間毎に 6回洗浄、その後 2%オスミウム中に氷上で 70分静置。 2%オスミウムを回収した後、蒸留水にて水洗 3回。エタノール 50% 15分、 70% 15分、 90% 15分、 95⁰/₀15分、 99. 5⁰/₀30分 2回【こて脱水した後、 tブチノレノレ =3一ノレ【こ浸清（20分 3 回)。凍結の後、試料を凍結乾燥器にて凍結乾燥し、アルミニウムの載物台にカーボン両面テープにて接着、金蒸着装置 [JFC-1200、 JEOL]にて金属コーティングした試料を、走査電子顕微鏡 [JSM-5800LV、 JEOL]にて観察した。

[0040] 網膜電図検査：正常未処置の白色家兎眼を散瞳し、 30分間喑順応の後、網膜電図を記録した [LE_2000、 TOMEY]。次に同一の白色家兎眼硝子体腔内に 1 FUZ 0. lmlのナツトウキナーゼ溶液を注入、 30分間喑順応の後、溶液注入 1時間後に網膜電図を記録した (n=4)。

[0041] (2)実験の結果超音波画像診断検査：対照眼 (眼科手術用眼内灌流液注入眼)では、注入後も特記すべき変化が認められな力つたのに対し、ナツトウキナーゼ注入眼では、注入後早期より後部硝子体剥離を示す所見が認められた (図 1〜図 3)。

走査電子顕微鏡検査：ナツトウキナーゼ注入眼では、網膜表面の硝子体線維は濃度依存的にほぼ消失した。なお、網膜表面の損傷は認められな力つた（図 4〜図 7)。網膜電図検査：ナツトウキナーゼ注入前の a波振幅の平均は 104. 8 V、ナツトウキナーゼ注入前の b波振幅の平均は 190. 4_μ ν。ナツトウキナーゼ注入後の a波振幅の平均は 98. 4_μ ν、ナツトウキナーゼ注入後の b波振幅の平均は 163. であり、 a波 b波ともに振幅の有意な低下は認められなかった（各々 p = 0. 35、 0. 48

) o

[0042] 参考例：

ナツトウキナーゼの他に手術補助薬としてプラスミンの利用が考えられる。以下にプラスミンを用いての実験結果を参考例として示す。

プラスミンの投与：白色家兎の処置眼に 0. 5%トロピカミドと 0. 5%塩酸フエ-レフリン混合液を点眼し散瞳した。過去の報告（Margherio AR, Margherio RR, Hartzer M, Trese MT, Williams GA, Ferrone PJ. Plasmin enzyme-assisted vitrectomy in trauma tic pediatric macular holes. Ophthalmology 1998;105: 1617— 1620.、 Trese MT. Enzy matic vitreous surgery. Semin Ophthalmol 2000;15: 116-121.)に従って健常人より精製し活性ィ匕したプラスミン (0. 05単位、 0. 25単位、 0. 5単位)と、対照として眼科手術用眼内灌流液 [BSSplus登録商標、アルコン]を、硝子体手術用コンタクトレンズを角膜上に設置後、眼科手術用顕微鏡下に角膜輪部から 2mm離れた場所よりシリンジに接続した 30ゲージ針を刺入して、注意深く 0. 05mlを硝子体腔内中央へゆっくりと注入した。また対照眼には、眼科手術用眼内灌流液 0. 05mlを同様に注入した。なお、硝子体腔内に注入する溶液はすべて 0. 22 mのフィルタ一にて濾過滅菌した。

[0043] 走査電子顕微鏡検査:各濃度のプラスミン注入 30分後に眼球を摘出し、 4°Cの固定液（2%パラホルム、 2. 5%ダルタール）中に入れ、その 1時間後に毛様体扁平部に半周切開を加えた後、再び同固定液中でー晚静置。その後、スプリング剪刀にて毛様体扁平部を全周切開しアイカップを作製。アイカップを剃刀で髄翼と垂直方向に半割し、走査電子顕微鏡検査用の試料とした。同試料を 4°Cの 2%タンニン酸 [Wako ]中で一晚静置した後、 PBSにて 20分間毎に 6回洗浄、その後 2%オスミウム中に氷上で 70分静置。 2%オスミウムを回収した後、蒸留水にて水洗 3回。エタノール 50% 15分、 70%15分、 90%15分、 95%15分、 99. 5%30分 2回にて脱水した後、 tブチルアルコールに浸漬 (20分 3回)。凍結の後、試料を凍結乾燥器にて凍結乾燥し、アルミニウムの載物台にカーボン両面テープにて接着、金蒸着装置 [JFC-1200、 JE OL]にて金属コーティングした試料を、走査電子顕微鏡 [JSM-5800LV、 JEOL]にて観祭した。

[0044] 結果:プラスミン投与により、網膜表面の硝子体線維は濃度依存的にほぼ消失した（図 8〜11)。

産業上の利用可能性

[0045] 本発明の薬剤は、眼科疾患、特に網膜'硝子体疾患の治療'予防剤又は手術補助剤として有用である。眼科疾患 (網膜'硝子体疾患など)の治療，予防薬又は手術補助薬としてナツトウキナーゼ (subtilisin NAT)を使用することによって、プラスミン精製のための技術や施設を有しない施設においても、その代替薬として利用可能となる。本発明で使用するナツトウキナーゼは、各個人の血清から精製する必要がなぐ緊急手術の際も利用可能である。また、本発明によれば、個人間のばらつきがなくなり正常組織に傷害を与えることのないより安全かつ低侵襲な治療手段を提供することができる。また、本発明で使用するナツトウキナーゼの生産コストは安価である。

図面の簡単な説明

[0046] [図 1]図 1は、正常未処置眼の超音波断層像を示す。

[図 2]図 2は、眼科手術用眼内灌流液 0. 1mlを硝子体腔内に注入 30分後の眼球超音波断層像を示す。

[図 3]図 3は、 3FU/0. 1mlのナツトウキナーゼを硝子体腔内に注入 30分後の眼球超音波断層像を示す。

[図 4]図 4は、眼科手術用眼内灌流液 0. 1mlを硝子体腔内に注入 30分後の網膜表面の走査電子顕微鏡写真（500倍、幅 264 μ m)を示す。

[図 5]図 5は、 0. 01FU/0. 1mlのナツトウキナーゼを硝子体腔内に注入 30分後の網膜表面の走査電子顕微鏡写真（500倍、幅 264 μ m)を示す。

[図 6]図 6は、 0. 1FU/0. 1mlのナツトウキナーゼを硝子体腔内に注入 30分後の網膜表面の走査電子顕微鏡写真（500倍、幅 264 μ m)を示す。

[図 7]図 7は、 1FU/0. 1mlのナツトウキナーゼを硝子体腔内に注入 30分後の網膜表面の走査電子顕微鏡写真（500倍、幅 264 μ m)を示す。

[図 8]図 8は、眼科手術用眼内灌流液を硝子体腔内に注入 30分後の網膜表面の走查電子顕微鏡写真（500倍、幅 264 μ m)を示す。

[図 9]図 9は、プラスミン 0. 05単位を硝子体腔内に注入 30分後の網膜表面の走査電子顕微鏡写真（500倍、幅 264 μ m)を示す。

[図 10]図 10は、プラスミン 0. 25単位を硝子体腔内に注入 30分後の網膜表面の走查電子顕微鏡写真（500倍、幅 264 μ m)を示す。

[図 11]図 11は、プラスミン 0. 5単位を硝子体腔内に注入 30分後の網膜表面の走査電子顕微鏡写真（500倍、幅 264 μ m)を示す。

Claims

請求の範囲

[1] ナツトウキナーゼを含む、眼科疾患の治療 ·予防剤又は手術補助剤。

[2] ナツトウキナーゼが、納豆菌培養エキス由来のものである、請求項 1に記載の眼科疾患の治療 ·予防剤又は手術補助剤。

[3] 眼科疾患が網膜'硝子体疾患である、請求項 1又は 2に記載の眼科疾患の治療，予防剤又は手術補助剤。

[4] 硝子体の液化及び Z又は後部硝子体剥離の誘導作用を有する、請求項 1から 3の何れかに記載の眼科疾患の治療'予防剤又は手術補助剤。

[5] 硝子体腔内に投与される、請求項 1から 4の何れかに記載の眼科疾患の治療，予防剤又は手術補助剤。