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WO2005040799A1 - 相補性ペプチド人工抗体 - Google Patents

相補性ペプチド人工抗体 Download PDF

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WO2005040799A1
WO2005040799A1 PCT/JP2004/015140 JP2004015140W WO2005040799A1 WO 2005040799 A1 WO2005040799 A1 WO 2005040799A1 JP 2004015140 W JP2004015140 W JP 2004015140W WO 2005040799 A1 WO2005040799 A1 WO 2005040799A1
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WO
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peptide
complementary
peptides
antibody
artificial antibody
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PCT/JP2004/015140
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hidechika Okada
Noriko Okada
Original Assignee
Hidechika Okada
Noriko Okada
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting and analyzing a target protein by using a technique for designing a complementary peptide having a binding property to a protein, and using the complementary peptide as an artificial antibody instead of an antibody.
  • One of the evaluation indices for utilizing a complementary peptide in a Genetic Algorithm is a hydrophobicity value.
  • For the amino acid at each position of the peptide add the amino acids before and after it (5 or several amino acids before and after it, and 0 in the case of the terminal amino acid), calculate the average of the hydrophobicity values, and calculate the hydrophobicity.
  • the sex value is the opposite value! If it is +3.0, -3.0 is the full score of the hydrophobicity evaluation at that amino acid position.
  • the second evaluation index is the correspondence of the bulkiness of the amino acid side chain at the corresponding position.
  • Ex carbons of the corresponding amino acids do not prevent them from approaching each other near 5 angstroms, resulting in a side chain volume. If no volume inhibition occurs, a full score shall be given, and a penalty score shall be assessed according to the degree of inhibition.
  • As the third evaluation index an evaluation point is given using the degree of coincidence of the backbone alignment of the peptide skeleton as an evaluation index.
  • a predetermined number e.g., 300
  • randomly designed peptides consisting of the same number of amino acids as the target peptide is generated as a candidate peptide library, and their complementarity to the target peptide is evaluated. Record in memory.
  • the top two peptides with the highest evaluation scores were selected from among them, and the amino acid sequences of those peptides were scrambled into another sequence.
  • a next-generation peptide library is created.
  • the complementarity to the target peptide is evaluated, the evaluation value is recorded in the combi- rator memory, the top two peptides are selected, and the next-generation peptide library is prepared in the same manner as described above. create. Repeat this continuously, ideally Is repeated continuously until a peptide with a full score is obtained.
  • This computer program software is called MIMETIC! At or near the full score, a peptide is synthesized, the binding activity to the protein having the target peptide is evaluated, and a peptide with high binding affinity is adopted as an artificial antibody peptide.
  • a mouse or a heron can be immunized with an antigen, and sera from animals that produce antibodies can be used as antisera to purify the antibodies with serum ability.
  • Lymphocytes such as spleen cells of an animal such as a mouse immunized with an antigen can be fused with a myeloma cell line to prepare a hybridoma, and a hybridoma that produces the desired antibody can be cloned to produce a monoclonal antibody.
  • the phage display method is used to prepare an antibody having reactivity with an epitope having no antigenicity to an immunized animal, but it is an extremely complicated method.
  • a complementary peptide that is expected to have reactivity with a target peptide portion of an antigen protein is designed using a computer program such as MIMETIC. By synthesizing the designed peptide and confirming that it has specific binding to the target protein, it can be used as an artificial antibody peptide. Means for solving the problem
  • a peptide having complementarity to the amino acid sequence of a target peptide portion of an antigen protein is designed using a computer program such as MIMETIC.
  • the peptide prepared above is allowed to react with the target protein, and the specific binding to the target protein is examined.
  • the peptide having specifically high binding is defined as an artificial antibody peptide.
  • the complementarity binding to the amino acid sequence of the target site of any protein molecule is A peptide is prepared and used as an artificial antibody peptide for detecting an antigen protein.
  • MIMETIC a design program software, can be used to design complementary peptides. Therefore, it is possible to freely design an artificial antibody peptide that reacts to an arbitrary site of the protein selected as a target, and it is not necessary to use a complicated antibody preparation technique such as immunizing an animal! / ⁇ . Since antibodies and the like are prepared, artificial antibody peptides for new proteins can be quickly created, so that it can be used to construct detection methods for new proteins and the like. When producing antibodies by immunizing animals, it is difficult to expect antibody production at sites common to animal species.
  • the artificial antibody peptide of the present invention can create a peptide having reactivity also to a site common to animal species, and thus can easily construct a method for detecting an antigen protein.
  • the present invention when constructing a detection system such as an ELISA method or a protein array method using two or more antibodies, the present invention, which can design and create an artificial antibody peptide for a distant site of a target molecule, is extremely useful. .
  • Example 1 A peptide complementary to a peptide at each site of reverse transcriptase (hereinafter abbreviated as RT) of Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), which is a pathogenic virus of AIDS, was analyzed by the analysis program of the present invention ( As a result of automatic design by MIMETIC), each of the peptides shown in Table 1 could be designed.
  • the synthesis of the designed peptide was carried out using a peptide synthesizer (AMS 422 Multiple Poptide Synthesizer) manufactured by ABiMED by an ordinary solid-phase method in which 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) amino acids were sequentially bonded.
  • a peptide synthesizer AMS 422 Multiple Poptide Synthesizer
  • the synthesized peptide was cut out like a mold, and the residue block was removed.
  • the resulting peptide was recovered by precipitation with ether, the ether was removed by drying and purified by reverse phase HPLC.
  • Virus RNA was extracted by the guanidine isothiophene method (homezynski, P. & 3 ⁇ 4acchi, N.
  • the amount of full-length viral genomic RNA contained in the total RNA sample is determined by the ribonuclease protection method (Kaye, JF, et al. Cis-acting sequences involved in human immunodeficiency virus type 1 RNA packaging.J. Virol. 69: 6588 6592, 1995 and Huang, Y., et al. The role of nucleocapsid and U5 stem / A rich loop sequences in tRNA (3Lys) genomic placement and initiation of reverse trans criptation in human immunodeficiency virus type 1.J. Virol. 72:
  • the viral genomic RNA binds tRNA Lys3 in the cell and can be used for measuring RT activity. About 50 million viral genomic RNAs were added to 20 ul RT buffer (50 mM Tris—HC1, pH 7.5, 60 mM KC1, 3 mM MgCl, 10 mM
  • tRNA Lys3 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dTTP, 5 uCi 32 P-dGTP and 0.05 mM ddATP were reacted by extending one base with 32 p-dCTP in 5 microliters and extending it by 6 bases.
  • the extended primer was recovered by precipitation with ethanol, and electrophoresed on a 6% polyacrylamide gel containing 7 Murea, and the extended primer was detected and analyzed by autoradiography. A test peptide for examining the effect on RT activity was added to this RT reaction system, and the presence or absence and the amount of the base sequence added by RT were examined. As a result, TLMA2993,
  • Table 1 shows the amino acid sequences of various sites considered to be involved in the activity of the reverse transcriptase (RT) of HIV-1, and the amino acid sequences of peptides automatically designed by MIMETIC for these sites. Out of the ten peptides, three peptides suppressed the RT activity.
  • the 50X inhibitory concentration for RT is 17 ⁇ ⁇ for ESLA2340. 15 ⁇ for TLMAZ993. 15 ⁇ for PSTW1594.
  • HIV reverse transcriptase HIV reverse transcriptase
  • a 96-well plate was coated with ESLA2340, and a diluted solution of HIV-RT was added thereto. The plate was incubated at 4 ° C overnight. After washing the plate, the plate was washed with biotin-labeled TLMA2993. And left at room temperature for 1 hour. After the plate was washed again, avidin labeled with peroxidase was added and reacted for 1 hour at room temperature.
  • Pro-carboxypeptidase R is an active form of carboxypeptidase R, which is excised from the amino terminal to the 92nd arginine with a trypsin-like enzyme such as thrombin or plasmin.
  • Peptidase R is an active form of carboxypeptidase R, which is excised from the amino terminal to the 92nd arginine with a trypsin-like enzyme such as thrombin or plasmin.
  • the peptide complementary to the amino acid sequence consisting of 5 or 11 amino acids was automatically designed by the analysis program of the present invention (MIMETIC), and the peptides shown in Table 2 could be designed respectively.
  • MIMETIC analysis program of the present invention
  • peptides consisting of 20 and 15 amino acids peptides (Note 1) and (Note 2) in Table 2) were activated by T / TM of ProCPR. The effect on was analyzed.
  • the synthesized peptides were synthesized using ABiMED's peptide synthesizer (AMS 422 Multiple Poptide Synthesizer).
  • ProCPR was also activated by elastase-trypsin and the like, but these peptides suppressed only the activation of T / TM and did not inhibit the activation of elastase-trypsin.
  • Table 2 summarizes the designed peptides complementary to ProCPR. Table 2 shows mimetic peptides automatically designed by MIMETIC for 11, 15, 20, 24, and 30 amino acid sequences after the 87th amino acid of ProCPR. Since it is considered that a sugar chain has been added to the amino acid at position 86, the peptide after amino acid 87 is removed.
  • VGGRRTRARRVLLLVLTETH (hereinafter abbreviated as VGG) showed a binding reaction to ProCPR using a surface plasmon resonance analyzer (Biacore).
  • a surface plasmon resonance analyzer (Biacore)
  • human plasma containing ProCPR was diluted and added, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • 10G1 which was a monoclonal antibody against ProCPR labeled with biotin was added to the plate and reacted for 1 hour at room temperature.
  • avidin labeled with peroxidase was added to react.
  • a peroxidase coloring reagent was added to form a color according to the strength of the enzyme reaction of peroxidase as in the form, and the measurement was carried out with a plate reader. Color development was observed according to the concentration of plasma including ProPCR, confirming that VGG coated on the plate can be used as an artificial peptide antibody.

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Abstract

抗原タンパク質の標的部位に対する相補性ペプチドを設計合成して、標的部位への結合性を確認し、抗原タンパク質を検出する人工抗体ペプチドを提供する。　本発明の人工抗体ペプチドは、標的部位のペプチドのアミノ酸配列に対応する相補性ペプチドを自動設計する設計プログラムのMIMETICなどを活用して、創成した相補性ペプチドが標的部位へ特異的に結合することを確認して人工抗体ペプチドとする。

Description

明 細 書
相補性ペプチド人工抗体
技術分野
[0001] タンパク質に結合性を持つ相補性ペプチドを設計する技術を用いて、相補性べプチ ドを抗体に代わる人工抗体として、標的とするタンパク質の検出方法及び解析方法 に関する。
背景技術
[0002] 相補性ペプチドを Genetic Algorithm (遺伝子進化的手法)で活用する評価指標の一 つは、疎水性値である。ペプチドの各位置のアミノ酸について、その前後のアミノ酸（ 前後のアミノ酸を 5個ずつもしくは数個ずつ、末端アミノ酸の場合には 0個）を加えて、 疎水性値の平均値を算出し、その疎水性値が逆の値になって!/、ることで評価する。 + 3. 0であれば、ー3. 0をそのアミノ酸の位置での疎水性評価を満点とする。 第二 の評価指標は、対応する位置のアミノ酸側鎖の容積 (bulkiness)の対応性である。対 応するアミノ酸同士の ex炭素 (アミノ酸の側鎖が結合して 、る基部の炭素原子）が 5ォ ングストローム近くに相互に接近することを阻害しな 、側鎖容積になって 、ることを評 価し、容積阻害を起こさない場合を満点とし、阻害の程度により減点評価する。 第 三の評価指標は、ペプチド骨格のバックボーン並列性 (Backbone alignment)の一致 度を評価指標として、評価点をつける。標的ペプチドに対して同一アミノ酸数からな る任意に設計したペプチドを定めた数 (例えば 300種)だけ候補ペプチドライブラリー として発生させ、それらについて標的ペプチドに対する相補性を評価してその評価 値をコンピュータメモリーに記録する。 定めた数 (例えば 300個）の評価ペプチドライ ブラリーを得た段階で、その内で、評価点の高い上位 2種類のペプチドを選び、それ らのペプチドのアミノ酸配列をスクランブルして別の配列に変えたり、アミノ酸の置換 も任意に行 、別の候補ペプチドを設計し、次世代のペプチドライブラリーを作成する 。各ペプチドについて、標的ペプチドに対する相補性を評価してその評価値をコンビ ユータメモリーに記録し、その、上位 2種類のペプチドを選び出し、次次世代のぺプ チドライブラリーを上記と同様な手法で作成する。これを連続して繰り返し、理想的に は満点値のペプチドが得られるまで繰り返しを連続して行う。 それぞれのペプチドを 評価した記録を得点の高いものからソートして並べて一覧表を作り、上位のもの（例 えば上位 300のペプチド）を記録として残し一覧表にする。このコンピュータープログ ラムソフトを MIMETICと呼んで!/、る。満点あるいはそれに近 、ペプチドを合成して、 標的ペプチドを持つタンパク質に対する結合清を評価し、高!ゝ結合性を持つぺプチ ドを人工抗体ペプチドとして採用する。
[0003] マウスやゥサギに抗原を免疫し、抗体を産生した動物の血清などを抗血清として用い 、血清力も抗体を精製することもできる。抗原を免疫したマウスなどの動物の脾細胞 などのリンパ球をミエローマ細胞株と融合させてハイプリドーマを作成し、 目的の抗体 を産生するハイブリドーマをクローユングして、モノクローナル抗体を産生させることも できる。しかし、抗体の作成には動物が抗原の目的のェピトープを認識して抗体産生 をしてくれる幸運を期待しなければならない。免疫動物に対して抗原性がないェピト ープに対して反応性を持つ抗体を作成するには、ファージディスプレイ法を用いるが 、極めて煩雑な手法である。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 抗原タンパク質の標的ペプチド部分に反応性を持つと期待できる相補性ペプチドを MIMETICなどのコンピュータプログラムを用いて設計する。設計したペプチドを合成 して標的タンパク質に対して特異的結合性を持つことを確かめることにより、人工抗 体ペプチドとしての活用を可能にする。 課題を解決するための手段
[0005] 本発明は、抗原タンパク質の標的ペプチド部分のアミノ酸配列に対して相補性を持 つペプチドを MIMETICなどのコンピュータプログラムを用いて設計する。上記で作製 したペプチドを標的蛋白質と反応させ、標的蛋白質に対する特異的結合性を調べ、 特異的に高い結合性を示したペプチドを人工抗体ペプチドとする。
発明の効果
[0006] 本発明では、任意の蛋白質分子の標的とする部位のアミノ酸配列に結合する相補性 ペプチドを作成して、これを人工抗体ペプチドとして抗原タンパク質の検出に用いる 。相補性ペプチドの設計には設計プログラムソフトである MIMETICを用いることがで きる。したがって、 目標として選んだタンパク質の任意の部位に反応する人工抗体べ プチドを自由に設計できるので、動物を免疫するなどの煩雑な抗体作成の手法を必 要としな!/ヽ。抗体などが用意されて ヽな ヽ新規なタンパク質に対する人工抗体ぺプ チドが速やかに作成できるので、新規なタンパク質などの検出法の構築に対応でき る。 動物に免疫して抗体を作成する際には、動物種間で共通の部位に対しては抗 体産生を期待することが難しい。これに対し、本発明の人工抗体ペプチドは動物種 間で共通の部位に対しても反応性を持つペプチドを創生できるので、抗原タンパク 質の検出法を容易に構築できる。特に、 2個以上の抗体を用いる ELISA法やプロティ ンアレイ法などの検出系を構築する際には、標的分子の離れた部位に対する人工抗 体ペプチドを設計創生できる本発明は極めて有用性が高い。
発明を実施するための最良の形態
(実施例 1) エイズの病原ウィルスである Human immunodeficiency virus- 1(HIV-1)の 逆転写酵素 (reverse transcriptase:以下 RTと略す)の各部位のペプチドに対する相補 的ペプチドを本発明の解析プログラム (MIMETIC)によって自動設計した結果、それ ぞれ、表 1に示したペプチドを設計することが出来た。 設計したペプチドの合成は ABiMED社製ペプチド合成機（AMS 422 Multiple Poptide Synthesizer)を用て、 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)アミノ酸を順次結合させる通常の固相法で行つ た。合成したペプチドを型の如く切りだすとともに、残基のブロックをはずした。得られ たペプチドはエーテルで沈殿させて回収し、エーテルを乾燥除去して逆相 HPLCで 精製した。 HIV-1を感染させた PLB細胞 (株化したヒトリンパ球細胞株)の培養上清 を 65%と 15%の蔗糖液を重ねた超遠心機用試験管の上層部の上に載せて 26,500回 転で 1時間の超遠心で HIV-1粒子を回収した。ウィルスの RNAはグァ-ジンイソチォ ンフネ ~~ト法 (し homezynski, P. & ¾acchi, N. RNA isolation from cultured cells. Analytical Biochemistry, 162: 156 159, 1987)により抽出し、これを 5 mM Tris buffer (pH7.5)に溶解して用いた。 Total RNA試料に含まれる全長のウィルスゲノム RNA の量は、型のごとくリボヌクレアーゼプロテクション法 (Kaye, J.F., et al. Cis-acting sequences involved in human immunodeficiency virus type 1 RNA packaging. J. Virol. 69: 6588 6592, 1995及び Huang, Y., et al. The role of nucleocapsid and U5 stem/ A rich loop sequences in tRNA (3Lys) genomic placement and initiation of reverse trans criptation in human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 72:
3907-3915, 1997)で定量した。そのウィルスゲノム RNAは細胞内で tRNALys3を結合し ており、 RT活性の測定に供することができる。約 5000万分子のウィルスゲノム RNAを 20 ulの RT buffer (50 mM Tris— HC1, pH 7.5, 60 mM KC1, 3 mM MgCl , 10 mM
2
DTT)中で、 50 ng HIV- RT、 10単位 RNase及び dNTP's (デォキシ核酸）と 37度 Cで 15 分間反応させた。先頭の 6個の塩基配列は CTGCTAとなる。 tRNALys3は 5マイクロキ ユーり一の32 p- dCTPで 1塩基のばし、 6塩基延ばすために、 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dTTP, 5uCi 32P-dGTP及び 0.05 mM ddATPを反応させた。延長されたプライマーは エタノールで沈殿させて回収したあと、 7 M ureaを含む 6%ポリアクリルアミドゲルで電 気泳動をして延長したプライマーをオートラジオグラフィ一により検出して解析した。 この RTの反応系に RT活性に対する作用を調べる被検ペプチドを添加して、 RTによ つて付加される塩基配列の有無と多寡を検定した。その結果、 TLMA2993,
PSTW1594及び ESLA2340の 3種のペプチドが 20マイクロモル程度で 50%の RT活 性を抑制した。残りの 7種のペプチドには抑制活性を認めな力つた力 設計したぺプ チドの 30%が抑制活性を持ち、これは極めて高い確率で目的の活性を持つペプチド を設計できたことになる。その結果は表 1にまとめた。表 1は、 HIV-1の逆転写酵素（ reverse transcriptase: RT)の活性に関わると考えられる種々の部位のアミノ酸配列と それらに対して MIMETICで自動設計したペプチドのアミノ酸配列である。 10種のぺ プチドの内、 3種のペプチドが RT活性を抑制した。
[表 1] RT分子内標的ペプチド RT分子内 自動設計された相補的ペプチド
サフ'ドメイン （ペプチドの名称）
96HPAGLKKKKSVTVLDVGDAY115 pa lm MWATEL I L !SDSDEVDS I QM
(MWAT2299)
178PD I I YQYMDDLYVGSDLE I 191 pa l m RFYPHI HIHHVGVKSD IEVY
( FYP2448)
283L GTKALTEVI PLTEEAELEL302 thumb ESLALYKSLQQSEMLLELEL
(ESLA2340)
ESLALYKSLQ
(ESLA1153)
(QSEM1205)
383 GKTPKFKLP I QKETWETWTEYWQATW I E413 connect ion TLMALELKGKLLLAGLAPSAFLPLSFPEL
(TLMAZ993)
PSTTPTFLKFQLK
(PSTT1508)
PSTWPTFLKFQLK
( PSTW1594)
I PARLGH FMLRRVGL
<隱誦）
350KTGKYARMRGAHTN363 connect i on LSATMAAAAASMS
(LSAT1256)
RTに対する 50X抑制濃度は ESLA2340が 17 μ . TLMAZ993が 15 μΜ. PSTW1594が 15 μΜ。
それら以外の相補性ペプチドには RTに対する抑制作用は認めなかった。 逆転写酵素の活性をおさえることが確認できた ESLA2340と TLMA2933とを用い、こ れらの相補性ペプチドを人工抗体ペプチドとして HIV逆転写酵素 (HIV-RT)の検出を 以下のごとく行った。 ESLA2340を 96穴プレートにコートしておき、これに HIV-RTの 希釈液を添加して 4度 Cに一晩清置した後、プレートを洗浄し、これにピオチン標識し た TLMA2993を添カ卩して室温で 1時間放置した。プレートを再び洗浄した後、ペルォ キシダーゼを標識したアビジンを添加して 1時間室温にて反応させた。プレートを洗 浄して、未反応のアビジンを除去したあと、ペルォキシダーゼの発色試薬を添加して 室温にて発色反応を型のごとく行った。 HIV-RTの濃度に応じて発色が認められ、人 ェペプチド抗体をサンドイッチ ELISA法に活用できることが示された。 （実施例 2) プ 口カルボキシぺプチダーゼ R(Pro-carboxypeptidase R:以降 ProCPRと略す)は、ァミノ 末端から 92番目のアルギニンまでがトロンビンやプラスミン等のトリプシン様の酵素で 切除されて活性型のカルボキシぺプチダーゼ R(carboxypeptidase R:以下 CPRと略 す）となる。この ProCPRのァミノ末端から 87番目のアミノ酸から 30個、 24個、 20個、 1 5個あるいは 11個からなるアミノ酸配列に対する相補的ペプチドを本発明の解析プロ グラム (MIMETIC)によって自動設計を実施し、それぞれ表 2に示したペプチドを設計 することが出来た。それらの相補的ペプチドの内から、 20個及び 15個のアミノ酸から なるペプチド（表 2の（注 1)および（注 2)のペプチド）につ!/、て ProCPRの T/TMによる 活性化反応に及ぼす作用を解析した。 設計したペプチドの合成は ABiMED社製べ プチド合成機（AMS 422 Multiple Poptide Synthesizer)を用て、
9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)アミノ酸を順次結合させる通常の固相法で行つ た。合成したペプチドを型の如く切りだすとともに、残基のブロックをはずした。得られ たペプチドはエーテルで沈殿させて回収し、エーテルを乾燥除去して逆相 HPLCで 精製した。 精製した 20個および 15個から成るペプチドを ProCPRと室温で 10分間 反応させたあと、トロンビン ·トロンボモジュリン複合体（Thrombin/thrombomodulin complex:以降 T/TMと略す）を作用させ、 CPRの基質である HippurU-L- arginineを 加えて 37°Cで 45分間反応させた後、遊離した馬尿酸を既報の
方法 (Komura, H. et al. Effect of anticoagulants in colorimetnc assay ror basic carboxypeptidases. Microbiol. Immunol. 46: 115- 117, 2002)に準じて測定した。 2 0マーのペプチドと 15マーのペプチドを添加しておいた場合には、それぞれ 1 μ Μ のペプチドで T/TM〖こよる ProCPRの CPRへの活性化が抑制された。この様に、調べ た 2種類のペプチドが両方ともターゲットの ProCPRに対して抑制効果を発揮したので 、我々が MIMETICと呼ぶ相補的ペプチド設計プログラムソフトの効率の良さを示して いると考えられる。 ProCPRはエラスターゼゃトリプシンなどによっても活性ィ匕されるが 、これらのペプチドは T/TMによる活性ィ匕だけを抑制し、エラスターゼゃトリプシンによ る活性ィ匕は阻害しな力つた。設計した ProCPRに対する相補的ペプチドを表 2に纏め た。 表 2ίま、 ProCPRの 87番目のアミノ酸以降の 11、 15、 20、 24及び 30個のァミノ 酸配列に対して MIMETICで自動設計された mimetic peptidesである。 86番目のァス ノ ラギンには糖鎖が付加されていると考えられるので、それを除いた 87番目のァミノ 酸以降のペプチドを標的とした。 92番目のアルギニンのカルボキシル基側がトロンビ ンによる切断場所であるので、それをまたぐ形で Mimetic peptidesの設計を試みた。 そのうち、 15個と 20個のアミノ酸からなる 2種類のペプチドを選んでトロンビン'トロン ボモジュリン複合体による ProCPRの活性ィ匕作用に対する作用を調べたところ、両方 とも 1 μ Μで阻害効果を発揮した。
[表 2]
ProCPR分子内 アミノ酸配列 相補的ペプチド（mime t ic pept ides) の位置
87-97 (11 a a) DTVSPRASASY VSG KRRAGIR
87-101 (15 a a) DTVSPRASASYYEQY VSRGRRRDRR ILMi l (注 1 )
VRSGRTRA RL I LM
VSGRR RDRI L M
87-105 (20 aa) DTVSPRASASYYEQYHSLNE VGGR TRA RVLLLVLTETH (注 2 )
!SGSRRRATTWDKRVKAEGL
87-110 (24 aa) DTVSPRASASYYEQYHSLNE I YSW ISGGTLTARACFLLIHTEVLDVTP
87-116 (30 aa) DTVSPRASASYYEOYHSLNE I YSW I EF ITE VCGEG I SA AVVELVVGR I LNSAPYFQYPL
(注 1 ) 及び （注 2 ) は実際にペプチドを合成して検討を行い ProCPRの活性化を 抑制することが確かめられたぺプチド
ProCPRの活性ィ匕を抑制することが確認できた 20アミノ酸力もなる
VGGRRTRARRVLLLVLTETH (以下 VGGと略す）は表面プラズモン共鳴解析装置 (Biacore)で ProCPRに結合反応を示すことが確認できた。 VGGをプレートにコートし て洗浄後、 ProCPRを含むヒト血漿を希釈して加え、室温にて 1時間反応させた。プレ ートを洗浄して、余分な血漿を除去した後、ピオチンを標識した ProCPRに対するモノ クロナール抗体である 10G1を添カ卩して 1時間室温で反応させた。プレート洗浄して余 分な 10G1抗体を除去した後、ペルォキシダーゼを標識したアビジンを添加して反応 させた。未反応のアビジンを洗浄、除去した後、ペルォキシダーゼ発色試薬を添加し て形のごとくペルォキシダーゼの酵素反応の強さに応じた発色を行わせ、プレートリ ーダ一で測定を行った。 ProPCRを含む血漿の濃度に応じて発色が認められたので 、プレートにコートした VGGが人工ペプチド抗体として用いることができることを確認 できた。

Claims

請求の範囲
[1] 標的タンパク質に結合作用を持つ相補性ペプチドを人工抗体とする抗原の検出方 法。
[2] 酵素、放射性同位元素、ピオチン、アビジンなどで標識したことを特徴とする請求項 1 に記載の標的タンパク質に結合することを特徴とする相補性ペプチド。
[3] 請求項 1および 2に記載の同一抗原に対する 2種類あるいはそれ以上の種類の相補 性ペプチドを用いて、一方の相補性ペプチドを固層化し、それに反応する抗原、また は、それに反応する他の相補性ペプチドを酵素、放射性同位元素あるいはピオチン などで標識したことを特徴とする相補性ペプチドを含有するキット。
[4] 抗原を認識する相補性ペプチドと天然抗体を含有することを特徴とする請求項 3〖こ 記載のキット。
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