NO881239L

NO881239L - Analyse for detektering av hepatitt-antigener og aids-antistoffer.

Info

Publication number: NO881239L
Application number: NO881239A
Authority: NO
Inventors: John E Geltosky; Richard S Smith
Original assignee: Ortho Pharma Corp
Priority date: 1987-03-23
Filing date: 1988-03-21
Publication date: 1988-09-26
Also published as: JPS63277970A; IL85811A0; ZA882042B; FI881355A0; EP0286264A3; FI881355L; DK156788A; EP0286264A2; GR880100180A; AU1334588A; GR1000033B; DK156788D0; PT87036A; NO881239D0

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en test for samtidig deteksjon av markører for hepatitt B-viruset og det humane immunosviktviruset (HIV) i en kroppsvæske og spesielt i en blodprøve. Oppfinnelsen angår spesielt en test hvor en enkelt blodprøve, i en enkelt test, kan analyseres for tilstedeværelsen av markører for det ene eller det andre viruset.

Det humane immunosviktviruset (HIV) er det etiologiske middel for det ervervede immunosviktsyndromet (AIDS). Dette retroviruset ødelegger valgte klasser av T-lymfocytter og resulterer i progressiv, alvorlig immunsvikt. Populasjoner som representerer høy risiko for AIDS representerer også risiko for hepatitt B (se Rustgi V.K., et al. "Hepatitis B virus Infection in the Acquired Immunodeficiency Syndrome" Annals of Internal Medicine 1984; 101:795-97). Enzym-tilknyttede immunosorberende analyser (ELISA'er) til over-flateantigenet til hepatitt B (HBsAG) og antistoff til HIV benyttes rutinemessig for å overvåke donert blod og blodprodukter for å hindre overføring av disse alvorlige in-feksjonene gjennom blodproduktene (se Saxinger W.C., Gallo R.C., "Applications of the Indirect Enzyme-Linked Immuno-sorbent Assay Microtiter to the Detection and Surveillance of Human T-cell Leukemia-Lymphoma Virus (HTLV)" Laboratory Investigation 1983; 49:371-77 og Wei R., et al., "Solid Phase Enzyme Immunoassay for Hepatitis B Surface Antigen", Clin. Chem. 1977; 23:813-15).

Analysene for antistoff til HIV (samt til en gruppe av nær beslektede retroviruser normalt kjent som Lymphoadenopath Virus, LAV; eller AIDS-relaterte viruser, ARV) har for deteksjon av antistoffene generelt basert seg på bruken av viralproteiner oppnådd fra dyrkede infiserte T-lymfocytter. Viruset oppnådd fra de dyrkede cellene spaltes (f.eks.- med detergent) og et fluid, viralt glysat, oppnås. Dette lysatet, som inneholder en rekke forskjellige fragmenter av viralprotein, blir deretter typisk benyttet som fastfase-komponenten i en immunoanalyse.

De for tiden benyttede kommersielle immunoanalyser er av det konvensjonelle sandwich-ELISA-formatet, hvor fastfase-komponenten, som har det virale lysatet avsatt derpå, bringes i kontakt med blod eller serum som mistenkes for å inneholde HIV-antistoffene. Dersom antistoffene er tilstede vil de binde seg til det virale lysatet og, etter at ubundet materiale er vasket bort, blir de bundne antistoffene deretter brakt i kontakt med enzymmerket anti-human immuno-globulin. De merkede antistoffene vil bindes til hvilke som helst humane antistoffer som er festet til den faste fasen og dermed indikerer tilstedeværelsen av de bundne HIV-mål-antistoffene. Denne type av kommersiell HIV-antistofftest blir for tiden benyttet for å analysere vesentlig alle blodprodukter og har i betydelig grad minsket overføringen av HIV-virus via anvendelse av slike produkter.

Likeledes blir blodprodukter rutinemessig testet for HBsAG ved bruk av ELISA-analyser hvorved monoklonale antistoffer som er spesifikke overfor HBsAG (a-HBsAG) festet til en fast overflate og deretter brakt i kontakt med det fluid som mistenkes for å inneholde målantigenene. Ubundet materiale vaskes bort og tilstedeværelsen av bundet antigen detekteres ved å bringe den faste overflaten i kontakt med en merket cx-HBsAG-reagens. Etter vasking og utvikling vil merkingen indikere tilstedeværelsen av målantigenet.

Mens, som tilfellet er for analysene for detektering av HIV-antistoffer, slike HBsAG-analyser har blitt funnet å være effektive ved analyse av blodprodukter, har nødvendigheten av å foreta to separate tester vært både tidskrevende og uhensiktsmessige. Uansett så antas det at det hittil .ikke er tilgjengelig noen effektiv enkelt test som kan kombinere deteksjonen av HBsAG- og HIV-antistoffer i en enkel analyse. Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en analyse hvorved tilstedeværelsen av enten HBsAG- eller HIV-antistoffer kan detekteres ved kombinasjon av en mistenkt fluidprøve med en enkelt reagens, Inkubering av denne, vasking, og deretter detektering av målet med en merket reagens.

Foreliggende kombinerte analyse drar fordel av det nylig oppdagede alternativ til viral lysatreagens i analyse av HIV-antistof fer. Disse nye reagensene er beskrevet i US patant-søknad serial nr. 843 437, inngitt 24. mars 1986 av J. Rosen, et al. angående "Synthetic HTLV-III Peptides" og i en "continuation-in-part" av nevnte søknad, US patentsøknad serial nr. 025 108 inngitt 20. mars 1987. Som beskrevet i disse patentsøknadene kan en rekke peptider hvert tatt alene eller tatt i kombinasjon, benyttes i en ELISA-analyse for å erstatte det uønskede virallysatet som nå er i kommersiell bruk. Det angis i disse søknadene at benyttelsen av de kjemiske syntetiserte peptidene istedenfor virallysatet er fordelaktig ved at lysatet er produsert fra levende virus-infiserte celler og således representerer fremstillingen og bruken av slike, fare for at overlevende levende virus skal infisere alle som kommer i kontakt dermed. Videre, siden virallysatet er et naturprodukt er det variabelt og disse variasjonene kan reslutere i uforutsigbare analyser fremstilt dermed. Slik variasjon eksisterer ikke i tilfellet for kjemisk syntetiserte peptider. Sluttelig angis det at bruken av virallysat i ELISA-analyser resulterte i et vesentlig antall falske positive resultater, mens bruken av de syntetiske peptidene derimot praktisk talt har eliminert disse.

Det har nå blitt oppdaget at ytterligere en annen stor fordel oppstår ved bruken av slike syntetiske peptider. Spesielt har det blitt oppdaget at slike peptider kan benyttes i kombinasjon med de HBsAG-detekterende reagenser I en enkelt ELISA-analyse for samtidig å detektere både HBsAG og HIV-antistof fet .

Spesielt tilveiebringes en analyse for detektering ora enten HBsAG eller HIV-antistoffet er tilstede i et mistenkt fluid som omfatter en første reagens. Den første reagensen innbefatter: (a) en fast overflate hvortil det er bundet et peptid som har et epitop som er i stand til å bindes til en paratop av et HIV-antlstoff, og (b) en fast overflate hvortil det er bundet et antistoff som er spesifikt for HBsAG. Analysen innbefatter videre en annen reagens som innbefatter: (c) et merket peptid som har en epitop som er i stand til å bindes til en paratop av et HIV-antistof f, og (d) merket antistoff spesifikt for HBsAG.

Ved bruk kan det mistenkte fluid bringes i kontakt med den første reagensen i en tilstrekkelig tid til å tillate at en Immunologisk reaksjon kan foregå. Deretter kan det ubundne materialet vaskes fra de faste overflatene og deretter kan den faste overflaten bringes i kontakt med den andre reagensen. Etter vasking vil tilstedeværelsen eller fraværet av merket annen reagens på den faste overflaten indikere tilstedeværelsen eller fraværet av målmaterialet (HBsAG eller HIV-antistoff) i det mistenkte fluidet.

I en foretrukket utførelse velges peptidet som et eller flere av peptidene beskrevet i de ovennevnte patentsøknader til Rosen, et al. I en utvalgt utførelse velges peptidene som en blanding av to peptider betegnet og beskrevet heri som E32 og E34.

I en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse er de faste overflatene til både (a) og (b) nevnte ovenfor, simpelthen den samme overflaten til en brønn i en mikrotiterplate.

Oppfinnelsen omfatter festing av peptider som er spesifikke for HIV-antistoff, og antistoffer som er spesifikke. ovenfor HBsAG, til faste overflater som en første reagens.

De valgte peptidene er kjemisk syntetiserte oligopeptider som har aminosyrerest-sekvenser i de kritiske regionene til kappeglykoprotein GP 41 i HIV. Sekvensene og syntesene er godt beskrevet i de ovennevnte patentsøknader til Rosen et al. Spesielt kan egnede peptider velges fra gruppen som har de følgende aminosyrerestsekvensene:

Strukturen til de angjeldende peptider er gitt i de konvensjonelle enkeltbokstav-kodene for aminosyrer. For hensikts-messighetens skyld skal det nevnes at enkelbokstav-kodene for aminosyrene som inneholdes i de angjeldende peptider er: I = L-isoleucin; W = L-tryptofan; G = glysin; C = L-cystein; S = L-serin; K = L-lysin; L = L-leucin; T = L-treonin; A = L-alanin; V = L-valin; P = L-prolin; D = L-aspartinsyre; N = L-asparagin; E = L-glutaminsyre; R = L-arginin; Y = L-tyrosin; Q = L-glutamin; F = L-fenylalanin; M = L-metionin.

Som beskrevet i de ovennevnte søknader blir gjenkjennelsen av antistoffer til HIV betydelig forbedret dersom de ovennenvte peptider anvendes i kombinasjon, i overensstemmelse med en spesifikk seleksjonsforeskrivelse. Spesielt blir forbedret gjenkjennelse oppnådd ved valg eller seleksjon av to eller flere av de ovenfor beskrevne peptider hvor et første av nevnte peptider inneholder gp 41-proteinsekvensen:

Dette første peptidet inneholder fortrinnsvis idet minste disse syv aminosyrerestene og enda mer foretrukket minst en tolv-aminosyrerestsekvens fra gp 41-proteinet og inkludert sekvensen med formel (I).

Kombinasjonen av peptider bør også innbefatte minst et annet peptid hvor nevnte peptid innbefatter idet minste aminosyre-restsekvensen

Hvor X er valgt fra gruppen bestående av I, L, M eller F. Det skal påpekes at X tilsvarer 602-stillingen i pg 41-proteinet og når X er I, så tilsvarer formel (XVI)-sekvensen 599 til 603-stillingen i gp 41-proteinet. På den annen side antas det at basert på et studium av sekvenssammenligningen av HIV-isolater i den kritiske regionen i gp 41- proteinet, så er erstatning av I i denne posisjon, 602, med L, M eller F antigenetisk ekvivalent. Dette andre peptidet bør i tillegg til å inkludere sekvensen med (XVI), også innbefatte et totale på minst femten aminosyrerester i en sekvens som finnes i gp 41-proteinet. Med andre ord omfatter det andre peptidet sekvensen

hvor X er valgt fra gruppen bestående av~ I, L, M eller F;

hvor Z er valgt fra amlnosyrerestsekvensen i HTLV-III virus gp 41 proteinet umiddelbart tilstøtende aminosiden i L-leucinresten i 599-stillingen i gp 41 proteinet;

hvor Z' er valgt fra amlnosyrerestsekvensen i HTLV-III virus gp 41 proteinet umiddelbart tilstøtende karboksysiden i L-tryptofanresten i 603-stillingen i gp 41 proteinet; og

hvor en av Z eller Z' kan ha en lengde på 0 rester og hvor Z og Z' sammen omfatter minst 10 rester.

Kombinasjonen av peptider (IV) eller (XII) med peptider (III), (XIII), eller (X) er spesielt foretrukket. Kombinasjonen av (III) og (IV) eller (XIII) og (IV) er de ønskede kombinasjoner.

De ønskede petidene er en blanding av

IWGCSGKLICTTAVPWNAS, idet følgende betegnet "E32", og AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI, idet følgende betegnet "E34".

Disse peptidene kan syntetiseres ved følgende metoder:

Syntese av E32 og E34

Syntese av peptidene E32 og E34 ble oppnådd ved bruk av klassisk Merrifield-teknikk (2). Peptidsekvensene ble syntetisert på et automatisert Vega 250C peptid-syntese-apparat ved bruk av et dobbelt koblingsprogram.

For petid E32 ble boc-serinharpiks med substitusjon av 0,92 mmol/gram benyttet. For peptid E34 ble boc-Isoleucinharpiks med substitusjon av 0,8 mmol/gram benyttet. Syntese av boc-serin- og boc-isoleucinharpiksene ble oppnådd ved gisin-metoden som beskrevet av Stewart & Young (1).

For peptid E32 ble peptidsekvensen 'IWGCSGKLICTTAVPWNAS' syntetisert ved bruk av boc-serinhårpiksen sekvensielt dobbeltkoblet med følgende mol-L-aminosyrer i 12 meq overskudd :

For peptid E34 ble peptidsekvensen 'AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI' syntetisert ved bruk av følgende boc-aminosyrer i 12 meq overskudd:

(1) Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, andre utgave (1984), Pierce Chemical Co. (2) Merrifield, R.B. (1963), J. Amer. Chem. Soc. 85, pp. 2149-2154. (3) Alle boc-aminosyrer oppnådd fra Bachem Inc., Torrance, Calif.

(4) Analytiske HPLC betingelser:

Buffer A: 0,1* TFA/destillert deionisert vann Buffer B: 0,1* TFA/HPLC kvalitet acetonitrilgradient betingelser: 10* 'B' til 50* 'B' over 20 minutter. Bølgelengde: 214 nm

Strøm: 1,0 ml/min

Kolonne: Vydac 214TP54 C-4 proteinkolonne, 250 x 4,5 mm

(5) Aminosyreanalyse foretatt på et LKB 4150 alfaaminosyre-analyseapparat. (6) Peptidsekvens-bestemmelse foretatt på et Applied Biosystems 470A proteinsekvensapparat. (7) Peptldinnhold bestemt fra utvinning ved aminosyreanalyse av kjent mengde peptid. (8) Boe er en kjemisk forkortelse for tert-butyloksy-karbonyl-alfaaminobeskyttende gruppe. Den funksjonelle gruppen fjernes ved hydrolyse i 50* trifluoreddiksyre (TFA)/50* diklormetan (CH2C12) etter at aminosyren har blitt koblet til den voksende peptidkjeden. Denne handling eksponerer kjedens aminoterminus slik at den neste aminosyren gis anledning til å bli effektivt koblet.

I tillegg til den boc-beskyttende gruppen på hver aminosyre, blir sidekjedene til noen aminosyrer videre beskyttet overfor angrep ved den kjemi som er innbefattet i peptidsyntese. Disse beskyttelsesgruppene, angitt i parentes på oversikt-listen, er alle stabile overfor betingelsene ved peptidsyntese, men er likevel lette å fjerne fra aminosyren under spalting i hydrofluorsyre. Anisol (metylfenyleter) virker som et nukleofilt rensemiddel under HF-spaltingstrinnet for hindring av alkylering av peptidet av de frigjorte karbonium-ionene fra beskyttende grupper. De beskyttende gruppene for de angitte aminosyrene er definert nedenfor: 0-benzyl: benzyl-ester; festet til hydroksylsidekjeden i både serin og treonin for å hindre acylering eller forgrening av peptidkjeden.

MeObzl: 4-metoksybenzyl; festet til sulfydrylgruppen i cystein for å hindre dets oksydasjon under peptidsyntese.

Cl-Z: 2-klorbenzyloksykarbonyl; festet til alfa-amino-gruppen i lysin for å hindre dannelsen av sidekjedevekst fra dets sete på peptidet.

Hobt: 1-hydroksybenzotriazol; benyttet i ekvimolare mengder til glutamin og asparagin under kobling for å hindre de-hydratisering til nitrilformene.

Tosyl: p-toluensulfonyl; benyttet for å acylere guanidin-gruppen i sidekjeden til arginin.

Bzl: beta-benzylester; blokkerer karboksylgruppene i sidekjeden til aspartinsyre og glutaminsyre.

Brz: 2-brombenzyloksykarbonyl; blokkerer hydroksylgruppen i sidekjeden til tyrosin.

Peptider ble spaltet fra harpiksen, filtrert, ekstrahert

med eddiksyre og ført gjennom en fraktogel-avsaltningskolonne som i eksempel I. For peptid E34 , ble fraktogel-fraksjoner analysert ved analytisk HPLC og fraksjoner inneholdende minst 30* av den totale absorbsjon ved 214 nm som hovedtopp som migrerte ved ca. 14 minutter retensjonstid ble oppsamlet. De oppsamlede fraksjonene ble kromatografert på karboksymetyl-cellulose, likevektsinnstilt med 0,01 M ammoniumacetat, pH 4,4. Kolonnen ble eluert med en trinngradient av ammoniumacetat og fraksjonen som eluerte ved 0,2 M ammoniumacetat ble oppsamlet, lyofilisert og analysert ved analytisk HPLC. Hovedtoppen som migrerte ved 14 minutters retensjonstid omfattet mellom 30 og 40* av den totale absorbsjon ved 214 nm og materiale hadde et akseptabelt amminosyreinnhold.. Dette materialet ble oppløseliggjort på ny og benyttet i ELISA.

For peptid E34 , ble fraktogel-fraksjoner likeledes analysert ved analytisk HPLC. Fraksjoner inneholdende minst 70% av den totale absorbsjon ved 214 nm som hovedtopp som migrerte ved omkring 12,99 minutters retensjonstid, ble kombinert, lyofilisert og analysert ved HPLC og med henblikk på amino-syreinnhold. Dette materialet ble oppløseliggjort på nytt og benyttet i ELISA.

Anti-HBsAG (fortrinnsvis monoklonalt) for benyttelse med det syntetiske proteinet i den kombinerte analysen ifølge oppfinnelsen, kan være et hvilket som helst slikt monoklonalt antistoff som er vist å være spesifikt for HBsAG-materialet og som er anvendbart i en ELISA-analyse. Spesielt benyttet ble en anti-HBsAG musemonoklonal oppnådd fra Ortho Diagnostic Systems, Inc., Raritan, New Jersey, identisk med det benyttet i antistoffet til hepatitt B overflateantigen (anti-HBa)

(murin-monoklonal) orto antistoff til HBsAG ELISA-testsystem. Andre kilder for anti-HBsAG monoklonale antistoffer er kjent slik som fra Accurate Chemical & Scientific Corp (Westbury, NY) (f.eks. produktnummer MAS 103, MAS 104, MAS 105, MAS 106 eller MAS 107). Alternativ kan velkjente hybridomteknikker benyttes for å bringe, selektere og rense et egnet monoklonalt antistoff til HBsAG. Slike metoder vil f.eks. innbefatte isolering og rensing av hepatittrelaterte antigener, inkludert de virale overflateantigenene. Likeledes er produksjonen av hybridomer ifølge metodene, først fremsatt av Kohler og Milstein [Nature 256, 495-497 (1975)], velkjent og behøves ikke gjentas her. Mens monoklonale antistoffer generelt er foretrukket på grunn av deres store spesifisitet, kan polyklonale antistoffer også med fordel benyttes. Fremgangsmåter for fremstilling av polyklonale antistoffer er likeledes velkjent eller de kan oppnås kommersielt lik som fra Cambridge Research Laboratories, Massachusetts (f.eks. prod. 597015 hepatitt B overflateantigen geit polyklonalt antistoff).

Ifølge foreliggende oppfinnelse blir den første reagensen fremstilt ved å feste både peptidene og anti-HBsAG og det anti-HBsAG monoklonale antistoffet til faste overflater. Slike faste overflater kan være partikler av forskjellige materialer slik som f.eks. polysakkarider, kiselholdige materialer eller plaster eller lignende. I ELISA-analyser er de faste overflatene, fortrinnsvis brønnene, i en mikrotiter-platebrønn og både det monoklonale antistoffet og peptidene festes til overflaten i hver brønn.

Den andre reagensen omfatter en blanding av merkede peptider og antistoffer. Mens det innen teknikker er kjent at mange like "merkinger" kobles til immunogene aktive materialer i ELISA-analyser, er den merking som foretrekkes for peptidene biotin-streptavidin-biotin-HRPO (pepperrotperoksidase) kompleks. Den merking som foretrekkes for antistoffene er

HRPO.

Grunntrekk ved foretrukket analyse

Grunntrekkene ved en foretrukket analyse ifølge oppfinnelsen er som følger: 1) Den første reagensen, som omfatter både E32- og E34-peptider og a-HBsAG monoklonal belagt på overflaten til en brønn i en mikrotiterplate, inkuberes med den mistenkte fluid, f.eks. pasientplasma, 1 tilstrekkelig tid til å immunoreagere f.eks. i en time ved 37°C og vasking foretas; . 2) Den andre reagensen, som omfatter E32 og E34 koblet med biotin og i blanding med anti-HBsAG koblet til HRPO, til-settes og inkuberes i tilstrekkelig tid til å immunoreagere f.eks. en time ved 37°C, og deretter foretas vasking; 3) Merkingen utvikles ved tilsetning av et fremstilt streptavidin-biotin-HRPO-kompleks og inkubering foretas til bundet peptid-biotinkompleks, f.eks i 30 minutter ved 37°C; 4) Sluttelig utvikles merkingen med OPD-substrat i 30 minutter ved romtemperatur og den optiske densitet avleses ved 492 nm.

Materiale og metoder

Studiesub. jekter og kontrollgrupper

En gruppe av 30 serumprøver ble oppnådd fra pasienter med AIDS eller AIDS-relatert kompleks (ARC) fra San Diego. 48 prøver ble oppnådd i februar og mars 1980 som del av et epidemiologisk studium av hepatitt B i homoseksuelle menn. Serum ble lagret ved -20°C. Disse sera ble innledningsvis analysert for HBV-overflateantigen og for antistoff til dette ved bruk av AusRIA-utstyr (Abbott Laboratories, North Chicago, 111). Et totale av 32 serumprøver fra lavrisiko-pasienter i en gastroenterologisk klinikk ble analysert som ukjente i anti-HIV env/HBsAG-analysen. I tillegg ble 26 sera fra pasienter med sykdommer på grunn av reumatoid artritt, systemisk lupus erytematosus og traumer urelatert til HIV-infeksjon, analysert.

E32/ E34 env peptider og ELISA som bruker dem som antigener E32 og E34 er syntetiske oligopeptider fra regioner i kappeglykoprotein gp 41 i HIV. Deres sekvens, deres syntese og ELISA som bruker dem som antigen, har tidligere blitt beskrevet.

Biotlnylerlng av env peptider

HIV env peptidene E32 og E34 benyttet i dette studium ble syntetisert ved hjelp av fast fasemetoden ifølge Merrifield

[6]. Peptidsekvensene blekarakterisert vedaminosyreanalyse (LKB 4150 aminosyre-analyseapparat) og aminosyresekvens (Applied Biosystems 470 H protein-sekvensapparat). Analytisk HPLC av de oppsamlede og kombinerte proteinene viste at peptidet var mer enn 70* rent. Peptidet ble lyofilisert for å fjerne eddiksyre. En mengde på 1,0 mg av E32- og E34-peptider ble oppløselig-gjort separat 1 250 pm 0,1 M natriumkarbonat-bikarbonat-buffer, pH 9,6 på is.

I separate reagensrør ble 0,5 mg biotin-x-NHS (biotinyl-e-aminokaproinsyre n-hydroksy-succinimidester, Calbiochem, San Diego, CA) for E32, og 0,1 mg bidtin-x-NHS for E34, oppløst i 1,0 ml av 0,1 M natriumfosfat (0,1 M NaH2P04, 0,1 M Na2HP04, pH 6,5) på is. Til hvert reagensrør ble det tilsatt 1,0 mg EDC (l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimid-Hcl, Pierce Chemical Co., Rockford, 111.) og oppløsningen ble inkubert i 15 minutter på is. Et volum på 750 pl av 0,1 M natriumfosfat ble tilsatt til peptidoppløsningene som deretter ble tilsatt separat til den passende EDC-biotin-x-NHS-oppløsing til et totalvolum på 2 ml. Reagensrørene ble anbrakt i et ende-over-ende-rotasjonsapparat og inkubert i 30 minutter ved 4°C, og deretter i 4 timer ved romtemperatur.

De biotinylerte peptidoppløsningene ble kromatografert på en Sephadex G-10 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) 1,0 x 20 cm kolonne (Biorad Laboratories, Richmond, CA), med et sjiktvolum på 10,0 ml. Peptidene ble eluert med PBS pH 7,2 med en strømningsgrad på 1,0 ml/min.

Absorbansen ble målt ved 235 nm med PBS som referanse-blindprøve. Absorbans-hovedtoppen ved 235 nm ble oppsamlet, kombinert og frosset ved -20°C med 10* glyserol tilsatt for å stabilisere peptidene.

Effektiviteten til biotinyleringen ble overvåket ved prøving av forskjellige fortynninger av de biotinylerte peptidene i anti-HIV env peptid/HBsAG-analysen for å bestemme hvilken fortynning som resulterte i det mest skarpe signalforhold mellom positive og negative prøver.

Anti- HIV env peptld/ HBsAG ELISA

E32- og E34-peptidene ble oppløseliggjort ved oppløsning av peptidene i 0,1M natriumkarbonat-bikarbonat-buffer, pH 9,6 til en konsentrasjon på 200 pg/ml. ELISA-analysen ble foretatt 12-brønners "removawell"-mlkrotiterstrimler (Nunc, Irvine Scientific, Irvine, CA. eller Dynatech Immulon II, Chantilly, Va.). Hver brønn ble belagt med en oppløsning av 200 pl av 2,5 pg/ml E32 og 0,5 pg/ml peptid E34. Hver brønn ble også belagt med 10 pg/ml av anti-HBsAG muse-monoklonal, (Ortho Diagnostics Systems, Inc., Raritan, NJ) i samme buffer. Mikrotiterplaten ble dekket med parafilm og inkubert i et minimum av 12 timer ved 4°C. Nevnte env peptid-anti HBsAG-oppløsning ble deretter kassert og overskudd bindings-seter behandlet med 300 pl/brønn av 10* normal hesteserum i PBS (0,15 M NaCl. 0,5 M NaH2P04. 0,05 M Na2HP04, pH 7,3) hvor til 2,5* føtalkalveserum, 0,2* bovinserumalbumin (BSA) og 0,05* tween-20 hadde blitt tilsatt. Denne oppløsningen hadde blitt inkubert i 15 minutter i et 37°C fuktiggjort kammer. Brønnene ble tømt ved endevending og 200 pl/brønn rent plasma eller serum ble tilsatt til hver testbrønn. Mikrotiterplaten ble dekket med parafilm, inkubert i 1 time ved 37"C, deretter vasket 5 ganger med 400 pl/brønn av 0,05* tween-20 i PBS.

Et volum på 200 pl ble deretter tilsatt til hver brønn med en oppløsning i PBS inneholdende 1:50 muse-monoklonal til HBsAG konjugert til HRPO og en 1:350 fortynning av hvert biotinylert peptid. Etter en times inkubasjon ved 37°C, ble brønnene vasket 5 ganger med 400 pl av 0,05* tween-20 i PBS.

En oppløsning av 200 pl/brønn streptavidin-biotin-pepperrotperoksidase-kompleks, på forhånd inkubert i 30 minutter ved 37°C (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 30 minutter ved 37"C. Brønnene ble vasket 5 ganger med 0,05* tween-20 i PBS og inkubert med 200 pl/brønn med o-fenylendiaminoppløsning (en 10 mg OPD.tablett i 15 ml destillert vann og 6,25 pl 30* H202; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i 30 minutter ved romtemperatur. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 50 pl/brønn av 4N H2SO4. Absorbans ved 490 nm ble bestemt i en mikroelisa-avlesningsanordning nullstilt på en tom mikrotiterbrønn.

Bedømmelse av antl- HIV env peptld/ HBsAG ELISA

Intra- og inter-analysereproduserbarhet av anti-HIV env/HBsAG analysen ble bestemt ved måling av tre fortynninger av to separate prøver (en HIV positiv og en HBsAG positiv) i samme analysen eller i flere analyser utført flere ganger iløpet av en uke.

Utvinningen av forskjellige andeler av en HIV-positiv prøve tilsatt til en HIV-negativ prøve og andeler av en HBsAG-positiv kontroll tilsatt til et HBV-negativt serum ble bestemt. Disse supplerte og usupplerte prøvene ble analysert i nevnte anti-HIV env/HBsAG som ukjente.

Referanse HIV antistoff og HBsAG metoder

Antistoff til HIV i serum og plasma ble målt med to kommersielt tilgjengelige ELISA-utstyrspakker: Virgo HTLV-III ELISA, (Electro-Nucleonics, Inc., Columbia, MD), idet følgende betegnet HIV ELISA I; og Abbott HTLV III EIA (Abbott Laboratories, North Chicago, III), idet følgende betegnet HIV ELISA II. Hepatitt-overflateantigen ble målt ved hjelp av Auszym HBsAG EIA-utstyr (Abbott Laboratories, North Chicago, ILL), betegnet HBsAG I, og Ortho HBsAG ELISA-testsystemet (Ortho Diagnostic Systems, Inc., Raritan, NJ) betegnet HBsAG II. Disse analysemetodene ble foretatt ifølge produsentens Instruksjoner.

Standarder

For HBsAG-sensitivitetssammenligning ble Abbott Laboratories HBsAG standard (Lot #84464 HR) subtyper ad og ay, benyttet. Standardene ble lagret ved 4"C og analysert i duplikat.

Immunoblot- analyse for HIV

Utvalgte prøver ble analysert ved immunoblot-analyse som beskrevet av Symlngton [se Symington, J. et al., "Immunoauto-radiographic Detection of Proteins after Electrophoretic transfer from Gels to Dlazo-Paper. Analysis of Adenovirus Encoded Proteins", Proe. Nati. Acad. Sei. 1981;78:177-181] ved bruk av biorad-immunoblotanalysen (Bio-Rad Clinical Division, Richmond, CA). En prøve ble ansett for å være reaktiv ved immunoblot-teknikken ved tilstedeværelsen av antistoff rettet mot 24 KD qaq og 41 KD env glykoprotein-båndene. Denne bio-rad-analysemetoden ble foretatt ifølge produsentens instruksjoner.

Statistiske analyser

Middelverdier er uttrykt med deres standard avvik. Normale ytterverdier ble fjernet fra de normale områdestudiene ved bruk av den statistiske teori beskrevet av Barnett [se Barnet R.M., "Clinical Laboratory Statistics", 1979 2nd Ed. Boston. Little, Brown & Company 124].

Resultater

Normalområde- bestemmelser og kontrollgrupper

Serum eller plasma ble oppnådd fra 72 friske frivillige og analysert i duplikat i HIV env peptid/HBsAG-analysen. To prøver ble kassert som statistisk signifikante ytterligheter på grunn av optiske densitetsverdier (0,62 og 0,054) over det normale området bestemt ifølge Barnetts teori. Disse sera ble verifisert til å være negative for HBsAG, og HIV ved kommersiell ELISA og Western Blot. Det normale området for HIV env/HBsAG ELISA ble deretter beregnet fra analyse-resultatene fra testing av 70 prøver. Den midlere optiske densitetsverdien eller absorbansen var 0.008. Den midlere optiske densitetsverdien pluss seks standard avvik var 0,096. Anti-HIV env peptid/HBsAG ELISA-resultatene på ukjente sera over en optisk densitet på 0,100 ble ansett som positive. Den midlere optiske densitet eller absbrbans, når verdiene fra de to ytterlighetene ble addert til fordelingen, ble bestemt til å være 0,026. Dette middel pluss tre standard avvik var 0,097 og pluss seks standard avvik var det 0,168. De 32 prøvene fra den gastroenterologiske klinikk var negative i anti-HIV env/HBsAG-analysen og det var også 26 andre prøver fra forskjellige sykdommer.

For anti-HIV env/HBsAG-analysen ble intra-analysevariasjonskoeffisienten bestemt ved analyse av tre forskjellige plasmaprøver 8 ganger i en enkelt analyse og varierte fra 3,0 til 7,0. Inter-analysevariasjonskoeffisienten ble fastslått ved analyse av tre plasma-ansamlinger på tre etter hverandre følgende dager og varierte fra 3,0 til 11,0 (tabell I). For å bestemme nøyaktigheten av denne analysen ble det utført plasmasupplement- og utvinningsforsøk I hvilke fortynninger av en HIV-positiv og en HBsAG-positiv kontroll ble tilsatt separat til et normalt plasma, som deretter ble analysert i anti-HIV env/HBsAG-analysen. Resultatene for HIV-antistoff-utvinningsforsøket viser at anti-HIV env/HBsAG ELISA kunne detektere de forskjellige fortynningene (1:2-1:200) av en HIV-positiv prøve tilsatt til en HIV-negativ prøve. Kjente mengder av en HBsAG-positiv kontroll ble tilsatt til et normalt serum og analysert i anti-HIV env/HBsAG ELISA. Resultatene viste at anti-HIV env/HBsAG-analysen kan detektere forskjellige konsentrasjoner fra 6 nanogram til 0,75 nanogram av denne HBsAG-kontroll tilsatt til normalt serum.

Sammenligning av anti- HIV env/ HBsAG- analysen med HIV og HBsAG ELISA- utstvr

Prøver oppnådd fra 48 homoseksuelle menn oppnådd tildlig i 1980 ble analysert i duplikat i nevnte anti-HIV env/HBsAG ELISA og sammenlignet med HIV og HBsAG ELISA-metoder som beskrevet i "Materialer og metoder". Resultatene viste at nevnte anti-HIV env/HBsAG ELISA på nøyaktig måte detekterte antistoffer til HIV- og HBV-overflateantigen i prøver når en eller begge av analyttene var tilstede (tabell II). Det sterkeste signalet uttrykt som absorbans ble obervert med prøver som var HBsAG-positive analene. Et totale på 6 prøver var E32/E34 ELISA-testposltive og -negative i anti-HIV env/HBsAG-analysen. Som en ytterligere spesifisitetstest for nevnte anti-HIV env/HBsAG ELISA, ble 30 prøver fra pasienter med AIDS eller ARC som hadde blitt analysert med henblikk på tilstedeværelsen av HBsAG, analysert i anti-HIV env peptider/HBsAG- og HIV-utstyret. Resultatene (tabell III) viser fullstendig overenstemmelse mellom testresultater og HIV- og HBsAG-testutstyr. Anti-HIV env peptid/HBsAG-analysen detekterte alle prøver som positive som inneholdt HBsAG alene, antistoffer til HIV alene, eller begge deler.

Sensitivitet for HBsAG

Fortynninger av HBsAG-standarder inneholdende en kjent mengde HBsAG ble analysert i anti-HIV env peptid/HBsAG ELISA og sammenlignet med HBsAG ELISA-metoder nr. I og II. Resultatene fra dette studium (tabell IV) viser at nevnte anti-HIV env peptid/HBsAG ELISA var like sensitiv som referanse-metodene for detektering av kjente mengder av HBsAG fra standarder av subtyper ad og ay. HBsAG ELISA-metode nr. II var i stand til å detektere en fortynning til av ad- og ay-standarden eller mindre enn 1 nanogram av sensitivitet sammenlignet med HBsAG ELISA-metode nr. 1.

Diskusjon

Det fremgår at det som tilveiebringes ved foreliggende oppfinnelse er en ELISA som samtidig kan detektere prøver med enten antistoff til HIV- eller HBV-overflateantigen. Antistoffet til HIV ble detektert med syntetiske oligopeptider benyttet som antigen i steden for HIV-vlrale lysater. En sandwich-peptidanalyse ble etablert når det bivalente humane HIV-antistoffet på den faste fasen ble inkubert med biotinylert peptid env etter primærreaksjonen med sera. Det bundne biotinylerte peptidet ble deretter detektert ved hjelp av et streptavidin-biotin-HRPO-kompleks. Denne ELISA har sammenlignbar sensitivitet med kommersielle metoder for detektering av antistoff til HIV. Et komplemen-

Tabell IV

Sensitivitet for anti-HIV env/HBsAG analysen sammenlignet med HBsAG ELISA-metoder nr. I og II. Individuelle prøver av Abbott HBsAG-standarden ble analysert i de tre metodene. Grenseverdien for anti-HIV env/HBsAG-analysen var 0,100.

Claims

1. Analysesystem for detektering av om noen av HBsAG- og HIV-antistoff ene er tilstede eller ikke i en mistenkt fluid, karakterisert ved at det innbefatter: en første reagens omfattende (a) fast overflate hvortil det er bundet et eller flere peptider som har en epitop som kan bindes til en paratop av et HIV-antistoff; og (b) en fast overflate hvortil det er bundet et antistoff som er spesifikt for HBsAG; og en annen reagens omfattende (c) et eller flere merkede peptider som har en epitop som kan bindes til en paratop av et HIV-antistoff; og (d) merket antistoff som er spesifikt for HBsAG; hvor nevnte mistenkte fluid kan bringes i kontakt med nevnte første reagens, ubundet materiale kan vaskes fra nevnte faste overflater, de faste overflatene kan bringes i kontakt med den andre reagensen og igjen vaskes, og nevnte merkinger kan benyttes for å detektere tilstedeværelsen eller fraværet av både HBsAG- eller HIV-antistoffer.

2. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte peptider innbefatter en sekvens valgt fra gruppen bestående av:

De antigeniske og immunologiske fragmenter og diagnostisk akseptable salter derav.

3. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

4. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

5. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

6. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

7. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

8. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

9. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

10. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

11. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

12. Analysesystem Ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

13. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

14. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

15. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

16. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

17. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at et av nevnte peptider har formelen:

18. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at en eller begge av nevnte reagenser omfatter en blanding av nevnte peptider idet blandingen omfatter to eller flere peptider inneholdende aminosyrerestsekvenser som er homologe til deler av HIV pg 41-proteinsekvensen, hvor i hver nevnte blanding: et første av nevnte peptider omfatter delen av HIV gp 41-proteinsekvensen CSGKLIC; og et annet av nevnte peptider omfatter sekvensen ZLLGXWZ <*> ; hvor X er valgt fra gruppen bestående av I, L, M eller F; Z er valgt fra amlnosyrerestsekvensen i HIV gp 41-proteinet umiddelbart tilstøtende til aminosiden i L-leucinresten i stilling 599 i gp 41-proteinet; Z' er valgt fra amlnosyrerestsekvensen 1 HIV gp 41-proteinet umiddelbart tilstøtende til karboksylsiden i L-tryptofanresten i stillinger 603 i gp 41-proteinet; idet en av Z og Z' kan ha en lengde på null rester; og Idet Z og Z' sammen omfatter idet minste ti rester.

19. Analysesystem ifølge krav 18, karakterisert ved at nevnte første peptid er valgt fra gruppen bestående av:

idet nevnte andre peptid er valgt fra gruppen bestående av:

20. Analysesystem ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte første peptid består av:

at nevnte andre peptid består av

21. Analysesystem ifølge krav 20, karakterisert v e d at X er I.

22. Analysesystem ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte første peptid består av:

at nevnte andre peptid består av

23. Analysesystem ifølge krav 22, karakterisert ved at X er I.

24. Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte faste overflate omfatter partikler av plast, kiselholdige partikler eller polysakkaridpartikler.

25... Analysesystem ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte overflater til (a) og (b) begge omfatter veggene i en enkelt brønn i en mikrotiterplate.

26. Analysesystem Ifølge krav 25, karakterisert ved at det innbefatter en mikrotiterplate som har flere av nevnte enkeltbrønner.

27. Fremgangsmåten for detektering av om noen av HBsAG- og HIV-antistoffene er tilstede eller ikke i en mistenkt fluid, karakterisert ved trinnene: (a) tilveiebringelse av et første reagens omfattende en fast overflate hvortil det er bundet et eller flere peptider som har en epitop som kan bindes til en paratop i et HIV-antistoff og en fast overflate hvortil det er bundet et monoklonalt antistoff som er spesifikt for HBsAg; (b) anbringelse av nevnte første reagens i kontakt med det mistenkte fluid i et tilstrekkelig tidsrom til å tillate at det oppstår en immunologisk reaksjon; (c) detektering av tilstedeværelsen av HBsAG- eller HIV-antlstoffer bundet til nevnte faste overflater.

28. Fremgangsmåten ifølge krav 27, karakterisert ved at den ytterligere omfatter: Tilveiebringelse av en annen reagens omfattende merket peptid som har en epitop som kan bindes til en paratop i et HIV-antistoff og merket antistoff spesifikt for HBsAG; og hvor trinnet (c) for detektering av tilstedeværelsen av HBsAG- eller HIV-antistoffer bundet til nevnte faste overflater foretas ved vasking av de faste overflatene frie for ubundet materiale etter trinn (b); anbringelse av de vaskede faste overflater i kontakt med nevnte andre reagens; vasking av nevnte faste overflater, som er brakt I kontakt med nevnte andre reagens, frie for ubundet materiale; og utvikling av merkingen som et tegn på tilstedeværelsen av HBsAG- eller HIV-antistoffene.

29. Fremgangsmåten ifølge krav 27, karakterisert ved at nevnte et eller flere peptider omfatter:

30. Fremgangsmåte Ifølge krav 27, karakterisert ved at nevnte et eller flere peptider omfatter en blanding av peptider; nevnte blanding omfatter to eller flere peptider inneholdende aminosyrerestsekvenser som er homologe til deler av HIV pg 41-proteinsekvensen, hvori i hver nevnte blanding: et første av nevnte peptider omfatter delen av HIV gp 41-proteinsekvensen CSGKLIC; og et annet av nevnte peptider omfatter sekvensen ZLLGXWZ'; hvor X er valgt fra gruppen bestående av I, L, M eller F; Z er valgt fra amlnosyrerestsekvensen 1 HIV gp 41-proteinet umiddelbart tilstøtende til aminosiden i L-leucinresten i stilling 599 i gp 41-proteinet; Z' er valgt fra amlnosyrerestsekvensen 1 HIV gp 41-proteinet umiddelbart tilstøtende til karboksylsiden i L-tryptofanresten i stillinger 603 i gp 41-proteinet; idet en av Z og Z' kan ha en lengde på null rester; og idet Z og Z' sammen omfatter minst ti rester.

31. Fremgangsmåten ifølge krav 30, karakterisert ved at nevnte første peptid er valgt fra gruppen bestående av:

at nevnte andre peptid er valgt fra gruppen bestående av:

32. Fremgangsmåten følge krav 31, karakterisert ved at nevnte første peptid består av:

at nevnte andre peptid består av

33. Fremgangsmåten ifølge krav 32, karakterisert v e d at X er I.

34. Fremgangsmåten ifølge krav 31, karakterisert ved at nevnte første peptid består av:

at nevnte andre peptid består av

35. Fremgangsmåten ifølge krav 34, karakterisert ved at X er I. Nve Patentkrav

1. Analysesystem for detektering av om noen av HBsAG- og HIV-antistoffene er tilstede eller ikke i en mistenkt fluid, karakterisert ved at det innbefatter: en første reagens omfattende (a) fast overflate hvortil det er bundet et eller flere peptider som har en epitop som kan bindes til en paratop av et HIV-antistoff; og (b) en fast overflate hvortil det er bundet et antistoff som er spesifikt for HBsAG; og en annen reagens omfattende (c) et eller flere merkede peptider som har en epitop som kan bindes til en paratop av et HIV-antistoff; og (d) merket antistoff som er spesifikt for HBsAG; hvor nevnte mistenkte fluid kan bringes i kontakt med nevnte første reagens, ubundet materiale kan vaskes fra nevnte faste overflater, de faste overflatene kan bringes i kontakt med den andre reagensen og igjen vaskes, og nevnte merkinger kan benyttes for å detektere tilstedeværelsen eller fraværet av både HBsAG- eller HIV-antistoffer.