WO2005003343A1

WO2005003343A1 - 新規微生物、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ並びにその製造方法

Info

Publication number: WO2005003343A1
Application number: PCT/JP2004/009606
Authority: WO
Inventors: Yuko Hidaka; Yuji Hatada; Susumu Ito; Koki Horikoshi; Masahiro Yoshida; Nobuyuki Nakamura; Masayasu Takada; Teruo Nakakuki
Original assignee: Independent Administrative Institution, Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology; Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd.
Priority date: 2003-07-04
Filing date: 2004-06-30
Publication date: 2005-01-13
Also published as: CN1816623B; JP4336897B2; JPWO2005003343A1; CN1816623A

Abstract

　本発明は、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有する新規なパエニバチルス属微生物、およびマルトースのみに作用し、マルトース中のα−１，４−グルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解する新規なマルトースホスホリラーゼ、並びにトレハロースのみに作用し、トレハロース中のα−１，４−グルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解する新規なトレハロースホスホリラーゼ、並びにこれらの酵素の製造方法を提供する。　この酵素は、従来の方法に比較し酵素の取得が容易であり、培養時間も大幅に短縮することができ、かつ、高い温度安定性を有し、両者がほぼ同じ最適ｐＨ範囲を有している。

Description

明細書 ifi見微生物、マル卜ースホスホリラーゼおよび卜レ八ロースホスホリラーゼ並びにその製造方法技術分野

本発明は、新ΐよ微生物、新規な酵素及び新規な酵素の製造方法に関する。更に詳しくは、トレ八ロースを酵素的に生産する場合に必要なマル卜ースホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼの生産能を有するパェニバチルス（Paen i bad 1 1 us) 属に属する新規微生物、この微生物から得られる新規なマル卜ースホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼ、これらの酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子、並びにこれら酵素の製造方法に関するものである。

背景技術

卜レハロースは、医薬品、ィ bffi品、食品などに広い用途が期待され、従来から工業生産するための多くの試みがなされてきた。これらの技術は大別して次の三つにすることができる。その一つはトレ八ロースを菌体内に蓄積する性質を有する微生物から該物質を抽出精製する方法である（例えば、 J. Am. Chem. Soc. 7 2巻， .2 0 5 9頁， 1 9 5 0年、ドイツ特許第 2 6 6 5 8 4号公報、特開平 3— 1 3 0 0 8 4号公報、特開平 5 — 9 1 8 9 0号公報、特開平 5— 1 8 4 3 5 3号公報およ ζ ^寺開平 5— 2 9 2 9 8 6号公報を参照)。この方法は、微生物の培養工程、分離工程、微生物からの卜レハロースの抽出工程、抽出したトレ八ロースの精製結晶化工程から構成されており、トレハロースの製造工程が非常に複雑である。しかも、トレ八ロースの性が低いばかりでなぐ多量の微生物抽出残査が廃難として発生するため、経効率の良い方法とは言えなかつた。

また、卜レハロースを菌体外に生産する微生物として、ブレビパクテリゥ厶

(Brevibacterium)属ゃコリネバクテリウ厶 (Corynebacterium) 属等の微生物を培養してトレ八ロースを生産させる発酵法が開発されている（例えば、特開平 5— 2 1 1 88 2号公報参照）。しかしながら、この方法においても卜レハロースの培地中の蓄積率は約 3% (w/v) と低いため、卜レハロースを工業的に大量生産するためには大容量の発酵槽とそれに見合う規模の精製設備が必要であり経済的に問題がある。しかも、この方法においても精製した卜レハロースを得るためには除菌操作が必要とされるばかリでなく、 ±咅養時に使用菌株が生産する夾雑物あるいは培地成分等の除去に煩雑な工程が必要である。、

—方、これら発酵法の種々の問題点を解決する方法として酵素法が開発されている。即ち、微生物由来のマル卜一スホスホリラーゼ（maltose:orthophosphate β -D-glucosyl transferase) と藻類由来の卜レハロースホスホリラーゼ（ α， -treha!ose:orthophosphate 3 -D-glucosyl transferase) をリン酸存在下でマル I— スに作用させてトレハロースを生産する方法（例えば、特許第 1 51 351 7号公報、 Agric. Biol. Chem,， 49巻， 2 1 1 3頁， 1 985年を参照）、および細菌由来のシュ一クローズホスホリラーセ (sucrose: orthophosphate α-D-glucosy I transferase;と担子囷由来の卜レノヽロースホスホリラ一ゼ ( α， a -treha!ose:orthophosphate a -D-glucosyl transferase) をリン酸存在下で蔗糖に作用させて卜レ八ロースを得る方法（例えば、平成 6年度日本農芸化学会大会講演要旨集 3 R a 1 4を参照）とが報告されている。これらの方法によればマル! ^一スあるいは蔗糖から 6 0〜 7 0 %の高い収率でトレ八ロースが生成することができる。また、原料として精製された高縮の糖質を使用することから、酵素反応により得られるトレ八ロースの精製も容易であり、他の方法に i:tlSして工業的に有利な方法であると考えられている。しかしながら、これらの方法においても使用される酵素、特に、卜レハロースホスホリラ一ゼの供給源がユーグレナやマイタケなどのように藻類や担子菌と tゝう非常に限られたものであリ、安定して酵素を生産するためには経済的な問題ばかりでなく技術的にも困難な点があった。しかも、得られるトレ八ロースホスホリラーゼゃこれに組み合わせて用いられるシユークロ —ズホスホリラーゼゃマル卜ースホスホリラーゼはそれぞれの酵素の至適 p H領域が大きく異なっており、また、温度に対する安定性も非常に低く、卜レハロースの生成反応は 2 5〜3 7 °C程度の低温下でしか行えなかった。このことは、 2種類の酵素を組み合わせて使用する際の P H管理が非常に困難であるばかりでなぐが低いため解放型の反応槽を用いて行われる酵素反応時に雑菌汚染が起こることを示唆しておリ、これによる副次的な反応を防止するために厳密な衛生管理を必要とする等の問題点を有している。さらには、これら公知の酵素を組み合わせて用いる場合、これらの酵素の有する基質離依存性の為に高の原料が使用出来なかった。この為、これらの方法も経済的に効率の良い方法とは言えなかった。

更に ¾^解物を基質として、トレハロースを得る方法が報告されている。この方法によれば、嫩分解物に末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成させるマル卜オリゴシル卜レハロース生成酵素と、この非還元性糖質から特異的に卜レハロースを遊離する卜レハロース遊離酵素を作用させ、 ^^から 8 0 %の高い収率で卜レハロースが生成する（例えば、特開平 7— 1 4 3 8 7 6号公報、欧州特許出願 6 2 8 6 3 0 A 2号明細書、日本農芸化学会講演要旨集、 p 3 1 ( 1 9 9 5 ) 参照）。しかしながら、本方法では;屏漱を基質としているため、当該酵素を固定ィ匕して基質を通液することが困難であり、リアクタ一などの更なる製造の簡匕及び効率化が困難であった。更に、卜レハロースを結晶化した後に得られる分蜜液の再糖ィ匕プロセスの構築も困難であった。以上のことから、その製造および精製が容易で、かつ高い熱安定性を有し、依存性が無い新たなマル卜ースホスホリラーゼおよび卜レ八ロースホスホリラーゼを見出すことができれば、容易に且つ大量に入手できるマル卜一スを原料として高収率でしかも容易に且つ効率よく卜レ八ロースを製造することが期待できる。

そこで、本発明の第一の目的は、上記のような従来の技術の種々の問題点を解決し、これらの種々の要求を満足する新規な酵素であるマル卜ースホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼを高い生産効率で生成し得る新規微生物を提供することにある。本発 TO第二の目的は、製造および精製が容易で、高い熱安定性を有し、基質濃度依存性が無い新たなマル卜ースホスホリラーゼおよび卜レ八ロースホスホリラーゼを提供することにある。さらに本発明の第三の目的は、上記微生物を用いて、上記の 2 種類の酵素を容易に且つ高い収率で得ることができるマルトースホスホリラーゼおよび/または卜レ八ロースホスホリラーゼの製造方去を提 ί共することにある。発明の開示

本発明者らは、工業的生産に使用するためのマル卜ースホスホリラ一ゼおよび卜レ八ロースホスホリラーゼが具備すべき、上述の諸性質を有する酵素を生産する能力を持つ微生物を得るべく広く天觸を検索した。その結果、ノ \°ェニバチルス (Paen i bac i l l us) に属する微生物が上記要件を備えた両酵素を著量生産することを見出し、本発明を完成せしめたものである。

即ち、本発明は、以下に記載した内容をその要旨とする発明である。

(1)本発明は、マソレ卜ースホスホリラーゼぉよびトレハロースホスホリラ一ゼ生産能を有するノ \°ェニバチルス属微生物を提供するものであり、具体的には、例えば、寄託番号 F E R BP— 8420のパェニバチルスエスピー S H— 55 (Paenib acillus sp. SH-55) を提供するものである。

(2) また、本発明は、以下に示す理化学的性質を有するマルトースホスホリラ一ゼを提供するものである。

(ィ）作用：マル卜一ス中の a— 1， 4—ダルコビラノシド結合を可逆的に加リン酸分解し、グルコースと i8-D—グルコース 1—リン酸を生成する。

(口）基質特異性（分解反応）：マル卜—スに作用し、卜レ八ロース、シユークロース、ラク卜ース、セロビオースなどには作用しない。

(ハ）作用 PHの範囲、最適 pHおよび安定 pH範囲：作用 pHの範囲は 4. 5〜9. 5である。分解 J¾Sの最適 pHは 7. 0〜8. 0であり、合成反応の最適 pHは 5. 5 〜6. 5である。 50°C、 1 0分間の加熱条件下では pH5. 5〜7. 5の範囲内で安定である。

(二）作用の範囲と最：作用範囲は 20〜60°Cである。 45〜55°C 近傍に分解反応の最適温度を有し、合成反応の最適显度は 50〜55°Cである。

(ホ）安定性： pH 6. 0、 1 5分間の加熱条件下では 50 °Cまで極めて安定である。また、 70°Cで完全に失活する。

(へ）阻害剤：銅、水銀、 N—プロモサクシニイミド、卫—クロロマーキユリ安息香酸 (各々 1 mM)、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（1 %) で阻害される。 (卜）等電, ： pH4. 8〜5. 0の範囲にある。

(チ） SDS—ポリアクリソレアミド電気泳動法による分子量は約 89, 000〜90， 000ダル卜ン、ゲル法による分子量は約 1 90， 000夕つレ卜ンであリ、ホモ 2量体から構成されている。

(3) また、本発明は、配列番号 "iで示されるアミノ酸配列、またはこの配列中の 1 個もしくは複数アミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する、前記（ 2 )に記載のマルトースホスホリラーゼを提供するものである。

(4) また、本発明は、配列番号 1で示されるアミノ酸配列と 52%以上、好ましくは 70%以上、更に好ましくは 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、前記（2)に記載のマル卜ースホスホリラーゼを提供するものである。

(5) また、本発明は、前言己 (2) に記載のマソレ卜一スホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、下記の（a)〜 (c) からなる群、

( a )配列表の配列番号 1に示すァミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド、

(b) 配列表の配列番号 1に示すアミノ酸配列中の Ί個もしくは複数個のアミノ^^ 欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ —ドするポリヌクレオチド、および

( c ) 配列表の配列番号 2に示すヌクレ才チド配列を有するポリヌクレ才チド、より選ばれたポリヌクレオチドのいずれかを提供するものである。

(6) また、本発明は、前記（5) に記載のポリヌクレオチドを有する組換えべクタ一および該組換えべクタ一によリ形質転換された微生物を樹共するものである。 (7) 更に、本発明は、以下に示す理化学的性質を有するトレ八ロースホスホリラーゼを提供するものである。

(ィ）作用：卜レハロース中の (¾— 1， 1—ダルコビラノシド結合を可逆的に加リン酸分解し、グルコースおよび /8 - D—ダルコース 1ーリン酸を生成する。

(口）基質特異性（分解反応）：卜レハロースに作用し、マルトース、シユークロース，ラク卜ース、セロビオースなどに作用しない。

(ハ）作用 pHの範囲、最適 pHおよび安定 pH範囲：作用 pHの範囲は 4· 5〜9. 5である。分解 J¾Sの最適 p Hは 7 · 0-8. 0であり、合成反応の最適 p Hは 5 · 8 〜7. 8である。 50°C、 1 0分間の加熱条件下では ρΗ5. 5〜9· 5の範囲内で安定である。

(二）作用の範囲と最：作用範囲は 25〜了 0。Cである。 50〜 65 °C 近傍に分解反応の最適温度を有し、合成反応の最適温度は 45〜60°Cである。

(ホ）温度に対する安定性： H7. 0、 1 5分間の加熱条件下では 60°Cまで極めて安定である。また、 70°Cで完全に失活する。

(へ） P且害剤：銅、 7k銀、 N—プロモサクシニイミド、卫—クロロマーキユリ安息香酸で阻害される。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（1 %) で阻害されない。

(卜）等電点 ρΗ4· 8〜5· 2の範囲にある。

(チ） S D S—ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は約 89000〜 900 00タレ卜ンであり、ゲ去による分子量は約 1 90, 000タリレ卜ンであり、ホモ 2量体から構成されている。

(8) また、本発明は、配列番号 3で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の 1個もしくは複数アミノ欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を 6

8

有する、前記（ 7 )に記載の卜レ八ロースホスホリラーゼを提供するものである。

(9) また、本発明は、配列番号 3で示されるアミノ酸配列と 63%以上、更には 7 5%以上、好ましくは 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、前記（7) に記載の卜レ八ロースホスホリラーゼを提供するものである。

(1 0) また、本発明は、前記 (7) に記載のトレハロースホスホリラーゼのァミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、下記（d) 〜（f) からなる群、

( d ) 配列表の配列番号 3に示すァミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、

(e) 配列表の配列番号 3に示すアミノ酸配列中の 1個もしくは複数個のァミノ欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および

( f ) 配列表の配列番号 4に示すヌクレ才チド配列を有するポリヌクレ才チド、から選ばれるポリヌクレ才チドのいずれかを提供するものである。

(1 1) また、本発明は、前記 (10) 記載のポリヌクレオチドを有する組換えべク夕一および該$且換えべク夕一によリ形質転換された微生物を撤共するものである。

(1 2) 更に、本発明は、マル卜一スホスホリラ一ゼおよびトレ八ロースホスホリラ —ゼ生産能を有するバエ二バチルス属微生物を培養し、前記（2)若しくは（3) に記載のマルトースホスホリラーゼ、および Zまたは前記 (7) 若しくは（8) に記載のトレ八ロースホスホリラ一ゼの少なくとも一つを生成 ·蓄積させ、これを採取することを特徴とする、マル卜一スホスホリラ一ゼ若しくはトレ八ロースホスホリラーゼまたは両者の混合物の製造方法を提供するものである。

(1 3) また、本発明は、前記培養を、マルトースを含む炭素源の存在下で行い、マ 4009606

9 ル卜ースホスホリラーゼおよび卜レ八ロースホスホリラーゼを生成 ·蓄積させることを特徴とする、前記（1 2) に記載のマルトースホスホリラーゼまたはマルトースホスホリラーゼと卜レ八ロースホスホリラーゼの混合物の製造方法を提供するものである。

(14) また、本発明は、前記培養を、トレハロースを含む炭素源の存在下で行い、トレ八ロースホスホリラ-ゼを優先的に生成 '蓄積させる、前記（1 2) に記載の卜レハロースホスホリラーゼまたはマルトースホスホリラーゼと卜レノヽロースホスホリラーゼの混合物の製造方法を提供するものである。

(1 5) また、本発明は、次の（i)乃至（iii)のいずれかの方法から選ばれるマルトースホスホリラ一ゼおよび/または卜レ八ロースホスホリラーゼの粗酵素の製造方法であ。

(i) マル I スホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼ生産能を有するバエ二バチルス属微生物を培養し、得られた培養液から分離した菌体をそのままの採取する、

(ii) マル I ^一スホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼ生産能を有するパェニバチルス属微生物を培養し、得られた培養液から分離した菌体からマルトースホスホリラーゼおよび/または卜レ八ロースホスホリラーゼ粗酵素を抽出する、または、

(iii) マル卜一スホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼ生産能を有するパェ： zバチルス属微生物を培養し、得られた培養後の培養液から菌体を分離し、培養上清液を採取する。

(1 6)更に、本発明は、燐酸の存在下で、前記（2) または (3) に記載のマルトースホスホリラーゼ、および前記（7) または（8) に記載のトレ八ロースホスホリラ一ゼをマルト一スに作用させることを特徴とするトレハロースの製造方法を提供するものである。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の酵素を生産する微生物であるバエ二バチルスエスピー S H— 5 5の分類学的位置を示す図である。

図 2は、本発明のマル卜一スホスホリラ一ゼと卜レ八ロースホスホリラーゼの S D S一ポリアクリルアミド電気泳動法による分析の結果を示す図である。

図 3は、本発明のマル卜ースホスホリラーゼと卜レ八ロースホスホリラーゼの分解反応（白丸）と合成 J¾¾ (黒丸）の廳 p Hと作用 p H範囲を示す図である。

図 4は、本発明のマルトースホスホリラ一ゼ (白丸) と卜レハロースホスホリラーゼ（黒丸）の酵素活性と p Hの関係を示す図である。

図 5は、本発明のマリレ卜一スホスホリラーゼ (A) と卜レハロースホスホリラ一ゼ

( B) の分解 J¾5 (白丸）と合成反応（黒丸）の酵素活性と作用の関係を示す図 'あ。

図 6は、本発明のマル卜一スホスホリラ一ゼ (白丸) とトレ八ロースホスホリラーゼ（黒丸）の耐熱性を示す図である。 JP2004/009606

11

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明について更に詳しく説明する。

本発明者らは、工業的生産に使用可能なことを目的として、その製造と精製が容易で、作用温度が ]±¾的高ぐ高い熱安定性を有し、かつ基質依存性のないマル卜ースホスホリラーゼおよび卜レ八ロースホスホリラーゼを生産する能力を持つ微生物を得るべく広く天然界を検索し、その結果、パェニバチルス (Paeni bacillus)に属する新規微生物が上記要件を備えた二つの酵素を著量生産することを見出した。

即ち、本発明の新規菌株は、本発明者等により、海洋研究開発機構が保有する紫毎探査潜水艇「深海 2000」を用いて、相模湾初島南東沖、 7l深 1 1 74mの海底泥から新たに単離されたものである。

このような本発明のパェニバチルスに属する新規な微生物の一例として、バエニバチルスエスピー SH-55 (Paenibacillus sp. SH-55) が挙げられる。以下にパェニバチルスエスピー S H— 55の菌学的諸性質を以下に示す。

<形態的性質 >

細胞の形態：桿菌

細胞の大きさ：（0, 7〜0. 9 x2. 0〜4· 0 tm)

運動性：有り

鞭毛：有り（極鞭毛）

胞子形成：有り

<生育状態 >

コロニーの形態：不規則で周辺はやや波状である。光沢があリクリ一厶色 (無均一）をしている。

生育温度： 1 5〜4 5 °Cで生育する。 5 0 °Cで生育しない。

食塩濃度： 5 %の食塩で生育する。 7 %以上の食塩で生育しない。

嫌気での生育性：生育しない。

理学的性質 >

グラム ¾fe性：陰性

O - Fテスト（グルコース）： P倉性。グルコースから酸とガスを生成しない。カタラーゼテス卜：陽性。

ォキシダーゼテス卜：陽性。

ゼラチン分解能：陰！^

カゼイン分解能：陽性。

デンプン分解能：腸性。

馬尿酸塩分解能；陰性

O N P Gテス卜：陽性。

ゥレアーゼ産生：陽性。

オル二チンデカルポキシラーゼ産生： P倉性。

リシンデカルボキシラーゼ産生：陰性。

硫ィ Μ素生産：陰性。

インドーリ産：陰性。

硝離還元能：陰性。

硫ィ素産生：陰性。

ァセ卜イン産生 (V Pテス卜）： P倉性。資化性：グリセロール、 L—ァラビノース、リボース、 D—キシロース、ガラク卜ース、グルコース、フラク I ^一ス、マンノース、マンニ! ^一ル、アルブチン、エスクリン、サリシン、 N—ァセチルダルコサミン、ラク卜ース、メリビオー X、卜レハロース、シユークロース、セロビオース、マリレ! ^一ス、ラフイノース、デンプン、グリコーゲンの資ィヒ 1生が有る。また、この本発明菌の 1 6 S r DNA配列を CLUSTAL X Mu i t i p I e Seq u e n c e A I i g nme n t P r og r am (ve r s i o n 1.81 ) 用いて学的位置を解析した。解析した結果を n e i g h b o r - j o i n i n g¾ に基づき記載した系統樹を図 1に示す。この結果から、本発明菌は、 ^1的に ( ェニバチルスダルカノリテイクス（Paenibacillusglucanolyticus)に近い位置にあるが、明らかに系統樹において異なった分岐に存在する。従って、パェニバチルス

(PaenibaciNus) 属の新種であると判断した。そして、これをパェニバチルスエスピー SH-55 (PaenibaciNus sp. SH-55) と命名し、平成 1 5年 (2003 年） 6月 27日に、独立行去業技術総合研究鹏許生物寄託センター（郵便番号 305-8566、日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に寄託番号 FERM BP— 8420として国際寄託した。本発明の新菌株は次のようにしてスクリーニングした。まず、採取した海底泥を生理食塩水に懸濁し、該懸濁液 Ί滴を以下の組成の寒天培地に塗沬した。使用した寒天平板培地は、寒天 2% (w/v), 卜レハロースまたはマルトース 1 %、ポリペプトン 0. 5 %、酵母エキス 0. 5 %、リン酸ニ力リウ厶 0. 1 %,硫酸マグネシウム■七 7jd 0. 0 2 %を含有し、 p Hは 7である。かくして、寒天平板培地を 3 7 °Cにて好気的に培養し、平板上に現れた各コロニーを得、各々のコロニーを上記の寒天培地に用いたものと同一の組成の液体培地中（ p H 7 )で 3 7 °Cにて 2 4〜 7 2時間、 1 8 0 r p mで振盪培養した。次いで、各培養液を 1 2 , 0 0 0 且にて1 0分間、 4 °Cで遠心分離し菌体と上澄液に分離した。かくして得られた菌体を少量の 0 , 1 Mリン酸緩衝夜 ( p H 7. 0 ) に懸濁させ、鍵する方法で活性を測定した。その結果、上記の菌学的識寺性を有する菌株を分離することができた。

このようにして見出された本発明の新規な微生物であるノ \°工ニバチルス属に属する微生物は、マル卜一スホスホリラーゼおよびトレ八ロースホスホリラーゼを生産する新ま ¾菌である。

この本発明の新規な微生物から本発明の酵素である前記のマル卜ースホスホリラーゼおよび卜レ八ロースホスホリラーゼを得るには、例えばこの微生物を常法に従って適当な培地に接種して培養し、次いで培養物中から回収すればよい。培養条件は、微生物自体の生育^ J の観点から 2 5〜4 2 °Cの^ J 範囲が好ましく、 8〜7 0時間好気的に培養することが'好ましい。

本発明の酵素を得るための微生物の培養に用いる培地は、以下に示すものに特に制限されるものではなく、微生物が生育でき、本発明の酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合離地および天然培地のいずれでもよい。

培地は、その炭素源としては、この微生物が資化しうる物であればよく、例えば、グリレコース、フラク I ^一ス、マンノース、卜レハロース、シュクロース、マンニ卜一ル、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クェン酸、コ八ク酸などの有機酸もすることができるが、卜レハロースやマルトースおよびこれらを含有する糖質を用いることが好ましい。炭素源として卜レ八ロースもしくは該物質を含有する糖質を用いると、本発明の微生物はトレ八ロースホスホリラ一ゼを優先的に生産する。また、マル卜ースもしくは該物質を含有する糖質を炭素源として用いると、本発明の微生物はマル卜一スホスホリラーゼおよび卜レ八ロースホスホリラ一ゼを同時に生産する。さらに、炭素源として卜レハロースとマルトースの両者又はこれらの物質を含有する糖質を用いると、卜レハロースホスホリラ一ゼとマルトースホスホリラーゼとを同時に生産させることができ、卜レノヽロースとマルトースの量を制御することによって、卜レハロースホスホリラーゼとマル卜ースホスホリラーゼの生成割合をコン卜ロールすることもできる。

窒素源としては、各種有機および無機の窒素化勿、さらに培地は各種の無を含むことができる。窒素源としては、例えば、コーンスチ一プリカ一、大豆粕、あるいは各種ペプトン類等の有機窒素源、そして硫安、硝安、燐安、尿素等の無機窒素源などの一般に微生物の培養に用、られている化合物が使用可能である。尿素や有機窒素源が炭素源にもなることはいうまでもない。

また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン艦、マンガン塩、 Sift塩、鉄塩、同塩、モリブデン塩、コノレト塩などが適宜用いられる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いられる。

本発明の酵素を得るための微生物の培養に適した培地としては、具体的には、例えば、卜レハロースホスホリラ一ゼを優先的に生産したい場合には、卜レハロース 0. 5〜 3 % (w/v ), 酵母エキス 0. 5 ~ 2 %、リン酸アンモニゥ厶 0. 1 5 %、尿素 0 · 1〜0. 2 %、食塩 0. 5 ~ 1 . 5 %、リン酸二カリウム 0. 0 5 ~ 0. 3 %、硫酸マグネシゥ厶■ 77]d^0. 01〜0. 05%および炭酸カルシウム 0. 1〜0. 3%を含む pH7. 0〜7. 5の液術咅地を用いることが'適当である。また、マルトースホスホリラ一ゼとトレ八ロースホスホリラーゼを同時に生産する場合には、マルトース 0. 5 〜3% (w/v), ポリペプトン S (日本製薬製） 1 -3%, リン酸アンモニゥ厶 0. 1〜0. 3%、尿素 0. 05〜0. 3%、食塩 0. 5〜1. 5%, リン酸二カリウム 0. 05〜0. 25%、硫酸マグネシウム- 77K1^0. 01〜0. 05%および炭酸カレシゥ厶 0. 1〜0. 3%を含む液 ^±咅地を用いることができる。これらの培地U は限定されるものでは無ぐ炭素源や窒素源などの種類ゃ纖によって適当に変更できる。マルトースを炭素源として用いるとマル卜一スホスホリラ一ゼばかりでなく、卜レハロースホスホリラーゼもあるの量が生産される。従って、卜レハ口一ス生産用の粗酵素 (マルトースホスホリラ一ゼとトレ八ロースホスホリラ一ゼとの混合物）を生産するためには、マルト一スを炭素源として用いる方が経済的である。

培養は、通常、温度 20乃至 45°C、好ましくは 25乃至 42°C、 pH5乃至 9、好ましくは 6乃至 8から選ばれる条件で好気的に行われる。 ±咅養時間は微生物が増殖し始める時間以上の時間であればよく、好ましくは 8時間乃至 70時間である。また、培養液の雜瞧離には特に制限はないが、通常は、 0· 5乃至 2 O p pmが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に,を追加したりすればよい。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。

このようにして、本発明の微生物を培養した後、生成した本発明の酵素であるマル卜一スホスホリラ一ゼとトレ八ロースホスホリラ一ゼを回収する。生成する酵素の大部分は菌体内に蓄積され、一部分は菌体外に蓄積される。そこで、菌体内あるいは菌体外に生成蓄積されたマル卜ースホスホリラ一ゼおよび/または卜レ八ロースホスホ 4 009606

1 7 リラーゼを採取する。本発明の酵素の回収法は、一般の酵素の採取の手段に準じて行うことができる。以下に示す方法に特に限定はされないが、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミリ砕法等の菌体破砕法で得られた菌体破砕物、あるいは培養物を遠心分離、ろ過等の操作によつて菌体と培養上清に分離することで得られた培養上 ί青を、粗酵素液として用いることができる。

この粗酵素液は、そのままで使用することもできるが、必要に応じて、例えば塩析法、沈驟去、限外 ;1®去等の分離手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、

P及着クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー、逆相クロマ卜グラフィ一等の公知の方法を組み合わせて、更に分離精製したものも使用することができる。また、本発明の酵素を得るための別の方法としては、上記の本発明の菌株から本発明の酵素をコ一ドする遺伝子を取り出した後、遺伝子工学技術を用、て組換え微生物を作製し、当該組換え微生物を培養する方法が挙げられる。具体的には、本発明の酵素のアミノ酸配列コードするヌクレオチド配列を上記菌株より取得し、次いでこのヌクレオチド配列を適当なベクターに組込み、更に、このベクターにより大腸菌ゃ枯草菌等の宿主を形質転換し、これを培養して本発明の酵素を産生させ、培養物より本発明の酵素を探取すれば'よい。

以下に具体的な遺伝子工学技術を用いた本発明の酵素の製造方法について説明する。本発明の両酵素、即ちマル卜ースホスホリラーゼと卜レハロースホスホリラーゼは、それぞれ配列表の配列番号 1と 3で示されるアミノ酸配列、または、それぞれこれらの配列中の 1個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリべプチドであるから、これらに対応したヌクレ才チド配列を使用することが必要である。

本発明の酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の例としては、マル卜ースホスホリラーゼの場合には、具体的に下記（a)〜（c ) からなる群より選ばれるポリヌクレ才チドが挙げられる。

( a) 配列表の配列番号 1に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、

( b) 配列表の配列番号 Ίに示すアミノ酸配列中の 1個もしくは複数個のアミノ欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ —ドするポリヌクレオチド、

( c ) 配列表の配列番号 2に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。また、本翻の酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の例として、卜レハロースホスホリラーゼの場合には、具体的に下記 (d )〜 ( f ) からなる群より選ばれるポリヌクレ才チドが挙げられる。

( d ) 配列表の配列番号 3に示すアミノ酸配列を有するポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、

( e ) 配列表の配列番号 3に示すアミノ酸配列中の 1個もしくは複数個のアミノ^^ 欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、

( f ) 配列表の配列番号 4に示すヌクレ才チド配列を有するポリヌクレオチド。本発明の酵素を生産する組換え微生物の作製は、公知の手段を組み合わせることに P T/JP2004/009606

19 より行うことができる。すなわち、例えば、上言ェニバチルスエスピー S H— 5 5から本発明の酵素をコードするヌクレ才チド配列の取得やその増幅、ベクターへのヌクレオチド配列の挿入、当 l¾S伝子による宿主の形質転換等は、この分野の成書に記載された方法を適宜利用することにより行われる。このうち、組換え微生物の製去の一例としては、特に限定はされないが、次に示す方法を用いることができる。即ち

、バエ二バチルスエスピー 5 1"1—5 5から、ショットガンクローニング、あるいは特定のプライマ一を用いた P C R増幅等によって、該当する 2つの酵素遺伝子を取得する。これらの遺伝子を、 E K系の大腸菌 (Escher i ch i a co l i ) 等に代表されるグラ厶陰性菌、あるいは B S系の枯草菌 (Bac i l l us subt i l i s)等に代表されるグラム陽性菌に導入して、組換え体を取得する。形質転換にはプラスミド等の核外遺伝子をべク夕一にして利用、あるいは宿主菌本来有している D N A取り込み能力等を利用するする方法も用いることができる。

以上に述べたように本発明のバエ二バチルス属微生物または本発明の酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子を組み込んだ組換え微生物を培養し、その培諭から回収することによって、本発明の酵素を得ることができる。本発明の酵素である前述のマル卜ースホスホリラーゼと卜レ八ロースホスホリラーゼは、既に述べたように、これらの培養蘭体内又は菌体外の培養上清中に蓄積するので、常法にょリ単離して取得することができる。まず、菌体内の酵素は、菌体ごと粗酵素として用いることができる。さらに、菌体から酵素を抽出することで粗酵素を回収することもできる。また、菌体外の培養上清中にも酵素は含まれており、菌体を分離した残りの培養液を粗酵素含有液として利用することもできる。さらに、これらの粗酵素は、エタノール、アセトン、イソプロパノによる溶媒沈殿去、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ一等の通常の方法を用いて精製することができる。さらに、マル卜一スホスホリラーゼとトレ八ロースホスホリラーゼとの分離は、例えば、両酵素の等電点の違いを禾リ用して陰イオン交換クロマトグラフィーなどによって可能である。

このようにして得られる本発明の酵素は、後述の実施例にお tゝて詳細に説明するように既に述べたような理化学的性質を有する亲形1よ酵素であるマリレ卜ースホスホリラ一ゼ及び卜レハロースホスホリラーゼである。

これらの酵素の活性の測定は、本発明のパェニバチルスエスピー S H— 5 5がマル I ^一スゃ卜レ八ロースを加水分解する α—ダルコシダーゼ (マルターゼ)、ダルコアミラ一ゼ、卜レノヽラーゼ等を生産しないので、加リン酸分解の場合の活性の測定には、それぞれマル卜一スあるいはトレ八ロースを基質とし、リン赚存在下で酵素 J¾S させて生成するダルコースをダルコース才キシダーゼ法で測定するという簡便法を使うことができる。また、合成反応の場合には、 j8— D—グリレコース 1 -リン酸とグレコ -スの混夜を基質とし、酵素によリ生成する無機リン酸を常法によリ測定することによって求めることができる。

以下に、本発明の酵素の活性測定法について説明する。

(0 分解反応の場合： 5 0 m Mのリン醮夜（ P H 7 ) に溶解させた 2 0 m Mのマル卜一スまたはトレ八ロース溶液 0. 5 m Lに、酵素液 0 . O l m Lを添加し、 5 0 °C で 1 5分間反応させた後、沸騰水浴中で 3分間加熱して酵素反応を止める。氷水中で冷却した後、生成したグルコースをグルコース才キシダ―ゼ法（和光纏工業（株）製、グルコース C— I Iテスト 'ヮコ一）で測定する。ここで、この測定条件下で 1分間に 1 4009606

21

Atmo I eのグルコースを生成する酵素量を 1単位の酵素活性と定義した。

(ii)合成 J¾¾の場合： 70mMのへぺス（HE PES) ί 夜（ρΗ 7， 0) に溶解させた 27mMの) 3— D—グルコース 1 -リン酸 N a塩と同 ^J のグルコースとの混合溶液 0. 1 5mLに、 0. 05mLの酵素液を添カ卩し、 50 °Cで 1 5分間反応させた後、沸騰水浴中で 2分間加熱して酵素活性を止める。ラ中で冷却後、生成した無機リン酸を和光聽工業（株）製ピ一テストヮコ一を用いて測定する。ここで、この測定条件下で 1分間に Ί m 0 I eの無機リン酸を生成する酵素量を Ί単位の酵素活性と定義した。

以上のように、本発明の新規な酵素であるマルトースホスホリラーゼ及びトレ八ロ —スホスホリラーゼは、新規な微生物である本発明のパェニバチルス属微生物 (例えば、パェニバチルスエスピー SH-55 (Paenibaci I lus sp. S H-55) )または本発明の酵素のァミノ酸配列をコ一ドする遺伝子を組み込んだ組換え微生物を培養し、その培養生産物を回収することによって、容易に製造することができる。そして、この二つの本発明の酵素は、それぞれマル卜ース中の α- 1 , 4—ダルコピラノシド結合および卜レハロース中の α— 1， 1一ダルコビラノシド結合を可逆的に加リン^^ 解し、グルコースと) 3— D—グルコース 1—リン酸を生成するという特徴を有する。従って、リン酸の存在下に、マル卜一スにこれらのニゥの酵素を組み合わせて作用させることによって、極めて効率よく卜レハロースを生産することができる。しかも、これらの二つの酵素の作用 ρΗ範囲が 4. 5〜9. 5と広く、かつ二つの酵素の最適 ρΗ範囲が重複しているため酵素反応において非常に取り扱いやすく、また、作用温度範囲が 20-60°Cと比較的高いでの使用が可能であるため、高いでの酵素反応が可能となり、従来の方法に見られたような雑菌汚染の恐れがなくトレ八ロースを生産することができる。そして、原料としてマルトースという容易にかつ大量に入手することができ、さらに精製した高純度のものも使用することができるため、酵素 J¾¾後の生成物中への不純物の混入が少なく、従って生成物の精製が容易で、かつ極めて効率よく卜レハロースを生産することができるという禾リ点も有する。

本発明のこれらの酵素は、それそ' ma酵素又は精製酵素として利用することができる。さらに、両酵素の活性を有する菌体および該菌体を適当な担体に包括、吸着あるいは化学的に結合させた固定化菌体などを卜レ八口一スの製造に使用することができる。さらには、本発明の両酵素は、夫々公知の方法で固定ィ匕させた固定化酵素として使用することもできる。実施例以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。実施例 1 ：

菌体内及び菌体外マルト一スホスホリラーゼの製造及び精製

ノヽ。ェニバチルスエスピー S H— 55 (Paenibacillus sp. SH-55) (FERM BP— 8420)を、マル卜一ス 1 % (w/v), ポリペプトン S (日本製薬製） 2. 5%, リン酸アンモニゥ厶 0. 1 5%、尿素 0. 1 5%、食塩 1 %、リン酸二カリウム 0. 1 %、硫酸マグネシウム · 77]塩 0. 02%および炭酸カルシウム 0. 2%を含む p H7. 0の液術咅地に植菌した。次に、この液咅地を 37 °Cで 24時間好気的に培養した。得られた培養液を 4°Cで 1 2， 000 呈にて1 5分間遠心分離して菌体と上漓夜とに分けた。 T/JP2004/009606

23

ここで得られた菌体は、少量の 20 m Mリン酸誦夜 (pH7. 0 )に懸濁させた後、超音波破壊した。該破砕菌体懸濁液に硫安を加えて 30%飽和とし、 4°Cで一雄置した。次いで、遠心分離をして沈澱物を除いて得られる上清液にさらに硫安を加えて 7 0%飽和とした。更に 4 °Cで一夜放置して生成する沈澱物を遠心分離で集め、 20mM リン酸 « (pH7) に溶解させた後、同緩衝夜で充分に透析した。

次いで、 20mMリン酸謹夜 (pH7)で平衡化した D E A E—フラク卜ゲル（メルク社製）力ラムに酵素を吸着させた。吸着酵素を上記の緩衝夜に含まれる 0 Mから 0. 5 Mの食塩の離勾配法で溶出させた後、 UF膜（アミコン社製、 YM-30)で濃縮した。翥縮酵素を 0. 2 M食塩含有の上述の謹夜で平衡化したセフアクリル S— 30 0 (フアルマシア社製）カラムでゲル精製した。得られたマルト一スホスホリラ一ゼ活性画分を集め、 1 · 5 M硫安を含む同上緩衝夜で透析した後、 1 · 5 M硫安を含む同上灘腋で平衡化したフヱニル' トヨパール（東ソ一社製）カラムに酵素を吸着させた。吸着酵素を同上緩衝液中で 1. 5 Mから 0 Mの硫安の濃度勾配法で溶出させた後、得られたマル卜ースホスホリラーゼ活性画分を集め 0. 2 M食塩を含む同上緩衝夜で透祈した。前述の UF膜を用いて濃縮後、 0. 2 M食塩を含む同上緩衝夜で平衡化したス一パーデックス 200 (フアルマシア社製)を用いて再度ゲル濾過クロマトグラフィーをい、得られたマル卜一スホスホリラーゼ活性画分を前述の方法で濃縮した。

ここで、活性画分とは、ゲル麵クロマトグラフィー等により分離して得た画分であつて、マルトースまたはトレ八ロースを基質にして活性測定を行った場合に活性が認められた画分であリ、それぞれマル卜ースホスホリラーゼ活性画分および卜レハロースホスホリラ一ゼ活性画分のことを意味する。即ち、マル卜一スまたはトレ八ロースに対する活性が'みとめられるときは、 DEAE—フラク卜ゲルカラムを用いた場合、食塩濃度 P T/JP2004/009606

24

0. 3 M付近にマルトースホスホリラ一ゼ活性画分があり、 0. 35 M付に卜レズ、口ースホスホリラーゼ活性画分がある。

その結果、蘭体内酵素として、ポリアクリルアミドゲルスラブ電気泳動法並びに SD S—ポリァクリルアミド電気泳動法において均一なマル卜ースホスホリラーゼ（活性収率約 30%) を得た。また、菌体外酵素についても培養上清を出発原料として、上記の方法と同様の方法で精製し、活性収率約 25%でマルトースホスホリラーゼの精製酵素を得た。 S D S-ポリアクリルアミド電気泳動法により得られた精製酵素の分子量を測定したところ、分子量は 89， 000〜90， 000タリレ卜ン近傍にあり、後述の実施例 3で決定した推定アミノ酸配列から計算された 87, 762ダル卜ンとよく一致していた。精製酵素の分子量をセフアクリル S— 200ゲル ¾ti 法により測定したところ、その^?量は約 200, 000ダルトンであったので、本酵素はホモ 2量体で構成されていると思われた。実施例 2 ：

菌体内および菌体外卜レハロースホスホリラーゼの製造及び精製

パェニバチルスエスピー 31~1—55を、卜レハロース 1 % (w/v)、酵母ェキス 2%、リン酸アンモニゥ厶 0. 15%、尿素 0. 1 5%. 食塩 1 %、リン酸二カリゥ厶 0. 1 %、硫酸マグネシウム■ 77 0. 02%および炭酸カルシウム 0. 2% を含む PH7. 0の液咅地に植蘭した。この液咅地を実施例 1と同様に培養し、後処理して菌体破砕液と上'; 夜を得た。得られた菌体破碎液と上意夜について、それぞれ例 1と同様な方法で精製した。更に、菌体破砕液と上清液から得た上記の精製液を、それぞれポリアクリルアミドゲルスラブ電気泳動法ならびに S D S一ポリア 2004/009606

25

クリルアミド電節永動法において精製し、均一な菌体内トレ八ロースホスホリラーゼおよび菌体外トレ八ロースホスホリラーゼを得た。それぞれの活性収率は 30%および 35%であった。 SDS—ポリアクリルアミド電気泳動法にょリ両方の精製酵素の分子量を測定したところ、分子量はいずれも 89， 000〜90, 000ダルトン近傍にあり、後述の実施例 3で決定した推定アミノ翻己列から計算された値 87， 1 51 ダルトンとよく一致していた。精製酵素の量をセフアクリル S— 200ゲル麵法により測定したところ、分子量は約 1 90， 000ダル卜ンであったので本酵素はホモ 2量体で構成されて t \ると思われた。実施例 3 ：

マル卜ースホスホリラーゼと卜レハロースホスホリラーゼの遺伝子のクローニングとシーゲンス

マルトースホスホリラ一ゼの遺伝子のクロ一ニングは以下の方法で行った。実施例 1 で得られた精製酵素の N末端アミノ酸配列を常法により決定したところ、 MKQYLK L DEWの配列を有していた。さらに精製酵素をプロテアーゼの一種である V 8 (シグマ製）によりゲル内消化を行った。ゲル内消化は、精製酵素 5^gを SDS PAGE ゲルに供し、同時に V 8プロテアーゼ溶液 1 t gを精製酵素溶液に重層して泳動を行い、ゲル中で目的酵素を分解する方法で行った。得られた蛋白質断片の 2種類の N末端アミノ酸配列を常法により決定した。その結果、断片 1から A I a-Ty r-S e r-G I y— S e r— S e r— L e u-G I n— G I y— S e r -Ty r— Me t -A I a― G I y— Va l — Ty r—Ty r— P r o— As p— Ly s、断片 2から G l y-As p- V a I -A I a-A I a— G l n -G I n - A I a- I I e - A r gの配列を得ることができた。 1種類のアミノ酸をコードする DNA配列は】〜 6種類存在する。そこで、断片 1の 1〜9番目のアミノ酸配列のおよび断片 2の 1〜9番目アミノ酸配列から D N A配列に基づく下記で表わされる混合プライマーおよびアンチセンス混合ブライマ一を調製した。

断片 1のアミノ酸配列に基づくプライマー：

5' -CNTARAGRGGNTCNTCNCTNCAYG-3'

断片 2のアミノ酸配列に基づくアンチセンスプライマ一：

5' -ATNGCYTGYTGNGCNGCNACYTCG-3'

上記混合プライマーを用い、 ¾fe体 DN Aをテンプレー卜にして Ex Taq (タカラバイオ）を用いて P C Rを行い、 D N A断片の増幅を行った。反応条件は、 96でで 2分間加熱した後、 96 °Cで 20秒、 55 °Cで 30秒、 72 °Cで 1分のサイクルを 30 回繰り返してから、最後に 72°Cで 1 0分間保温した。 J¾&液をァガロースゲル電永動したところ *約 0. 8 k b塩基対の DN A断片が検出された。反応液から増幅された DNA断片を TA C l o n i n K i t (インビ卜ロジェン）を用いてクローニングし、塩基配列決定用プラスミドを調製した。このプラスミドをテンプレー卜として d Rod am i n e Dy e Te rm i n a t o r Cyc l e S e q u e n c i n g Re ad y Re ac t i o n K i t (パーキンエルマ一）を用いた蛍光ラベル RiSを行い、 D N Aシークェンサ一 377 (Ap p l i e d B i o s y s t ems) で分析し、配列番号 5に示されるヌクレオチド配列のうち 477番目〜 1 304番目の塩基配列を決定した。

上言基配列を基に、 5' -CAGTTGGTGCTGTTCAACACTTTG- 3' で示されるプライマー MF 1、及び 5' -ATGGCGATGTAAAGAAT AAAG-3' で示されるプライマ一 MR 1を調製した。一方、体 DNAを制限酵素 X h 0 Iで切断した後、 L i ga t i o n h i gh (東洋紡）を用いて 1 6°Cで 1時間ライゲ一シヨンを行い、この DN Aをテンプレートとし、プライマ一として MF 1及び MR 1を用い、 LA Taq (タカラバイオ）を用いてインバース P C Rを行つた。反応液をァガ口一スゲル電気泳動したところ、約 7 k b塩基対の DNA断片が検出された。反応液から増幅された D N A断片を精製し、塩基配列決定用 D N Aを調製した。この DN A断片をテンプレー卜として d R 0 d am i n e Dye Te rm i n a t o r C c l e Seq u e n c i ng Re ad y Re ac t i o n K i t (パーキンエルマ一）を用いた蛍光ラベル J¾5を行い、 DN Aシークェンサ一 377 (App l i ed B i o s y s t ems)で分析し、配列番号 1で示されるアミノ酸配列および配列番号 2で示されるヌクレオチド配列によって表されるマル卜ースホフホリラーゼの遺伝子を取得した。

次に、卜レハロースホスホリラーゼの遺伝子のクローニングは以下の方法で行った。実施例 2で得られた精製酵素の N末端アミノ酸配列を常法により決定したところ、 M e t— Th r— Ly s— Me t— I I e— Se r— As n— P r o— As p— Le uであった。ここから、下記のプライマ一 1で表される配列の混合プライマーを設計した。さらに、既知のトレハロースホスホリラ一ゼのアミノ酸配列から相同性の高い配列を検索し G I y-T y r -G I u -G I y-H i s— Ty r— Ph e— T r p— As pのアミノ酸配列を見出した。ここから、下記のプライマー 2で表される配列のアンチセンス昆合プライマ一を設計した。

プライマー 1 : ₅' -ATGACNTGGATGATHAGCAAYC-3' プライマー 2： 5' -CCAYAAYTAYTGNCCRTCYTANCC-3' T/JP2004/009606

28 上記混合プライマーを用い、 ¾fe体 D N Aをテンプレー卜にして上記プライマー 1及び 2を用いて Ex Ta q (夕カラバィ才）により P C Rを行い、 DNA断片の増幅を行った。反応条件は、 96 °Cで 2分間加熱した後、 96°Cで 20秒、 55°Cで 30秒、 72 °Cで 1分のサイクルを 30回繰り返してから、最後に 72°Cで 1 0分間保温した。反応液をァガロースゲル電気泳動したところ、約 1. 0 k b塩基対の DNA断片が検出された。反応液から増幅された DN A断片を T A C l on i ng K i t (インビ卜ロジェン）を用いてクローニングし、塩基配列決定用プラスミドを調製した。このブラスミドをテンプレー卜として d R o d am i n e Dy e Te rm i n a t o r Cyc l e Seq ue nc i ng Read y Reac t i o n K i t ノーキンェルマー）を用いた蛍光ラベル反応を行い、 DN Aシークェンサ一 377 (App I i ed B i o s ys t ems)で分析し、配列番号 7に示されるヌクレオチド配列のうち Ί 1 1 3番目〜 21 68番目の塩基配列を決定した。

上言 £1 ^基配列を基に、 5'— ACGATGACCAGCTCCAGGAAG— 3' で示されるプライマー TF 1、及び 5， -TCAGATAGGTACCGCGAATGG -3' で示されるプライマー TR 1を調製した。一方、染色体 DNAを制限酵素 Xh 0 Iで切断した後、 L i ga t i on h i gh (東洋紡）を用いてライゲ一シヨンを行い、この DN Aをテンプレー卜とし、プライマーとして TF 1及び TR 1を用い、 LA Taq (タカラバィ才）を用いてインバース P C Rを行った。反応液をァガロースゲル電気泳動したところ、約 6 k b塩基対の DNA断片が検出された。反応液から増幅された DNA断片を精製し、塩基配列決定用 DN Aを調製した。この DNA断片をテンプレ —卜として dRod am i n e Dye Te rm i n a t o r Cyc l e S e q ue nc i ng Re ady Reac t i on K i t (パーキンエルマ一）を用 P T/JP2004/009606

29 いた蛍光ラベル反応を行い、 DN Aシークェンサ一377 (App l i ed B i o s y s t erns)で分析し、配列番号 3で示されるアミノ豳己列および 12列番号 4で示されるヌクレ才チド配列によって表される卜レ八ロースホフホリラーゼの遺伝子を取得した。

配列番号 1と配列番号 3から推定される分子量 (SDS—ポリアクリルアミド電気泳動法による）と等電点は、マル卜ースホス木リラ一ゼが' 87， 762タレトンと p H 4. 98、トレノヽロース木スホリラーゼが 87， 1 51ダルトンと pH5. 1 3であった。実施例 4 ：

菌の形質転換、形質転換体の培養および、精製

実施例 3で得た配列番号 5のマル I ^一スホスホリラーゼをコ一ドする D N A配列の開女台コドンである 343塩基目からの 5' -GTGAAACAATATTTAAAGC TTG-3'で表される才リゴヌクレ才チドの 5 '末端に制限酵素 X h 0 I切断部位を

3，で表されるプライマーを M F 2、終止コドンである 2649塩基目からのアンチセンス配列 5' — TTATTTTGAAGCTGCTGTG— 3'で表される才リゴヌクレオチドの 3 '末端に制限酵素 Kpn I切断部位を付けた 5' -TTATTTTGAA GCTGCTGTGGGTACCCCG— 3，で表されるをプライマーを M R 2とし、 ¾fe体 DNAをテンプレー卜とし Py r 0 be s t (タカラバィ才）を用い PC Rを行い、マル! ^一スホスホリラーゼを含む約 2. 3 k塩基対の DN A断片を取得した。反応条件は、 96 °Cで 2分間加熱した後、 96でで 20秒、 55 で 30秒、 72 °Cで 2分のサイクルを 30回繰り返してから、最後に 72°Cで 10分間保温した。得られた DN A断片を精製した後、制限酵素 X h 0 I及び K p n Iで切断した。これをプラスミドべクタ一 p R S E T A (インビ卜ロジェン社）を制限酵素 X h 0 I及び K p n Iで切断したもの 5 O ngと L i g a t i o n h i gh (東洋紡）を用いて、 1 6°Cで 2時間ラィゲ一シヨンして、組換えプラスミド p R S M P 1を創製し、 ^iiMB L 21 (DE3) pLy s S ( οπιρϊ oSB(rB— mB-) / dcm(DE3) pLysS (Cam^R)) 株へコンビテン卜セル法を用いて導入を行い、形質転換された大腸菌 R S M P 1を得た。

同様に、実施例 3で得た配列番号 7の卜レ八ロースホスホリラ一ゼをコードする D N A配列の開始コドンである 1 1 1 3塩基目からの 5' -ATGACGTGGATGAT AAGCAATC— 3'で表されるオリゴヌクレオチドの 5 '末端に制限酵素 BamH

I切断部位をつけた 5' - CGCGGATTCATGACGTGGATGATAAGC AATC-3'で表されるプライマーを TF 2、終止コドンである 341 3塩基目からのアンチセンス配列 5' — TTATTTTGAAGCTGCTGTG - 3，で表される才リゴヌクレオチドの 3'末端に制限酵素 Ec o R I切断部位を付けた 5' -TTAT れるをプライマーを TR 2とし、染色体 DN Aをテンプレートとし P y r o b e s t (タカラバィ才）を用い PC Rを行い、トレ八ロースホスホリラ一ゼを含む約 2. 3 k 塩基対の DN A断片を取得した。 J¾5条件は、 96 °Cで 2分間加熱した後、 96°Cで 2 0秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 2分のサイクルを 30回繰り返してから、最後に 72°C で 1 0分間保温した。得られた DN A断片を精製した後、制限酵素 BamH I及び Ec

0 R Iで切断した。これをプラスミドベクター pR SETA (インビ卜ロジェン社）を制限酵素 B amH I及び E c o Iで切断したもの 5 O ngと L i ga t i o n h

1 gh (東洋紡）を用いて、 1 6 °Cで 2時間ライゲーシヨンして、組換えプラスミド p 6

31

R S T P lを創製した。これを大腸菌 B L 2 1 (D E 3) p L y s S (F—'ompT hsdS (rB- -) gal dcm(OE3) pLysS (Cam^R)) 株へコンビテン卜セル法を用いて導入を行い、形質転換された §菌 R STP1を得た。

次に、形質転^ i菌 R S M P 1及び R S T P Ίをそれぞ tli咅養し、組換え酵素の調製を行った。

まず、得られた形質転換体の R SMP 1または R S T P 1のシングルコロニーを、容量 30 OmLの三角フラスコに LB培地（バク卜ペプトン 1 %、酵母エキス 0、 5 %、塩化ナトリウム 0、 5%) にアンピシリン溶液を終で 5

しクロラ厶フェニコール溶液を終離で 34 g/mLになるように添カ卩した溶液 3 OmLに植菌し、 37 C、 1 80 r p mT 1 6時間培養して、 SMP 1または R S T P 1の種培養液を調製した。

次いで、形質転換体の培養を以下のようにして行なった。即ち、形質転換体の RSM P 1または R STP 1のそれぞれについて、容量 2 Lの三角フラスコに L B培地 (バク卜ペプトン 1 %、酵母エキス 0. 5%、塩化ナトリウム 1 %) 0. 5 Lを入れて滅菌した後、アンピシリン溶液を終で 50 t g/mしクロラムフエ二コール溶液を終濃度で 34 g/m Lになるように添加し、 RSMP 1または R S T P 1を用いた種培養液を 1 %になるようにそれぞれ接種して、；¾37。C、 1 80 r pmで、 OD₆₀。 (6 O O nmでの濁度）が 0. 5になるまで培養した。その後、イソプロピルチ才ガラク卜ビラノシド（I PTG)を終^ J で 1 mMになるように添加し、さらに 3時間培養を行つた。 ±咅養終了後、培養液を 5000 X旦、 1 0分間遠心分離を行い菌体を得た。得られた Mi蘭を超音波破壊し、 1 2000 X直、 1 5分間遠心分離を行った。得られた粗抽出液をァフィ二ティーカラム（TALON Resin, クロンテック社製）で 2度クロマ卜グラフィ一を行 t \ (洗浄、 5 m Mイミダゾール；溶出、 1 00 m Mイミダゾール)、均一なまでに精製したマルトースホスホリラーゼ（MP) と卜レ八ロースホスホリラ一ゼ（TP) を得た。両酵素のァフィ二ティーカラムによる精製の結果を表 1に示す。表 1

表 1に示すように、精製したマル卜一スホスホリラーゼ（MP) と卜レハロースホスホリラ一ゼ（TP) の比活性はそれぞれ約 50および 42単位/ mgであった。これら組換えマル卜一スホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼの S D S-ポリアクリルアミド電気泳動法によって求めた分子量は、図 2の Aおよび Bに示すように、夫々約 90， 000〜92， 000ダル卜ン（計算値、 92， 233ダル卜ン）（図 2A) と約 89, 000〜91 , 000タリレ卜ン（計算値、 91, 280タリレ卜ン）であった（図 2 B)o これらは推定アミノ酸配列から計算された夫々の分子量 92， 233ダルトンおよび 91 , 280ダルトンとよく一致していた。実施例 5 枯草菌の形質転換、形質転換体の培養および精製

枯草菌での発現は以下の方法で行った。即ち、実施例 3で得たマルトースホスホリラーゼ及び卜レハロースホスホリラ一ゼの D N A配列をそれぞれ枯草菌用発現べクタ一 PHY300 PLK (夕カラ社）にライゲ一シヨンし、枯草菌 Bacillus subtil is I S W1 21 4 (/e"A8 me hsm) に形質転換し、形質転換体 B S M P 1及び B S T P 1を得た。

また、実施例 4と同様に、得られた形質転換体の B S M P 1または B STP1のシンダルコロニ一を、試験管に PM培地 (ポリペプトン S4%、マル卜ース 4%、酵母工キス 0. 1 %、 LAB L EMCO POWDER (Ox o i d) 0. 2%、リン酸二水素カリウム 0. 1 %、硫酸マグネシウム 0. 02%、塩化カルシゥ 0， 02 %、テ卜ラサイクリン 1 5 tg/mL)の 5mLに植蘭し、 30C、 1 20 r p mで 24時間培養して、 B S M P 1または B STP 1の種培養液を調製した。

次に、得られた形質転換体 B S M P 1及び B S T P 1のそれぞれについて、 P M培地 (ポリペプトン S 4%、マル! ス 4%、酵母エキス 0. 1 %、 LAB LEMCO P OWDER (Oxo i d) 0. 2 %、リン酸ニ水素力リウ厶 0. 1 %、硫酸マグネシゥ厶 0. 02%、塩化カルシウム 0， 02%、テトラサイクリン 1 5 tg/mL) に上記の種培養液 1 %をそれぞれ接種し、 30°C、 1 20 r pm、 64時間培養を行った。培養終了後、 ±咅養液を 10000 X旦、 10分間遠心分離を行い、 B S M P Ί及び B S T P 1の培養上清及び菌体を得た。菌体は超音波破壊し、 Ί 2000 X 、 1 5分間遠心分離を行い、粗抽出液を調製した。それぞれの活性を測定したこところ、マルト一スホスホリラーゼでは、培養上清で 0. 2単 &/mg、菌体で 0· 1単 ii/mgであり、卜レハロースホスホリラーゼでは、培養上清で 0. 4単 &/mg、菌体で 0. 2単ィ i/m gであった。実施例 6： .

マル卜一スホスホリラーゼとトレ八ロースホスホリラ一ゼの推定アミノ酸配列と他酵素のアミノ酸配列の相同性

実施例 3で得たマル卜一スホスホリラーゼ遺伝子と卜レハロースホスホリラーゼ遺伝子について、これらの遺伝子がコードしている夫々のアミノ酸配列の FAS T A相同性検索 (http://ddbj.nig. ac.jp) を行った。本発明のマル! ^一スホスホリラ一ゼは、バチルスエスピー RK— 1 (Bacillus sp. RK— 1， A B 0084460)、ェンテロコッカスヒラエ (Enterococcus hirae, E21769)、ラク卜バチルスブレビス

(Lactobaci 1 lus brevis. 1 H 54 A)、ラク卜バチリレスラクテイス (Lactobaci I lus lactis, E 86834)、ラク卜バチルスサンフラウンシセンシス (Lactobacillus sanfranciscensis, L S J A 4340)、ネイセリアメニンギティギス (Neiisseria meningitides, F81 203)と全アミノ酸を通じてそれぞれ 5 1. 4%、 5 1. 4%、 48. 3%、 48. 9%、 45. 1 %、 48. 4%しか一致しなかった。また、本発明のトレ八ロースホスホリラーゼは、バチルスステアロサ一モフィラス S K 1

(Bad I lus stearothermophilus SK- 1， AB 0796 1 0)、サ一モアエロビゥ厶ブロッキ ATCC35047 (Thertnoanaerobium brocki i ATCC35047, A B073930) と全アミノ酸を通じてそれぞれ 62. Ί %、 44. 2%しか一致しな力、つた。実施例 7 T/JP2004/009606

35 パェニバチリレスエスピー S H— 55の生産するマレ I スホスホリラーゼぉよび卜レ八ロースホスホリラーゼの酵素化学的諸'性質

パェニバチリレスエスピー S H— 55が生産する本発明の新規マル卜一スホスホリラーゼおよびトレ八ロースホスホリラ一ゼの一般的な酵素化学的特性に関し、実施例 1、 2、 4および 5と同様な方法で精製して得た精製酵素を用いて検討した。なお、実験の結果、マル卜ースホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラ一ゼのいずれについても、パェニバチルスエスピー SH— 55の菌体内および菌体外の両酵素と、これらの組換え酵素は共にほぼ同様な理化学的、酵素学的諸性質を有していたので、ここでは実施例 4で得た; §菌で発現させた組換え酵素についての諸性質を示す。

(ィ）作用

1 OmMリン酸锾衝夜 (pH7. 0) に溶解させた 1 % (w/v) のマル I ス及びトレ八ロース溶液に、マル! ^一スホスホリラーゼとトレ八ロースホスホリラ一ゼを基質 1 gに対して、それぞれ 5単位（分解反応活性）添加し、 50°Cで 5時間反応させた後、沸騰水浴中で 3分間加熱して酵素を失活させた。得られた糖化液中の糖を高速液体クロマ卜グラフィ一法で測定した結果、グルコース及びグルコース 1一リン酸がそれぞれ検出された。また、 1 OmMの卜リス—塩酸锾衝夜 (pH7. 0) に溶解させた 1 % (w /v) のグルコースおよび ]8— D—グルコース 1 -リン酸 N a塩もしくは en— D—ダルコース 1 -リン酸 N a塩との混溶液を基質とし、マルトースホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼを基質 1 gに対してそれぞれ 5単位添加し 50でで 5時間反応させた。上述のように処理して生成した糖誠を測定した結果、グルコースとの— D—グルコース 1 -リン酸からはマル卜一スおよび卜レハロースが検出され、マルトースホスホリラ一ゼおよび卜レ八ロースホスホリラーゼによる合成反応が確認されたが、グルコースと a一 D—グルコース 1 -リン酸からの二糖類の合成反応は検出されなかつ生 ¾の分析は以下の方法で行った。先ず、加熱失活させて得られる糖化液中の不溶物を 0. 45 μπιポアサイズのメンブレンフィルターで濾別した。得られた濾液を供試糖液とし、 YMC— Pac k、 ODS-AQ (AQ-304, YMC社製）カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー法で測定した。なお、移動相には水を用い、カラム温度を 30°Cとし、検出には示差屈折計を用いた。

(口）基質特異性（分解

(i)マルト一スホスホリラーゼの場合：

先に記載した酵素の活性測定法（分解反応）において、使用する基質をマルトースの代わりに、トレ八ロース、イソマレ! ^一ス、ネオ卜レハロース、シユークロース、ラク卜ース、またはセロビオースを基質としてこれらの基質の分解活性を調べたが、これらの基質では酵素活性は全く認められなかった。

(ii)卜レハロースホスホリラ一ゼの場合：

同様に酵素の活性測定法（分解反応）において、使用する基質を卜レハロースの代わりにマル!—ス、イソマル! ^一ス、ネ才卜レハロース、シユークロース、ラク I ^一ス、またはセロビオースを基質としてこれらの基質の分解活性を調べたが、これらに基質では酵素活性は全く認められなかった。

(ハ）作用 P H範囲、最適 p Hおよび安定 p H範囲

実施例 4で得た精製酵素を用いて分解および合成反応の最適 p Hを測定した。その結果を図 3に示す。図 3の Aに示したように、マルトースホスホリラ一ゼの分解反応（白丸）の最適 pHは 7. 0〜8. 0であり、作用 pH範囲は 4. 5〜9. 5であった。同 9606

37

じくマルトースホスホリラーゼの合成反応（黒丸）の最適 pHは 5· 5〜6· 5であり、作用 ρΗ範囲は 4. 5〜9. 5であった。

また、図 3の Βに示すように、トレ八ロースホスホリラーゼの分解 J¾5 (白丸）では、最適 PHは ρΗ7· 0〜8. 0であり、同じく合成反応（黒丸）は ρΗ5· 8〜7. 8 が最適であった。作用 Ρ Η範囲は、分解反応と合成 J¾&の何れの場合も 4. 5〜 9 · 5 であった。

なお、分解反応の場合は 5 OmMリン酸一クェン酸锾種 ¾夜（ρΗ4. 5〜8· 0)、リン ^~¾ΒΙ酸锾衝液（ρΗ8· 0〜9. 5) とグリシン一 NaOH緩衝液（ρΗ9. 0 〜1 2.0)に 25 mMリン酸カリウムを添加した溶液を用いた。合成反応の場合には、 MES (p H 5. 5〜6. 5)、 MOPS (pH6. 5〜7. 0)、 HEPES (p H 7. 0〜8. 0)、卜リス一塩酸（pH7. 5-9. 0) の各^夜を用いた。

精製した両酵素を薩中で 1 0分間、 50°Cで処理し、それらの残存酵素活性を分解反応で測定した。図 4に示すように、マル卜ースホスホリラーゼ（白丸）は p H 5 · 5〜7. 5の範囲で、また、卜レハロースホスホリラーゼ（黒丸）は pH5. 5〜9. 5まで安定であった。なお、 pH調節は 5 OmMのリン酸一クェン酸麵夜 (pH4. 5〜8. 0)、リン酸 ~ii酸緩衝夜（ρΗ8. 0〜9· 5) とグリシン一 NaOH緩衝液（PH9. 0-1 2. 0)の各夜を用いた。

(二）作用範囲と最^¾

図 5の Aに示すように、マル! ^一スホスホリラーゼの分解反応の場合（白丸）は 4 5〜55。C近傍に最適作用 Sitを有し（50mMリン酸 ¾確、 pH7. 0)、作用温度範囲は 20〜60°Cであり、合成反応の場合（黒丸）は 50〜55°C近傍に最適作用温度を有し、作用温度範囲は 20〜 60 °Cであつた。また、図 5の Bに示すように、 JP2004/009606

38

トレハロースホスホリラーゼの分解の（白丸）は 50〜65°C近傍に最適作用温度を有し（50mMリン酸锾衝夜、 pH7. 0)、作用温度範囲は 25〜70°Cであり、合成反応の場合（黒丸）は 45〜 60°C近傍に最適作用温度を有し、作用温度範囲は 25〜 70 °Cであつた。

(ホ）安定性

マル I ^一スホスホリラ一ゼおよび卜レハロースホスホリラ一ゼの耐熱性を、それぞれ PH6. 0および 7. 0 (50mMリン酸 Hffij夜中）の条件下で、種々の^^で 1 5分間処理してその残存活性を常法によリ求めることによリ測定した。その結果を図 6に示す。図 6からわかるように、マル卜一スホスホリラーゼ（白丸）は 50°Cまで極めて安定であり、 70°Cで完全に失活した。また、トレ八ロースホスホリラ一ゼ（黒丸）は 6 0 °Cまで極めて安定であリ、 70 °Cで完全に失活した。

(へ）阻害剤

マルトース木スホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼの分解活性を各種無機イオンと阻害剤存在下で測定した。その結果両酵素活性は、銅、 7k銀、 N—プロモサクシニイミド、且—クロロマ一キユリ安息香酸 (各々 1 mM)によって強く阻害された。マルトースホスホリラ一ゼは SDS (1 %)で強く阻害されたが、卜レハロースホスホリラーゼは阻害されなかった。

(卜）等電点

イソエレクト口フォーカシング法ァイソゲル (FMC BioProducto社製)により、マル卜 —スホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼの等電点を測定した結果、マル卜ースホスホリラーゼは ρΗ4· 8〜5. 0 (計算値、 ρΗ4. 98)、卜レハロースホスホリラーゼは ρΗ 4· 8-5. 2 (計算値、 ρΗ5. 1 3) であった。 (チ）ゲルろ週丟による分子量

セフアクリル S— 200を用いるゲル濾過法によりマル! スホスホリラ一ゼおよびトレ八ロースホスホリラーゼの分子量を測定した。その結果、ゲル濾過法では両酵素の量はいずれも約 1 90， 000ダルトンであつたが、 S D S—ポリアクリルアミド電詠動法ではマル! スホスホリラーゼは約 89， 000〜 90， 000タリレトン（計算値、 92, 233タリレトン)、卜レノヽロースホスホリラーゼは約 89, 00 0〜90， 000タリレ卜ン（計算値、 91 , 280タリレトン）であったことから、これらの酵素はそれぞれホモ 2量体から構成されていることが予想された。両組換え酵素の分子量が野性型に較べて若干大きいのは、 N末端に H i sタグとスぺーサ一部分の 23アミノ酸配列が付加されている為に、量が野生型に比べて約 3500大きくなっている為である。実施例 8：、

菌体内および菌体外卜レハロースホスホリラーゼの製造

卜レハロース 1 % (w/v)、酵母エキス（D i f c o社製) 2%、リン酸アンモニゥ厶 0. 25%、尿素 0. 1 5%、食塩1 %、リン酸二カリウム 0. 1 %、硫酸マグネシゥ厶■七 7jdg 0. 02 %および炭酸カルシウム 0. Ί 5 %を含む p H 7. 5の液咅地 1 0 L (リットル）に、予め同じ培地で一夜培養したパェニバチルスエスピー SH —55の種菌 50 OmLを無菌的に添加し、 35°C、 300 r pm、通気量 1 vvm [通気量 (L)/培地 (L)/m in]の条件下で 24時間通気攪拌咅養した。き養液のトレハロースホスホリラーゼ活性を測定した結果、培養液 1 mL当たり 1 · 8単位であった。また同様にマルト一スホスホリラ一ゼ活性も測定したが、活性は微量であった。次いで、この培養液を、 1 2, 000 X呈、 4°Cで 1 0分間遠心分離し、約 75 gの菌体（湿潤量）および約 1 0 L (リツ卜ル）の上清液を得た。この上潔夜をアミコン (Ami con) 社製 U F膜（YM— 30)で濃縮し、約 50 OmLの菌体外濃縮粗酵素が得られた。上意夜中の酵素活性を測定した結果、全活性（約 1 4 X 1 0³単位)の約 25 %の活性があった。菌体部分につゝては 1 0 m Mのリン酸液（ p H 7 )で充分洗浄し、 240mLの同上緩衝夜に懸濁させ、超音波菌体破砕機で菌体を破碎した。常法によりトレハロースホスホリラーゼ活性を測定した結果、全活性の約 75 %が菌体内に含まれていた。

従って、炭素源としてトレ八ロースを用いてパェニバチルスエスピー SH— 55 を培養することにより、卜レ八ロースホスホリラーゼを優先的に生産することができ、その際酵素は菌体内に約 75%、蘭対外に約 25%の割合で食まれることが分かつ †-

実施例 9 ：

マル卜ースホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼ含有菌体内および蘭体外酵素の製造

実施例 2で用いた培地成分中の卜レ八ロースをマル卜一スに、酵母エキス 2 %をポリペプトン FC (日本製薬（株）製） 4. 5% (w/v) にそれぞれ代え、その他は同様な条件と方法でバエ二バチルスエスピー SH-55を培養した。この培養液のマ Jレ卜 -スホスホリラーゼ活性とトレ八ロースホスホリラ一ゼ活性を測定した結果、培養液 1 mL当たり 0. 8単位のマルトースホスホリラーゼ活性と 0. 5単位のトレハロースホスホリラ一ゼを生産していた。実施例 8と同様に遠心分離して約 50 gの菌体 (湿潤量) および 7 L (リットル）の上清液を得た。得られた菌体および上清中のマルトースホスホリラ一ゼ活性を測定したところ、マル卜一スホスホリラーゼの全活性の約 80%カ簡体内に、約 20%が難外 (培養上清）に含まれていた。また、卜レハロースホスホリラーゼの全活性の約 80 %が菌体内に、約 20 %が菌体外 (培養上清)に含まれて t、す:。実施例 1と同様な方法で培養上清を濃縮し、約 33 OmLの濃縮酵素を得た。濃縮酵素中には約 550単位のマル! スホスホリラーゼと 500単位の卜レハロースホスホリラーゼが含まれていた。

従って、炭素源としてマル I スを用 t、てパェニバチルスエスピー S H— 55を培養することにより、マルトースホスホリラーゼを生産するが、同時に、トレハロースホスホリラーゼも生産することができ、その際いずれの酵素とも菌体内に約 80% 、菌対外に約 20%の割合で含まれることが分かった。実施例 1 0 ：

マル I ^一スからの卜レ八ロースの製造

1 OmLの 1 OmM燐酸 fjj夜 (pH 6) に溶解させた 1 0%、 20%、 30%、および 40% (W/V) の各マル卜ース溶液に本発明の卜レハロースホスホリラーゼおよびマル卜ースホスホリラ一ゼを各々基質重量 1 g当たり 5単位（分解活性）添加し、 55 °Cで 70時間反応させた。反応終了後、 J¾¾夜を 1 00°Cで 5分間加熱して酵素を失活させて得られる糖化液中のトレ八口一ス含有量を測定した。その結果、前記 4種類のマルトース溶液のそれぞれについて、基質重量に対してそれぞれ 58. 2 %、 58. 1 %、 58. 6%、ぉょび57. 9 %の卜レハロースが生成していた。なお、トレ八ロースの定量は以下の方法で行った。即ち、加熱失活させた糖化液に水を加え、約 1 % (W/V) とした後、該糖化液 0. 5m lにダルコアミラーゼ（生化学工業製、ピュアグレード 3 OUZmg) を 0· 01単ィ加し、 50°C、 pH5 . 0で 1時間 J¾Sさせて未反応のマル! ^一スをグルコースに完全に分解させた。次いで 1 00°Cの沸騰水浴中で 5分間加熱してダルコアミラーゼを失活させた後、生成する不溶性蛋白質を 0. 45 のメンブレンフィルターで除去して得られる濾液中の卜レハロース含有量を YMC— P a c k ODS— AQ (AQ— 304、 YMC社製 ) カラムを用いる液体クロマ卜グラフ法（HPLC法）で測定した。なお、測定は移動相に水を用い、カラム温度を 30°Cとして、検出には示差屈折計を用いた。実施例 1 1 ：

マル! ^一スシラップからのトレ八ロースの製造

1 0|711_の5 1\1燐酸藤夜 (pH6) に溶解させた 20% (W/V) のハイマル卜ースシラップ (日本食品化工製、商品名 MC— 95、糖滅：グルコース 2. 5% 、マル I ^一ス 95. 2%、マル卜卜リオ一ス 0. 8%、マル卜テ卜ラオース 1 · 5% ) に、本発明の卜レ八ロースホスホリラーゼおよびマソレ卜ースホスホリラ一ゼを基質重量 1 g当たり各々 5単忝加し、以下実施例 1 0と同様に反応させた。生成した卜レハロースを H P L C法で測定した結果、使用した基質重量に対して 54 · 3 %の卜レハロースが生成した。産業上の利用可能性

本発明によれば、トレハロースを酵素的に製造する際に必要なマルトースホスホリラーゼおよび卜レ八ロースホスホリラーゼを菌体内及び菌体外に生産し得る新規な微生物が提供される。本発明の微生物は細菌であるので、従来トレ八ロースホスホリラ一ゼの供 v給源として知られていた緑藻や担子菌に]; して、酵素の取得方法が非常に容易であるばかりでなく、培養時間も大幅に短縮することができ経済的である。さらに、本発明の微生物は、一種類の微生物のみを用いて、トレ八ロースの酵素的生産に必要な二種類の酵素を同時に生産し得るという点でも実用的に著しヽ利点を有する。また、本発明の 2つの酵素は、トレ八ロースを酵素的に生産する際に要求される諸要件をいずれも満足するので、得られる卜レハロースの有効利用を著しく容易にし、経済的にも大幅な改善を達成し得るものである。即ち、本発明のマルトースホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼは高い ^安定性を有し、高温での酵素 J¾s か可能であるので反応中の雑菌汚染から免れることができる。さらには、両方の酵素がほぼ同じ最適 p H範囲を有しているので反応中の煩雑な p H管理が不要であると tゝう利点も有する。更に、本発明の酵素を得るための別の方法として、上記蘭株から本発明の酵素をコードする遺伝子を取り出した後、遺伝子工学技術を用いて組換え微生物を作製し、当該組換え微生物を培養することによって卜レハロースを酵素的に製造する際に必要なマル I ^一スホスホリラーゼと卜レハロースホスホリラーゼの生産、両酵素の夕ンパク質工学的な改良が可能になった。

Claims

請求の範囲

1. マル卜一スホスホリラーゼおよびトレ八ロースホスホリラ一ゼ生産能を有するパェニバチルス属微生物。

2. 微生物が、パェニバチルスエスピー S H - 55 (Paenibacillus sp. SH-5 _5) (寄託番号 FERM BP— 8420)である、請求の範囲第 1項言 S載のマル卜一スホス木リラーゼおよび卜レ八ロースホスホリラーゼ生産能を有する微生物。

3. 以下に示す理化学的性質を有するマルトースホスホリラーゼ。

(ィ）作用：マルトース中の α— 1， 4—ダルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解し、ダルコ、ースとー D—グルコース 1一リン酸を生成する。

(口）基質特異性（分解反応）：マルトースに作用し、トレハロース、シユークロース、ラク卜ース、セロビオースなどには作用しない。

(八）最適 ρΗおよび安定 ρΗ範囲：分解 J¾Sの最適 ρΗは 7. 0〜8. 0であり、合成 J¾5の最適 ρΗは 5. 5-6. 5である。 50°C、 1 0分間のカロ熱条件下では p H 5 · 5〜7. 5の範囲内で安定である。

(二）作用の範囲と最 i SJt：作用範囲は 20〜60°Cである。分解反応の最適温度は 45 ~ 55 °Cであリ、合成反応の最は 50〜 55 °Cである。

(ホ）温度安定性： pH 6. 0、 1 5分間の加熱条件下では 50 °Cまで極めて安定である。また、 70°Cで完全に失活する。 (へ） S D S—ポリアクリルアミド電気泳動法による量は約 8 9 , 0 0 0- 9 0 , 0 0 0ダル卜ン、ゲル去による分子量は約 1 9 0， 0 0 0ダル卜ンであり、ホモ 2量体から構成されている。

4. 配列番号 1で示されるアミノ酸配列、またはこの配列中の 1個もしくは複数アミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する、請求の範囲第 3項記載のマルトースホスホリラーゼ。

5. 配列番号 1で示されるアミノ酸配列と 5 2 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求の範囲第 3項記載のマルトースホスホリラーゼ。

6. 請求の範囲第 3項記載のマルトースホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、下記の（a)〜 ( c ) からなる群、

( b) 配列表の配列番号 1に示すアミノ酸配列中の 1個もしくは複数個のアミノ^^ 欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ —ドするポリヌクレオチド、および

( c ) 配列表の配列番号 2に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、より選ばれるポリヌクレオチド。

7. 請求の範囲第 6項記載のポリヌクレ才チドを有する組換えべク夕一。

8. 請求の範囲第 7項記載の組換えべクターにより形質転換された微生物。

9. 以下に示す理化学的性質を有する卜レ八ロースホスホリラーゼ。

(ィ）作用：トレ八口一ス中の α— 1， 1—ダルコビラノシド結合を可逆的に加リン酸分解し、グルコースおよび i8— D—グルコース 1一リン酸を生成する。

(口）基質特異性（分解反応）：卜レハロースに作用し、マル卜一ス、シユークロース、ラク卜一ス、セロビオースなどに作用しない。

(八） ¾ϋρΗおよび安定 pH範囲：分解反応の最適 pHは 7. 0〜8. 0であり、合成 J¾5の最適 pHは 5· 8〜7. 8である。 50 °C、 1 0分間の力 Π熱条件下では pH5. 5〜9. 5の範囲内で安定である。

(二）作用の範囲と最：作用^^範囲は 25〜70°Cである。分解 J¾Sの最適温度は 5、0〜 65 °Cであリ、合成反応の最適温度は 45 ~ 60 °Cである。

(ホ）温度安定性： pH7. 0、 1 5分間の加熱条件下でほ 60 °Cまで極めて安定である。また、 70°Cで完全に失活する。

(へ） S D S—ポリアクリルァミド電気泳動法による分子量は約 89， 000〜 90， 000タリレ卜ンであリ、ゲル ¾1ϋ法による分子量は約 1 90， 000ダル卜ンであリ、ホモ 2量体から構成されている。

1 0. 配列番号 3で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の 1個もしくは複数アミノ^^ '欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する、請求の範囲第 9項記載の卜レ八ロースホスホリラーゼ。

1 1 . 配列番号 3で示されるアミノ酸配列と 6 3 %以上の相同性を有するァミノ MIB 列を有する、請求の範囲第 9項記載の卜レハロースホスホリラーゼ。

1 2. 請求の範囲第 9項記載のトレ八ロースホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、下記 (d ) 〜（f ) からなる群、

( d ) 配列表の配列番号 3に示すァミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド、

( e ) 配列表の配列番号 3に示すアミノ酸配列中の 1個もしくは複数個のアミノ^^ 欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および

( f ) 配列表の配列番号 4に示すヌクレ才チド配列を有するポリヌクレ才チド、よリ選ばれるポリヌクレ才チド。

1 3. 請求の範囲第 1 2項記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクター。

1 4. 請求の範囲第 1 3項記載の組換えベクターにより形質転換された微生物。

1 5. マル卜一スホスホリラ一ゼおよびトレ八ロースホスホリラーゼ生産能を有するパェニバチルス属微生物を培養し、請求の範囲第 3項若しくは第 4項に記載のマル卜ースホスホリラーゼぉよび/または請求の範囲第 9項若しくは第 1 0項に記載の卜レ八ロースホスホリラーゼの少なくとも一つを生成'蓄積させ、これを採取することを特徴とする、マル卜ースホスホリラーゼ若しくは卜レハロースホスホリラーゼまたは両者の混^の製造方法。

1 6. 前記培養を、マルトースを含む炭素源の存在下で行い、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを生成■蓄積させることを特徴とする、請求の範囲第 1 5項に記載のマルトースホスホリラ一ゼ、またはマル卜一スホスホリラーゼと卜レ八ロースホスホリラーゼの混合物の製造方法。

1 7 . 前記培養を、トレハロースを含む炭素源の存在下で行い、卜レハロースホスホリラ一ゼを優先的に生成'蓄積させる、請求の範囲第 1 5項に記載のトレ八ロースホスホリラーゼ、またはマル卜ースホスホリラーゼと卜レ八ロースホスホリラーゼの混の製造方法。

1 8.次の L、ずれかの方法から選ばれるマル卜ースホスホリラーゼおよび Zまたは卜レ八ロースホスホリラ一ゼの粗酵素の製造方法；

( マル卜一スホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼ生産能を有するバエ二バチルス属微生物を培養し、得られた培養液から分離した菌体をそのままの採取する、

(i i) マル卜ースホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼ生産能を有するバエ二バチルス属微生物を培養し、得られた培養液から分離した菌体からマルトースホスホリラーゼおよび/または卜レハロースホスホリラーゼ粗酵素を抽出する、または、 (i i i) マル卜ースホスホリラーゼおよび卜レハロースホスホリラーゼ生産能を有するパェコチルス属微生物を培養し、得られた培養液から菌体を分離し、培養上意夜を採取する。 9. 燐酸の存在下で、請求の範囲第 3項または第 4項に記載のマルトースホスホリラ —ゼ、および請求の範囲第 9項または第 1 0項に記載の卜レハロースホスホリラーゼを、マリレトースに作用させることを特徴とする卜レハロースの製造方法。