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WO2004040971A1 - Ｇａｎｐ遺伝子導入トランスジェニック哺乳動物及びその利用 - Google Patents

Ｇａｎｐ遺伝子導入トランスジェニック哺乳動物及びその利用 Download PDF

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WO2004040971A1
WO2004040971A1 PCT/JP2003/014221 JP0314221W WO2004040971A1 WO 2004040971 A1 WO2004040971 A1 WO 2004040971A1 JP 0314221 W JP0314221 W JP 0314221W WO 2004040971 A1 WO2004040971 A1 WO 2004040971A1
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WO
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ganp
cells
antibody
mice
gene
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/014221
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English (en)
French (fr)
Inventor
Nobuo Sakaguchi
Original Assignee
Immunokick Incorporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Immunokick Incorporation filed Critical Immunokick Incorporation
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Priority to EP03810668A priority patent/EP1559318B1/en
Priority to US10/534,043 priority patent/US7919674B2/en
Priority to CA2504867A priority patent/CA2504867C/en
Priority to DE60327094T priority patent/DE60327094D1/de
Priority to JP2004549646A priority patent/JP4478577B2/ja
Publication of WO2004040971A1 publication Critical patent/WO2004040971A1/ja
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Definitions

  • the present invention relates to a transgenic Lancemic mammal into which a GANP gene has been introduced and use thereof. More specifically, the present invention provides a transgenic mammal capable of highly expressing GANP and producing a high affinity antibody, a method of producing a high affinity antibody using the transgenic mammal, And use of the obtained high affinity antibody.
  • the functions of the immune system are classified into functions based on cellular immune responses mainly on the effects of T cells and functions based on humoral immunity mainly on the effects of antibodies. In fact, these two functions cooperate to produce an immune response.
  • the antibody is expressed as a cell surface receptor for B cells generated in bone marrow.
  • the diversity of antigens recognized by the first antibody formed in the living body is said to be on the order of 10 9 to LOU pieces, and such an antibody (antigen reception) is considered to be any antigen determination that may exist in the environment. Recognize groups. However, although these diverse antigen receptors generally have a low ability to bind to an antigen and low affinity antibodies are often produced, this does not result in a sufficient immune response.
  • Lymphocytes in particular B cells / immunoglobulins (antibodies), are used in various applications based on their immune reaction, for example, kits for detecting antigens such as pathogens, diagnostic agents, and therapeutic agents.
  • kits for detecting antigens such as pathogens, diagnostic agents, and therapeutic agents.
  • an antibody highly reactive to an antigen is used as an antibody in such an antigen detection agent or various disease therapeutic agents, the sensitivity to the antigen is excellent and the performance as a therapeutic agent at the same dose is excellent.
  • no means have been known for enhancing the affinity of antibodies.
  • the present invention relates to a high-affinity antibody that is effective as a diagnostic and therapeutic agent for various diseases, a lancing mice for producing the antibody, and the high-affinity antibody or high-affinity antibody-producing cells.
  • the purpose is to provide a drug.
  • the inventor of the present invention has produced a transgenic animal into which a GANP gene has been introduced, and when it is immunized with an antigen, the transgenic animal can produce high affinity antibodies.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • the introduced GANP gene can be expressed in B cells.
  • the transgenic animal of the present invention or a progeny thereof can be generated from ES cells transfected with the GANP gene. Mammals include, for example, mice.
  • a method for producing a high affinity antibody which comprises administering an antigen to the transgenic mammal or a progeny thereof, and collecting an antibody from the resulting animal or progeny.
  • Antibodies of the present invention are those which affinity is represented by 1 X 10- 7 (M) or less.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • a hybrid antibody or human antibody or fragment thereof comprising the V region of the antibody or fragment thereof.
  • a pharmaceutical composition comprising at least one selected from the group consisting of the antibody or a fragment thereof and the humanized antibody or a human antibody or a fragment thereof.
  • FIG. 1 shows the results of immunohistochemical analysis using anti-GANP monoclonal antibody and ALP-conjugated anti-rat Ig antibody.
  • the scale bar is 100 111.
  • FIG. 2 shows the appearance rate of GANP hi cells in the popliteal lymph nodes of female NZB mice. Scale bar is 100 m.
  • FIG. 3 shows the appearance rate of GANPW cells in the spleen of female NZB mice.
  • the scale bar is 100.
  • FIG. 4 shows the results of staining of spleen sections from multiple strains of mice with anti-GANP monoclonal antibody. : RP; red pulp, F; follicle. Scale bar is 100 m.
  • FIG. 5 shows the identification of GANPW cells in the red pulp of the spleen.
  • FIG. 6 shows the identification of plasma cell markers in GANPW cells. Scale bar is 100 m.
  • FIG. 7 shows the expression of GANP hi cells in the red pulp area of the spleen of C57BL / 6 mice by TD-Ag immunization.
  • the scale is 100 m.
  • Figures 8A-C show somatic mutations of transfectants stably expressing murine GANP in Daudi cells.
  • FIGS 9A-C outline the generation of transgenic mice overexpressing GANP in B cells.
  • FIG. 10 shows the results of analysis of somatic mutations in GANP overexpressing transgenic (Tg) mice or wild type mice.
  • FIGS 11A-E show an overview of the generation of B cell specific GANP deficient mice (B_GANP).
  • B_GANP B cell specific GANP deficient mice
  • FIG. 12 shows the results (flow cytometry 1) of cell surface staining using B cell specific GANP deficient mice (B-GANP ⁇ ).
  • FIG. 13 shows the results of B cell proliferation assay. Although there was almost no difference, only the growth by anti-CD40 antibody stimulation was reduced to about 1/2.
  • FIG. 14 shows antibody titers in sera of non-immunized Cre-flox / + mice and B-GANP + mice. There was no difference in the antibody titers of the various isotypes.
  • FIG. 15 shows the results of measurement of antibody production in B-GANP ⁇ / ⁇ mice.
  • FIG. 16 shows the results of staining of GC with peanut agglutinin.
  • FIG. 19 shows the results of flow cytometry of GC-B cells.
  • FIG 20A ⁇ F is, Cre-flox / + a V H 186.2 was amplified by PCR, and (following the order F from A) the Sequence Analysis row one are shown the results.
  • FIG 20G ⁇ L is, Cre-flox / + a V H 186.2 was amplified by PCR, and (following the order from G to L) shows the results of one row of the Sequence analysis.
  • FIG. 21 shows the frequency of IgG1 mutations in Cre-flox / + and B-GANP mice.
  • FIG. 22 shows the frequency of mutation when the 33rd W of VH 186.2 is mutated to L.
  • FIG. 23 shows the results of measurement of activation-induced cell death (AICD) and the results of suppression of apoptosis.
  • AICD activation-induced cell death
  • FIG. 24 shows the results of measurement of the apoptosis sensitivity of cells to anti-CD40 and anti-CD95 stimulation.
  • FIG. 25 shows the results of detection of apoptotic cells by TUNEL assay.
  • FIG. 26 shows the results of detection of apoptotic cells by TUNEL assay.
  • FIG. 27 shows UNA expression levels of Bcl-2 family involved in suppression of apoptosis.
  • FIG. 29 shows the results of high affinity antibody production using hybridoma clones derived from GANP transgenic mice.
  • FIG. 30 shows binding and dissociation curves by Biacore using hybridoma culture supernatants derived from GANP transgenic mice.
  • FIG. 31 shows binding and dissociation curves by Biacore using hybridoma culture supernatants derived from GANP transgenic mice.
  • Figure 32 shows a schematic of the structure of the GANP-GST fusion protein.
  • FIG. 33 shows the results of a pull-down assay to determine the region of GANP that directly binds MCM. The position of the size standard is shown on the left.
  • FIG. 34 shows the results of pull-down assays using in vitro translated MCM.
  • Figure 35 shows binding of each GANP construct to MCM by immunoprecipitation.
  • Figures 36A-B show the binding of each GANP construct to MCM by immunoprecipitation.
  • FIG. 37 shows an overview of the structure of the GANP construct and the intracellular distribution of the construct.
  • Figure 38 shows the intracellular distribution of GANP construct.
  • Figure 39 shows the localization of MCM3 in the nucleus.
  • FIG. 40 shows cytoplasmic localization of MCM3 induced by expression of GANP.
  • FIG. 41 shows a control protein localized to the nucleus.
  • FIG. 42 shows the effect of GANP constructs on the localization of MCM 3 mutants.
  • FIG. 43 shows nuclear-cytoplasmic shuttling of MCM3 detected by heterokaryon assembly.
  • Figure 44 shows the localization of GANP during cell cycle.
  • the present invention has been completed based on the finding that high affinity antibodies can be obtained by introducing a GANP gene into a non-human mammal to produce a transgenic animal and immunizing such transgenic animal with an antigen. It is 1.
  • GANP is called Germinal center-associated nuclear protein and is a 210 kDa nuclear protein having homology with yeast Sac3 protein (WO 00/50611). And, SAC3 is characterized as an inhibitor of clergyin formation.
  • GANP is selectively upregulated in germinal center (GC) B cells surrounded by follicular dendritic cells (FDCs) and has phosphorylation-dependent RNA-primase activity. And proteins involved in cell cycle regulation of B cells (Kuwahara, K. et al "(2000) Blood 95, 2321.2328).
  • the amino acid sequence of the GANP protein is shown in SEQ ID NO: 2 for mice and in SEQ ID NO: 4 for humans.
  • the base sequence of the gene encoding GANP protein (referred to as GANP gene) is shown in SEQ ID NO: 1 for mouse and SEQ ID NO: 3 for human.
  • the above amino acid sequence and base sequence are also described in International Publication WO 00/50611.
  • the GANP protein may be a mutant, which is an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and is a protein having RNA primase activity. It is also good. For example, one or more (preferably one or several (eg, 1 to 10, more preferably 1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 are deleted.
  • one or more (preferably one or several (eg, 1 to 10, more preferably 1 to 5)) amino acids are substituted with another amino acid, and or 1 or It consists of an amino acid sequence to which a plurality of (preferably 1 or several (eg 1 to 10, more preferably 1 to 5)) other amino acids have been added, and is similar to the above GANP protein It is also possible to use GANP variant proteins having RNA priming activity.
  • RNA primase activity refers to a short primer which is a starting point of elongation when synthesizing a strand (lagging strand) opposite to the strand elongation in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction in RNA replication.
  • primer primer A molecule that binds to the DNA polymerase ⁇ is used, but in germinal center B cells, a second primase, GANP primase, is also induced.
  • the GANP protein has an amino acid sequence shown in the above SEQ ID NO: 2 or 4 or a variant amino acid sequence thereof, as well as a partial sequence at the N-terminal side (eg, Nos. 1 to 600 of the amino acid sequence shown in SEQ And those having a mutant amino acid sequence of these.
  • the GANP gene to be introduced into an animal includes the above GANP protein, a part of the N-terminal sequence, or a gene encoding a mutant protein.
  • a gene for example, one having a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 can be used.
  • the base sequence of only the coding region may be used.
  • the “stringent conditions” are the conditions for washing after hybridization, which have a salt (sodium) concentration of 150 to 900 mM, a temperature of 55 to 75 ° C., preferably salts (sodium). It refers to the conditions at a concentration of 250-450 mM and a temperature of 68 ° C.
  • a known kit such as Kunkel method or Gapped duplex method, for example, a kit for introducing a mutation using site-directed mutagenesis, for example, GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen Corporation) And TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (MutarrK, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Yukara Bio Inc.).
  • Kunkel method or Gapped duplex method for example, a kit for introducing a mutation using site-directed mutagenesis, for example, GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen Corporation) And TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (MutarrK, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Yukara Bio Inc.).
  • RNA-primase activity of GANP (Kuwahara, K. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 10279-10283).
  • the RNA-primase domain at the N-terminal side of the GANP protein contains a serine residue, and its phosphorylation is catalyzed by Cdk2 at ⁇ .
  • the C-terminal domain binds GANP to the MCM3 replication licensing factor (Kuwahara, K. et al "(2000) Blood 95, 2321-2328; Abe, E. et al. (2000) Gene 255, 219-227). .
  • the present invention relates to a transgenic mammal into which a GANP gene has been introduced, which is preferably capable of expressing the introduced GANP gene in B cells.
  • the complex formed by the GANP gene and its related molecule is a molecule required directly and indirectly in the process of inducing mutation in the gene. Since the GANP protein has the ability to promote the induction of mutations in the V region so as to obtain a high affinity antibody when repairing gene mutations, the transgenic mammals of the present invention
  • the introduction of this GANP gene or its mutant gene can promote high affinity antibody production for acquired immunity.
  • transgenic non-human mammals overexpressing this gene can rapidly produce an antibody with high antigen-binding ability. Therefore, by immunizing the above-mentioned transgenic non-human mammal with a predetermined antigen, a high-affinity antibody which can not be obtained conventionally can be conveniently obtained.
  • polyclonal antibodies or monoclonal antibodies capable of eliminating intractable pathogenic microorganisms and foreign substances can be obtained.
  • a humanized antibody using the transgenic animal of the present invention, or alternatively, producing a single-chain antibody containing the V region of the antibody produced by the transgenic mammal of the present invention. And, it is possible to dramatically increase the efficacy of antibody therapy.
  • the transgenic mammal of the present invention can promote the production of a high affinity antibody in B cells by the introduction of GANP or its mutant gene, and the high affinity antibody Producer cells are resistant to signals that induce apoptosis.
  • GANP is a molecule that functions in antibody production of the acquired immune response
  • the present inventors first designed to selectively deficient B cells deficient in GANP gene. As a result, it was found that even if the GANP gene is deleted, no influence is observed on the development, differentiation, and proliferation of cells in the immune system, and no significant change is seen in the total production of antibodies.
  • T cell independent antigens Antigens that produce antibodies even in the absence of T cells are called T cell independent antigens.
  • general antigens other than T cell independent antigens are called T cell dependent antigens.
  • T cell dependent antigens differentiation of B cells into antibody producing cells is assisted by helper T cells.
  • antigenic determinants of pathogenic viruses are weakly immunogenic in themselves and are activated by the peptide antigens of carrier proteins recognized by T cells.
  • GANP transgenic animals can frequently produce highly compatible antibodies against antibody production responses to soluble antigens that can not produce strong antibodies in normal animals.
  • a nitrophenyl group (NP group), which is being analyzed as a hapten, was conjugated to dity-gamma globulin to prepare an antigen (referred to as NP-CG), and the reaction of T cell-dependent antigen was examined.
  • VH 186.2 the V region of the IgG heavy chain of the antibody
  • VH 186.2 the V region of the IgG heavy chain of the antibody
  • L the chain lambda 1 gene
  • the present inventor examined whether or not high affinity antibodies were produced when W33-L mutation was caused in GANP gene-deficient mice. As a result, almost no high affinity antibody production was observed compared to the control Cre_flox / + mice. Therefore, it was found that the GANP gene is a gene having an important function for producing high affinity antibodies. To further verify this, mice overexpressing the GANP gene were generated. Overexpression of the GANP gene can be achieved by ligating the mouse immunoglobulin promoter and the human immunogloblin gene part to the 5 'side of the GANP gene and selectively expressing it in B cells. The
  • the term "mammal” means any non-human mammal such as ushi, kuma, buda, cypress, sagi, fin, cat, mouse, rat, hams and guinea pig, preferably Is a mouse, rabbit, rat or hamster, particularly preferably a mouse.
  • the transgenic mammal according to the present invention is preferably a stage of embryonic development in the development of a non-human mammal, preferably an unfertilized egg, a fertilized egg, a spermatozoa including sperm and progenitor cells thereof, and the like (more preferably The calcium phosphate method, the electric pulse method, the liposome method, the agglutination method, the microinjection method, the particle gun method, the DEAE-Dekiss method, for cells at the single cell stage or the fertilized egg cell stage and generally before the 8-cell stage). It can be produced by introducing the GANP gene by the orchid method or the like.
  • the GANP gene of interest can be transferred to a somatic cell, an organ of a living body, a tissue cell or the like by the above gene transfer method, and can be used for cell culture, tissue culture or the like.
  • transgenic mammals can also be produced by fusing these cells with the above-mentioned embryo cells by a known cell fusion method.
  • a vector having a GANP gene linked to a downstream of various promoters capable of expressing the GANP gene from various mammals having the target GANP gene is a fertilized egg of the target mammal (for example, The transgenic mouse can be used to produce a transgenic mouse that highly expresses the target GANP gene by microinjection into the fertilized mouse egg.
  • Examples of expression vectors for the GANP gene include a plasmid derived from E. coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as single colony leukemia virus, an animal or insect such as vaccinia virus or baculovirus Virus etc. are used.
  • promoters that regulate gene expression include promoters of virus-derived genes, and promoters of various mammals (humans, Japanese rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and birds (such as chickens) -derived genes It is possible to use one hour or the like.
  • a promoter for a virus-derived gene for example, cytomegalovirus, Promoters of Moloney Leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, etc. derived genes can be mentioned.
  • promoters for various mammalian and avian-derived genes include, for example, albumin, insulin II, erythropoietin, endothelin, avesocalcin, muscle creatinine kinase, platelet derived growth factor; 8, keratin, ⁇ , K14, collagen Type I and II, atrial natrium diuretic factor, dopamine beta-hydroxylase, endothelial receptor tyrosine kinase, sodium potassium adenosine triphosphate, neurofilament light chain, meta-portal thionein I and zeta, meta Oral protein 1 tissue inhibitor 1, MHC class I antigen, smooth muscle blockin, polypeptide chain elongation factor la (EF-la), ⁇ -r-cutin, ⁇ ⁇ and / 3 myosin heavy chain, myosin light Chains 1 and 2, myelin basic protein, serum amyloid ⁇ component, myoglobin, There is a promotor of genes such as
  • the above vector may have a terminator that terminates transcription of the target messenger RNA in transgenic mammals.
  • a terminator that terminates transcription of the target messenger RNA in transgenic mammals.
  • the GANP gene can be linked to the B gene by linking the GANP gene downstream of the immunoglopurine promoter, or by linking the human immunoglobulin gene intron enhancer portion to the 5 'side of the GANP gene. It can be selectively expressed in cells.
  • the introduction of the GANP gene at the fertilized egg cell stage is preferably ensured so as to be present in excess in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • the excess of the GANP gene in the germinal cells of the produced animal after gene transfer means that all offspring of the produced animal have the GANP gene in excess in all the germ cells and somatic cells. Means And, the offspring of this type of animal that inherits the gene have an excess of GANP protein in all of their embryo cells and somatic cells.
  • heterozygotes having the transgene in one of the homologous chromosomes are obtained, and heterozygotes are mated to obtain homozygotes having the transgene in both of the homologous chromosomes.
  • all offspring stably retain the introduced GANP gene. Then, it is confirmed that they have an excess of GANP gene, and can be bred and passaged in a normal breeding environment.
  • an exogenous GANP gene which is a gene different from the endogenous gene possessed by the transgenic subject animal, to a target non-human mammal (preferably a mouse or the like) or a fertilized egg (backcross) of its ancestor Fertilized eggs are obtained by crossing the same male mammal and female mammal.
  • a target non-human mammal preferably a mouse or the like
  • a fertilized egg (backcross) of its ancestor Fertilized eggs are obtained by crossing the same male mammal and female mammal.
  • fertilized eggs can also be obtained by natural mating, a method of artificially adjusting the sexual cycle of a female mammal and mating with a male mammal is preferred.
  • a method of artificially adjusting the sexual cycle of a female mammal for example, follicle stimulating hormone (fertility serum gonadotropic hormone (PMSG)), and then luteinizing hormone (human chorionic gonadotropin (hCG ) Is preferred, for example, by intraperitoneal injection.
  • PMSG ility serum gonadotropic hormone
  • luteinizing hormone human chorionic gonadotropin (hCG )
  • a non-human mammal having a DNA incorporating the foreign gene is artificially transplanted and implanted into a female mammal.
  • a method for artificially transplanting / implanting a fertilized egg to a pseudopregnant female mammal whose fertility is induced by mating with a male mammal after administering luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) to a female mammal Is preferred.
  • LHRH luteinizing hormone-releasing hormone
  • fertilized eggs and early embryos can be used as totipotent cells into which genes are introduced.
  • DNA microinjection is preferable.
  • the fertilized ova into which the gene has been injected is then transplanted into the fallopian tube of a temporary parent, and after raising the animal that has developed to an individual and reared it as a foster parent, a part of the body (in the case of a mouse, for example, tail tip) Extract DNA from DNA, and analyze the presence of the transgene by Southern analysis or PCR. It can be confirmed. If the individual in which the presence of the transgene is confirmed is the founder (Founder), the transgene is transmitted to 50% of its offspring (F1).
  • an individual (F2) having a transgene in one (heterozygous) or both (homozygous) of diploid chromosomes is generated.
  • GANP protein highly expressing transgenic mammals can also be prepared by introducing the above-described GANP gene into ES cells (embryonic stem cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • the GANP gene is introduced into HPRT negative (hypoxanthine guanosine phosphoribosyltransferase gene) ES cells derived from normal mouse blastocyst (blastocyst).
  • HPRT negative hyperxanthine guanosine phosphoribosyltransferase gene
  • the GANP gene is subjected to homologous recombination on the mouse endogenous gene, and the integrated ES cells are selected by the HAT selection method.
  • the sorted ES cells are microinjected into fertilized eggs (blastocysts) obtained from another normal mouse.
  • the obtained blastocysts are transplanted into the uterus of another normal mouse as a temporary parent.
  • chimeric transgenic mice are born from temporary parent mice.
  • a heterotransgenic mouse can be obtained by mating a born chimeric transgenic mouse with a normal mouse. Then, homotransgenic mice can be obtained by crossing heterotransgenic mice.
  • transgenic mammals not only the above-mentioned transgenic mammals but also their offspring, as well as the transgenic mammals or part of their offspring are within the scope of the present invention.
  • tissues, organs and cells of such transgenic mammals or their progeny may be mentioned, and as organs or tissues, spleen, thymus, lymph nodes, bone marrow or tonsils etc.
  • the cells include B cells.
  • the transgenic mammal of the present invention can also be mated with a mammal that further activates B cells, which can further produce high affinity antibodies.
  • MRL / lpi ', NZB, (NZB x NZW) Fl which are considered as autoimmune disease mice, as an animal that further activates the B cells.
  • the antibody in the present invention means a protein having an activity of specifically binding to an antigen, and is preferably produced by B cells.
  • an antibody highly reactive to an antigen is referred to as a high affinity antibody.
  • "High affinity" means that the binding ability of the antibody to the antigen is high, and in the present invention, the binding ability of the antibody is higher than that of an antibody produced using a general animal such as a mouse. High and, conversely, antibodies that are slow to dissociate from the antigen of interest. This means that the ability to bind closely in close proximity to an antigenic determinant (epitope) is high and specific, and binding of an antibody results in not only the antigenic determinant but also the antigen thereof.
  • the resulting potent activity (neutralization of virulence, prevention of infectivity of virus etc., inactivation of pathogen, inactivation of in vivo, promotion of elimination from in vivo, denaturation of antigen molecule, etc. Creature It also includes the indication of activity).
  • the binding ability (affinity) of the antibody is measured as a dissociation constant (KD), dissociation rate constant (Kdiss), or binding rate constant (Kass) by Scatchard yard analysis or a surface plasmon resonance sensor called Biacore.
  • KD dissociation constant
  • Kdiss dissociation rate constant
  • Kass binding rate constant
  • the Biacore instrument integrates the three technologies of sensor chip, microchannel system, and SPR detection system to measure the strength, speed, and selectivity of molecular binding, and is used in real time without labeling. It can detect biomolecules and monitor interactions between multiple molecules. Examples of Biacore devices include Biacore 3000, Biacore 2000, Biacore X, Biacore J, and Biacore Q (all are Biacore).
  • the antibody is preferable in that the smaller the dissociation constant (KD value), the higher the affinity.
  • KD value dissociation constant
  • the binding ability (affinity) of an antibody is determined by two parameters, Kdiss and Kass.
  • KD [M] Kdiss / Kass
  • KD value is less than 1 X 10- 7 (M), for example ⁇ ⁇ ⁇ 8 (M) hereinafter , ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ - ⁇ ( ⁇ ) or less, or IX 10-u (M) or less.
  • the produced antibody when the produced antibody is an antibody that exerts any of the above-mentioned functions or properties, it is judged to be "high affinity".
  • the affinity enhancement of antibody molecules is produced by the induction of somatic mutation (SHM) in the variable region (V region) gene of the antibody gene. Specificity of the antibody to the antigen has been observed since the initial immunization of the antigen in the body, but many of the initial antibodies are of the IgM class, and their binding affinity to the antigen is not high, and they remove pathogens and foreign substances, The ability to inactivate is low. However, if the antigen is administered to the living body and several booster immunizations are performed The binding affinity of the antibody for the antigen is increased.
  • An antibody derived by immunizing a C57BL / 6 mouse with a nitrophenyl-nitrile globulin as an antigen of a hapten carrier uses a V H 186.2 locus as the ⁇ chain and an ⁇ L light chain.
  • the antibody obtained by the booster immunization is an IgGi antibody, and among these, the mutation induced to the V region sequence of the antibody with high binding affinity is that the 33rd tributophane is mutated to leucine. It has been known.
  • high-affinity-type V region mutations have been induced in this model system, with clear evidence at the molecular level indicating that high-affinity antibodies have been induced. It can be said that there is.
  • high affinity antibodies can be obtained by administering an antigen to the above-mentioned transgenic mammals or their progeny to produce antibodies. That is, the antigen of interest is administered to an animal in which GANP protein is highly expressed in a conventional manner, and the affinity of the sensitized animal is higher than lymphocytes of tissues (not limited to these tissues) such as blood or spleen.
  • Antibodies can be prepared.
  • the high affinity antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • an antigen is administered to a rabbit lanthanum mammal of the present invention to immunize it, blood is collected from the immunized mammal, and the antibody is separated and purified from the collected blood. It can be obtained by
  • Methods of immunization are known to those skilled in the art, for example, for administering the antigen one or more times. Can do more.
  • the type of antigen is not particularly limited, and all substances capable of having a three-dimensional structure as an antigenic determinant are applicable, and all biological components such as proteins, enzymes, peptides, sugars, lipids, DNA, RNA, and prions are applicable.
  • any of cancer antigens, virus antigens, organic and inorganic synthetic antigens can be used.
  • Is antigen administration for example? It may be administered 2-3 times at intervals of 30 days.
  • the dose can be, for example, about 0.05 to 2 mg of antigen per dose.
  • the route of administration is also not particularly limited, and subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, etc. can be selected as appropriate, but intravenous, intraperitoneal or subcutaneous injection It is preferable to use Alternatively, the antigen may be dissolved in an appropriate buffer, for example, an appropriate buffer containing a commonly used adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide, depending on the administration route and conditions, etc. In some cases, they do not use an adjuvant.
  • a commonly used adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide
  • the serum of the mammal is sampled and the antibody titer is measured.
  • the antibody titer has risen, for example, 100 to: 1000 tg of antigen can be used for boosting.
  • blood is collected from the immunized mammal, and the blood is subjected to various conventional methods used for separation of proteins, for example, centrifugation, precipitation with ammonium sulfate or polyethylene glycol.
  • Polyclonal antibodies can be obtained as polyclonal antisera by chromatography such as gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
  • the hybridoma method can be mentioned.
  • the peptide constituting the antigen of interest is suspended in an adjuvant, and the resulting suspension is administered subcutaneously or intradermally to the immunized animal (ie, the transgenic mammal of the present invention).
  • the type of antigen is the same as described above.
  • adjuvants Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, BCG, trehalose dimycolate (TDM), lipopolysaccharide (LPS), alum adjuvant, silica adjuvant etc.
  • TDM trehalose dimycolate
  • LPS lipopolysaccharide
  • silica adjuvant etc.
  • antibody induction Seki no Noeki From the point of view, it is preferable to use Freund's complete adjuvant (CFA) and Freund's incomplete adjuvant (IFA) in combination.
  • CFA Freund's complete adjuvant
  • IFA Freund's incomplete adjuvant
  • the immunized animals be further boosted several times after the initial immunization with an antigen, and after an appropriate number of days, partial blood sampling is performed to measure the antibody titer.
  • the antibodies produced by the methods of the present invention are high affinity antibodies, the first immunization may be sufficient for the first immunization.
  • the antibody titer can be measured by a known method such as, for example, enzyme immunoassay (hereinafter referred to as "ELISA").
  • the spleen is then removed from the sensitized immune animal to obtain B cells. At this time, it is preferable to obtain B cells that bind to the antigen, since it is possible to reduce the subsequent screening.
  • the B cells obtained here are high-affinity antibody-producing cells, which can also be used as immunostimulants.
  • a V region gene can be obtained directly from B cells and somatic mutations in the V region can be measured.
  • B cells are fused with myeloma cells in a conventional manner to produce antibody-producing hybrids.
  • the spleen is removed, and the removed spleen is placed in, for example, Hank's balanced salt solution (HBSS), and cells are extruded with forceps to obtain spleen lymphocytes (B cells).
  • HBSS Hank's balanced salt solution
  • B cells spleen lymphocytes
  • the obtained splenic lymphocytes are stained with a trypanble or the like staining solution to count the number of viable cells, and fused with myeloma cells to obtain a hybridoma.
  • the myeloma cells used for cell fusion are not particularly limited, and known ones can be used. For example, mentioning P3-X63.Ag8 (X63), P3-X63.Ag8.Ul (P3U1), P3 / NS I / l-Ag4 '(NSI), Sp2 / 0-Agl4 (Sp2 / 0), etc. Can. When selecting myeloma cells, consider their compatibility with antibody-producing cells as appropriate.
  • Cell fusion is carried out in a culture medium for animal cell culture, such as serum-free DMEM, RPMI-1640 medium, 1 10 6 to 1 10 7 cells / 1 1 1 1 antibody-producing cells and 2 10 5 to 2 10 6 cells / £ 11 (5: 1 cell ratio between antibody-producing cells and myeloma cells is preferred) and the fusion reaction is performed in the presence of a cell fusion promoter.
  • a culture medium for animal cell culture such as serum-free DMEM, RPMI-1640 medium, 1 10 6 to 1 10 7 cells / 1 1 1 1 antibody-producing cells and 2 10 5 to 2 10 6 cells / £ 11 (5: 1 cell ratio between antibody-producing cells and myeloma cells is preferred
  • Cell fusion method Sendai virus method, polyethylene glycol method, proto
  • methods known in the art such as the plast method can be arbitrarily selected and used
  • the polyethylene glycol method is particularly preferable because it is relatively less cytotoxic and the fusion operation is easy.
  • polyethylene glycol as a cell fusion promoter one having an average molecular weight of 1000 to 6000 daltons can be used.
  • a hybridoma in which antibody producing cells stimulated with a vinylpyridine derivative and myeloma cells are fused.
  • the obtained hybridomas are cultured in a HAT medium (a medium containing hypoxanthine, paminoputerin and thymidine) for a suitable period according to a conventional method to select a hybridoma. Then, after screening for a target antibody-producing hybridoma, cloning of the hybridoma is performed.
  • HAT medium a medium containing hypoxanthine, paminoputerin and thymidine
  • a known antibody detection method can be used, and for example, ELISA method, radioimmunoassay (hereinafter referred to as "RIA") method, plaque method, agglutination reaction method and the like can be used.
  • RIA radioimmunoassay
  • cloning method methods known in the art can be used, and for example, limiting dilution method, soft agar method, FACS method and the like can be used.
  • the obtained hybridoma is administered, for example, into the abdominal cavity of a mouse, which is compatible with an ability to culture in a suitable culture solution or with a hybridoma.
  • the desired monoclonal antibody can be isolated and purified from the thus obtained culture solution or ascites fluid by salting out, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, or the like.
  • fragments of the antibodies described above and single chain antibodies of the V region are fragments of the antibodies described above and single chain antibodies of the V region.
  • the fragment of the antibody means the partial region of the aforementioned polyclonal antibody or monoclonal antibody, specifically, F (ab ') 2, Fab', Fab, Fv (variable fragment of antibody), sFv There are dsFv (disulphide stabilized Fv), a single dAb (single domain antibody) and the like.
  • F (ab ′) 2 ” and “Fab ′” are produced by treating dinoglobin (monoclonal antibody) with the proteases pepsin, papain, etc., respectively, in the hinge region.
  • IgG When IgG is treated with pepsin, it is cleaved downstream of the disulfide bond existing between the two H chains in the hinge region to produce an antibody fragment slightly larger than the two Fab's linked by the hinge region. can do. This antibody fragment is called F (ab ') 2 .
  • Single-chain antibodies have a structure in which V L and V H are linked by a linker.
  • the high affinity antibody of the present invention may be a humanized antibody or a human antibody. These antibodies can be used to immunize a mammal whose immunity system has been replaced with that of human, to produce a human antibody directly as a conventional monoclonal antibody.
  • a humanized antibody the variable region of the mouse antibody to the complementarity determining region
  • CDR complementarity determining region
  • human antibodies generally have problems with their antigen binding sites in the V region, ie, their hypervariable regions, their specificities and binding affinities, they may be constructed in any animal (mouse) , Rats, etc.). On the other hand, it is desirable that the structure of the other part of the V region and the constant region have the same structure as human antibodies.
  • a gene engineering method has been established for gene sequences common to humans.
  • Isotype of the antibody of the present invention is not particularly limited, for example, IgG (IgGi, IgG 2, IgG 3, IgG 4), with IgM, IgA (IgAi, IgA 2 ), any Aisotai flop IgD or I g E be able to. 4.
  • the high affinity antibody of the present invention is useful as a drug for diagnosing, treating or preventing a disease.
  • the diagnostic method for various diseases using the antibody of the present invention comprises combining a sample collected from a subject suspected of various diseases, such as serum, etc. with the antibody of the present invention by an antigen-antibody reaction, and It is carried out by detecting the amount of the target antigen in the sample. Detection of the amount of antibody may be performed according to a known immunoassay, and for example, immunoprecipitation, immunoagglutination, labeled immunoassay, immunonephelometry, immunoturbidimetric assay, etc. can be used. In particular, a labeled immunoassay is preferable in terms of simplicity and high sensitivity.
  • the antibody titer in a sample may be expressed by the amount of labeling directly detected using a labeled antibody, or may be relatively expressed using an antibody of known concentration or known antibody titer as a standard solution. That is, the standard solution and the sample can be simultaneously measured by the same measurement system, and the antibody titer in the sample can be relatively expressed based on the value of the standard solution.
  • labeled immunoassay known assays such as ELISA, RIA, fluorescence immunoassay, chemiluminescence immunoassay, etc. can be used arbitrarily.
  • an enzyme, a radioactive isotope, a fluorescent compound, a chemiluminescent compound and the like may be appropriately selected according to the above-mentioned measuring method.
  • the enzyme include peroxidase, alkaline phosphatase, acid phosphatase, glucose oxidase and the like. It is also possible to improve the detection sensitivity of the labeled substance by using an avidin / biotin complex as the above-mentioned labeled substance.
  • the radioisotope is mainly i 25 I
  • the fluorescent compound is forefluorinated thiothiocyan 1 (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC).
  • FITC forefluorinated thiothiocyan 1
  • TRITC tetramethylrhodamine isothiocyanate
  • Be Chemiluminescent compounds include oral fin, luminol, lucigenin and the like
  • Be The labeling of the antibody with the above-mentioned labeling substance can be carried out according to a conventional method.
  • a labeled immunoassay using a labeled antibody will be described.
  • Labeled immunoassays can be used to detect various diseases using known non-competitive reaction systems or competitive reaction systems.
  • noncompetitive reaction systems a solid phase is required (solid phase method).
  • solid phase method In the competitive reaction system, a solid phase is not necessarily required (liquid phase method), but using a solid phase is preferable because the measurement procedure is simplified.
  • the material of the solid phase include polystyrene, nylon, glass, silicon rubber, cellulose and the like, and the shape of the solid phase includes spheres, wells, tubes, sheets and the like. There is no limitation to these, and known ones used for labeled immunoassay can be optionally used.
  • the measurement procedure is to immobilize the sample or the antibody of the present invention, then react with the antibody or sample of the present invention, and then pre-label anti-immunoglobulin antibody (second antibody Add and react with the antibody reacting with the immobilized sample.
  • second antibody Add pre-label anti-immunoglobulin antibody
  • the labeling of this secondary antibody makes it possible to detect the amount of antibody bound to the sample. Since the amount of labeled secondary antibody detected is positively correlated with the amount of the target antigen in the sample, the amount of the target antigen in the sample can be determined.
  • a sample and a fixed amount of a target antigen are competitively bound to a fixed amount of antibody.
  • the sample is immobilized, it is reacted with the antibody of the present invention to which the target antigen has been added and reacted.
  • the antibody reacted with the immobilized sample is reacted with a previously labeled anti-immunoglobulin antibody (second antibody), and the amount of antibody can be detected by the labeled substance.
  • the amount of label detected is inversely correlated with the amount of the target antigen added.
  • the antibody of the present invention is immobilized, reacted with the sample, and then reacted with a target antigen which has been labeled in advance.
  • the amount of label detected is inversely correlated with the amount of GANP protein in the sample bound to the antibody.
  • an anti-immunoglobulin antibody for example, An anti-IgG antibody, an anti-IgM antibody etc. can be used.
  • antibody molecules may be used as they are, or alternatively, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 which is an antibody fragment containing an antigen binding site obtained by enzymatic treatment of the antibody may be used. It is also good.
  • a substance having specific affinity for the antibody molecule such as protein A having specific affinity for IgG may be used by labeling.
  • the labeled immunoassay include an enzyme-labeled immunoassay and an ELISA method.
  • the ELISA method is, for example, placing a sample or a diluted solution thereof in a 96-well plate and allowing it to stand overnight at 4 ° C to room temperature or for 1 to 3 hours at 37 ° C to adsorb GANP protein to be detected. Let it solidify. Next, the antibody of the present invention is reacted, and then an enzyme-conjugated anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody) is reacted. Finally, a suitable chromogenic substrate (eg, P-nitrophenyl phosphate if the enzyme is phosphatase) is added to react with the enzyme, and the antibody is detected by this color development.
  • a suitable chromogenic substrate eg, P-nitrophenyl phosphate if the enzyme is phosphatase
  • the efficacy of therapeutic agents for various diseases can be evaluated.
  • the drug efficacy evaluation method using the high affinity antibody of the present invention comprises administering an agent to various disease patients or various disease model animals, and then using the antibody of the present invention, the amount of antigens such as viruses in these living organisms. By detecting and comparing the amounts, it is possible to evaluate the efficacy as a therapeutic agent for various diseases through the amount of antigen in a living body.
  • the high affinity antibody of the present invention can be provided in the form of a kit for diagnosing various diseases.
  • the kit can be used for the diagnostic method of the present invention and the efficacy evaluation method of the present invention.
  • the kit of the present invention contains at least one or more selected from the following (a) and (b).
  • the labeled substance of the antibody means one labeled with an enzyme, a radioactive isotope, a fluorescent compound, or a chemiluminescent compound.
  • the antibodies, or the solid Examples of the material include polystyrene, nylon, glass, silicone rubber, cellulose gel, and the like.
  • the shape of the solid phase include, but are not limited to, spheres, wells, tubes, and sheets.
  • a solid phase and a solid phase reagent necessary for the solid phase attachment may be attached.
  • immobilization by physical adsorption for example, 50 mM carbonate buffer (pH 9.6), 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5, containing 100 mM sodium chloride), PBS, etc.
  • immobilization reagent include a solution and a blocking solution containing 0.5% gelatin or the like in the coating solution, if necessary.
  • the antibody in the kit of the present invention may be in a state of being dissolved in PBS or the like, or in a state of being bound to a gel (hereinafter referred to as “absorbable gel”).
  • the absorption gel may be further packaged in an appropriate amount, for example, 0.5 to 2 ml of microcentrifuge tube for absorption by a batch method, or column volume for absorption by a column method. May be pre-packed in 0.1 to 5 ml mini-columns.
  • the kit of the present invention includes the components described above, and other reagents for carrying out the detection of the present invention, for example, when the label is an enzyme label, an enzyme substrate (chromogenic substrate etc.), an enzyme substrate solution An enzyme reaction stop solution, or a sample dilution solution may be included.
  • the sample dilution solution for example, PBS (physiological phosphate buffer, pH 7.4), pH 7.4, 20 mM Tris-hydrochloride buffer (hereinafter referred to as “ TBS (abbreviated as TBS), 0.05% Tween 20, PBS containing 0.1 to 1% of BSA, TBS and the like can be mentioned.
  • TBS physiological phosphate buffer, pH 7.4
  • TBS Tris-hydrochloride buffer
  • the sample dilution solution may be used for dilution of an antibody, for example, other than sample dilution.
  • the high-affinity antibody of the present invention is useful as a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease, as long as it has an action to neutralize the activity of the antigen causing the disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably comprises the high affinity antibody of the present invention or a fragment thereof as an active ingredient and is further provided in the form of a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier means excipients, diluents, fillers, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, coloring agents, sweeteners, thickeners And flavoring agents, solubilizers and other additives.
  • compositions in the form of tablets, pills, powders, granules, injections, solutions, capsules, troches, elixirs, suspensions, emulsions or syrups by using one or more of such carriers
  • the composition can be prepared.
  • These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally.
  • Other forms for parenteral administration include external solutions formulated in accordance with the conventional method, one or more active substances, suppositories and vessaries for enteric administration, and the like.
  • the dose of the drug of the present invention may vary depending on the patient's age, sex, body weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, type of high affinity antibody which is the active ingredient contained in the drug, etc. Usually, it can be administered at a dose of 10 Zg to 1000 mg, preferably 10 mg to 100 mg per one adult, but it is not limited to this range.
  • the injection it is dissolved or pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection to a concentration of 0.1 antibody / ml carrier to 10 mg antibody / ml carrier or It can be produced by suspending.
  • the injection prepared in this way is preferably in the ratio of 1 g to 100 mg, preferably 50 g to 50 mg, per kg body weight per single dose for human patients in need of treatment. It can be administered once to several times a day.
  • the mode of administration includes intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection or intraperitoneal injection and the like, with preference given to intravenous injection.
  • injections are optionally prepared as non-aqueous diluents (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.), suspensions or emulsions. It can also be done.
  • non-aqueous diluents eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.
  • Such injections can be sterilized by filter sterilization through a bacteria retention filter, incorporation of a bactericidal agent or irradiation.
  • the injection can be prepared as a form of preparation at the time of use. That is, it is used as a sterile solid composition by a lyophilization method etc. and dissolved in sterile distilled water for injection or other solvents before use can do.
  • the B cell tumor strain was able to achieve a dramatic somatic mutation induction effect of the V region gene by GANP gene transfer. It showed that it had. This effect is not seen when using a mutant gene that does not cause phosphorylation of the 502nd serine, which is necessary for the RNA polymerase activity of GANP. It has been shown that the rapid induction of mutations requires an RNA primer activity. This result indicates that GANP has an enhancing effect on specific antibody production as a clinical adjuvant.
  • a retrovirus vector as a vector and combining TNF family single molecule stimulation such as CD40 and BAFF with GANP is also effective for clinical adjuvant activation.
  • induction of high affinity binding in T cells can also be expected by performing this gene transfer at the bone marrow cell level. If high-affinity antibodies such as AIDS, hepatitis C virus, adult T-cell leukemia, mad cow disease can not be obtained, or if they are obtained, the high-affinity antibody is If production can not be sustained, this gene transfer can be expected to exert excellent effects.
  • the GANP gene overexpressing mammal of the present invention is effective for developing a monoclonal antibody effective for producing a biological research reagent and a clinical test reagent.
  • a monoclonal antibody directed against a specific signal transduction molecule specifically to a functional domain or functional motif and a convenient, high-affinity antibody having high avidity can be used in a wide range of applications. Many antibodies do not undergo as much screening and may not be used for Western analysis and immunoprecipitation.
  • high affinity antibody-producing cells can be sorted in a short time from relatively few clones of antibodies, and the cost, time, and labor can be greatly reduced.
  • phosphorylated antibodies and the production of specific antibodies against gene mutations are diagnostic agents, Alternatively, it can be applied to selective injection of drugs using an antibody. It also enables the production of high affinity antibodies that selectively bind to the sequence or nucleotide portion of the gene.
  • high affinity antibodies have not been obtained conventionally, mice produced by crossing with autoimmune disease mice are effective for obtaining high affinity antibodies against any antigen. It is possible that high affinity antibodies with an avidity of 10-UM order can be produced by this method, and by introducing technological development of the ELISA method, it is possible to develop a technique for detecting trace substances easily. is there.
  • RNA primase inactive GANP gene means a gene lacking an RNA primer domain or a mutation in an RNA primer domain, which is caused by mutation of a nearby gene containing a mutation of the 502th serine residue. It refers to a gene that has produced a structural and functional change in the GANP molecule.
  • the gene therapeutic agent of the present invention can be produced by blending a recombinant vector containing the RNA primer inactivated GANP gene with a base used for the gene therapeutic agent.
  • vectors used for construction of recombinant vectors include retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, baculovirus vectors, vaccinia virus vectors, etc. as virus vectors.
  • Expression plasmids can also be used.
  • the vector one is preferably a viral vector.
  • a base used for injection can be usually used.
  • salt solution such as distilled water, sodium chloride or a mixture of sodium chloride and inorganic salt, mannitol, lactose, Solution such as dextran, glucose etc., amino acid solution such as glycine, arginine etc., organic acid solution or salt solution and glucose solution A mixed solution with a liquid, etc.
  • these bases are injected as solutions, suspensions and dispersions using an auxiliary agent such as an osmotic pressure adjusting agent, pH adjusting agent, vegetable oil or surfactant. Agents can also be prepared.
  • These injections can also be prepared as a preparation for dissolution at the time of use by operations such as powderization and lyophilization.
  • the administration mode of the gene therapeutic agent of the present invention may be general intravenous administration, systemic administration such as intraarterial, etc., or local administration such as local injection or oral administration.
  • the dose of the therapeutic agent for gene of the present invention varies depending on the age, sex, symptoms, administration route, frequency of administration, dosage form, but in general, the weight of the recombinant gene per day is 1 g / kg to 1000 mg / kg as the weight of recombinant gene per day. It is in the range of about kg, preferably in the range of about 10 g / kg to about 100 mg / kg.
  • the frequency of administration is not particularly limited.
  • Example 1 Expression of GANP in autoimmune disease model animal and its function
  • NZB, NZW, B / WF1, MRL / lpr, and BXSB mice were purchased from Japan SLC Co.
  • C57BL / 6 and BALB mice were purchased from Charles River Japan.
  • the NOD mouse was donated by Dr. Miyazaki, graduate School of Osaka University.
  • a rat monoclonal antibody against mouse B220 (RA3-6B2) mouse IgM (AM / 3) and mouse IgD (CS / 15) was purified from the culture supernatant of hybridoma and D-bithionine-N-hydroxysuccinimide ester ( Labeled with Roche diagnostics, Branchburg, NJ).
  • Piotin-labeled rat anti-mouse Syndecan-1 and anti-mouse CD5 monok Oral antibodies were purchased (BD PharMingen, San Diego, CA).
  • Piotin-labeled peanut gglutinin (PNA) was purchased from Vector Laboratories (Burlingame, CA). 3. Immunity
  • TNP-KLH Trinitrophenyl keyhole limpet hemocyanin
  • TNP'Ficoll Trinitrophenyl keyhole limpet hemocyanin
  • Biosearch Technologies Novato, CA
  • TNP-KLH or 25 g TNP-Ficoll in PBS was injected intraperitoneally to mice After 14 days, lymphatic organs were obtained and frozen together with OCT compound for immunohistological analysis.
  • GANP expression is highly expressed in highly autoimmune B cells. Lymphocytes expressing high levels of GANP (GANP hi cells) appear spontaneously in the non-immune state in peripheral lymph nodes of MRL / lpr mice.
  • Immunohistochemical analysis was performed on knee diseased lymph nodes from autoimmune disease models MRL / lpi ', NZB and normal C57BL / 6 female mice using anti-GANP monoclonal antibody and ALP-conjugated anti-rat Ig antibody.
  • GANP RNA primase activity may play an important role in B cell activation and differentiation. Therefore, using the anti PSei'so 2 monoclonal antibody in NZB mice were compared phosphorylation state of Ser 5 02 is an important phosphorylation sites of RNA primer Ichize activity.
  • the lower panel shows the numbers of GANPhi (black bars) and pSer502 GANPhi (hatched bars) in the extrafollicular region during aging.
  • GANP hi cells appeared in the spleen at 4 weeks, and the cell number reached a maximum at 12 weeks, but disappeared after 24 weeks (FIG. 3; upper panel). Expression of P Ser502 GANP was also detected at 8 and 12 weeks (FIG. 3; middle panel). As a result of comparison with the relative cell number of the red pulp, it can be seen that GANPhi cells appearing in the spleen migrate to peripheral lymph nodes after 12 weeks. The increase in GANP is proportional to the amount of autoantibodies produced prior to the onset of autoimmune disease (FIGS. 2 and 3; Theofilopoulos AN, et al., 1985, Adv. Immunol 37: 269-390).
  • GANPW cells appeared prominently in the red pulp of MRL / lpr, NZB and B / WF1.
  • the number of GANPW cells did not increase as much in the spleen of BXSB and NOD in SLE-model mice, but increased when compared to control BALB / c mice ( Figure 4) and C57BL / 6 mice ( Figure 1).
  • the spleen section showed association or immature association of PNA + B cells as a GC-like structure.
  • the expression of GANP in the GC-like region was determined by immunizing normal C57BL / 6 mice and BALB / c mice with T cell-dependent antigens (T cell-dependent Ag S : TD-Ags). Not high compared to the expression of However, GANP hi cells appeared prominently in the red pulp area of autoimmune tendency mice (Fig. 4).
  • GANPW cell populations were analyzed by marker analysis of lymphoid cells.
  • the GANP hi cells were identified by double staining of spleen sections of NZB mice using the biotin-labeled anti-B220 monoclonal antibody, the biotin-labeled anti-Syndecan-1 monoclonal antibody, the biotin-labeled anti-IgM monoclonal antibody, and the anti-IgG antibody. .
  • the results are shown in FIG. In the left column of the panel shown in FIG. 5, when using the biotin-labeled anti-IgM monoclonal antibody, the anti-IgG antibody, the piotin-labeled anti-B220 monoclonal antibody and the piotin-labeled anti-Syndecan-1 monoclonal antibody in order from top to bottom It is a figure of.
  • the middle row shows the expression of GANP in the same section as with each of the above antibodies.
  • the right column is a diagram in which the left column and the center column are superimposed.
  • the double-stained cells in the right column indicate that the GANP hi cells are B220-Syndecanl + IgM +.
  • GANP expression is shown in red for IgM, IgG and B200 and in green for Syndecan-1.
  • the markers are shown in green for IgM, IgG and B200 and in red for Syndecan-1.
  • GANP ⁇ cells express the B220-Syndecan-1 + phenotype and express abundant IgM in the cells (Fig. 5). Negative for CR1, ThyI, GL-7, CD23 and PNA, these results indicate that GANPW cells are the late maturation stage of B-lineage cells, probably plasma cells. Whether this GANPW cell is a proliferating plasmablast or not
  • NZB mice were dosed (intravenous infusion) with BrdU (1 mg / mouse) and incubated for 2 hours to allow uptake of BrdU at the insitu. Thereafter, spleen sections were prepared from mice.
  • Sections were double stained with anti-GANP monoclonal antibody (blue) and anti-BrdU monoclonal antibody (red). PAS staining was performed according to a conventional method.
  • GC shows germinal center (left).
  • GANP single positive GANP hi cells are indicated by arrows, and PAS single positive cells are indicated by arrowheads (middle).
  • the GANPW cells were not positive for BrdU incorporation (Figure 6), suggesting that these cells were not proliferative and were more mature than the plasmablastic stage.
  • Mott cell formation is observed in autoimmune prone mice as aberrant differentiation of B-1 cells.
  • Mott cells are an abnormal form of plasma cells, and abundant IgM molecules accumulate in rough endoplasmic reticulum-bound vesicles that are detected as cytoplasmic Russell bodies by PAS staining [Jiang Y., et al. 1997, J. Immunol. 158: 992-997].
  • GANP cells are not stained with PAS-staining (FIG. 6), which allows GANP hi cells to be distinguished from Mott cells of B-1 cell-derived plasma cells.
  • mice Female C57BL / 6 mice (7 weeks old), TNP-Ficoll ( ⁇ -2'Ag) or TNP'KLH (TD-Ag) The mice were immunized intraperitoneally, and spleens were obtained 14 days later. Mice immunized with TNP-Ficoll did not show GANP hi cells in the red pulpal area when counterstained with pyothin-labeled anti-IgD monoclonal antibody (FIG. 7 left). Mice immunized with TNP-KLH showed induction of GANP hi cells in the red pulpal region (FIG. 7 right). In FIG. 7, GANP hi cells are indicated by arrows. WP indicates the white pulp region.
  • the GANP ⁇ plasma cell population although very few in number, is also induced in the spleens of normal C57BL / 6 and BALB / c mice by immunization with TD-Ags ( Figure 7). Immunization with T cell independent Ag (T cell-independent Ag: TI-Ag) is less effective in inducing such cells.
  • the GANP cell population showed the same phenotype as BSSOklgMhilgDkGLkPNAk CDSkCDAOiQ, but showed Syndecan-1 +.
  • the PCR product was digested with Ncol and Xbal, gel purified, and ligated with NcoI_XbaI digested plasmid. After transformation into competent bacteria, the nucleotide sequence of a small amount of plasmid DNA prepared using the QIAprep kit (QIAGEN) was determined by an automated sequencer (Applied Biosystems).
  • the transgene was constructed by introducing a 5.6 kb mouse GANP gene into the Xhol site of pLG vector.
  • This vector is a specific vector that has human immunogloblintoin enhancer region (2 kb EcoRI fragment) and performs strong expression in B cells.
  • the gene was linearized and introduced into mice.
  • Linearized pLG vector containing mouse GANP full-length cDNA (Koike, M. et al. Int. Immunol. 7, 21-30 (1995) was microinjected into fertilized eggs of C57BL / 6 mice.
  • the mouse tail genomic DNA and the following primers and reactions were used to screen for the presence of the transgene.
  • GANP transcripts were detected by agarose gel electrophoresis.
  • 3-actin transcript was used as a control.
  • Somatic mutation of the V region gene of the transgene in which mouse GANP is stably expressed in Daudi cells
  • the GANP gene was introduced into various human B lymphocyte cells used for analysis of SHM in vitro (Rogozin, I. B “et al” Nat. Immunol. 2, 530-536 (2001); Kuwahara, K. et al. al. Blood 95, 2321-2328 (2000); and Denepoux, S. et al "Immunity 6, 35-46 (1997). Many B cell lines can not be transfected. However, it was possible to introduce the GANP gene into Daudi B cells that express AIDs that normally do not produce SHM during maintenance.
  • This clone showed a high frequency of SHM (5 ⁇ ICH / bp) in the V region as compared to wild type and mock transfected cells. .
  • the fragment of VH3-CH1C ⁇ is amplified by PCR and subcloned into a plasmid, and the schematic diagram of the somatic cell mutation is shown in FIGS. 8A to 8C.
  • ”) indicates a silent mutation (an amino acid does not change), and the other symbol (a vertical line with a ⁇ ) indicates an amino acid substitution mutation.
  • Transfectants introduced with a mutant (GANP S / A) in which serine 502 is substituted for serine 502 related to control of DNA primase activity decrease the efficiency of mutation.
  • SHM was not induced in the constant region gene (Fig. 8A-C).
  • the RNA primer activity of GANP is regulated by phosphorylation at S502, which can be detected by specific monoclonal antibodies (Kuwahara, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283 ( 2001).
  • Stimulation of B cells both in vitro and in vivo induces the phosphorylation of S502 (Kuwaham, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283 (2001)), this phosphorylation It was investigated whether or not is involved in the generation of SHM in Daudi B cells.
  • This mouse showed increased expression of GANP in B cells (FIG. 9C) and showed normal differentiation of B lineage cells in surface marker analysis of bone marrow, spleen and lymph node cells.
  • the V H 186.2 oral cavity shows a unique pattern of SHM for high affinity IgG ( ⁇ 1 ⁇ 1) ⁇ responses.
  • Sequence analysis of whole spleen ⁇ cells after immunization with NP-CG showed that the frequency of SHM was slightly increased in GANP-Tg mice as compared to wild type mice (FIG. 10).
  • a targeting vector was prepared by inserting the neomycin resistance gene (neo) downstream of Sexon II using GANP genomic DNA.
  • the ⁇ site was introduced into the adjacent region on the 3 'side of neo and in the intron between Ekson I and II. That is, flox mice were prepared by inserting Ekson II at the ⁇ sequence, and these were mated with CD 19-Cre mice to establish mice lacking GANP in B cells (FIGS. 11A and B).
  • a linearized evening setting vector was prepared from TT2 ES cells (Yagi, T. et al. Anal. It was transfected by electroporation into Biochem. 214, 70-76 (1993)). After selection with G418, ES colonies were picked and incubated with the proteinase K. The homologous recombinants were screened with the following neo2 primers and CGK3'-2 primers.
  • neo2 Primer 5, -GCCTCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT_3, (SEQ ID NO: 9)
  • CGK 3'-2 primer 5 -GGCACCAAGCATGCACGGAGTACACAGA-3, (SEQ ID NO: 10)
  • GANP flox / + mice were backcrossed with C57BL / 6 mice at least 10 times. In order to delete the GANP gene in B cells, GANP-floxed mice were crossed with CD19-Cre knock-in mice (Rickert, RC, et al., Nucleic Acids Res. 25, 1317-1318 (1997)) .
  • Splenocytes were isolated from Ci'e-flox / + mice and B-GANP mice (7-8 weeks old) and treated with 0.15 M ammonium chloride buffer to remove erythrocytes. On plastic tray After incubating for 30 minutes at 37 ° C, non-adherent cells are recovered as lymphocytes, and T cells are used according to the attached protocol using Dynabeads-anti-mouse Thyl.2 monoclonal antibody (Dynal). Removed. The purity of B cells (90% or more) was confirmed by cell surface staining using FITC-conjugated anti-B220 monoclonal antibody (BD Pharmingen).
  • RPMI-1640 medium containing a mitogen
  • FCS heat-inactivated FCS
  • 5 ⁇ 10 ⁇ 5 2-mercaptoethanol purified B cells
  • the cells were incubated at 2 ⁇ 10 5 cells / well in a 96-well microtiter plate for 48 hours in and without.
  • Cells were pulsed with 0.2 Ci / well of [ 3 H] -thymidine (ICN) for 16 hours and then harvested, and incorporated radioactivity was measured with a scintillation counter.
  • the mitogen is a affinity purified mouse anti-mouse chain specific antibody (10 g / ml) [F (ab ') 2 ] (ICN), rat anti-mouse CD40 monoclonal antibody (LB 429; 10 g / ml) And LPS (Sigma; 10 Hg / ml) were used.
  • TNP-KLH, TNP-Ficoll, and double-stranded phage-biglobulin (NP-CG) (23: 1) were purchased from Biosearch Technologies. 50 _ 1 g of TNP-KLH and NP-CG (precipitated with aluminum) or 25 TNP-Ficoll (dissolved in PBS) were injected into the peritoneal cavity of Cre_flox / + mice and B-GANP-/-mice.
  • Serum was collected from the immunized mice 10 and 14 days after the challenge. 5 g / well of TNP-BSA (Biosearch Technology) was coated on the ELISA plate. Each well was blanked with 3% BSA in PBS and incubated with serially diluted serum. After washing with PBS-0.1% Tween 20, the wells were subjected to isotope-specific isotype binding Incubated with monoclonal antibody and alkaline phosphatase (ALP) conjugated Streptavidin (Southern Biotechnology). Color development was performed in the presence of a substrate.
  • ALP alkaline phosphatase
  • the ratio of the NP2-binding antibody to the NP25-binding antibody was calculated as follows: NP2-BSA (two NPs bound to BSA per molecule) and NP25 to coating antigen -Calculated by differential ELISA using -BSA (25 NPs per molecule bound to BSA) (Biosearch Technology).
  • NP-binding from Cre-flox / + and B-GANP mice immunized with NP-CG B cells were fractionated by FACS Vantage (Becton Dickinson Biosciences) using (4-hydroxy-5-yodo-3-nitrophenyl) acetyl (NIP) and incubated at 37 ° C. with proteinase K . Using the lysate, PCR was performed twice as described (Takahashi, Y., et al. Immunity 14, 181.192 (2001)). V H 186.2 gene DNA was ligated into pBluescript and sequenced by automated sequencing. 9. Detection of apoptotic cells
  • B cells purified from Ci'e-flox / + and B-GANP-/-mice were stimulated with various reagents for 40 hours (Watanabe, N. et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47, 541.547. ).
  • anti-X antibody 50 / ig / ml
  • purified B cells were stimulated with various stimulants for 48 hours and subsequently incubated for 4 hours with anti-Fas monoclonal antibody (Jo2; BD Pharmingen) (Wang, J. et al. (1996). ) J. Exp. Med. 184, 831-838).
  • PI Propidium Iodide
  • RNA primer GANP B-GANP chi-mouse was generated from CD19 + B cells using the Cre-loxP system to delete the GANP gene (FIGS. 11A and 11B).
  • the B-GANP ⁇ mouse gene was almost deficient in Exon II ( Figure 11C).
  • B-GANP-/-cells did not express GANP mRNA (FIG. 11D) and by immunostaining almost no protein (FIG. 11E).
  • B-GANP- ⁇ ⁇ mice successfully completed They grew and showed normal numbers of lymphocytes in the bone marrow, spleen, thymus, and lymph nodes.
  • B-GANP + shows a surface marker profile similar to that of the control Cre-flox / + mice on cells of bone marrow, spleen and lymph nodes (Fig. 12), Cre- £ lox / There was no difference from + (control).
  • B cells from B-GANP- mice showed a normal proliferative response after stimulation with anti-antibodies, anti-antibodies + anti-CD40 monoclonal antibodies, or lipopolysaccharides in vitro (FIG. 13: white bars in B-GANP2; Cre-flox / + is a black stick).
  • B cells from B-GANP mice had reduced proliferative activity after stimulation with anti-CD40 monoclonal antibody (5, 10 g / mL) (FIG. 13). This indicates that the proliferation of B cells in B-GANP mice is slightly impaired in response to the CD40 / CD145 interaction. Serum Ig levels were similar to Cre-flox / + mice (FIG. 14).
  • Cre-flox / + showed a large mature GC stained with peanut agglutinin, which is a marker of GC_B cells on day 10 (arrow in FIG. 16).
  • B-GANP had slightly less GC formation.
  • B-GANP was more abundant than Cre-flox / +, and GC formation was delayed even after 20 days (arrow in Fig. 16).
  • the differential ELISA using hapten / protein conjugates of NPs with different molecular weights was compared to the response to multihapten NP25-BSA Condyuge.
  • NP-specific IgGlduii CDSS w B cells were significantly reduced in B-GANP mice. That is, in the 10 days after immunization, the Cre-flox / + mice whereas a 1,164 cells / 10 6 cells, B-GANP - / - in mouse was 88 cells / 10 6 cells. In addition, on day 14, Cre-flox / + had 879 cells and B-GANP- had 83 cells. This trend was similar on the 20th day.
  • V H 186.2 locus is used for high affinity IgG (r ( ⁇ ⁇ ) NP-response (Cumano, A. & Rajeww, K. (1985) Eur. J. Immunol. 15, 512-520).
  • the IgM locus was not different compared to Cre-flox / +.
  • Cre-flox / + or B-GANP-/- were immunized with NP-CG and sorted for GC-B cells (Ag-conjugated IgGi B cells) that showed positive for NP-conjugated IgGi weak CD38.
  • Figure 19 genomic DNA was extracted from the cells after sorting, VH 186.2 was amplified by PCR, sequence analysis was performed, and the sequences of VH 186.2 were compared (Fig. 20A to L).
  • Figure 20A ⁇ F is a sequence of Cre-flox / + of V H 186.2
  • FIG 20G ⁇ L the B-GANP - a comparison of the sequences of the V H 186.2 - /.
  • AICD Activation-induced cell death
  • spleen spleen cells are stimulated for 48 hours with anti-CD40 monoclonal antibody (LB 429), anti-antibody + anti-CD40 monoclonal antibody, IL-4 + anti-CD40 monoclonal antibody, and anti-antibody + IL-4 + anti-CD40 monoclonal antibody, and Anti-CD95 monoclonal antibody was added to the medium.
  • anti-CD40 monoclonal antibody LB 429
  • anti-antibody + anti-CD40 monoclonal antibody anti-antibody + anti-CD40 monoclonal antibody
  • IL-4 + anti-CD40 monoclonal antibody anti-antibody + IL-4 + anti-CD40 monoclonal antibody
  • Anti-CD95 monoclonal antibody was added to the medium.
  • RNA expression of one member of the Bcl-2 family which is recognized to be a molecule necessary for CD40-mediated apoptosis suppression of various malignant lymphoma cells and normal B cells.
  • the levels of c-; &, ax and bai / in mutant B cells were similar to the levels of Cre-flox / + B cells (FIG. 27).
  • Two animals each of a wild type (WT) mouse and a GANP transgenic (Tg) mouse were immunized with 100 g of NP-CG, and 28 days later serum was taken and subjected to ELISA.
  • 20 g / ml of NP2-BSA and NP17-BSA were coated on an ELISA plate at 1 ° C at 4 ° C. After blocking for 1 hour with 3% BSA / PBS-0.1% Teen 20, the serum was allowed to react for 1 hour.
  • the cells were washed 3 times with PBS-0.1% Tween 20, and reacted with petiotin-labeled anti-mouse IgGi antibody (Southern Biotechnology) for 1 hour.
  • Wild type (WT) mice and GANP transgenic (Tg) mice are immunized with NP-CG as an immunizing antigen, and cell fusion is carried out using each mouse, and in the culture supernatant of the obtained positive hybridoma, Binding curves of antibodies reactive with antigen were obtained using ELISA and Biacore. From the binding curves obtained, the utility of the Tg mice was derived.
  • Wild-type mice and GANP transgenic (Tg) mice were Wild-type mice and GANP transgenic (Tg) mice.
  • NP16-CG (—16 NPs per molecule bound to CG nextimylomnopurine), NP2-BSA (2 NPs per molecule bound to BSA (bovine serum albumin)), NP17 -BSA (-17 NPs bound to BSA per molecule), HRP-labeled anti-mouse IgG, IgA and IgM were used.
  • the wild-type mice and GANP transgenic (Tg) mice were each immunized 3 times with NP16-CG as an immunizing antigen three times every two weeks, collected 3 times after immunization, and collected using antisera.
  • WT wild-type mice
  • Tg GANP transgenic mice
  • cell fusion with P3U1 myeloma cells is performed using splenocytes of high titer mice, and the number of splenocytes in GANP-Tg mice (6.0 ⁇ 10 ⁇ cells) and the number of splenocytes in WT (4.8 ⁇ 10 7). ), So as to be 1 ⁇ 10 5 / well, cells from GANP-Tg mice are 600 clones, and cells from WT mice are 480 clones in HAT medium. Cultured.
  • the culture supernatant after 9 days of HAT culture was used to conduct an ELISA method using NP2-BSA (1 g / mL) as the immobilized antigen. From the culture supernatants of GANP-Tg mice and WT mice, the top 2.5% of clones showing production of high affinity antibody in ELISA absorbance results were selected, and cloning was performed in HT medium.
  • GANP-Tg is 6 clones (clone name: G2-6, G2 -9, G2-12, G2-14, G2-15, G2_16), and WT established a hybridoma of 1 clone (clone name: W2-7).
  • substances having different antigen properties so-called substances having different NP content per CG-molecule, were evaluated based on their ELISA reactivity ratios.
  • NP2-BSA (1 g / mL) and NP17-BSA (1 g / mL) were used as immobilized antigens, respectively, and immobilized overnight at 4 ° C. After washing the immobilized plate with PBS-Tween 20, blocking was performed with skimmed milk PBS-Tween 20.
  • the analysis by Biacore is that the one with an NP2-BSA (1 ⁇ g / mL) as a ligand bound to the Biacore chip is considered to have the highest affinity as an analyte solution, Tg (G2-9), The association rate constant (k ass), dissociation rate constant (k diss), and RPMI culture supernatants of 3 clones of Tg (G2-15) and WT (W2-7), which are considered to be the lowest, were used.
  • Fig. 30 shows the Biacore pattern of G2-9 (ELISA: 82.9% NP2 / NP17 ratio).
  • Curves (a) to (e) shown in FIG. 30 are those at antibody concentrations of 26.6, 13.3, 6.65, 3.33 and 1.66 nM, respectively.
  • the association rate constants (k ass) 1.48 X 10 5
  • the dissociation rate constant (k diss) 9.63 X 10- 4
  • Fig. 31 shows the pattern of Biacore of G2-15 (ELISA: 33.9% NP2 / NP17 ratio) expected to have relatively low affinity from the results of ELISA.
  • Curves (a) to (e) shown in FIG. 31 are those at antibody concentrations of 23.0, 11.5, 5.75, 2.88 and 1.44 nM, respectively.
  • Association rate constant (k ass) 5.33 ⁇ 10 4
  • dissociation rate constant (k diss) 1.56 ⁇ 10 ⁇ 2
  • the present inventors determined MCM3 binding region of GANP by using partially-cleaved mutant GANP, and phosphorylated serine amino acid 502 of the GANP specific region (pSer 5 o 2
  • the localization of GANP in NIH-3T3 cells was characterized using a monoclonal antibody specific for
  • the binding between primase and MCM is one linked function, and the molecular complex in which both are bound has the effect of releasing DNA from the duplex. Therefore, when a GANP partial fragment binds to MCM, the GANP fragment also exhibits primer activity and is considered to have a high affinity antibody production action.
  • COS7, Hela and Swiss'3T3 cells were treated with 10% heat-inactivated FCS (Dainippon Pharmaceutical), 2 mM L-glutamine (Biowhittaker), 100 g / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin and 50 The cells were maintained in 5% CO 2 at 37 ° C. in D-MEM medium (Invitrogen) supplemented with 2-mercaptoethanol (Takei, Y. et al., (1998) J. Biol. Chem, 273, 22177-22180, Sakaguchi, N. et al "(1988) EMBO J. 7,
  • NIH-3T3 was fixed with 3.7% paraformaldehyde for 5 minutes in PBS (pH 7.4) and permeabilized with 0.2% Triton-100 (Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13 , 4311-4320).
  • Rat anti-pSer502 GANP monoclonal antibody Kuwahara, K. et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283
  • rabbit anti-MCM3 antibody Kimura, H.
  • pSR-MCM3-HA has been described in the literature (Kimura, H. et al., (1995) Nucl. Acids Res. 23, 2097-2104) Three nuclear localization signals (NLS) of SV40 T-Ag
  • the pECFP-Nuc vector carrying one was purchased from Clontech.
  • the PCR fragments obtained using the following combinations of 3 'and 5' primers are introduced into pGEX-4T-l (Amersham) and they are used to fuse different forms of mouse cDNA with glutathion S-transferase (GST) Prepared as a protein.
  • GANP 1-5 '5'-GGGGATCCATACCC GGG TGAACCCCTT-3' (SEQ ID NO: 1 1)
  • GANP 1-3 '5'-GGGTCGACGCGCACAGACT TTC CCCTGA-3' (SEQ ID NO: 1 2)
  • GANP2-5 '5'-GGGAATTCTCCCCGCCTTCAGCTGTGAC-3' No.
  • GpANLS-GFP and 13 mutants were prepared as described in the literature (Imai, Y. et al., (1991) Nucl. Acids Res. 19, 2785- 2785). All constructs were checked for quality by controlling the nucleotide sequence to ensure correct orientation and as a tagged fusion protein the correct reading frame of the codon.
  • Expression vectors with mutant RNA / DNA primase domains (PD) have been described in the literature (Gp mutants from Ser 502 to Ala [GpS502A] or Glu [GpS502E]) (Kuwahara, K. et al. ., (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283) 2, 4 Detection of introduced gene products by confocal microscopy
  • ⁇ -3 ⁇ 3 was transfected with pCXN2-w and Z or pSR a -MCM3-HA using F GENE 6 (Roche Diagnostics). Sixteen hours prior to immobilization Leptomycin B (LMB; (Kudo, N. et al "(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9112-9117)) was added to the culture medium. In the case of co-transfection, rabbit anti-HA antibody (Santa Cruz) and Alexa 546-bound herring anti-wagi IgG antibody are used, and in the case of single transfer, Alexa 488-conjugated rabbit anti- IgG antibody (Molecular Probes) was used to stain exogenous MCM3 protein. The nucleic acids were counterstained with Tio-iodinated for cotransfection experiments and with Iodiated Provision (PI; Sigma) for single transfection experiments.
  • PI Iodiated Provision
  • GST fusion proteins were purified as described in the literature (Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328).
  • Various GST fusion proteins (5 Hg) immobilized on glutathione-sepharose beads (Amersham) were treated with TNE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.8 ⁇ , 150 mM NaCL 1 mM EDTA, 1% Nonidet P'40].
  • TNE buffer 10 mM Tris-HCl [pH 7.8 ⁇ , 150 mM NaCL 1 mM EDTA, 1% Nonidet P'40].
  • the cells were incubated with BAL17 lysates prepared using 10 ⁇ g aprotinin, 1 mM phenylmethyl-sulfonyl fluoride [PMSF]). Bound proteins were separated by 8% SDS-PAGE, transferred to a nitrocellulose filter, and blocked.
  • COS7 was transfected with pCXN2-3 ⁇ 4 ⁇ and / or pSR a -ikiCM5-H4. After 26 hours, cells are lysed using TNE buffer, and the resulting lysate is combined with protein A-Sepharose (Amersham). Incubated with the anti-HA antibody. Immunoprecipitates are separated by 8% SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose filters, blocked plots, incubated with mouse anti-FLAG M2 antibody (Stratagene), and then peroxidase-labeled gray anti-mouse Incubated with IgG (H + L) antibody (Zymed). For detection of Gp-GFP and its variants, the blotted filters were picked with a rabbit anti-GFP antibody (Santa Cruz) and peroxidase binding protein A (Zymed).
  • Hela cells were transfected with pSR_kfCM? -H. Twenty hours later, transfected HeLa cells and non-transfected mouse Swiss-3T3 cells were trypsinized and seeded together in a culture dish at a ratio of 1: 1. After 24 hours, cells were fused using polyethylene glycol 1500 (Roche diagnostics) at room temperature for 2 minutes (Sc midt-Zachmann, MS et al "(1993) Cell 74, 493-504). After washing several times, medium containing cycloheximide was added (final concentration 20 ⁇ g / ml), and the cells were incubated for 5 hours at 37 ° C.
  • the Map 80 region termed GANP 5-7 ′, is a cell extract as previously indicated (Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 431 1-4320). Pulled down MCM3 from Surprisingly, GANP 1 and GANP2, partial fragments of GANP, also pulled down MCM3 (FIG. 33; upper and lower panels).
  • Negative controls (first lane) with GST alone or GST fused to an irrelevant protein showed no signal. And, the binding to GST-GANP1 was stronger than the binding to Map80 region (GST-GANP5-7 '). This binding was also confirmed in cells by DNA transfection experiments with constructs tagged with FLAG ( Figure 35).
  • Cos7 cells were cotransfected with V CXm-FLAG-Ganp, pCXNS- ⁇ Z ⁇ Gi ⁇ and pCXNS- ⁇ MG-G ⁇ ⁇ W in combination with pSR-MCM3-HA or pSRa-?- ⁇ .
  • Western blot was performed with anti-FLAG monoclonal antibody.
  • the expected size of the FLAG-tagged protein is indicated in each lane by a triangle.
  • the left and right panels have similar band migration, but the exposure time for ECL detection is 1 minute for the left panel and 3 minutes for the right panel ( Figure 35).
  • RNA primase region As a whole GANP molecule, regardless of the potential binding activity of the Map80 region, binding to MCM3 requires an RNA primase region (PD). Open triangles indicate the position of GanpA PD-GFP. The size of Ganp-GFP, which is equal to the size of Ganp S502A-GFP and Ganp S502E-GFP, is shown as a black triangle (FIG. 36B; lower panel). These results indicate that binding of GANP to MCM3 is via its PD region, but phosphorylation at the Ser 502 site does not affect this binding.
  • GANP has two possible NLSs. One is in the N-terminal primer region and the other is in the C-terminal Map 80 region. GANP also has two nuclear export signal (NES) -like motifs. One is between the SAC3 homology region and the Map80 region, and the other is within the Map80 region.
  • NES nuclear export signal
  • NIH-3T3 cells were transfected with pCXN2- (3 ⁇ 4 ⁇ 4 ⁇ 4t ⁇ or pCXN2- (3 ⁇ 4aj ⁇ ⁇ ) and fixed 48 hours later LMB was added 16 hours before fixation Nuclei were prestained with PI Images were collected using confocal microscopy Representative expression profiles are shown in Figure 37. The number of cells with different profiles was counted and expressed as a percentage ( Figure 37).
  • RNA / DNA A 5 '1-kb DNA fragment carrying a lymase domain and an N-terminal NLS (but not including the NES-like motif) was fused to GFP (Fig. 38, Gp-GFP) D
  • Gp-GFP This Gp-GFP product is located in the nucleus (N and N> C, 94%) (Fig. 38), but the mutant Gp-GFP (GpANLS-GFP; lacking amino acids 497 to 500 as shown in Fig. 38) lacking the NLS It was shown to be cytoplasmic, and it was confirmed that the N-terminal NLS is involved in nuclear localization.
  • NLS N-terminal NLS has a functional role in the import of Ganp into the nucleus.
  • NLS may not be strong enough to maintain GANP expression in the nucleus. This is because Ganp-GFP is also present in the cytoplasm (FIG. 37).
  • LMB levutomycin B
  • MCM3 Mammalian MCM3 changes its binding state to chromatin during cell cycle, but exists only in the nucleus throughout the interphase (Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 431 1-4320. ).
  • NIH-3T3 cells were transfected with pSRa-M (7?-3 ⁇ 44 or pSRa-i5-H ⁇ 4), fixed, immunolabeled with anti-HA antibody (Alexa 488) and stained with PI.
  • MCM 3-HA is consistent with the presence of a typical NLS (Kimui'a, H. et al "(1994) EMBO J. 13, 4311.4320, Takei, Y.
  • the cells were cotransfected with pCXN2-Ganp-gfp by pCXN2- ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 9 ⁇ ⁇ and pSR-MCM3-IIA, fixed, immunolabeled with anti-HA antibody (Alexa 546), and the nuclei were TOTO-3. Prestained with ( Figure 40). Cell numbers are shown at the bottom of the panel ( Figure 40).
  • MCM 3-HA was found in heterokaryons in both human and mouse nuclei. Unfused mouse cells do not show such staining. This indicates that MCM 3-HA was exported from HeLa nucleus to cytoplasm and then transferred to mouse nucleus.
  • MCM3-HA is a shuttling protein. Furthermore, it is often difficult to demonstrate the nuclear-to-cytoplasmic transfer of endogenous proteins with similar sensitivity to transgene products (Kimura, H., Ohtomo, T. et al., (1996) Genes Cells 1 J., 977-993, Mizuno, T. et al "(1999) Mol. Cell. Biol. 19, 7886-7896) The results presented in this example were also: More primitive cells such as yeast. It is also difficult to demonstrate the nuclear-to-cytoplasmic transition of endogenous MCM proteins in mammalian cells, with the same sensitivity as achieved in.
  • the localization of GANP during mitosis was analyzed in detail by triple labeling with anti MCM3 antibody and nucleic acid TOTO-3. As cells progress from premetaphase to metaphase, GANP appears to be dissociated from enriched chromatin ( Figure 44). The yellow signal in the superimposed image indicates co-localization of GANP with MCM3, but some blue staining indicates that GANP can be seen alone in the center of the pre-metaphase image. At this stage, GANP and MCM3 do not overlap with the enriched chromosomes. In metaphase cells, GANP is detected in the spindle region. And this signal decreases in the late phase while chromosomes separate into two daughter cells.
  • GANP shuttling for type 2 RNA / DNA primases should wait for further clarification. It may be related to the generation of RNA primers at the final stage of DNA repair.
  • the expression level of GANP is low in normal cells, but up-regulated in germinal centers where cells proliferate rapidly (Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328, Kuwahara, K et al "(2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283.) GANP is also expressed at higher levels in certain cells with fast cell termination. It has been suggested that association with MCM complex may stimulate DNA replication (Kuwahara, K. et al "(2001). Proc. Natl.
  • a mouse overexpressing GANP By using a mouse overexpressing GANP according to the present invention, it is possible to rapidly produce an antibody having high affinity and specific to a viral antigen which could not be obtained conventionally. Therefore, it is expected that it will be possible to rapidly obtain specific and strong antibodies without delaying the deterioration of the medical condition caused by a prolonged infection such as AIDS or hepatitis C to the mutation of the virus antigen. In addition, this makes it possible to produce a customized antibody specific to virus antigen mutations from infected patients. An immunization period of about 10 days is sufficient for antibody production, and among them, the production efficiency of antibodies with high affinity mutations is as high as 60%. The production protocol for high-affinity antibodies using bedside patient samples is expected to be a new immunotherapy that will replace vaccine therapy.

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Abstract

本発明の目的は、各種疾患の診断薬及び治療薬として有効な高親和性抗体、当該抗体を産生するためのトランスジェニック哺乳動物、該高親和性抗体又は高親和性抗体産生細胞を用いた薬剤を提供することである。本発明によれば、GANP遺伝子を導入したトランスジェニック哺乳動物、その子孫又はそれらの一部、並びにそれを用いた高親和性抗体の産生方法が提供される。

Description

明 細 書
GANP遺伝子導入トランスジエニック哺乳動物及びその利用 技術分野
本発明は、 GANP遺伝子を導入した卜ランスジエニック哺乳動物及びその利用 に関する。 より詳細には、 本発明は、 GANPを高発現し、 高親和性抗体を産生す ることができるトランスジエニック哺乳動物、 該トランスジエニック哺乳動物を 用いて高親和性抗体を産生する方法、及び得られた高親和性抗体の利用に関する。 背景技術
免疫系の機能は、 T細胞の効果を主とする細胞性免疫反応に基づく機能と抗体 の効果を主とする液性免疫に基づく機能とに分類される。 実際は、 この両者の機 能は協調して免疫応答が行われる。抗体は骨髄で生まれる B細胞の細胞表面レセ プターとして表出している。 生体で形成される最初の抗体が認識する抗原の多様 性は 109〜： LOU個のオーダーに上ると言われ、 そのような抗体 （抗原レセプ夕一） は、 環境に存在しうるあらゆる抗原決定基を認識する。 しかしながら、 この多様 な抗原レセプターは抗原に対して結合する能力は概して低く、 低親和性の抗体が 産生されることが多いが、 これでは十分な免疫応答とはならない。
リンパ球、 特に B細胞/免疫グロブリン （抗体） は、 その免疫反応に基づく各種 用途、 例えば病原体等の抗原検出のためのキット、 診断薬、 治療薬として利用さ れている。このような抗原検出薬、あるいは各種疾患治療薬における抗体として、 抗原に対する反応性が高い抗体を使用すると、 抗原に対する感度が優れ、 かつ同 一投与量での治療薬としての性能が優れる。 しかしながら、 これまでの所、 抗体 の親和性を高める手段は知られていない。
ところで、 生体は病原体や異物が体内に侵入すると、 それらを抗原として認識 して、 末梢のリンパ組織において、 抗原と直接結合する抗体の V領域の遺伝子に 高頻度の体細胞突然変異を誘導する。 その変化には T細胞の刺激を必要としてお り、胚中心 (Germinal center)領域で活性化 T細胞から刺激を受けると考えられる。 近年、 本発明者らはこの領域の活性化 B 細胞で選択的に発現が上昇する分子 GANPを見出している （国際公開 WO00/50611号公報）。 この分子は DNAヘリ カーゼ活性を有する MCM ninichromosome maintenance)と呼ばれる分子と直 接結合し、 さらに RNAプライマーゼ活性を有することから、 DNA複製に関連す ることが示唆されている。 しかしながら、免疫系における GANPの機能について は解明されていなかった。 発明の開示
本発明は、 各種疾患の診断薬及び治療薬として有効な高親和性抗体、 当該抗体 を産生するための卜ランスジエニック哺乳動物、 該高親和性抗体又は高親和性抗 体産生細胞を用いた薬剤を提供することを目的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 GANP遺伝子を 導入したトランスジエニック動物を作製し、 抗原で免疫すると、 このトランスジ エニック動物は高親和性抗体を産生し得ることを見出し、 本発明を完成するに至 つた。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
(1) GANP遺伝子を導入したトランスジエニック哺乳動物又はその子孫。
導入した GANP遺伝子は B細胞で発現することができる。 また、 本発明のト ランスジエニック哺乳動物又はその子孫は、 GANP遺伝子をトランスフエクトし た ES細胞から発生させることが可能である。 哺乳動物としては、 例えばマウス が挙げられる。
(2) 前記トランスジエニック哺乳動物又はその子孫の一部。
(3) 前記トランスジエニック哺乳動物又はその子孫に抗原を投与し、 得られる 動物又は子孫から抗体を採取することを特徴とする高親和性抗体の製造方法。
(4) 前記 (3)記載の方法により得られる高親和性抗体又はその断片。
本発明の抗体は、 親和性が 1 X 10— 7 (M) 以下で示されるものである。 本発明 の抗体は、 ポリクロ一ナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。 (5) 前記抗体又はその断片の V領域を含む、 ヒ卜型化抗体若しくはヒト抗体又は それらの断片。
(6) 前記抗体又はその断片、 及び前記ヒト型化抗体若しくはヒト抗体又はそれ らの断片からなる群から選択される少なくとも 1つを含有する医薬組成物。
(7) 抗原を投与した請求項 1〜4のいずれかに記載のトランスジエニック哺乳 動物又はその子孫から採取される、 高親和性抗体産生細胞。 図面の簡単な説明
図 1は、抗 GANPモノクローナル抗体および ALP結合抗ラット Ig抗体を用い た免疫組織化学分析の結果を示す。 スケールバーは 100 111。
図 2は、雌 NZBマウスの膝窩のリンパ節中の GANPhi細胞の出現速度を示す。 スケールバーは 100 m。
図 3は、 雌 NZBマウスの脾臓中の GANPW細胞の出現速度を示す。 スケール バ一は 100 。
図 4は、複数系統のマウス由来の脾臓切片を抗 GANPモノクローナル抗体で染 色した結果を示す。 ： RP; 赤脾髄， F; 濾胞。 スケールバーは 100 m。
図 5は、 脾臓の赤脾髄における GANPW細胞の同定を示す。
図 6は、 GANPW細胞における形質細胞マーカ一の同定を示す。 スケールバー は 100 m。
図 7は、 TD-Ag 免疫による C57BL/6 マウスの脾臓の赤脾髄領域における GANPhi細胞の発現を示す。 スケ一ルバ一は 100 m。
図 8 A〜Cは、 Daudi細胞にマウス GANPを安定的に発現させたトランスフエ クタントの体細胞突然変異を示す。
図 9 A〜Cは、 B細胞で GANPを過剰発現させたトランスジエニックマウスの 作製の概要を示す。
図 10は、 GANP過剰発現トランスジエニック （Tg) マウス又は野生型マウス における体細胞突然変異を解析した結果を示す。
図 11A〜Eは、 B細胞特異的 GANP欠損マウス (B_GANP )の作製の概要を示 す。
図 12は、 B細胞特異的 GANP欠損マウス (B-GANP^)を用いた細胞表面染色の 結果 （フローサイトメトリ一） を示す。
図 13 は、 B細胞の増殖アツセィの結果を示す。 ほとんど差はなかったが、 抗 CD40抗体刺激による増殖のみが約 1/2に減少していた。
図 14は、免疫をしていない Cre-flox/+マウス及び B-GANP+マウス血清中の抗 体価を示す。 各種アイソタイプの抗体価に差はなかった。
図 15は、 B-GANP-/-マウスにおける抗体産生を測定した結果を示す。
図 16は、 GCをピーナッツァグルチニンで染色した結果を示す。
図 17は、 B-GANP マウスにおける抗原特異的抗体産生を測定した結果を示す t 図 18は、 100 M gの NP-CGを免疫し、 免疫後 14日及び 35日目における親和 性の成熟の度合いをディファレンシャル ELISAにより測定した結果を示す。
図 19は、 GC-B細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。
図 20A〜Fは、 Cre-flox/+の VH186.2を PCRで増幅し、 シークェンス解析を行 つた結果を示す （Aから Fに順に続く）。
図 20G〜Lは、 Cre-flox/+の VH186.2を PCRで増幅し、 シークェンス解析を行 つた結果を示す （Gから Lに順に続く）。
図 21は、 Cre-flox/+及び B-GANP マウスにおける IgGlの変異の頻度を示す。 図 22は、 VH186.2の 33番目の Wを Lに変異させたときの変異の頻度を示す。 図 23は、 活性化誘導細胞死 (AICD)の測定結果及びアポトーシスの抑制結果を 示す。
図 24は、 抗 CD40及び抗 CD95刺激に対する細胞のアポトーシス感受性を測 定した結果を示す。
図 25は、 TUNELアツセィによりアポトーシス細胞を検出した結果を示す。 図 26は、 TUNELアツセィによりアポト一シス細胞を検出した結果を示す。 図 27は、アポト一シス抑制に関与する Bcl-2ファミリーの UNA発現レベルを 示す。
図 28は、 GANP トランスジエニックマウスを用いて高親和性抗体を産生した 結果を示す。 ' 図 29は、 GANP トランスジエニックマウス由来のハイブリド一マクローンを 用いて高親和性抗体を産生した結果を示す。
図 30は、 GANP トランスジエニックマウス由来のハイプリドーマクローン培 養上清を用いた Biacoreによる結合解離曲線を示す。
図 31は、 GANP トランスジエニックマウス由来のハイプリドーマクローン培 養上清を用いた Biacoreによる結合解離曲線を示す。
図 32は、 GANP-GST融合タンパク質の構造の概略を示す。
図 33は、 MCMと直接結合する GANPの領域を決定するためのプルダウンァ ッセィの結果を示す。 左に大きさのスタンダードの位置を示す。
図 34は、 in vitro翻訳された MCMを用いたプルダウンアツセィの結果を示す。 図 35は、 GANP各構築物と MCMの結合を免疫沈降によって示す。
図 36A〜Bは、 GANP各構築物と MCMの結合を免疫沈降によって示す。
図 37は、 GANP構築物の構造の概要及び、 構築物の細胞内での分布を示す。 図 38は、 GANP構築物の細胞内での分布を示す。
図 39は、 MCM3の核における局在化を示す。
図 40は、 GANPの発現によって誘導される MCM3の細胞質局在化を示す。 図 41は、 核に局在する対照タンパク質を示す。
図 42は、 MCM 3変異体の局在化における GANP構築物の効果を示す。
図 43は、 ヘテロカリオンアツセィによって検出される MCM3の核-細胞質間 シャトリングを示す。
図 44は、 細胞周期の間の GANPの局在化を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明は、 GANP遺伝子を非ヒト哺乳動物に導入してトランスジエニック動物 を作製し、 そのようなトランスジエニック動物を抗原で免疫すると、 高親和性の 抗体が得られる知見に基づいて完成されたものである。 1 . GANP
GANP は、 胚中心結合核タンパク質（Germinal center-associated nuclear protein)と呼ばれており、 酵母 Sac3 タンパク質とホモロジ一を有する 210kDa の核タンパク質である （WO00/50611号公報）。 そして、 SAC3はァクチン形成の 抑制物質として特徴づけられている。 また、 GANP は、 濾胞樹状細胞 (follicular dendritic cells: FDC)により囲まれる胚中心 (germinal center, GC)B細胞におい て選択的にアップレギュレートされ、 リン酸化依存性 RNA-プライマーゼ活性を 有し、 B細胞の細胞周期調節に関与しているタンパク質である （Kuwahara, K. et al" (2000) Blood 95, 2321.2328)。
本発明においては、 GANPタンパク質のアミノ酸配列を、 マウスについて配列 番号 2に、 ヒトについて配列番号 4に示す。 また、 GANPタンパク質をコードす る遺伝子 （GANP遺伝子という） の塩基配列を、 マウスについて配列番号 1に、 ヒトについて配列番号 3に示す。 なお、 上記アミノ酸配列及び塩基配列は、 国際 公開 WO00/50611号公報にも記載されている。
また GANPタンパク質は変異体でもよく、 配列番号 2又は 4に記載のァミノ 酸配列において 1又は複数のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミノ酸配列 であって RNAプライマーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。 例えば、 配列番号 2又は 4に示すァミノ酸配列のうち 1若しくは複数個（好ましくは 1個 又は数個 （例えば 1個〜 10個、 さらに好ましくは 1個〜 5個）） のアミノ酸が欠 失しており、 1若しくは複数個 （好ましくは 1個又は数個 （例えば 1個〜 10個、 さらに好ましくは 1個〜 5個）） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されており、 及 び 又は 1若しくは複数個 （好ましくは 1個又は数個 （例えば 1個〜 10個、 さ らに好ましくは 1個〜 5個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ上記 GANPタンパク質と同様の RNAプライマーゼ活性を有する GANP変 異型タンパク質を使用することもできる。
「RNAプライマーゼ活性」 とは、 RNA複製において、 5'→3'方向に進む鎖の伸 長とは逆向きの鎖 （ラギング鎖） を合成する際に、 伸長の開始点となる短いブラ イマ一の； RNAを合成する酵素活性を意味する。 通常は 0；プライマ一ゼと呼ばれ る DNAポリメラーゼ θίと結合する分子が用いられるが、 胚中心 B細胞では第二 のプライマーゼである GANPプライマーゼも誘導されている。
GANPタンパク質は、 上記配列番号 2若しくは 4に示すアミノ酸配列又はこれ らの変異型アミノ酸配列のほか、 N末端側の一部の配列 （例えば配列番号 2に示 すアミノ酸配列の 1〜600番、 好ましくは 139〜566番） 又はこれらの変異型ァ ミノ酸配列を有するものも含まれる。
本発明において、 動物に導入するための GANP遺伝子は、 上記 GANPタンパ ク質、 N末側の一部の配列、 又は変異型タンパク質をコードする遺伝子が挙げら れる。 そのような遺伝子として、 例えば配列番号 1又は 3に示す塩基配列を有す るものを使用することができる。 配列番号 1又は 3に示す塩基配列のうち、 コー ド領域のみの塩基配列であってもよい。 また、 上記配列番号 1又は 3に示す塩基 配列に相補的な配列と、 ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 かつ、 RNA プライマ一ゼ活性を有するタンパク質をコ一ドする遺伝子を使用すること も可能である。
「ストリンジェン卜な条件」 とは、 ハイブリダィズさせた後の洗浄時の条件で あって塩 （ナトリウム） 濃度が 150〜900mMであり、 温度が 55〜75°C、 好まし くは塩（ナトリウム）濃度が 250〜450 mMであり、温度が 68°Cでの条件をいう。 遺伝子に変異を導入するには、 Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法に より、 例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、 例えば GeneTailor™ Site -Directed Mutagenesis System (インビトロジェン社製）、 TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (MutarrK、 Mutan-Super Express Km等：夕カラバイオ社製） を用いて行うことができる。
変異遺伝子の詳細並びに取得方法は国際公開 WO00/50611 号公報にも記載さ れている。
なお、 抗^抗体及び抗 CD-40モノクローナル抗体で B細胞を in り刺激す ると、 GANP発現のアップレギュレーションのみならず、 GANPタンパク質のァ ミノ酸配列のうち特定のセリン残基 （例えば 502番目のセリン： S502) のリン酸 化を引き起こす。 この反応は、 GANPの RNA-プライマーゼ活性についてキ一と なる反応である（Kuwahara, K. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 10279-10283)。 GANPタンパク質の N末端側の RNA-プライマーゼドメインは セリン残基を含んでおり、 そのリン酸化は ώ οにおいて Cdk2によって触媒 される。 C末端側ドメインにより、 GANPは MCM3複製ライセンシング因子に 結合する（Kuwahara, K. et al" (2000) Blood 95, 2321-2328； Abe, E. et al. (2000) Gene 255, 219-227)。
2 . GANP遺伝子を導入した卜ランスジエニック哺乳動物
本発明は、 GANP遺伝子を導入したトランスジエニック哺乳動物に関するもの であり、 当該トランスジエニック哺乳動物は、 好ましくは、 導入した GANP遺伝 子を B細胞で発現することができる。
(1) GANP遺伝子とその関連分子
GANP遺伝子とその関連分子で形成される複合体は、遺伝子に変異を誘導する プロセスで直接および間接的に必要な分子である。 GANPタンパク質は、 遺伝子 変異を修復する際に、高親和性の抗体が得られるように V領域の変異の誘導を促 す能力を保有していることから、 本発明のトランスジエニック哺乳動物は、 この GANP遺伝子又はその変異遺伝子の導入によって、 獲得性免疫の高親和性抗体産 生を促進することができる。 また、 この遺伝子を過剰に発現するトランスジェニ ック非ヒト哺乳動物は、 速やかに抗原に対する結合力の高い抗体を産生すること ができる。 従って、 上記トランスジエニック非ヒト哺乳動物を所定の抗原で免疫 することで、 従来では得られないような高親和性の抗体を簡便に得ることができ る。 その結果、 難治性の病原微生物や異物を排除できるポリクロ一ナル抗体又は モノクローナル抗体を得ることができる。 また、 本発明のトランスジエニック哺 乳動物を用いてヒト型化抗体を作製することによって、 あるいは、 本発明のトラ ンスジエニック哺乳動物が産生する抗体の V領域を含む一本鎖抗体を作製するこ とによって、 抗体療法の効力を飛躍的に高めることが可能となる。
本発明のトランスジエニック哺乳動物は、 GANP又はその変異遺伝子の導入に よって、 B細胞で高親和性抗体の産生を促進することができ、 前記高親和性抗体 産生細胞はアポトーシスを誘導するシグナルに対して抵抗性を有する。 本発明者らは、 GANPが獲得免疫応答の抗体産生に機能している分子であるこ とを確認するため、 先ず GANP遺伝子の欠損マウスを B細胞選択的に欠損する ように企図して作製した。 その結果、 GANP遺伝子が欠損しても、 免疫系の細胞 の発達、 分化、 増殖には影響が見られず、 また抗体の産生総和には大きな変化は 見られないことが判明した。
ここで、 抗原と反応した B細胞がそのまま増殖し、 抗体産生細胞に分化するも のは、 ある種の抗原の場合に限られており、 通常の抗原に対する抗体産生につい ては T細胞の共存を必要とする。 T細胞が存在しなくても抗体が産生されるよう な抗原を T細胞非依存性抗原という。 これに対し、 T細胞非依存性抗原以外の一 般の抗原を T細胞依存性抗原という。 T細胞依存性抗原の場合は、 B細胞の抗体 産生細胞への分化がヘルパー T細胞により補助される。
病原ウィルスの抗原決定基 （抗原ェピ卜一プとも言う） の多くはそれ自体免疫 原性が弱く、 T細胞によって認識されるキヤリアタンパク質のペプチド抗原によ つて活性化を受ける。
本発明においては、 通常の動物では、 強力な抗体を産生できないような可溶性 の抗原に対する抗体産生応答に対して、 GANP遺伝子導入動物では高頻度に高親 和性の抗体を産生することができることを調べるため、 ハプテンとして解析が進 んでいるニトロフエニル基 （NP 基)をニヮトリ-ガンマグロブリンと結合させて 抗原 (NP-CGという）を作製し、 T細胞性依存性抗原の反応を調べた。
ここで、 C57BL/6マウスの NPに対する反応は単一の V領域で行われることが 知られている。 この反応は、 抗体の IgG重鎖の V領域 （VH186.2 という） と 鎖ラムダ 1遺伝子によってのみ形成されるというものである。 このシステムを使 えば、 アイソタイプが IgGiの抗体について、 VH186.2 のアミノ酸配列を調べる ことによって高親和性抗体の遺伝子変異を調べることが可能である。 しかも、 最 も強い親和性は、 重鎖 V領域 （VH186.2) のアミノ酸配列のうち、 第 33番目の アミノ酸であるトリプトファン (W)が口イシン (L)に変異 (W33-L)したときに生じ ることが報告されている。
そこで、 本発明者は、 GANP遺伝子欠損マウスで W33-L変異を起こさせたと きに、 高親和性抗体が産生されるか否かを調べた。 その結果、 対照である Cre_flox/+マウスに比べて高親和性抗体産生はほとんど見られなかった。 従つて、 GANP遺伝子は、 高親和性抗体を産生するための重要な機能を有する遺伝子であ ることが判明した。 このことをさらに検証するために、 GANP遺伝子を過剰に発 現するマウスを作製した。 GANP遺伝子の過剰発現は、 マウス免疫グロブリンプ 口モーター部分とヒト免疫グロプリン遺伝子ィントロンェンハンサ一部分を GANP遺伝子の 5'側に連結して、 B細胞で選択的に発現させることによって行つ た。
上記 GANP過剰発現マウスも正常に生まれ、 リンパ組織の発達、 分化、 増殖に は変化が見られないが、 NP-CGに対する反応では、 著しく高親和性型の V領域 遺伝子 (W33-L)が増加していた。 RNAプライマーゼ活性がこの際にどのような機 能的な役割を担っているかについてはまだ確定されていないが、（i) GANP分子の プライマーゼ活性をみる指標となる 502番目のセリン残基のリン酸化が胚中心の 高親和性 B 細胞の生み出される領域の細胞 （セント口サイト） に高いこと、 （ii) Daudi細胞への ganp遺伝子導入実験によつて誘導される V領域の突然変異の頻 度が高いことから、 GANP分子の： NAプライマーゼ活性あるいはそれに関わる 502番目のセリン残基のリン酸化が高親和性抗体産生に関連していると考えてい る。 この結果は、 GANP分子を高発現させること、 及び RNAプライマ一ゼ活性 を賦活化することが、 免疫応答による高親和性抗体の産生に必要であることを示 すものである。
(2) GANP遺伝子導入用哺乳動物
本発明における 「哺乳動物」 とは、 ゥシ、 ゥマ、 ブダ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 マウス、 ラット、 ハムス夕一及びモルモット等の任意の非ヒト哺乳動物を 意味し、 好ましくはマウス、 ゥサギ、 ラットまたはハムスターであり、 特に好ま しくはマウスである。 本発明のトランスジエニック哺乳動物は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその 始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生にお ける胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一 般に 8細胞期以前） の細胞に対して、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポ フエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE-デキス卜ラン法などにより、 GANP遺伝子を導入することにより作製する ことができる。 また、 上記遺伝子導入方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細 胞などに目的とする GANP遺伝子を転移させ、細胞培養、組織培養などに利用す ることもできる。 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法によ り融合させることにより、トランスジエニック哺乳動物を作製することもできる。
GANP遺伝子を対象動物に導入させる際、 当該遺伝子を対象となる動物の細胞 で発現させうるプロモーターの下流に連結した遺伝子構築物として導入すること が好ましい。具体的には、 目的とする GANP遺伝子を有する各種哺乳動物由来の GANP遺伝子を発現させうる各種プロモーターの下流に、 GANP遺伝子を連結し たべクタ一を、 対象となる哺乳動物の受精卵 （例えば、 マウス受精卵） にマイク 口インジェクションすることによって、目的とする GANP遺伝子を高発現するト ランスジエニック哺乳動物を作製することができる。
(3) 発現べクタ一
GANP遺伝子の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来 のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリオファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルス又はバキュ ロウィルスなどの動物又は昆虫ウィルスなどが用いられる。
遺伝子発現の調節を行うプロモーターとしては、 たとえばウィルス由来遺伝子 のプロモーター、 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハム スター、 ラット、 マウスなど） および鳥類 （ニヮトリなど） 由来遺伝子のプロモ 一夕一などを使用することが可能である。
ウィルス由来遺伝子のプロモータ一としては、 例えばサイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 JC ウィルス、 乳癌ウィルス等由来遺伝子のプロモー ターが挙げられる。
各種哺乳動物及び鳥類由来遺伝子のプロモータ一としては、 例えば、 アルブミ ン、 インスリン II、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 ォステオカルシン、 筋ク レアチンキナーゼ、 血小板由来成長因子 ;8、 ケラチン ΚΙ,ΚΙΟおよび K14、 コラ 一ゲン I型および II型、心房ナトリゥム利尿性因子、 ド一パミン β -水酸化酵素、 内皮レセプ夕一チロシンキナーゼ、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵 素、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン I及び ΙΙΑ、 メタ口プロティ ナ一ゼ 1組織インヒビ夕一、 MHC クラス I抗原、 平滑筋ひァクチン、 ポリぺプ チド鎖延長因子 l a (EF-l a ) 、 β了クチン、 ひ及び /3ミオシン重鎖、 ミオシン 軽鎖 1及び 2、 ミエリン基礎タンパク、 血清アミロイド Ρコンポーネント、 ミオ グロピン、 レニンなどの遺伝子のプ口モーターが挙げられる。
上記ベクターは、 トランスジエニック哺乳動物において目的とするメッセンジ ヤー RNA の転写を終結するターミネタ一を有していてもよい。 その他、 GANP 遺伝子をさらに高発現させる目的で、 各遺伝子のスプライシングシグナル、 ェン ハンサー領域、真核生物遺伝子のィントロンの一部をプロモー夕一領域の 5'上流、 プロモーター領域と翻訳領域間、 あるいは翻訳領域の 3'下流 に連結することも 所望により可能である。
本発明の好ましい態様では、免疫グロプリンプロモーターの下流に GANP遺伝 子を連結することにより、 あるいはヒト免疫グロブリン遺伝子イントロンェンハ ンサ一部分を GANP遺伝子の 5'側に連結することにより、 GANP遺伝子を B細 胞で選択的に発現させることができる。
(4) GANP遺伝子の導入
受精卵細胞段階における GANP遺伝子の導入は、対象の哺乳動物の胚芽細胞お よび体細胞の全てに過剰に存在するように確保することが好ましい。 遺伝子導入 後の作出動物の胚芽細胞において GANP遺伝子が過剰に存在することは、作出動 物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに GANP 遺伝子を過剰に有す ることを意味する。 そして、 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚 芽細胞および体細胞の全てに GANP蛋白質を過剰に有する。
本発明においては、 導入遺伝子を相同染色体の一方に持つヘテロ接合体を取得 し、 ヘテロ接合体同士を交配することで導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホ モ接合体を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が導入さ れた GANP遺伝子を安定に保持する。 そして、 GANP遺伝子を過剰に有するこ とを確認して、 通常の飼育環境で繁殖継代することができる。
トランスジエニック対象動物が有する内在性の遺伝子とは異なる遺伝子である 外来性 GANP遺伝子を対象非ヒト哺乳動物 （好ましくはマウスなど） 、 又はその 先祖の受精卵 （バッククロス） に転移する際に用いられる受精卵は、 同種の雄哺 乳動物と雌哺乳動物を交配させることによって得られる。
受精卵は自然交配によっても得られるが、 雌哺乳動物の性周期を人工的に調節 した後、 雄哺乳動物と交配させる方法が好ましい。 雌哺乳動物の性周期を人工的 に調節する方法としては、 例えば、 初めに卵胞刺激ホルモン （妊馬血清性性腺刺 激ホルモン (PMSG)) 、 次いで黄体形成ホルモン （ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン (hCG)) を、 例えば腹腔注射などにより投与する方法が好ましい。
得られた受精卵に、前述の方法により外来性 GANP遺伝子を導入した後、雌哺 乳動物に人工的に移植 ·着床することにより、 外来性遺伝子を組み込んだ DNA を有する非ヒト哺乳動物が得られる。 雌哺乳動物に黄体形成ホルモン放出ホルモ ン (LHRH)を投与後、 雄哺乳動物と交配させることにより受精能を誘起された偽 妊娠雌哺乳動物に、 受精卵を人工的に移植 ·着床させる方法が好ましい。 遺伝子 を導入する全能性細胞としては、 マウスの場合、 受精卵や初期胚を用いることが できる。 また培養細胞への遺伝子導入法としては、 トランスジエニック哺乳動物 個体の産出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、 DNA のマイ クロインジェクシヨンが好ましい。
遺伝子を注入した受精卵は、 次に仮親の卵管に移植され、 個体まで発生し出生 した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（マウスの場合には、例えば、 尾部先端）から DNAを抽出し、 サザン解析や PCR法により導入遺伝子の存在を 確認することができる。 導入遺伝子の存在が確認された個体を初代 （Founder) とすれば、 導入遺伝子はその子 (F1)の 50%に伝達される。 さらに、 この F1個体 を野生型動物または他の F1動物と交配させることにより、 2倍体染色体の片方 (ヘテロ接合） または両方 （ホモ接合） に導入遺伝子を有する個体 (F2)を作製す ることができる。
あるいは、 GANP 蛋白質高発現トランスジエニック哺乳動物は、 上記した GANP遺伝子を ES細胞 （embryonic stem cell) に導入することによって作製す ることもできる。 例えば、 正常マウス胚盤胞 （blastocyst) に由来する HPRT陰 性 (ヒポキサンチングァニン ·フォスフオリボシルトランスフェラ一ゼ遣伝子を 欠いている） ES細胞に、 GANP遺伝子を導入する。 当該 GANP遺伝子がマウス 内在性遺伝子上に相同組み換えを起こさせ、 インテグレートされた ES 細胞を HATセレクション法により選別する。 次いで、 選別した ES細胞を、 別の正常マ ウスから取得した受精卵 （胚盤胞） にマイクロインジェクションする。 得られた 胚盤胞を、 仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。 その後、 仮親マウス からキメラトランスジエニックマウスが生まれる。 生まれたキメラトランスジェ ニックマウスを正常マウスと交配させることにより、 ヘテロトランスジエニック マウスを得ることができる。 そして、 ヘテロトランスジエニックマウス同士を交 配することにより、 ホモトランスジエニックマウスが得られる。
本発明においては、上記したトランスジエニック哺乳動物に限らず、その子孫、 並びにトランスジエニック哺乳動物又はその子孫の一部も本発明の範囲内である。 トランスジエニック哺乳動物の一部としては、 当該トランスジエニック哺乳動物 又はその子孫の組織、 器官及び細胞などが挙げられ、 器官または組織としては、 脾臓、 胸腺、 リンパ節、 骨髄あるいは扁桃腺などが挙げられ、 細胞としては B細 胞などが挙げられる。
本発明のトランスジエニック哺乳動物は、 B細胞をさらに活性化する哺乳動物 と交配することも可能であり、 これによりさらに高親和性抗体を産生することが 可能である。
最近、 MRL/lprマウスで B細胞が末梢のリンパ節での活性化の際に胚中心を経 過した後、 T細胞領域でさらに V領域の突然変異誘導が亢進していることが報告 されている。 また、 本発明者らも MRL/lprマウスにおいて GANP遺伝子が Igプ ロモ—夕—、 ェンハンサ一の下流に結合して作成した ^ トランスジエニック マウスに見られるのと同等の高い発現が、 非免疫の状態で見られることを見出し ている。 このことは、 正常では自己の抗原に対しては高親和性の抗体はできない のに対して、 この自己免疫疾患マウスでは、 GANP分子の異常な活性化が起こる ために、 自己の抗原に対しての高親和性抗体が産生されることとなる可能性が示 唆される。
そこで、 上記 B細胞をさらに活性化する動物として、 自己免疫疾患マウスであ るとされる MRL/lpi'， NZB，（NZB x NZW)Flなどを用いれば、 さらに高い変異誘 導を期待できる。
以上のことを利用した MLRAprマウスの GANP トランスジエニックマウスを 作製することによって、 スーパー高親和性抗体産生マウスを作出できる可能性が ある。すなわち、本発明の GANP遺伝子過剰発現トランスジエニック哺乳動物と さまざまな自己免疫疾患モデル動物との交配により、 高親和性抗体を産生できる 哺乳動物を作製することができる。
3 . 高親和性抗体の作製
本発明でいう抗体とは、抗原と特異的に結合する活性を有する蛋白質を意味し、 好ましくは B細胞が産生するものである。 本発明では、 抗原に対する反応性が高 い抗体のことを高親和性抗体と言う。 「高親和性」 とは、抗体が抗原と結合する結 合能が高いことを意味し、 本発明においては、 抗体の結合能が一般のマウスなど の動物を用いて作製した抗体と比較して高く、 また逆に当該の抗原から解離する ことが遅い抗体のことをいう。 これは、 抗原決定基 （ェピトープ） に対して、 立 体的に密接して結合する能力が高く特異的であることを意味するとともに、 抗体 が結合することによって抗原決定基のみならずその抗原の構造の変換をきたすこ とによって結果的に強力な活性 （毒性の中和、 ウィルスなどの感染性阻止、 病原 体の不活性化、 生体内からの排除の促進、 抗原分子の変性を引き起こす等、 生物 活性を示すもの） を示すことも包含している。
また、 抗体の結合能 （親和性） は、 スキャッチヤード解析や Biacore と呼ばれ る表面プラズモン共鳴センサーにより、解離定数 (KD)、解離速度定数 (Kdiss)、 結 合速度定数 (Kass)として測定することができる。 Biacore装置は、 センサーチッ プ、マイクロ流路系、 SPR検出系の 3つの技術を統合して分子結合の強さ、速さ、 選択性を測定するというものであり、 標識を使わずにリアルタイムで生体分子の 検出と複数個の分子間での相互作用のモニタリングを行うことができる。 Biacore 装置としては、例えば Biacore 3000、 Biacore 2000、 Biacore X、 Biacore J、 Biacore Q (いずれも Biacore社） などが挙げられる。
上記 Biacore によって、 抗体の親和性を示すパラメーター、 すなわち解離定数 (KD)、 解離速度定数 (Kdiss) [1/Sec] 及び結合速度定数 (Kass) [1/M.Sec]を測定す る。
抗体は、 解離定数 （KD値） が小さい値であるほど親和性が高いという点で好 ましい。 抗体の結合能 （親和性） は、 Kdiss及び Kassの 2つのパラメ一ターに より決定され、
KD[M] = Kdiss/Kass
により表わされる。
抗原の種類等複数の要因によって、 得られる抗体の親和性は異なるが、 一般に は、 KD値は 1 X 10— 7 (M) 以下であることが好ましく、 例えば Ι Χ ΙίΓ 8 (M) 以 下、 Ι Χ ΙΟ-ιο(Μ)以下、 あるいは I X 10-u(M)以下のものが挙げられる。
本発明においては、 作製された抗体が上記いずれかの作用又は性質を発揮する 抗体であるときに、 「高親和性」 であると判断される。 抗体分子の親和性亢進は抗体遺伝子の可変領域 （V領域） 遺伝子に体細胞突然 変異 （SHM) が誘導することによって生まれる。 抗体の抗原に対する特異性は、 抗原を生体に免疫した当初から認められるが、初期の抗体の多くは IgMクラスで あり、 また抗原に対する結合親和性は高くはなく、 病原体や異物を除去したり、 不活化する能力は低い。 しかし、 抗原を生体に投与して数回の追加免疫を行うと 抗体の抗原に対する結合親和性が高まる。 この際、 B細胞は T細胞からの刺激が 必要であり、 末梢のリンパ組織の胚中心領域でその活性化が行われるとされてい る。 V領域遺伝子の突然変異誘導に必要な分子としては、 最近、 胚中心で発現す る UNAエディティング分子 AID であると報告されている。 さらに、 ゥラシル DNAグリコシダーゼ、 また DNA複製に必要な DNAポリメラーゼとしてミスを 生じやすい DNAポリメラーゼゼ一夕 （ζ ) とアイオタ ( し ~) が関与しているこ とが報告されているが、 これらの機能を制御する分子はまだ明らかにされていな い。 GANP分子は新たな SHM誘導分子としてその機能が明らかにされたもので あり、 その分子の発現上昇が SHM誘導に重要な鍵を握る。 とりわけ、 高親和性 抗体を産生するために重要であることが明らかになった。
C57BL/6 マウスにハプテン ·キャリアの抗原としてニトロフエニル -ニヮトリ ァグロブリンを免疫することにより誘導される抗体は、 Η鎖は VH186.2ローカス を用い、 L鎖は λ ΐである。 この際、 追加免疫をして得られる抗体は IgGi抗体で あり、そのうち特に結合親和性の高い抗体の V領域配列に誘導される突然変異は、 33番目のトリブトファンがロイシンに変異したものであることが知られている。 本明細書の実施例では、 このモデルシステムで高い高親和性型の V領域突然変異 が誘導されており、 これは、 高親和性抗体が誘導されたことを示す分子レベルで の明らかな証拠であると言える。
従って、 上記トランスジエニック哺乳動物又はその子孫に抗原を投与して抗体 を産生することによって、 高親和性抗体を得ることができる。 即ち、 GANP蛋白 質を高発現させた動物に目的とする抗原を常法によって投与し、 感作された動物 の血液又は脾臓等の組織 （これらの組織に限定されない） のリンパ球より高親和 性抗体を調製することができる。 高親和性抗体はポリクローナル抗体でもモノク ローナル抗体でもよい。
ポリクローナル抗体を産生する方法としては、 例えば、 抗原を本発明の卜ラン スジエニック哺乳動物に投与して免疫し、免疫された哺乳動物から血液を採取し、 採取した血液から抗体を分離 ·精製することにより得ることができる。
免疫感作の方法は当業者に公知であり、 例えば抗原を 1回以上投与することに より行うことができる。
抗原の種類は特に限定されるものではなく、 抗原決定基としての立体構造を持 ちうる物質すべてが該当し、 タンパク質、酵素、ペプチド、糖、脂質、 DNA, RNA, プリオンなどのあらゆる生体成分のほか、 癌抗原、 ウィルス抗原、 有機、 無機合 成抗原など任意のものを使用することができる。
抗原投与は、 例えば？〜 30日間隔で 2〜3回投与すればよい。投与量は 1回に つき、例えば抗原約 0.05〜2mg程度とすることができる。投与経路も特に限定さ れず、 皮下投与、 皮内投与、 腹膜腔内投与、 静脈内投与、 筋肉内投与等を適宜選 択することができるが、 静脈内、 腹膜腔内もしくは皮下に注射することにより投 与することが好ましい。 また、 抗原は適当な緩衝液、 例えば完全フロイントアジ ュバン卜又は水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュパントを含有する適 当な緩衝液に溶解して用いることができるが、 投与経路や条件等に応じてアジュ バントを使用しない場合もある。
免疫感作した哺乳動物を一定期間飼育した後、 哺乳動物の血清をサンプリング し、 抗体価を測定する。 抗体価が上昇してきたときに、 例えば 100 〜： 1000 t g の抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。 最後の投与から 1〜2ヶ月後に 免疫感作した哺乳動物から血液を採取して、 その血液をタンパク質の分離に採用 される各種常法、 例えば遠心分離、 硫酸アンモニゥム又はポリエチレングリコー ルを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等によって、 ポリク ローナル抗血清として、 ポリクローナル抗体を得ることができる。
モノクローナル抗体を産生する方法としては、 ハイプリドーマ法を挙げること ができる。先ず、アジュバント中に目的とする抗原を構成するペプチドを懸濁し、 得られる懸濁液を、 免疫動物 （即ち、 本発明のトランスジエニック哺乳動物） の 皮下または真皮内に投与する。 抗原の種類は前記と同様である。 用いられるアジ ュバントとしては、 フロイントの完全アジュバント、 フロイントの不完全アジュ バント、 BCG、 トレハロースダイマイコレート（TDM)、 リポ多糖 (LPS)、 ミヨウ バンアジュバント、 シリカアジュバント等が挙げられるが、 抗体の誘導能等の関 係から、 フロイントの完全アジュバント（CFA)とフロイントの不完全アジュバン ト (IFA)とを組み合わせて使用することが好ましい。
モノクローナル抗体の産生において、 免疫動物は抗原の初回免疫後、 更に、 追 加免疫を数回行い、 適当な日数を経過した後に部分採血を行い、 抗体価を測定す ることが好ましい。 本発明の方法で産生される抗体は高親和性抗体であるため、 上記免疫は初回のみで十分である可能性がある。 なお、 抗体価は、 例えば酵素ィ ムノアッセィ （以下 「ELISA」 という） 法等、 公知の方法により測定することが できる。
次いで、 感作の終了した免疫動物から脾臓を摘出し、 B細胞を得る。 この際、 抗原に結合する B細胞を得ることが、その後のスクリーニングを軽減できる点で 好ましい。 ここで得られる B細胞は高親和性抗体産生細胞であり、 これをそのま ま免疫賦活剤として使用することもできる。 また、 B細胞から直接 V領域遺伝子 を得て、 その V領域の体細胞突然変異を測定することもできる。
次いで、 B細胞を常法に従いミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイプリド —マを作製する。 例えば、 マウスの場合であれば、 脾臓を摘出し、 摘出した脾臓 を、 例えばハンクスの平衡塩溶液 （HBSS) 中に置き、 ピンセットで細胞を押し 出して脾臓リンパ球 （B細胞） を得る。 得られた脾臓リンパ球は、 トリパンブル 一等の染色液で染めて生細胞数をカウントし、 ミエローマ細胞と融合させてハイ ブリドーマとする。
細胞融合に用いられるミエローマ細胞は特に限定されず、 公知のものを使用で きる。例えば、 P3-X63.Ag8 (X63), P3-X63.Ag8.Ul (P3U1)、P3/NS I/l-Ag4'l(NSI)、 Sp2/0-Agl4(Sp2/0)等を挙げることができる。 ミエローマ細胞の選択にあたって は、 抗体産生細胞との適合性を適宜考慮する。
細胞融合は、 血清を含まない DMEM、 RPMI-1640培地などの動物細胞培養用 培地中で、 1 106〜1 107個/1111の抗体産生細胞と2 105〜2 106個/ £11のミェ ローマ細胞とを混合し （抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比 5 ： 1が好ま しい）、 細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。
細胞の融合方法は、 センダイウィルス法、 ポリエチレングリコール法、 プロト プラスト法等、 当該分野で公知の方法を任意に選択して用いることができるが、 特にポリエチレングリコール法が、 細胞毒性が比較的少なく、 融合操作も簡単で あるという理由から好ましい。 細胞融合促進剤としてのポリエチレングリコール は、 平均分子量 1000〜6000ダルトンのものを使用することができる。 なお、 抗 体を大量に作り出したい場合は、 ビニルピリジン誘導体で刺激した抗体産生細胞 と骨髄腫細胞を細胞融合させたハイプリドーマを用いることが好ましい。
得られたハイプリドーマは、 常法に従い、 HAT培地 （ヒポキサンチン、 ァミノ プテリン、 およびチミジン含有培地） 中で適当な期間培養し、 ハイプリドーマの 選択を行う。 次いで、 目的とする抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングを行 つた後、 ハイプリドーマのクローニングを行う。
スクリーニング法としては、公知の抗体検出方法を用いることができ、例えば、 ELISA法、 ラジオィムノアッセィ （以下 「RIA」 という） 法、 プラーク法、 凝集 反応法等を用いることができる。 また、 クローニング法としては、 当該分野で公 知の方法を用いることができ、 例えば、 限界希釈法、 軟寒天法および FACS法等 を用いることができる。 得られたハイプリドーマは、 適当な培養液中で培養する 力 あるいはハイプリドーマと適合性のある、 例えばマウス腹腔内に投与する。 こうして得られる培養液中または腹水中から、 塩析、 イオン交換クロマトグラフ ィー、 ゲル濾過、 ァフィ二ティークロマトグラフィー等により、 所望のモノクロ ーナル抗体を単離精製することができる。
また、 上記した抗体の断片及び V領域の一本鎖抗体も本発明の範囲内である。 抗体の断片としては、 前述したポリクローナル抗体又はモノク口一ナル抗体の一 部分の領域を意味し、 具体的には F(ab')2、 Fab'、 Fab, Fv (variable fragment of antibody) 、 sFv、 dsFv (disulphide stabilized Fv)あるレ 【ま dAb (single domain antibody) 等が挙げられる。 ここで、 「F(ab')2」 及び 「Fab'」 とは、 ィムノグロ ブリン （モノクローナル抗体） を、 それぞれ蛋白分解酵素であるペプシン、 パパ ィン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存在する ジスルフィ ド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。 例えば、 IgGをパパインで処理すると、 ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存在する ジスルフィ ド結合の上流で切断されて VL (L鎖可変領域） と CL (L鎖定常領域） からなる L鎖、 及び VH (H鎖可変領域） と CH T I (H鎖定常領域中のァ1領域） とからなる H鎖フラグメントが C末端領域でジスルフィド結合により結合した 相同な 2つの抗体フラグメントを製造することができる。 これら 2つの相同な抗 体フラグメントを各々 Fab'という。 また IgGをペプシンで処理すると、 ヒンジ領 域中の 2本の H鎖間に存在するジスルフィ ド結合の下流で切断されて前記 2つの Fab'がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造する ことができる。 この抗体フラグメントを F(ab')2という。 一本鎖抗体は、 VL と VHをリンカ一でつないだ構造を持つ。
本発明の高親和性抗体はヒト型化抗体ゃヒト抗体でもよい。 これらの抗体は、 免疫系をヒトのものと入れ換えた哺乳動物を用いて、 該哺乳動物を免疫して、 通 常のモノクローナル抗体と同様に直接ヒト抗体を作製することができる。 ヒト型化抗体を作製する場合は、 マウス抗体の可変領域から相補性決定領域
(complementarity determining region； CDR) をヒ卜口] "変領 に移植して、 ノ レームワーク領域 (FR)はヒト由来のものを、 CDRはマウス由来のものからなる再 構成した可変領域を作製する。
次に、これらのヒ卜型化された再構成ヒ卜可変領域をヒ卜定常領域に連結する。 最終的に再構成されたヒト型化抗体のヒト以外のアミノ酸配列に由来する部分は、
CDR及び極く一部の FRのみである。 CDRは超可変アミノ酸配列により構成さ れており、 これらは種特異的配列を示さないため、 マウス CDRを有するヒト型 化抗体を使用することが可能である。 ヒト型化抗体の作製法は、 当分野において 周知である。
ヒト抗体は、 一般に V 領域の抗原結合部位、 すなわち超過変領域 (Hyper Variable region)についてはその特異性と結合親和性が問題となるが、 構造的に どの動物で作製してもかまわない （マウス、 ラット等）。 一方、 V領域のそのほ かの部分や定常領域の構造はヒトの抗体と同じ構造をしていることが望ましい。 ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作成する方法が 確立されている。 本発明の抗体のアイソタイプは特に限定されず、 例えば、 IgG (IgGi, IgG2、 IgG3、 IgG4) 、 IgM、 IgA (IgAi、 IgA2) 、 IgDまたは IgEの任意のァイソタイ プを有することができる。 4 . 高親和性抗体の利用
本発明の高親和性抗体は、 疾患の診断、 治療又は予防のための薬剤として有用 である。
( 1 ) 疾患の診断
本発明の抗体を用いた各種疾患の診断方法は、 各種疾患の疑いのある被験者か ら採取した検体、 例えば血清等と本発明の抗体とを抗原抗体反応によって結合さ せ、 結合した抗体量により検体中の目的とする抗原の量を検出することにより行 う。 抗体量の検出は、 公知の免疫学的測定法に従って行えばよく、 例えば、 免疫 沈降法、 免疫凝集法、 標識免疫測定法、 免疫比ろう法、 免疫比濁法等を用いるこ とができる。 特に標識免疫測定法が簡便かつ高感度という点で好ましい。 標識免 疫測定法では、 検体中の抗体価は標識抗体を用いて直接検出した標識量で表すほ か、 既知濃度あるいは既知抗体価の抗体を標準液として用いて相対的に表しても よい。 すなわち、 標準液と検体を同測定系にて同時に測定し、 標準液の値を基準 にして検体中の抗体価を相対的に表すことができる。
標識免疫測定法としては、 公知の測定法、 例えば、 ELISA法、 RIA法、 蛍光免疫 測定法、 化学発光免疫測定法等を任意に利用することができる。 用いる標識物質 は、 上記測定法に応じて、 酵素、 放射性同位体、 蛍光化合物、 および化学発光化 合物等を適宜選択すればよい。 前記酵素としては、 例えば、 ペルォキシダーゼ、 アルカリホスファタ一ゼ、 酸性ホスファタ一ゼ、 グルコースォキシダーゼ等を挙 げることができる。 上記標識物質はアビジン一ピオチン複合体を用いることによ り、 標識物質の検出感度を向上させることも可能である。 また、 放射性同位体と しては、 主に i25Iが、 蛍光化合物としては、 フルォレセィンィソチオシァネー 1、 (FITC) ゃテトラメチルローダミンイソチオシァネート （TRITC) 等が挙げら れる。 化学発光化合物としては、 口フィン、 ルミノール、 ルシゲニン等が挙げら れる。上記標識物質による抗体の標識は、常法に従って行うことができる。以下、 標識抗体を用いた標識免疫測定法について説明する。
標識免疫測定法による、 各種疾患を検出する方法としては、 公知の非競合反応 系あるいは競合反応系を用いて行うことができる。 非競合反応系においては、 固 相が必要である （固相法）。 競合反応系においては、 必ずしも固相を必要としない (液相法） が、 固相を用いた方が、 測定操作が簡便になるため好ましい。 固相の 材質としては、 例えば、 ポリスチレン、 ナイロン、 ガラス、 シリコンラバー、 セ ルロース等が挙げられ、 固相の形状としては、 球状、 ゥエル状、 チューブ状、 シ ート状等が挙げられるが、 これらに限定されず、 標識免疫測定法に用いられる公 知のものを任意に用いることができる。
非競合反応系の場合、 測定操作は、 検体または本発明の抗体を固相化した後、 本発明の抗体または検体と反応させ、 次いであらかじめ標識しておいた抗免疫グ ロブリン抗体 （二次抗体） を加えて固相化した検体と反応している抗体と反応さ せる。 この二次抗体の標識により、 検体に結合した抗体量を検出することができ る。 検出された標識化二次抗体の量は、 検体中の目的とする抗原の量と正相関す るので、 これにより検体中の目的とする抗原の量を求めることができる。
競合反応系では、 一定量の抗体に対して、 検体と一定量の目的とする抗原を競 合的に結合させる。 例えば、 検体を固相化した後に、 あらかじめ目的とする抗原 を添加し反応させた本発明の抗体と反応させる。 次に、 固相化された検体と反応 した抗体を、 あらかじめ標識しておいた抗免疫グロブリン抗体 （二次抗体） と反 応させ、 標識物質によって抗体の量を検出することができる。 検出される標識量 は、 添加された目的とする抗原の量と逆相関する。 そのほかの競合反応系として は、 本発明の抗体を固相化して、 これに検体と反応させた後、 あらかじめ標識し ておいた目的とする抗原を反応させる。 検出される標識量は、 抗体と結合した検 体中の GANP蛋白質量と逆相関する。
前記した抗原または抗体の固相化法としては、 物理的吸着法、 共有結合法、 ィ オン結合法、 架橋法等、 公知の方法を使用できる。 特に、 物理的吸着法が簡便と いう点で好ましい。 また、抗免疫グロブリン抗体（二次抗体） としては、例えば、 抗 IgG抗体、 抗 IgM抗体等を用いることができる。 これらの抗体は、 抗体分子 をそのまま使用してもよいし、 あるいは抗体を酵素処理して得られる抗原結合部 位を含む抗体フラグメントである Fab、Fab'、F(ab')2を使用してもよい。さらに、 標識した抗免疫グロプリン抗体の代わりに、 抗体分子に特異的な親和性をもつ物 質、例えば IgGに特異的な親和性をもつプロテイン A等を標識して使用してもよ い。
前記標識免疫測定法の好適な例として、 酵素を標識とした免疫測定法、 ELISA 法を挙げることができる。 ELISA法は、 例えば、 96穴プレートに検体またはそ の希釈液を入れて、 4 °C〜室温で一晩、 または 37°Cで 1〜3時間程度静置して検 出すべき GANP蛋白質を吸着させて固相化する。次に、本発明の抗体を反応させ、 次いであらかじめ酵素を結合させた抗免疫グロブリン抗体 （二次抗体） を反応さ せる。 最後に酵素と反応する適当な発色性の基質 （例えば、 酵素がホスファタ一 ゼの場合は P-ニトロフエニルリン酸等） を加え、 この発色によって抗体を検出す る。
また、 本発明の高親和性抗体を利用することにより、 各種疾患の治療薬の薬効 評価を行うことができる。 本発明の高親和性抗体を利用した薬効評価方法は、 各 種疾患患者あるいは各種疾患モデル動物に対して薬剤を投与後、 これら生体中の ウィルス等の抗原の量を本発明の抗体を用いて検出し、 その量を比較することに より、 生体中の抗原の量を通して各種疾患の治療薬としての薬効を評価すること ができる。
本発明の高親和性抗体は、 各種疾患診断用キッ卜の形態で提供することができ る。 該キットは、 本発明の診断方法や本発明の薬効評価方法に使用することがで きる。本発明のキットは以下の (a)及び (b)から選ばれる少なくとも一つ以上を含む。
(a)本発明の抗体またはその標識物
(b)前項 (a)記載の抗体またはその標識物を固定した固相化試薬
ここで、 抗体の標識物とは、 酵素、 放射性同位体、 蛍光化合物、 または化学発 光化合物によつて標識されたものを意味する。
また本発明のキットにおける抗体、 もしくはこれらの標識物を固定する固相の 材質としては、 ポリスチレン、 ナイロン、 ガラス、 シリコンラバー、 セル口一ス 等が挙げられ、 固相の形状としては、 球状、 ゥエル状、 チューブ状、 シート状等 が挙げられるが、 これらに限定されない。 該固相化試薬の代わりに、 固相と固相 化に必要な固相化試薬を添付したものでもよい。 固相化試薬として、 例えば物理 的吸着による固相化の場合は、 50mM炭酸塩緩衝液 （pH 9.6)、 10 mM トリス- 塩酸緩衝液 (pH8.5、 lOOmM塩化ナトリウム含有)、 PBS等のコーティング液と、 さらに必要に応じてコーティング液に 0.5%のゼラチン等を含有させたブロッキ ング液が挙げられる。
また、 本発明のキットにおける抗体は、 PBS等に溶解させた状態、 あるいはゲ ルに結合させた状態 （以下、 「吸収用ゲル」 と略す） であってもよい。 前記吸収用 ゲルはさらに適量を、 バッチ法による吸収処理用に 0.5〜2ml程度のマイクロ遠 沈チュ一ブに予めパッケージングされた状態であつてもよく、 あるいはカラム法 による吸収処理用にカラム容量が 0.1 〜5 mlのミニカラムに予め充填された状 態であってもよい。
本発明のキットは、 上記した構成要素のほか、 本発明の検出を実施するための 他の試薬、 例えば標識物が酵素標識物の場合は、 酵素基質 （発色性基質等）、 酵素 基質溶解液、 酵素反応停止液、 あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。 前 記検体用希釈液としては、 例えば PBS (生理的リン酸緩衝液、 pH7.4)、 137mM 塩化ナトリウムおよび 3mM塩化力リゥムを含む pH7.4かつ 20mMのトリス-塩 酸緩衝液 （以下、 「TBS」 と略す）、 0.05 %Tween20、 0.1〜： 1 %の BSA を含有さ せた PBS、 あるいは TBS等を挙げることができる。 該検体用希釈液は、 検体希 釈以外、 例えば抗体の希釈等に用いてもよい。
( 2 ) 疾患の治療又は予防用医薬組成物
本発明の高親和性抗体は、 疾患の病原となる抗原の活性を中和させる作用を有 するものであれば、 疾患の治療又は予防のための医薬組成物として有用である。 本発明の医薬組成物は、 本発明の高親和性抗体またはその断片を有効成分として 含み、 さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが 好ましい。 ここで 「薬学的に許容され得る担体」 とは、 賦形剤、 希釈剤、 増量剤、 崩壊剤、 安定剤、 保存剤、 緩衝剤、 乳化剤、 芳香剤、 着色剤、 甘味剤、 粘稠剤、 矯味剤、 溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。 そのような担体の一つ以上 を用いることにより、 錠剤、 丸剤、 散剤、 顆粒剤、 注射剤、 液剤、 カプセル剤、 トローチ剤、 エリキシル剤、 懸濁剤、 乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組 成物を調製することができる。 これらの医薬組成物は、 経口あるいは非経口的に 投与することができる。 非経口投与のためのその他の形態としては、 一つまたは それ以上の活性物質を含み、 常法により処方される外用液剤、 腸溶内投与のため の坐剤およびべッサリーなどが含まれる。
本発明の薬剤の投与量は、 患者の年齢、 性別、 体重及び症状、 治療効果、 投与 方法、 処理時間、 あるいは該薬剤に含有される活性成分である高親和性抗体の種 類などにより異なるが、 通常成人一人当たり、 一回につき 10 Z gから 1000mg、 好ましくは lO gから lOOmgの範囲で投与することができるが、 この範囲に限 定されるものではない。
例えば、 注射剤の場合には、 例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等 の薬学的に許容される担体中に 0.1 抗体/ ml担体〜 10mg抗体/ ml担体の濃度 となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。 このように して製造された注射剤は、 処置を必要とするヒト患者に対し、 1回の投与におい て lkg体重あたり、 1 g〜100mgの割合で、 好ましくは 50 g〜50mgの割合 で、 1日あたり 1回〜数回投与することができる。 投与の形態としては、 静脈内 注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、 好ましくは静脈内注射である。 また、 注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例 えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 ォリーブ油のような植物 油、 エタノールのようなアルコール類など） 、 懸濁剤あるいは乳濁剤として調製 することもできる。 そのような注射剤の無菌化は、 バクテリア保留フィルターを 通す濾過滅菌、 殺菌剤の配合または照射により行うことができる。 注射剤は、 用 時調製の形態として製造することができる。 即ち、 凍結乾燥法などによって無菌 の固体組成物とし、 使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用 することができる。
5 . 本発明の応用
本発明者らは、 B細胞腫瘍株に GANPの過剰発現を誘導した上で解析を行った 結果、 B細胞腫瘍株は GANP遺伝子導入によって、 飛躍的な V領域遺伝子の体 細胞突然変異誘導効果を有することを示した。 この効果は、 GANPの RNAブラ ィマ一ゼ活性に必要な 502番目のセリンのリン酸化が起こらないような変異遺伝 子を用いた場合には見られないことから、 V領域遺伝子の体細胞突然変異の飛躍 的な誘導には、 RNAプライマ一ゼ活性が必要であることを示している。 この結果 は、 臨床的な補助免疫賦活剤として、 GANPが特異的抗体産生の増強効果を有す ることを示すものである。
ベクターとしてレトロウイルスベクターを使用し、 CD40、 BAFFなどの TNF ファミリ一分子を介する刺激を GANPと併用することも、臨床的な補助免疫賦活 作用にとって効果的である。 また、 この遺伝子導入を骨髄細胞レベルで行うこと によって、 T細胞における高親和性結合の誘導も期待できる。 エイズ、 C型肝炎 ウィルス、 成人 T細胞白血病、 狂牛病などの高親和性抗体が得られない場合や、 あるいは得られたとしてもすぐに抗原の変異が起こるために十分に高親和性抗体 の産生が持続できない場合には、 この遺伝子導入は優れた効果を発揮すると期待 できる。
本発明の GANP遺伝子過剰発現哺乳動物は、生物学研究試薬、臨床検査試薬作 製に有効なモノクローナル抗体の開発に有効である。 例えば、 特定のシグナル伝 達分子に対するモノクローナル抗体を機能ドメインや機能モチーフに特異的にそ して結合力の高い高親和性抗体を簡便に作製することは非常に活用される範囲が 広い。 多くの抗体はそれほど多くのスクリーニングをかけないため、 ウェスタン 解析と免疫沈降に用いることができない場合がある。 この場合、 本発明のトラン スジエニック哺乳動物を用いれば、 比較的少ないクローンの抗体から高親和性抗 体産生細胞を短時間で選別することができ、 経費、 時間、 労力の削減する効果は 大きい。 特にリン酸化抗体、 遺伝子変異部分に対する特異抗体の作製は診断薬、 あるいは抗体を用いた薬物の選択的注入法に応用できる。 また遺伝子の配列ゃヌ クレオチド部分に選択的に結合する高親和性抗体の産生も可能となる。
無機物、 炭水化物、 化学合成物など、 任意の物質の立体構造の一部は、 抗原モ チーフとして認識される。 従来には高親和性抗体は得られていないが、 自己免疫 疾患マウスとの交配で作製されるマウスは、 あらゆる抗原に対して高親和性抗体 を得るために有効である。この方法で結合力が 10-UMオーダーの高親和性抗体が できる可能性があり、 ELISA法の技術開発を導入することにより、 微量物質の検 出を簡便に行う技術を開発することが可能である。
また、 本発明によれば、 RNAプライマ一ゼ不活性型 GANP遺伝子を含む、 ァ レルギ一疾患又は自己免疫疾患のための遺伝子治療剤を提供することも可能であ る。 「RNAプライマーゼ不活性型 GANP遺伝子」 とは、 RNAプライマ一ゼドメ イン欠損、 又は RNAプライマ一ゼドメインが変異した遺伝子を意味し、 502番 目のセリン残基の変異を含む近傍の遺伝子の変異によって GANP分子の構造お よび機能的な変化を生じた遺伝子のことを意味する。
本発明の遺伝子治療剤は、 RNAプライマーゼ不活性型 GANP遺伝子を含む組 み換えベクターを、 遺伝子治療剤に用いる基剤と一緒に配合することにより製造 することができる。 組み換えベクターの構築の際に用いるベクターとしては、 ゥ ィルスべクタ一としてレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデ ノ随伴ウィルスベクタ一、 バキュロウィルスベクター、 ワクシニアウィルスべク 夕一などが挙げられ、 あるいは動物発現用プラスミドを使用することもできる。 ベクタ一は好ましくはウィルスベクターである。 RNAプライマーゼ不活性型 GANP遺伝子をウィルスベクタ一に組み込んだ場合は、 組換え体 DNAを含有す るウィルス粒子を調製し、 遺伝子治療剤に用いる基剤と一緒に配合することによ り遺伝子治療剤を製造することができる。
遺伝子治療剤に用いる基剤としては、 通常注射剤に用いる基剤を使用すること ができ、 例えば、 蒸留水、 塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合 物等の塩溶液、マンニトール、 ラクトース、デキストラン、 グルコース等の溶液、 グリシン、 アルギニン等のアミノ酸溶液、 有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶 液との混合溶液等が挙げられる。 あるいはまた、 当業者に既知の常法に従って、 これらの基剤に浸透圧調整剤、 pH調整剤、 植物油、 もしくは界面活性剤等の助 剤を用いて、 溶液、 懸濁液、 分散液として注射剤を調製することもできる。 これ らの注射剤は、 粉末化、 凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製する こともできる。
本発明の遺伝子治療剤の投与形態としては、 通常の静脈内、 動脈内等の全身投 与でもよいし、 局所注射又は経口投与等の局所投与を行ってもよい。 本発明の遺 伝子治療剤の投与量は、 年齢、 性別、 症状、 投与経路、 投与回数、 剤型によって 異なるが、 一般に、 成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として 1 g/kgか ら 1000mg/kg程度の範囲であり、 好ましくは 10 g/kgから 100mg/kg程度の範 囲である。 投与回数は特に限定されない。 実施例
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されるものではない。
実施例 1 ： 自己免疫疾患モデル動物における GANPの発現とその機能
(材料及び方法）
1. 動物
NZB、 NZW、 B/WF1、 MRL/lpr、 及び BXSB マウスは Japan SLC Co.から購 入した。
C57BL/6及び BALBんマウスは Charles River Japanから購入した。 NODマ ウスは大阪大学大学院の宮崎博士から供与された。
2. 抗体及び試薬
マウス B220 (RA3-6B2) マウス IgM (AM/3) 及びマウス IgD (CS/15)に対す るラットモノクローナル抗体はハイプリドーマの培養上清から精製し、 D-ビォチ ン -N-ヒドロキシスクシンイミドエステル (Roche diagnostics, Branchburg, NJ) で標識した。ピオチン標識ラット抗マウス Syndecan-1及び抗マウス CD5モノク 口一ナル抗体は購入した （BD PharMingen, San Diego, CA)。 ピオチン標識ピー ナッツァグルチ二ン (PNA)は Vector Laboratories (Burlingame, CA)から購入し た。 3. 免疫
トリニトロフエニル-キーホールリンぺッ トへモシァニン（Trinitrophenyl keyhole limpet hemocyanin (TNP-KLH)及び TNP'Ficoll は Biosearch Technologies (Novato, CA)から購入した。完全フロイントアジュバンドに乳化し た 100 /i gの TNP-KLHまたは PBS中の 25 gの TNP-Ficollをマウスの腹腔内 に注入した。 14日後、 リンパ器官を取得し、 免疫組織分析用に OCT化合物とと もに凍結した。
4. 免疫組織分析
6 mの凍結切片をアセトンで 5分間固定し、 PBS中の 3% BSAで 15分間ブ ロッキングし、ラット抗マウス GANPモノクローナル抗体 (42-23) [Kuwahara K.， 他、 2000, Blood 95: 2321-2328]またはラット抗 -pSer502 GANPモノクロ一ナル 抗体 （PG/103) [Kuwahara K.，他、 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10279- 10283]と一緒に 1時間インキュベートした。切片をのせたスライドグラス を PBSで数回洗浄し、アルカリホスファタ一ゼ （ALP)-結合ャギ抗ラット IgG抗 体 (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA)と一緒にィンキュベートした。 発色 は Vector Blue kit (Vector)を用いて行った。 二重染色のために、 反応はピオチン 標識抗体と西洋ヮサビペルォキシダーゼ (HRP)-結合ス トレブトアビジン (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, JVID)を糸且み合わせ一し行つた。 3-3，-ジァミノべンジジンテトラヒドロクロライド (DAB; 同仁化学)による発色後、 切片を PBS 中 1%グルタルァルデヒドで 1分間固定した。 Aquatex (Merck, Darmstadt, Germany)をマウンティングのために用いた。インビボで増殖活性の ある細胞を検出するために、プロモデォキシゥリジン （BrdU) (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO; 1 nig/マウス）を屠殺する 2時間前に静脈内に注入した。 DNA合成を行う細胞を抗 BrdUモノクローナル抗体 （BD PharMingen)と ALP- 結合ャギ抗マウス Ig抗体 (Sigma)とを組み合わせて染色し Vector Red (Vector) により発色させて検出した。 PAS染色は既報の通り行った [Jiang Y.他、 1997, ^7： Immunol. 158： 992.997]。
5.結果
(1) MRL/lpr マウスのリンパ節における GANPhi細胞の出現
GANP 発現は自己免疫傾向の高活性 B 細胞で高発現している。 高レベルの GANPを発現するリンパ細胞 （GANPhi細胞)は、 MRL/lprマウスの末梢リンパ 節において非免疫状態において自発的に出現する。
抗 GANPモノクローナル抗体および ALP結合抗ラット Ig抗体を用いて、自己 免疫疾患モデル MRL/lpi'、 NZBおよび正常 C57BL/6雌マウス由来の膝嵩リンパ 節について免疫組織化学分析を行った。
結果を図 1に示す。 Vector Blue (ALP基質） で染色された GANPhi細胞は 7 週目に MRL/lprマウスのリンパ節で観察されたのに対し、 同年齢の NZBマウス では観察されず、 40週目に出現した （図 1 )。 正常 C57BL/6マウスでは、 極少数 の GANPhi細胞が全期間を通じて観察された。
自己免疫疾患モデルマウスは、 C57BL/6 マウスと比較してリンパ細胞の増加 は顕著であり、 非免疫条件下では GANPhi細胞は示されない （図 1 )。 そのような GANPhi細胞の出現を、加齢の間少しずつ自己免疫状態を引き起こす NZBマウス のリンパ節で調べた。 若い NZBマウス （7週齢） は、 膝窩リンパ節に GANPhi細 胞を有さないが、 加齢した NZB (40 週齢)は多数の GANPhi細胞を有した。
GANP RNAプライマーゼ活性は B細胞の活性化と分化において重要な役割を 担っている可能性がある。そこで、 NZBマウスで抗 pSei'so2モノクローナル抗体 を用いて、 RNAプライマ一ゼ活性の重要なリン酸化部位である Ser502のリン酸 化状態を比較した。
NZBマウスのリンパ節中の GANPおよび p Ser 502 GANPの発現を比較した。 PSer502 GANPは抗 pSer5o2 GANP(PG/103)モノクロ一ナル抗体 (青)で検出し、全 切片をピオチン標識抗 B220モノクローナル抗体で染色した後、 HRP結合ストレ ブトアビジンと DAB (茶色)を組み合わせて検出した。 2回の独立した実験から代 表的データを示した （図 2 )。
図 2において、 下段の図 （グラフ） は、 加齢の間に濾胞外領域の GANPhi (黒の 棒)および pSer502 GANPhi (斜線の棒)の細胞数を示す。
GANPの発現は 8週目で顕著であり、 GANPhi細胞が 32週までの全期間を通 じて検出された （図 2 ;上図)。 対照的に、 pSer5o2-陽性細胞は 8週目に最大であつ たが、 その後、 陽性細胞は顕著に減少した (図 2 ；真中の図)。 ピーク年齢に基づ く顕微鏡観察での反応性細胞数を図に示す（図 2 ；下図）。 これらの結果から、 GANP発現は最初に R N Aプライマーゼ活性を伴うが、 この活性は長期間に渡つ ては調節されていないことが分かる。
(2) 自己免疫傾向マウスの脾臓の赤脾髄における GANPhi細胞の自発的 出現
自己免疫傾向 NZBマウスの膝窩リンパ節で検出された GANPhi細胞が非免疫状況 下の脾臓に出現するかどうかを調べた。
免疫染色は前記 (1)の操作 （図 2 ) と同様に行った。 3回の独立した実験からの 代表的データを示した （図 3 )。
GANPhi細胞は 4週目に脾臓に出現し、 細胞数は 12週目に最大値に達したが、 24週後に消失した（図 3 ;上図)。 PSer502 GANPの発現も 8週目と 12週目に検出 された （図 3 ;真中の図)。 赤脾髄の相対細胞数と比較した結果、 脾臓に出現した GANPhi細胞は 12週後には末梢リンパ節に移動していることが分かる。 GANP の増加は、 自己免疫疾患の発症に先行する自己抗体の産生量に比例している （図 2及び図 3； Theofilopoulos A.N.，他、 1985, Adv. Immunol 37： 269-390)。
GANPhi細胞の出現は自己免疫傾向マウスにおける B細胞の異常と関連してい る可能性があるので、 非免疫条件下で各種の自己免疫傾向マウス （8週齢） にお ける GANPW細胞の出現を調べた。 結果を図 4に示す。 GANPW細胞は MRL/lpr、 NZB及び B/WF1の赤脾髄で顕 著に出現した。
GANPW細胞の数は SLE-モデルマウスの BXSB 及び NODの脾臓にはそれほ ど増加しなかったが、 対照の BALB/cマウス （図 4 ) 及び C57BL/6マウス （図 1 )と比較すれば増加していた。 脾臓の切片は、 GC様構造として PNA+ B細胞の 連想又は未熟の会合を示した。 GC様領域での GANPの発現は、 正常 C57BL/6 マウス及び BALB/cマウスに、 T細胞依存性抗原 (T cell-dependent AgS: TD-Ags) を免疫することによって作製した GCでの GANPの発現と比較して高くない。し かし、 GANPhi細胞は、 自己免疫傾向マウスの赤脾髄領域で顕著に出現していた (図 4)。
さらに、 GANPW細胞集団を、 リンパ系細胞のマーカー分析によって解析した。 ピオチン標識抗 B220モノクローナル抗体、 ピオチン標識抗 Syndecan-1モノ クローナル抗体、 ピオチン標識抗 IgMモノクローナル抗体、 及び抗 IgG抗体を 用いて、 NZBマウスの脾臓切片について二重染色を行い、 GANPhi細胞を同定し た。
結果を図 5に示す。 図 5に示すパネルの左の列は、 上から下に順にピオチン標 識抗 IgMモノクローナル抗体、抗 IgG抗体、 ピオチン標識抗 B220モノクロ一ナ ル抗体及びピオチン標識抗 Syndecan-1モノクローナル抗体を用いたときの図で ある。 中央の列は、上記それぞれの抗体を用いたのと同じ切片での GANPの発現 を示す。 右の列は左の列と中央の列を重ね合わせた図である。 右列の二重に染色 された細胞は、 GANPhi細胞が B220-Syndecanl+IgM+であることを示す。 GANP 発現は、 IgM、 IgG及び B200の場合は赤色で示し、 Syndecan-1の場合は緑色で 示す。 マ一カーは、 IgM、 IgG及び B200は緑色で示し、 Syndecan-1の場合は赤 色で示す。
GANP^細胞は B220-Syndecan-1+ の表現型を発現し、 多量の IgM を細胞中 に発現する（図 5 )。 CR1、 Thyl, GL-7、 CD23及び PNAについては陰性であり、 これらの結果から、 GANPW細胞が B系細胞の後期成熟段階、 おそらく形質細胞 であることが示される。 この GANPW細胞が増殖性形質芽細胞であるかどうかを 調べるために、 NZBマウスに BrdU (1 mg/マウス）を投与 （静脈内注入） し、 ィ ンピポで BrdUを取り込ませるために 2時間インキュベートした。 その後、 マウ スから脾臓切片を調製した。
切片を抗 GANPモノクロ一ナル抗体（青）及び抗 BrdUモノクローナル抗体（赤） で二重染色した。 PAS染色を常法に従って行った。
結果を図 6に示す。 GCは胚中心を示す （左）。 GANP単一陽性 GANPhi細胞 は矢印で示し、 PAS単一陽性細胞を矢頭で示す （中央）。
また、 切片をピオチン標識抗 CD-5モノクローナル抗体で染色した。 PALS領 域は、 リンパ節動脈周囲鞘を示す （右）。 図 6は、 3回の独立した実験から代表的 データを示した。
GANPW細胞は BrdU取り込みについて陽性ではないことから （図 6 )、 これ らの細胞は増殖性ではなく、形質芽細胞段階より成熟していることが示唆された。
B-1細胞の異常な分化として、 Mott細胞形成が自己免疫傾向マウスで観察され る。 Mott細胞は形質細胞の異常な形態であり、 多量の IgM分子が、 PAS染色に より細胞質内 Russell 小体として検出される粗面小胞体結合小胞に蓄積している [Jiang Y.,他、 1997, J. Immunol. 158： 992-997]。 GANP 細胞は PAS-染色で 染色されず (図 6 )、 これにより GANPhi細胞を B-1 細胞由来形質細胞の Mott細 胞と区別することができる。脾臓 GANP 集団は CD5発現が陰性であり（図 6 )、 NZBマウス（12週)カゝら得た腹膜細胞は GANPW細胞について陰性であったこと から、 B-1細胞は多量の GANPを発現していないことが示される。 これらの結果 から、 GANPW 細胞は自己免疫状態で高活性の B 細胞に分類され、 この集団が B-1細胞の起源とは異なる起源の系統であることが示唆される。 (3) TD-Agでの免疫による正常マウスにおける GANPW細胞の誘導 二次リンパ器官における GANPhi形質細胞の出現が、 自己免疫傾向マウスに限 られているかどうかを調べた。
雌 C57BL/6 マウス（ 7週齢）を、 TNP-Ficoll (ΤΙ-2'Ag)又は TNP'KLH (TD-Ag) で腹腔内免疫し、 14 日後に脾臓を得た。 TNP-Ficollで免疫したマウスは、 ピオ チン標識抗 IgDモノクローナル抗体で対比染色した場合、 GANPhi細胞を赤脾髄 領域で示さなかった （図 7左）。 TNP-KLHで免疫したマウスは 、 GANPhi細胞 の誘導を赤脾髄領域で示した （図 7右）。 図 7において、 GANPhi細胞は矢印で示 す。 WPは白脾髄領域を示す。
GANP^ 形質細胞集団は、 数は非常に少ないが、 TD-Ags による免疫によって 正常 C57BL/6及び BALB/cマウスの脾臓においても誘導される（図 7 )。 T細胞非 依存性 Ag (T cell-independent Ag: TI-Ag) による免疫はそのような細胞の誘導 において効果は小さい。 GANP 細胞集団は BSSOklgMhilgDkGL kPNAk CDSkCDAOiQ と同様の表現型を示したが、 Syndecan-1+を示した。
これらの結果から、 自己免疫傾向マウスにおける GANPhi形質細胞の生成は、 TD-Ag に対する免疫応答のために提供されるのと同様の刺激によって誘導され ることが示される。 GCで増殖と分化を経た Ag駆動 B細胞は、 GANPを発現し ながらより長い間、 形質細胞段階として赤脾髄領域に局在化している可能性があ る。 ' 実施例 2 ： GANPの過剰発現
(方法）
1. Daudi細胞への安定なトランスフエクシヨン
10 gの線状化した pCXN-2マウス GANP又は GANPS/A502 cDNAを Daudi 細胞に、 Gene Pulser II (Bio-Rad)を用いてエレクトロポレ一ションを行った。 48時間後、 G418 (Promega; 1 mg/ml)により選択を開始して、 マウス GANPを安 定に発現する Daudi細胞を得た。 2. Daudiトランスフエクタントの Ig VH転写物の分析
全 RNAを全細胞から Trizol (Invitrogen)を用いて抽出した。 cDNAを既報の通 り取得した (Kuwahara, K. et al" Blood 95， 2321-2328 (2000))。 LVH3- CHIC 転写物を以下のプライマー及び反応液を用いて増幅した。 増幅は、 Pfu Turbo (Stratagene)を用レ た。
5，-LVH3 プライマ一： 5，-CTATAACCATGGACCATGGACATACTTTGTTCC-3，
(配列番号 5 )
3，-XbaI-CHl-C プライマー ：
5'-TGCATGCATTCTAGAGTTGCCGTTGGGGTGCTGGAC-3' (配列番号 6 ) 反応液組成：
cDNA 0.5 μΐ
10x buffer 2.5 μΐ
10 mM dNTP mix 0.5 μΐ
5'-LVH3 primer (10 μΜ) 1 ΐ
3'-Xba Ι-ΟΗΙ-Ομ primer (10 μΜ) 1 μΐ
Pfu Turbo 0.5 μΐ ―
dH20 19.5 μΐ 反応条件：
94°C 1 min
[94°C 1 min; 62°C 1 min； 72°C 1 min] X 35 サイクル
72°C 10 min
4°C
PCR産物を Ncol及び Xbalで消化し、 ゲルで精製し、 NcoI_XbaIで消化した プラスミドとライゲ一シヨンした。 コンビテント細菌に形質転換後、 QIAprepキ ット（QIAGEN)を用いて調製した少量のプラスミド DNA の塩基配列を自動シ一 クェンサー （Applied Biosystems) により決定した。
3. GANP-トランスジエニック（Tg)マウスの作製
導入遺伝子は、 pLGベクタ一の Xholサイトに 5.6 kbのマウス GANP遺伝子 を導入して作製した。 このべクタ はヒト免疫グロプリンィントロンェンハンサ 一領域 （2 kb EcoRIフラグメント） を持ち、 B細胞での強力な発現を行う、 特異 的べクタ一である。 この遺伝子を直線化してマウスに遺伝子導入を行った。 マウ ス GANP 全長 cDNA を含む線状化した pLG vector (Koike, M. et al. Int. Immunol. 7, 21-30 (1995)) を C57BL/6 マウスの受精卵にマイクロインジェク シヨンした。 マウスの尾のゲノム DNAおよび以下のプライマー及び反応液を用 いて導入遺伝子の存在についてスクリーニングした。
1-5' プライマー： 5'-TCCCGCCTTCCAGCT GTGAC-3' (配列番号 7 )
1-3'プライマ一： 5'-GTGCTGCTGTGTTATGTCCT-3， （配列番号 8 )
反応液組成：
DNA (50 ng/ μΐ) 1 μΐ
10x buffer 2.0 μΐ
2.5 mM dNTP mix 2.0 μΐ
1-5' primer (10 μΜ) 0.8 μΐ
1-3， primer (10 μΜ) 0.8 μΐ
Z-Taq DNA polymerase 0.1 μΐ
dH20 13.3 μΐ 反応条件：
[98°C 5 sec; 59で 5 sec ; 72°C 10 sec] X 35 サイクル
4°C
4. RT-PCR
全 RNAは、 脾臓又は脾臓 B細胞から Trizol(Invitrogen)を用いて抽出し、 RT-PCRは、 2種のプライマ一 1-5'及び 1-3'を用いて行い、 cDNAを合成した
(Kuwahara, K. et al., Blood 95, 2321-2328 (2000))。 GANP転写物はァガロ ースゲル電気泳動により検出した。 |3 -ァクチン転写物は対照として用いた。
5. 結果
(1) Daudi細胞にマウス GANPを安定的に発現させたトランスフエクタ ントの V領域遺伝子の体細胞突然変異 （SHM)
GANP遺伝子を、インビトロで SHMの分析に使用される各種ヒト Bリンパ球 細胞に導入した (Rogozin, I. B" et al" Nat. Immunol. 2, 530-536 (2001)； Kuwahara, K. et al. Blood 95, 2321-2328 (2000); 及び Denepoux, S. et al" Immunity 6， 35-46 (1997))。多くの B細胞株にはトランスフエクションできな かったが、 維持中は SHMを通常は生成しない AIDを発現する Daudi B細胞に は GANP遺伝子を導入できた。
このクローンは、 野生型及び偽トランスフエクシヨンした細胞と比較して高頻 度の SHM (5 X ICH/bp)を V領域で示した。 .
VH3-CH1C ^の断片を PCRで増幅してプラスミドにサブクローニングし、シー 体細胞変異の模式図を図 8 A〜Cに示す。 縦線 （「 |」） はサイレントミューテ ーシヨン （アミノ酸が変わらない）、 もう一つの記号 （縦線に ·印を付したもの） にはアミノ酸が置換している変異を示す。 Daudi/mock ではほとんど変異が入つ ていないが、 Daudi/GANP-14， 15, 17， 21の 4クローンは、 程度の差はあるが変 異を多く認める。 DNAプライマーゼ活性の制御に関係する 502番目のセリンを ァラニンに置換した変異体（GANP S/A)を導入したトランスフエクタントでは変 異の入る効率が減少する。
SHMは、定常領域遺伝子には誘導されなかった（図 8 A〜C )。 GANPの RNA プライマーゼ活性は S502でのリン酸化により調節され、 これは特異的モノクロ ーナル抗体により検出できる （Kuwahara, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98， 10279-10283 (2001))。 インビトロ及びインビポでの B 細胞の刺激は共に S502のリン酸化を誘導するので （Kuwaham, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283 (2001))、 このリン酸化が Daudi B細胞での SHMの生 成に関与するかどうかを調べた。
非リン酸化 GANP変異体 (GANP-S502A)を導入した場合、 SHMは誘発されな かったことから （図 8 A)、 S502のリン酸化が、 GC-B細胞での SHMの生成に 重要であることが示唆された。 (2) B細胞で GANPを過剰発現させたトランスジエニックマウス 免疫応答における GANPの関与を調べるために、 ヒト Igェンハンサ一及びプ 口モーターの制御下にマウス GANpを過剰発現させた GANP-トランスジェニッ ク （Tg)マウスを作製した （図 9 A及び B )。 GANP mRNA の発現の亢進は、 RT-PCRで確認した。
このマウスは、 B細胞で GANPの発現の増加を示し （図 9 C )、 骨髄、 脾臓及 びリンパ節の細胞の表層マーカー分析において、 B系細胞の通常の分化を示した。
SHM における GANP のインビポでの役割を調べるために、 TD-Ag である NP-CGの免疫後における VH186.2 領域について調べた。 すなわち、 GANP過剰 発現トランスジエニック （Tg) マウスに 50 ^i gの NP-CGを 2週間おきに 3回免 疫して、 VH186.2を PCRで増幅し、 体細胞突然変異を解析した。
結果を図 10 に示す。 変異の数は Tgでやや増加しているが、 高親和性を示す 33番目の Wが Lに変わる変異 (SHM)は、 Tgで約 3倍に増加していた。 なお、 CDRは相補鎖決定領域を示す。
VH186.2 口一カスは、 高親和性 IgG (ァ 1 λ 1)ΝΡ-応答について特有のパターン の SHMを示す。 NP-CGでの免疫後における全脾臓 Β細胞の配列分析により、 野生型マウスと比較して GANP-Tgマウスでは SHMの頻度が僅かに増加してい ることが示された (図 10)。
この変異は、ハプテン特異的 B細胞の親和性成熟に重要であることが以前に示 されている （Allen, D. et al" EMBO J. 1995-2001 (1988))。 実施例 3 ： B細胞特異的 GANP欠損マゥス (B-GANP+マゥス)の作製 (方法）
1. CD19-Cre/+GANP flox マウスの樹立
GANPゲノム DNAを用いて、 ェクソン IIの下流にネオマイシン耐性遺伝子 (neo) を挿入することによってターゲッティングベクターを調製した。 ΙοχΡ部 位は、 neoの 3 '側の隣接領域とェクソン I及び IIの間のィントロンに導入した。 つまり、ェクソン IIを ΙοχΡ配列で挿んだ floxマウスを作製し、これと CD 19 - Cre マウスとを交配させて、 B細胞で GANPが欠損するマウスを樹立した （図 11A 及び B)。
直線化した夕一ゲッティングベクターを TT2 ES 細胞 （Yagi, T. et al. Anal. Biochem. 214, 70-76 (1993)) にエレクトロポレーシヨンによりトランスフエク シヨンした。 G418で選択後、 ES コロニーを拾い上げ、 プロテナ一ゼ Kと一緒 にィンキュベートした。 相同組換え体を下記 neo2プライマー及び CGK3'-2ブラ イマ一によりスクリーニングした。
neo2 プライマー： 5，-GCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT_3， （配 列番号 9 )
CGK3'-2プライマー： 5，-GGCACCAAGCATGCACGGAGTACACAGA-3， （配 列番号 1 0 )
相同組み換えは、 BamHIで消化した ESクローンの DNAをプローブ Aを用い てサザンプロット分析することにより確認した。 4kbのバンドを示す 3個の陽性 クローンを用いて、 ICR胚盤胞へのマイクロインジェクションによりキメラ初代 マウスを作製した。 なお、 B細胞で GANPの発現が見られないことは、 サザンブ ロッテイング、 RT-PCRと細胞染色で確認した （図 11C、 D及び E)。
GANP flox/+マウスは少なくとも 10回、 C57BL/6マウスと戻し交配した。 B 細胞における GANP 遺伝子を欠失させるために、 GANP-floxed マウスと CD19-Cre ノックインマウス （Rickert, R. C, et al., Nucleic Acids Res. 25, 1317-1318 (1997)) とを交配した。
2. FACS分析
リンパ器官由来の単一細胞懸濁物を、 各ピオチン標識モノクローナル抗体によ り氷上で 1時間染色した。 染色バッファーで洗浄後、 細胞を FITC結合ストレブ トァビジン （Amersham Bioscience)及び PE結合モノクローナル抗体で 1時間ィ ンキュペートした。 リンパ細胞を、 CellQuest ソフトウェアを用いて FACScan (Becton Dickinson)により分析した。
3. B細胞の精製
脾臓細胞を Ci'e-flox/+マウス及び B-GANPチマウス (7から 8週齢） から単離し、 0.15 M 塩化アンモニゥム緩衝液で処理して赤血球を除いた。 プラスチック皿上 で 37°Cで 30分間ィンキュベーシヨンした後、 未接着細胞をリンパ球として回収 し、 T細胞を Dynabeads-anti-mouse Thyl.2 モノクロ一ナル抗体 (Dynal)を添付 のプロトコールに従って使用して除去した。 B細胞の純度 (90%以上)を FITC結 合抗 B220モノクローナル抗体 (BD Pharmingen)を用いた細胞表層染色により確 認した。
4.インビトロ増殖アツセィ
精製した B細胞を、 10%熱不働化 FCS(JRH Biosciences) ^ 2 mMの L-グルタ ミン及び 5 χ 10·5 Μの 2-メルカプトエタノールを含む RPMI-1640培地（分裂促 進剤を含むものと含まないもの） 中において、 96穴マイクロタイタープレートで 2 X 105 細胞/ゥエルで 48時間インキュベートした。 細胞を、 0.2 Ci/ゥエルの [3H]-チミジン (ICN)で 16時間パルスしてから回収し、取り込まれた放射活性をシ ンチレーシヨンカウンターで測定した。
分裂促進剤は、 ァフィ二ティー精製したャギ抗マウス 鎖特異的抗体 (10 g/ml)[F(ab')2] (ICN)、 ラット抗マウス CD40 モノクローナル抗体 (LB429; 10 g/ml)及び LPS(Sigma; 10 H g/ml)を用いた。
5.抗原及び免疫
TNP-KLH、 TNP-Ficoll 及び二ト口フエエル-二ヮトリアグロブリン (NP-CG) (23:1)は、 Biosearch Technologiesから購入した。 50 _1 gの TNP-KLH及び NP-CG (アルミニウムで沈殿）、 又は 25 の TNP-Ficoll (PBSに溶解） を Cre_flox/+ マウス及び B-GANP-/-マウスの腹腔内に注入した。
6.抗原特異的抗体産生の測定
抗原投与の 10 日後と 14 日後に、 免疫したマウスから血清を回収した。 5 g/ ゥエルの TNP-BSA (Biosearch Technology) を ELISAプレートに被覆した。 各 ゥエルを PBS中の 3% BSAでブッロキングし、 段階希釈した血清とィンキュベ ートした。 PBS-0.1% Tween 20で洗浄後、 ゥエルをピオチン結合 isotype特異的 モノクローナル抗体及びアル力リホスファターゼ (ALP)結合ストレブトアビジン (Southern Biotechnology)とともにインキュベートした。 発色は基質の存在下で 行った。
血清中の NP結合抗体の親和性を求めるために、 NP2結合抗体の NP25結合抗 体に対する割合を、 被覆抗原に NP2-BSA (1分子あたり 2個の NPが BSAに結 合したもの）及び NP25-BSA ( 1分子あたり 25個の NPが BSAに結合したもの） (Biosearch Technology)を用いたディフアレンシャル ELISAにより計算した。
7. 免疫組織化学
免疫したマウスからの の脾臓切片をアセトンで軽く固定した。 サンプル を PBS-Tween 20中の 3% BSAでブロックし、 抗 IgDモノクローナル抗体及び ALP-結合抗ラッ卜 IgG(ICN)抗体とともにインキュベートした。 第一の発色は Vector Blueキット（Vector)を用いて行った。 第二の発色は、 サンプルをピオチン 結合ピーナッツァグルチニン (PNA) (Vecor)及び西洋わさびペルォキシダ一ゼ結 合ストレプトアビジン (Kirkegaard & Perry)とともにインキュベートし、 次に 3，3'-ジァミノべンジジンテトラ塩酸塩 (Dojindo)とともにィンキュベートした。 PBS 中の 1%ダルタルアルデヒ ドを用いてサンプルを固定した後、 Aquatex(Merck)によりマウンティングを行った。 8. VH186.2 遺伝子の配列分析
NP-CG で免疫した Cre-flox/+及び B-GANPチマウスからの NP-結合
Figure imgf000043_0001
B 細胞を、 （4-ヒドロキシ -5-ョード -3-ニトロフエニル)ァセチル (NIP)を用いて FACS Vantage (Becton Dickinson Biosciences)で分画し、 プロテ ナーゼ Kと一緒に 37°Cでー晚インキュベートした。 ライセートを用いて、 PCR を既報の通り （Takahashi, Y.， et aL Immunity 14， 181.192 (2001)) 2回実施 した。 VH186.2 遺伝子 DNAを pBluescriptにライゲーシヨンし、 自動シークェ ンサ一により配列を決定した。 9.アポトーシス細胞の検出
Ci'e-flox/+及び B-GANP-/-マウスから精製した B細胞を 40時間、 種々の試薬 で刺激した (Watanabe, N. et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47， 541.547)。 AICD には、 24ゥエルプレートに抗 X抗体 (50 /i g/ml)を固定した。そのほかの場合には、 精製した B細胞を種々の刺激物質で 48時間刺激し、 続いて抗 Fasモノクローナ ル抗体 (Jo2;BD Pharmingen)で 4 時間インキュベートした（Wang, J. et al. (1996) J. Exp. Med. 184, 831-838)。 細胞を、 プロピジゥムアイォダイド (PI)溶液 (50 UL g/ml PI, 0.1% Triton Χ-100, 0.1% クェン酸ナトリゥム）を用い、 室温で 1 時間インキュベートし、 アポトーシス細胞 (％)を FACScanで G1以下領域として 計算した。 なお、 アポトーシス細胞は、 トリパンブルーによる染色後、 顕微鏡下 での確認も行った。
10. TUNELアツセィ
Cre-flox/+及び B-GANP- マウスを SRBC (ヒッジ赤血球細胞)で免役した後、そ れぞれの脾臓切片を調製し、 PBS中の 4%パラホルムアルデヒドで凍結切片を固 定した。 切片サンプルを、 MEBSTAIN Apoptosis Kit ll(MBL)で処理し、 PIで対 比染色した。 TdT媒介 dUTP-ピオチンニック-エンド標識 （TUNEL) アツセィと 共に行う実験用に、 切片は抗 IgGiモノクローナル抗体 (BD Pharmingen)及び Alexa546-結合ャギ抗ラット IgG抗体 (Molecular Probes)を用いた染色も行った。 陽性シグナルを検出し、 結果を蛍光顕微鏡 (BX51; Olympus)により確認した。
11.結果
(1) RNAプライマ一ゼ GANPの役割
RNAプライマーゼ GANPの役割を調べるために、 Cre-loxP システムを用いて CD19+ B細胞にして GANP遺伝子を欠失させた B-GANPチマウスを作製した (図 11A及び B)。 B-GANP^マウス遺伝子は、ェクソン IIをほとんど欠損していた（図 11C)。 B-GANP-/-細胞は GANP mRNAを発現せず (図 11D)、 また免疫染色によれ ばタンパク質をほとんど発現しなかった （図 11E)。 B-GANP-ζ·マウスは正常に成 育し、 骨髄、 脾臓、 胸腺、 リンパ節で正常な数のリンパ細胞を示した。 フローサ ィトメトリ一分析では、 B-GANP+は、 骨髄、 脾臓及びリンパ節の細胞上に、 対 照である Cre-flox/+マウスと同様の表面マーカープロフィールを示し（図 12)、 Cre-£lox/+ (対照） と差はなかった。
B-GANP のリンパ節では、 sIgMi。wsIgDhigh を発現する成熟 B細胞（IgM+IgD+) の数が減少していた。 B-GANP-マウス由来の B細胞は、インビトロで抗 抗体、 抗 抗体 +抗 CD40モノクローナル抗体、 またはリポ多糖による刺激後に通常の 増殖応答を示した （図 13： B-GANPチは白の棒、 Cre-flox/+は黒の棒）。 一方、 B-GANP マウス由来の B細胞は、 抗 CD40モノクローナル抗体 (5, 10 g/mL) による剌激後に増殖活性が低下した （図 13)。 このことは、 B-GANPチマウスの B 細胞の増殖では、 CD40/CD145相互作用への反応がわずかに損なわれていること を示す。 血清 Ig量は Cre-flox/+マウスと同様であった （図 14)。
(2) B-GANP+マウスにおける抗原特異的抗体産生
TI-Ag及び TD-Agによる免疫後の B-GANP マウスの免疫応答を調べた。 TI 抗原であるトリニト口フエニル (TNP)-Ficollを免疫して 14日後に、 抗 TNP抗体 価を ELISA で測定した。 その結果、 （TNP)-Ficoll は B-GANP マウス及び Cre-flox/+マウスにおいて同様の応答を誘導し、 特に差はなかった （図 15)。
胚中心（GC)形成を調べてみると、 TD-Ag である TNP-keyhole limpet hemocyanin (KLH)及び NP'CG などの TD_Ags に応答して、 変異体マウスは Cre-flox/+マウスと比べて遅延した GC形成を示した。
GC形成のピーク応答については、 Cre-flox/+は、 10 日目に GC_B細胞のマー カーであるピーナッツァグルチニンで染色された大きな成熟した GC を示した (図 16の矢印）。免疫後 10 日では B-GANP の方が GC形成がやや少なかった。 しかし、 14 日後では Cre-flox/+に比べて B-GANP の方が数が多くなつており、 20日後でも GC形成が遷延していた （図 16の矢印）。
B-GANP+マウスは 14日目に GCの明白な形成を示したので、抗原特異的抗体 応答を測定した （図 17)。 TD抗原である TNP-KLHによる免疫では、 B-GANP-/- マウスは 10 日目まで明確な GCを示さず、 抗体価はほとんど差がなかったが、 TNP-KLHによる免疫後の 14日目には、 B-GANP で GCの段階的な増加と拡大 を示した （図 17)。 変異体マウスは TNP-KLHに対して Cre-flox/+マウスと同様 の抗体応答を示した。
(3) B-GANP マウスにおける親和性成熟の障害
B-GANP マウスにおける GC の特徴 （抗体応答が低親和性であること） をさ らに調べるために、 抗原特異的 IgGl+ GC-B細胞を NP-CGによる免疫後に調べ た。
異なる分子量を有する NPのハプテン/タンパク質コンジュゲートを用いたディ ファレンシャル ELISAにより、 マルチハプテン NP25-BSAコンジユゲー卜に対 する応答と比較した。
B-GANPチマウスにおいて、 NP2-BSA コンジユゲー卜に対する抗体応答は、 NP-CG 免疫後 35 日目において低親和性 (13%)であった。 この値は、 Cre-flox/+ マウスの値 (42%)と比較して抗体反応は著しく減少していた （図 18)。
また、 図 19に示す通り、 NP-特異的 IgGlduiiCDSS w B細胞は B-GANP マウ スでは著しく減少した。 すなわち、 免疫後 10日目において、 Cre-flox/+マウスで は 1,164細胞/ 106細胞であるのに対し、 B-GANP-/-マウスでは 88細胞/ 106細胞で あった。 また、 14 日目においては、 Cre-flox/+が 879細胞に対し、 B-GANP- は 83細胞であった。 なお、 この傾向は 20日目も同様であった。
対照的に、 IgGlhighCD38high メモリー B細胞は減少しなかった。 これらの結果 は、 GANP の無発現変異は IgGlhighCD38i。w GC-B細胞段階で B細胞の分化に欠 陥を生じさせていることを示す。
B-GANPチマウスにおける抗体の親和性成熟の減少を確認するため、 NP-CGで 免疫した後の脾臓 B細胞の VH186.2領域の配列を調べた。
SHMは B細胞分化のこの段階で生じるため、 VH186.2 ローカスの SHMにつ いて各種の精製した B細胞を調べた。 なお、 VH186.2 ローカスは、 高親和性 IgG ( r Ι λ ΐ) NP-応答のために利用されている（Cumano, A. & Rajewsky, K. (1985) Eur. J. Immunol. 15, 512-520)。 IgM ローカスは Cre-flox/+と比較して差異がな かった。
次に、 Cre-flox/+又は B-GANP— /—に NP-CGを免疫し、 NP-結合 IgGi弱陽性 CD38弱陽性を示す GC-B細胞 （Ag-結合 IgGi B細胞） についてソーティングし た （図 19)。 また、 ソーティング後の細胞からゲノム DNA を抽出し、 VH186.2 を PCRで増幅し、 シークェンス解析を行い、 VH186.2 の配列を比較した （図 20 A〜L )。図 20A〜Fは Cre-flox/+の VH186.2 の配列を、図 20G〜Lは B-GANP-/- の VH186.2 の配列を比較したものである。
B-GANP マウスにおいて、 IgV領域配列の全体の変異は 14 X 10-3であり、 Cre-flox/+マウス (21 X 10-3)と比較して変異の数が減少していた（図 21)。さらに、 W33から への高親和性型の変異 （33番目のァミノ酸残基トリブトファンから リシンへの変異、 C57BL/6 マウスで顕著に見られる） は 13%(2/15 V領域） であ り、 変異型マウスでは、 Cre-flox/+マウスの値 (71%， 10/14 V領域）と比較してよ り顕著に減少し、 親和性は 1/3に低下した （図 22)。
以上の結果より、 GANPは抗体の親和性の成熟に必須であることが示された。
(4) B-GANP+マウス B細胞におけるアポトーシスからの保護機能 B-GANPチマウスにおいて、 高親和性抗体の産生が減少するのは、 抗原剌激後 の B細胞が不安定であるためであると考えられる。 そこで、 B細胞の感受性を調 ベるため、 in vitroでの B細胞のアポトーシスを検討した。
正常な B細胞は、 強力に架橋した B細胞抗原受容体により活性化誘導細胞死 (AICD)が誘導され、 AICD は、 CD40 の刺激によって阻止された。 B-GANPチ B 細胞では、 AICDの刺激に対する感受性は正常 B細胞 （対照） と同程度であった が、 抗 CD40を介するアポト一シスの抑制の程度については、 Cre-flox/+対照 B 細胞よりも劣っていた （図 23)。 このことは、 B-GANP マウスは、 GC形成期の 間、 抗原反応性 B細胞の保護機能に欠けることを示す。
GC では、 抗原刺激された B 細胞と CD40/CD154 との相互作用によって Fas/CD95 の表面発現が誘導され、 Fas誘導性アポト一シスに感受性を持つよう になる。そこで、 本発明者は、 ώ りにおいてアポト一シスを誘導する抗 CD95 刺激に対する B-GANP+B細胞の感受性を測定した。
まず、脾臓 Β細胞を抗 CD40モノクローナル抗体 (LB429)、抗 抗体 +抗 CD40 モノクローナル抗体、 IL-4+抗 CD40モノクローナル抗体、 及び抗 抗体 + IL-4+ 抗 CD40モノクローナル抗体で 48時間刺激し、 次に抗 CD95モノクローナル抗 体を培地に添加した。
その結果、 B-GANP マウスの B細胞のアポトーシス応答は、 Cre-flox/+マウ スの B細胞の応答と同様であり、 B-GANP+マウス及び Cre-flox/+マウスでは差 がなかった （図 24)。
上記の通り、 抗 CD40(LB429)処理後に抗 CD95で刺激しても、 発現誘導は、 B-GANP マウス及び Cre-flox/+マウスでは差がなかった。 このことは、 B-GANP マウスの B細胞においては、 in vivoで GC.B細胞により通常受ける アポトーシス刺激に対して感受性を有することを示す。 そこで、 TUNELアツセ ィを、 TD-Agとして SRBCを用いて免疫した後の組織切片について行った。 その結果、 TUNEL陽性細胞は、 B-GANP マウスの GC領域において増加し ており、 ほとんどの細胞は、 IgGlを発現することも示された （図 25、 26)。 これ らの結果は、 B-GANP マウスのアポトーシス細胞は、 ほとんどが GC-B細胞で あることが示された (図 25、 26)
次に、種々の悪性リンパ腫細胞及び正常 B細胞の CD40媒介性アポトーシス抑 制に必要な分子であると認識されている Bcl-2ファミリ一メンバーの RNA発現 を検討した。
抗 抗体 + IL-4で刺激すると、 Cre-flox/+ B細胞における bcl-2の転写の明ら かな増加を誘導し、 抗 CD40 mAb はその発現をさらにアップレギュレートした (図 27)。 また、 B-GANP-/- B細胞については、 抗 抗体による bcl-2転写物と同 様のアップレギュレーションを示したが、 抗 CD40 mAb (抗 CD40 mAb単独又は 抗 Ab + IL-4 + 抗 CD40 mAb)に対する応答は、 Cre-flox/+の B細胞ほど高くは なかった (図 27)。すなわち、アポト一シス抑制に関与する Bel- 2ファミリーの RNA 発現レベルは、抗 CD40抗体で刺激したときの B-GANP マウス B細胞において、 対照よりも低下していた （図 27)。
変異 B細胞中の c -; &、 み ax及び bai/については、 Cre-flox/+ B細胞のレベル と同程度であった (図 27)。
以上の結果は、 GANPは、 GC-B細胞において CD-40を介した Bcl-2の誘導に 関する情報伝達を制御しており、 in WTOでの高親和性 BCR+ B細胞の生存に大き く寄与していることを示す。
(5) まとめ
B-GANP マウス及び GANP-Tg マウスの結果は、 GANPが TD-Agによる免 疫後における高親和性 B細胞の生成に関与していることを実証している。 GANP の役割としては、 GC-B細胞で DNAポリメラーゼの効率的なリクルートと調節 を仲介している可能性がある。 V-領域 SHMを有する GC-B細胞が高親和性 BCR を取得すると、それらは選択されるべきであり、そしてさらに B細胞の V領域の SHM は抑制されて、 インビポで高親和性抗体の産生が保証されるはずである。 GC-B細胞での AIDの発現は DNA変異を絶えず生成する可能性があるため、 AID 活性の調節が B細胞での高親和性 BCRを維持するために必要であるかもしれな レ^ B-GANP マウスでの結果から、 GANPが SHMプロセスに必要であること が示される。 実施例 4 ： GANP 卜ランスジエニックマウスを用いた高親和性抗体の産生
1 . ディファレンシャル ELISAによる抗体価の比較
野生型 (WT)マウスと GANP トランスジエニック（Tg)マウスの 2匹ずつに NP-CG 100 gを免疫し、 28 日後の血清を取り、 ELISAを行った。 20 g/ml の NP2-BSAと NP17-BSAを ELISAプレートに 4 °Cで 1晚コーティングした。 3% BSA/PBS-0.1% T een20で 1時間ブロックし、血清を 1時間反応させた。 PBS-0.1%Tween20 で 3回洗い、 ピオチン標識抗マウス IgGi抗体 (Southern Biotechnology)で 1時間反応させた。 PBS_0.1%Tween20で 3回洗い、 アルカリ ホスファターゼ標識ストレプトアビジン (Southern Biotechnology)で 30 分反応 させた。 PBS-0.1%Tween20で 3回、 TBSで 1回洗い、 p-Nitrophenyl phosphate を基質として発色させた。 吸光度を 405nmで測定した。
結果を図 28に示す。 図 28の結果から、 GANP トランスジエニックマウスを使 用することにより高親和性抗体が産生されることが分かる。
2 . ELISA及び Biacoreを用いた抗原-抗体結合親和性解析
野生型 (WT)マウスと GANP トランスジエニック（Tg)マウスに、 免疫抗原とし て NP-CGを免疫し、 それぞれのマウスを用いて細胞融合を行い、 得られた陽性 ハイブリドーマの培養上清において、 ELISA法及び Biacoreを用いて抗原と反応 する抗体の結合曲線を得た。得られた結合曲線から、 Tgマウスの有用性を導いた。
( 1 ) 材料
( a ) 動物
野生型 （WT) マウスと GANP トランスジエニック （Tg) マウス。
( b ) 抗体及び試薬
NP16-CG (—分子あたり 1 6個の NPが CGニヮトリィムノグロプリンに結合 したもの）、 NP2-BSA (一分子あたり 2個の NPが BSA (牛血清アルブミン） に 結合したもの）、 NP17-BSA (—分子あたり 1 7個の NPが BSAに結合したもの）、 HRP標識抗マウス IgG、 IgA及び IgMを用いた。 ( 2 ) 方法及び結果
野生型 （WT) マウスと GANP トランスジエニック （Tg) マウスの各 5匹に、 免疫抗原として NP16-CGを、 2週間をおきに 3回免疫し、 3回免疫後に採血し、 抗血清を用いて抗体価の比較をしたところ、 前記 1項に記載の結果と同様に GANP-Tgマウスの有用性が確認された。
この中から、 力価の高いマウスの脾細胞を用いて、 P3U1 ミエローマ細胞と細 胞融合を実施し、 GANP-Tg マウスの脾細胞数 (6.0x10?個）、 WT の脾細胞数 (4.8x107)に基づき、 1x105/ゥエルになるようにまきこみ、 GANP-Tgマウス由来 の細胞は 600クローン、 WTマウス由来の細胞は 480クローンを HAT培地にて 培養した。
HAT培養 9日後の培養上清を用いて、 NP2-BSA ( 1 g/mL) を固相化抗原 として ELISA法を実施した。 GANP-Tgマウスおよび WTマウスの培養上清のそ れぞれから、 ELISA吸光度結果において高親和性抗体の産生を示す上位 2.5%の クローンを選出し、 HT培地にてクローニングを実施した。
HT培養 9日後の培養上清を用いて、 NP2-BSA ( 1 n gXmL) を固相化抗原と して ELISA法を実施した結果、 GANP-Tgは 6クローン（クローン名： G2-6, G2-9, G2-12, G2-14, G2-15, G2_16)、 WTは 1クローン (クローン名： W2-7) のハイ プリドーマを樹立した。
GANP-Tgマウス、 WTマウスのそれぞれのクローンを RPMI培地にて培養し、 以下の実験に用いるのに適した培養上清を l m Lずつ確保した。 この培養上清を 用いて、 以下の評価検討を実施した。
( a ) ELISA法
抗体価を評価するにあたり、 抗原の性質の異なるもの、 いわゆる、 CG —分子 あたり NP含有率の異なる物質を用いて、 その ELISA反応性の比率をもって評 価した。
本法は、 NP の親和性を測るのに有用な測定法であり、 簡便で多くの検査をす ることができるので、 一次スクリーニングとして適当で信頼できるものである。 まず、 NP2-BSA ( l g/mL) と NP17-BSA ( 1 g/mL) をそれぞれ固相 化抗原として用い、 4 °Cで一晩固相化した。 固相化プレートを PBS-Tween20で 洗浄した後、 スキムミルク PBS-Tween20にてブロッキングを実施した。 さらに プレートを PBS-Tween20で洗浄した後、 GANP-Tgマウスの 6クロ一ン （クロ ーン名： G2-6, G2-9, G2-12, G2-14, G2-15, G2-16) 及び WTマウスの 1クロ一 ン （クローン名： W2-7) の; PMI培養上清 （原液〜 2 5 6倍希釈液） を用いて、 室温で 1時間固相化抗原と反応させた。 次に、 プレートを PBS-Tween20で洗浄 した後、 HRP標識抗マウス IgG、 IgA及び IgMを室温で 1時間反応させた。 さ らに、プレートを PBS-Tween20で洗浄した後、オルトフエ二レンジァミン（OPD) にて 5分間発色し、 2 N硫酸を用いて反応を停止した。
吸光度は、 ELISA READERを用いて、 490nmにて測定した。
ELISAの結果を図 29に示す。 図 29の結果より GANP-Tgマウスを使用する ことにより、 高親和性抗体が産生されることがわかる。
( ) Biacoreを用いた高親和性解析
上記 ELISA の結果で、 一番親和性の高いと予想されるクローンについて、 Biacoreを用いて物理化学的結合能を調べた。
Biacoreによる解析は、 NP2-BSA ( 1 μ g/mL) をリガンドとして Biacoreチ ップに結合させたものに、 アナライト溶液として一番親和性の高いと思われる Tg(G2-9)、一番低いと思われる Tg(G2-15)、及ぴ WT(W2-7)の 3クローンの RPMI 培養上清を用いて、 それぞれの結合速度定数 (k ass)、解離速度定数 (k diss)、及び 親和性の指標となる解離定数 KD (KD=k diss/k ass)を算出した。 KDが小さい 程、 親和性は高いと評価される。
その結果として、 G2-9 (ELISA: 82.9% NP2/NP17比） のビアコアのパターン を図 30に示す。 図 30に示す曲線 (a)〜(e)は、 抗体濃度がそれぞれ 26.6、 13.3、 6.65、 3.33及び 1.66 nMのものである。上記結果から、結合速度定数 (k ass)=1.48 X 105、解離速度定数 (k diss)=9.63 X 10-4、そして親和性の指標となる解離定数は、 KD (KD=k diss/k ass)=6.50 X 10'9となつた。
一方、 ELISA の結果から比較的親和性の低いと予想される G2-15 (ELISA: 33.9% NP2/NP17比）のビアコアのパターンを図 31に示す。図 31に示す曲線 (a) 〜(e)は、抗体濃度がそれぞれ 23.0、 11.5、 5.75、 2.88及ぴ 1.44nMのものである。 結合速度定数 (k ass)=5.33 X l04、 解離速度定数 (k diss)=1.56 Χ 10·2、 そして親 和性の指標となる解離定数は、 KD (KD=k diss/k ass)=2.92 X 10-7となつた。 こ の値は、 ELISA法でも同等の親和性を示す W2-7 (ELISA: 31.6% NP2/NP17比） の活性を持つ KD値 =1.67 X 10-7と近似していた。
以上をもって、 GANP トランスジエニック（Tg)マウスを使用することにより、 高親和性抗体が産生されることが明らかである。 実施例 5 ： GANPと MCM3の会合、 細胞周期中の核 細胞質間の移動 1 . 概要
本実施例では、 本発明者は部分切断型の変異体 GANP を用いることによって GANPの MCM3結合領域を決定し、 GANP特異的な領域における 502番目のァ ミノ酸のリン酸化セリン (pSer5o2)に対する特異的なモノクローナル抗体を用いて NIH-3T3細胞における GANPの局在を特徴づけた。
プライマーゼと MCMとの結合は、 一つの連動した機能であり、 両者が結合し た分子複合体は DNAを二重鎖から解く作用を有する。 従って、 GANP部分断片 が MCMと結合すれば、 当該 GANP断片もプライマ一ゼ活性を発揮し、高親和性 抗体の産生作用を有するものと考えられる。
そこで、 GANP及びその部分断片、 Map80及び MCM3の核/細胞質区画の局 在を、 cDNAトランスフエクシヨンと細胞融合実験を用いて解析した。
得られたデータから、 GANPは MCM3と結合することが示され、さらに、 GANP の局在は MCM3 の発現によって影響されることが示された。 GANP は Map80 の結合機序とは異なる結合機序によって MCM3 と会合する。 これらの結果は、 MCM3に結合した GANPは、 Map80/MCM3APの機能とは異なる独特の機能を 介することを示す。 2 . 材料および方法
2. 1.細胞および細胞培養
NIH-3T3. COS7、 Helaおよび Swiss'3T3細胞を、 10%熱不活化 FCS (大日 本製薬）、 2 mM L-グルタミン (Biowhittaker)、 100 g/mlストレプトマイシン、 100 U/mlぺニシリン及び 50 ίΐ Μ 2-メルカプトエタノールを補充した D-MEM 培地 (Invitrogen)中で、 37°Cで、 5% CO2のもとで維持した （Takei, Y. et al., (1998) J. Biol. Chem, 273, 22177-22180、 Sakaguchi, N. et al" (1988) EMBO J. 7,
3457-3464、 Kimura, H. et al., (1995) Nucl. Acids Res. 23, 2097-2104)。 BAL17は RPMI-1640培地 (Invitrogen)中で培養した。 2.2.リン酸化 GANPおよび MCM3の細胞内局在化
NIH-3T3を PBS (pH 7.4)中で 3.7%パラホルムアルデヒドで 5分間固定し、 0.2% Triton Χ-100を用いて透過性とした (Kimura, H. et al.，（1994) EMBO J. 13, 4311-4320)。ラット抗 pSer502 GANPモノクローナル抗体（Kuwahara, K. et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283) 及びゥサギ抗 MCM3 抗体 Kimura, H. et al" (1994) EMBO J. 13, 4311-4320を一次抗体として使用し た。 次に二次抗体として、 GANPに対しては Alexa488結合ャギ抗ラット IgG抗 体 (Molecular Probes)を使用し、 MCM3に対しては Alexa546結合ャギ抗ゥサギ IgG抗体 (Molecular Probes)を使用して、 ョゥ化 TOTO-3 (Molecular Probes)で 対比染色し、 そして共焦点レーザー顕微鏡 (FV500; ォリンパス）によって観察し た。
2.3.発現のための cDNA構築物
pSR -MCM3-HAは文献に記載されている（Kimura， H. et al., (1995) Nucl. Acids Res. 23, 2097-2104) SV40 T-Ag の 3 つの核局在化シグナル (NLS)を担持する pECFP-Nucベクタ一は Clontechより購入した。 下記の組み合わせの 3'及び 5' プライマーを用いて得た PCR断片を pGEX-4T-l (Amersham)に導入し、 それら を用いて異なる形のマウス cDNA をダルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST)との融合タンパク質として調製した。
GANP 1-5' 5'-GGGGATCCATACCCGG TGAACCCCTT-3' (配列番号 1 1 ) GANP 1-3' 5'-GGGTCGACGCGCACAGACTTTCCCCTGA-3' (配列番号 1 2 ) GANP2-5' 5'-GGGAATTCTCCCGCCTTCCAGCTGTGAC-3' (配列番号 1 3 ) GANP2-3' 5'-GGGTCGACGTGCTGCTGTGTTATGTCCT-3' (配列番号 1 4 ) GANP3-5' 5' - GGGAATTC C ATGAG CT GAGACCCTCAGC-3' (配列番号 1 5 ) GANP3-3' 5'-GGGTCGACTGAGGATGCAGGAGGCGGCT -3' (配列番号 1 6 ) GANP4-5' 5'-GGGAATTCTACGTTGGAGAGAGCCTGGC-3' (配列番号 1 7 ) GANP4-3' 5'-GGGTCGACCATGCTGTCATCTCCTGTGA-3' (配列番号 1 8 ) GANP5-5'： 5'-GGGAATTCGAGAA CCTGGCCAAGGGTCT-3' (配列番号 1 9 ) GANP5-3'： 5'-GGGTCGACGAAAAACCGACGGCTGAACT-3' (配列番号 2 0 ) GANP6-5'： 5'-GGGAATTCAAGCCCTTCCAGCCTGCCCT-3' (配列番号 2 1 ) GANP6-3'： 5'-GGGTCGACCGAGGGAACGTGGTATTTTC-3' (配列番号 2 2 ) GANP7-5'： 5'-GGCCCGGGCC CGTGGGATGACATCATCA-3' (配列番号 2 3 ) GANP7-3'： 5'-GGCTCGAGCATGTCCACCATCTC CAGCA-3' (配列番号 2 4 ) cDNA構築物は、 PCR断片を pSVEGFP pAに導入することにより緑色蛍光夕 ンパク質 (GFP)をタグした Ganp 変異体として調製した （Kuwata, N. et al., (1999) J. Immunol. 163, 6355-6359)。次に、 これらの構築物を pCXN2哺乳動物 発現ベクター中に導入した （Niwa, H. et al., (1991) Gene 108， 193-200)。 プラ イマ一配列は、 Ganpをコードするように下記の通り設計した。
Gp-gfp- '：
5'-GGGGATCCGAATTCCACCATGGCAGTCTTCAAACCGATA CC-3' (配列番 号 2 5 )
Gp-gfp-3'：
5'-GCAGGGGCTCCTCCTGATCT-3' (配列番号 2 6 )
Gsac'gip-ら, ：
5'-GGGGATC CGAATTCCACCATGTCCGAGGGCCTTGGTTCTTG-3' (配列 番号 2 7 )
Gsac-gfp-3'：
5'-CTGTCTT GTTTCTAAGCCGC-3' (配列番号 2 8 )
Gmap80-gip-5'：
5'-GGGGATCCGAATTCCACCATGGAGA ACCTGGCCAAGGGTCT-3' (配列 番号 2 9 )
Gmap80-gfp-3'：
5'-GAGGACTTGTAGATGTTTTCAC CATGG-3' (配列番号 3 0 )
FLAG をタグした Ganp変異体については、 以下のプライマーを用いて PCR により得た cDNA断片を pCXN2に導入した。 ： FLAG-Gp-S：
5'-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGG
CAGTCTTCAA CCGATACC-3' (配列番号 3 1 )
FLAG-Gp-3'：
5'-GGGAATTCCTCCGGGTCTCCCTCAAGTA-3' (配列番号 3 2 )
FLAG-Gsac^：
TTGGTTCTTG-3' (配列番号 3 3 )
FLAGGsac-S' ：
5'-GGGAATTCGCTGTCTTGTTTCTAAGCCG-3' (配列番号 3 4 )
FLAG-Gmap- '：
5'-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGG
AGAACCTGGCCAAGGGTCT-3' (配列番号 3 5 )
FLAG-Gmap-3'：
5'-GGGAATTCTGAGGACTTG TAGATGTTTT-3' (配列番号 3 6 )
内部欠失変異体 GpANLS-GFPおよび 13変異体 (MCMANLS-HA) は、 文献に 記述されているように調製した （Imai, Y. et al., (1991) Nucl. Acids Res. 19, 2785-2785)。全ての構築物は、ヌクレオチド配列の決定により配向が正しいこと、 およびタグを付けた融合タンパク質としてコドンの読み枠が正しいことを確認し、 品質を管理した。 変異体 RNA/DNAプライマーゼドメイン (PD) を有する発現べ クタ一は文献に記載されている（Ser502から Ala [GpS502A]又は Glu [GpS502E] までの Gp変異体） (Kuwahara, K. et al., (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283) 2，4.導入した遺伝子産物の共焦点顕微鏡検査による検出
F GENE 6 (Roche Diagnostics)を用いて、 pCXN2- w および Zまたは pSR a -MCM3-HAによって ΝΙΗ-3Τ3をトランスフエクトした。 固定化の 16時 間前にレプトマイシン B (LMB; (Kudo, N. et al" (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9112-9117) )を培養培地に添加した。 共トランスフエクシヨンの場合に はゥサギ抗 HA抗体 （Santa Cruz)および Alexa546結合ャギ抗ゥサギ IgG 抗体 を用いて、 そして単独トランスフエクシヨンの場合には Alexa488結合ャギ抗ゥ サギ IgG抗体 （Molecular Probes)を用いて、外因性 MCM3タンパク質を染色し た。 核酸は、 共トランスフエクシヨン実験についてはヨウ化 TOTO-3 を用いて、 単独トランスフエクション実験についてはヨウ化プロビジゥム (PI; Sigma)を用 いて対比染色した。
2.5.GSTプルダウンアツセィ
GST融合タンパク質を文献に記述されているように精製した （Kuwahara, K. et al.， (2000) Blood 95, 2321-2328 )。 グルタチオン -Sepharose ビ一ズ (Amersham)に固定した種々の GST融合タンパク質 (5 H g)を、 TNEバッファー (10 mM Tris-HCl [pH 7.8〗、 150 mM NaCL 1 mM EDTA、 1% Nonidet P'40、 10 li gァプロチニン、 1 mM フエニルメチル-スルフォニルフルオリド [PMSF]) を用いて調製した BAL17溶解物と共にインキュベートした。 結合タンパク質を 8% SDS-PAGEによって分離し、 ニトロセルロースフィルタ一に転写し、 ブロッ クした。次にゥサギ抗マウス MCM3抗体（Kimura, H. et al.，（1994) EMBO J. 13, 4311-4320) 及びペルォキシダーゼ標識プロテイン A (Amersham)と共に連続的 にインキュベートし、最後に ECL検出キット (Amersham)を用いてシグナルを可 視化した。 直接結合アツセィのためには、 [35S-メチォニン] (Amersham)を用い て、 in vitro転写および翻訳結合システム (Novagen)を製造者の説明書に従って使 用して放射性標識化 MCM3を合成し、 [35S]-標識 MCM3をォートラジオグラフ ィ一で検出した。 2.6.導入した遺伝子産物の免疫沈降およびウエスタンプロッティング
FuGENE 6を用いて、 pCXN2- ¾ ^および/または pSR a -ikiCM5-H4 によって COS7をトランスフエクトした。 26時間後、 TNEバッファーを用いて 細胞を溶解し、 得られた溶解物をプロテイン A-Sepharose (Amersham)と組み合 わせた抗 HA抗体と共にィンキュベートした。免疫沈降物を 8% SDS-PAGEによ つて分離し、 ニトロセルロースフィルターに転写し、 プロットをブロックし、 マ ウス抗 FLAG M2抗体 (Stratagene)と共にインキュベートし、 次にペルォキシダ ーゼ標識ャギ抗マウス IgG (H+L)抗体 (Zymed) と共にインキュベートした。 Gp-GFPおよびその変異体の検出のためには、 ブロッテイングしたフィルターを ゥサギ抗 GFP 抗体（Santa Cruz)およびペルォキシダーゼ結合プロテイン A(Zymed)により釣り上げた。
FuGENE 6を用いて、 pSRひ _ kfCM?-H によって Hela細胞をトランスフエ クトした。 20時間後、 トランスフエクトした HeLa細胞およびトランスフエクト していないマウス Swiss-3T3細胞をトリプシン処理し、 1 ： 1の比で共に培養皿 に播いた。 24時間後、 ポリエチレングリコール 1500 (Roche diagnostics)を室温 で 2分間用いて細胞を融合させた (Sc midt-Zachmann, M.S. et al" (1993) Cell 74， 493-504)。 培養皿を培地で 4回洗浄した後、 シクロへキシミド含有培地を添 加し (最終濃度 20 ϋ g/ml) , 細胞を C02インキュベータ一中で 37°Cで 5時間ィ ンキュペートした。次に、 250 mM HEPES-NaOH (pH 7.4)中で 4%パラホルムァ ルデヒドを用いて細胞を 20分間固定し、 PBS中で 0.5% Triton Χ-100を 30分間 用いて透過性とし、 PBS で洗浄した。 抗 ΗΑ 抗体 (12CA5; Covence Research Products)および Cy3結合ロバ抗マウス Ig抗体 (Jackson)を用いて細胞を染色し た。 また、 PBS中で 100 ng/ml Hoechst 33342 (Sigma)を用いて DNAを 20分間 対比染色した。 lOOx PlanNeofluar位相差対物レンズ （NA 1.3) および Spotll CCDを備えた Zeiss Axioplanを用いて画像を集めた。 3 . 結果および考察
3.1.GANPと MCM3の会合
これまでに、 B細胞系統における GANPと MCM3の相互作用が、 共免疫沈降に よって実証されている （Kuwahara, K. et al., (2000) Blood 95, 2321-2328)。 GANPの C末端領域は全 Map80タンパク質と同一であるため、 GANPは同一領域 で MCM3と会合すると予想される。 本発明者は、 どの領域が MCM3と直接会合す るのかを決定するため、 図 32に示す種々の末端切断型 GANPを有する GST融合夕 ンパク質を用いてプルダウンアツセィを実施した。 GSTを図 32に示される 1から 7 及び 5-7，と称した切断型 GANPの N末端に融合した。 図 33の下のパネルにおいて、 GANP5-7'と称する Map80領域は、 以前に示されたように （Kimura, H. et al., (1994) EMBO J. 13, 4311-4320)、 細胞抽出物から MCM3をプルダウンした。 驚くべきことに、 GANPの部分断片である GANP 1および GANP2もまた MCM3 をプルダウンした (図 33；上および下パネル）。
次に、 網状赤血球溶解物系により、 in vitroで合成した MCM3を用いてこの結 合を調べた （図 34)。 GST-GANP1 および GST-GANP2 もまた in vitro翻訳カク テルから [35S]-MCM3 をプルダウンした。
GST単独を用いた陰性対照 （最初のレーン）、 又は、 無関係なタンパク質と融 合した GSTは、シグナルを示さなかった。そして、 GST-GANP1との結合は Map80 領域 （GST-GANP5-7')との結合よりも強かった。 この結合は、 FLAGをタグした 構築物を用いた DNAトランスフエクション実験により細胞においても確認され た （図 35)。
COS7細胞を pSR -MCM3-HA又は pSRa- ?-^^と組み合わせて、 VCXm-FLAG-Ganp, pCXNS- ^Z^G-i^及び pCXNS- ^MG-G^ <Wによつて共 トランスフエクトした。 抗 HA抗体を用いた免疫沈降の後、 抗 FLAGモノクロ一ナ ル抗体でウエスタンブロットを行った。 FLAG標識タンパク質の予想サイズを、 それぞれのレーンにおいて三角で示す。 左及び右のパネルは、 バンドの移動度 (migration) が同様であるが、 ECL検出の露光時間は左のパネルが 1分、 及び 右のパネルは 3分である （図 35)。
FLAG-Ganp, FLAG-Gp および FLAG_Gmap80は野生型 MCM3-HA (HAェピ ト一プをタグした MCM3)と結合した （図 35; 左パネル）。 FLAG-Gsac のみが結 合しなかった。 13 変異体 MCM3 (MCM3 Δ NLS)との結合に関しては、 FLAG-Gmap80 のみが陽性の結果を示した （図 35;右パネル）。 N末端 NLSを担持 する Gp領域は、 大量の MCM3を有する細胞において一貫して MCM3と会合して いる（図 35 ;左パネル）。 これらの結果は、 GANPが Gp領域を介して MCM3の NLS 領域と会合していることを示している。 本発明者はさらに、 Gp領域の Ser5o2のリン酸化の状態が MCM3との結合に影響 するかどうかを検討した。 プライマ一ゼ部位を欠損した Ganp変異体 (GanpAPD-GFP),及び GanpS502A又は GanpS502Eとして調製される Ser502にお ける Ganp変異体を、 GFPと融合した （図 36A)。 細胞を ρΟΧΝ2
Figure imgf000060_0001
Q! - kfO 9- ¾ によって共トランスフエク卜し、 溶解液は抗 HA抗体を用いた免疫 沈降に用いた。
GE シグナルは抗 GFP抗体で検出され（図 36B;上パネル）、 このことは、 GANP が MCMに結合したことを意味する。
Ganp-GFP変異体との共トランスフエクシヨンも同様に行った。 それぞれの夕 ンパク質の予想位置を決定するために、 溶解液を SDS-PAGE上で分離し、 同じよ うに抗 GFP抗体でプロットした （図 36B;下パネル）。
非リン酸化性の変異体 (GanpS502A-GFP)は、 野生型 Ganp-GFPまたはホスホ セリンに良く似た変異体 (GanpS502E-GFP)と同じく MCM3と結合した（図 36B; 上パネル)。 興味深いことに、 GanpAPD-GFP は MCM3-HAと共沈降しない （図 36B; 上パネル)。
GANP分子全体としては、 Map80領域の潜在的結合活性に関わりなく、 MCM3 との結合には RNAプライマーゼ領域 （PD)が必要である。 白抜き三角は GanpA PD-GFPの位置を示す。 Ganp S502A-GFP および Ganp S502E-GFPのサイズと 等しい Ganp-GFPのサイズを黒三角で示す (図 36B;下パネル)。 これらの結果は、 GANPの MCM3との結合はその PD領域を介するが、 Ser502 部位におけるリン酸 化はこの結合に影響しないことを示している。
末端切断型構築物を用いた実験によって GANPと MCM3との会合が広い領域 にわたつて示されたが、 GANPの N末端の 600個のアミノ酸領域が関与する全 GANPとの結合には MCM3の NLSが必要とされる。 NLSを欠く MCM3変異体 は、細胞中で全 GANP分子と効果的に会合できなかった。 Map80領域は NLS陰 性 MCM3と結合し、 このことは GANPの MCM3との結合が主として Map80と の相互作用に必要とされる領域以外との結合であることを示している。 Map80 は MCM3インポート因子であると考えられているが、 GANPは MCM3と共同し て異なる役割を果たすのかもしれない。 GANPは可能性のあるリン酸化部位を多 数有し、そして細胞中に多くの会合成分をもつように思われる（Kuwahara, K. et al.， (2000) Blood 95, 2321-2328)。 したがって、 その領域のリン酸化の状態が GANP/MCM3 会合および細胞質と核コンパートメント間の輸送の調節に影響を 及ぼす領域を特定することが必要であろう。
3.2.トランスフエクションによって示される Map80および Ganp変異体の細胞内 局在化
GANPは 2つの可能性のある NLSを有する。 1つは N末端プライマ一ゼ領域内に あり、 もう 1つは C末端 Map80領域内にある。 また、 GANPは 2つの核輸出シグナ ル (NES)様モチーフを有する。 1つは SAC3相同領域と Map80領域との間にあり、 もう 1つは Map80領域内にある。
NIH-3T3細胞を p CXN2- (¾i¾t φ又は pCXN2- (¾2aj^ひ φによつてトランス フエクトし、 48時間後に固定した。 LMBを、 固定の 16時間前に添加した。 核を PIで前染色し、 共焦点顕微鏡を用いて画像を集積した。 代表的な発現特性を図 37 に示す。 異なる特性を持つ細胞数を計数し、 パーセントとして表した （図 37)。
Ganp -GFP (GFPでタグしたほぼ全長 GANP) は、 核優性発現 (Nおよび N>C; 38%)又は細胞質優性発現 (Cおよび ON; 31%)を示す細胞の割合に変動はあった が （合計 500個の細胞から任意に計算された数の％)、 細胞質および核コンパ一卜 メントの両方に存在することが見いだされた （図 37; Ganp-GFP, LMB -)。対照的 に、 Gmap80-GFP は殆ど細胞質に見出され、 発明者の分類による核優性発現は 示さなかった （N>C, 0%； N=C， 35%； C and C>N, 65%) (図 37; Gmap80-GFP, LMB -)。 Ganp-GFPの局在化は、 Gmap80_GFPの局在化とは異なる。
N末端 NLSモチーフが機能性であるかどうかを確かめるため、 RNA/DNAプ ライマーゼドメインおよび N末端 NLSを担持する （ただし NES様モチーフは含 まない） 5' 1-kb DNA断片を GFPと融合させた （図 38, Gp-GFP)Dこの Gp-GFP 産物は 核にのみ存在したが （Nおよび N>C， 94%) (図 38)、 NLS を欠く変異体 Gp-GFP (GpANLS-GFP; 図 38に示すようにアミノ酸 497から 500が欠失して いる）は細胞質性であることを示し、 N末端 NLSが核局在化に関与していること が確認された。
本発明者は、隣接する Ser502 のァラニンへの突然変異 (GpS502A-GFP;非リン 酸化型） 又はグルタミン酸への突然変異 (GpS502E-GFP; ホスホセリンを模倣す る型)がこの局在化に影響を及ぼすかどうかを検討した （図 38)。 そして、 本発明 者は、 これらの突然変異が Gp の局在化を変えないことを観察した。 これは、 N 末端 NLSが Ser5o2 のリン酸化状態に関わりなく機能性であることを示唆してい る （図 38)。 対照的に、 N末端 NLSも C末端 NLSも持たない Gac-GFPは、 殆 どが細胞質中に存在するように思われる（N及び N>C, 0%； N=C, 3%； C及び ON, 97%) (図 38)。
これらの結果は、 N末端 NLSが Ganpの核への移入に機能的な役割を有する ことを示唆している。 しかし、 NLSは GANP発現を核内に維持するほど強くは ないのかもしれない。 なぜなら、 Ganp-GFPは細胞質中にも存在するからである (図 37)。 この問題をさらに検討するため、 Crnil によって媒介される核への輸 出を抑制するため、 cDNA トランスフエクシヨン後、 細胞をレブトマイシン B (LMB)で処理した （Kudo, N. et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9112-9117)。
LMBで処理した細胞では、 殆どのトランスフエクタントにおいて Ganp-GFP は核に局在化した （図 37)。 優性な細胞質発現を示す細胞画分は 31%から 4% に 減少し、対照的に、核において優性な発現を示す細胞が 38%から 81%に増大した。 従って、 Ganpの細胞質への移行は LMBによって抑制されるように思われる。
Gmap80-GFPの局在化もまた LMB処理後、劇的に変化した (図 37)。すなわち、 細胞質発現を示す細胞画分が 65%から 37%に減少し、優性な核発現を示す細胞画 分が 0%から 41% に増大した。 これらの所見は、 COS7および Ltk- 細胞を含む 他の細胞系においても再現され、 核から細胞質への GANP輸出が Crml依存性 経路によって調節されていることを示している。 従って、 GANP及び Map80は 核と細胞質の間をシャトリング （往復） しているように思われ、 そしてそれらの 局在化は他の分子と共同している核移入および輸出機構の間のバランスに依存す るようである。
3.3.共トランスフエクトした細胞における MCM3および GANPの局在化
次に、 本発明者は GANPの移行が MCM3発現と関連しているかどうかを検討し た。哺乳動物の MCM3は、細胞周期中にクロマチンとの結合状態を変化させるが、 間期の間を通して核にのみ存在する （Kimura, H. et al.， (1994) EMBO J. 13， 4311-4320)。 NIH-3T3細胞を、 pSR a -M(7 ?- ¾4又は pSR a -i5-H^4によってト ランスフエク卜し、 固定し、抗 HA抗体 (Alexa488)で免疫標識し、 PIで染色した。 トランスフエクトした MCM3-HAは、典型的な NLSの存在と合致して（Kimui'a， H. et al" (1994) EMBO J. 13, 4311.4320、 Takei, Y. et al" (1998) J. Biol. Chem. 273, 22177-22180)、 核に局在化した （図 39)。 この核局在化は MCM3の NLSに依 存した。 なぜなら、 この NLSを欠く変異体 MCM3 (13; MCM3ANLS-HA)は、 細 胞質にのみ発現されたからである （図 39; 右パネル)。
細胞を、 pCXN2- Ganp-gfp は pCXN2- <¾2 <9ひ ·φ及び pSR -MCM3-IIAに よって共トランスフエクトし、 固定し、 抗 HA抗体 (Alexa546)で免疫標識し、 核を TOTO-3で前染色した （図 40)。 細胞数はパネルの下に示す （図 40)。
興味深いことに、 Ganp-GFP を用いて共トランスフエクシヨンした場合、細胞 の 17%において MCM3の細胞質局在化がもたらされた（図 40， 白い矢印で示す)。 Gmap80-GFPまたは Gp-GFPを用いた共トランスフエクシヨンの場合には、 その ような結果はみられなかった。
MCM3への Ganpの効果が特異的であることを証明するために、 核において出 現する ECFP-Nucの発現を、
Figure imgf000063_0001
トランスフエクション前後 で調べた。 Ganp-GFPでトランスフエクトした代表画像を示す（図 41)。ECFP-Nuc の核への局在化は、 Ganp-GFP (図 41)又は Gmap80-GFP又は Gp-GFPを用いた共 トランスフエクシヨンのいずれによっても影響されなかった。
Ganp及び MCM3の共発現もまた GANP局在化の変更をもたらした。 Ganp-GFP 単独 (38%)及び Gmap80-GFP単独 (0%)のトランスフエクシヨン （図 37) と比較し て、 MCM3を用いた共トランスフエクシヨ ンは Ganp-GFP (74%)および Gmap80-GFP (64%) の核発現レベルを増大させた （図 40)。 MCM3は、 GANPお よび Map80を核内に保持したが、 Ganpの過剰発現のみが MCM3 の細胞質におけ る出現を促進した（図 40 ; Ganp-GFP発現によって 17°/。）。他方、 Gmap80 MCM3 の細胞質における出現を促進しなかつた (Gmap80-GFP発現によつて 4%)。 MCM3 の NLSにおける突然変異 (13; MCM3ANLS-HA) (その結果、 MCM3は細胞質に 存在することになる） は、 Ganp-GFPまたは Gmap80-GFP の核への蓄積を引き 起こさなかった (図 42)。
野生型 MCM3とは異なり、 13 変異体 （MCM3ANLS-HA) は Ganp又は Gpと会 合しない（図 35)という事実を考え合わせるならば、 MCM3の NLSモチーフは、 細 胞において GANPとの機能的会合および核と細胞質間の GANPの輸送に必要であ ることが示唆される。
DNAトランスフエクシヨン実験は、 MCM3と共に導入された場合、 Ganp-GFP が核コンパートメントに蓄積することを示し、核における GANP/MCM3複合体の 形成を示唆した。 MCM3 は Crmlによつて認識されうる明らかな共通 NES様モチ ーフを含まず、 したがって核からの MCM3の輸出は、 恐らく、 NES様モチーフを 有する他の結合分子または異なる輸出機構に依存するのであろう。 GANP上の 2 つの NES様モチーフは、 LMB感受性 Crml依存性輸出経路に関与しているように 思われる （図 37)。 GANPによって担持される 2つの NES様モチーフ （これらは Crmlによって認識されるのかもしれない） は、 複合体の輸送に関与している可 能性がある。
最近、 GANP相同領域を担持する酵母 SAC3が、 あるタンパク質の核輸出に関 与し、 そして核膜孔複合体の成分と会合することが示された （Jones, A丄. et al.， (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3224.3229)。 GANPとの共発現は、 MCM3 の細胞質コンパートメントへの局在化を変化させた。 細胞融合技法を用いて、 MCM3の核-細胞質間シャトリング (往復）を調べた (Schmidt-Zachmann, M.S. et al" (1993) Cell 74, 493-504)。 HeLa細胞を最初 MCM3-HAでトランスフエクトし、 次にトランスフエクトしていないマウス Swiss-3T3細胞と融合させた。 タンパク質合成を抑制するためシクロへキシミド の存在下で 5時間インキュベートした後、 細胞を固定し、 MCM3-HA を免疫標識 した。へキスト (Hoechst)染色によってへテロカリオンを調べた。この染色は、 「ま だらの」 ヘテロクロマチンを有するマウスの核 （矢印） をヒト HeLa核と区別す る。
図 43に代表的なものを示すように、 MCM3-HA はへテロカリオン中にヒトぉ よびマウスの核の両方に見出された。 融合されていないマウスの細胞は、 そのよ うな染色を示さない。 このことは、 MCM3-HAが HeLa核から細胞質へ輸出され、 次にマウス核に移入されたことを示している。
これらの結果から、 MCM3-HAはシャトリングタンパク質であると結論される。 なお、 トランスジーン産物と同じような感度で内因性タンパク質の核から細胞質 への移行を実証することはしばしば困難である （Kimura, H., Ohtomo, T.et al., (1996) Genes Cells 1, 977-993、 Mizuno, T. et al" (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 7886-7896) 本実施例に示す結果についても、 そうであった。 酵母のようなより 原始的な細胞で達成されたとの同じような感度で、 哺乳動物細胞における内因性 MCMタンパク質の核から細胞質への移行を実証することもまた困難である。
しかしながら、 本発明者の結果は、 （実験は DNAトランスフエクシヨン法によ つて行ったが） 未操作細胞において MCMタンパク質の核-細胞質間シャトリング が恐らく重要であることを示している。 細胞周期の進行中における MCM複合体 の核-細胞質間移動の明確な理解を容易にするには、さらなる成分の発見が必要で あるかもしれない。
3.4.細胞周期の間の GANPの局在化
RNA/DNA プライマーゼドメインの GANPに特有のェピトープ（pSerSos GANP)に特異的なモノクローナル抗体を用いて、共焦点レーザー顕微鏡検査によ つて NIH-3T3細胞における GANPの局在化を調べた （Kuwahara, K. et al.， (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283)。 細胞周期の異なる時期に ある NIH-3T3細胞を、 抗 pSer502 GANP (Alexa488; 緑)及び抗 MCM3 (Alexa546; 赤)抗体で免疫染色した。 核を TOTO-3ヨウ化物 （青） で前染色した。 間期の間、 上記モノクローナル抗体は核小体を除く核内のすべてで反応した （図 44)。
抗 MCM3抗体および核酸を染色する TOTO-3を用いた三重標識によって、 有糸 分裂の間の GANPの局在化を詳しく分析した。 細胞が前中期から中期へ進むにつ れ、 GANPは濃縮クロマチンから解離されてくるように思われる （図 44)。 重ね 合わせた画像の黄色いシグナルは GANPと MCM3との共局在化を示すが、 若干の 青い染色は前中期画像の中心部で GANPが単独でも見えることを表している。 こ の段階では、 GANP及び MCM3は濃縮された染色体と重なり合っていない。 中期 の細胞においては、 GANPは紡錘体領域に検出される。 そしてこのシグナルは後 期に染色体が 2つの娘細胞に分離する間に減少する。
減数分裂後期においては、 GANPの殆どは核が形成されるまで （終期）、 細胞質 コンパートメントに見出される。 これらの結果は、 GANPおよび MCM3の挙動が 類似していて、 これら 2つは間期の間を通じて殆ど核に共局在化することを示し ている。 このことは、 これら 2つの相互会合と一致している。 しかし、 有糸分裂 の間に共焦点顕微鏡検査によって示されたように、 GANPおよび MCM3は別々に 存在することもできる （図 44)。
第 2型の RNA/DNAプライマーゼに関する核-細胞質間の GANPシャトリング の生物学的意味は、 今後の解明を待たなければならない。 それは DNA修復の最 終段階における RNAプライマーの生成に関連するのかもしれない。 正常細胞で は GANPの発現レベルは低いが、細胞が急速に増殖する胚中心においてはアップ レギユレーションされる (Kuwahara, K.et al., (2000) Blood 95, 2321-2328 、 Kuwahara, K. et al" (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10279-10283)。 GANPはまた、 速い細胞終期を有するある種の細胞においてより高レベルで発現 される。 このことは、 MCM複合体との会合が DNA複製を刺激する可能性を示 唆している （Kuwahara, K. et al" (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98， 10279-10283)。 RNA/DNAプライマ一ゼ活性、 MCM3結合能、 およびァセチル トランスフエラーゼドメイン （Takei, Y.et al.，（2001) EMBO Rep. 2, 119-123を 有する GANPの発現は、 細胞周期進行の調節に関与しているのかもしれない。 配列表フリーテキスト
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産業上の利用の可能性
本発明による GANPを過剰発現したマウスを用いることによって、従来では得 られることのできなかったウィルス抗原に特異的で高親和性の抗体を速やかに作 製することができる。 そのため、 エイズや C型肝炎のように遷延する感染による 病状悪化を当該のウィルス抗原の変異に遅れないで特異的で強力な抗体を速やか に得ることが可能となると期待される。 また、 これによつて、 感染患者からのゥ ィルスの抗原の変異に対応するオーダーメードの特異的抗体を作製することがで きる。 抗体の作製に必要な免疫期間は 1 0日程度で十分であり、 そのうち高親和 性の変異を持つ抗体の産生効率は 6 0 %近くに上る。 べッドサイドの患者サンプ ルを用いる高親和性抗体の産生プロトコールはワクチン療法に変わる新しい免疫 療法となると期待される。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . GANP遺伝子を導入したトランスジエニック哺乳動物又はその子孫。
2 . 導入した GANP遺伝子が B細胞で発現するものである請求項 1記載のトラ ンスジエニック哺乳動物又はその子孫。
3 . GANP遺伝子をトランスフエクトした ES細胞から発生させた、 請求項 1 又は 2に記載のトランスジエニック哺乳動物又はその子孫。
4 . 哺乳動物がマウスである請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載のトランスジェ ニック哺乳動物又はその子孫。
5 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のトランスジエニック哺乳動物又はその 子孫の一部。
6 . 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のトランスジエニック哺乳動物又はその 子孫に抗原を投与し、 得られる動物又は子孫から抗体を採取することを特徴と する高親和性抗体の製造方法。
7 . 請求項 6記載の方法により得られる高親和性抗体又はその断片。
8 . 親和性が 1 X 10— 7 (M) 以下で示されるものである請求項 7記載の抗体又は その断片。
9 . ポリクローナル又はモノクローナル抗体である、 請求項 7又は 8記載の抗体 又はその断片。
1 0 . 請求項 9記載の抗体又はその断片の V領域を含む、 ヒト型化抗体若しくは ヒト抗体又はそれらの断片。
1 1 . 請求項 8〜： 10のいずれか 1項に記載の抗体又はその断片、 及び請求項 11 記載のヒト型化抗体若しくはヒト抗体又はそれらの断片からなる群から選択 される少なくとも 1つを含有する医薬組成物。
1 2 . 抗原を投与した請求項 1〜4のいずれかに記載のトランスジエニック哺乳 動物又はその子孫から採取される、 高親和性抗体産生細胞。
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