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WO2004017057A1 - バイオセンサとその製造方法 - Google Patents

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Publication number
WO2004017057A1
WO2004017057A1 PCT/JP2003/010117 JP0310117W WO2004017057A1 WO 2004017057 A1 WO2004017057 A1 WO 2004017057A1 JP 0310117 W JP0310117 W JP 0310117W WO 2004017057 A1 WO2004017057 A1 WO 2004017057A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
electrode
biosensor
reaction
electrically insulating
reaction section
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/010117
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masaharu Maruo
Tetsuji Deguchi
Original Assignee
Gunze Limited
Japan Science And Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=31890525&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2004017057(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gunze Limited, Japan Science And Technology Agency filed Critical Gunze Limited
Priority to US10/524,380 priority Critical patent/US7727367B2/en
Priority to CA002494250A priority patent/CA2494250C/en
Priority to DE60335812T priority patent/DE60335812D1/de
Priority to JP2005502026A priority patent/JP4247440B2/ja
Priority to EP03788056A priority patent/EP1548427B1/en
Publication of WO2004017057A1 publication Critical patent/WO2004017057A1/ja

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a pyrosensor capable of quickly, easily, and quantitatively analyzing a specific component in a sample with high accuracy and a method for producing the same.
  • Biosensors have been used as a method for simply quantifying specific components in a sample solution without diluting or stirring the sample solution. There have been many reports on technologies for improving the disadvantages of conventional biosensors.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-220264 discloses a method of improving the measurement accuracy by adding a hydrophilic polymer to a reaction layer.
  • a hydrophilic polymer for example, Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-220264, since the ferricyanide precipitates, the shape of the obtained reaction part becomes non-uniform. It was not satisfactory.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-281022 discloses a method of forming a reaction layer by a sublimation method.
  • the pressure must be reduced during the biosensor manufacturing process, so that equipment and the like are expensive, and are not suitable for low-cost manufacturing.
  • productivity is low due to complicated work. Disclosure of the invention
  • the present inventor has conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, has adopted a precipitation method utilizing a pigmentation technique, and made the crystalline compound in the reaction part of the Noosensor into fine particles, thereby obtaining a sensor chip.
  • the present inventors have found that the reaction time can be shortened by increasing the dissolution and dissolution of the reaction part in the sample, and further developed to complete the present invention. That is, the present invention provides the following pyrosensor (hereinafter, also referred to as “first invention biosensor”) and a method for manufacturing the same.
  • Item 1 An electrically insulating substrate (1), an electrode portion (2) having a working electrode (2 1) and a counter electrode (2 2) provided on the substrate, and fixed to one end of the electrode portion (2).
  • a biosensor provided with a reaction section (4) containing an oxidoreductase, an electron acceptor, and microcrystalline cellulose powder comprising the following steps (A1) to (C1). Manufacturing method characterized by performing:
  • (A1) an electrode part (2) forming step in which a working electrode (1) and a counter electrode (2) are provided in parallel close proximity on an electric insulating plate (1);
  • Item 2. The electrodes are made of platinum, gold, palladium, and indium oxide.
  • Item 2. The method according to Item 1, comprising at least one selected from the group consisting of
  • Item 3 A biosensor manufactured by the method according to Item 1 or 2.
  • Item 4 A method for measuring a glucose component, an alcohol component, a lactic acid component, or a uric acid component in a sample liquid using the biosensor according to item 3.
  • the present inventors have found that a biosensor having excellent storage stability can be obtained by coexisting a specific hydrophilic polymer component in the reaction section of the ion sensor, and further developed the biosensor. Thus, the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following biosensor (hereinafter, also referred to as “second invention biosensor”) and a method for producing the same.
  • Item 5 An electrically insulating substrate (1), an electrode portion (2) having a working electrode (2 1) and a counter electrode (2 2) provided on the substrate, and fixed to one end of the electrode portion (2).
  • Item 6 The biosensor according to item 5, wherein the hydrophilic polymer comprises a linear oxyalkylene segment and an alkyl group-branched oxyalkylene segment.
  • the average molecular weight of the alkyl group-branched oxyalkylene segment in the hydrophilic polymer is 150 to 400, and the linear oxyalkylene segment in all the molecules is 30 to 80% by weight. 7.
  • the reaction section (4) is a dispersion liquid containing an oxidoreductase, an electron acceptor, a microcrystal cell mouth, and a hydrophilic polymer composed of a 7K-affected segment and a hydrophobic segment.
  • the biosensor according to any one of Items 5 to 7, which is formed by coating.
  • Item 9 The method for producing a biosensor according to Item 8, wherein each of the following steps (A2) to (C2) is sequentially performed.
  • the present inventor provides a biosensor in which an electrical insulating substrate and a cover sheet are opposed to each other with a spacer sheet therebetween at a distal end portion.
  • a protruding part that protrudes toward the sensor tip on one side, it was found that the liquid sample could be smoothly introduced into the holding space without leaving any bubbles, and this was further developed to complete the present invention. That is, the present invention provides the following biosensor (hereinafter, also referred to as “third invention biosensor”) and a method for producing the same.
  • the electric insulating substrate (1) and the cover sheet (6) are opposed to each other at a distance from each other by a spacer sheet (5) at a front end, and the substrate, the cover sheet, and the front end of the spacer sheet are disposed.
  • a reaction section (4) containing a redox enzyme is provided in the storage space (S) formed by the rim,
  • a liquid sample is introduced from the sensor tip side into the holding space by capillary action, and an electrochemical change caused by an enzymatic reaction between the liquid sample and the reaction section (4) is paired with the working electrode (2 1).
  • the biosensor according to Item 10 wherein a corner (52) is formed at a leading edge of the spacer sheet.
  • the present invention provides an electrically insulating substrate (1), an electrode portion (2) having a working electrode (21) and a counter electrode (22) provided on the substrate, and an electrode portion fixed to one end of the electrode portion.
  • the present invention relates to a method for producing a biosensor provided with a reaction section (4) containing an oxidoreductase, an electron acceptor and microcrystalline cellulose powder.
  • the pyrosensor of the present invention has a feature in that a precipitation method using a pigmentation technique is used in the process of forming the reaction part of the biosensor, whereby a uniform fine crystal reaction part can be constructed. High dispersion solubility in the sample liquid in the reaction section is achieved.
  • the electrode part (2) of the signal conversion part constituting the hard part of the biosensor of the first invention will be described.
  • the electrode section (2) is composed of a working electrode (2 1) (also referred to as a measurement electrode) and a counter electrode (2 2) (a reference electrode may be provided, if necessary).
  • a working electrode (2 1) also referred to as a measurement electrode
  • a counter electrode (2 2) a reference electrode may be provided, if necessary.
  • the substrate include polyester resin films such as polyethylene terephthalate (PET), polyethylene naphthalate, a biodegradable polyester resin composed of an aliphatic unit and an aromatic unit, and more heat and chemical resistance.
  • PET polyethylene terephthalate
  • a biodegradable polyester resin composed of an aliphatic unit and an aromatic unit, and more heat and chemical resistance
  • a plastic film such as a polyamideimide film and a polyimide film having excellent strength and the like, and an inorganic substrate such as a ceramic.
  • the thickness may be about 50 to 200 m.
  • a plastic film is used.However, it is a two-layer substrate made by laminating a polyester resin film and a polyimide film because it has characteristics such as ease of production, heat resistance, chemical resistance, and strength. In some cases.
  • a white substrate is kneaded with titanium oxide or the like from the viewpoint of easy viewing.
  • the working electrode (21) and the counter electrode (22) are formed (directly or indirectly) on the substrate (1) by a good conductor such as platinum, gold, palladium, or indium oxide. Is done.
  • the forming means can be formed by hot stamping, but vacuum deposition or sputtering is preferable because a fine electrode pattern can be formed accurately and quickly. In the case of this sputtering, the outside of the bipolar formation is masked. It can be formed all at once.
  • it can also be formed by first forming an entire thin film using the good conductor, and then forming this into a corresponding electrode pattern by photoetching.
  • the thickness of the electrode varies depending on the specific resistance of the good conductor, but should not be unnecessarily thick. Generally about 30-15 Onm is good.
  • the shape of the electrode is basically a stripe shape, and the working electrode (21) and the counter electrode (22) are arranged in parallel close proximity on the substrate.
  • the shape of the electrode tip provided with the reaction part (4) is generally a stripe shape, but may be, for example, a bent shape so as to increase the contact area with the reaction part.
  • the other end of the electrode serves as a terminal connected to a potential scanning unit built in the measuring device, and may be generally detachable from the measuring device.
  • the reaction section (4) provided at one end of the electrode section (2) is formed by applying a three-component mixed solution described later in a reaction section cell (31) provided on the mask sheet (3). It is.
  • the reaction section (4) is provided in the reaction section cell (31) so as to cover both the working electrode (21) and the counter electrode (22), and the three-component mixture leaks to other parts. It is formed so that there is no.
  • FIG. 1 For reference, the structure of the above signal conversion part is schematically illustrated in FIG.
  • a striped working electrode (21) and a counter electrode (22) are provided in parallel and closely on an electrically insulating substrate (1), and a mask sheet (3) is provided on the upper surface of both electrodes.
  • An electrically insulating spacer sheet (5) and a cover sheet (6) are sequentially laminated.
  • the mask sheet (3) is provided with a reaction section cell (31), where a reaction section (4) composed of three components described later is formed.
  • the spacer sheet (5) is provided with a protruding portion (51) on one side of the edge of the tip (R curve) of the sensor, and a corner (52) at the root thereof.
  • the spacer sheet (5) is covered with an electric insulating force sheet (6). As a result, a sample suction part (15) leading to the reaction part (4) is formed.
  • the amount and ease of inhalation of the sample depend on the shape and cross-sectional area of the sample inlet.
  • the volume of the reaction section (4) depends on the thickness of the mask sheet (3) and the cell for the reaction section.
  • the reaction section (4) is composed of a film (or layer) formed mainly of three components of oxidoreductase, electron acceptor and microcrystalline cellulose.
  • oxidoreductase is the central component that comes into contact with a liquid sample, selectively reacts with certain test components in it, and recognizes it. Therefore, at least this oxidoreductase is indispensable.
  • the components that selectively react with the enzyme by redox reaction include, for example, a glucose component, an alcohol component, a lactic acid component, and a uric acid component.
  • a glucose component for example, a glucose component, an alcohol component, a lactic acid component, and a uric acid component.
  • glucose reacts selectively with glucose oxidase, but the actual reaction takes place in the presence of water and oxygen, producing dalconic acid and hydrogen peroxide.
  • alcohol value use alcoholic alcohol or alcohol dehydrogenase.
  • lactate oxylase or lactate dehydrogenase When measuring lactic acid, use lactate oxylase or lactate dehydrogenase. If uric acid is to be measured further, use peroxidase.
  • an electron acceptor also referred to as electron media
  • a typical example of the coexistence of the electron acceptor is a Darcos sensor, for example, measurement of a blood glucose level using blood as a sample.
  • the electron acceptor is generally an inorganic or organic fine powder compound that promotes the reductive oxidation of an enzyme.
  • alkali metal ferricyanide particularly preferably potassium metal salt
  • fecacene or an alkyl-substituted product thereof P-benzoquinone, methylene blue, ⁇ -naphthoquinone 4-potassium sulfonate, phenazine methoxide Sulfate, 2,6-dichlorophenol indophenol and the like.
  • alkali metal ferricyanide and Hue-Sen system work effectively. This is because the function as an electron transfer medium is stable and it is well soluble in aqueous solvents such as water, alcohols, or a mixed solvent thereof.
  • the size of the electron acceptor powder is about 5 to 100 m.
  • a practical level sensor can be obtained even with a reaction section composed of the two components, a pyrosensor obtained by applying an aqueous solution of both components to the electrode section tends to have a variation in measurement accuracy depending on the usage environment and the like. . In other words, it is difficult to obtain a biosensor with constant performance. Although the cause of this is not well understood, it is thought to be due to the crystal structure formed by precipitation after coating.
  • Microcrystalline cellulose as the third component is added as a component for improving the above-mentioned variation in measurement accuracy.
  • Various factors can be considered for the improvement of the variation.
  • the electrochemical reaction between the electrode and the electron acceptor is suppressed due to the decrease in the chance of direct contact of the electron acceptor with the electrode, or the enzyme particles and the electron acceptor particles are made finer.
  • the cellulose adsorbs the blood cells, or the cellulose forms a network.
  • other factors such as preventing the two components from scattering out of the system. It is considered that these factors act synergistically, and consequently, variations in measurement accuracy are suppressed.
  • the microcrystalline cellulose is fine particles obtained by extracting a crystal part in a plant fiber, and generally has a diameter of about 10 m or less and a length of 300 m or less.
  • this microcrystalline cellulose is mainly used, but it may be mixed with amorphous cellulose fine powder which can be obtained simultaneously.
  • the method of manufacturing the first invention is characterized by sequentially performing the following steps (A1) to (C1):
  • a reaction part forming step for forming the reaction part (4) is characterized in that in the process (B1) of forming the reaction part (4) of the biosensor, a precipitation method utilizing a pigmentation technique is used, whereby uniform fine crystals are obtained.
  • the reaction section can be constructed, and high dispersion solubility of the reaction section in the sample solution can be achieved.
  • a working electrode (21) and a counter electrode (22) are provided in parallel proximity on an electrically insulating substrate (1) to form an electrode section (2).
  • Various methods can be used for forming the electrode portion (2) on the electrically insulating substrate (1).
  • hot stamping, direct vacuum deposition, sputtering, etc. can be used on the substrate (1).
  • Examples include a method of forming an electrode pattern, a method of forming an electrode pattern by a photoetching method, and a method of bonding an electrode tape having a conductive material to the substrate (1).
  • a specific example of a method of bonding an electrode tape having a conductive material to the substrate (1) will be described below.
  • Conductive materials such as platinum, gold, palladium, and indium-tin oxide are deposited or sputtered on a thin, supportive, heat-resistant plastic sheet such as polyimide or aromatic polyimide.
  • a heat sealing material such as ethylene vinyl acetate is coated on the back surface of the electrically insulating material sheet.
  • the multilayer sheet is chopped into a tape to form an electrode tape.
  • the electrode tape (2) is formed by thermally bonding the electrode tape to the insulating substrate (1).
  • an electrode pattern by sputtering or the like when the desired shape of both electrodes is a stripe shape, first, a mask in which two stripe-shaped parallel holes are punched out as a masking material for sputtering is used. This is fixed to the polyimide film in such a way that it contacts the upper surface of the polyimide film without any gap. Sputtering is performed on the film, and spattering platinum is projected from the striped window holes to form two continuous striped electrodes in close contact with the polyimide film.
  • the electrode part (2) is formed by laminating the polyimide film on which the electrodes are formed to a PET film via an adhesive.
  • a conductive material can be placed directly on an electrically insulating substrate (1) (eg, PET film).
  • the electrode part (2) may be formed by sputtering a material.
  • the coating solution for a reaction part of the present invention comprises a reaction reagent system containing three components of an oxidoreductase, an electron acceptor, and a fine crystal cell mouth powder. Since the reaction reagent system contains microcrystalline cellulose powder, it is excellent in film formability in forming a reaction part. As the above three components, those described above can be used.
  • the good solvent of the present invention may be any solvent having high solubility in oxidoreductase and electron acceptor, and is preferably water or an aqueous good solvent such as a water-containing solvent.
  • the aqueous solvent is a solvent that is compatible with water, for example, a mixed solution of methanol, ethanol, dioxane, isopropyl alcohol, and the like and water.
  • the poor solvent for the reaction reagent system of the present invention may be any solvent that dissolves in water and lowers the solubility of oxidoreductase and electron acceptor, such as alkylenedalycol monoalkyl ether, alkylene glycol, propylene alcohol, Butanol and the like, and ethylene glycol monoethyl ether (Cellosolve) is preferred.
  • the above three-component reaction reagent system may be partially dissolved. Specifically, the two components of the oxidoreductase and the electron acceptor may be substantially dissolved, and the fine crystalline cellulose powder may be in a dispersed or suspended state.
  • the above-mentioned good solvent and poor solvent water-ethylene-dalcol monoethyl ether is preferable.
  • the ratio of the amount of the good solvent to that of the poor solvent is about 1: 0.5 to 10, preferably about 1: 1 to 3.
  • a specific example of the electrode forming step (B1) is shown.
  • the aqueous suspension of microcrystalline cellulose is stirred with a homogenizer, and an oxidoreductase (glucose oxidase, etc.) and an electron acceptor (potassium ferricyanide, etc.) are added thereto and stirred to obtain a mixed solution A.
  • an oxidoreductase glucose oxidase, etc.
  • an electron acceptor potassium ferricyanide 5 to 70 g
  • microcrystalline cellulose 1 to 10 g per 100 mL of 100% water is as follows.
  • Mixture A is produced.
  • the mixed liquid A is added dropwise to this, whereby the dispersion liquid B is adjusted.
  • This is used as the coating solution for the reaction section.
  • finer crystals can be obtained as the deposition rate is higher.
  • reaction section forming step (C1) will be described.
  • a predetermined amount of the reaction part coating liquid is applied dropwise to one end of the electrode part (2) of the electrode forming plate obtained in the step (M), and dried to form a film.
  • a mask sheet (3) is thermally bonded on an electrically insulating substrate (1) having a working electrode (21) and a counter electrode (22) provided in parallel and close proximity.
  • the mask sheet (3) is made of a heat-fusible sheet, and is provided with a reaction part cell (31) for regulating the electrode area of the sensor chip reaction part. That is, the reaction part cell (31) is provided at one end of the sensor so as to form a window through which the working electrode (21) and a part of the counter electrode (22) can be seen.
  • the part to be coated with the three-component coating liquid for the reaction part obtained in the step (B1) is placed in the reaction part cell (31) provided on the mask sheet (3) on the electrically insulating substrate (1). It is.
  • the reaction section coating liquid is applied so as to cover both the working electrode (21) and the counter electrode (22) in the reaction section cell (31).
  • the coating liquid is applied using a pipette, a nozzle, or the like, and dried in an oven or the like for a certain period of time to form a film.
  • This membrane is fixed across the working electrode (1) and the counter electrode (2) and functions as a reaction part (4).
  • the spacer sheet (5) is provided with a protruding portion (51) on one side of the edge of the tip (R curve) of the sensor and, if necessary, a corner (52) at the root thereof.
  • the protruding portion (51) when the sensor of the present invention comes in contact with the sample liquid, the sample liquid can be smoothly introduced without leaving bubbles in the holding space portion by utilizing the capillary phenomenon.
  • the spacer sheet (5) may be a double-sided adhesive sheet having a constant thickness.
  • the spacer sheet (5) is covered with an electrically insulating cover sheet (6). This forms a sample suction part (15) leading to the reaction part (4).
  • the sample inhalation volume and ease of inhalation depend on the shape and cross-sectional area of the sample inlet.
  • the volume of the reaction section (4) is determined by the thickness of the mask sheet (3) and the area of the reaction section cell (3 1). It is advisable to change each of them as appropriate to determine the optimal conditions.
  • the reaction section is preferably fixed over the working electrode (2 1) and the counter electrode (2 2), but the working electrode (2 1) and the counter electrode (2 2) are not necessarily fixed. It does not have to be provided in the same shape and arrangement.
  • a desired biosensor is obtained through the above steps (A1) to (C1), but finally, all steps are completed by applying force as a biosensor chip.
  • the biosensor according to the second invention of the present invention will be described in detail with reference to FIGS.
  • the biosensor of the second invention comprises an electric insulating substrate (1), an electrode having a working electrode (21) and a counter electrode (22) provided on the substrate, and a reaction fixed to one end of the electrode.
  • a biosensor comprising a part (4), wherein the reaction part comprises an oxidoreductase, an electron acceptor, a microcrystalline cellulose powder, and a hydrophilic polymer composed of a hydrophilic segment and a hydrophobic segment. It is characterized as being a main component.
  • the electrode part (2) of the signal conversion part constituting the hardware part of the present invention is the same as the description of the “electrode part (2)” in the above “1. First Invention Biosensor”.
  • the reaction section (4) mainly comprises four components of a oxidoreductase, an electron acceptor, a microcrystalline cell opening, a hydrophilic polymer composed of a hydrophilic segment and a hydrophobic segment. It is a film (or layer) formed as a component.
  • reaction II! 5 (4) the description of “Reaction II! 5 (4)” in the above “1. The same is true.
  • the biosensor of the first invention employs the above-mentioned three-component reaction section, greatly improving the packing and measuring the components in the sample with high accuracy.
  • various pre-checks are conducted, and there is room for further improvement in the following points.
  • a reaction part of the biosensor of the first invention is configured to include the above-mentioned “hydrophilic segment and hydrophobic segment” as a fourth component. It has been found that it is effective to add a certain hydrophilic polymer.
  • the polymer exerts a large effect only by the combination of the three components and the hydrophilic polymer, and even if the microcrystalline cellulose in the three components is lacking, for example, it is replaced by another component.
  • the problem in the present invention is not solved.
  • the four components form more uniform and fine particles than the reaction component (3) of the three components, and the polymer reacts in a state where the three components are closely connected to each other.
  • the biosensor of the second invention basically has the structure of the biosensor of the first invention, and differs in that the above-described four-component system is employed in the reaction section (4).
  • the hydrophilic polymer is, for example, a polymer having the following content.
  • the meaning of hydrophilicity means a property of dissolving or hydrating and swelling in water or at least a hydroxyl-bonded aliphatic alcohol dissolved in water or a mixed solvent thereof.
  • a polyacrylic acid-based alkali metal salt or polyacrylic acid Alkanolamine salts and polyoxyalkylenes are preferred.
  • polyoxyalkylenes are preferred.
  • examples thereof include a polyoxyethylene alkyl (hydrophilic) ether having a higher aliphatic group (hydrophobic) at one terminal, a higher fatty acid ester (hydrophobic) of polyethylene glycol (hydrophilic), and a linear oxy group.
  • the polymer include an alkylene segment (hydrophilic) and an alkyl group-branched oxyalkylene segment (hydrophobic). Hydrophilic polymers (hereinafter referred to as “A polymer”) are more preferred.
  • the action and effect (high temporal stability, high measurement accuracy, etc.) of the mixture of the hydrophilic polymers can be further increased.
  • the hydrophilic polymer has more distinct amphoteric properties, for example, during the manufacture of the pyrosensor described in Section 9, particularly, the step of preparing the coating solution for the reaction part (B2) can be effectively performed, The above effects can be promoted. Further, since the affinity between the electrode substrate and the coating liquid for the reaction part becomes compatible, coating is easy, and the adhesion of each sheet is also improved. Therefore, in the case of a hydrophilic polymer having only a hydrophilic segment alone or only a hydrophobic segment, it is difficult to obtain a high level of the effect such as long-term storage stability.
  • the bond between the linear oxyalkylene segment expressing hydrophilicity and the alkyl group-branched oxyalkylene segment expressing hydrophobicity is, for example, randomly or alternately regularly (block structure).
  • block structure is more preferable. This is because it is easy to control the molecular weight between the units, and the degree of hydrophilicity and hydrophobicity can be clearly and easily changed.
  • the amphoteric balance of the A polymer can also be controlled by the molecular weight and content of each fragment, and in the present invention, those defined in Item 7 are preferable. That is, the alkyl group-branched oxyalkylene segment in the hydrophilic polymer is referred to as an average molecular weight, and the linear oxyalkylene segment is referred to as a weight%. Specifically, the former is preferably 150 to 400, more preferably 2000 to 300, and the latter is preferably 30 to 80% by weight, more preferably 4 to 100% by weight. 0 to 70% by weight.
  • the surface of the reaction part (4) to be formed is formed without stickiness, and the reaction part changes to an abnormally dry state even in a dry environment.
  • the reaction part changes to an abnormally dry state even in a dry environment.
  • the monomer component forming the linear oxyalkylene segment is, for example, a ring-opening polymer unit of a linear alkylene oxide such as ethylene oxide, 1,3-propylene oxide, or 1,4-butylene oxide.
  • the monomer component forming an alkyl group-branched oxyalkylene segment exhibiting hydrophobicity is formed by branching (side chain) of an alkyl group such as methyl ethylene oxide or ethyl ethylene oxide.
  • Ring-opening polymer units of alkylene oxides Basically, the above four components should be mainly composed. In that case, it is more effective to make each composition ratio as follows.
  • the content is 1 to 30% by weight, preferably 3 to 20% by weight, and the hydrophilic polymer is 2 to 40% by weight, preferably 5 to 30% by weight.
  • the biosensor of the present invention is characterized in that it has a reaction part (4) containing the four components as main components, and the above-mentioned reaction part (4) and the other components act synergistically.
  • Great improvement effects are achieved. This is not always achieved at exactly the same level no matter what manufacturing method is used.
  • the production method provided in Item 9 can be mentioned.
  • biosensor manufacturing method characterized by sequentially performing the following steps (A2) to (C2).
  • a mixed solution Ma composed of three components of oxidoreductase, electron acceptor and microcrystalline cellulose and ⁇ 1 in advance is used as a poor solvent for the three components, but for the hydrophilic polymer. Do not stir into the hydrophilic polymer solution Pa dissolved in an aqueous solvent that is a good solvent.
  • the above-mentioned production method is particularly characterized in that, among various conceivable methods, the coating solution to be coated to form the reaction part provided in item 8 is in the form of a dispersion (or suspension). are doing.
  • the electrode forming step (A2) is a step of providing a working electrode (21) and a counter electrode (22) in parallel proximity on an electrically insulating substrate (1).
  • Various methods can be used to form the electrode portion (2) on the electrically insulating substrate (1). For example, hot stambling, direct vacuum evaporation, sputtering, etc. can be performed on the substrate (1).
  • a specific example of a method of bonding an electrode tape having a conductive material to the substrate (1) will be described below.
  • Conductive materials such as platinum, gold, palladium, and indium-tin oxide are deposited or sputtered on a thin sheet of plastic insulating material such as polyimide and aromatic polyimide that is thin and has excellent heat resistance.
  • the back of the insulating material sheet is coated with a heat sealing material such as ethylene vinyl acetate. This multilayer sheet is chopped into a tape shape to form an electrode tape.
  • the electrode tape (2) is formed by thermally bonding the electrode tape to the insulating substrate (1).
  • the substrate is a two-layer substrate obtained by laminating a polyester resin film and a polyimide film in the above examples. This case will be described.
  • polyester resin film for example, a PET film is mentioned, and its thickness is generally about 70 to 150 m.
  • the polyester resin film itself can be used as a substrate.
  • poly As a polyimide film to be laminated on the ester-based resin film a (thin) aromatic polyimide film (hereinafter PI film) having a thickness of about 20 to 50 m is generally used.
  • the two electrodes are formed on a PI film in advance, and the back surface of the PI film and the PET film are laminated via an adhesive. This completes the formation of the electrodes together with the two-layer substrate. It also becomes an electrode plate that excels in heat resistance, chemical resistance, and various physical properties.
  • the reason why the electrodes are formed on a PI film in advance and this is laminated on a PET film is as follows.
  • the PI film is tough and has high heat resistance, and can be used in a large amount of thin film by roll winding, and has excellent adhesion of the formed electrode, making it suitable for electrode formation by sputtering. Used for That is, the longer film can be continuously supplied in a roll-to-roll manner for a long time, and a high-quality electrode plate with high productivity is easily obtained.
  • high-purity platinum is preferably used as a good conductor used in the sputtering method.
  • the sputtering conditions in this case were as follows: an argon atmosphere, a degree of vacuum of 1.
  • the electrode formation by masking is performed as follows. For example, if the desired shape of both electrodes is striped, first use a masking plate with two striped parallel holes punched out as a masking material, and use this as a gap on the upper surface of the PI film that is continuously supplied. It is fixed in a state where it comes in contact with it. At the above-mentioned speed, sputtering is started simultaneously with the supply of the film. A sputtered ring platinum is projected from the striped window hole to form a continuous two striped electrode S adherently. It is supplied and wound on a roll-to-roll basis.
  • the sputtering may be repeated while rewinding.
  • the PI film on which the electrodes are formed is laminated on a PET film via an adhesive. Then, a suspension sheet (5) provided with a protruding portion (51) and an outer cover cover are formed so that a sample suction portion (15) and a reaction portion (4) described in FIG. 7 are formed. And (6) are sequentially bonded and laminated via an adhesive. Of course, after the step (C2), the outer surface cover sheet (6) is covered with the terminal portion provided at the other end of the biosensor, without being covered.
  • a coating liquid for the reaction section in the step (B2) is prepared.
  • the three components of the redox enzyme, the electron acceptor, and the microcrystalline cellulose are added to a good solvent within the above composition ratio to prepare a mixed solution Ma.
  • the good solvent, the three components are dissolved or dispersed (suspended) in water have a solvent containing a UGA, lower monovalent aliphatic alcohols in particular miscible with water or water (up to at most C 3 And an alcohol mixture.
  • the oxidoreductase and the electron acceptor are substantially dissolved in the good solvent, but the fine crystal cell opening may be in a dispersed state or a suspended state.
  • the three components may be simultaneously added to the good solvent and stirred at room temperature.
  • a sequential method in which the components are added and stirred may be employed.
  • a solution Pa of a hydrophilic polymer is separately prepared.
  • the solvent used for the solution Pa is a solvent that is almost completely soluble in the hydrophilic polymer itself (good solvent), but a solvent that is hardly soluble or substantially insoluble in the above three components (poor solvent).
  • Solvent (hereinafter also referred to as “specific solvent”).
  • the "specific solvent” examples include a monohydric aliphatic alcohol having 4 or more carbon atoms, a higher aliphatic polyhydric alcohol having 2 to 3 valences, or a polyhydric alcohol in which at least one of the hydroxyl groups of the polyhydric alcohol has been substituted with an alkyl group.
  • Alcohol a divalent aliphatic alcohol in which one hydroxyl group is substituted with an alkyl group is preferable, and specific examples include monomethyl or monoethyl ether of ethylene glycol.
  • two or more of these organic solvents can be mixed and adjusted.
  • the aqueous mixed solution Ma in which the three components are dissolved is dropped into the hydrophilic polymer solution Pa under stirring.
  • This stirring should not be too vigorous, but should be done gently, and the dropping should be done slowly over a certain amount of time. This Thereby, it is possible to generate fine crystal particles having a uniform particle size.
  • Such a special mixing means is particularly effective for preparing a coating solution for the reaction section.
  • a hydrophilic polymer may be mixed in advance in addition to the three components in the aqueous mixed solution Ma, and only the above “specific solvent” may be dropped and mixed.
  • a procedure of drop-mixing the hydrophilic polymer solution Pa into the aqueous solution Ma may be adopted.
  • the procedure of the step (B2) can form a more preferable reaction part (4).
  • the present invention is characterized in that the reaction part coating liquid composed of four components is a dispersion liquid. Since the above three components are originally fine crystalline powders, when the film is formed by coating and drying, each of the three components becomes original crystal particles and is mixed and dispersed. However, since the size of each particle varies in size and is uneven and mixed and dispersed, this causes poor connection between components and poor stability over time.
  • the reaction component coating solution composed of four components is in a state of a dispersion (suspension) precipitated in a hydrophilic polymer containing an “aqueous solvent”.
  • the particles in the dispersed (suspended) state have the same particle size and are ultrafine particles.
  • the electrode section of the electrode forming plate obtained in the step (B2) is used.
  • a desired biosensor is obtained through the above steps (A2) to (C2). Finally, all the steps are completed by force-working as a biosensor chip.
  • the thus-obtained Pyosensor of the first invention and the Pyosensor of the second invention thus obtained are used for quantifying specific components in various sample liquids.
  • the darco in the sample solution Components, alcohol components, lactic acid components or uric acid components are measured with high accuracy without variation.
  • a known biosensor measurement method can be used.
  • the measurement is suitably performed using the method described in Example 3.
  • the reaction section (4) of the third invention biosensor may employ the composition described in the first invention biosensor or the second invention biosensor.
  • the electric insulating substrate (1) of the present embodiment is formed in a long plate shape, and the tip portion is formed in a substantially semicircular shape.
  • the electrode part (2) disposed on the substrate (1) is composed of a working electrode (21) and a counter electrode (22) disposed substantially in parallel along the longitudinal direction of the substrate (1). ing.
  • two electrode films obtained by sputtering and depositing a platinum film on a predetermined polyimide film are adhered on a substrate (1) with an adhesive at an interval of about 0.5 mm to form an electrode portion (2). Is composed.
  • This mask sheet (3) is provided with a substantially elliptical (or rectangular) reaction part cell (window) (31) on the front end side, which is substantially semicircular, and the reaction part cell (31). ) Exposes the tip side of the electrode section (2). Also, the mask sheet (3) is not laminated on the rear end side of the substrate (1), but exposes the rear end side of the electrode section (2).
  • the exposed portion on the distal end side of the electrode section (2) serves as a detection section for detecting an electrochemical change due to an enzymatic reaction between the reaction section (4) described below and the liquid sample, and the electrode section ( 2)
  • the exposed part on the rear end side is a connection terminal for connecting to the measuring device.
  • a hot melt film having a substantially semicircular tip is thermocompression-bonded and laminated as a mask sheet (3) on a substrate (1).
  • the reaction section (4) disposed on the detection section of the electrode section (2) in the reaction section cell (31) of the mask sheet (3) has an enzyme that reacts with a specific component of the liquid sample to be measured. And an electron-donor for donating electrons during the enzymatic reaction.
  • the configuration of the reaction section (4) is as described above.
  • the leading edge of the electrically insulating spacer sheet (5) disposed on the mask sheet (3) has one side in the width direction.
  • a protruding portion (51) protruding toward the sensor tip side is formed at the base, and a corner (52) is formed at the root of the protruding portion (51).
  • a PET film having an adhesive layer on both sides is laminated on a mask sheet (3) as a spacer sheet (5).
  • the leading end of the electrically insulating cover sheet (6) provided on the spacer sheet (5) is formed in a substantially semicircular shape slightly smaller than the leading end of the substrate (1).
  • the cover sheet (6) and the substrate (1) are opposed to each other at a predetermined interval by the spacer sheet (5).
  • a storage space S surrounded by the top edge of the storage space S is formed.
  • a transparent PET film is laminated on the upper surface of the spacer sheet (5) as a cover sheet (6).
  • the biosensor (10) When measuring a liquid sample using the biosensor (10) configured as described above, first, attach the biosensor (10) to the measuring device at the rear end, and then use the biosensor (10) to measure the liquid sample to be measured. The sample is brought into contact with the sample suction part (15) at the tip of the sensor (10), and the liquid sample is introduced into the holding space (S) using capillary action. Then, the specific component of the liquid sample and the reaction part (4) are subjected to an enzymatic reaction in the storage space (S), and the electrochemical change at that time is detected by the electrode part (2), and the specific component in the liquid sample is detected. Is measured with a measuring device.
  • This biosensor (10) has a protruding part (51) formed on one side of the leading edge of the spreader sheet (5). Therefore, the sample suction part (15) at the tip of the sensor by capillary action (15) The sample can first be brought into contact with the protrusion (51). Then, by using the wettability of the protrusion (51), the introduction of the liquid sample by the capillary phenomenon can be promoted at the protrusion (51). Therefore, as shown in Fig. 9, after the front edge F of the liquid sample flowing from the sample suction part (15) side of the sensor tip comes into contact with the protruding part (51), this liquid sample is moved to the protruding part (51).
  • the gas can be preferentially flowed in from one side along the side surface of the container, and the gas in the storage space (S) is discharged to the opposite side of the protruding portion (51) (see the arrow in FIG. 3).
  • the sample can be smoothly introduced into the entire storage space (S).
  • the discharged air flow C causes the liquid sample to come into contact with the space sheet (5) even in a portion other than the protrusion (51). It is possible to prevent bubbles from being generated and to introduce the liquid sample without leaving any bubbles in the storage space S.
  • the biosensor (10) can introduce a liquid sample from one side along the protrusion (51) by the introduction promoting action of the protrusion (51), the depth of the storage space (S) can be reduced. ⁇ ⁇ Even if the corner (52) is formed in the chassis (5), no air bubbles remain in the corner (52). Therefore, according to the biosensor (10), the formation of the corner is not limited due to the remaining air bubbles as in the prior art.
  • the capacity of the retaining space S can be easily expanded by forming the corner. Can be.
  • the biosensor (10) can support the cover sheet (6) by the protruding part (51) protruding toward the sample suction part (15) at the sensor tip, so that the substrate (1) and the cover sheet can be supported.
  • (6) It is possible to stably maintain the set interval with. Therefore, for example, it is possible to prevent the cover sheet (6) from being deformed due to, for example, a temperature change or an external force, and the liquid sample can be introduced into the holding space (S) in a prescribed amount, thereby enabling measurement. Accurate measurement with few errors is possible.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an example of a sensor chip configuration.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a cross section of a reaction part of Example 1 and Comparative Example 1.
  • FIG. 3 shows a copy of an electron micrograph of the surface state of the reaction part in Comparative Example 1.
  • FIG. 4 shows a copy of an electron micrograph of the surface state of the reaction part in Example 1.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a comparison of Faraday current values in Example 1 and Comparative Example 1.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a comparison of sensor outputs in Example 1 and Comparative Example 1.
  • FIG. 7 is a diagram showing an embodiment of the biosensor of the present invention.
  • FIG. 7 (a) is a plan view
  • FIG. 7 (b) is a cross-sectional view taken along line AA.
  • FIG. 8 is an exploded perspective view of the biosensor of the present invention.
  • FIG. 9 is a partial plan view for explaining the introduction process when introducing the liquid sample into the storage space of the biosensor of the present invention.
  • FIG. 10 is a graph showing the output change and the CV value with respect to the elapsed date of the enzyme sensor.
  • the measurement system in the example was composed of a disposable sensor chip and a main body of the measuring instrument, and used an enzyme electrode method.
  • Platinum was sputtered on the polyimide sheet.
  • the back surface of the polyimide sheet was coated with ethylene vinyl acetate (EVA) as a heat sealing material.
  • EVA ethylene vinyl acetate
  • the multilayer sheet was cut into a tape. This is a platinum electrode tape. Holes (cells for the reaction part) that regulate the electrode area of the reaction part of the sensor chip were punched out of a polyester hot melt adhesive sheet to form a mask sheet.
  • a platinum electrode tape and a mask sheet were thermally bonded to a white PET sheet, which is an insulating material.
  • a spacer sheet was made by punching a hole in the double-sided adhesive sheet having an acrylic adhesive layer (thickness 25 ffl) on both sides of the PET layer (thickness 100 nm) to provide a sample suction chamber.
  • THEOLUS CREAM (SEOLUS CREAM FP-03 manufactured by Asahi Kasei Corporation, 10% by weight of crystalline cellulose) was added to 150 g of distilled water, and the mixture was stirred with a homogenizer at 10,000 to 111 for 15 minutes. This is used as a theolus cream diluent.
  • Ethylene glycol monoethyl ether (Nacalai Tesque, special grade) While stirring iOO mL with a magnetic stirrer at 500 rpm, gently add 100 mL of the above solution A dropwise. After the whole amount of the solution A was dropped, the mixture was stirred for 5 minutes. This is B solution. The solution B thus obtained is used as a coating solution for the reaction section.
  • FIG. 4 shows an electron micrograph of the surface state of the reaction part.
  • FIG. 2 (b) shows a schematic diagram of the cross section of the reaction part shown in FIG.
  • the induced current flowing when the reaction part of the sensor chip was dissolved in the sample solution was measured to evaluate the solubility of the sensor chip.
  • the Faraday current value of ten sensor chips was measured, and the solubility was evaluated.
  • the average was 160.1 (Table 1, Fig. 5).
  • the output sensitivity at a measurement time (20 seconds) at a Darcos concentration of 100 mg / dL was 154.7 (Table 2, Fig. 6).
  • the CV value is a value of (standard deviation value of sensor output Z average value of sensor output) X100.
  • Solution A was made as in Example 1. Ten sensor chips were formed in the same manner as in Example 1 except that this solution A was used as a reaction part coating solution.
  • Figure 3 shows an electron micrograph of the surface of the reaction zone.
  • Fig. 2 (a) shows a schematic diagram of the cross section of the reaction part shown in Fig. 3.
  • Example 1 As in Example 1, the solubility was evaluated for ten sensor chips by measuring the Faraday current value, and the average was 17.6 (Table 1, Fig. 5).
  • the output sensitivity at a glucose concentration of 100 mg / dL at a measurement time of 30 seconds was 99.2 (Table 2, Figure 6).
  • the sensor chip of Example 1 has much higher solubility in the reaction section than the sensor chip of Comparative Example 1.
  • the sensor chip of Example 1 has a higher sensor output than that of Comparative Example 1 and is a more reliable sensor chip.
  • the variation in the output of the sensor chip in the first embodiment is It was smaller than that of Comparative Example 1.
  • the electrode forming step (A2) was performed with the following contents.
  • a working electrode (21) and a counter electrode (22) are formed on a 25-m-thick polyimide film by sputtering platinum with a thickness of 0.06 um, a size of 1 x 35 mm, and an interval of lmm, and this is formed by sputtering. It was laminated on a 250 m long white PET film (1) with an adhesive. Next, one end is left as a terminal (21a, 22a) on both electrode forming surfaces, and the other end is a rectangular window (reaction 10 O (thickness) with a cell (3 1)) (1.5 X 5 mm) (room for the reaction part (4)) and a sample suction part (15) for the sample suction passage leading to this window.
  • m PET film electrically insulating sheet (5)
  • step (B2) of preparing the coating solution for the reaction section was carried out in the following manner.
  • Oxidoreductase ⁇ ⁇ glucose oxidase (Toyobo Co., Ltd. activity 165 units (u) / mg) 2.44 g (hereinafter referred to as experimental enzyme)
  • Poison electron acceptor-Pure potassium ferricyanide manufactured by Nacalai Tesque, Inc. 40 g (hereinafter referred to as experimental receiver)
  • Reference hydrophilic polymer solution ' ⁇ A block polymer of ethylene oxide and propylene oxide. The average molecular weight of oxypropylene glycol unit is about 2050, and the ethylene content of all molecules is about 50% by weight. C) is a paste. A solution of 7.5 g of the polymer uniformly dissolved in 10 Oml of ethylene diol monoethyl ether (hereinafter referred to as experimental hydrophilic polymer solution Pa).
  • the mixed solution Ma was gently dropped into the experimental hydrophilic polymer solution Pa in a stirring state, and when the entire amount was dropped, stirring was continued for 5 minutes and stopped. The whole changed to a suspended aqueous liquid due to the precipitation of fine particles. This is hereinafter referred to as a coating liquid for a reaction part.
  • the process proceeded to the reaction section formation step (C2), where reaction section (4) was formed, and the desired 100 biosensors were completed.
  • Example 2 was carried out under exactly the same conditions except that no hydrophilic polymer was used. That is, first, a reaction part coating solution for comparison (aqueous liquid having the same appearance as in Example 2) was prepared, and this was applied to the reaction part cell (31) of the platinum electrode forming plate, and the reaction part was prepared. Without the membrane, 100 enzyme sensor chips for comparison were obtained.
  • a reaction part coating solution for comparison aqueous liquid having the same appearance as in Example 2 was prepared, and this was applied to the reaction part cell (31) of the platinum electrode forming plate, and the reaction part was prepared. Without the membrane, 100 enzyme sensor chips for comparison were obtained.
  • an aqueous glucose solution having a concentration of 10 O mg / dL was used as a specimen.
  • 10 pieces stored for 5 days and 10 pieces stored for 40 days were used.
  • 5 L of the sample was injected from the suction ports of each of the 10 chips, and immediately after 8 seconds had elapsed, immediately at a scanning speed of 5 O mv / s, 0 v ⁇ —0.2 v ⁇ + 0.2
  • the voltage was applied while changing the potential continuously in the course of v, and the current generated at that time was measured.
  • the output sensitivity based on the current with respect to the applied potential of each bay was determined.
  • the average of the 10 sensitivities was determined and shown in Table 3.
  • the output sensitivity is an integrated value (integrated current value) of the current value between the applied potential and 0.2 V ⁇ + 0.2 V.
  • This value is an index that indicates the efficiency with which the reaction displacement of the sample in the reaction section is quickly and surely taken into the electrode. Therefore, the larger the value, the more the reaction displacement is taken. In general, it is extremely important from the viewpoint of measurement accuracy that not only the reactivity between the sample component and the reaction part but also all the reaction displacements are taken into the electrode as much as possible.
  • Comparative Example 2 92 8 1 Next, 35 samples were extracted from the remaining enzyme sensor chip (random), measured using the specimen under the following conditions, the output generated for each elapsed day was measured, and the output change was determined and plotted. This is shown in the graph of FIG.
  • a CV value (%) was determined from a variation in the output of the five sensor chips measured at each of the elapsed days, and the CV value for each of the elapsed days is also shown in the graph of FIG.
  • the actual c V corresponds to Example 2
  • the ratio c V corresponds to Comparative Example 2.
  • the CV value is obtained by calculating the standard deviation value from the variation of the five sensor chips measured on each elapsed day, dividing the standard deviation value by the average current, and multiplying the value by 100.
  • Example 2 has less inter-product variation than Comparative Example 2 and has excellent long-term storage stability. Industrial applicability
  • the reaction part is formed by using the suspension reaction coating solution produced by the precipitation method, the solubility of the sensor chip reaction part in the sample is remarkably improved.
  • the measurement accuracy was greatly improved.
  • the measurement time can be reduced by improving the solubility in the sample.
  • the biosensor of the second invention even if the biosensor is stored for a longer period of time, the reactivity with the sample component is hardly changed, and the measurement can be performed with higher accuracy. As a result, production control and inventory control of the Noo sensor are also facilitated, and Has also become easier to handle. In addition, since the result of the reaction with the sample can be measured more reliably and efficiently, a more accurate biosensor can be manufactured.
  • the pyro sensor according to the present invention also has a feature in the structure of the sample suction unit. The protrusion formed on one side of the back of the storage space prevents the liquid sample from being introduced by capillary action on one side of the storage space. As in the past, there is no need to provide an exhaust port for venting gas inside the storage space as in the past, and with a very simple configuration, liquid samples can be smoothly removed without leaving air bubbles in the storage space. Can be introduced.

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Abstract

本発明は、簡便かつ迅速に高い精度で試料中の特定成分の定量分析が可能なバイオセンサ、及びその製造方法を提供する。また、本発明は、長期間の保存後においても高い精度で定量分析が可能な、即ち保存安定性に優れたバイオセンサ、及びその製造方法を提供する。電気絶縁基板（１）、該基板上に設けられた作用電極（２１）と対電極（２２）を有する電極部（２）、並びに該電極部（２）の一端に固着されてなる反応部（４）を備えたバイオセンサであって、該反応部が酸化還元酵素、電子受容体、微細結晶セルロース粉体、及び親水性セグメントと疎水性セグメントとから構成されている親水性ポリマを主成分としてなることを特徴とするバイオセンサ等に関する。　　

Description

明 細 書 ノ ォセンサとその製造方法 技術分野
本発明は、 試料中の特定成分について、 迅速かつ簡便に高い精度で定量分析が 可能なパイォセンサ及びその製造方法に関する。 背景技術
試料液中の特定成分について、 試料液の希釈や撹拌などを行うことなく簡便に 定量しうる方式として、 バイオセンサが用いられている。 従来のバイオセンサの 欠点を改良する技術については、 これまで多くの報告例がある。
例えば、 特開平 3— 2 0 2 7 6 4号公報には、 反応層に親水性高分子を添加す ることにより、 測定精度を向上させる方法が開示されている。 しかし、 特開平 3 - 2 0 2 7 6 4号公報に記載のグルコースセンサにおいて、 フェリシアン化カリ ゥムが析出するため、 得られる反応部の形状は不均一となるため、 センサの測定 精度は満足できるものではなかった。
また、 酵素と電子メディエータを反応層とする系に、 微細結晶セル口一スを共 存させる技術がある （特開 2 0 0 1— 3 1 1 7 1 2号公報)。 しかし、特開 2 0 0 1 - 3 1 1 7 1 2号公報に記載の酵素センサでは、 反応層膜厚の均一化、 センサ チップの精度向上ゃチップ個体間の性能安定ィ匕には寄与するが、 試料への溶解性 が悪いため十分に溶解、 混合するのが遅く、 結果として測定に時間がかかるとい う問題があった。その原因の一つとして、へキサシァノ鉄 (I I I)カリウムの結晶が 大きく成長し、 反応層の表面が試料と接する面積が小さいために、 分散および溶 解しにくいことが考えられる。
また、 特開 2 0 0 1—2 8 1 2 0 2号公報には、 反応層を昇華法により形成す る方法が開示されている。 しかし、 この方法では、 バイオセンサの製造過程で減 圧させる必要があるので設備などに費用がかかり、 低コストでの製造に向いてい ない。 また、 作業が繁雑になるため生産性も低いという問題点がある。 発明の開示
本発明の目的は、 簡便かつ迅速に高い精度で液体試料中の特定成分の定量分析 が可能なバイオセンサ、 及びその製造方法を提供することにある。 本発明の他の 目的は、 さらに長期間の保存後においても高い精度で定量分析が可能な、 即ち保 存安定性に優れたバイオセンサ、 及びその製造方法を提供することにある。 さら に、 本発明の他の目的は、 液体試料の保留空間部内の気体を抜く排気口を設けず とも、 保留空間部に気泡を残さず、 スムーズに液体試料を導入することができる 構成簡素なバイォセンサを提供することにある。
本発明者は、 上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、 顔料化技術を応 用した析出法を採用し、 ノィォセンサの反応部の結晶性化合物を微粒子化するこ とにより、 センサチップ反応部の試料への分散溶解性を高めて反応時間の短縮を 図れることを見出し、 さらにこれを発展させて本発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明は、下記に示すパイォセンサ（以下、 「第一発明バイォセンサ」 とも呼ぶ） 及びその製造方法を提供する。
項 1 . 電気絶縁基板（ 1 )、 該基板上に設けられた作用電極（2 1 ) と対電極 ( 2 2 ) を有する電極部（2 )、 並びに該電極部 ( 2 ) の一端に固着されてなる酸 化還元酵素、 電子受容体及び微細結晶セルロース粉体を含む反応部 (4) を備え たバイォセンサの製造方法であって、 次の (A1)〜 (C1)に記載の各工程を順次行う ことを特徴とする製造方法：
(A1)電気絶 «板（1 ) 上に作用電極 ( 1 ) と対電極 （2 ) とを平行近接して設 ける電極部 （2 ) 形成工程、
(B1)予め酸化還元酵素、電子受容体及び微細結晶セルロースの 3成分と良溶媒と からなる混合液 Aを、 貧溶媒に攪拌しながら滴下して分散液 Bを調製する反応部 用塗布液の調製工程、
(C1)前記 (A1)工程で得られた電気絶縁基板 ( 1 ) 上の電極部 ( 2 ) の一端に、 前 記 (B1)工程で得られた反応部用塗布液を塗布'乾燥して反応部 （4) を形成する 反応部形成工程。
項 2 . 電極が、 白金、 金、 パラジウム、 及びインジウムースズ酸化物からな る群から選ばれる少なくとも 1つからなる項 1に記載の製造方法。
項 3 . 項 1又は 2に記載の製造方法により製造されるバイオセンサ。
項 4. 項 3に記載のバイオセンサを用いて、 試料液中のグルコース成分、 ァ ルコール成分、 乳酸成分又は尿酸成分を測定する方法。
また、 本発明者は、 上記のイオンセンサの反応部に、 特定の親水性ポリマ成分 を共存させることにより、 優れた保存安定性を有するバイオセンサが得られるこ とを見出し、 さらにこれを発展させて本発明を完成させるに至つた。
すなわち、本発明は、下記に示すバイオセンサ（以下、 「第二発明バイオセンサ」 とも呼ぶ） 及びその製造方法を提供する。
項 5 . 電気絶縁基板（ 1 )、 該基板上に設けられた作用電極（2 1 ) と対電極 ( 2 2 ) を有する電極部（2 )、 並びに該電極部 ( 2 )の一端に固着されてなる反 応部 （4 ) を備えたバイオセンサであって、 該反応部 （4) が酸化還元酵素、 電 子受容体、 微細結晶セルロース粉体、 及び親水性セグメントと疎水性セグメント とから構成されている親水性ポリマを主成分としてなることを特徴とするバイォ センサ。
項 6 . 前記親水性ポリマが、 直鎖ォキシアルキレンセグメントとアルキル基 分枝ォキシアルキレンセグメントとからなる項 5に記載のバイオセンサ。
項 Ί . 前記親水性ポリマ中のアルキル基分枝ォキシアルキレンセグメントの 平均分子量が 1 5 0 0〜 4 0 0 0で、 全分子中の直鎖ォキシアルキレンセグメン トが 3 0〜8 0重量％である項 6に記載のバイオセンサ。
項 8 . 前記反応部 （4) が、 酸化還元酵素、 電子受容体、 微細結晶セル口一 ス、 及び親 7K性セグメントと疎水性セグメントとから構成されている親水性ポリ マを含む分散液のコ一ティングにより形成されてなる項 5〜 7のいずれか 1項に 記載のバイオセンサ。
項 9 . 次の (A2)〜 (C2)に記載の各工程を順次行うことを特徴とする項 8に記 載のバイオセンサの製造方法。
(A2)電気絶縁基板 ( 1 ) 上に、 作用電極 （2 1 ) と対電極 （2 2 ) とを平行近接 して設ける電極部 （2 ) 形成工程、
(B2)予め酸化還元酵素、電子受容体及び微細結晶セルロースの 3成分と良溶媒と からなる混合液 M aを、 該 3成分に対しては貧溶媒であるが前記親水性ポリマに 対しては良溶媒である溶媒に溶解した該親水性ポリマ溶液 P a中に攪拌しながら 滴下して分散液を調製する反応部用塗布液の調製工程、
(C2)前記 (A2)工程で得られた電気絶縁基板 (1) 上の II極部 (2) の一端に、 前 記 (B2)工程で得られた反応部用塗布液を塗布 '乾燥して反応部 (4) を形成する 反応部形成工程。
さらに、 本発明者は、 先端部において電気絶縁基板とカバーシートとがスぺー サシートにより間隔を隔てて対向配置されたバイオセンサにおいて、 液体試料の 保留空間部において、 前記スぺ一サの先端縁の片側にセンサ先端側へ突出する突 出部を形成することにより、 気泡を残さずにスムーズに液体試料を保留空間部に 導入できることを見出し、 さらにこれを発展させて本発明を完成させるに至った すなわち、本発明は、下記に示すバイオセンサ (以下、 「第三発明バイオセンサ」 とも呼ぶ） 及びその製造方法を提供する。
項 10. 先端部において電気絶縁基板 (1) とカバ一シ一ト （6) とがスぺ ーサシート (5) により間隔を隔てて対向配置され、 該基板と該カパーシートと 該スぺーサシートの先端縁とにより形成された保留空間部 （S) に、 酸化還元酵 素を含む反応部 (4) を備え、
液体試料をセンサ先端側から該保留空間部内へ毛細管現象を禾拥して導入し、 該液体試料と該反応部 （4) との酵素反応による電気化学変化を、 作用電極 （2 1) と対電極 （22) とを含む電極部 （2) で検出するバイオセンサであって、 前記保留空間部 （S) において、 前記スぺ一サシートの先端縁の片側にセンサ 先端側へ突出する突出部 (51) を形成したことを特徴とするバイオセンサ。 項 11. 前記スぺーサシートの先端縁に入隅部 （52) が形成されてなる項 10に記載のバイオセンサ。 以下、本発明を、 「第一発明バイオセンサ」、 「第二発明バイオセンサ」及び「第 三発明バイオセンサ」 に分けて詳細に説明する。
I. 第一発明バイオセンサ 第一発明バイオセンサ
本発明の第一発明ノィォセンサについて、 その一実施態様である図 1を用いて 詳細に説明する。本発明は、電気絶縁基板（1 )、該基板上に設けられた作用電極 ( 2 1 ) と対電極（2 2 ) を有する電極部（2 )、 並びに該電極部の一端に固着さ れてなる酸化還元酵素、 電子受容体及び微細結晶セルロース粉体を含む反応部 ( 4) を備えたバイオセンサの製造方法に関する。 本発明のパイォセ サは、 パ ィォセンサの反応部の形成過程において、 顔料化技術を応用した析出法を利用し ている点に特徵を有し、 これにより均一な微細結晶の反応部を構築でき、 反応部 の試料液に対する高い分散溶解性が達成される。
まず、 第一発明バイオセンサのハード部位を構成する信号変換部位の電極部 ( 2 ) から説明する。
該電極部 ( 2 ) は、 作用電極 （2 1 ) (測定電極とも呼ぶ。） と対電極 （2 2 ) (必要に応じて、参照電極も有していてもよい）とが 1対となって平行近接して、 電気絶縁基板 ( 1 ) 上に設けられている。 該基板としては、 例えば、 ポリエチレ ンテレフ夕レート (P E T) ,ポリエチレンナフタレー卜、脂肪族ユニットと芳香 族ユニットとからなる生分解性ポリエステル樹脂等のポリエステル系樹脂フィル ム、 より耐熱性、 耐薬品性、 強度等に優れるポリアミドイミドフィルム、 ポリイ ミドフィルム等のプラスチックフィルム、 セラミック等の無機系基板力挙げられ る。 その厚さは、 約 5 0〜2 0 0 m程度であればよい。
一般には、 プラスチックフィルムが用いられるが、 製造の容易さ、 耐熱性、 耐 薬品性、 強度等の特性を合わせ持つという意味から、 ポリエステル系樹脂フィル ムとポリイミドフィルムとをラミネートした 2層基板とする場合もある。
尚、 ポリエステル系樹脂フィルムの場合には、 見易さ等の点から、 酸化チタン 等を練り込み白色基板とするのが好ましい。
作用電極 （2 1 ) と対電極（2 2 ) は、 前記基板 ( 1 ) 上に、 （直接又は間接的 に） 例えば白金、 金、 パラジウム、 インジウムースズ酸化物等の良電導体によつ て形成される。 形成手段は、 ホットスタンビングによっても作れるが、 真空蒸着 又はスパッタリングによる方が微細な電極パターンを精度良く、 迅速に形成でき るので好ましい。 このスパッタリングの場合は、 該両極形成外をマスキングする ことで一挙に形成できる。
勿論、 まず該良導体による全面薄膜形成してから、 これをフォトエッチング法 によって、 相当する電極パターンにすることでも形成できる。
電極の厚さは、 前記良電導体の有する固有抵抗により異なるが、 必要以上に厚 くならないようにする。 一般には約 30〜15 Onmで良い。
電極の形状は、 基本的にはストライプ状で、 作用電極 （21) 及び対電極 (2 2) を前記基板上に平行近接配置とする。 そして反応部 (4) が設けられる該電 極先端の形状は、 一般にはストライプ状そのままであるが、 該反応部との接触面 積をより大きくするように、 例えば曲折形状にしても良い。
尚、 該電極のもう一端は、 測定装置に内蔵される電位走査部に連結される端子 となり、 一般に測定装置に着脱自在となっていてもよい。
また、 電極部 (2) の一端に設けられる反応部 (4) は、 マスクシート （3) に設けられた反応部用セル （31) 内に、 後述の 3成分混合液を塗布して形成さ れる。 反応部 (4) は、 反応部用セル （31) 内において、 作用電極 (21) と 対電極 （22) とを共に被覆するように設けられ、 該 3成分混合液が他部分に漏 れることのないように形成される。
参考までに、以上の信号変換部位の構造を概略的に図 1でもって図解しておく。 図 1において、 電気絶縁基板 (1) 上に平行に近接して設けられたストライプ状 の作用電極（21)と対電極（ 22 )を有し、該両電極の上面にマスクシ一ト（ 3 )、 電気絶縁性のスぺーサシート （5) 及びカバ一シート （6) が順に積層されてい る。 マスクシート （3) には反応部用セル （31) が設けられ、 ここに後述する 3成分からなる反応部 （4) が形成される。 該スぺーサシート （5) には、 セン ザの先端 （Rカーブ） の縁の片側に突出部 （51) が設けられ、 その根本に入隅 部 （52) が設けられている。 そして、 該スぺ一サシート （5) 上に電気絶縁性 の力パーシート （6) が被覆されている。 これにより反応部 （4) に通じる試料 吸入部 （15) が形成される。
試料の吸入量と吸入のし易さは、 試料吸入口の形状、 断面積等によって左右さ れる。 そして反応部 （4) の容積は、 マスクシート （3) の厚さと反応部用セル
(31) の面積によって決まる。 各々、 適宜変えて最適条件を決めると良い。 次に反応部 （4 ) について説明する。
該反応部 (4 ) は、 前記の通り、 酸化還元酵素、 電子受容体及び微細結晶セル ロースの 3成分を主成分として形成される膜 （或いは層） からなる。
以下個々の成分から説明する。
まず酸化還元酵素は、 液体試料と接しその中のある検査成分と選択的に酸化還 元的に反応し、 それを認識する中枢成分である。 従って少なくともこの酸化還元 酵素はなくてはならないものである。 ここで該酵素と選択的に酸化還元反応する 成分としては、 例えば、 グルコース成分、 アルコール成分、 乳酸成分、 尿酸成分 である。 勿論、 これ等の成分の全てが一種の酵素によって行われるのではなく、 これ等成分と選択的に反応する各種酵素が使用される。
例えば、 グルコースは、 グルコースォキシ夕ーゼと選択的に反応するが、 実際 の反応は水と酸素の共存のもとで行われ、 ダルコン酸と過酸化水素が生成する。 また、 アルコール値を測定する場合には、 アルコールォキシ夕一ゼ又はアルコ一 ルデヒドロゲナーゼを使用する。 また、 乳酸を測定する場合には、 乳酸ォキシ夕 ーゼ又は乳酸デヒドロゲナ一ゼを使用する。 更に尿酸を測定する場合には、 ゥリ 力一ゼを使用する。
しかしながら、 一般には前記酵素のみでは認識応答が遅く測定精度も良くない ので、 これを補うために電子受容体 （電子メデイエ一夕とも呼ぶ） を共存させる ことが行われている。 この電子受容体を共存させて用いられる代表例がダルコ一 スセンサであり、 例えば血液を検体とする血糖値の測定である。
電子受容体は、 一般には酵素の還元酸化を促進させる無機又は有機の微細粉末 状化合物である。 具体的には、 例えば、 フェリシアン化アルカリ金属塩 （特に力 リウム金属塩が好ましい）、フエ口セン又はそのアルキル置換体、 P—ベンゾキノ ン、 メチレンブルー、 β—ナフトキノン 4—スルホン酸カリウム、 フエナジンメ トサルフェート、 2、 6—ジクロロフェノールインドフエノール等が挙げられる。 就中、フェリシアン化アルカリ金属塩、フエ口セン系が有効に作用する。これは、 電子移動媒体としての働きが安定しており、 水、 アルコール類、 又はこれら混合 溶媒等の水性溶媒に良く溶けるからである。 ·
尚、 この電子受容体粉末のサイズは、 約 5〜1 0 0 mである。 前記 2成分からなる反応部でも実用レベルのセンサは得られるが、 両成分の水 溶液を前記電極部に塗布して得られるパイォセンサでは、 その使用環境等によつ て測定精度にバラツキが出やすい。 つまり、 常に一定性能を有するバイオセンサ が得がたい。 この原因は良く判らないが、 塗布後に析出形成される結晶構造に起 因するものと考えられる。
第 3成分としての微細結晶セルロースは、 前記の測定精度のバラツキを改善す る成分として添加される。このパラツキの改善の因子は種々考えられる。例えば、 電子受容体の電極への直接接触のチヤンスが少なくなるとかの要因で電極と電子 受容体間での電気化学的反応を抑制されることとか、 酵素粒子と電子受容体粒子 とをより微細に均一に分散させることとか、 また例えば血液を検体とする場合に 血漿中に微量の血球が混入されていてもこれを該セルロースが吸着してくれるこ ととか、 該セルロースがネットワークを形成することで前記 2成分の系外への飛 散が防止されるなどの因子が挙げられる。 これ等の作用因子が相乗的に働き、 そ の結果測定精度のバラツキが抑制されるものと考えられる。
ここで微細結晶セルロースは、植物繊維中の結晶部分を抽出して得た微細粒で、 その大きさは一般に直径約 1 0 m以下、 長さ 3 0 0 m以下である。 勿論この 微細結晶セルロースが主体になるが、 これに同時的に取得できる非晶セルロース 微粉末が混入されていても良い。
第一発明バイォセンサの製造方法
第一発明パイォセンサの製造方法は、 次の (A1)〜 (C1)に記載の各工程を順次行 うことを特徴とする：
(A1)電気絶縁基板 ( 1 ) 上に、 作用電極 （2 1 ) と対電極 （2 2 ) とを平行近 接して設ける電極部 （2 ) 形成工程、
(B1)予め酸ィ匕還元酵素、電子受容体及び微細結晶セルロースの 3成分と良溶媒 からなる混合液 Aを、 貧溶媒に攪拌しながら滴下して分散液 Bを調製する反応部 用塗布液の調製工程、
(C1) 前記 (A1)工程で得られた電気絶 «板 ( 1 ) 上の電極部 ( 2 ) の一端に、 前記 (B1)工程で得られた反応部用塗布液を塗布 '乾燥して反応部 （4 ) を形成す る反応部形成工程。 上記の製造方法は、 バイオセンサの反応部 (4) の形成過程 (B1)において、 顔 料化技術を応用した析出法を利用している点に特徴を有し、 これにより均一な微 細結晶の反応部を構築でき、 反応部の試料液に対する高い分散溶解性が達成され る。
まず、 （A1)の電極部形成工程について説明する。 電気絶縁基板 (1) 上に、 作 用電極 (21) と対電極 （22) とが平行近接して設けられ電極部 (2) が形成 される。
電気絶縁基板 (1) 上に電極部 (2) を形成する方法は種々の方法を採用する ことができるが、 例えば、 該基板 (1) 上に、 ホットスタンピング、 直接真空蒸 着、 スパッタリング等により電極パターンを形成する方法、 フォトエッチング法 により電極パターンを形成する方法、 或いは、 導電性材料を有する電極テープを 該基板 （1) に接着する方法などが挙げられる。
導電性材料を有する電極テープを該基板 (1) に接着する方法の具体例を下記 に示す。 薄くて支持性があり耐熱性に優れるポリイミドゃ芳香族ポリイミドなど のプラスチック電気絶縁性材料シ一ト上に、 白金、 金、 パラジウム、 インジウム ースズ酸ィ匕物などの導電性材料を蒸着あるいはスパッタリングし、 その該電気絶 緣性材料シートの裏面にエチレン酢酸ビニルなどの熱融着材料をコ一ティングす る。この多層シートを細断してテープ状にしたものを電極テープとする。そして、 上記絶縁性基板 (1) に、 この電極テープを熱接着することにより、 電極部（2) が形成される。
また、 スパッタリング等により電極パターンを形成する方法としては、 所望す る両電極形状がストライプ状である場合は、 まずスパッ夕リング用のマスキング 材として 2本のストライプ状の平行穴が打ち抜かれたマスク用板を使い、 これを ポリイミドフィルムの上面に隙間なく接する状態で固設する。 該フィルムにスパ ッ夕リングをおこない、 ストライプ状の窓穴からスパッ夕リング白金が投射され て、連続した 2本のストライプ状電極がポリイミドフィルム上に密着形成される。 電極の形成されたポリイミドフィルムを、 接着剤を介して PETフィルムにラミ ネートすることにより電極部 （2) が形成される。
或いは、 電気絶縁基板 (1) (例えば、 PETフィルム） 上に、 直接、 導電性材 料をスパッタリングして電極部 （2 ) を形成してもよい。
次に、 （B1)の反応部用塗布液の調製工程について説明する。
本発明の反応部用塗布液は、 酸化還元酵素、 電子受容体及び微細結晶セル口一 ス粉体の 3成分を含む反応試薬系からなる。 反応試薬系が、 微細結晶セルロース 粉体を含むので、 反応部作成における成膜性に優れている。 上記の 3成分は前述 したものを用いることができる。
本発明の良溶媒とは、 酸化還元酵素および電子受容体に対し溶解度の高い溶媒 であれば良く、 水又は含水溶媒の水性良溶媒が好ましい。 含水溶媒は、 水と相溶 性のあるもの、 例えばメタノール、 エタノール、 ジォキサン、 イソプロピルアル コールなどと水の混合溶液である。
本発明の反応試薬系に対する貧溶媒とは、 水に溶けて、 かつ、 酸化還元酵素お よび電子受容体の溶解度を下げる溶媒であれば良く、 アルキレンダリコールモノ アルキルエーテル、 アルキレングリコール、 プロピレンアルコール、 ブタノーレ などが挙げられ、 エチレンダルコ一ルモノエチルェ一テル (セロソルブ) が好ま しい。
上記工程 (B1)で生成する分散液 B中には、 上記 3成分の反応試薬系が一部溶け ていても良い。 具体的には、 酸化還元酵素及び電子受容体の 2成分は実質的に溶 解していてもよぐ微細結晶セルロース粉体は分散或いは懸濁状態であればよい。 上記良溶媒と貧溶媒の組合せとして、 水一エチレンダルコールモノェチルエー テルが好ましい。 また、 良溶媒と貧溶媒の量の比は、 1 : 0. 5〜10程度、 好ましく は 1 ： 1〜 3程度である。
(B1)の電極形成工程の具体例を示す。 微細結晶セルロースの水懸濁液をホモジ ナイザーで撹拌し、 これに酸化還元酵素 (グルコースォキシダ一ゼ等) 及び電子 受容体 （フェリシアン化カリウム等） を加え撹拌して混合液 Aを得る。 本発明の 1つの実施態様として、 例えば、 100%の水 100 mLに対し、 ダルコ一スォキシダ ーゼ 0. 1〜10 g、 フェリシアン化カリウム 5〜70 g、 微細結晶セルロース 1〜10 g の割合で前記混合液 Aが製造される。 貧溶媒 （エチレングリコールモノェチルェ 一テル等） を撹拌しながら、 これに該混合液 Aを滴下することにより分散液 Bが 調整される。 これを反応部用塗布液とする。 上記のいわゆる析出法による分散液 Bの調整は、 その析出する速度が大きいほ ど、 より微細な結晶が得られる。 また、 上記反応部 (4) における乾燥工程の簡 便さを考慮すると、 良溶媒及び貧溶媒の沸点がお互いに近いものを選択すること が好ましい。
最後に、 （C1)の反応部形成工程について説明する。 前記 (M)工程で得られた電 極形成板の電極部 （2) の一端に、 反応部用塗布液の所定量を滴下して塗布し、 乾燥して膜が形成される。
具体的には、 平行に近接して設けられた作用電極 （21) と対電極 （22) を 有する電気絶縁基板 (1) 上にマスクシート （3) を熱接着する。 該マスクシ一 ト （3) は、 熱融着性シートからなり、 センサチップ反応部の電極面積を規制す るような反応部用セル （31) が設けられている。 つまり、 センサの一端に該作 用電極（21) と対電極（22)の一部が見える窓ができる様に反応部用セル（3 1) が設けられている。
前記 (B1)工程で得られた 3成分からなる反応部用塗布液を塗布する部分は、 電 気絶縁基板 (1) 上のマスクシート （3) に設けられた反応部用セル （31) 内 である。 該反応部用セル （31) 内の作用電極 (21) 及び対電極 (22) の双 方を覆うように、 反応部用塗布液が塗布される。 該塗布液は、 ピペット、 ノズル 等を用いて塗布され、 オーブンなどに一定時間入れて乾燥することにより膜が形 成される。 この膜は作用電極 （1) と対電極 (2) にまたがって固着され、 反応 部 （4) として機能する。
さらに、 このマスクシート （3) 上に、 電気絶縁性のスぺーサシート （5) 及 びカバーシート （6) が順に積層されている。 該スぺーサシート （5) は、 セン ザの先端 （Rカーブ） の縁の片側に突出部 （51) が設けられ、 必要に応じその 根本に入隅部 （52) が設けられている。 この突出部 (51) を設けることによ り、 本発明のセンサが試料液と接した際、 毛細管現象を利用して保留空間部に気 泡を残さずスムーズに試料液を導入することができる。スぺーサシート（5)は、 一定の厚みを持つ両面接着シートであればよい。
そして、 該スぺーサシート （5) 上に電気絶縁性のカバーシート （6) が被覆 されている。 これにより反応部 (4)に通じる試料吸入部 (15)が形成される。 検体吸入量と吸入のし易さは、 試料吸入口の形状、 断面積等によって左右され る。そして反応部 (4 ) の容積は、マスクシート （3 ) の厚さと反応部用セル（3 1 ) の面積によって決まる。 各々、 適宜変えて最適条件を決めると良い。
なお、 該反応部は、 作用電極 （2 1 ) と対電極 （2 2 ) とにまたがって固着さ れているのが良いが、 作用電極 ( 2 1 ) と対電極 （2 2 ) とは必ずしも同等の形 状や配置に設けられていなくてもよい。
以上の (A1)〜(C1)の工程を経て所望するバイオセンサが得られるが、最後には、 バイオセンサチップとして力ット加ェして全工程が終了する。 I I. 第二発明バイオセンサ
第二発明バイオセンサ
本発明の第二発明バイオセンサについて、 その一実施態様である図 7〜 9を用 いて詳細に説明する。第二発明バイオセンサは、電気絶縁基板（1 )、 該基板上に 設けられた作用電極 （2 1 ) と対電極 ( 2 2 ) を有する電極、 並びに該電極の一 端に固着されてなる反応部 ( 4) を備えたバイオセンサであって、 該反応部が酸 化還元酵素、 電子受容体、 微細結晶セルロース粉体、 及び親水性セグメントと疎 水性セグメントとから構成されている親水性ポリマを主成分としてなることを特 徵としている。
本発明のハード部位を構成する信号変換部位の電極部 （2 ) については、 前記 の 「1. 第一発明バイオセンサ」 の 「電極部 （2 )」 の記載と同様である。
次に反応部 （4) について説明する。
該反応部 ( 4) は、 前記の通り、 酸化還元酵素と電子受容体と微細結晶セル口 ースと親水性セグメントと疎水性セグメントとにより構成されている親水性ポリ マとの 4成分を主成分として形成される膜 （或いは層） である。
該反応部 ( 4) を構成する酸化還元酵素、 電子受容体及び微細結晶セルロース の 3成分については、 前記の 「1. 第一発明バイオセンサ」 の 「反応咅! 5 (4)」 の 記載と同様である。
第一発明バイオセンサでは、 上記 3成分による反応部を採用しており、 パラッ キも大きく改善され、高い精度で試料中の成分を測定することができる。しかし， 実際に使用する段階に至っては、 更なる種々の事前チェックが行われるため、 そ の中で次のような点で更なる改良の余地があつた。
それは、 製造直後は高い精度で測定が可能であるが、 製造してからユーザが実 用するまでの期間が長い場合、 測定値が低下する傾向がみられ正確な測定に難点 があった。 つまり反応部の反応性に経時的な劣化が見られるため、 長期間の保存 安定性についてさらなる改善の余地があった。 また、 検体中に有する成分量 （絶 対値） と実測値との差を更に近づけ、 測定精度をさらに高める必要性もあった。 このような、 第一発明バイオセンサに残された課題を解決するために、 第一発 明バイオセンサの反応部に第 4成分として、 前記の 「親水性セグメントと疎水性 セグメントとをもって構成されている親水性ポリマ」 を添加することが有効であ ることが見出された。 従って、 該ポリマは、 前記 3成分と該親水性ポリマの組合 せでのみ大きな作用効果をもたらすものであり、 該 3成分中の例えば微細結晶セ ルロースが欠けても、 他の成分に置換されても、 本発明でいう課題は解決される ものではない。
前記 3成分の中に、 更に該ポリマを混在させることが有効である理由は明確で はないが、 次のような作用効果によることが推察される。
つまりこの 4成分により、 前記 3成分による反応部 （4) よりも均一な微細な 粒子が形成され、 しかも該ポリマが 3成分を相互に緻密に繋いだ状態の反応部
( 4) が形成されるからと考えられる。 これにより、 以後の反応部内部の状態の 変化が小さくなり外部環境 （特に乾燥環境） に対しての影響もより小さくなるた め、 本発明のバイオセンサは高い経時的安定性を発揮する。 また、 反応部 （4) の粒子が微細であり成分相互が緻密に繋がれているため、 検体成分との反応がよ り迅速かつ定量的に進行し、 高い測定精度が発揮される。
本第二発明バイオセンサは、 基本的には第一発明バイオセンサの構造を有して おり、 反応部 （4) において上記の 4成分系を採用する点で相違する。
前記親水性ポリマとしては、 例えば次の内容のポリマである。 まず親水性とい う意味は、 水又は水に溶解する少なくとも水酸基結合の脂肪族アルコール又はこ れ等の混合溶媒に対して、 溶解又は水和して膨潤する性質をいう。
具体的には、 例えば、 ポリアクリル酸系のアルカリ金属塩又はポリアクリル酸 系のアルカノ一ルァミン塩とか、 ポリオキシアルキレン系等が挙げられる。 就中 ポリオキシアルキレン系が好ましい。 このものとしては、 例えば高級脂肪族基 ( 疎水性） を一末端に有するポリオキシエチレンアルキル （親水性） ェ一テル、 ポ リエチレングリコール （親水性） の高級脂肪酸エステル （疎水性） 、 直鎖ォキシ アルキレンセグメント (親水性) とアルキル基分枝ォキシアルキレンセグメント (疎水性） とからなるポリマ等が挙げられるが、 就中後者の直鎖ォキシアルキレ ンセグメン卜とアルキル基分枝ォキシアルキレンセグメントとからなる親水性ポ リマ （以下これを 「Aポリマ」 と呼ぶ。 ) がより好ましい。
これらの親水性ポリマを採用することにより、 前記の親水性ポリマ混在の作用 効果 （高い経時的安定性、 高い測定精度等） をより一層大きなものとする。 また 、 親水性ポリマがより明確な両性を有することで、 例えば項 9に記載するパイォ センサの製造中、 特に (B2)の反応部用塗布液の調製工程を有効に行うことができ るため、 前記の作用効果を促進できる。 さらに、 前記電極基板と反応部用塗布液 の間が親和的になるためコーティングもし易く、 各シートの密着性も向上する。 従って、 親水性ポリマのうち、 全くの親水性セグメントだけの場合や、 疎水性 セグメントだけの場合では、 高いレベルでの前記の長期間保存安定性等の効果は 得がたい。
前記 Aポリマにおいて、 親水性を発現する直鎖ォキシアルキレンセグメントと 疎水性を発現するアルキル基分枝ォキシアルキレンセグメントの結合は、 例えば ランダムか、 交互に規則的に結合 （ブロック構造） していてもよいが、 後者のブ ロック構造であるのがより好ましい。 これは該ュニット間の分子量のコント口一 ルが容易で、 それによる親水性と疎水性の程度も明確かつ容易に変更することが できるからである。
この Aポリマの両性のバランスは、 各フラグメントの分子量と含有量とで制御 することもでき、 本発明では、 項 7で規定するものが好ましい。 つまり、 この親 水性ポリマ中のアルキル基分枝ォキシアルキレンセグメントを平均分子量でいい 、 直鎖ォキシアルキレンセグメントを重量％でいう。 具体的には、 前者は好まし くは 1 5 0 0〜4 0 0 0、 より好ましくは 2 0 0 0〜3 0 0 0、 後者は好ましく は 3 0〜8 0重量％、 より好ましくは 4 0 ~ 7 0重量％ある。 かかる親水性ポリマを用いると、 形成される反応部 (4 ) の表面がベトツキ感 ない状態で形成されると共に、 乾燥環境に置かれてもその反応部が異常に乾燥し た状態に変化したり、 その結果反応部の作用に悪影響をもたらすといった危険性 もなくなる。 つまりより優れた保存安定性能が付与される。
尚、 前記直鎖ォキシアルキレンセグメントを形成するモノマ成分は、 例えばェ チレンォキサイド、 1、 3—プロピレンォキサイド、 1 , 4ーブチレンォキサイ ド等の直鎖アルキレンォキサイドの開環重合ポリマユニッ卜であり、 そして疎水 性を発現するアルキル基分枝ォキシアルキレンセグメントを形成するモノマ成分 は、 メチルエチレンォキサイド、 ェチルエチレンォキサイド等のアルキル基が分 枝 （側鎖） しているアルキレンオキサイドの開環重合ポリマユニットである。 基本的には前記 4成分を主として組成すれば良いが、 その場合、 各々の組成割 合を次のようにするのがより有効である。酸化還元酵素 0 . 1〜1 0重量％、好ま しくは 0 . 3〜6重量％、 電子受容体 2 0〜9 0重量％、 好ましくは 3 5〜8 6 重量％、 微細結晶セル口一ス 1〜3 0重量％、 好ましくは 3〜2 0重量％、 親水 性ポリマ 2〜4 0重量％、 好ましくは 5〜3 0重量％である。
第二発明バイォセンサの製造方法
本発明のバイオセンサは、 前記 4成分を主成分とする反応部 （4 ) を有するこ とを特徴としており、 該反応部 （4 ) と他の構成が相乗的に作用しあって初めて 前記の大きな改善効果 （高い経時的安定性、 高い測定精度等） が奏される。 これ も如何なる製造手段を採っても全く同じレベルで得られるとは限らない。 特に、 一定以上の高い性能を有する該バイオセンサを効率的に製造できる方法として、 項 9で提供される製造方法が挙げられる。
具体的には、 次の (A2)〜 (C2)に記載の各工程を順次行うことを特徴とするバイ ォセンサの製造方法である。
(A2)電気絶縁基板 ( 1 ) 上に、 作用電極 （2 1 ) と対電極 （2 2 ) とを平行近接 して設ける電極部 （2 ) 形成工程、
(B2)予め酸化還元酵素、電子受容体及び微細結晶セルロースの 3成分と ^1 と からなる混合液 M aを、 該 3成分に対しては貧溶媒であるが前記親水性ポリマに 対しては良溶媒である水性溶媒に溶解した該親水性ポリマ溶液 P a中に攪拌しな がら滴下して分散液を調製する反応部用塗布液の調製工程、
(C2)前記 (A2)工程で得られた電気絶縁基板 (1)上の電極部の一端に、 前記 (B2) 工程で得られた反応部用塗布液を塗布'乾燥して反応部 （4) を形成する反応部 形成工程。
上記の製造方法は、 各種考えられる方法の中で、 特に項 8で提供する反応部を 形成するためにコーティングする塗布液が、 分散液 （又は懸濁液） の状態にある 点に特徵を有している。
まず、 （A2)の電極形成工程は、 電気絶縁基板 (1) 上に作用電極 (21) と対 電極 （22) とを平行近接して設ける工程である。 電気絶縁基板 (1) 上に電極 部 （2) を形成する方法は種々の方法を採用することができるが、 例えば、 該基 板 （1) 上に、 ホットスタンビング、 直接真空蒸着、 スパッタリング等により電 極パターンを形成する方法、 フォトエッチング法により電極パターンを形成する 方法、 或いは、 導電性材料を有する電極テープを該基板 (1) に接着する方法な どが挙げられる。
導電性材料を有する電極テープを該基板 (1) に接着する方法の具体例を下記 に示す。 薄くて支持性があり耐熱性に優れるポリイミドゃ芳香族ポリイミドなど のプラスチック電気絶縁性材料シート上に、 白金、 金、 パラジウム、 インジウム ースズ酸化物などの導電性材料を蒸着あるいはスパッタリングし、 その該電気絶 縁性材料シートの裏面にエチレン酢酸ビニルなどの熱融着材料をコーティングす る。この多層シ一卜を細断してテープ状にしたものを電極テープとする。そして、 上記絶縁性基板 (1) に、 この電極テープを熱接着することにより、 電極部 (2) が形成される。
また、 基板 （1) として 2層基板を採用しその上に電極部 (2) を設けること も好ましい態様として例示できる。 該基板として好ましいのは、 前記例示する中 で、 ポリエステル系樹脂フィルムとポリイミドフィルムをラミネートした 2層基 板である。 この場合について説明することにする。
ポリエステル系樹脂フィルムとしては、 例えば、 PET フィルムが挙げられ、 そ の厚さとしては一般に 70〜150 m程度である。 なお、 該ポリエステル系樹 脂フィルムは、 それ自身で基体として使用することもできる。 本発明では、 ポリ エステル系樹脂フィルムに積層するポリイミドフィルムとしては、 一般に厚さ 2 0〜5 0 m程度の （薄い） 芳香族ポリイミドフィルム （以下 P Iフィルム） が 用いられる。
この方法によれば、 予め P Iフィルム上に前記両電極を形成しておき、 接着剤 を介して該 P Iフィルムの裏面と P E Tフィルムをラミネートする。 これにより 一挙に 2層基板と共に、 電極の形成も終了する。 そして耐熱、 耐薬品性、 各種物 性に卓越した電極板にもなるというものである。
予め P Iフィルムに該電極を形成しておき、 これを P E Tフィルムにラミネー トする理由は次による。 P Iフィルムは強靭で高耐熱性があり、 より薄いフィル ムを大量にロール巻きで使用することができ、 且つ形成される電極の密着性にも 優れていることにより、 スパッタリング法による電極形成に好適に用いられる。 つまり、 より長尺の該フィルムが、 ロール対ロールでより長時間連続供給でき、 生産性の高い、 高品質の電極板が得られ易いからである。
前記スパッタリング法で使用する良電導体としては、 高純度の白金が好ましく 使用される。 この場合のスパッタリング条件は、 アルゴン雰囲気下、 真空度 1 .
3〜 1 . 3 X 1 0 2 P a程度、 投入電力 0 . 2〜 3 kW程度、 スパッ夕リング速度
0 . 2〜3 . 0 m/分程度である。
マスキングによる電極形成は次のようにして行う。 例えば、 所望する両電極形 状がストライプ状である場合は、 まずマスキング材として 2本のストライプ状の 平行穴が打ち抜かれたマスク用板を使い、 これを連続供給される P Iフィルムの 上面に隙間なく接する状態で固設しておく。 前記の速度で該フィルムの供給と同 時的にスパッタリングをスタートする。 抜いたス卜ライプ状の窓穴から、 スパッ 夕リング白金が投射されて、連続した 2本のストライプ状電極力 S密着形成される。 ロール対ロールで供給され巻き取られる。
尚、 一回のスパッタリングでは所定厚さの電極が得られない場合は、 巻き戻し つつ更にスパッタリングを繰り返せばよい。
前記電極の形成された P Iフィルムは、 P E Tフィルムに接着剤を介してラミ ネートする。 そして、 図 7で説明する試料吸入部 （1 5 ) と反応部 (4) とが形 成されるように、 突出部 （5 1 ) を設けたスぺ一サシート （5 ) と外面カバーシ ート （6 ) とを順次接着剤を介して接着積層する。 勿論、 この外面カバーシート ( 6 ) は、 （C2)工程を経た後に、 バイオセンサの他端に設けられた端子部分は残 して被覆される。
次に、 （B2)工程の反応部用塗布液が調製される。 該ェ程では、 まず酸化還元酵 素、 電子受容体及び微細結晶セルロースの 3成分を前記組成比以内で良溶媒中に 添加して、 混合液 M aが調製される。
ここで良溶媒とは、 該 3成分が溶解或いは分散 （懸濁） する水を含む溶媒をい うが、 具体的には水又は水と混和する低級 1価脂肪族アルコール （せいぜい C 3 迄のアルコール等） との混合液が例示できる。 なお、 該 3成分のうち、 酸化還元 酵素及び電子受容体は、 該良溶媒に実質的に溶解しているが、 微細結晶セル口一 スは分散状態或いは懸濁状態であればよい。
混合液 M aの調製方法は、 3成分を該良溶媒に同時に添加し、 常温で攪拌すれ ばよい。 或いは、 まず微細結晶セル口一スを水 （蒸留水） に懸濁させておき （約 4〜 7重量％程度の低濃度としホモジナイザーを使って懸濁するのが良い）、この 中に残り 2成分を添加し撹拌するという逐次的方法も採用できる。
一方、 別途親水性ポリマの溶液 P aが調製される。 溶液 P aに使う溶媒は、 親 水性ポリマ自身に対しては略完全に溶解する溶媒 （良溶媒） であるが、 前記 3成 分に対しては難溶ないし実質的に不溶性である溶媒（貧溶媒）である溶媒（以下、 「特定溶媒」 とも呼ぶ） である。
この 「特定溶媒」 としては、 例えば、 C 4以上の 1価脂肪族アルコール、 2〜 3価の高級脂肪族多価アルコール又は該多価アルコールの水酸基の少なくとも 1 個がアルキル基置換された多価アルコールが挙げられる。 この中でも、 1個の水 酸基をアルキル基置換した 2価の脂肪族アルコールが好ましく、 具体的には例え ばエチレングリコールのモノメチル又はモノェチルェ一テルである。 勿論、 溶解 性や分散性をコントロールする意味で、 これ等有機溶媒の中で 2種以上を混合し て調整することもできる。
そして前記 3成分溶解の水性混合液 M aが、 前記親水性ポリマ溶液 P a中に攪 拌の下で滴下される。 この攪拌も余り激しくするのではなく、 静かに行い、 そし て滴下も、 一定量を一定時間要してゆっくりと滴下するようにするのが良い。 こ れにより、 粒径が均一で微細な結晶粒子の生成が可能となる。 このような特別な 混合手段は、 特に反応部用塗布液を調製するのに有効である。
或いは、 水性混合液 M aの中に、 予め 3成分に加え親水性ポリマも混合させて おいて、 上記の 「特定溶媒」 のみを滴下混合しても良い。 或いは、 該水性溶液 M aの中に親水性ポリマ溶液 P aを滴下混合するという手順を採っても良い。 しか しながら、 前記 (B2)工程の手順の方がより好ましい反応部 (4) を形成すること ができる。
本発明では、 4成分からなる反応部用塗布液が分散液である点に特徴を有して いる。 本来前記 3成分は結晶性の微粉体であることから、 塗布後乾燥して膜を形 成した時点では、 各々元の結晶粒子になって混合分散している。 しかし、 各粒子 の大きさは大小様々で不均一で混合分散されているため、 これが各成分の相互間 の繋がりを悪くし、 経時的安定性が劣る原因になっている。
しかしながら、 4成分からなる反応部用塗布液は、 「水性溶媒」 を含む親水性ポ リマ中で析出させた分散液 （懸濁液） の状態である。 しかも、 この分散 （懸濁） 状態にある粒子が、 同じような粒径で、 且つ超微細粒になっている。 このような 塗布液が塗布'乾燥されて反応部 （4) として形成されると、 この粒子は親水性 ポリマを介して分散状態が維持される。 このような状態で形成される該反応部で は、 検体との反応も迅速で、 且つ周囲の環境等にも影響されることなく長期間安 定を保ち続ける。
次の（C2)の反応部形成工程では、 前記 (B2)工程で得られた電極形成板の電極部
( 2 ) の一端に、 反応部用塗布液の所定量を滴下して塗布し、 乾燥して膜が形成 される。 この膜は作用電極 （2 1 ) と対電極 （2 2 ) にまたがって固着され、 反 応部 （4 ) として機能する。
具体的には、 前記 「1 . 第一発明バイオセンサ」 の 「(C1)の反応部形成工程」 と同様にして実施される。
以上の (A2)〜 (C2)の工程を経て所望するバイォセンサが得られるが、最後には、 バイォセンサチップとして力ット加工して全工程が終了する。
かくして得られる本発明の第一発明パイォセンサ及び第二発明パイォセンサは、 各種試料液中の特定成分の定量に用いられる。 具体的には、 試料液中のダルコ一 ス成分、 アルコール成分、 乳酸成分又は尿酸成分などが、 バラツキ無く高精度に 測定される。 いずれも、 公知のバイオセンサの測定方法を用いることができる。 特に、 試料液中のグルコース成分を測定する場合は、 実施例 3に記載の方法を用 いて好適に測定される。
III. 第三発明バイオセンサ
上記において、 バイオセンサの反応部 (4) に特徴を有する第一発明及び第二 発明バイオセンサについて詳述した。 次に、 図 7〜図 9を参照しながら、 ノ ォ センサの液体試料吸入部の形状に特徴を有する第三発明バイオセンサについて詳 細に説明する。 なお、 第三発明バイオセンサの反応部 (4) は、 前記の第一発明 パイォセンサ又は第二発明バイォセンサで記載した組成を採用してもよい。 図 7及び図 8において、 本実施形態の電気絶縁基板 (1) は、 長板形状に形成 され、 その先端部は略半円形状に形成されている。 上記基板 (1) 上に配設され た電極部 （2) は、 基板 （1) の長手方向に沿って略平行に配設された作用電極 (21) と対電極 （22) とから構成されている。 本実施形態では、 所定のポリ イミドフィルムに白金膜をスパッタリング蒸着した 2本の電極フィルムを、 0. 5 mm程度の間隔で基板 (1) 上に接着剤で貼着して電極部 （2) を構成してい る。
上記電極部 (2) を部分的に被覆するために基板 (1) 上に積層された電気絶 縁性のマスクシート (3) である。 このマスクシート (3) は、 略半円形状を成 す先端部側に略長円形状 （或いは長方形状） の反応部用セル （窓） （31) を備 え、 この反応部用セル （31) により電極部 (2) の先端側を露出させている。 また、 マスクシート （3) は、 基板 (1) の後端側には積層されておらず、 電極 部 （2) の後端側を露出させている。 こうして、 電極部 （2) の先端側の露出部 分が次述する反応部 (4) と液体試料との酵素反応による電気化学変化を検出す るための検出部とされ、 また、 電極部 (2) の後端側の露出部分が測定装置に接 続するための接続端子とされている。 本実施形態では、 先端部が略半円形状を成 すホットメルトフィルムを、 マスクシート (3) として基板 (1) 上に熱圧着し て積層している。 上記マスクシート （3) の反応部用セル （31) 内において電極部 （2) の検 出部上に配設された反応部 （4) は、 測定すべき液体試料の特定成分と反応する 酵素と、 酵素反応時の電子を授与する電子授与体とから構成されている。 反応部 (4) の構成は前述した通りである。
上記マスクシート （3) の先端の略半円形状部分を除いてマスクシート （3) 上に配設された電気絶縁性スぺ一サシート （5) の先端縁には、 その幅方向の片 側にセンサ先端側へ突出する突出部 （51) が形成されており、 突出部 （51) の根本部分に入隅部 （52) が形成されている。 本実施形態では、 両面に粘着層 を備えた PET系フィルムを、 スぺ一サシート (5) としてマスクシ一卜 (3) 上に積層している。
上記スぺーサシート （5) 上に配設された電気絶縁性カバーシート （6) の先 端部は、 上記基板 (1) の先端部よりも若干小さな略半円形状に形成されている 。 このカバーシ一ト （6) の半円形状部分において、 カバーシート （6) と基板 (1) とがスぺ一サシート （5) により所定間隔を隔てて対向配置されている。 このことにより、 センサ先端側において、 基板 （1) 上のマスクシ一ト （3) 及 び反応咅 15 (4) の上面と、 カバ一シート （6) の下面と、 スぺ一サシート （5) の先端縁とによって囲んだ保留空間部 Sが形成されている。 本実施形態では、 透 明の PET系フィルムを、 カバーシート （6) として、 スぺーサシート （5) の 上面に積層している。
以上のように構成されたバイオセンサ （10) を用いて液体試料を測定すると きは、 まず、 バイオセンサ （10) をその後端部で測定装置に取り付けた後、 測 定すべき液体試料をバイオセンサ （10) の先端の試料吸入部 （15) に接触さ せ、 液体試料を毛細管現象を利用して保留空間部 (S) 内へ導入する。 そして、 保留空間部 （S) 内で液体試料の特定成分と反応部 （4) とを酵素反応させ、 そ の際の電気化学変化を電極部 (2) で検出して液体試料中の特定成分を測定装置 で測定する。
このバイオセンサ （10) は、 スぺ一サシート （5) の先端縁の片側に突出部 (51) を形成しているので、 毛細管現象によりセンサ先端の試料吸入部 （15 ) 力^流入した液体試料を、 最初に突出部 （51) に接触させることができる。 そして、 突出部 （51) のぬれ性を利用して突出部 （51) で、 毛細管現象によ る液体試料の導入を促進させることができる。 したがって、 図 9に示すように、 センサ先端の試料吸入部 （15) 側から流入した液体試料の前縁 Fが突出部 （5 1) に接触した後は、 この液体試料を突出部 （51) の側面に沿わせて片側から 優先的に流入させることができ、 保留空間部 （S) の気体を突出部 （51) の反 対側へ排出しながら （図 3中の矢印。参照） 、 液体試料を保留空間部 （S) の全 体にスム一ズに導入することができる。
しかも、 気体が突出部 （51) の反対側へ排出される際には、 この排出気流 C によって、 液体試料が突出部 （51) 以外の部分においてもスぺーサシ一ト （5 ) と接触してしまい気泡を作ってしまうのを防ぐことができ、 保留空間部 Sに決 して気泡を残すことなく液体試料を導入することができるのである。
更にまた、 バイオセンサ （10) は、 突出部 （51) の導入促進作用により突 出部 （51) に沿わせて片側から液体試料を導入できるので、 保留空間部 （S) の奥部のスぺ一サシ一ト （5) に入隅部 （52) が形成されていても、 この入隅 部 （52) に気泡を残すことがない。 したがって、 バイオセンサ (10) によれ ば、 従来のように、 気泡残存のため入隅部の形成が制限されることもなぐ 入隅 部の形成により容易に保留空間部 Sの容量拡大を図ることができる。
更にまた、 バイオセンサ （10) は、 センサ先端の試料吸入部 （15) 側へ突 出する突出部 （51) によってカバ一シート （6) を支えることができるので、 基板 （1) とカバーシート （6) との設定間隔を安定的に維持することができる 。 したがって、 例えば、 温度変化や外力等によりカバーシート （6) 等が変形し てしまうのを防ぐことができ、 液体試料を規定量どおりに保留空間部 （S) へ導 入することができ、 測定誤差の少ない正確な測定が可能となる。 図面の簡単な説明
図 1は、 センサチップ構成の一例を示す図である。
図 2は、 実施例 1及び比較例 1の反応部断面の模式図である。
図 3は、 比較例 1における反応部表面状態の電子顕微鏡写真のコピーを示す。 図 4は、 実施例 1における反応部表面状態の電子顕微鏡写真のコピーを示す。 図 5は、 実施例 1および比較例 1におけるファラデー電流値の比較を表す図で ある。
図 6は、 実施例 1および比較例 1におけるセンサ出力の比較を表す図である。 図 7は、 本発明のバイオセンサの実施形態を示す図であり、 同図 （a) は平面 図であり、 同図 （b ) は A— A線断面図である。
図 8は、 本発明のバイオセンサの分解斜視図である。
図 9は、 本発明のバイォセンサの保留空間部へ液体試料を導入する際の導入過 程を説明する部分平面図である。
図 1 0は、 酵素センサの経過日に対する出力変ィ匕と C V値とを示すグラフであ る。 発明を実施するための最良の形態
以下、 比較例と共に実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、 本発明は これら実施例に限定されるものではない。
I . 第一発明バイオセンサ
まず、 実施例における測定原理を説明する。
実施例における測定系は、使い捨てのセンサチップと測定機本体から構成され、 酵素電極法を用いた。
本測定の反応は下記の式で表される。 グルコース + Fe(CN) GOD ，ダルコノラクトン + 2H+ + Fe{CN)t Fe{CN)t 囊 >
Figure imgf000025_0001
+e~ 血液中のグルコースがグルコース酸化酵素 (GOD)によって酸化されダルコノラク トンが生成する。 このとき受容体であるへキサシァノ鉄（I I I)カリウム （フエ リシアン化カリウム） は還元され、 へキサシァノ鉄 (I I) (フエロシアン化)ィォ ンが生成する。 フエロシアン化イオンは通電された白金電極近傍でフェリシァン 化イオンに酸ィ匕され、 電子が発生する。 この発生電子を電流値とし、 グルコース 濃度に換算する。
実施例 1 (a)センサ構造部材の準備
ポリイミドシート上に白金をスパッタリングした。 該ポリイミドシートの裏面 に熱融着材料であるエチレン酢酸ビニル （E VA) をコーティングした。 該多層 シートを細断しテープ状にした。 これを白金電極テープとする。 ポリエステル系 のホットメルト接着剤シートに、 センサチップ反応部の電極面積を規制するよう な空孔 （反応部用セル） を打ち抜いてマスクシートとした。 絶縁性材料である白 色 P E Tシートに白金電極テ一プ、 マスクシートを熱接着した。 P E T層 （厚さ 100 nm) の両面にアクリル系粘着剤層 （厚さ 25 ffl) を持つ両面粘着性シートに 試料吸入室を設けるような空孔を打ち抜いてスぺーサシートを作った。
(b)反応部用塗布液の調製
セォラスクリーム （旭化成製セォラスクリーム FP- 03、 結晶セルロース 1 0重 量％) 100 gを蒸留水 150 gに加え、ホモジナイザ一で 10000卬111、 15分間撹拌した。 これをセォラスクリーム希釈液とする。
グルコースォキシダーゼ (東洋紡績製、活性 165ユニット (u)/mg) 2. 44 g及びフエ リシアン化カリウム (ナカライテスク製、 特級） 0 gを上記セォラスクリーム希 釈液に加え、 マグネッチックスターラにて 500 rpm、 15分間撹拌した。 これを A液 とする。
エチレングリコールモノェチルエーテル （ナカライテスク製、 特級） iOO mLを マグネッチックスターラで 500 rpmで撹拌しながら、 上記 A液 100虬を静かに滴下 する。 A液全量を滴下してから 5分間撹拌した。 これを B液とする。 このようにし て得られた B液を反応部用塗布液とする。
(c)反応部用塗布液の塗布乾燥
(a)の電極テープおよびマスクシートを貼りあわせたベ一スシート上のマスク シート反応部用セルに、ピペットを用いて、（b)で得られた反応部用塗布液を 1 l 塗布した。
上記ベースシートを 10分間オーブンに入れ乾燥させる。 乾燥後、 反応部が形成 された。
(d)センサチップ形成
(c)で得られたベースシート上に、 （a)で得られたスぺ一サシート、 カバ一シ一 トの順に貼りあわせた。 センサチップ形状に打ち抜いて、 センサチップを 10個形 成した。 その反応部表面状態の電子顕微鏡写真を図 4に示す。 また、 図 4で表さ れる反応部断面の模式図を、 図 2 ( b) に示す。
(e)測定
上記 (d)で得られたセンサチップを用いて、 次のような測定を行った。
センサチップの反応部がサンプル液に溶解したとき流れる誘導電流を測定し、 センサチップの溶解性を評価した。 つまり、 10個のセンサチップについてファラ デ一電流値を測定し、溶解性を評価したところ、平均 160. 1だった（表 1、図 5 )。 また、 センサ出力を調べたところ、 測定時間 （20秒） でのダルコ一ス濃度 100 mg/dLにおける出力感度は 154. 7だった （表 2、 図 6 )。
センサチップ個体間の出力ばらつきについて測定したところ、 CV値は 3 %であつ た （表 2、 図 6 )。 ここでいう CV値は、 （センサ出力の標準偏差値 Zセンサ出力の 平均値） X 1 0 0の値である。
比較例 1
実施例 1と同様に溶液 Aを作った。この溶液 Aを反応部塗布液とすること以外は、 実施例 1と同様にセンサチップを 10個形成した。その反応部表面状態の電子顕微鏡 写真を図 3に示す。 また、 図 3で表される反応部断面の模式図を、 図 2 ( a) に 示す。
実施例 1と同様に、 ファラデー電流値を測定することにより、 10個のセンサチ ップについて溶解性を評価したところ、 平均 17. 6だった （表 1、 図 5 )。
測定時間 30秒でのグルコース濃度 100 mg/dLにおける出力感度は、 99. 2だった (表 2、 図 6 )。
センサチップ個体間の出力ばらつきについて測定したところ、 CV値は 10%であ つた （表 2、 図 6 )。
図 5を見て分かるように、 実施例 1のセンサチップは、 比較例 1のセンサチッ プに比べ、 反応部の溶解度が非常に大きい。
また、 図 6を見て分かるように、 実施例 1におけるセンサチップは、 比較例 1 のものに比べセンサ出力がより大きく、 より信頼性の高レ ^センサチップであるこ とが分かる。 また、 実施例 1におけるセンサチップにおける出力のばらつきは、 比較例 1のものよりも小さかった。
表 1 ファラデー電流値の比較
Figure imgf000028_0001
表 2 センサ出力の比較
Figure imgf000029_0001
II. 第二発明バイオセンサ
ここでの実施例は、本パイォセンサの製造方法の好ましい形態として提供する、 項 9の記載に従って具体的に説明することにする。
実施例 2
まず (A2)の電極形成工程は、 次の内容で実施した。
次のような仕様で、 図 7に示す構造の 100個の酵素センサを作製した。
つまり厚さ 25 mのポリイミドフィルム上に、 厚さ 0.06 um、 大きさ 1 X 35mm, 間隔 lmmで、 作用電極 （21) と対電極 （22) とを白金のスパ ッタリングにより形成し、 これを厚さ 250 mの白色 PETフィルム （1) に 接着剤でラミネートして積層した。 次に、 この両電極形成面に一端は端子 （21 a、 22 a) として残し、 もう一端は両極にまたがる大きさの長方形の窓 （反応 部用セル （3 1)) (1.5 X 5mm) (反応部 (4) となる部屋） 及びこの窓に通 じる検体吸入路用の試料吸入部 （1 5) を設けた、 厚さ 10 O mの PETフィ ルム （電気絶縁スぺ一サシート （5)) を接着剤を介して積層した。
一方 (B2)の反応部用塗布液の調製工程は、 次の内容で実施した。
まず使用した 4主成分は次のものであった。
き酸化還元酵素 · ·グルコースォキシタ一ゼ (東洋紡績株式会社製 活性 16 5 ユニット （u) /mg) 2. 44 g (以下実験酵素と呼ぶ。）
暴電子受容体- ·純フェリシアン化カリウム （株式会社ナカライテスク製） 40 g (以下実験電受体と呼ぶ。）
き微細結晶セルロース懸濁液' 'セォラスクリーム （旭化成工業株式会社製 F P— 03で結晶セルロース 1 0重量％) 100 gと 1 5 Omlの蒸留水との懸濁 液 （以下実験セルロース液と呼ぶ。）
參親水性ポリマ溶液' ·酸化ェチレンと酸化プロピレンによるブロックポリマで、 ォキシプロピレングリコールュニットの平均分子量約 2050、 全分子中の酸ィ匕 エチレン含量約 50重量％ょりなり、 外観 (20°C) はペースト状。 該ポリマの 7. 5 gを 1 0 Om lのエチレンダリコ一ルモノェチルエーテルに均一溶解した もの （以下実験親水性ポリマ溶液 P aと呼ぶ。）
そして前記の実験酵素と実験電受体とを、 実験セルロース液に添加し 3成分の 混合液をえた。 これを混合液 M aと呼ぶ。
次に攪拌状態にある前記実験親水性ポリマ溶液 P a中に、 混合液 Maを静かに 滴下し、 全量滴下終了したらそのまま 5分間攪拌を続けて停止した。 全体は微粒 子の析出で懸濁状の水性液に変化した。 以下これを反応部用塗布液とする。 最後に (C2)の反応部形成工程に移り、 反応部 （4) を形成し、 所望する 100 個のバイォセンサに仕上げた。
つまり前記 (A2)工程で得た白金電極形成板に設けた長方形の反応部用セル （ 3 1) に、 上記の反応部用塗布液をピペットで 1 Lをゆっくりと滴下し、 乾燥し て反応部膜 （該膜面はべトツキはない） を固着した。 最後にこの上を PETフィ ルムで前記端子 （2 1 a、 22 a) を残して、 接着剤 （反応部と試薬吸入部に相 当する部分には使用せず） で外面カバーシ一卜 （6) を貼着積層し、 チップ状に カットして所望する 1 0 0個の酵素センサチップを得た。
比較例 2
実施例 2において、親水性ポリマを使用しない以外は全く同一条件で実施した。 つまり、 まず比較用の反応部用塗布液（外観上は実施例 2と同じ状態の水性液） を調製し、 これを白金電極形成板の反応部用セル （3 1 ) に塗布して反応部膜と なし、 1 0 0個の比較用の酵素センサチップを得た。
実施例 3
実施例 2、 比較例 2で得た各酵素センサチップ 2 0個 （ランダム抜取り） を用 いて、 その両端子 （2 1 a、 2 2 a) を酵素センサ測定器に連結して、 次の条件 で各走査電位に対する電流を測定した。
まず検体として濃度 1 0 O mg/d Lのグルコース水溶液を使用した。各酵素セ ンサチップは、 5日間保存した 1 0個と 4 0日間保存した 1 0個を使用した。 そ して各 1 0個の該チップの吸入口から該検体 5 Lを注入し 8秒経過したら、 直 ちに走査速度 5 O mv/ sで 0 v→— 0. 2 v→+ 0. 2 vの経緯で電位を連続的 に変えながら印加し、 その時発生する電流を測定した。 各々の塲合の印加電位に 対する電流に基づく出力感度を求めた。 各 1 0個の該感度を平均して求め表 3に 示しに。
尚該出力感度は、 印加電位— 0 . 2 v→+ 0. 2 V間での電流値の積分値 （積算 電流値） である。 この数値は、 反応部での検体の反応変位が迅速に確実に電極へ 取り込まれる効率を知る指標となり、 従って大きい程反応変位の全てが取り込ま れたことになる。 一般に検体成分と反応部との反応性もさることながら、 可能な かぎり反応変位の全てが電極に取り込まれることも、 測定精度上から極めて重要 になる。
表 3
5曰 40曰
実施例 2 1 28 127
比較例 2 92 8 1 次に残る前記酵素センサチップの中から 3 5個を抜き取り （ランダム)、前記検 体を使い、 次の条件で測定し、 各経過日に対する発生出力を測定し、 出力変化を 求めてそれを図 1 0のグラフで示した。
まず、 3 5個の該センサチップを乾燥剤入りの常温の保存容器中に、 1日〜 6 0日の間放置した。 この容器の中から各経過日毎に 5個づっ取出して、 その各 5 個に該検体の 5 X Lを注入し、 前記実施例 1と同じ測定条件で発生出力を測定し た。 そして、 各経過日の該センサチップの発生出力 （5個の発生出力値の平均値） を、 1日経過した該センサチップの発生出力（5個の出力平均）で除して出力変化 とした。
該図で実 2が実施例 2、 比 2が比較例 2であり、 実 2では出力の変化が小さい ことが分かる。 尚、 比較例 2については、 実施例 2との間で顕著な差が現れたの で 3 6日迄とした。
又、 前記各経過日で測定した前記センサチップ 5個の出力のバラツキから C V 値 （％) を求め、 各経過日に対する CV値も図 8のグラフに示した。 該図で実 c Vが実施例 2に、 比 c Vが比較例 2に対応している。
尚 C V値は、 各経過日で測定した 5個のセンサチップのパラツキから標準偏差 値を求め、 これを平均値電流で除した値に 1 0 0を乗じたものである。
以上の実験結果からも証明されるように実施例 2は、 比較例 2に比べてより製 品間パラツキも小さく、 長期間の保存安定性に優れていることが判る。 産業上の利用可能性
第一発明バイオセンサによれば、 析出法により製造される懸濁状の反応用塗布 液を用レゝて反応部が形成されるため、 センサチップ反応部の試料への溶解性が格 段に大きくなり、 該析出法を用いずに作った従来のバイオセンサに比べ、 バイオ センサ間のばらつきが無く、 測定精度が大幅に向上した。 また、 試料への溶解性 向上により、 測定時間を短縮することができる。
第二発明バイォセンサによれば、バイォセンサの保存がより長期間に及んでも、 殆ど検体成分との反応性に変ィ匕がなく、 より高い精度で測定できるようにもなつ た。 これにより、 ノイォセンサの生産管理、 在庫管理もしゃすく、 またユーザで の取扱も容易になった。 また、 検体との反応による結果がより確実に、 効率良く 測定できるので、 より精度の高いバイォセンサが製造できるようになった。 また、 本発明に係るパイォセンサは、 その試料吸入部の構造にも特徴を有し、 保留空間部の奥部の片側に形成した突出部によって、 毛細管現象による液体試料 の導入を保留空間部の片側で促進させることができるので、 従来のように、 保留 空間部内の奥部に気体を抜くための排気口を設ける必要がなく、 頗る簡素な構成 で保留空間部に気泡を残さずスムーズに液体試料を導入することができる。

Claims

請求の範囲
1. 電気絶縁基板（1)、 該基板上に設けられた作用電極（21) と対電極 (2 2) を有する電極部（2)、並びに該電極部 (2) の一端に固着されてなる酸化還 元酵素、 電子受容体及び微細結晶セルロース粉体を含む反応部 （4) を備えたバ ィォセンサの製造方法であって、 次の (A1)〜(C1)に記載の各工程を順次行うこと を特徴とする製造方法：
(A1)電気絶縁基板 (1) 上に作用電極 (1) と対電極 (2) とを平行近接して設 ける電極部 （2) 形成工程、
(B1)予め酸化還元酵素、電子受容体及び微細結晶セルロースの 3成分と良溶媒と からなる混合液 Aを、 貧溶媒に攪拌しながら滴下して分散液 Bを調製する反応部 用塗布液の調製工程、
(C1)前記 (A1)工程で得られた電気絶縁基板 (1) 上の電極部 (2) の一端に、 前 記 (B1)工程で得られた反応部用塗布液を塗布 '乾燥して反応部 （4) を形成する 反応部形成工程。
2. 電極が、 白金、 金、 パラジウム、 及びインジウム一スズ酸化物からなる群 から選ばれる少なくとも 1つからなる請求の範囲第 1に記載の製造方法。
3. 請求の範囲第 1又は 2に記載の製造方法により製造されるバイオセンサ。
4. 請求の範囲第 3に記載のバイオセンサを用いて、 試料液中のダルコ一ス成 分、 アルコール成分、 乳酸成分又は尿酸成分を測定する方法。
5. 電気絶縁基板（1)、 該基板上に設けられた作用電極（21) と対電極（2 2) を有する電極部（2)、 並びに該電極部（2) の一端に固着されてなる反応部
(4) を備えたバイオセンサであって、 該反応部 (4) が酸化還元酵素、 電子受 容体、 微細結晶セルロース粉体、 及び親水性セグメントと疎水性セグメントとか ら構成されている親水性ポリマを主成分としてなることを特徴とするパイォセン サ。
6. 前記親水性ポリマが、 直鎖ォキシアルキレンセグメントとアルキル基分枝 ォキシアルキレンセグメントとからなる請求の範囲第 5に記載のバイオセンサ。
7. 前記親水性ポリマ中のアルキル基分枝ォキシアルキレンセグメントの平均 分子量が 1500〜 4000で、 全分子中の直鎖ォキシアルキレンセグメントが 30〜80重量％である請求の範囲第 6に記載のバイオセンサ。
8. 前記反応部 （4) が、 酸化還元酵素、 電子受容体、 微細結晶セルロース、 及び親水性セグメントと疎水性セグメントとから構成されている親水性ポリマを 含む分散液のコーティングにより形成されてなる請求の範囲第 5〜 7のいずれか 1項に Ϊ3載のバイオセンサ。
9. 次の (Α2)〜 (C2)に記載の各工程を順次行うことを特徴とする請求の範囲第 8に記載のバイオセンサの製造方法。
(Α2)電気絶縁基板 (1) 上に、 作用電極 （21) と対電極 (22) とを平行近接 して設ける電極部 (2) 形成工程、
(Β2)予め酸化還元酵素、電子受容体及び微細結晶セルロースの 3成分と良溶媒と からなる混合液 M aを、 該 3成分に対しては貧溶媒であるが前記親水性ポリマに 対しては良溶媒である溶媒に溶解した該親水性ポリマ溶液 Pa中に攪拌しながら 滴下して分散液を調製する反応部用塗布液の調製工程、
(C2)前記 (A2)工程で得られた電気絶縁基板 (1) 上の電極部の一端に、 前記 (B2) 工程で得られた反応部用塗布液を塗布'乾燥して反応部 (4) を形成する反応部 形成工程。
10. 先端部において電気絶縁基板 (1) とカバ一シート （6) とがスぺーサ シート （5) により間隔を隔てて対向配置され、 該基板と該カバーシートと該ス ぺ一サシートの先端縁とにより形成された保留空間部 （S) に、 酸化還元酵素を 含む反応部 （4) を備え、
液体試料をセンサ先端側から該保留空間部内へ毛細管現象を利用して導入し、 該液体試料と該反応部 （4) との酵素反応による電気化学変化を、 作用電極 (2
1) と対電極 （22) とを含む電極部 （2) で検出するバイオセンサであって、 前記保留空間部 （S) において、 前記スぺ一サシートの先端縁の片側にセンサ 先端側へ突出する突出部 （51) を形成したことを特徴とするバイオセンサ。
11. 前記スぺーサシートの先端縁に入隅部 （52) が形成されてなる請求の 範囲第 10に記載のバイオセンサ。
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