WO2002040681A1

WO2002040681A1 - Fragment polypeptidique du virus de l'hepatite e, composition vaccinale contenant ledit fragment, agent diagnostic et leurs applications

Info

Publication number: WO2002040681A1
Application number: PCT/CN2001/001469
Authority: WO
Inventors: Ningshao Xia; Jun Zhang; Shaowei Li; Shengxiang Ge; Ying Gu; Zhigiang He
Original assignee: Yang Sheng Tang Company, Ltd.
Priority date: 2000-09-30
Filing date: 2001-09-30
Publication date: 2002-05-23
Also published as: CN101367869B; EP1331271A4; MXPA03002751A; BRPI0114510B8; US7615228B2; EP2298793A3; KR20090088429A; BRPI0114510B1; KR101121754B1; JP2004525613A; CN101367869A; JP5681337B2; CN1345775A; US20040052813A1; JP2014138593A; US20100143410A1; KR20030048052A; AU2002220460A1; US20100150962A1; EP2298793A2

Description

戊型肝炎病毒之多肽片段以及包含所述片段的

疫苗组合物和诊断试剂盒及其用途发明领域

本发明涉及包含戊型肝炎病毒开放阅读框（ ORF ) 2之（如 SEQ ID NO: 1中所示）氨基酸序列或其片段的多肽的 n聚体，其中 n为 1-180的整数，还涉及本发明所述多肽片段与流感病毒血凝素中的保守片段构成的嵌合多肽，涉及与戊型肝炎病毒 ORF3 中的表位的多肽或其有免疫原活性的片段相结合的本发明所述多肽片段，涉及包含编码上述多肽的 DNA分子之表达载体，含有该表达载体的能够表达所迷多肽的表达宿主，本发明还涉及含有上述多肽的戊型肝炎病毒疫苗组合物及戊型肝炎病毒感染的诊断试剂盒，包括戊型肝炎病毒 IgG、 IgM 以及总抗体的诊断试剂盒，以及所迷疫苗組合物和诊断试剂盒在预防、诊断和 /或治疗戊型肝炎病毒感染中的用途。 . 背景技术

戊型肝炎病毒（以下筒称为 HEV)作为一种肠道传染性非甲非乙型肝炎的致病因子在 1983年首先被发现的（ Balayan等人， 1983. Intervirology 20:23 )。戊型肝炎主要流行于亚洲、非洲、中美洲的 ^中国家，发达国家中的病例主要见于外来移民或出国旅行者中，可以以散发形式存在，也可出现大流行。从五十年代到九十年代间，先后有数次由于饮水污染导致的戊型肝炎暴发流行（ Visvanathan， 1957, 印度医学研究杂志（Indian J. Med. Res. ) (SuppL). 45:1-30; Wong等人， 1980,柳叶刀（ Lancet. ), 2:882-885; Myint等人， 1985, 美国热带医疗卫生杂志（Am J Trop Med Hyg. ), 34:1183-1189; Belabbes等人， 1985医学病毒学杂志（ J Med Virol. ), 16:257-263; Hau等人， 1999, 美国热带医疗卫生杂志， 60:277-280 )。 HEV感染多为自限性过程，少有慢性化，但当孕妇感染戊型肝炎时后果较为严重，病死率可高达 17%以上（Tsega等人， 1992, 临床感染性疾病（ Clin. Infec Dis. ), 14:961-965; Dilawari等人， 1994, 印度胃肠疾病杂志（ Indian J Gastroenterol. ), 13:44-48; Hussaini等人， 1997, 病毒性肝炎杂志（ J Viral Hepat. ), 4:51-54 X

1991年，研究者首次获得了 HEV的全长基因组序列，发现其为单股正链无包膜 RNA病毒（ Tam等人， 1991，病毒学（ Virology ) 185:120-131 λ 对 HEV基因组的序列分析表明，约 7.2kb的病毒基因组含有三个开放读码框架。位于 5，末端的 ORF1编码病毒非结构蛋白，位于 3，末端的 ORF2编码病毒主要结构蛋白。 ORF3的 5，端与 ORF1的 3，端有 1个碱基的重叠， 3，端与 ORF2有 339个碱基的重叠。 ORF3被认为编码另一个功能尚不明确的结构蛋白。（Tam等人， 1991,病毒学， 185:120-131; Aye等人， 1992，核酸研究（Nucleic Acids Res. ), 20:3512; Aye等人， 1993, 病毒遗传学（ Virus Genes. ), 7:95-109; Huan 等人， 1992, 病毒学， 191:550-558; Reyes等人， 1993, 病毒学学报增刊（ Arch Virol Suppl. ) 7:15-25 )。

长期以来， HEV感染的检测主要赖于免疫电镜技术（IEM) 或免疫荧光技术，然而，这些检测技术十分繁杂，价格昂贵，而且在多数实验室难以完成。在 HEV基因组克隆和测序完成之后， JUL 出了更灵敏的检测技术如酶联免疫吸附试验（ ELISA )、蛋白印迹试验（ Western blot)和聚合酶# ^应 ( PCR)等，用于 HEV感染相关标志物的检测。

血清 HEV抗体检测试剂的必要性早已被广大研究人员所认识，但由于感染者或感染动物的 HEV病毒分泌浓度极低，因而几乎不可能作为血清检测试剂的抗原来源，而迄今 HEV的细胞培养的效率仍极低，同样也无法得到足够量的抗原用于检测试剂。因此目前

HEV的抗体检测一直依赖于合成肽抗原和重组抗原。遗憾的是，利用不同区域的合成肽或重组抗原进行的众多血清学研究结果间存在着相当大的不一致性。例如， Goldsmith 等人，（ 1992, 柳叶刀， 399:328-331 ) 用 ORF2 3-2 ( M)抗原（墨西哥株 ORF2 的氨基酸 613-660片段）对入院戊肝病人进行检测，其 ¾G检出率为 91 %，但 6~ 12个月后仅剩 27~ 50% , 而用 3-2(M)的同源片段 3-2(B) (缅甸株 O F2的相同片段）进行检测，入院病人的检出率仅为 64% , 6 ~ 12月后无一检出；相反地， 3-2(M)对一例巴基斯坦患者恢复期血清无反应，而 3-2(B)对该病人 4.5年后的血清仍可检出。对这些蛋白，当一些病人抗体已经阴转时，另一些病人仍可有很高的抗体存在。用大肠杆菌表达的多线性表位嵌合蛋白抗原的结果也类似。因此一直无法对 HEV感染的抗体动态进行较深入的描述。大体而言，在疾病早期即可检出特异性 IgG抗体，发病后 2 ~ 4周达峰值，随后较快下降，在发病后 9个月即有较多阴转，也有一些患者在发病后多年仍可呈阳性。最近，利用杆状病毒表达系统和大肠杆菌表达系统分别表达出了几种重组抗原，其与急性期和恢复期血清均有良好反应。这些抗原在逆辑上更适合于血清流行病学调查：虽然在急性期后血清抗 HEV- G滴度迅速下降，但在多年后仍可维持在可检出的水平上。值得注意的是，这种抗体与疾病流行时对感染的保护是相关的。

另一方面，国际上一直未能研制成功成熟的 HEV- M抗体检测试剂，这与目前采用的检测方法均使用间接法有关。间接法检测 IgM抗体的技术中，一方面影响检测结果的因素众多，重复性较差，另一方面，检测结果可靠性不好，容易出现假阳性，同时阴性值偏高，灵敏度也较差。从目前的各种报道看来，在检测临床标本时，通常 M检测呈阳性时 ¾G抗体也已可同时检出，因此对于早期诊断价值不大，但对于提高急性感染诊断的特异性有帮助。

由于已报道的几种合成肽抗原和一些重组抗原的抗体在多数感染者中具有迅速消失的急性抗体表现，因此目前临床上通常以 IgG 抗体检测试剂进行急性戊肝的诊断，与临床的符合率也较高，但该方法的最大缺陷还是无法区分患者为既往感染或近期感染，特别在戊肝高流行区容易造成误诊，而用于流行病学调查时则会低估戊肝的流行率。因此，目前对可靠灵敏的 μ链捕获法 M检测试剂和对恢复期血清仍敏感的高灵敏度 IgG检测试剂的需求都十分迫切。

近几年来，在研制高灵敏度 IgG试剂方面取得了一定进展。 Mast 等人（ 1998, 肝脏病学（Hepatology ) 27: 857-861 )对国际上 10种主要的 IgG抗体 EIA试剂进行了综合评价，结果在检出已知阳性血清方面有不少检测试剂的结果吻合得很好，但在对美国献血员的检测中各试剂的结果间有较大的差距，提示在非流行地区 HEV感染率的调查结果的可靠性较差。这些试剂中的大多数采用戊型肝炎病毒的线性表位作为抗原，但有两种试剂采用了构象型表位，一种是 ORF2.1 ( ΆΆ394-660 )，另一种是杆状病毒表达的 VLP ( aall2- 07 )。这两种抗原都可以检出恢复期抗体，但迄今仍无直接数据对两者间的符合情况进行比较，也有可能两者识別的是不同的抗体。另外， VLP 试剂在美国这一非流行区域有接近 20 %的检出率，使人们不免对其特异性产生了怀疑，但随着猪、羊、牛、鸡、鼠、野猴和團养猴在内的动物体内陆续检出 HEV，而在美国马里兰州、路易斯安娜州野鼠的抗体检出率分别高达 77%和 44%, 也有可能美国人群的抗体流行率就是比预计的高出许多，但由于动物 HEV的毒力问题而极少引起临床疾病 (Kabrane-Lazizi等人， 1999 美国热带医疗卫生杂志， 61:331-335)。而 ORF2.1试剂在巨细胞病毒（ CMV )感染者、自身免疫病患者中的检出率也有所偏高。另外，报道的 ORF2.1 多肽为 GST融合蛋白或多聚组氨酸融合蛋白，在实际应用中易出现假阳性结果。

由于 HEV的细胞培养和组织培养均未成功，目前还没有找到实用的获得大量病毒的手段，因此传统的灭活疫苗和減毒活疫苗的研制工作均难以开展，而只有通过基因工程手段进行亚单位疫苗或 DNA疫苗的研制。

戊型肝炎病毒的 ORF2开始于 5147位碱基，含 1980个核苷酸，编码 660个氨基酸的多肽，推测为病毒主要结构蛋白，组成病毒衣壳。 ORF2蛋白在 N端有一个典型的信号肽序列，其后是一个富含精氨酸的结构域，这一强正电区域被认为与病毒组装过程中的基因組 RNA衣壳化（encapisidation )有关。 OR 2在翻译过程中通过信号肽识别蛋白（SRP )机制进入内质网（ER), 并在 ER中糖基化和累积，并很可能在此形成衣壳的子粒（capsomer)。 OR 2上有三个 N-糖基化位点， Asn-137、 Asn-310和 Asn-562, 在各毒株间高度保守，其中 Asn-310为主要糖基化位点。以 ORF2转染哺乳动物细胞 COS、人肝癌细胞 Huh-7、 HepG2, 表达出 88kD糖蛋白，在胞浆和胞膜上均可见到。对这些糖基化位点进行突变，并不影响 POR 2 定位于细胞膜，而去除信号肽序列后则 POR 2 仅见于胞浆，提示 PORF2的移位而非糖基化为蛋白细胞表面定位所必需。 PORF2 可能与 HBV的 MS蛋白一样直接由内质网（ER)分泌至细胞表面，而无需经 Golgi体。在转染细胞表面， gpORF2 并非散在分布，而是集中于某些区域，提示一个蛋白亚单位的主动结合过程，也许在此汇集成某种更有序的高级形式。病毒体最后的组装 /成熟因需要基因组 RNA的衣壳化，因此必然发生在 ER外的胞浆中或胞膜内壁， gpORF2在细胞膜上的聚集可能意味着病毒体的装配。同时，衣壳蛋白在细胞膜上的定位也提示成熟病毒通过芽生方式分泌至细胞外的可能性。另一个值得注意的是，用具备翻译修饰功能的体外转录翻译体系进行 PORF2的体外翻译，翻译出的 88kD的 gpORF2除单体外，还可见明显的二聚体形式，说明 gpOR 2有自发形成同源二聚体的倾向，病毒衣壳的子粒很可能即是由 gpORF2 的同源二聚体组成 (Jameel等人， I"⁶. 病毒学杂志（ J. Virol.), 70:207-216 Li等通过水冻蚀刻电镜技术显示出杆状病毒表达的重組 HEV类病毒颗粒为 T=l的二十面体对称结构，由 60个 Ρ50亚单位拷贝組成，其直径约 22~23nm。由于这一大小的颗粒内部空间对 RNA 的容纳能力在 lkb左右，而 HEV的基因组为 7.5kb长，因此推测天然 HEV 病毒应为 T> 3 的晶格结构，但子粒的拓朴结构相似。 Τ = 3 的亚单位总数为 90个子粒（Li等人， 1999. 病毒学， 265:35-45. )。

由上述可知， HEV是一种无包膜病毒，病毒衣壳则由 ORF2编码蛋白组成，该蛋白具有主要的优势免疫表位，并已发现了一些中和表位，因此成为亚单位基因工程疫苗的首选区段。

在美国专利 5885768号中， Reyes等首先报道了利用含有缅甸株 ORF2 C端 2/3 ( aa225~660 ) 的大肠杆菌重組蛋白 trpE-C2, 采用铝盐佐剂， 50 μ g/针于 0天、 30天静脉免疫 4只食蟹猴， 2只为空白佐剂对照。在 4周后采血蛋白质印迹（WB )检测，结果均未测出抗体；此时对其中 2只猴以无佐剂不溶性重組蛋白 80 y /只第三次免疫， 4周后抗体阳转（ WB )。将 6 只实验猴分为两组，每組含 3 针免疫、 2针免疫和对照各 1只，第一组以缅甸毒株攻击，第二组以墨西哥毒株攻击。结果：（1)免疫组 ALT—直维持正常水平，对照组 ALT则较攻毒前呈 6 10倍升高；（2 )应用免疫荧光法检测肝活检标本，攻击缅甸毒抹的 3针免疫猴未见 HEV抗原存在，其余均见肝细胞内 HEV抗原存在；（3)攻击缅甸毒株的 3针免疫猴未见粪便排毒，其余均陆续见粪便排毒。尽管该研究规模很小，但提示 ORF2 来源的重组蛋白在野毒株攻击时能阻止病毒性肝炎生化指标的出现，对一些实验猴可提供完全保护。

Tsarev等人（ 1994, 美国国家科学院院报 ( Proc Nat Acad Sci USA. ), 91:10198-10202； Tsarev等人， 1993，感染性疾病杂志（J. Infect. Dis. ), 168:369-378； Tsarev等人， 1997, 疫苗（Vaccine ) 15:1834-1838 )应用昆虫杆状病毒表达系统（ SF9细胞）表达 HEV ORF2基因，在细胞上清中获得 20mi！〜 30nm蛋白颗粒，大小多样，在重組病毒感染细胞后期小颗粒明置增多； WB检测杆状病毒表达的 ORF2, 可见到 25kD， 29kD, 35kD, 40〜45kD, 55~70kD, 72kD 等多条特异带；利用离子交换、分子筛法纯化 HEV特异性蛋白，在重组病毒感染细胞后第 1天首先出现 72kD的全长 ORF2肽，随后逐渐消失，第 2天出现 63kD和 55kD肽； 1天时即有 53kD肽出现于细胞上清中，且量大，在 3 天时丰度最高，提示初始 72kD蛋白随机剪切出 55kD (在细胞裂解液中）和 /或 53kD (细胞上清） HEV 蛋白产物；对 55kD蛋白和 53kD蛋白进行两端测序，结果表明 55kD 蛋白位于 ORF2的 aall2〜607,而 53kD蛋白位于 aall2^578，而 63kD 蛋白对应于 aall2~660; ELISA结果显示， 55kD蛋白的活性明显强于 53kD蛋白。只以 aall2 60片段在昆虫杆状病毒系统中表达，同样可见 63kD和 55kD HEV重組蛋白。

收获感染 7天的 SF9细胞，初步纯化后以铝佐剂吸附， 50 μ g/针肌肉注射免疫食蟹猴， 4只接种 1针， 4只接种 2针（0d， 28d ), 最后 1针后 4周以同一 HEV病毒株 ( SAR-55株，来源于巴基斯坦病人） 1000〜10000CID₅。剂量静脉攻击， 15周内每周 1 次肝活检及收集血清、粪便。结果在攻毒前 1针組抗体滴度在 1:100〜1:10000之间，而 2针组滴度均达 1:10000 (纯化 55kD蛋白包被 )； 1针組 1只实验猴在攻毒后 9周因 1次麻醉意外死亡（仍统计在结果中）， 2针组 2 只在攻毒后即死亡（未进行统计），原因不明； 6 只免疫组中，无一有 ALT升高或肝活检病理改变，均未检出病毒血症，但 1针组 4只中有 3只有粪便排毒，而 2针组 2只均未见排毒。

通过离子交换、分子筛等进一步纯化杆状病毒系统表达的 55kD 蛋白，使其纯度达到 99%以上，铝佐剂吸附后，按每剂量 50 μ _§、 10 μ g、 2 μ g、 0.4 μ g、 0 μ g (对照）五组 0d、 28d两针免疫恒河猴，每组 4只，最后一针后 4周以； 30万 ΜΠ ₅。同型病毒（ SAR-55株）攻击，结果免疫组 16只猴均不发病，肝活检仅 1只 2 μ g組和 1只 0.4 組出现轻微病理改变；虽然免疫组避免了肝炎，但均无法避免感染，在所有 16只免疫猴中均出现了粪便排毒，除 1只 50 g组和 1只 10 μ _δ組外均出现了病毒血症，而且在大多数猴中虽然排毒量有所下降，但排毒时间并无明显缩短。另以 2 χ 50 μ _§免疫 4只恒河猴，最后一针后 4周以 10万 ΜΠ)₅。异型病毒（墨西哥株 Mex-14 ) 攻击，结果与同型毒株攻击结果类似， 4只免疫猴均未见 ALT升高及肝病理改变，但仅 1只未查见粪便排毒和病毒血症，其余 3只均有粪便排毒和病毒血症，虽然排毒量有明显下降，但排毒时间并无明显缩短。据作者分析，这批实验猴子完全保护效果较前次为差，可能与所用病毒量有较大关系，本次实验用的同型病毒量达 30 万 MID₅₀, 而前次实验仅用了 1000 ~ 10000MID₅。的病毒量。另一值得注意的是，在攻毒前，从 0.4 μ _δ到 50 g组的血清抗体滴度并无明显差别。，

Genelabs 公司研究人员同样利用昆虫杆状病毒表达系统表达 ORF2的 aall2〜660片段，获得大量可溶性的重組 62kD蛋白，纯化后免疫食蟹猴，同样可对 1000CI ₅。剂量的异源病毒（墨西哥株）攻击产生良好保护（20 g免疫 3只，均不发病，其中 2只不排毒， 1 只排毒減少）（Zhang等人， 1997，临床诊断与实验室免疫（Clin Diagn Lab Immunol. ) ;4:423-8.)

McAtee等人，（ 1996蛋白质表达纯化（ Protein Expr. Purif. ) 8:262-270 ) 用重组杆状病毒制备的缅甸株 ORF2 62kD 蛋白 ( aall2~660 ) 为双联体，用方向高效液相层析偶联电喷射盾谱技术 ( LC-MS )将联体解离，得到相对分子质量分别为 56.5kD和 58.1kD 的多肽，经蛋白质肽谱分析，该两个多肽的 N端同为 aall2, C端分别为 aa637和 aa652, 其中 56.5kD蛋白具有很好的免疫反应性。

澳大利亚 Anderson小组 (Anderson等人， 1999. 病毒学方法杂志（J. Virol. Methods. ) 81:131-142; Li等人， 1994, 临床微生物杂志（ J Clin Microbio. ) 32:2060-2066; Li等人， 1997医学病毒学杂志（ J. Med. Virol. ) 52:289-300； Li等人， 2000, 医学病毒学杂志， 60:379-386)用大肠杆菌表达 ORF2的 aa394^60 ( OR 2.1 ), 其表达为带有 GST或多聚组氨酸（His ) 的融合蛋白，可以形成一种高度构象依赖的恢复期表位，对恢复期血清有很高的检出率，但是当该片段的 N端再延伸一些或缩短一些时都会使恢复期表位丧失。以 ORF2.1重組蛋白免疫小鼠，取 30w血清对恢复期病人血清进行阻断实验，以杆状病毒表达的 VLP 为包被抗原，其阻断率可达 81%〜86%。以 ORF2.1蛋白制备单克隆抗体，获得两个识別 OR 2.1 构象型表位的单抗 2E2和 4B2, 以及另外 5个可能识别线性表位的单抗，其中 2E2或 4B2对恢复期病人血清与 VLPs抗原反应的阻断率可达 60%, 提示这两个单抗识别的表位占恢复期病人血清抗体识别表位中的主要部分。这种种迹象提示 ORF2.1 可能具备了与 VLP 十分相似的主要表位结构，这一表位抗体在感染者血清中可持续较长时间存在，很可能是一个重要的保护性表位，但迄今仍未见 OR 2.1 蛋白对动物的保护实验结果报道。发明概述

本发明的一个方面，提供了一种包含戊型肝炎病毒 ORF2 (如 SEQ ID NO: 1中所示）的氨基酸序列或其片段的多肽的 n聚体，其中 n为 1-180的整数，包含的所迷 SEQ ID NO: 1的氨基酸片段的多肽选自：

( 1 )氨基端位于 113位至 469位氨基酸之间，羧基端位于 596 位氨基酸至 660位氨基酸之间的多肽，

( 2)氨基端位于 370位至 469位氣基酸之间，羧基端位于 601 位氨基酸至 628位氨基酸之间的多肽，

( 3)氨基端位于 390位至 459位氨基酸之间，羧基端位于 601 位氨基酸至 610位氨基酸之间的多肽，

( 4 )具有 SEQ ID NO: 1的 414位至 660位氨基 ^^列的多肽，以后称为多肽 247，

( 5 )具有 SEQ ID NO: 1的 429位至 660位氨基酸序列的多肽，以后称为多肽 232，

( 6)具有 SEQ ID NO: 1的 439位至 660位氨基酸序列的多肽，以后称为多肽 222,

( 7)具有 SEQ ID NO: 1的 459位至 660位氨基酸序列的多肽，以后称为多肽 201,

( 8 )具有 SEQ ID NO: 1的 394位至 628位氨基酸序列的多肽，以后称为多肽 235N,

( 9 )具有 SEQ ID NO: 1的 394位至 618位氨基酸序列的多肽，以后称为多肽 225N,

( 10)具有 SEQ ID NO: 1的 394位至 602位氨基^^列的多肽，以后称为多肽 209N，

( 11 )具有 SEQ ID NO: 1的 394位至 601位氨基 ^^列的多肽，以后称为多肽 208N,

( 12 )具有 SEQ ID NO: 的 394位至 606位氨基列的多肽，以后称为多肽 NE2I,

( 13 )具有 SEQ ID NO: 的 390位至 603位氨基酸序列的多肽，以后称为多肽 217D，

( 1 )具有 SEQ ID NO: 的 374位至 618位氨基 ^^列的多肽，以后称为多肽 205,

( 15 )具有 SEQ ID NO: 的 414位至 602位氨基 ^^列的多肽，以后称为多肽 189,

( 16 )具有 SEQ ID NO: 的 414位至 601位氨基^^列的多肽，以后称为多肽 188，

( 17 )具有 SEQ ID NO: 的 459位至 628位氨基 ^^列的多肽，以及

( 18 )氨基端添加 Met, 羧基端被修饰的 SEQ ID NO: 1的 X 位至 603位氨基^^列的多肽，其中所迷端修饰是 603位氨基酸 Pro的 3，端以 5， - 3，方向添加氨基酸序列 -Pro-Pro-Arg, 包括： a) X=394时，所述多肽为 SEQ ID NO: 2所示的多肽，以后称为 NE2;

b) X=41 时，所述多肽为 SEQ ID NO: 3所示的多肽，以后称为 193C;

c) X=429时，所述多肽为 SEQ ID NO: 4所示的多肽，以后称为 178C;

d) X=439时，所述多肽为 SEQ ID NO: 7所示的多肽，以后称为 168C;

e) X=449时，所述多肽为 SEQ ID NO: 8所示的多肽，以后称为 158C; f) X=459时，所述多肽为 SEQ ID NO: 9所示的多肽，以后称为 148C;

g) X=469时，所述多肽为 SEQ ID NO: 10所示的多肽，以后称为 138C.

本发明另一方面，提供了与上迷任一多肽具有至少 80%同一性，且具有相同的抗原性、免疫原性等生物学性质的多肽。

本发明又一方面，提供了重组表达载体，其包含编码上述多肽的核苷酸序列。本发明还提供数种经上述重組表达载体转化的宿主细胞，其能够表达包含的核苷酸序列所编码的上述多肽。

本发明的再一方面，提供了一种用于预防和 /或治疗哺乳动物戊型肝炎病毒感染的疫苗组合物，其含有至少一种上述多肽或其任意组合，以及任选地药学可接受的载体和 /或佐剂。

本发明的再一方面，提供了由上述多肽之一与流感病毒血凝素的保守片段构成的嵌合蛋白。

本发明的再一方面，提供了一种用于预防和 /或治疗哺乳动物戊型肝炎病毒感染的疫苗組合物，其含有由上述多肽之一与流感病毒血凝素的保守片段构成的嵌合蛋白，以及任选地药学可接受的载体和 /或佐剂。

本发明的再一方面，提供了上述疫苗组合物用于免疫哺乳动物使其免受戊型肝炎病毒感染的用途。

本发明的再一方面，提供了一种用于预防和 /或治疗哺乳动物戊型肝炎病毒感染的方法，其包括向受试者施用预防和 /或治疗有效量的至少一种上述多肽或者由上述多肽之一与流感病毒血凝素的保守片段构成的嵌合蛋白。

本发明的再一方面，提供了一种用于诊断生物学样品中戊型肝炎病毒感染的诊断试剂盒，其中包括诊断有效量的至少一种上述多肽或其任意组合。

本发明的再一方面，提供了一种用于诊断生物学样品中戊型肝炎病毒感染的诊断试剂盒，其包括拿断有效量的至少一种上迷多肽或其任意组合，其中还包括戊型肝炎 ORF3中的抗原性表位的多肽，或其有抗原活性的片段，其中 ORF3 的抗原性表位多肽或其具有抗原活性的片段任选地与所用的上述多肽共价结合。

本发明的再一方面，提供了一种用于诊断生物学样品中戊型肝炎病毒感染的方法，其包括用上述诊断试剂盒在适于发生抗原抗体反应的条件下与待测样品相接触。

本发明的再一方面，提供了一种用于检测生物学样品中戊型肝炎病毒 G抗体的方法；一种用于检测生物学样品中戊型肝炎病毒 IgM抗体的方法，以及检测生物学样品中戊型肝炎病毒总抗体的方法。发明详述

除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域里的熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。在本发明中，除另外指出，以下名词的含义应为：

"戊型肝炎病毒"，或 "HEV", 是指一种病毒、病毒类型或病毒类别，具体地，（I) 它引起来源于水的传染性肝炎；（II ) 它在血清学特性上不同于甲型肝炎病毒（HAV )、乙型肝炎病毒（HBV )、丙型肝炎病毒（HCV )、和丁型肝炎病毒（HDV ); ( m )该病毒含有一个同源于插入 pTZKFl(ETl.l)中之 1.33kb cDNA的基因組区域，所述质粒由美国典型培养物保藏中心（ATCC )保藏号 67717 的大肠杆菌菌株 BB4携带。本发明的多肽

本发明一方面提供了一系列具有出人意料的良好抗体反应性和 / 或免疫原性的戊型肝炎病毒的多肽片段，所述片段包含于戊型肝炎病毒 ORF2中 SEQ ID NO: 1所示的氨基 ^^列中。所述各个片段的名称详见实施例 6中的表 1。

在本发明中，所用的氨基酸序列的位置编号与国际纯化学和应用化学协会所用的编码方式相同（International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry. Joint Commission on Biochemical Nomenclature, "Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides", Pure Appl. Chem, 56, 595-624 (1984). )。具体说来，以 SEQ ID NO: 1中起始信号 Met为位置 1, 自 5，向 3，递增。本发明的一个方面，提供了包含戊型肝炎病毒 ORF2(如 SEQ ID NO: 1中所示）的氨基列或其片段的多肽的 n聚体，其中 n为 1-180的整数。当 n=2时，所述多肽为二聚体；当 n=3时，所述多肽为三聚体；当 n=4时，所述多肽为四聚体，其余类推。

本发明中，包含所述 SEQ ID NO: 1所示的氨基^ ^列之片段的多肽的氨基端（ 5，端）位于 113位至 469位氨基酸之间，优选地位于 370位至 469位氨基酸之间，更优选地，位于 390位至 459位氨基酸之间，所述多肽的羧基端位于 5%位氨基酸至 660位氨基酸之间，优选地，位于 601位氨基酸至 628位氨基酸之间，更优选地，位于 601位氨基酸至 610位氨基酸之间的多肽。具体地，本发明所述的多肽尤其是多肽 247，多肽 232, 多肽 222，多肽 201,多肽 235N, 多肽 225N, 多肽 209N, 多肽 208N, 多肽 NE2I, 多肽 217D, 多肽 205，多肽 189, 多肽 188, 和具有 SEQ ID NO: 1的 459位至 628 位氨基列的多肽。

本发明中，包含所述 SEQ ID NO: 1所示的氨基 ^^列之片段的多肽进一步包括氨基端添加 Met, ½端被修饰的 SEQ ID NO: 1的 X位至 603位氨基酸序列的多肽，其中 X位分别为第 394、 414、 429、 439、 449、 459和 469位，所述羧基端修饰是 603位氨基酸 Pro 的 3，端以 5，- 3，方向添加氨基酸序列 -Pro-Pro-Arg, 包括 a) NE2; b) 193C; c) 178C; d) 168C; e) 158C; f) 148C; g) 138C.

本发明另一方面，提供了与上述任一多肽具有相同的抗原性和 / 或免疫原性等生物学性质，且具有至少 80%同一性的多肽，即本发明所述多肽的衍生物。具体的，如果一个多肽之氨基酸序列包含有上述多肽的氨基酸序列，但其 N端和 /或 C端带有其他非本发明所述多肽本身的相邻序列的其他氨基酸，然而，所得多肽具有与本发明所述多肽相似的抗原性和 /或免疫原性等生物学性质仍然类似，则称该多肽为本发明所述多肽的衍生物，其相应的 DNA 分子称为衍生 DNA。例如，为利于目标多肽的表达和 /或纯化，而在上述多肽序列的 N端添加起始氨基酸 (甲硫氨酸）或其他引导肽和 /或信号肽，或在 C端添加数个组氨酸以利于纯化等。

本发明进一步地涵盖了与上述任一多肽具有相同的抗原性和 /或免疫原性等生物学性质的多肽；或者与上述任一多肽具有至少 80 % 同一性的多肽。此处所迷的 "同一性百分比" 旨在表示经序列优化比对后获得的所比较的两种序列之间相同核苷酸或氨基酸残基的同一性百分比，该百分比完全是统计学的，两种序列之间的差异随机分布且包含于其全长。两种核酸或氨基酸序列之间的序列比较通常通过将这些序列优化比对后比较来进行，所述比较通过片段或通过 "比较窗" 来进行，从而鉴定并比较局部区域的序列相似性。除了手工操作，用于比较的序列优化比对可以通过 Smith和 Waterman ( 1981, 应用数学进展（Ad. App. Math. ) 2: 482 ) 的局部同一性算法、 Neddleman和 Wunsch ( 1970,分子生物学杂志（ J. Mol. Biol. ) 48： 443 ) 的局部同一性算法、 Pearson和 Lipman ( 1988, 美国国家科学院迸展 ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA ) 85: 2444 )的相似性搜索方法、使用这些算法的计算机软件（威斯康星遗传学软件包 ( Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 中的 GAP、 BESTFIT, FASTA、和 TFASTA,或者 BLAST N或 BLAST P比较软件）产生。

两种核酸或氨基酸序列之间的百分比同一性通过比较经比较窗优化比对的这两种序列来测定，待比较的核酸或氨基酸序列在比较窗中的区域相对于用于这两种序列间优化比对的参考序列可能包含添加或删除。百分比同一性的计算方法是，测定两种序列之间核苷酸或氨基酸残基相同的同一位置的数目，将此同一位置数目除以比较窗中的总位置数目，并将得数乘以 100, 从而获得这两种序列之间的百分比同一性。

例如，可以利用 BLAST程序 "BLAST 2 sequences", 可以由站点 http：〃 www.ncbi.nlm.nm.gov/gorf bl2.html获得，所用参数为缺省值（特别是 "开放缺口罚" 参数： 5和 "延伸缺口罚" 参数： 2; 所选矩阵是例如由程序提供的 "BLOSUM 62" 矩阵)，待比较的两种序列之间的同一性百分比由程序直接计算。本发明所述多肽的制备

本发明所迷的多肽可通过化学合成、遗传重组的方法制备。优选地，本发明所述多肽可通过重组途径表达。用于制备重組蛋白的方法在当今对于本领域技术人员是众所周知的，因而在此描述中将不再详述；然而，可以参照实施例中描述的方法。在可能用于产生这些重组蛋白的细胞中，当然应当提及细菌细胞（ P. O. Olins和 S. C. Lee, 1993, 大肠杆菌中异源基因表达的最新，生物技术当代观点（Our. Op. Biotechnology ) 4: 520 - 525 )、酵母细胞（R G. Buckholz, 1993, 用于表达异源基因产物的酵母系统，生物技术当代观点 4: 538 - 542 X 动物细胞特别是哺乳动物细胞培养物 ( C. P. Edwards和 A. Aruffo, 1993, 基于 COS细胞的瞬时表达系统的现行应用，生物技术当代观点 4: 558 - 563 )、和昆虫细胞，用于昆虫细胞的方法可能采用例如杆状病毒（ V. A. Luckow, 1993, 用于表达人类基因产物的杆状病毒系统，生物技术当代观点 4: 564 - 572 )。因此，本发明又一方面，提供了重组表达载体，其包含编码上迷多肽的核苷酸序列。本发明还提供了一种经上述重組表达载体转化的宿主细胞，其能够表达包含的核苷酸序列所编码的上述多肽。

在本发明的一个实施方案中，分別利用大肠杆菌表达本发明所述的如下多肽：多肽 247, 多肽 232, 多肽 222，多肽 201, 多肽 235N, 多肽 225N, 多肽 209N, 多肽 208N，多肽 E2I, 多肽 217D, 多肽 205, 多肽 189, 多肽 188，以及多肽 a) NE2; b) 193C。测定了所迷多肽的单双体比例，多聚体形成情况以及相应的半径（具体结果见实施例 6)。结果表明，上述表达产物易于复性，复性后在溶液中可自发形成较稳定的多聚体的特点，这一特点使本发明多肽尤其适于作为疫苗，用于戊型肝炎病毒感染的预防或治疗。在本发明所举的实施方案中，用一种方法测得了从 2到 4的多聚体。由于方法学的限制，不能排除其中推测的三聚体实际上是由适当比例的二聚体和四聚体混合物組成，同样也不排除由于方法的改进，实际上本发明所述多肽能够形成更大的聚合体。从已公开的文献中（（Jameel等人， 1996.病毒学杂志， 70:207-216; Li等人， 1999. 病毒学， 265:35-45. )。可以发现，天然 HEV病毒有较大的可能是由 90个子粒组成，而每个子粒为 ORF2 多肽的二聚体，因此可以合理地认为，本发明所述多肽实际上最大可形成 180聚体，或由于对病毒结构认识的深入，实际上可形成大于 180聚体的多聚体。

在本发明的又一优选的实施方案中，经大肠杆菌 ERR2566表达的多肽 201, 虽然以高表达量的包涵体形式表达，但是，本发明人出人意料的发现，所述包涵体在条件为 pH7.45的 PBS緩冲液中可以自发发生蛋白质复性，无需加入盐酸胍和多步透析等费时费力且大大降低回收率的传统变性 /复性过程，同时，由于其它同时由大肠杆菌表达的非目标蛋白包涵体在上述条件下不能自发复性，故只须简单的离心、收集上清液，即可基本上纯化本发明目标蛋白。本发明多肽与流感病毒血液凝集素保守片段构成的嵌合蛋白

本发明的再一方面，提供了由上迷多肽之任一项与流感病毒血凝素的保守片段构成的嵌合蛋白。血细胞凝集素（以下筒称为 HA ) 是流感病毒的两种表面抗原之一，是特异性检测受试者血清中流感病毒抗体的最重要的抗原。已知用所述 HA免疫动物产生的抗体可有效防止流感病毒再次感染受试者。因此，有理由认为大多数人群体内具有 HA 的抗体。根据（McEwen J等人，疫苗（Vaccine ) 1992;10(6):405-11 ) 文献报道， 91-108aa表位是所有流感病毒 A型 H3株系的 HA基因中的保守氨基^ ^列。在本发明的一个优选实施方案中，利用基因工程的手段首先将 HA基因（91-108aa )和有较强免疫原性的本发明 HEV ORF2基因之多肽片段通过柔性连接，例如（Gly-Gly-Ser), 在原核生物表达系统中尤其是大肠杆菌中实现嵌合表达。利用已有流感病毒感染产生 HA抗体的再次免疫加强作用，产生高滴度的保护性抗 HEV抗体，从而，成为比单独含有 ORF2 片段之本发明多肽的疫苗更优的 HEV疫苗。

根据本发明的教导，本领域普通技术人员还可从 HA基因的其它保守片段中选择适用于本发明所述的疫苗组合物的表位。至于连接 HA的特定表位与本发明多肽的特定柔性连接，可以由适当的肽片段或类似物組成，只要其可有利于本发明的多肽与 HA 中的所选片段相结合，并基本不影响本发明的多肽用于预防 /治疗哺乳动物戊型肝炎病毒感染。应当理解，用于连接本发明的多肽与 HA 的接头的选择主要取决于构成所选择的本发明多肽的性质。例如，不同的本发明的多肽可能需要不同接头与 HA连接。优选的，本发明所用的 HA保守片段为 91 - 108位氨基酸的片段。

用于使作为免疫原的本发明的多肽与 HA特定片段连接的配体，优选地用常规合成技术如化学合成技术合成。此外，技术人员利用标准化学方法如 t-BOC化学法使用自动肽合成仪可合成任何肽。参见，例如， L.A. Carpino, 美国化学协会杂志（ J. Am. Chem. Soc. ) 79, 4427 ( 1957 )。肽也可通过蛋白盾的化学切割或其他方法制备。分离这些肽，使得当化学合成时其基本上不含化学前体或其他化学试剂，或通过蛋白质的化学切割获得。

此外，可通过常规遗传工程技术如重組 DNA技术，通过在宿主微生物或细胞中克隆表达一种带有 HA片段以及选自本发明的多肽的编码序列的 DNA片段，在编码该肽的核酸序列所转化的宿主细胞中制备与 HA 融合的本发明的多肽之嵌合蛋白。当通过重组技术产生时，在适当转化的细胞中，可用常规方法从细胞培养基、宿主细胞或两者中纯化所得嵌合蛋白。分离重組产生的嵌合蛋白，使在通过重组 DNA技术生产时，这些肽基本上不含细胞物质或培养基。这些肽的编码序列可以合成制备，或通过已知技术由病毒 RNA产生，或从可获得的含 cDNA质粒中产生。

为在本发明的方法中使用，可将上述嵌合蛋白设计为通常已知的或另外的构建体，以提高其表达产量或有利于其纯化。在不同微生物和细胞包括如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌（ Streptomyces )、酵母属（Saccharomyces )、哺乳动物、酵母、昆虫细胞和植物细胞中克隆表达 HBV衣壳嵌合肽的系统及其合适的载体已知，并可从未公开及公开的实验室和保藏所获得，及从供应商处获得。

无论是重组产生还是合成产生，如上迷产生的嵌合蛋白可用常规纯化方法纯化。本领域技术人员能容易地确定为了希望的用途使用肽所需的适当纯度水平。疫苗组合物

本发明的再一方面，提供了一种用于预防和 /或治疗哺乳动物戊型肝炎病毒感染的疫苗组合物，其含有至少一种本发明所述的多肽或其任意组合，以及任选地药学可接受的载体和 /或佐剂。

本发明的再一方面，提供了一种预防和 /或治疗哺乳动物戊型肝炎病毒感染的疫苗组合物，其含有由上迷本发明多肽之一与流感病毒血凝素保守片段构成的嵌合蛋白，以及任选地药学可接受的载体和 /或佐剂。

本发明的再一方面，提供了上述本发明的疫苗組合物用于免疫哺乳动物使其免受戊型肝炎病毒感染的用途。

本发明中，用于预防和 /或治疗所迷的哺乳动物包括但不限于人和其它灵长类动物，如狒狒、猿、猴等；经济类家畜，如牛、羊、猪、兔、鼠以及家养宠物如猫、狗、等。疫苗组合物包含治疗和 /或预防有效量的至少一种本发明的多肽，即经施用一定时间治疗和 /或预防受试者免受戊型肝炎病毒感染有效的量。本发明所迷的疫苗组合物可单独施用，或作为药用或预防制剂的部分，其中任选地含有药学可接受的载体，包括控制释放的制剂。所述载体还可包括适于为治疗和 /或预防戊型肝炎病毒感染而施用的药学可接受的载体或稀释剂。合适的药学可接受的载体是生理学惰性和 /或无毒性的。本领域已知多种载体，可根据希望的用途选用。典型的载体包括但不限于：无菌盐水、乳糖、蔗糖、碑酸钙、明胶、糊精、琼脂、明矾、氧化铝、氢氧化铝、花生油、橄榄油、芝麻油和水。另外，载体或稀释剂可包括緩释物质，如单独的或与石蜡一起的单硬脂酸甘油或二硬脂酸甘油。另外，也可使用常规緩释聚合物制剂，包括如可溶性玻璃。

此外，含有本发明至少一种多肽或其任意組合的本发明的疫苗组合物如需要可含有其他治疗或预防剂。例如，这些组合物可含有在所述戊型肝炎病毒感染的治疗或预防中有用的多种试剂的 "鸡尾酒混合物"。一种这样的鸡尾酒混合物可含有其他试剂如干扰素、核苷类似物和 /或 N-乙酰 -半胱氨酸。

任选地，含有至少一种本发明所述多肽的疫苗组合物可进一步含有免疫系统调节剂，如在进一步诱导患者的抗体和 T细胞应答中有用的佐剂或细胞因子。这些调节剂包括常规的基于明矾的佐剂，或胞壁酰二肽、防腐剂、化学稳定剂或其他抗原性蛋白质。一般而言，稳定剂、佐剂和防腐剂等是合适的。合适的防腐剂可包括氯氧基丁炔醇（chlor l but nol)、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯（propyl gallade)、对羟基笨甲酸脂、甘油和苯酚。利用疫苗组合物预防和 /或治疗哺乳动物戊型肝炎病毒感染的方法

本发明的再一方面，提供了一种用于预防和 /或治疗哺乳动物戊型肝炎病毒感染的方法，其包括向受试者施用预防和 /或治疗有效量的至少一种本发明所述多肽，或者施用预防和 /或治疗有效量的由本发明所迷多肽之一与流感病毒血凝素的保守片段构成的嵌合蛋白。尤其是，包括向受试者施用本发明的疫苗组合物。优选的，本发明所选 HA保守片段为 91 - 108位氨基 ^列片段。

可根据希望的免疫反应水平确定这些疫苗組合物中本发明多肽的适当含量。通常，含有本发明所述多肽的疫苗組合物可含有约 5 g〜200 g颗粒。这些疫苗組合物可以以单次或一系列接种施用，例如，以 2^6个月的间隔接种 3次。也可由经治医生判断确定合适的剂量，当作为单一治疗施用时，应考虑如患者健康状态、体重或年龄，以及成分免疫原的常规剂量等因素。待患者病症改善或接触特定病原体的可能性增加后，如必要时可施用维持剂量的含有本发明所述多肽的组合物。随后，施用的剂量或频率或此两者可減为能保持希望的作用的水平。此时，应停止治疗。但是，个体在不希望复发时可能需要长期的断续治疗。

含有至少一种本发明的多肽的疫苗組合物可通过任何合适的途径施用，例如，肠胃外施用，特别是肌内或皮下，以及口服。也可利用其他途径，如肺、鼻、耳、肛门、皮肤、眼、静脉内、动脉内、腹膜内、粘膜、舌下、皮下和颅内。

可制备含有至少一种本发明的多肽作为活性成分的疫苗组合物，其方便地为可配制为液体溶液或悬液形式的可注射的组合物。也可制备成在注射前适于以液体溶解或悬浮的固体形式。在某些实施方案中，制剂也可以是乳化的或在脂质体中封装的，或为可溶性玻璃，以便逐渐释放和 /或延时译放。此外，制剂也可以是气雾剂或喷雾形式。它们也可以包含于透皮贴剂中。活性成分可以与任意量的药学可接受的并与活性成分相容的赋形剂混合。这些赋形剂包括，例如，弗氏不完全佐剂、细菌脂多糖、离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、胞壁酰二肽、卵磷脂、緩冲物、基于纤维素的物质和聚乙二醇。检测生物学样品中戊型肝炎病毒 G抗体、 M抗体或总抗体诊断试剂盒和方法

本发明所述多肽可用于检测生物学样品中戊型肝炎病毒 G抗体、 M抗体和 /或总抗体的存在，相比于现有的检测试剂盒及检测方法而言，具有灵敏度高、特异性好的特点。因此，本发明提供了用于检测生物学样品中是否存在戊塑肝炎病毒感染的方法，其包括用检测有效量本发明的多肽在适于发生抗原抗体反应的条件下与待测样品相接触。

本发明所述的待检测生物学样品来源于但不限于人，以及其它灵长类动物，如狒狒、猿、猴等；经济类家畜，如牛、羊、猪、兔、鼠以及家养宠物如猫、狗等。

本发明的又一方面，提供了一种用于检测生物学样品中戊型肝炎病毒 IgG抗体的诊断试剂盒，其中包括至少一种选自本发明的所迷多肽 , 如需要，所述多肽可领包被合适的支持物表面；还包括带有可检测标记的市售或使用常规方法制备的抗待检生物样品来源的 IgG抗体和与可检测标记相应的检测剂，如需要还应包括适当的緩冲体系。在本发明的一个实施方案中，所述待检测生物样品来源为人，所用抗体为抗人 IgG抗体。进一步地，本发明的 IgG抗体诊断试剂盒中还包括戊型肝炎病毒 ORF3 中的免疫原性表位的多肽，或其有免疫原活性的片段，其中 ORF3 的免疫原性表位多肽或其具有免疫活性的片段任选地与所用的本发明的多肽共价结合。对于 ORF3 的免疫原性表位多肽或其具有免疫活性的片段任选地与所用的上述多肽共价结合的情况，优选地利用遗传重組方法制备嵌合多肽。也可以利用化学法将 ORF3 的免疫原性表位多肽或其具有免疫活性的片段与所用的上述多肽共价结合。

本发明的又一方面，提供了一种用于检测生物学样品中戊型肝炎病毒 Μ抗体的诊断试剂盒，其中包括使用由常规方法制备的或市售的抗待检生物样品来源的 Μ抗体作为捕捉抗体，如需要，所迷捕捉抗体可预包被合适的支持物表面，还包括带有可检测标记的至少一种选自本发明的多肽和与可检测标记相应的检测剂，如需要还应包括适当的緩冲体系。在本发明的一个实施方案中，所述待检测生物样品来源为人，所用抗体为抗人 JgM抗体。进一步地，本发明的 IgM抗体诊断试剂盒中还包括戊型肝炎病毒 ORT3中的免疫原性表位的多肽 > 或其有免疫原活性的片段，其中 ORF3 的免疫原性表位多肽或其具有免疫活性的片段任选地与所用的本发明的多肽共价结合。对于 ORF3 的免疫原性表位多肽或其具有免疫活性的片段任选地与所用的上述多肽共价结合的情况，优选地利用遗传重组方法制备嵌合多肽。也可以利用化学法将 ORF3 的免疫原性表位多肽或其具有免疫活性的片段与所用的上述多肽共价结合。

本发明的又一方面，提供了一种用于检测生物学样品中戊型肝炎病毒 IgM抗体的诊断试剂盒，其中包括使用由常规方法制备的或市售的抗待检生物样品来源的 M抗体作为捕捉抗体，如需要，所迷捕捉抗体可预包被合适的支持物表面，还包括至少一种本发明所迷多肽，以及带有可栓测标记的抗戊型肝炎病毒多克隆抗体或单克隆抗体和与可检测标记相应的检测剂，如需要还应包括适当的緩冲体系。在本发明的一个实施方案中，所述待检测生物样品来源为人，所用抗体为抗人 IgM抗体。进一步地，本发明的 IgM抗体诊断试剂盒中还包括戊型肝炎病毒 ORF3 中的免疫原性表位的多肽，或其有免疫原活性的片段，其中 ORF3 的免疫原性表位多肽或其具有免疫活性的片段任选地与所用的本发明的多肽共价结合。对于 ORF3 的免疫原性表位多肽或其具有免疫活性的片段任选地与所用的上述多肽共价结合的情况，优选地利用遗传重组方法制备嵌合多肽。也可以利用化学法将 ORF3 的免疫原性表位多肽或其具有免疫活性的片段与所用的上述多肽共价结合。

本发明还提供了一种用于检测生物学样品中戊型肝炎病毒总抗体的诊断试剂盒，其中包括至少一种本发明的多肽，如需要所述多肽可预包被于合适的支持物表面；还包括带有可检测标记的本发明所述多肽，以及与所选可检测标记相应的检测剂。在本发明的诊断试剂盒中，用于预包被支持物表面所用的本发明所述多肽可以与同样选自本发明所述多肽中的带有可检测标记的多肽为同一多肽，或不同的多狀。

¾一步地，本发明的总抗体诊断试剂盒中还包括戊型肝炎病毒 ORF3 中的免疫原性表位的多肽，或其有免疫原活性的片段，其中 ORF3 的免疫原性表位多肽或其具有免疫活性的片段任选地与所用的本发明的多肽共价结合。对于 O F3 的免疫原性表位多肽或其具有免疫活性的片段任选地与所用的上述多肽共价结合的情况，优选地利用遗传重组方法制备嵌合多肽。也可以利用化学法将 ORF3 的免疫原性表位多肽或其具有免疫活性的片段与所用的上述多肽共价结合。

本领域技术人员知晓，本发明的上述诊断试剂盒中，可使用多种市售的或使用常规方法利用多种动物制备抗人 G抗体和抗人 IgM抗体，以及利用多种动物制备待检测的生物样品来源动物之抗 IgG抗体和抗 IgM抗体，用于制备抗体的所迷动物包括但不限于山羊、綿羊、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、猪等。用于标记的可检测标记能单独或与其他组合物或化合物一起提供可检测信号，从而表明样品中目标分析物的存在。这些可检测标记可选自诊断测定领域技术人员周知的且易于获得的物质，包括但不限于酶标记、荧光标记、放射性标记等。因此本发明不被特定检测标记的选择所限制，并且认为其包括本领域技术人员周知的测定形式。为方便起见，可以以试剂盒的形式提供检测试剂。这些试剂盒任选地包括预吸附有本发明的多肽的微量滴定板，多种适当配制的稀释液和緩冲液，用于检测特异结合的抗原抗体复合物的标记偶联物及其他信号产生试剂，如酶底物、辅因子和生色团。其他成分可由本领域技术人员轻易确定。

此外，本发明提供了一种用于检测生物学样品中戊型肝炎病毒

IgG抗体的方法，其包含如下步骤：将一种选自本发明所述的多肽预包被支持物表面；适当洗涤；与待测的生物学样品，优选的血清，在适于发生抗原抗体反应的条件下相接触；再次用适当緩冲液洗条；然后用带有可检测标记的市售或使用常规方法制备的抗待检测生物样品来源的动物之 I_gG抗体温育足以使抗原抗体发生反应的一段时间，然后使用与可检测标记相应的检测剂检测支持物表面的抗原抗体复合物，得出样品中所含 IgG抗体的量。在本发明的一个实施方案中，所述待检测生物样品来源为人，所用抗体为抗人 IgG抗体。在发明的一个实施方案中，用多肽 NE2I作为抗原与特定支持物表面预包被。在本发明的一个实施方案中，用与戊型肝炎病毒 ORF3 中的表位偶联的多肽 247作为抗原与特定支持物表面预包被。

另一方面，本发明提供了一种检测生物学样品中戊型肝炎病毒 IgM抗体的方法，其包含如下步骤：将市售或使用常规方法制备的抗待检测生物样品来源的动物之 IgM抗体预包被支持物表面；适当洗涤；与待测的生物学样品，优选地血清在适于发生抗原抗体反应的条件下相接触；再次用适当緩冲液洗涤；然后与带有可检测标记的至少一种选自本发明的多肽温育足以使抗原抗体发生反应的一段时间，使用与可检测标记相应的检测剂检测支持物表面形成的抗原抗体复合物，得到样品中所含的 IgM抗体的量。在本发明的一个实施方案中，所迷待检测生物样品来源为人，所用抗体为抗人 IgM抗体。

在本发明的一个实施方案中，用与辣根过氧化物酶结合的多肽 225N检测样品中所含的 IgM抗体。在本发明的一个实施方案中，用与戊型肝炎病毒 ORF3 中的表位偶联的多肽 247与辣根过氧化物禺联以检测样品中所含 IgM抗体。

另外，本发明还提供了一种检测生物学样品中戊型肝炎病毒总抗体的方法，其包含如下步骤：将至少一种选自本发明的多肽预包被于支持物表面；适当洗涤；与待测的生物学样品，在适于发生抗原抗体反应的条件下相接触；再次用或不用适当緩冲液洗涤；然后与带有可检测标记的一种选自本发明的多肽温育足以使抗原抗体发生反应的一段时间，使用与可检测标记相应的检测剂检测支持物表面形成的抗原抗体复合物，得到样品中所含总抗体的量。

在本发明的一个实施方案中，用 E2I预包被支持物表面，用与辣根过氧化物酶结合的多肽 225检测样品中所含的总抗体。在本发明的一个实施方案中，用与戊型肝炎病毒 ORF3 中的表位偶联的多肽 NE2I预包被支持物表面，用辣根过氧化物酶结合的与戊型肝炎病毒 ORF3中的表位偶联的多肽 225检测样品中所含的总抗体。

以下参照附图及实施例更详细地说明本发明。

附图说明：

图 1显示多肽 201表达载体 pTO-T7-ORF2-201的构建过程。图 2显示诱导后的含有 TO-T7-ORF2-201表达载体之重组大肠杆菌培养物裂解液（制备方法：离心培养液，收集菌体，用含 0.1 % SDS的样品緩冲液重悬，沸水浴处理 10分钟， 12,000转 /分离心 10 分钟，吸取上清液用于测定）进行 12%丙烯酰胺 SDS-PAGE分析。考马斯亮蓝染色。泳道 1、 2为两批细菌培养物裂解液的分析结果，经 UVi凝胶成像仪 ( UVItec公司生产 DBT-08型）分析，表达量均为占总蛋白量的约 35%。

图 3显示 4批由含有 TO-T7-ORF2-201表达载体之重組大肠杆菌获得的多肽 201 包涵体洗涤纯化样品之 2M和 4M尿素变性液的 12%丙烯酰胺 SDS-PAGE分析结果。考马斯亮蓝染色。结果表明， SDS-PAGE分析过程中，有部分的多肽 201复性成双体 (双体比例从 10 - 60%不等），但复性比率低于在 1 X PBS中（ 20 X PBS(IL): Na₂HP0₄ - 12H₂0 73.344g, KH₂P0₄ 4g, NaCl 163.632g, C1 4.024g, pH7.45 )复性的样品（如图 4显示，双体比例为 99% X

图 4显示如上所得多肽 201 与确证为 HEV 阳性的人血清的 Western印迹分析结果。泳道 1-3为 SDS-PAGE对照，其中泳道 1 为蛋白分子量标记，泳道 2为多肽 201经 1 X PBS中的复性样品、泳道 3为经沸水浴 10分钟处理后的多肽 201PBS复性样品；泳道 4 和 5分别为与泳道 2、 3上样样品相对应的 Western印迹结果。

图 5显示如上所述的多肽 201 经 HPLC ½过滤进一步纯化后， 20，000g离心 10分钟，再用 Ο.ΐμιη的氧化铝微孔滤膜过滤，于动态光散射仪 ( PROTEIN SOLUTIONS生产的 DYNAPRO99-D-50 动态光散射仪）上测量，图中纵坐标表示光遇到分子发生散射的百分比强度，横坐标 Rh表示水化动力学半径，单位为 nm, 峰尖对应的 Rh为通过 Regulation算法计算得到的最优水化动力学半径分布，即为测得分子半径，而质量百分比 Mass %表示对发生光散射的质量貢献程度，如图，第 1个峰质量贡献为 100% , 第 2个峰质量贡献为 0% , 说明第 2个峰的是由于收到偶然的环境变化如尘埃、气泡等的瞬间干扰造成的，因为所得的结果采样达到 30次之多，再进行平均权衡计算，偶然的干扰的质量贡献接近于 0, 因此第 1个峰为溶液中分子的动力学半径。

图 6显示多肽 208N 209N和 225N与鼠源单克隆抗体 1F6 2C9 3F5的 Western印迹结果。泳道 1 2 3分別为多肽 208N沸水浴 10分钟处理复性样品、复性样品和复性沉淀样品；泳道 4 5 6分别为多肽 209 沸水浴 10分钟处理复性样品、复性样品和复性沉淀样品；泳道 7 8 9分别为多肽 225N沸水浴 10分钟处理复性样品、复性样品和复性沉淀样品；泳道 10为多肽 201单体对照。

图 7显示用不同剂量之包含弗氏佐剂的多肽 201的疫苗免疫小鼠的抗体产生动态图，其中横坐标为攻击的天数，纵坐标血清抗体检测的 OD_{45 620}

图 8显示用不同剂量之包含无佐剂的多肽 201 的疫苗免疫小鼠的抗体产生动态图，其中横坐标为攻击的天数，纵坐标为血清抗体检测的 OD_450nm/620nm

图 9显示用不同剂量之包含铝佐剂的多肽 201 的疫苗免疫小鼠的抗体产生动态图，其中横坐标为攻击的天数，纵坐标为血清抗体检测的 OD₄₅0nm/620nm°

图 10 A、图 10B、图 10C和图 10D分别为静脉攻击 HEV病毒以模拟天然感染的恒河猴 No.l 2 3和 13的结果。其中横坐标为攻击的天数，纵坐标为血清抗体检测的 OD_45fl/62。_nm读值。从图中可看出 No.l 2 3恒河猴的抗 E2I-IgG出现比 Gendabs-IgG及万泰 Anti-HEV-IgG早 5到 10 天； No.13 Anti-NE2I-IgG可检出，而 Genelabs-IgG及万泰 Anti-HEV-IgG则漏检。

实施例

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测的进行，基本上参照 J. Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第 2版，冷泉港实验室出版社， 1989, 以及 F. M. Ausubd等人，精编分子生物学实验指南，第 3版， John Wiley & Sons, Inc., 1995 中所述的方法进行，限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例中以举例方式描述的本发明不旨在限制本发明所要求保护的范围。实施例 1: 编码本发明所述多肽的多核苷酸的获得及包含其的表达载体的构建

用做模板之 HEV ORF2片段的制备

以从新疆维吾尔自治区的戊肝病人中克隆得到的 HEV全基因 ( Aye，T.T" Uchida等，核酸研究， 20 (13)， 3512 (1992); GenBank 序号： D11092 ) 为模板， ORF2FP:5，-atgcgcc ctcggcca-3，为正向引物， ORF2RP:5，- aaataaactataactcccga -3，为反向引物，在 PCR热循环仪（Biometra T3 )按照如下条件进行 PCR反应： 94 C 5分钟；随后是 50秒， 57°C 50秒， 72 2分 30秒的 25个循环，最后为 72°C 延伸 10分钟。得到特异的 2kb左右大小的用做制备本发明多肽之模板的 HEV ORF2的 DNA片段。将上迷获得的 PCR产物与商售的 pMD 18-T载体（ TAKARA公司生产）连接，经 BamHI/ Hindlll酶切鉴定，得到插入 ORF2基因的阳性克隆。在上海博亚生物工程公司，利用 M13(+)/(-)引物，测得经过上述方法制备的用做制备本发明多肽的模板之两种 HEV ORF2的 DNA片段，其中一个为保守序列（模板 1， SEQ ID NO- 5)；另一个为突变序列（模板 2, SEQ ID NO: 6)。

经过比对和开放读码框（OR ) 分析，上迷用于制备本发明多肽的 HEV ORF2模板中的突变序列（ SEQ ID NO: 6 )与保守序列 ( SEQ ID NO: 5 )相比，缺失一个碱基 A (序列中标以大写 A处），导致移码突变，使 ORF2基因的第 604-605位氨基酸由原来的 His- Ser-Val突变成 Pro-Pro-Arg，随后由突变成的终止密码子 tag终止了多肽的继续翻译。

下面以本发明多肽 201 为例具体说明编码本发明多肽 201 的多核苷酸以及包含其的表达载体的制备。编码本发明多肽 201的多核苷酸以及包含其的表达载体的制备

以如上获得的 SEQ ID NO: 5为模板，利用正向引物 201 P 5，- ggatcccatatggttat tcaggattatgac-3' (见表 1 ), 其 5，端引入限制性内切酶 BamHI和 Ndel位点， Ndel位点序列为 CAT ATG, ATG为大肠杆菌系统中的起始密码子；和反向引物 201RP 5'- ctcgagaaataaactataa ctcccga-3' (见表 1 ), 其 5，端引入终止密码子和限制型内切酶 EcoRI位点。在 PCR热循环仪（ Biometra T3 )按照如下条件进行 PCR反应： 94 5分钟；随后是 94°C 50秒， 57 40秒， ΊΊ 40秒的 30个循环，最后为 72°C 延伸 10分钟。得到特异的 600bp左右大小的 DNA片段，经鉴别为编码本发明所述多肽 201的多核苷^^列。

用于表达本发明所迷多肽的表达载体 pTO-T7 的构建依照文献进行（罗文新等，生物工程学报， 2000， 16:53-57 )。具体步骤包括：将如上述获得的 PCR产物与商售的 pMD 18-T载体（ TAKARA公司生产）连接，经 BamHI/Eco I酶切鉴定，得到插入 201基因的阳性亚克隆； Ndel/EcoRI酶切获得 201基因片段，再与经 Ndel/EcoRI 酶切的 pTO-T7表达载体相连接， Ndel/EcoRI酶切鉴定得到插入 201 基因的阳性表达克隆 PTO-T7-ORF2-201, 含有多肽 201编码序列的 201 多肽重组表达载体 pTO-T7-ORF2-201。图 1 表示上述多肽 ORF2-201表达载体的构建过程示意图。

类似地，以上迷方法利用模板 SEQ ID NO: 6, 分别利用表 1 中所示针对各个多肽设计的引物制备本发明所述的端不是 Pro- Pro-Arg的其它多肽。编码羧基端是 Pro-Pro-Arg 的本发明所述多肽的多核苷酸以及包含其的表达载体的制备

以如上获得的 HEV O F2突变序列 SEQ ID NO: 6为模板，分别利用根据本发明所述多肽设计的不同正向引物和反向引物（具体见表 1 )参照制备多肽 201表达载体的条件进行 PCR反应，依与上述 ORF2-201表达载体的构建过程的相同方法进行克隆构建，转化大肠杆菌 ERR2566, 用于表达其羧基端是 Pro-Pro-Arg的本发明所述的多肽。由此，得到氨基端添加 Met, 端修饰是 603位氨基酸 Pro的 3，端以 5，- 3，方向添加氨基断列 -Pro-Pro-Arg的一系列具有良好免疫原性和免疫反应性的本发明的多肽（具体见表 1 )。表 1 用于制备编码本发明所述多肽的多核苷酸的 PCR扩增模板以;^应的正向 /反向引物

HEV ORF2 所用模

多肽名称

中的位置板编号正向引物（EP)和反向引物（RP)

HEFP:5 '-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3

NE2 ，

394-603ppr* 2

HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3'

217FP:5'-ggatcccatatgfcggctggtggccag-3'

217C 390-603ppr 2

HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3'

E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3'

193C 414-603ppr 2

HERP:5，-ctegagaaataaactataactcccga-3，

E235F:5'-ggatcccatatgcatgacatcgacctcg-3'

178C 429-603ppr 2

HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3'

E46F:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3'

168C 439-603ppr 2

HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3，

E56F:5'-ggatcccatatgcaggaccgaccgac-3'

158C 449-603ppr 2

HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3'

E66F:5'-ggatcccatatgtcgcgcccttttt-3'

148C 459-603ppr 2

HE P:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3'

138CF:5'-ggatcccatatggacgtgctttggctttctc-3'

138C 469-603ppr 2

HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3' HEFP:5，-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3

NE2D 394-603 2 ，

E2RD:5'-gaattcttagggggctaaaacagc-3'

217FP:5 ggatcccatatgtcggctggtggccag -3,

217D 390-603 2 ，-

E2RD:5'-gaattcttagggggctaaaacagc-3⁵

E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3⁵

193Ί> 414-603 2 E2RD:5'-gaattcttagggggctaaaacagc-3'

E235F:5^,-ggatcccatatgcatgacatcgacctcg-3^?

178D 429-603 2 E2RD:5^?-gaattcttagggggctaaaacagc-3'

HEFP:5⁵-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3'

NE2I 394-606 2 E2IQ:5'-gaattcttatgcggaatggggggctaaaacag-3⁹

217FP:5'- ggatcccatatgtcggctggtggccag -3

2171 390-606 2 ，

E2RI:5，-gaattcttatgcggaatggggggctaaaacag-3，

E220F: 5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3

1931 414-606 2 ，

E2RI:5'-gaattcttatgcggaat gggggctaaaacag-3⁵

E23SF:5，-ggatcccatatgcatgacatcgacctcg-3，

1781 429-606 2 ： E2RI:5，-gaattcttatgcggaatggggggctaaaacag-3，

HEFP:5，-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3，

266N 394-660 1 HERP: 5 ^?-ctcgagaaataaactataactcccga-3，

HEFP:5'-ggatccatatgcagctg tctactctcgtc-3⁵

235N 394-628 2 235NR:5^?- gaattcttacgggcagaagtcatcg -3，

HEFP:S'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3'

225N 394-618 2 225RP:5，-gaattcttaggcagggtagtccatgg-3，

HEFP:5，-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3，

209N 394-602 2 209RP:5'-gaattcttaggctaaaacagcaacc-3⁹

HEFP:5^?-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3'

208N 394-601 2 208RP:5'-gaattcttataaaacagcaaccgc-3'

HEFP:5，-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc - 3，

207N 394-600 2 207RP:5，- gaattcttaaacagcaaccgcg-3，

ECEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3'

203N 394-596 2 E203R:5'-gaattcttaggaaatagagacgggac-3'

HE P:5，-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3^?

193N 394-586 2 E220R:5，^ctcgag taagtggtgtaagtggaaatag-3，

HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctcgtc-3'

176N 394-569 2 E237R: 5 '-ctcgagttacagttggtcactagcagt-3，

227FP:5'-ggatcccatatgctaggcggtctaccca«3'

280 380-660 1 HERP:5，-ctegagaaataaaciataactcccga-3，

217FP:5'- ggatcccatatgtcggctggtggccag -3'

270 390-660 1 HERP:5^y-ctcgagaaataaactataactcccga-3^?

207FP:5'-ggatcccatatgcccgtcgtctcagc-3'

260 400-660 1 HEKP:5，-ctcgagaaataaactataactcccga-3，

E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3'

247 414-660 1 HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3'

E235F:5^y-ggatcccatatgcatgacatcgacctcg-3'

232 429-660 1 HE P:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3^?

E46F:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3'

222 439-660 1 HERP:5'-ctcgagaaataaactataactcccga-3⁹

E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3^!

205 414-618 2

225 P:5，- gaattcttaggcagggtagtccatgg -3，

E46F;5'-ggatcccatatggttattcaggat atgac-3'

201 459-660 1 HERP:5^?»ctcgagaaataaactataactcccga-3^?

138CF: 5 '-ggatcccatatggacg gctttggctttctc-3，

191 469-660 1 HERP:5'"Ctcgagaaataaactataactcccga-3'

E220F:5^,"ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3¹

189 414-602 2 209RP:5⁵«gaattcttaggctaaaacagcaacc-3'

E220F:5^ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3

188 414-601 2 208RP:5^,-gaattcttataaaacagcaaccgc-3' E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3'

183 414-596 2

E203R:5'-gaattcttaggaaatagagacgggac-3'

E220F:5'-ggatcccatatgacatctgtagagaatgctca-3'

173 414-586 2

E220R:5'-ctcgagttaagtggtgtaagtggaaatag-3'

E46F:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3

170 459-628 2 ，

235NR:5'-gaattcttacgggcagaagtcatcg-3'

138CF:5'-ggatcccatatggacgtgctttggctttctc-3'

C160 469-628 2

235NR:5'~ gaaffcttacgggcagaagtcatcg -3，

E46F:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3 '

N160 459-618 2

225RP:5'- gaattcttaggcagggtagtccatgg -3，

138CF:5'-ggatcccatatggacgtgctttggctttctc-3'

150 469-618 2

225RP:5'- gaattcttaggcagggtagtccatgg -3'

E46F:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3'

144 459-602 2

209RP:5'-gaattcttaggctaaaacagcaacc-3'

E46F:5'-ggatcccatatggttattcaggattatgac-3 '

142 459-600 2

207RP:5'-gaattcttaaacagcaaccgcg-3'

138CF:5'-ggatcccatatggacgtgctttggctttctc-3'

134 469-602 2

209RP:5'-gaattcttaggctaaaacagcaacc-3'

*： ppr示¾¾^¾ 603位氨基酸 Pro的 3，端以 5， - 3，方向添加氨基 ^^列 -Pro-Pro-Arg的多肽. 实施例 2: 多肽 201的表达

l L的 pTO-T7-ORF2-201质粒（ 0.15mg/ml )转化 40μΕ 的氯化钙法制备的感受态大肠杆菌 ERR2566, 涂布于卡那霉素（终浓度 25 g/mL, 下同 )抗性的固体 LB培养基， 37"C静置培养 10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含 4mL卡那霉素抗性的液体 LB 培养基之试管， 37°C 220 转 /分振荡培养 10 小时，至菌体浓度为 OD550 « 1.5, 从中取 lmL保存于 4°C ，剩余的 3mL加入 2μ∑ 0.5Μ IPTG (终浓度为 0.3mM )， 371； 220转 /分振荡进一步诱导培养转化的表达菌株 4小时。取 1.5mL经诱导培养的表达菌株培养液, 12,000 转 /分离心 30秒，弃去上清，扣干，用 ΙΟΟμί l x凝胶加样緩冲液

( 50mM Tris · CI(pH6.8),100mM二硫苏糖醇 (DTT)，2%SDS，0.1% 溴酚蓝，10%甘油）重悬；沸水浴处理 10分钟； 12,000转 /分，离心 10分钟；取出 ΙΟμ 进行 12%丙烯酰胺 SDS-PAGE分析。挑^ 达量较高的转化菌株进行大量表达并长期保种。

每个 1L的三角培养瓶装 500mL新鲜 LB液体培养基，分别转接 200μΙ的保存菌液， 37V , 190转 /分振荡培养 11 小时，至菌体浓度 OD550 « 2.0。然后向每培养瓶加入 300μL· 0.5M IPTG使终浓度为 0.3mM, 37°C , 190转 /分进一步振荡诱导培养 4小时。离心所得的培养液，收集菌体，用含 0.1 % SDS的样品緩冲液重悬，沸水浴处理 10分钟， 12,000转 /分离心 10分钟，吸取上清液用于进行 12% 丙烯酰胺 SDS-PAGE分析。考马斯亮蓝染色。经 UVI »成像仪 ( UVItec公司生产 DBT-08型）分析，表达量约为占总蛋白量 35 %。参见图 2。实施例 3: 多肽 201在大肠杆菌中重达的包涵体的洗条纯化

如上述实施例 2中制备的高表达多肽 201重组菌株经诱导表达所得培养液 4000转 /分离心 15分钟后，弃上清；沉淀后的菌体以每 500mL培养基加 15mL裂解液（ 50mM Tris · CI, lOmM EDTA, 300mM NaCl pH7.2 )计算，重新悬浮于裂解液中。用超声波破碎仪 ( SONICS&MATERIALS生产 Uilbra-Cell VCX500型）破碎细胞，对于 200mL培养液所得菌体悬浮液，破碎条件为：设置 70%功率，安装大型的超声探头，将悬浮液装于 250mL的烧杯中，并置于水浴盒中，调整位置和高度，以使超声探头位于液体中央。每次脉冲破碎时间为 40秒，间隔 1分钟，共破碎 20分钟，直至无明显的粘稠物，且细胞破碎液离心后，沉淀中有少量黑色被碳化的物质为原则；随后 12,000转 /分 4Ό下离心 10分钟，弃上清；沉淀用 1/2菌体悬浮液体积的緩冲液 I溶液（200mM Tris«Cl, pH8.5, 5mM EDTA, lOOmM NaCl ) 重悬，加入等体积含 4%Triton-X100的緩冲液 I, 其中 IViton-xlOO的终浓度为 2%。下 200转 /分，振荡 30分钟； 10,000转 /分， 4"C离心 10分钟，弃上清；沉淀用与菌体悬浮液等体积的緩冲液 I重悬；条件同上，超声破碎，每次脉冲破碎时间为 40 秒，间隔 1分钟，共破碎 3分钟； 10,000转 /分， 4V, 离心 10分钟，弃上清；沉淀用 1/2 菌体悬浮液体积的緩冲液 I重悬，再加入等体积含 4%Triton-X100的缓冲液 I; 37°C , 200转 /分，振荡 30分钟； 10,000转 /分， 4°C , 离心 10分钟，弃上清；沉淀用与菌体悬浮液等体积的缓沖液 I重悬； 200转 /分，振荡 30分钟； 10,000转 / 分， 4" , 离心 10分钟，弃上清；沉淀用与菌体悬浮液等体积的 2M 尿素 /緩冲液 I重悬； 37Π , 200转 /分，振荡 30分钟； 10,000转 /分， 4°C , 离心 10分钟，留上清，样品编号为 201 2M; 沉淀用等体积的 4M尿素 /緩冲液 I重悬； 200转 /分，振荡 1小时， 4"C放置过夜（10小时）； 4Ό , 12,000转 /分，离心 10分钟，留上清，样 v¾编号为 201 4M, 弃沉淀；利用 12% SDS-PAGE分析所得样品 201 2M 和 201 4M的纯度，结果见图 3。实施例 4: 201重组多肽的复性

lOOmL经实施例 3制备的 201 4M样品分装到两个透析袋（美国联合碳化公司生产， 36DM, 截留分子量 8,000-10,000 )，放入 1L 容量的烧杯，加入 900mL 的 1 X PBS ( 20 χ PBS(IL)中含有 Na₂HP0₄ 12H₂0 73.344g, KH₂P0₄ 4g, NaCI 163.632g, CI 4.024g, pH7.45 ), 在 25^C下，搅拌透析过夜（ 10小时），透析袋里将出现白色不溶物；更换透析液继续透析，以后每隔 3 小时更换一次透析液，重复 4次。理论上，透析结束时，样品的尿素含量为 4 X 10"⁶M; 透析样品经 12，000转 /分， 25°C离心 10分钟；上清液通迚 0.22μιη的微孔滤膜过滤，可用于进一步纯化；离心沉淀用 4Μ尿素 / 緩沖液 I重悬，可重新用于透析，但所得的样品蛋白浓度小于第一次获得的样品，且透析过程仍将有沉淀出现。实施例 5： 201重組多肽的 HPLC凝胶过滤色谱纯化对利用如实施例 4的方法制备的复性样品 201采用如下 HPLC 系统和方法进一步纯化。

仪器系统： Beckman System Gold Nouveau 125NMP/166NMP HPLC, 层析柱： TSK GEL SW3000 21.5mm χ 60cm, 洗脱液： 1 >< PBS pH7.45, 流速： 4ml/min, 检测器波长： 280nm, 样品量： 2ml 样品 E² 4M ( ⁸mg/ml ), 收集模式：窗口式自动峰收集，收集时间： 1管 /20秒，收集延迟： 6秒。

结果表明：色谱过程的分子筛效应是十分有效的，然而，峰组分同时含有单体和二聚体以及介于其间均匀分布的蛋白，样品经沸水浴 10分钟处理后， 12%丙烯酰胺 SDS-PAGE分析目的蛋白峰的单体纯度，纯度可达 95%以上。说明在色镨分离过程中， ORF2-201 单体除了与自身聚合，还与其它小蛋白聚合，而且聚合体之间还发生相互作用，在色谱过程中一起被洗脱。实施例 6本发明的重組多肽表达产物的表征

利用如上实施例 1-5所迷的方法，分别构建并表达本发明的重组多肽（具体多肽见表 2 )。进一步的，按照实施例 3-4的方法对各个重组多肽进行洗涤和透析。表 2 中表明了本发明的各个重組多肽所对应的戊型肝炎病毒 ORF2 中的氨基酸位置，重组表达产物的复性性质及在其 SDS-PAGE 中单体与双体的构成比，以及多聚体的形成情况。

表 2 各个本发明所述多肽所对应的氨基^^列，表达产物的复性性质，在 SDS-PAGE中单体与双体的构成比，以及多聚体的形成情况多肽名称序列单体比例双体比例是否形成多聚体是否透析复性

NE2 SEQ ID NO: 2 10% 90% 是是 ^ ^ I w ^ ^ ^ ¥ ¥ ¥ ^ ^" - 8£ -

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%S6 %s ε ON cn Das D£6l M0/T0N3/X3d Ϊ890 OAV aa439~aa660

SEQ JD NO: 1

205 aa374~aa618 10% 90% 否是

SEQ ID NO: 1

201 aa459~aa660 1% 99% 否是

SEQ ID NO: 1

189 aa414~aa602 2% 98% 否是

SEQ ID NO: 1

188 aa414~aa601 4% 94% 否是

SEQ ID NO: 1

183 aa414~aa596 100% 0% 否否

SEQ ID NO: 1

173 aa414~aa586 100% 0% 否否如表 2所示，当包含于戊型肝炎病毒基因 ORF2 中如 SEQ ID NO: 1 中所示氨基酸序列中的本发明多肽其末端位于第一个序列第 601位氨基酸（ Leu) 至第 660位氨基酸之间时，所获得的重组多肽均复性良好,、使其易于表现出接近于天然 HEV蛋白的空间结构。具体地，其中多肽 247、 232、 222、 201、 235N、 225N、 209N、 NE2L 217D、 205、 189、 188、 NE2 ( SEQ ID NO: 2 )和 193C ( SEQ ID NO: 3 )在相应单体分子量位置及约为单体分子量 2倍的位置均有表达带，而且默体带的量明显高于单体带，其中 E2和 193C在更大的位置（推测为多聚体）亦有明显带，提示上述多肽具有自发形成多聚体的趋势。

由表 2, 本发明将可复性的重组多肽 193C、 201、 208N、 209N、 NE2、 222、 225N、 232和 247经 HPLC凝胶过滤进一步纯化后，分别 20，000g离心 10分钟，再用 Ο.ΐμιη的氧化铝微孔滤膜过滤，在动态光散射仪 ( PROTEIN SOLUTIONS生产的 DYNAPRO99-D-50 动态光散射仪）上测量的动力学半径，进而推测其聚集状态，结果见表 3。表 3中记录了利用动态光散射仪检测表 2中所迷可复性重组多肽的聚集状态。由所测得的分子半径表明，各个重組多肽均明显高于单体的领测半径，根据推算的分子量可以判断出这些多肽在溶液中均至少形成二聚体，多数形成更大的聚体，与这些多肽在 SDS- PAGE 电泳中的表现相符。实际上，由上迷方法制备的本发明的多肽最多可形成高达 180或更多的多聚体。进一步证实了本发明的重组多肽具有出人意料的性质，即经大肠杆菌体系重组表达的上述多肽在无变性剂的 PBS溶液中有自发形成多聚体的倾向，这有利于增强其作为疫苗的免疫原性。

表 3利用动态光散射仪检测本发明的可复性重组多肽的聚集状态单 ^¾论实测半径推算分子量

多肽推测聚集状态

分子量 (KD) ( nm) ( D)

193C 21.2 3.44 47 二聚体 (21.2 2 = 42.4)

201 22.1 3.08 62.7 三聚体 (22.1 3 = 66.3)

208N 22.9 3.57 66.1 三聚体 (22.9 3 = 68.7)

209N 23 4.10 91. 四聚体 (23 4=92)

NE2 24.4 4.04 90 四聚体 (24.4 4=97.6)

222 24.4 3.72 73 三聚体 ( 24.4 3=73.2)

225N 24.8 3.91 82 三聚体 (74.4)四聚体 (99.2)并存

232 25.5 3.97 85 三聚体 (25.5 3=76.5)

247 27.2 4.28 101 四聚体 (27.2 4=108.8)

266N 29.3 4.41 108 四聚体 (29.3 4=117.2) 实施例 7: 多肽 201理化性质的研究

包涵体的复性：如上迷实施例 1-3所述制备的重组表达多肽 201 的包涵体，按照实施例 4 中的方法经过 4M尿素变性处理，变性液对 100倍以上体积的 PBS透析， 12,000rpm离心 10分钟，有部分或全部重组蛋白出现在上清液，判断该重组蛋白可复性。重组蛋白的聚集性：复性上清液进行常规的 SDS-PAGE分析，出现单体、双体和多聚体带；再用常规的 Western 印迹进一步这些奈带的特异性，从而证实重組多肽 201 复性后形成多聚体。结果见图 4。

光散射技术测定多肽 201的分子大小：按照实施例 6 中所述的方法，将经 HPLC純化后的多肽 201, 20,000g离心 10分钟，再用 0.1 μ m 的氧化铝微孔滤膜过滤，于动态光散射仪（ PROTEIN SOLUTIONS生产 DYNAPRO99-D-50动态光散射仪）上测量，入射激光波长为 824.0mn, 使用 Regulation算法计算，该算法为多种标准样品所验证，以％ Intensit 峰对应的动力学半径算得分子半径，并将测定溶剂设为样品緩冲液 PBS。图 5为多肽 201的测量结果。实验结果表明，可复性的多肽 201在无变性剂的溶液中平均半径为 3.08nm, 推测分子量为 62.7KD, 约相当于三聚体形式。本领域技术人员知晓，由于检测方法所限，本发明中所述多肽实际上可形成 180 或更高的多聚体。实施例 8: E2多肽鼠源单克隆抗体的制备

杂交瘤细胞系的产生

取 6~8周龄雌性 Balb/c小鼠，初次免疫每只小鼠肌肉注射用福氏完全佐剂乳化的 5μ g NE2重组抗原（总体积 50 μ 1 )。 15天后进行二次基础免疫，方法为取相同量的抗原用福氏不完全佐剂乳化，肌肉注射。 30天后，尾静脉加强注射 5 y g不加佐剂的抗原，并于加强免疫后 72-96 小时，杀死小鼠，收集血液，取脾制备脾细胞悬液 (悬于 RPMI 1640培养基中），细胞计数板细胞计数。按 1/6于脾细胞的数量取培养的 SP2/0 小鼠骨髓瘸细胞，混合后离心，利用聚乙二醇（PEG 1500 )使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0融合。将细胞悬液与等体积的飼养细胞混合后，分置于 96孔细胞培养板中（200 μ ϊ/孔）于 5%二氧化碳培养箱（ ESPEC BNA-311 ) 37°C培养。 3天后，用 HT培养基（黄嘌呤 (hypoxanttm, H)1.361mg +胸腺嘧啶核苷（thymidine, T) 0.388mg, 加 RPMI1640 ( GBBCO公司）培养基至 100mL。 45 ~ 50°C条件下溶解后，过滤除菌。）半保留换液。 7 天后，用 NE2重组抗原包被板，利用如下述酶联免疫吸附法（ ELISA ) 检测 6孔细胞培养板中所得杂交瘤细胞上清培养液。对于 ELISA 检测为阳性的细胞克隆，利用有限稀释法进行克隆化。

ELISA检测法

于下使 100 μ 1 ΝΕ2重組抗原经如实施例 5中所述的 HPLC 纯化，溶解于 0.05mol/L碳酸包被緩冲液（ 20.02g Na2C03, 2.52g NaHC03加去离子水至 1升， pH为 9.5 ) 中，浓度约为 0.3 μ g/ml，在 96孔聚乙烯微量滴定板的各孔表面上吸附 2小时（37 ： ), 再置于 4°C过夜。用 PBS-吐温洗涤液（ 8.0g NaCL 0.2g KH₂P0₄、 2.9g Na₂HP0₄«12H₂0, 0.2g KC1和 0.5ml吐温 20，加去离子水至 1升， pH为 7.4 ) 洗涤滴定板以除去未结合的抗原蛋白。然后用 200 μ Ι/孔的封闭液（ 1 X PBS溶液，组成同前）中加入 2%明胶、 0.2%酪蛋白和 2%蔗糖） 37°C封闭 2小时。甩净、拍干后真空封闭， 4°C保存。

检测时，于每孔中加入 100 μ ΐ细胞培养液上清；每块 96孔微量滴定板设一阳性对照，加入 100 μ ΐ 小鼠多抗血清（1:100稀释使用）；另设一阴性对照，加入 100 μ 1 ΗΤ 细胞培养液。 37 温浴 30 分钟，用 PBS-吐温洗涤液洗 5遍，拍干后加入过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋白（HRP-GAM Ig, DAKO公司）， 37 温浴 30分钟，取出后用 PBS-吐温洗涤液洗 5遍，拍干后先后加入底物液、 B各 50 μ 1(底物液 A成分为：显色液 A成分为： 13.42g Na₂HP0₄ ·12Η₂0、 4.2g柠檬酸 Ή₂0和 0.3g过化氢，用去离子水中调节体积为 700ml; 显色液 B成分为： 0.2g四甲^ ^苯胺、 20ml二甲基甲酰胺用去离子水中调节体积为 700ml), 37°C显色 10分钟，加入 50 μ 1终止液 ( 2Μ H2S0 ) 终止反应，并于酶标仪上检测各孔的 OD450值，通常以 OD450值高于阴性对照 2倍以上者视为阳性。单克隆抗体腹水的获得及纯化

取 10周龄的健康 Balb/c小鼠，腹腔注射福氏不完全佐剂，每只 0.5mL 2-7 天后，收集克隆化的杂交瘤细胞，离心去上清，加入不含血清的培养基，调节细胞密度至 2 X 10⁵〜 2 X 10⁶个 /ml，每只小鼠注射 0.5ml。 7-10天后小鼠腹部增大，开始收集腹水。 3000rpm 离心 15分钟，吸取中间澄清部分的液体， 0.45 μ πι的微孔滤膜过滤除菌，分装后 -20°C保存。

将处理好的腹水用 0.02mol/L、 pH 7.4的 PBS ( 81ml 0.2mol/L Na₂HP0₄, 19ml 0.2moI/L NaH₂P0₄, 加生理盐水至 100ml )对倍稀释，搅拌下逐滴緩慢加入硫酸铵（浓度达到 50%饱和度)， 4°C过夜。

4。C , 12000rpm离心 15分钟，弃上清，将沉淀溶于原腹水体积 2倍的 PBS中。搅拌下逐滴緩慢加入硫酸铵，使硫酸铵浓度达到 33%饱和度， 4 静置过夜。 4°C , 12000rpm 离心 15分钟，弃上清，将沉淀溶于原腹水体积 2倍的 PBS中。搅拌下逐滴緩慢加入硫酸铵，（浓度达到 50%饱和度)， 4°C过夜。 41：, 12000rpm 离心 15分钟，弃上清。将沉淀溶于适量的 PBS 中，装入透析带中，放入 50-100倍含 20mmoI/L NaCl, pH 7.8的 120mmol/L Tris-HCl緩沖液中搅拌下脱盐 12 小时左右，期间更换 3次以上透析液。取出后分装 -20 °C保存。

以上述方法将本发明的多肽 NE2免疫 Balb/c小鼠，制备单克隆抗体，筛选出了 8株抗 NE2单克隆抗体（1F6、 2C9、 3F5、 8C11、 8H3、 13D8、 15B2和 16D7 )。将这 8株单抗分别包被 eppendorf管，以捕获 RT-PCR方法检测这些单抗结合天然戊型肝炎病毒的能力（参见实施例 9), 结果单抗 8C11、 8H3和 13D8表现出明显的病毒结合活性，表明其识别表位为病毒外壳上的天然表位，用于下面实施例 10 中所述的实验。实施例 9：抗^ Ml获 RT-PCR检测单克隆抗体与 HEV病毒颗粒的结合

将普通 1.5ml Eppendorf管紫外照射 30分钟，然后加入 500μ1 以碳酸包被緩冲液（ 20.02g Na2C03, 2.52g NaHC03加去离子水至 1 升， pH为 9.5 ) 1： 1000稀释的不同单克隆抗体， 37°C孵育包被过夜；移去包被液，加入 1.5ml封闭液（含 2%的白蛋白的 I X PBS緩冲液， H7.4 ), 37°C封闭 2小时；移去封闭液，加入 500μ1以无菌生理盐水稀释的的 HEV病毒阳性粪便 10%悬液， 37°C反应 2小时后，用 PBST洗涤 6遍；最后在洗涤好的 Eppendorf管加入 250 μ 1蒸馏水，参照实施例 14进行 RT-PCR检测。结果发现，实施例 8中所得 1F6、 2C9、 3F5、 15B2、 16D7这 5个单抗不能结合病毒，而 8C11、 8H3、 13D8这 3个单抗能结合病毒。实施例 10：本发明的多肽对阳性猴和人血清以及鼠源单克隆抗体的酶联免疫吸附测定（ELISA)和对鼠源单克隆抗体的点杂交重组多肽对阳性猴和人血清以及鼠源单克隆抗体的（ ELISA )

分别将表 2中所示的本发明的多肽按照实施例 1-6所述的方法制备并纯化，得到浓度为 lmg/ml的纯化重組蛋白样品，用 20mM pH7. 的 PBS緩冲液， 1:500稀锋，按 ΙΟΟμΙ/孔包被在 96孔瞟标板上，包被条件是：于 37°C 温育 2小时， 4°C 过夜温育约 12小时；在 TECAN全自动洗板机 ( M12/4R Columbus plus型）上用 PBS- 吐温洗涤液（8.0g NaCl、 0.2g KH₂PO4、 2.9g Na₂HP0₄ 12H₂0, 0.2g KCI和 0.5ml吐温 20, 加去离子水至 1升， pH为 7.4 )洗涤 1次，扣干，加入 200ul/孔的封闭液（组成： 2%明胶、 0.2%酪蛋白和 2% 蔗糖的 PBS溶液)，于 37°C温育 2小时；加入经适当稀释的抗血清或单克隆抗体（ ΙΟΟμΙ/孔），于 37 3温育 30分钟；在 TECAN全自动洗板机上用 PBS-吐温洗涤液洗涤 5次，每次间隔 20秒，扣干，加入合适稀释度的 HRP晦标二抗（羊抗人、鼠 G抗体)，于 37°C 温育 30分钟；在 TECAN全自动洗板机上用 PBS-吐温洗涤液洗涤 5 次，每次间隔 20秒，扣干，加入显色液 A和 B (显色液 A成分为： 13.42g Na₂HP0₄ · 12H₂0、 4.2g柠檬酸 · H₂0和 0.3g过氧化氢，用去离子水中调节体积为 700ml; 显色液 B成分为： 0.2g四甲基联笨胺、 20ml二甲基甲銑胺用去离子水中调节体积为 700ml )各 1滴，于 37°C显色 10分钟，加入 1滴终止液（2M H₂S0₄ ); 在 TECAN 酶标仪（ Sunrise Remote/ Touch Screen )上测量 OD_45Qnm (参比波长为 620nm)值，阳性阈值为 3倍的阴性均值， OD值大于阈值的结果为阳性结果， OD值小于阈值的结果为阴性。结果见表 4。高纯度的本发明的多肽对数种鼠源单克隆抗体的点杂交

分别取 10 μ 1 Img/ml的依实施例 1 - 5的方法制备并经 HPLC ¾过滤纯化的表 2 中所示多肽，緩慢反复点在硝酸纤维素膜上，自然风干；加入 5%的脱脂牛奶于室温封闭 1.5小时；加入如实施例 8中所述制备的各种鼠源单克隆抗体（以 5%脱脂奶 1:100稀释由单克隆 B淋巴细胞分泌的细胞上清液)，室温反应 1小时； TNT( 10mM Tris · Cl(pH8.0), 150mM NaCl, 0.05% 吐温 20 )洗涤三次，每次间隔 5分钟；加入 HRP标记的羊抗鼠 ¾G (晶美生物公司生产，以 5%脱脂奶 1:1000稀释使用），室温反应 1小时； TNT洗涤三次，每次间隔 5分钟； NBT/BCIP( C₄₀H₃oN₁₀0₆Cl₂/C₈H₆BrClN04 P C₇H₉N ) 显色。杂交点经 UVI凝胶成像仪扫描转换成灰度值而分成五种阳性等级 ++++、 +++、 ++、 +、 +-和阴性-。该方法与经典的 Western 印迹法相比，蛋白质没经过 SDS 的变性作用，更为真实地反映在无变性剂条件下的免疫反应性。表 ⁴本发明的多肽对鼠源单克隆抗体、戊肝患者恢复期血清、

戊肝病毒感染恒河猴急性期血清的反应性

ELISA 点印迹

多肽

猴血清人血清 8C11 8H3 13D8 8C11 8H3 13D8

NE2 ++ ++ +++ ++ +++ ++++ ++ +++

193C ++ ++ +++ + ++ ++ ++ ++

178C + ++ +++ +- +++ ++ ++ ++

168C - +- ++ - +++ +/- +/- +/-

158C + - + + - +++ + +/- +/-

148C + ++ - 一 - +/- +/- +/-

138C - - - - - +/- +/- +/-

NE2I +++ ++ + +++ +++ +++ ++ +++

2171 + + ++ - ++ + + +

1931 ++ ++ ++ - ++ +++ ++ +++

1781 +++ ++ ++ - ++ ++ ++ ++

NE2D ++ ++ ++ - ++ + + +

217D ++ ++ ++ _ ++ + + + 193D ++ ++ ++ - ++ + + +

178D ++ ++ +++ - +++ + + +

235N ++ +- +++ +- +++ +++ + +++

225N +++ +++ +++ +- +++ ++++ + +++

209N ++ ++ +++ + +++ ++++ +' +++

208N + +++ +++ - +++ ++ + ++

207N ++ + +

203N - - - - - ++ + +

193N - ++ + +

176N + - - - + +/- +

247 +++ + +++ ++++ +++ ++++

232 +++ + +++ ++++ ++++ ++++

222 +++ +- +++ ++++ ++ ++++

205 ++ + +++ - +++ +++ ++ ++

201 +++ + ++ ++++ ++ ++++

189 +- +++ - +++ ++ ++ ++

188 - +- ++ +++ ++ ++ ++

183 - + +- - +- ++ ++ ++

173 - ++ + ++

170 +++ - +++ ++++ +++ ++++

C160 - - -

N160 ++ - ++ ++ - ++

150 -

144 ++ - ++ ++ - ++

142 -

134 - 实验结果

分别以如表四所列纯化的重组多肽包被微孔板，以 ELISA方法检测其与实施例 8中所述三株鼠源单抗 8C11、 8H3和 13D8、戊肝患者恢复期血清以及戊肝病毒感染恒河猴急性期血清的反应，并以斑点杂交方法检测纯化的重组多肽与所用三株单抗的反应，结果其中的多肽 NE2、 193C、 178C、 NE2I、 235N、 225N、 209N、 247、 232、 222及 201对各血清 /单抗均反应良好，说明这些多肽呈现出较好的天然 HEV表位，可用于戊肝诊断试剂盒和 /或疫苗。

多肽 138C、 C160、 150、 142和 134的对各抗体的反应均差，说明 ORF2主要天然表位的形成至少要包含 469位氨基酸至 600位氨基酸的片段。

多肽 170、 C160、屬0、 150、 144、 142和 134的序列分别为起始氨基酸（ Met)之后分别接上 ORF2的 aa459~aa628、 aa469~aa628, aa459~aa618、 aa469~aa618、 aa459~aa602、 aa459~aa600 和 aa469〜aa602。实施例 11：本发明的多肽与鼠源单克隆抗体的 Western印迹

如实施例 1 - 5中所述制备的本发明多肽 208N、 209 和 225N分别与实施例 8中制备鼠源单克隆抗体 1F6、 2C9、 3F5进行 Western 印迹实验。所述多肽先经 SDS-PAGE分离，再按常规方法转移到硝酸纤维素膜上，加入 5%的脱脂奶于室温封闭 1.5小时；加入各种鼠源单克隆抗体（以 5%脱脂奶 1:100稀释由单克隆 B淋巴细胞分泌的细胞上清液)，室温反应 1小时； TNT洗涤三次，每次间隔 5分钟；加入 HRP标记的抗鼠 IgG (以 5%脱脂奶 1:1000稀释)，室温反应 1小时； TNT洗涤三次，每次间隔 5分钟； NBT/BCIP显色。 Western 印迹结果参见图 6。结果表明， Western印迹实验反应具有酶^：大效应，可观察到考马斯亮兰 R250染色显示不出的多聚体带，泳道 8 最为明显。进一步证实本发明的重组多肽 208N经 12 %丙烯酰胺 SDS-PAGE过程，没有多聚体形式的存在；单克隆抗体 1F6对 209N 和 225N多聚体的反应性比单克隆抗体 2C9、 3F5强。实施例 12：包含多肽 201的疫苗的制备以及利用其免疫小鼠的实验包含多肽 201的含有弗氏佐剂疫苗的配制

如上述制备本发明的多肽 201样品，经 HPLC纯化，纯度大于 95 % , 蛋白浓度为 1.02mg/ml, 用 PBS稀释，再加入等体积的弗氏完全佐剂（含卡介苗），使多肽 201终浓度到一定的量（如，设计每只小鼠免疫剂量为 5 μ 免疫体积为 ΙΟΟ μ Ι, 则配置的多肽 201终浓度为 0.05mg/ml)。混合乳化 30分钟，直至静置 30分钟仍没有出现油脂分层为止。

以弗氏佐剂为疫苗佐剂，免疫剂量梯度为每只注射 0.5、 1、 1、 5 量，每组平行免疫 3只昆明白小鼠。注射体积为 ΙΟΟ μ Ι/只鼠，注射方式为肌肉注射，免疫程序为 0、 7、 28 结果参见图 7。结果表明，弗氏佐剂配制的 ORF2-201疫苗，剂量在 2 /只以上有很强的免疫原性，免疫第二周即开始产生抗体，第四周达到最高滴度，据常规相关免疫学书籍和文献一般认为，通常蛋白抗原免疫小鼠剂量应在 30-70 μ _§/只才能产生高滴度的抗体。由此表明，本发明多肽 201与弗氏佐剂相结合的疫苗佐剂比现有疫苗有显箸高的免疫效果。多肽 201质铝佐剂疫苗的配制

原始铝佐剂来自兰州生物制品研究所（ A13+ 13.68% , Na+ 3.36%, pH5.55 ), 使用时，取所需量，用 1N的 NaOH调整酸度至刚好出现沉淀，混匀，加入 1 X PBS至 2倍体积， lOOOOrpm, 离心 1分钟，弃上清；沉淀再加 l x PBS至 2倍体积重悬， lOOOOrpm, 离心 1分钟，弃上清；重复平衡多次，直到上清 pH为 7-7.4为止，最后加 1 X PBS至等体积重悬，灭菌后存放于 4*C，以 1/9体积使用。

类似地，将如上所述制备的多肽 201样品经 HPLC 纯化，纯度大于 95% , 蛋白浓度为 1.02mg/ml, 用 PBS稀释，再加入 1/9体积的铝佐剂，使多肽 201的终浓度到一定的量， 4°C , 混合过夜。使用剂量为 100 μ !/只鼠。以铝佐剂为免疫佐剂，剂量梯度为 2、 5、 10 μ g/只，每组平行免疫 3只 Bal b/c小鼠。注射方式为肌肉注射，免疫程序为 0、 7、 28天。结果参见图 9。结果表明， 5 μ ΙΟμ 只的剂量有良好的免疫效果，这与市售的乙肝表面抗原疫苗效果相当，而乙肝表面抗原疫苗为颗粒性抗原，公认比一般的单体抗原免疫原性更好，从而说明本发明的多聚体多肽适用作为疫苗。无佐剂多肽 201疫苗的免疫实验

将如上获得的本发明多肽 201经为 4Μ尿素溶解离心上清，经 PBS ρΗ7.45透析复性的离心上清，纯度为 95%左右。以弗氏佐剂为对照，剂量梯度为 5、 25、 50ug/只，对照组为 5ug/只，每组平行免疫 3只昆明小白鼠。注射方式为肌肉注射，免疫程序为 0、 7、 28天。结果参见图 8。结果表明，无佐剂 ORF2-201疫苗免疫小鼠，有明显的抗体产生，与常规抗原的弗氏佐剂吸附样品的使用剂量相当，进一步说明本发明的多聚体多肽比有常规单体抗原更好的免疫原性。上迷结果表明，本发明中，将重组多肽 201、 NE2分别免疫 Bal b/c 小鼠，以 5ug/只的剂量，弗氏佐剂和铝佐剂配方，都能诱发鼠体产生特异性的抗体，其余的可复性多肽以弗氏佐剂配方也都能使鼠体产生良好特异性抗体，说明本发明的多肽具有用作疫苗的良好特性。实施例 13: 利用包含本发明的重組多肽的疫苗免疫恒河猴

选取 HEV各个指标均阴性并 ALT正常的恒河猴六只，分成两组，一组编号为 HF1、 HF2、 HF3, 一組为 HF4、 HF5、 HF6, 分别以如实施例 1 - 5和实施例 12制备的含有铝佐剂的多肽 NE2I 疫苗与多肽 201疫苗免疫受试恒河猴。免疫剂量都为 20 g , 三角肌注射，免疫方案为 0、 10、 30天。在最后一次加强后第 3周，利用间接 ELISA 测定各猴抗 NE2I- G 抗体的滴度分别为 HF1(1: 16000) 、 HF2(1:4000) 、 HF3(1:8000) 、 HF4(1:2000) 、 HF5(1:3000)、 HF6(1:5000)。

以多肽 NE2I和多肽 201为例的上述结果表明，本发明的重组多肽与 5885768 号美国专利中用做免疫原的戊型肝炎 ORF2 多肽 trpE-C2 ( SEQ ID NO: 1的 225 - 660位）相比，均具有良好的免疫原性。在 5885768号美国专利中， Reyes 等用大肠杆菌表达的戊型肝炎 ORF2多肽 trpE-C2用改良铝佐剂每针 50 μ g静脉注射，以 0天、 30天方案免疫 4只食蟹猴，同时以 2只食蟹猴仅注射佐剂作为对照，结果在 4周后免疫组均未检测到抗体产生。取其中 2只在第 58天时以 80 μ g无佐剂的不溶性 trpE-C2多 ½行第三次免疫，在 4周后方可检出抗体。实施例 14: HEV病毒对利用包含本发明的重組多肽疫苗免疫恒河猴猴的攻击实验

HEV病毒的制备与定量

取一份来自新疆的 HEV病人的粪便，用无菌生理盐水配成 10 %的悬液， 12000g 4。C离心 20 分钟，上清用 0.2 μ πι的除菌滤器 ( NALGENE® Cat.No.190-2520 ) 除菌。以 PCR可见的 HEV病毒量为一个感染剂量。

粪便 HEV RNA的提取、反转录及 PCR: 10%的粪便悬液用 GIBCOL公司的 Trizol试剂按其操作说明提取， 20 μ 1体积反转录，反转录引物为特异性引物 A3 ( 4566-4586, 5 -ggctcaccggagtgtttcttc- 3' ), AMV反转录酶 42°C反转录 40分钟。 nt-PCR第一轮引物为 A5

( 4341-4362, 5 -ctttgatgacaccgtcttctcg-3 A3, 反转录模板加 2 μ 1，总体积为 20 μ 1，条件为： 94°C预变性 5分钟； 94 变性 40秒， 68 °C 复性延伸 40秒， 35个循环； 72°C延伸 5分钟。第二轮引物为 B5 ( 4372-4392, 5 -gccgcagcaaaggcatccatg-3 ), B3 ( 4554-4575, 5 -gtgtttcttccaaaaccctcgc-3' ), 第一轮模板加 Ι μ ΐ, 总体积为 20 μ ΐ, 条件为： 94*C预变性 5分钟； 94Γ 变性 40秒， 56°C 复性 40秒， 72 延伸 1分 20秒， 35个循环；延伸 5分钟。

实验猴分組：免疫组 1中所用猴编号为为 V10、 VII、 V12 (分别对应于实施例 2中猴子 HF1、 HF2、 HF3 )；免疫組 2为 V13、 V14、 V15 (分别对应于实施例 2中的猴子编号 HF4、 HF5、 HF6 ); 空白组为 V16、 V17 V18。病毒攻击

以 PCR可见的 HEV病毒量为一个感染剂量。在利用如实施例 13所迷包含本发明重組多肽的疫苗对实验猴 HF1-6最后一次加强免疫后，第 3周对上述各猴以 1000个感染剂量攻击。攻毒后各猴 ALT 均未见升高。实验猴 V16、 V17于第 4周可检测到 Anti-NE2I-IgG， V18于第 5周可检测到 Anti-NE2- G。从第 1到 37天， V10-15均未检测到排毒； V16排毒从第 5天开始到第 30天结束； V17、 V18 也从第 5天开始，到第 37天仍未结束。这些结果表明了本发明涉及的这些多肽作为疫苗与 5885768号美国专利中的戊型肝炎病毒 ORF2 多肽 trpE-C2相比，具有良好免疫原性和保护性。

由这些结果可见，本发明涉及的疫苗以较小的剂量免疫恒河猴后，免疫组能产生很好的抗体反应，在病毒攻击后既没有转氨酶的升高，又检测不到粪便排毒，具有比采用 HEV ORF2之 trpE-C2为疫苗（美国专利 5885768 )和 Tsarev等人制备的多肽制成的疫苗。已报道结果更好的保护性。另外，由于 Tsarev和 Genelabs公司均采用对人体有潜在安全问题的杆状病毒表达系统由于其潜在的安全性问题，迄今仍未见有利用该系统表达的重組蛋白正式被批准用于商业化人体体内药物或疫苗的报告，而本发明利用大肠杆菌表达系统表达的重组多肽已有多种用作于商业化人体体内药物，具有更为可靠的安全性。实施例 15: 与本发明多肽 247嵌合的 HEV ORF3 中的表位之嵌合多狀的制备

以从新疆维吾尔自治区的戊肝病人中克隆得到的 HEV全基因 ( Aye，T.T" Uchida等，核酸研究， 20 (13)， 3512 (1992); GenBank 序号： GI221701 ) 为模板，利用正向引物 372FP ( 5'- ggatcccatatgaataacatgtcttttgct-3' ), 其 5，端引入限制性内切酶 BamHI和 Ndel位点；以及反向引物 372BRP ( 5'-ggatcctcggcgc ggcc-3' ), 其 5，端引入 BamHI位点，以如下条件进行 PCR反应： 94 °C 5分钟， 30 χ 50秒， 56°C 50秒， 72 °C 30秒)， 72 °C 10 分钟，得到特异的 370bp左右大小编码 HEV ORF3中表位的 DNA 片段。上述获得的 PCR产物与商售的 pMD 18-T载体（TAKARA 公司生产）连接， BamHI酶切鉴定得到插入 HEV-ORF3 中的表位基因的阳性亚克隆。核苷酸测序表明其未发生变异，由此得到 ORF 3 中表位的氨基^^列，见 SEQ ID NO: 11。

BamHI瑭切获得 HEV-ORF3基因片段，再与经 Bamffl酶切的按照实施例 1所述方法制备的 pTO-T7-ORF2-247表达质粒载体相连接， BamHI酶切鉴定得到插入 HEV-ORF3基因的阳性表达克隆 pTO-T7- ORF3-247, 该克隆转化大肠杆菌 ERR2566 菌株，用于表达 ORF3-247嵌合多肽。实施例 16：流感病毒血液凝集素（ΗΑ )与本发明的多肽 NE2D之嵌合多肽的制备

以如实施例 1中制备的 HEV-ORF2突变序列（ SEQ ID NO: 6 ) 为模板，以如下所示设计的正向 /反向引物 HAFP/E2RD, 94 C 5分钟， 30 x (94°C 50秒， 56°C 50秒， 72 °C 70秒)， 72V 10分钟，进行 PCR扩增，得到特异的 800bp左右大小的包含编码流感病毒血凝素 HA与本发明的多肽 NE2D之嵌合多肽的 DNA片段。其中 HAFP 为正向引物，其 5，端引入限制性内切酶 BamHI和 Ndel位点， Ndel 位点序列为 CAT ATG, ATG为大肠杆菌的起始密码子，并在 HA 与本发明多肽 NE2D之间引入柔性连接 Gly-GIy-Ser, 使两者的活性都能得以表现，以达到利用 HA增强本发明多肽 NE2D免疫原性的目的； E2RD为反向引物，其 5，端引入终止密码子和限制型内切酶 EcoRI位点。设计目的是在表达载体中翻译没有融合蛋白的 ORF2- NE2D蛋白盾，适用作为疫苗。

HAFP: 5，- AGAT T ATATG TCT AAA GCT TTC TCT AAC TGC TAC CCT

Bgin Ndel 91 Ser Lys Ala Phe Ser Asn Cys Tyr Pro

TAC GAC GTT CCG GAC TAC GCT TCT TTA GGT GGA TCC

Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leul08 Gly Gly Ser

CAG CTG TTC TAC TCT CGT CC-3' E2RD :5'-gaattcttagggggctaaaacagc-3 包含编码所得嵌合多肽的核酸构建体之表达载体的制备

将上述获得的 PCR产物与商售的 pMD 18-T载体（ TAKARA 公司生产）连接， Bamffl/EcoRI晦切鉴定得到插入本发明 ORF2 - NE2D基因的阳性亚克隆； Ndel/EcoRI酶切获得 HA-ORF2-NE2D 基因片段，再与经 Ndel/EcoRI酶切的 pTO-T7表达质粒载体相连接， Ndel/EcoRI酶切鉴定，得到插入编码本发明 ORF2-NE2D基因的、包含编码所得嵌合多肽的核酸构建体之阳性表达载体 PTO-T7- HA- ORF2-NE2D, 该克隆转化大肠杆菌 ERR2566菌株，用于表达 HA- ORF2-NE2D嵌合多肽。得到的 HA-ORF2-NE2D嵌合多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 12所示。实施例 17: 利用包含本发明的多肽 E2I的 IgG抗体诊断试剂盒诊断生物学样品中戊型肝炎病毒感染

包含本发明的重組多肽 NE2I的 G抗体诊断试剂盒组成如下：包^^包被好重组多肽 NE2I并用封闭液（ 20mM pH7.2 PB, 5%酪蛋白， 2%深水鱼皮明胶）封闭好的微孔条；样品稀释液（ 20mM H7.2 PB, 1%酪蛋白）；以及用酶稀释液（20mM pH7.2 PB, 5% 白, 10%新生牛血清）适当稀释的 HRP标记的抗人 ¾G抗体（DAKO 公司）；非生物活性材料如 20 X PBST, 显色剂 A、显色剂 B、终止液等购自北京万泰公司。

以 NE2I組装抗 HEV-IgG抗体诊断试剂盒，对 HEV感染的猴子的系列血进行检测，以两种商业试剂（北京万泰公司和新加坡 Genelabs公司）为对照。系列血逸模拟天然 HEV感染的猴子 Nol、 2、 3、 13在静脉攻毒后 0到 18周的血清。此试剂盒检测生物学样品中抗 HEV- G抗体步骤如下：在已预包被多肽 E2I的微孔条中加入 100 μ 1样品稀幹液；在样品稀释液中加入 10 μ 1待测血清，轻拍混匀后于 37°C温育 30分钟；然后用 PBST 洗涤 5次，在吸水纸上扣干后每孔加入 100 μ 1已稀释好的标记 HRP 的抗人 G抗体,轻拍混匀后再次于 37°C温育 30分钟；再次用 PBST 洗涤 5次并扣干后，加入显色剂 A、 B各 50 μ 1, 37°C温育 10分钟后，加终止液 50 μ ΐ终止，于晦标仪上读取 OD_45Q/62Qnm的读值。北京万泰公司和新加坡 Genelabs公司检测抗 HEV-IgG抗体的诊断试剂盒严格按其各自的操作说明书搡作。

结果采用本发明 NE2I的试剂检出生物学样品中 IgG抗体时间比 Genelabs公司及万泰公司试剂平均早 7 ~ 14天； Anti-NE2I-IgG 持续时间比 Genelabs Anti-HEV-IgG及万泰 Anti-HEV-IgG 长； Anti-NE2- G检出率比 Genelabs Anti-HEV-IgG及万泰 Anti-HEV- IgG高（参见图 10, 具体数据见表 5 )。对 34份随意人血清进行检测 ,本发明的 Έ2Ι试剂及 Genelabs试剂阳性率分別为 35 %与 11 % , 后者阳性者前者都能检出。对 263份临床肝炎标本进行 E2I-IgG 试剂、万泰 Anti-HEV-IgG试剂检测，阳性率分别为 27.7%、 10.6%。对 91份非甲、乙、丙肝炎病人血清进行 E2I-IgG试剂、 Genelabs 试剂检测，阳性率分别为 69.2%、 24.2 %。由此可看出本发明的 NE2I 试剂较现有商业试剂的更高的灵敏度。

表 5本发明提供的抗戊型肝炎 G抗体检测试剂盒（NE2I- G)与两种商业试剂对系列 HEV感染猴血清的检出情况比较

No.l血清 Ow lw 2 3w 4w 5 6w 7w 8 9w 10 llw 12w 13w 14w 15w 16w 17w 18

Genelabs Anti-HEV-IgG 0.01 0.01 0.01 0.01 0.21 2.6 3 3 2.61 1.7 1.36 0.92 0.92 0.92 0.96 0.72

万泰 Anti-HEV-IgG 0.01 0.02 0.01 0.02 0.01 1.8 2.45 2.48 2.4 1.7 1.3 0.54 0.36 0.25 0.18 0.1 0.05 0.05 0. 本发明 E2I-IgG 0.01 0.02 0.01 1.87 2.56 2. 2.52 2.49 2.7 2.52 2.5 2.47 2.53 2.58 2.64 2.65 2.40 2.36 2.

No.2血清 Ow lw 2 3w 4w 5 6w 7w 8 9w 10 llw 12w 13w 14w 15w 16w 17w 18

Genelabs Anti-HEV-IgG 0.05 0.07 0.05 0.04 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

万泰 Anti-HEV-IgG 0.02 0.02 0.02 0.02 2.05 2.5 2.42 2.46 2.6 2.5 2.3 2.23 2.3 2.21 2.2 2.26 2.26 2.38 2. 本发明 NE2I-IgG 0.06 0.06 0.06 0.77 2.26 2.3 2.5 2.56 2.6 2.65 2.4 2.47 2.4 2.54 2.51 2.38 2.29 2.34 2.

No.3血清 Ow lw 2w 3w 4w 5 6w 7w 8 9w 10 llw 12w 13w 14w 15w 16w 17w 18

Genelabs Anti-HEV-IgG 0.05 0.02 0.02 0.02 0.78 3 2.91 2.8 2.77 2.2 1.95 1.79 1.54 1.42 1.42 1.38

万泰 Anti-HEV-IgG 0 0 0 0.02 0.02 1.8 1.62 1.67 1.8 1.48 1.0 0.67 0.75 0.76 0.58 0.38 0.46 0.34 0. 本发明 E2I-IgG 0.01 0.05 0.04 0.83 2.2 2.6 2.59 2.62 2.7 3 2. 2.6 2.55 2.6 2.54 2.51 2.51 2.36 2.

No.13血清 Ow lw 2w 3 4w 5 6w 7w 8 9w 10 llw 12w 13w 14w 15w 16w 17w 18

Genelabs Anti-HEV-IgG 0.04 0.03 0.03 0.03 0.04 0.0 0.15 0.1 0.0 0.06 0.0 0.07 0.08 0.07 0.1 0.15 0.07 0.04 0. 万泰 Anti-HEV-IgG 0.02 0 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.0 0.03 0.0 0.03 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 本发明搬 I-IgG 0.1 0.11 0.09 0.09 2.3 2.4 2.51 2.5 2.3 2.21 2.1 2.14 2.05 2.01 1.82 1.87 1.79 1.7 1

实施例 18：对本发明的重组蛋白进行酶标的方法

各取 HRP、 NaI04 1 mg，加超纯水溶解；然后在 HRP溶液中逐滴加入 NaI04溶液，边加边搅拌，并将混合好的溶液置于 4°C；，暗置 30分钟；取 Ιμΐ 乙二醇溶于超纯水中，边加边搅拌的逐滴加入上述混合溶液中，室温暗置 30分钟，至此酶氧化过程完成。在氧化 HRP的过程中，用 ρΗ9.6左右的 50mM CB透析重组蛋白。 HRP 氧化完后，将透析好的重组蛋白与 HRP按所需比例混合，于 50mM pH9.5 CB中透析 6 小时以上；然后用新鲜配置的 NaBH4溶液终止， NaBH4量为 0.2 mg;摇匀， 4*€静置 2小时。然后用 pH7.2的 10 mM PBS透析过夜。实施例 19检测生物学样品中戊型肝炎病毒 IgM抗体的诊断试剂盒和检测生物学样品中戊型肝炎病毒 IgM抗体的捕获法

利用实施例 18所述的方法，对本发明的多肽 225N进行辣根过氧化物酶（HRP )标记。

辣根过氧化物酶标记的包含本发明的重組多肽 225N的捕获法检测 M抗体的诊断试剂盒组成如下：包含预包被好抗人 Μ μ链多克隆抗体（丹麦 DAKO公司）并封闭好的微孔条；样品稀释液（ 20mM pH7.2 PB, 1%酪蛋白）；以及用晦稀释液（20mM pH7.2 PB, 5% 酪蛋白， 10%新生牛血清）适当稀释的 HRP标记的重组多肽 225N; 非生物活性材料如 20 x PBST、显色剂 A、显色剂 B、终止液等购自北京万泰公司。

用此试剂盒检测生物学样品中戊型肝炎病毒 M抗体的捕获法包含如下步骤：在已预包被抗 μ链多抗的微孔条中加入 ΙΟΟ μ Ι样品稀释液；在样品稀释液加入 1 μ 1待测血清，轻拍混匀后于 37*C温育 30分钟；然后用 PBST洗涤 5次，在吸水紙上扣干后每孔加入 100 μ ΐ已稀释好的标记 HRP的重組多肽 225Ν, 轻拍混匀后再次于 37 温育 30分钟；再次用 PBST洗涤 5次并扣干后，加入显色剂 Α、 Β各 50 μ 1, 37*C温育 10分钟后，加终止液 50 μ 1终止，于酶标仪上读取 00₄₅。_/62()11111的读值。

利用如上述制备的本发明试剂盒用捕获法，对 263份临床肝炎标本进行 Anti-HEV-IgM检测，阳性率为 11 %。对 91份临床非甲、乙、丙肝炎病人血清进行 Anti-HEV-IgM捕获法检测，同时利用 Genelabs生产的 Anti-HEV-IgG检测试剂盒进行检测，阳性率分別为 48.4%、 24.2%。上述结果表明，采用本发明制备的诊断试剂盒以及捕获法检测 IgM抗体，检测结果为阳性者与临床诊断结果吻合好，而且大多数 Genelabs试剂阳性者捕获法 M 亦阳性，表明该捕获法 IgM试剂用于临床戊肝诊断较现有商业试剂更为灵敏与特异。实施例 20检测生物学样品中戊型肝炎病毒总抗体的诊断试剂盒和检测生物学样品中戊型肝炎病毒总抗体的方法

利用实施例 18所述的方法，对本发明的多肽 225N进行辣根过氧化物酶标记。

包含本发明的重组多肽 NE2I、 225 的总抗体诊断试剂盒组成如下：包含预包被好重組多肽 NE2I并封闭好的微孔条；以及用酶稀释液（ 20mM pH7.2 PB， 5%»酪蛋白， 10%新生牛血清）适当稀释的 HRP标记的重组多肽 225N; 非生物活性材料如 20 x PBST、显色剂 A、显色剂 B、终止液等购自北京万泰公司。

用如上述制备的本发明试剂盒检测生物学样品中抗戊型肝炎病毒总抗体的夹心法包含如下步骤：在已预包被重组多肽 E2I的微孔条中加入血清 50 μ I并加入 50 μ I已稀释好的标记 HRP的重组多肽 225N, 轻拍混匀后于 37"C温育 60分钟；用 PBST洗涤 5次并扣干后，加入显色剂 A、 B各 50 μ 1, 37°C温育 15分钟后，加终止液 50 μ 1终止，于酶标仪上读取 OD₄₅。_/62。_nm的读值。

对部分血清的检测结果如下：用本发明所述诊断试剂盒对 263 份临床肝炎标本进行 Anti-HEV 总抗体夹心法检测，同时用万泰 Anti-HEV-IgG试剂检测，阳性率分别为 52%、 10.6 %。用本发明所述诊断试剂盒对 91份非甲、乙、丙肝炎病人血清进行 Anti-HEV总抗体夹心法检测，同时用 Genelabs Anti-HEV-IgG检测，阳性率分别为 54.9%、 24.2%。结果表明，采用本发明制备的诊断试剂盒的检测结果优于现有临床用诊断试剂。

Claims

权利要求 1- 一种包含戊型肝炎病毒 ORF2之 SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列或其片段的多肽的 n聚体，其中 n为 1-180的整数，包含的所述 SEQ ID NO: 1的氨基酸片段的多肽选自：

( 2 )氨基端位于 370位至 469位氨基酸之间，羧基端位于 601 位氨基酸至 628位氨基酸之间的多肽，

( 3 )氨基端位于 390位至 459位氨基酸之间，羧基端位于 601 位氨基酸至 610位氨基酸之间的多肽，

( 4 )具有 SEQ ID NO: 1的 414位至 660位氨基 ^^列的多肽，即多 J& 247,

( 5 )具有 SEQ ID NO: 1的 429位至 660位氨基酸序列的多肽，即多肽 232,

( 6 )具有 SEQ ID NO. 1的 439位至 660位氨基 ^^列的多肽，即多肽 222,

( 7 )具有 SEQ ID NO: 1的 459位至 660位氨基 ^^列的多肽，即多肽 201,

( 8 )具有 SEQ ID NO: 1的 394位至 628位氨基 ^^列的多肽，即多肽 235N，

( 9 )具有 SEQ ID NO: 1的 394位至 618位氨基 ^^列的多肽，即多肽 225N，

( 10 )具有 SEQ ID NO: 1的 394位至 602位氨基 ^^列的多肽，即多肽 209N,

( 11 )具有 SEQ ID NO: 1的 394位至 601位氣基 ^^列的多肽，即多肽 208N,

( 12)具有 SEQ ID NO: 1的 394位至 606位氨基列的多肽，即多肽 NE2I,

( 13 )具有 SEQ ID NO: 1的 390位至 603位氨基 ^^列的多肽，即多肽 217D,

( 14 )具有 SEQ ID NO. 1的 374位至 618位氨基 ^^列的多肽，即多肽 205,

( 15 )具有 SEQ ID NO: 1的 414位至 602位氨基 ^^列的多狀，即多肷 189,

( 16 )具有 SEQ ID NO: 1的 414位至 601位氨基^^列的多肽，即多肽 188,

( 17 )具有 SEQ ID NO: 1的 459位至 628位氨基 ^^列的多肽，以及

( 18)氨基端添加 Met, 羧基端被修饰的 SEQ ID NO: 1的 X 位至 603位氨基^^列的多肽，其中所迷端修饰是 603位氨基酸 Pro的 3，端以 5， - 3，方向添加氨基酸序列 -Pro-Pro-Arg, 包括： a) X=394时，所迷多肽为 SEQ ID NO: 2所示的多肽，即 E2; b) X=414时，所述多肽为 SEQ ID NO: 3所示的多肽，即 193C; c) X=429时，所迷多肽为 SEQ ID NO: 4所示的多肽，即 178C; d) X=439时，所述多肽为 SEQ ID NO: 7所示的多肽，即 168C; e) X=449时，所迷多肽为 SEQ ID NO: 8所示的多肽，即 158C; Q X=459时，所迷多肽为 SEQ ID NO: 9所示的多肽，即 148C; g) X=469时，所迷多肽为 SEQ ID NO: 10所示的多肽，即 138C。

( 19)与上述（1 ) - ( 18 ) 中的任一多肽具有至少 80%同一性，且具有相同的抗原性、免疫原性等生物学性质的多肽。

2. —种重组表达载体，其包含编码权利要求 1 所述多肽的核苷列。

3. —种经权利要求 2 的重组表达载体转化的宿主细胞，其能够表达权利要求 1的多肽。

4. 一种用于预防和 /或治疗哺乳动物戊型肝炎病毒感染的疫苗组合物，其至少含有权利要求 1 的多肽之一或其任意组合，以及任选地药学可接受的载体和 /或佐剂。

5. —种包含权利要求 1 的多肽与流感病毒血凝素的保守片段的嵌合蛋白。

6- 一种用于预防和 /或治疗哺乳动物戊型肝炎病毒感染的疫苗组合物，其含有权利要求 5 的嵌合蛋白，以及任选地药学可接受的载体和 /或佐剂。

7. 一种用于免疫哺乳动物使其免受戊型肝炎病毒感染的权利要求 1多肽或权利要求 5的嵌合蛋白。

8. 权利要求 4或 6的疫苗組合物用于免疫哺乳动物使其免受戊型肝炎病毒感染的用途。

9- 一种用于预防和 /或治疗哺乳动物戊型肝炎病毒感染的方法，其包括向受试者施用预防和 /或治疗有效量的权利要求 1 的多肽或权利要求 5的嵌合蛋白。

10. 一种用于诊断生物学样品中戊型肝炎病毒感染的诊断试剂盒，其中包括诊断有效量的至少一种权利要求 1的多肽或其任意组合。

11. 权利要求 10的诊断试剂盒，其还包括戊型肝炎 ORF3中的免疫原性表位的多肽或其有免疫原活性的片段，其中 ORF3 的免疫原性表位多肽或其具有免疫原活性的片段任选地与所用的权利要求 1 的多肽共价结合。

12. 权利要求 10或 11的诊断试剂盒，其用于检测生物学样品中戊型肝炎病毒 IgG抗体，其中包含至少一种选自权利要求 1中的多肽，如需要，所述多肽可预包被合适的支持物表面；还包括带有可检测标记的抗待检生物样品来源的 G抗体和与可检测标记相应的检测剂，如需要还应包括适当的緩冲体系。

13. 权利要求 10或 11的诊断试剂盒，其用于检测生物学样品中戊型肝炎病毒 M抗体，其中包括使用抗待检生物样品来源的 IgM抗体作为捕捉抗体，如需要，所迷捕捉抗体可预包被合适的支持物表面，还包括带有可检测标记的至少一种选自权利要求 1 中的多肽和与可检测标记相应的检测剂，如需要还应包括适当的緩冲体系。

14. 权利要求 10或 11的诊断试剂盒，其用于检测生物学样品中戊型肝炎病毒总抗体，其中包括至少一种选自权利要求 1 中的多肽，如需要所述多肽可预包被于合适的支持物表面；还包括带有可检测标记的选自权利要求 1 中的多肽，以及与所选可检测标记相应的检测剂，其中用于预包被支持物表面所用的选自权利要求 1 中的多肽之多肽可以与同样选自权利要求 1 中的多肽之带有可检测标记的多肽为同一多肽，或不同的多肽。

15. —种诊断哺乳动物戊型肝炎病毒感染的方法，其包括用权利要求 10或 11 的诊断试剂盒在适于发生抗原抗体反应的条件下与待测哺乳动物样品相接触。

16. 一种检测生物学样品中戊型肝炎病毒总抗体的方法，其包含如下步骤：将至少一种权利要求 1 的多肽固定于支持物表面；与待测样品在适于发生抗原抗体反应的条件下相接触；用适当緩冲液洗涤；然后用带有可检测标记的戊型肝炎病毒抗原及相应的检测剂检测支持物表面的抗原抗体复合物。

17. —种检测生物学样品中戊型肝炎病毒 IgG抗体的方法，其包含如下步骤：将至少一种权利要求 1 的多肽固定于支持物表面；与待测样品在适于发生抗原抗体反应的条件下相接触；用适当緩冲液洗涤；然后用带有可检测标记的戊型肝炎病毒抗 G抗体及相应的检测剂检测支持物表面的抗原抗体复合物。

18. —种检测生物学样品中戊型肝炎病毒 IgM抗体的方法，其包含如下步骤：将抗 IgM抗体固定于支持物表面；与待测样品在适于发生抗原抗体反应的条件下相接触；用适当緩冲液洗涤；然后用带有可检测标记的至少一种权利要求 1 的多肽及相应的检测剂检测支持物表面的抗 M抗体与 M抗体复合物。

19- 一种检测生物学样品中戊型肝炎病毒 IgM抗体的方法，其包含如下步骤：将抗 IgM抗体固定于支持物表面；与待测样品在适于发生抗原抗体反应的条件下相接触；用适当緩冲液洗涤；然后用至少一种权利要求 1的多肽在适于发生抗原抗体反应的条件下相接触；用适当緩冲液洗涤；然后用带有可检测标记的抗戊型肝炎病毒多克隆抗体或单克隆抗体及相应的检测剂检测支持物表面的抗原抗体复合物。