WO2001040477A1

WO2001040477A1 - Transposase et procede de modification de genes

Info

Publication number: WO2001040477A1
Application number: PCT/JP2000/008014
Authority: WO
Inventors: Koichi Kawakami
Original assignee: Japan Science And Technology Corporation
Priority date: 1999-12-03
Filing date: 2000-11-14
Publication date: 2001-06-07
Also published as: US20060212958A1; US7741301B2; US20060212959A1; US7741302B2; EP1239042A1; JP2001218588A; JP4609869B2; EP1239042B1; US7034115B1; DE60041274D1; US7468430B2; EP1239042A4; US20060211116A1

Description

明細書トランスポゾン転移酵素および遺伝子改変方法技術分野

本発明は、トランスポザーゼ様活性を有する新規な蛋白質、当該蛋白質からなるトランスポゾン転移酵素、これを用いた細胞内の遺伝子の遺伝子構造を改変させる方法、この方法による細胞の機能を改変させる方法、この方法による遺伝子の導入方法、このためのプラスミド、及びこの方法により機能が改変された細胞に関する。背景技術

メダカ（Oryzias lat ipes) は東アジアに生息する魚であり、脊椎動物の遺伝の研究に使用されてきた。メダカの i 遺伝子座の変異は、メラニン欠乏症及び赤目を生じさせる。この i 遺伝子座はチロシナーゼの遺伝子をコードしていることが知られている。この i 遺伝子座のアレル変異体のひとつである i ⁴から約 4. 7 k bの D NAがクローニングされ、トランスポゾン様の配列を有しているとされていた。即ち、ショウジヨウバエの h o b o、トウモロコシの実の A cやキンギヨソゥの T a m 3などの h ATファミリ一のトランスポゾンのトランスポザーゼ

( iransposases) に類似したオープンり一ディイングフレームや短い逆転した配列の繰り返し（terminal inverted repeats) を有していた。メダカのこのエレメントは、 T o 1 2 と命名された。実験室で使用されるメダカは、一倍体（haploi d) のゲノム当たり約 1 0 コピー有している。

チロシナ一ゼの遺伝子座に存在した T o 1 2エレメントは、 i ⁴変異体の魚では胚発生の間に標的遺伝子座から切り出されることが P C Rにより示された（Koga 等、 1996) 。

一方、ゼブラフィッシュ（Danio rerio) もメダカ（Oryzias lat ipes) と同様に小型の硬骨魚であり、脊椎動物の遺伝現象及び発生の研究のためのモデル動物として開発されてきた（Takeuchi, 1966 ； Yamamoto, 1967 ； Streisinger 等、 1981) 。ゼブラフィッシュにおいては、大量の化学的突然変異誘発スクリーンが行なわれ（Driever等、 1996 ； Haf f ter 等、 1996) 、突然変異した遺伝子のクロ —ニングを容易にするため、シユードタイプ（pseudotyped) のレトロウイルスを用いた挿入突然変異誘発法が開発され実行されてきた（Lin 等、 1994 ； Gaiano等

1996 ； Amsterdam等、 1997) 。また、ェンハンサートラップ及び遺伝子トラップスクリーンが行なわれるようにするトランスポゾン技術の開発の試みの中で、魚類における Tc 1 /mar i n i erフアミリーのトランスポゾンの転位が調べられ、明らかにされてきた（Ivies等、 1997 ； Raz等、 1997 ； Fadool等、 1998) 。これらの結果は励みになるものではあるが、トランスポゾンを用いた非常に効率のよいトランスジエネシス又は挿入突然変異誘発法はまだ開発されていない。

本発明者らは、 T o 1 2因子を用いた新規なトランスポゾン技術の開発に興味をもってきた。この目標に向かう最初のステップとして、本発明者らはゼブラフイツシュ胚を用いて、ゼブラフィッシュの受精卵に、 T o 1 2因子を含んでいるプラスミド D NAを注入する一過性胚ェクシジョンアツセィを開発し、注入されたプラスミドから T o 1 2因子を切り出すことができることを示し、 T o 1 2 因子が自律的なメンバ一でありかつゼブラフィッシュにおいても活性があることを示した（Kawakami等、（1998) Gene 225, 17-22) 。 T o 1 2因子の D NA配列は h A Tファミリ一のトランスポゾンのトランスポザーゼと類似しているが、活性のあるトランスに機能することができる酵素も、切り出し反応に必須なシスエレメントも同定されていない。 T o 1 2因子をトランスジェネシス及び挿入突然変異誘発に有用な道具とするためには、シス及びトランスの必要条件を細かく調べ、特性を明らかにしなければならない。 T o 1 2因子によってコードされている活性のあるトランスポザーゼはまだ同定されていない。発明の開示

本発明は、第一にゼブラフィッシュ胚に注入された T o 1 2因子から転写された mR N Aを同定することを目的とする。次いで、この転写物が活性のある酵素をコード化しているかどうかを調べるため、ゼブラフィッシュ受精卵に、 T o l

2 c D N Aを铸型として用いて試験管内で合成された R NAと、トランスポザーゼをコード化している領域に欠失をもつ非自律的 T o 1 2因子を含んでいるブラスミド D N Aとをコインジェク卜する新規な分析法を開発する。

また、本発明は、ゼブラフイツシュにおける T o 1 2因子の切り出しに機能する、活性のあるトランス因子及び必須なシスエレメントを同定する。

したがって、本発明は、 T o 1 2因子にコードされている新規な蛋白質、それをコードするポリヌクレオチドを提供するものである。また、本発明は、当該蛋白質を用いて細胞、好ましくは脊椎動物の遺伝子構造を改変する方法、遺伝子構造の改変による細胞機能を改変する方法、これらの方法により機能が改変された細胞を提供するものである。さらに、本発明は遺伝子の転移に必要なシスエレメント構造を解明し、これを提供するものである。本発明は、配列表の配列番号 2 に示されるアミノ酸配列、又はそのアミノ酸の一部が置換され若しくは欠失し、又は他のアミノ酸が付加していてもよいアミノ酸配列を有するトランボザ一ゼ様活性を有する蛋白質に関する。また、前記の蛋白質からなるトランスポゾン転移酵素に関する。

また、本発明は、前記の蛋白質をコードする核酸、好ましくは配列表の配列番号 1 に示される塩基配列を有する D N A若しくは当該 D N Aにハイプリダイズし得る D N A、又は対応する R N Aに関する。

本発明は、前記の蛋白質がトランスボゾンを転移させるトランスポザーゼ様活性を有していること明らかにし、当該蛋白質又は当該蛋白質を産生し得る核酸の存在下で、細胞内、好ましくは脊椎動物の細胞内の遺伝子の一部を切り出し又は切り出して他の箇所に挿入することからなる遺伝子構造を改変させる方法に関する。当該切り出される遺伝子の一部の塩基配列の上流に、少なくとも 1 回の逆方向反復配列（i nv e r t e d r e pe a t s (Ange 1 エレメント））を含む塩基配列を有する遺伝子であることが好ましい。

また、本発明は、前記の方法を用いて、細胞の遺伝子に外来遺伝子を導入する方法、及び細胞の遺伝子の発現に基づく機能を改変する方法に関し、さらに本発明は、これらの方法により機能が改変された細胞に関する。

そして、本発明は、これらの方法に使用されるプラスミド、より詳細には塩基配列の上流に、少なくとも 1 回の逆方向反復配列を含む塩基配列を有する D N A を含有してなるプラスミドにも関する。

さらに、本発明は、脊椎動物のゲノム D N A中に、他の遺伝子を挿入する方法において、トランスポザースを用いて自律的に当該挿入を行うことを特徴とする脊椎動物のゲノム D N A中に他の遺伝子を挿入する方法、好ましくは他の遺伝子が丁 o 1 2エレメントであり、脊椎動物が、魚類である前記方法に関する。図面の簡単な説明

第 1 図は、 T o 1 2 プラスミド及びその転写物の構造、及び本発明の c D N A の構造を示すものである。破線部分はイントロンを示す。一番目のイントロンにある逆方向反復配列（ A n g e 1 エレメント）と、本発明で用いたプライマーの位置とを矢印で示す。

第 2図は、本発明の T o 1 2及び A c トランスポザーゼのアミノ酸配列の比較 ¾ 示" 5—。

第 3図は、本発明のコインジェクションによる一過性胚ェクシジョンアツセィの概要を示したものである。切り出し産物（ t y r — e x 4 f 及び t y r — e x 5 r ) の検出に用いたプライマーを矢印で示す。

第 4図は、ゼブラフィッシュ胚における本発明の切り出し反応の P C R分析の結果を示す図面に代わる写真である。

第 5図は、 T o 1 2エレメントをゲノムに転移させるための（T o 1 2 — t y r ) A R Vプラスミド、（T o 1 2 — t y r ) 及び T o 1 2 c D NAの構造を示す。第 5図上部の黒線はサザンブロッ卜分析に使用するプローブ部分を示す。第 6図は、 T o 1 2エレメントの存在が確認された親（ f f 一 1及び f f - 7 ) のそれぞれの子孫 F ,のサザンプロット分析の結果（第 6図の A) 、及び P C R分析の結果（第 6図の B) を示す、図面に代わる写真である。

第 7図は、 f f 一 7の子孫 F ,の A、 B及び Cの 3種における、ゲノム中に挿入された T o 1 2エレメントの周囲の塩基配列を示すものである。発明を実施するための最良の形態先に本発明者らは、チロシナ一ゼ遺伝子座からクローン化した T o 1 2因子を含んでいるプラスミドである T o 1 2 — t y r ブラスミドをゼブラフィッシュ受精卵に注入し、注入したプラスミド D N Aから T o 1 2因子を切り出すことができることを示した（Kawakarai等、 1998) 。推定上のトランスポザーゼ活性をコード化している転写物を同定するため、 T o 1 2 — t y r プラスミドを注入した胚から全 R N Aを調製した。筆者等はまず、 T o 1 2配列の別の部分とァニールする、重なりのある 4対のプライマ一を用いて 3 ' R A C Eを行なった。

3' R A C Eを行なうために用いられたとなり同士の前向きのプライマ一は：

T o 1 2 f 2 5' - TTGGTCAGACATGTTCATTG - 3' と

T o 1 2 f 3 5' ― ATGTTCATTGGTCCTTTGGA - 3'、

T o 1 2 f 4 5' - ATAGCTGAAGCTGCTCTGATC - 3' と

T o 1 2 f 5 5' ― CTGCTCTGATCATGAAACAG - 3'、

T o 1 2 f 8 5' ― GCTTAATAAAGAAATATCGGCC - 3' と

T o 1 2 f 9 5' - AATATCGGCCTTCAAAAGTTCG - 3'、並びに

T o 1 2 f 1 2 ； 5' - CTGTAATCAGAGAGTGTATGTGTA - 3' と

T o 1 2 f 1 3 ； 5' - ATTGTTACATTTATTGCATACAAT - 3'である。

ポリアデニル化された c D N Aは T o 1 2 f 8 と T o 1 2 f 9 , 及び T o 1 2 f 4 と T o l 2 f 5を用いた 3 ' R A C Eではうまく増幅されたが、 T o l 2 f 2 と T o l 2 f 3、及び T o l 2 f l 2 と T o l 2 f l 3 を用いた 3 ' R A C E ではそうではなかった。 .

次いで、 5 ' R A C Eを行なうために用いられた重なりのある逆向きの次のプライマ一：

T o 1 2 r 4 ； 5' - CTCAATATGCTTCCTTAGG - 3'と

T o 1 2 r 5 ； 5' - CTTCCTTAGGTTTGATGGCG - 3'

を用いた 5 ' R A C Eを行ない、 2 1 5 6個のヌクレオチドから成る完全な長さの T o 1 2転写物を同定した（第 1 図）。

得られた c D N Aの塩基配列を配列表の配列番号 1 に示す。

第 1図は， T o 1 2 プラスミド及びその転写物の構造を示す。第 1 図の最上段は完全な長さの T o 1 2因子（T o 1 2 — t y r ) である。図の破線部分は、ィントロンである。一番目のイントロンにある逆向きの反復（A n g e 1 因子）と、前記したプライマーの位置とを矢印で示す。その下の段は、 3 ' RAC Eの結果を示し、その下の段は 5 ' RAC Eの結果を示す。いずれの場合も、イントロン部分は破線で示されている。

その下の段にこれらの結果から得られた全長の mRNAの構造を示す。翻訳領域は、配列番号 1の c DNAの塩基配列の 8 5番目（ATG) から 2 0 3 2 (T AG) に相当している。

第 1図の下から 1段目と 2段目は、欠失変異株の（T o l 2— t y r ) Δ R V 及び（T o 1 2— t y r ) A i n l A RVの構造を示している。

5 ' R A C E分析では、プラスミド配列からスタートし、 T o 1 2因子の一番目のェクソン内の通常では機能しないスプライスァクセプ夕ー（crypt ic spl icea cceptor) 部位へジャンプした異常な転写物も見つかった（データは示さず）。これらの転写物についてはそれ以上は調べなかった。

c D NAの DNA配列決定により T o 1 2因子のェクソン一イントロン構造 (すなわち、 4つのェクソンと 3つのイントロン）が明らかにされた（第 1図の最上段参照）。この c DNAは 6 4 9個のアミノ酸から成るタンパク質をコード化している。この蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号 2に示す。

T o 1 2エレメントがトランスポゾン様配列であることは知られていたが、本発明は、 T o 1 2エレメントが蛋白質をコードし、当該蛋白質の発現による作用であることを初めて確認したものである。即ち、本発明は、 T o 1 2エレメントにおいてコードされている新規な蛋白質を提供するものであり、また、当該蛋白質をコードするボリヌクレオチドを提供するものである。

第 2図に本発明の蛋白質のアミノ酸配列及び公知の h ATファミリーのトランスポゾンのトランスポザーゼ類のアミノ酸配列を比較した図を示す。この比較から、これらの蛋白質は特に中央部のアミノ酸配列が類似していることがわかる (第 2図参照）。しかし、 N H ₂ _及び C O O H—末端のアミノ酸配列にはやや多様性があつた。

同定された本発明の蛋白質（T o 1 2転写物）が、活性のある酵素をコード化しているかどうかを決定するため、コインジェクジョンによる新規な一過性の胚ェクシジョンアツセィを開発し、これによる酵素活性を確認を行った。

ゼブラフィッシュの受精卵に、配列番号 1 に示す c D N Aを铸型として用いて試験管内で合成した mR NAと、 T o 1 2エレメントの E c o R V切断部位の間の塩基を欠失させた、（T o l 2 — t y r ) Δ R V (第 1 図参照）を含む（T o

1 2 — t y r ) A R Vプラスミドとをコインジェク卜した。コインジェクションの約 8時間後、各々の胚より D N Aを抽出し、 T o 1 2エレメントの外側の配列に基づいて調製されたプライマ一 t y r - e x 4 f 及び t y r 一 e x 5 r t y r - e x 4 f ： 5' -GCTACTACATGGTGCCATTCCT-3'

t y r - e x 5 r ： 5' -CACTGCCAGATCTGCTGGGCTT-3'

を用いて P C R法により分析した。第 3図にこの方法の概要を示し、第 4図の A にこれらのプライマーに一を示す。

(T o 1 2 — t y r ) A R Vプラスミドから T o 1 2エレメントの部分が切り出された場合に生成すると考えられる約 2 5 0 b pの P C R産物が、調べた全ての胚において増幅されていた（ 5 6個中 5 6個、第 4図 Bのレーン 1 一 1 0参照）。この P C R産物は（T o 1 2 — t y r ) A R Vプラスミド D NAのみを注入した胚からは決して検出されなかった（ 5 0個より多い中で 0個、第 4図 Bのレーン 1 1 — 2 0参照）。

6個の異なる胚からの P C R産物をクローン化し、配列決定した。それらのうちの 3個は、野性型のメダカチロシナーゼ遺伝子の配列（第 4図（：、切り出し産物 a ) を有し、正確な切り出しを示しており、他の 3個は、 h ATファミリ一のトランスポゾンの切り出しに特徴的な（Pohlraan等、 1984 ； Sutton等、 1984 ； K oga等、 1996 ； Kawakami等、 1998) 、少数のヌクレオチドが付加したほぼ野性型の配列（第 4図 C、切り出し産物 b及び c ) を有しており、この実験における切り出しという事象がトランスポザーゼ活性に依存することを示している。

これらの結果、即ち、本発明の配列番号 1 に示す塩基配列を有する mR NAと共にインジェクションした場合には、トランスポゾンの切り出しに特徴的な P C R産物が得られ、これをインジェクションしない場合にはこのような P C R産物が得られないということは、本発明の蛋白質（T o 1 2転写物）が、切り出しを触媒する活性のあるトランスポザーゼをコードしており、しかも（T o 1 2 — t y r ) A RVプラスミドは切り出しに必須のシスェレメン卜の配列を含むことを示している。

第 4図は、この実験の結果を示すものであり、第 4図 Aは、この分析に用いたプライマ一の位置及び方向を矢印で示している。第 4図 Bの上段は、プライマー t y r - e x 4 f 及び t y r - e x 5 rを用いた P C R産物を、下段はプライマ — T o 1 2 f 1及び T o 1 2 r 3を用いた P C R産物を示す、図面に代わる写真である。レーン 1一 1 0はゼブラフィッシュ胚に（ T o 1 2— t y r ) Δ R Vプラスミドと T o 1 2の mR NAと共にインジェクションした場合を、レーン 1 1 一 2 0は（T o 1 2— t y r ) A RVプラスミドのみを単独でインジェクションした場合を、レーン G及び Pは 5 0 n gのゼブラフィッシュゲノム D N Aと、 1 O p gの（T o l 2— t y r ) A RVプラスミド DNAとからの P C R産物である。第 4図の Cは、上記の実験で得られた切り出し産物の D N A配列を示している。 T o 1 2配列を肉太活字で示し、 T o 1 2エレメントの外側の 8 b pの同方向のプライマーの配列部分に下線をつけてある。

この実験では、切り出し産物は一回の P C R増幅の後に検出可能であつたが、試験管内で調製した mRNAに代えて全長の T o 1 2エレメントを含有するブラスミド D N Aを単独で受精卵に注入した分析法では、二回の P C Rが必要であつたことが注目された。ここで観察された効率のより高い切り出し反応は、 D N A 注入によって供給されるよりも多くのトランスポザーゼが RNA注入によって供給されたためとして説明することができる。

T o 1 2エレメントの一番目のイントロンは約 3 0 0 b pの大きな逆方向反復配列（inverted repeats) を含んでおり、最近 A n g e 1 エレメントの逆向きの重複として同定された（Izsvak等、 1999) (第 1図参照）。このイン卜ロン部分の配列が切り出しに必要であるかどうかを検討するために、一番目のイントロンの配列をも完全に欠いている（T o 1 2— t y r ) Δ i n 1 Δ R V (第 1図の下段参照）を含有する（T o 1 2— t y r ) A i n l A RVプラスミドを構築し、その活性を T o 1 2の mR NAとのコインジェクションにより前記の実験と同様に分析した。この結果を第 4図の Dに示す。

第 4図の Dの上段は、プライマ一 t y r - e x 4 f 及び t y r - e x 5 rを用いた P C R産物を、下段はプライマ一 T o 1 2 f 1及び T o 1 2 r 3を用いた P C R産物を示す、図面に代わる写真である。レーン 1 一 8はゼブラフィッシュ胚に、（T o 1 2— t y r ) Δ i n l A RVプラスミドと T o 1 2の mRNAとをインジェクションした場合を示し、レーン 9一 1 2は（T o 1 2— t y r ) Δ R Vプラスミドと T o 1 2の mRNAとをインジェクションした場合を示し、レーン 1 3— 1 6は（T o l 2— t y r ) A i n l A RVプラスミドのみをを単独でインジェクションした場合を示す。レーン Pは 1 0 p gの（T o 1 2— t y r ) Δ i n 1 A RVプラスミド DNAの P C R産物を示す。

レーン 9— 1 2は先ほどの実験を対照としておこなったものであり、切り出しを示す P C R産物を確認することができたが、イントロン部分を欠失させたブラスミドを用いたレーン 1 一 8のものでは、切り出し産物は検出することができず ( 1 6個のぅち 0個、第4図0、レーン 1— 8参照）、一番目のイントロンが切り出しに必須のシスエレメントを含んでいることが示された。

また、 A RV欠失を修復し、（T o 1 2— t y r ) A RVプラスミドとほぼ同じ大きさの（T o 1 2— t y r ) Δ i n 1、即ち T o 1 2エレメントの 6 44〜 2 1 6 3番目の塩基のみを欠失させたものを含有する（T o 1 2 - t y r ) Δ i η 1プラスミドもコインジェクションアツセィによって調べたが、切り出しを示す P C R産物は得られなかつた（ 1 6個のうち 0個、データは示さず）。

切り出しに必須のシスェレメントを正確に特定するためには、一番目のイント口ン内のより小さい欠失及び点突然変異を用いたさらなる分析が必要であろうが、これらの結果からイントロン部分が切り出しに必要であり、かつ当該イントロン部分には A n g e 1 エレメントが逆方向反復配列として含まれていることから、当該逆方向反復配列が本発明の切り出しに必要な配列と考えることもできる。このように、 T o 1 2エレメントによってコードされていた転写物（本発明の蛋白質）及びこの蛋白質のトランスボザ一ゼ活性と、転移に必須のシスエレメン卜とを初めて同定することに成功した。これらの発見は、 T o 1 2 トランスボザーゼの生化学的な特徴づけにつながるものであろう。

また、 T c 1 marinerファミリーに属するトランスポゾンのゼブラフィッシュゲノムへの転位が報告されている（Raz等、 1997 ； Fadool等、 1998) 。この報告の実験では、ゼブラフィッシュの一細胞期の胚に、インビトロで転写したトランスポザーゼ RNAと必須のシスエレメントをもつトランスポゾンベクタ一とがコインジェク卜された。

異なるファミリ一に属するトランスポゾンが、ゲノムへの組込みに関して異なる特異性及び効率を有するかもしれないが、 T o 1 2エレメントを用いた魚類における新規なトランスポゾン技術を開発した本発明の方法によれば、遺伝子の切り出しが前記したラッッ（Raz) らの方法と同様に行われていることから、 T e l marinerフアミリーのトランスポゾンにおいて行なわれたものと類似の方法で、 T o 1 2エレメントなどの遺伝子をゲノム内にトランスポーズすることができることになるであろう。

そこで本発明者らは、 T o 1 2エレメントを転位によりゼブラフィッシュのゲノムに導入することができるかどうかを検討した。ゼブラフィッシュのゲノムには T o 1 2エレメントは存在しないことが知られている。

T o 1 2エレメントがトランスポジションを活性化することができるトランスポゼ一スをコードしているかどうかを試験するために、ゼブラフィッシュの受精卵に、トランスポゼ一スをコードしていると考えられるテンプレートとしての T o 1 2 c DNAを用いてインヴィトロで転写した RNA、及びトランスボゼ一スをコードしていると考えられる領域を欠失させている（T o l 2— t y r ) Δ R Vエレメントを有するプラスミド DNAを、コインジェク卜した。

これらの（T o l 2— t y r ) A RVプラスミド及び T o l 2 DNAの構造を第 5図に示す。 3 ' 及び 5 ' は転写の方向を示す。

インジェク卜した卵を成魚に生長させて、インジェク卜していない成魚とつがいにした。そして、その子孫に T o 1 2配列が存在するか否かを分析した。

インジェクトした 8匹の魚のうちの 2匹からの子孫に、 T o 1 2配列を見出すことができた。この 2匹の魚を f f 一 1 ( founder fish- 1) 及び ί f 一 7 ( foun der fish- 7) と名付けた。

f f 一 1からの 6 8匹の F ,のうちの 2匹が T o 1 2配列を持っていた。これらの 2匹の魚は、 T o 1 2配列と同様にプラスミド配列も持っていた。また、 f f 一 7からの 5 0匹の F ,のうち 2 5匹は T o 1 2配列を持っていた。これらの 2 5 匹の魚はプラスミド配列をもっておらず、第 6図の Aに示すサザンブロッ卜の結果から A、 B及び Cの 3種類に分類された。このうち Aは 7匹で、 Bは 3匹で、 Cは 1 5匹であった。

第 6図の Aは、 f f — 1、 f f 一 7からの F ,の尾ひれから調製した D N Aを制限酵素 E c o R Vで消化し、これを第 5図に示すプローブを用いてサザンプロット分析した結果を示す、図面に代わる写真である。 ί f 一 1からの 2匹は同じパターンを示したが、 f f 一 7からのものは A、 B及び Cの 3種類のパターンを示しに。

次に、 f f — 1、 f f 一 7からの F ,の P C R分析を行った。第 5図に P C R 1 P C R 2及び P C R 3として示される位置のプライマーを用いた。対照として、ゼブラフィッシュのゲノム DNA ( G) 、及びゲノム DNAと（T o l 2— t y r ) A RVプラスミド DNA (G + P) を用いた。 f f 一 7からの F ,では、 P C R 2及び P C R 3における P C R産物を増幅することはできなかった。即ち、 f f — 7からの子孫は、 f f — 1からの子孫とは異なり T o 1 2のフランキング配列となるプラスミド配列を持っていなかった。

f ί一 7の子孫における T o 1 2配列を含む DNAフラグメント及びその近傍領域をインバース P C R (inverse PCR) によりクローニングして、その配列を決定した。 A、 B及び Cの 3種類のいずれの場合も T o 1 2配列はゼブラフイツシュのゲノム配列の中にあり、その両端には 8 b pの繰り返し配列がみられた。 T o 1 2配列の両端における 8 b pの繰り返しは、 h ATファミリーのトランスポザースによる挿入に特徴的なものであり、トランポザースによって T o 1 2配列の揷入が行われたことを示すものである。

第 7図に A、 B及び Cの 3種類の決定された塩基配列を示す。第 7図中の T o 1 2は、 T o 1 2の配列を示している。 Aでは、 T o 1 2配列の両端に「C T C AACTG」の繰り返しが、 Bでは、 T o 1 2配列の両端に「T AT AG AG A」の繰り返しが、 Cでは、 T o 1 2配列の両端に「GTTTT CAG」の繰り返しが見られた。

脊椎動物の培養細胞や生殖細胞において、 T c 1 /マリナー（mariner) フアミリーに属する、人工的に再構築され活性化されたスリ一ピングビュ一ティ一（si eeping beauty) (Ivies, Z. , et al.， Cell, 91, 501 -510 (1997)) 、線虫の T c 3 (Raz，E.， et al.， Current Biology, 8, 82-88 (1997)) 、ショウジヨウバエのマリナ一因子（mariner) (Fadool , J. M. , et al.， Pro Natl. Acad. Sci. U SA, 95, 5182-5186 (1998)) についてトランスポジション活性が報告されている。しかし、脊椎動物ゲノムに存在する自律的なトランスボゾン活性は未だ報告されていない。

本発明は、脊椎動物からの自律的なエレメントを同定した最初の報告であり、脊椎動物における機能的なトランスボザ一ス活性を最初に報告するものである。即ち、本発明は、脊椎動物において自律的に遺伝子を切り出す方法に関するのみならず、遺伝子を切り出し、きりだされた遺伝子をゲノムなどの他の遺伝子の中に挿入する方法にも関するものである。

本発明の蛋白質は、配列表の配列番号 2 に示されるアミノ酸配列を有するものであるが、必ずしもこの中の全てのアミノ酸を必須とするものではなく、本発明のトランポザ一ゼ活性又は当該活性と類似する活性（これらを併せて、トランスポザーゼ様活性という。）を有していればよく、その一部のアミノ酸が置換され若しくは欠失し、又は他のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有するものであつてもよい。そして、好ましくは T o 1 2エレメントに由来するアミノ酸配列を有するものである。また、本発明の蛋白質は、配列表の配列番号 1 に示される塩基配列に相当する塩基配列を有する m R NAから産生さることを特徴とするものでもある。

本発明の核酸は、前記した本発明の蛋白質からなるアミノ酸配列をコードするものであり、好ましくは配列表のはいれる番号 1で示される配列を有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。本発明の核酸は前記の塩基配列を有するもののみならず、これらの塩基配列にハイブリダィズ、好ましくはストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし得る塩基配列も包含される。

本発明の蛋白質又は当該蛋白質を産生し得る核酸の存在下で、細胞内の遺伝子の遺伝子構造を改変させる方法としては、細胞に本発明の前記した蛋白質又はその mR NAなどの当該蛋白質を産生し得る核酸を導入し、同時に転移させたい遺伝子を含有する遺伝子、例えばプラスミドなどを導入して、本発明の蛋白質による酵素作用により細胞内の遺伝子構造を改変することができる。本発明の改変は. 好ましくは自律的な転移を起こすものである。細胞としては、動物細胞が好ましく、より好ましくは脊椎動物の細胞、さらに好ましくは魚類の細胞、具体的にはゼブラフィッシュなどの魚類の細胞などが挙げられる。

前記の転移させたい遺伝子を含有する遺伝子としては、転移させたい外来遺伝子を含有するプラスミドのような天然の細胞内に存在しないものであってもよいが、天然の細胞内に存在する遺伝子であってもよい。この場合に転移に必要なシスエレメントを必要に応じて付加することもできる。転移させたい遺伝子としては、トランスポゾンが好ましいが、場合によっては各種の遺伝子異常による疾患を有する細胞に正常な遺伝子を導入するための遺伝子であってもよい。

また、本発明の改変方法は、導入されたプラスミドなどの細胞内の遺伝子の一部を切り出すことのみからなるものであってもよいが、この方法により切り出された遺伝子の全部又は一部が、他の遺伝子に挿入されることを包含するものであつてもよい。

本発明の改変方法における切り出される遺伝子は、その塩基配列の上流に、少なくとも 1回の逆方向反復配列を含む塩基配列を有することが好ましい。このような逆方向反復配列は、遺伝子の転移におけるシスエレメント、又はシスエレメントの一部と考えられるからである。

また、本発明は、前記してきた改変方法を用いて、細胞の遺伝子に外来遺伝子を導入する方法、及び細胞の遺伝子の発現に基づく機能を改変する方法に関する。前記してきた方法によれば、例えば、プラスミド中の外来遺伝子を細胞のゲノム中に転移させることができ、細胞に当該細胞が本来有していない新たな遺伝子を導入することができる。また、このようなあらたに導入された遺伝子を発現させることにより、当該細胞の機能を改変することも可能となる。さらに、本発明はこのような方法により細胞の機能が改変された細胞を提供することができる。この方法における細胞としても、前記した細胞が好ましい。

本発明の塩基配列の上流に、少なくとも 1 回の逆方向反復配列を含む塩基配列を有する D N Aを含有してなるプラスミドとしては、逆方向反復配列の下流にある遺伝子を転移させるためのものであり、少なくとも 1 回の逆方向反復配列を含む塩基配列を有する部分とその下流に転移させたい遺伝子を含有し、細胞に容易に導入することができるものであればよい。実施例

次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

本発明の実験においては、 T e u b i n g e n、 T L及び b r a s s 系統のゼブラフィッシュを用いて注入用の卵を得、以下の実験にはこれを使用した。実施例 1 ( c DNAのクローニング）

ゼブラフィッシュの受精卵に、（T o 1 2 — t y r ) プラスミドを注入し、注入の 9時間後に 5 0個のゼブラフィッシュ胚より、 T r i Z o 1 R e a g e n t (Li fe Technologies社）を用いて全 R N Aを抽出し、得られた約 3 gの全 R N Aを、各々次の 3 ' RA C E法及び 5 ' RA C E法に用いた。

3 ' RA C Eを行なうために用いられたとなり同士の前向きのプライマ一は：

T o 1 2 f 2 5' 一 TTGGTCAGACATGTTCATTG - 3'と

T o 1 2 f 3 5' - ATGTTCATTGGTCCTTTGGA - 3'、

T o 1 2 f 4 5' 一 ATAGCTGAAGCTGCTCTGATC - 3' と

T o 1 2 f 5 5' - CTGCTCTGATCATGAAACAG - 3'、

T o 1 2 f 8 5' - GCTTAATAAAGAAATATCGGCC - 3' と

T o 1 2 f 9 5' - AATATCGGCCTTCAAAAGTTCG - 3'、及び

T o 1 2 f 1 2 ； 5' - CTGTAATCAGAGAGTGTATGTGTA - 3'と

T o 1 2 f 1 3 ； 5' - ATTGTTACATTTATTGCATACAAT - 3'である。

5 ' R A C Eを行なうために用いられた重なりのある逆向きのプライマーは： T o 1 2 r 4 ； 5' - CTCAATATGCTTCCTTAGG - 3' と

T o 1 2 r 5 ； 5' - CTTCCTTAGGTTTGATGGCG - 3'である。

3 ' RA C E及び 5 ' R A C E産物をゲル抽出し、 T O P〇 Τ Α クロー二ングキット（ Invi trogen社）を用いてクロ一ン化し、さらに ABI PRISM 310 Gene tic Analyzerを用いて配列決定した。決定された塩基配列を配列表の配列番号 1に示し、その翻訳領域のアミノ酸配列を配列表の配列番号 2に示す。

また、その概要を第 1図に示す。括弧内の数字は、 T o 1 2エレメントの 5 ' 末端からの b pである。 c DNA配列の DD B J /EMB LZG e n b a n k 受け入れ番号は AB 0 3 2 2 44である。実施例 2 ( (T o 1 2 - t y r ) A i n l A RVプラスミドの構築）

(T o 1 2 - t y r ) A i n l A RVプラスミドは、まず（T o l 2— t y r ) プラスミドの N r u I - N s p Vを、 c DNAの N r u I - N s p Vフラグメン卜で置換し、さらにその結果得られたプラスミドを E c o R Vで消化し、自己連結させることによって構築した。実施例 3 (mRNA合成、胚への注入、及び P C R分析）

推定上のトランスポザーゼのコ一ド領域全体をコ一ド化している c DN Aを、 p B l u e s c r i p t S K⁺ (Stratagene) においてクローン化し、直鎖化しプロティナ一ゼ Kを用いて消化し、さらにフエノール/クロロフオルム抽出した。 mRNAは、 T 7 R N Aボリメラ一ゼ及び m C A P mRNA C a p p i n gキット（Stratagene) を用いた試験管内の転写により生成した。転写物の濃度及び大きさは、ァガロースゲル電気泳動で調べた。

ゼブラフイツシュ受精卵に、前記で得られた D N A溶液の 1 一 2 n 1 (〜 2 5 n gZ/i l のプラスミド DNA) を mRNA (〜 5 n g/ t l の丁〇 1 2の11 1¾ NA) と共に、又は単独で注入し、 2 8 °Cにて〜 8時間インキュベートした。各々の胚を、 5 0 1 の 1 0 mM E DTA、 1 0 m M T r i s - H C 1 ( p H 8. 0 ) 、 2 0 0 g/m l のプロティナ一ゼ Kに浸し、さらに 5 0 °Cにて 3時間インキュベートした。

次いで、 1 1 の溶解した胚を、 t y r— e x 4 f 及び t y r— e x 5 rプライマ一を用いて P C R ( 9 4 °C 3 0秒、 5 5 °C 3 0秒、及び 7 2 °C 3 0秒を 3 5 サイクル）に使用した（Kawakami等、 1998) 。 P C R産物を 2 %のァガロースゲル電気泳動にて分析した。結果を第 4図に示す。 D N A配列分析用には、 P C R産物をゲル抽出し、 T〇 P O T A C l o n i n g (Invi trogen) を用いてクローン化し、配列決定した。各々のサンプル中の注入されたプラスミド D NAの存在を、 T o 1 2 f 1 (5' -TCCACCCATGCTTCCA GCAGTA - 3' ) 及び T o 1 2 r 3 (5' - CGTTGTGGTTGCAATCCATTCAAC - 3' ) プライマーを用いた P C R ( 9 4 °C 3 0秒， 5 5 °C 3 0秒、及び 7 2 °C 3 0秒を 2 5サィクル）により確かめた。産業上の利用可能性

本発明は、遺伝子の転移酵素活性を有する新規な蛋白質及びそれをコードする核酸を提供するものである。

また、本発明は、脊椎細胞において異なるファミリーの遺伝子転移酵素が、遺伝子を転移させ得る活性を発現することができることを開示するものであり、脊椎動物における遺伝子の転移や転移による変異に関する技術の発展に大きく寄与するものである。一方、最近の遺伝子工学が個々の細胞の形質転換から生体の形質転換へと発展していることから、本発明の細胞レベルの遺伝子の転移技術が単に細胞の形質転換のみに制限されるものではなく、生体における形質転換の手段の一つとして、哺乳動物の遺伝子構造や機能を改変するための医学や農学の分野への応用が期待される技術である。とりわけ、遺伝子治療、魚類の品種改良においては有力な手段となることが期待される。

Claims

請求の範囲

1. 配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列、又はそのアミノ酸の一部が置換され若しくは欠失し、又は他のアミノ酸が付加していてもよいアミノ酸配列を有するトランポザーゼ様活性を有する蛋白質。

2. 請求の範囲第 1項に記載の蛋白質からなるトランスポゾン転移酵素。

3. 請求の範囲第 1項に記載の蛋白質をコードする核酸。

4. 核酸が、配列表の配列番号 1に示される塩基配列を有する D NA、又は当該 DN Aにハイブリダィズし得る DN Aである請求の範囲第 3項に記載の核酸。

5. 核酸が RNAである請求の範囲第 3項又は第 4項に記載の核酸。

6. 請求の範囲第 1項に記載の蛋白質又は当該蛋白質を産生し得る核酸の存在下で、細胞内の遺伝子の遺伝子構造を改変させる方法。

7. 当該蛋白質を産生し得る核酸が、 mRNAである請求の範囲第 6項に記載の方法。

8. 細胞が脊椎動物の細胞である請求の範囲第 6項又は第 7項に記載の方法。

9. 細胞内の遺伝子が、プラスミドである請求の範囲第 6項〜第 8項のいずれかに記載の方法。

1 0. プラスミドが、その細胞の外来遺伝子を含有するものである請求の範囲第 9項に記載の方法。

1 1. 遺伝子構造を改変させる方法が、細胞内の遺伝子の一部を切り出すことからなる請求の範囲第 6項〜第 1 0項のいずれかに記載の方法。

1 2. 切り出された遺伝子の一部が、他の遺伝子に挿入される請求の範囲第 1 1項に記載の方法。

1 3. 切り出される遺伝子の一部の塩基配列の上流に、少なくとも 1回の逆方向反復配列を含む塩基配列を有する請求の範囲第 1 1項又は第 1 2項に記載の方法。

1 4. 遺伝子構造を改変させられる遺伝子が、シスエレメントとして少なくとも 1回の逆方向反復配列を含む塩基配列を有する請求の範囲第 6項〜第 1 3項のいずれかに記載の方法。

1 5. 請求の範囲第 6項〜第 1 4項のいずれかに記載の方法を用いて、細胞の遺伝子に外来遺伝子を導入する方法。

1 6. 請求の範囲第 6項〜第 1 4項のいずれかに記載の方法を用いて、細胞の遺伝子の発現に基づく機能を改変する方法。

1 7. 請求の範囲第 1 6項に記載の方法により機能が改変された細胞。

1 8. 塩基配列の上流に、少なくとも 1回の逆方向反復配列を含む塩基配列を有する DNAを含有してなるプラスミド。

1 9. プラスミドが、請求の範囲第 1項の記載の蛋白質又は当該蛋白質を産生し得る核酸の存在下で、そのなかの一部の DNAが切り出されるためのものである請求の範囲第 1 8項に記載のプラスミド。

2 0. 脊椎動物のゲノム D N A中に、他の遺伝子を挿入する方法において、当該トランスポザースの活性を用いて他の遺伝子を挿入する方法。

2 1. 他の遺伝子が請求の範囲第 1 3項〜第 1 4項の特徴を有する T o 1 2ェレメントである請求の範囲第 2 0項に記載の方法。

2 2. 脊椎動物が、魚類である請求の範囲第 2 0項又は第 2 1項に記載の方法,