JP6958917B2 - 遺伝子ノックイン細胞の作製方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムなどのゲノム編集技術を利用して、高効率で遺伝子ノックイン細胞を作製する方法に関する。

遺伝子ターゲティング（ノックアウト又はノックイン）哺乳動物は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子機能を解析する上で重要なツールとなっているが、その製造は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を利用する複雑かつ手間のかかる工程を要するものとなっている。

これまでに、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９などのゲノム編集技術が開発され、遺伝子改変のための有用なツールとして注目されている。

これらゲノム編集技術のうち、現在最も利用されているＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、細菌の獲得免疫機構を基盤とし、二本鎖ＤＮＡ切断酵素であるＣａｓ９タンパク質と、標的ＤＮＡ領域と相補的な塩基配列を有するＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、ｃｒＲＮＡと一部相補的な塩基配列を有するＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｇ ＲＮＡ；ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなる複合体が、標的ＤＮＡ領域を特異的に認識・結合し、切断する。

このシステムを利用して、Ｃａｓ９タンパク質をコードするＲＮＡ、ならびにｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（これら２つのＲＮＡがリンカーヌクレオチドを介して結合している一本鎖キメラＲＮＡの形態の場合を含む）を受精卵に導入し、受精卵のゲノムをｉｎ ｖｉｖｏにて直接的に操作し（ｉｎ ｖｉｖｏゲノム改変）、ＥＳ細胞を介することなく、遺伝子ターゲティング哺乳動物を製造することができる（特許文献１、非特許文献１）。今日までに、この手法によりノックアウトマウスの製造（特許文献２、非特許文献２−４）や、一塩基置換を伴うノックインマウスの製造（非特許文献３，５，６）が多数行われている。

しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いて比較的大きなサイズの遺伝子を挿入したノックイン哺乳動物を製造する場合、遺伝子のノックイン効率が非常に低いことが問題となっている（非特許文献７）。

そこで、Ｃａｓ９タンパク質（ＲＮＡではなく、タンパク質の形態）、ｃｒＲＮＡ断片、及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片からなるクローニングフリーのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを利用して、比較的大きなサイズの二本鎖ＤＮＡをドナーとして、高効率で非ヒト哺乳動物にノックインする方法が開発された（特許文献３）。この方法では、主として、ドナーＤＮＡがヘテロでノックインされた哺乳動物を作製することができる（後述の比較例２を参照のこと）。

その一方、従来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを利用して、一本鎖ＤＮＡをドナーとして、高効率で非ヒト哺乳動物にノックインする方法も開発されている（非特許文献８）。この方法では、ドナーＤＮＡがホモでノックインされた哺乳動物を得ることに成功している。

なお、最近になり、新たなゲノム編集技術として、ＣＲＩＳＰＲ−ｃｐｆ１システムが開発された（非特許文献９）。このシステムも、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムと同様、ガイドＲＮＡ及びそれと相互作用するヌクレアーゼを利用したゲノム編集技術であり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムと同様の利用が期待されている。

ＷＯ２０１４／１３１８３３ ＷＯ２０１３／１８８５２２ ＷＯ２０１６／０８００９７

Ａｉｄａ，Ｔ．ら、Ｄｅｖ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．５６，３４−４５，１９４（２０１４）． Ｓｈｅｎ，Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２３ ７２０−３（２０１３）． Ｗａｎｇ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ １５３，９１０−８（２０１３）． Ｌｉ，Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，６８１−３（２０１３）． Ｌｏｎｇ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５，１１８４−８（２０１４）． Ｗｕ，Ｙ．ら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３，６５９−６２（２０１３）． Ｙａｎｇ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ １５４，１３７０−９（２０１３）． Ｍｉｕｒａ，Ｈ．ら、Ｓｃｉ． Ｒｅｐ. ５，１２７９９（２０１５） Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ １６３（３），７５９−７１（２０１５）

本発明は、従来法よりも飛躍的に高い効率でドナーＤＮＡを細胞にノックインしうる方法であって、かつ、ドナーＤＮＡをホモでノックインしうる方法を提供することを目的とする。

本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｃａｓ９タンパク質（ＲＮＡではなく、タンパク質の形態）、ｃｒＲＮＡ断片、及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片からなるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを利用して、長鎖一本鎖ＤＮＡをドナーとして、ノックイン動物の作製を試みたところ、驚くべきことに、検証した範囲において８０％の効率で、ドナーＤＮＡがノックインされた動物が得られることを見出した（後述の実施例１）。これは、上記の特許文献３の方法と比較しても、飛躍的に高い効率であった。しかも、本発明の方法によれば、特許文献３の方法では得ることが困難な、ホモでドナーＤＮＡがノックインされた個体を作製することができた。

また、一般にドナーＤＮＡは長鎖になればなるほどノックイン個体を作製することが困難となるが、本発明の方法では、非特許文献８の方法よりも長鎖の一本鎖ＤＮＡ（６００ｂｐ以上）を用いた場合でも、高い効率でノックイン個体を作製することができた。非特許文献８の方法では、２９６〜５１４ｂｐの一本鎖ＤＮＡをドナーとして用いているが、本発明と同様の条件（６００ｂｐ以上の一本鎖ＤＮＡ）で検証を行ったところ、ノックインの効率は極めて低かったことに鑑みれば（後述の比較例１）、本発明の方法は、特に長鎖の一本鎖ＤＮＡを用いた場合に、従来法と比較したノックインの効率の差がより顕著となると考えられる。

また、本発明者は、本発明に用いる長鎖の一本鎖ドナーＤＮＡが、非対称ＰＣＲや片側リン酸化ＰＣＲと特異的ＤＮＡ分解酵素との組み合わせにより、その鎖長に制限なく、ワンチューブ反応で短時間で調製しうることを見出した。

さらに、本発明者は、その原理から、ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質とガイドＲＮＡを含むゲノム編集システムであれば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム以外のシステムであっても本発明を広く応用できること、また、ノックイン動物の作製目的で受精卵にドナーＤＮＡをノックインする以外にも、様々な目的で広く細胞のノックインに応用できることを見出し、本発明を完成するに至った。

従って、本発明は以下を提供するものである。

[１]所望のＤＮＡが標的ＤＮＡ領域に挿入された細胞の作製方法であって、
（ａ）ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質、
（ｂ）標的ＤＮＡ領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列及び（ａ）のタンパク質と相互作用する塩基配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ、及び
（ｃ）所望のＤＮＡを含む一本鎖ドナーＤＮＡ
を細胞に導入する工程を含む方法。

[２]所望のＤＮＡが標的ＤＮＡ領域に挿入された細胞の作製方法であって、
（ａ）Ｃａｓ９タンパク質、
（ｂ）ｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片の組み合わせ、及び
（ｃ）所望のＤＮＡを含む一本鎖ドナーＤＮＡ
を細胞に導入する工程を含む方法。

[３]（ｃ）の一本鎖ドナーＤＮＡが６００塩基以上の塩基配列を有する、[１]又は[２]に記載の方法。

[４]（ｃ）の一本鎖ドナーＤＮＡが、次の（ｉ）又は（ｉｉ）の方法で調製される、[１]〜[３]のいずれかに記載の方法。
（ｉ）量の異なる一対のプライマーを用いたＰＣＲによりＤＮＡを増幅する工程、及び増幅産物に含まれる二本鎖ＤＮＡを特異的に分解する工程を含む方法
（ｉｉ）一対のプライマーのうち、一方のプライマーにリン酸化されたプライマーを用いるＰＣＲによりＤＮＡを増幅する工程、及び増幅産物におけるリン酸化された鎖を特異的に分解する工程を含む方法
[５]細胞が卵母細胞である、[１]〜[４]のいずれか１項に記載の方法。

[６]卵母細胞が受精卵である、[５]に記載の方法。

[７]所望のＤＮＡが標的ＤＮＡ領域に挿入された細胞を含む非ヒト個体の作製方法であって、
（ａ）[１]〜[６]のいずれか１項に記載の方法を実施する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）により得られた細胞から非ヒト個体を作製する工程、
を含む方法。

[８]非ヒト哺乳動物がげっ歯類である、[７]に記載の方法。

[９][１]〜[８]のいずれか１項に記載の方法に用いるためのキットであって、以下の（ａ）から（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１の分子を含むキット。
（ａ）ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）標的ＤＮＡ領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列及び（ａ）のタンパク質と相互作用する塩基配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ
（ｃ）所望のＤＮＡを含む一本鎖ドナーＤＮＡ

本発明によれば、ドナーＤＮＡとして用いる一本鎖ＤＮＡが、たとえ、長鎖であっても、従来のゲノム編集技術と比較して、飛躍的に高い効率で細胞にノックインすることができる。しかも、ドナーＤＮＡがホモでノックインされた細胞を得ることもできる。また、本発明に用いる一本鎖ドナーＤＮＡは、非対称ＰＣＲなどを利用してワンチューブ反応で短時間で収率よく調製でき、調製する一本鎖ＤＮＡの鎖長にも特に制限はない。従って、このように調製された一本鎖ドナーＤＮＡとクローニングフリーのゲノム編集システムとを組み合わせて用いる本発明は、ノックイン効率のみならず、簡便さにも優れたゲノム編集システムとなる。

通常法（ｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）により、長鎖一本鎖ドナーＤＮＡ（ｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１）をインジェクションして作製したマウスにおいて、ノックイン効率を検出した結果を示す電気泳動写真である。ノックインマウスではバンドサイズが高分子量にシフトしている（以下、同様）。 通常法（ｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）により、長鎖一本鎖ドナーＤＮＡ（Ｄｃｔ−Ｃｒｅ）をインジェクションして作製したマウスにおいて、ノックイン効率を検出した結果を示す電気泳動写真である。ノックインマウスではバンドサイズが高分子量にシフトしている。 クローニングフリーＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質）により、環状二本鎖ドナーＤＮＡ（ｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１）をインジェクションして作製したマウスにおいて、ノックイン効率を検出した結果を示す電気泳動写真である。 クローニングフリーＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質）により、長鎖一本鎖ドナーＤＮＡ（ｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１）をインジェクションして作製したマウスにおいて、ノックイン効率を検出した結果を示す電気泳動写真である。 産仔の数を増やして、図４と同様の実験を行った結果を示す電気泳動写真である。なお、レーン４（産仔３）は、解析不能であった。

本発明は、所望のＤＮＡが標的ＤＮＡ領域に挿入された細胞の作製方法を提供する。本発明の方法においては、以下の（ａ）〜（ｃ）の分子を細胞に導入する工程を含む。

（ａ）ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質
本発明において、「ヌクレアーゼ活性」とは、ＤＮＡを切断する触媒活性を意味する。典型的には、エンドヌクレアーゼ活性である。

本発明における「ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質」は、後述するＤＮＡ標的化ＲＮＡに結合して標的ＤＮＡ領域に標的化され、これにより部位特異的なヌクレアーゼ活性を発揮することができる限り、特に制限はない。このようなヌクレアーゼ活性を有するタンパク質としては、例えば、Ｃａｓ９タンパク質やＣｐｆ１タンパク質が挙げられる。本発明においては、特に、Ｃａｓ９タンパク質が好ましい。

本発明においてＣａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて使用できるものであればよく、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片と結合して複合体を形成し、標的ＤＮＡ領域に標的化されて標的二本鎖ＤＮＡを切断する。種々の由来のＣａｓ９タンパク質は公知であり、ＷＯ２０１４／１３１８３３に例示されるものを利用することができる。好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）を利用する。Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列及び塩基配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されており（例えば、アクセッション番号：Ｑ９９ＺＷ２．１等）、本発明においてはこれらを利用することができる。

好ましくは本発明においてＣａｓ９タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなるものを利用することができる。また、本発明においてＣａｓ９タンパク質には、天然型のアミノ酸配列に対して、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含む変異体を用いることもできる。ここで「複数個」とは１〜５０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個である。さらに、本発明においてＣａｓ９タンパク質には、元のタンパク質の活性を保持する限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなるポリペプチドも含む。アミノ酸配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。

このような変異体としては、例えば、触媒部位の１つに変異が導入されニッカーゼ活性を示すＣａｓ９タンパク質（ｎＣａｓタンパク質）が挙げられる。ｎＣａｓタンパク質を利用することにより、オフターゲット作用を減少させることができる。

一方、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムにおいて使用できるものであればよく、ｃｒＲＮＡ断片と結合して活性化し、標的二本鎖ＤＮＡを切断する。この作用において、ｔｒａｃｒＲＮＡ断片は不要である。また、Ｃａｓ９タンパク質は、標的二本鎖ＤＮＡを切断した結果、平滑末端を生じさせるのに対し、Ｃｐｆ１タンパク質は突出末端を生じさせる点でも異なる。Ｃｐｆ１タンパク質は公知であり、非特許文献９に例示されるものを利用することができる。好ましくは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍあるいはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ.由来のＣｐｆ１タンパク質（ＬｂＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１）を利用する。それらのアミノ酸配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されている（例えば、アクセッション番号：ＷＰ＿０２１７３６７２２、ＷＰ＿０３５６３５８４１等）。

例えば、本発明においてＣｐｆ１タンパク質は、配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなるものを利用することができる。また、天然型のアミノ酸配列に対して、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含む変異体を用いることができる点は、Ｃａｓ９タンパク質の場合と同様である。

本発明においてヌクレアーゼ活性を有するタンパク質は、タンパク質の形態で利用される。当該タンパク質は、遺伝子組換え技術により得られた形質転換細胞又は微生物に産生させることを含む生物学的手法により製造されたものであってもよいし、慣用のペプチド合成法を用いて化学的に製造されたものであってもよい。あるいは、市販品を使用してもよい。

（ｂ）標的ＤＮＡ領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列及び（ａ）のタンパク質と相互作用する塩基配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ
本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡ領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列及び上記ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質と相互作用する塩基配列を含む。

本発明において「標的ＤＮＡ領域」とは、生物のゲノムＤＮＡ上、目的とする遺伝子改変を生じる部位を含む領域を意味し、通常、１７〜３０塩基、好ましくは１７〜２０塩基からなる領域である。当該領域は３’側にてＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列と隣接する領域より選択されることが好ましい。典型的には、標的ＤＮＡの部位特異的切断は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡと標的ＤＮＡの間の塩基対形成の相補性と、その３’側に存在するＰＡＭの両方によって決定される位置で生じる。

ＰＡＭは、本発明のヌクレアーゼ活性を有するタンパク質の種類や由来により異なるが、Ｃａｓ９では、典型的には、「５’−ＮＧＧ（Ｎは任意の塩基）−３’」であり、Ｃｐｆ１では、典型的には、「５’−ＴＴＮ（Ｎは任意の塩基）−３’」又は「５’−ＴＴＴＮ（Ｎは任意の塩基）−３’」である。なお、タンパク質を改変すること（例えば、変異の導入）により、ＰＡＭ認識を改変することも可能である（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４８１−４８５（２０１５）、Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６１， ８８６−８９４（２０１６））。これにより標的ＤＮＡの選択肢を拡大することができる。

標的ＤＮＡ領域を選択する方法として種々の方法が知られており、例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）（マサチューセッツ工科大学）、Ｅ−ＣＲＩＳＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅ−ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ−ＣＲＩＳＰ／）、Ｚｉｆｉｔ Ｔａｒｇｅｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｚｉｆｉｔ．ｐａｒｔｎｅｒｓ．ｏｒｇ／ＺｉＦｉＴ／）（Ｚｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒコンソーシアム）、Ｃａｓ９ ｄｅｓｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｓ９．ｃｂｉ．ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／）（北京大学）、ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／）（東京大学）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｒｉｓｐｒ／）（華中農業大学）、Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ．（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗｓ．ｂｌｕｅｈｅｒｏｎｂｉｏ．ｃｏｍ／ｅｘｔｅｒｎａｌ／ｔｏｏｌｓ／ｇＲＮＡＳｒｃ．ｊｓｐ）（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）などを利用して決定することができる。

ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質と相互作用する塩基配列（タンパク質結合セグメント）を含むことによって、ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質と複合体を形成する（すなわち、非共有結合性相互作用によって結合する）。また、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡ領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列（ＤＮＡ標的化セグメント）を含むことによって、標的特異性を複合体に与える。このように、ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質は、それ自体がＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントと結合することによって標的ＤＮＡ領域に誘導され、そして、その活性によって標的ＤＮＡを切断する。

ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、また通常用いられるＲＮＡ自動合成装置を利用して、化学的に合成することができる。

ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの場合には、ｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片の組み合わせである。

ｃｒＲＮＡ断片は少なくとも、標的ＤＮＡ領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列とｔｒａｃｒＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列を、５’側よりこの順で含んでなる。ｃｒＲＮＡ断片は、そのｔｒａｃｒＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列において、ｔｒａｃｒＲＮＡ断片と二重鎖ＲＮＡを形成し、形成された二重鎖ＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する。これによりＣａｓ９タンパク質が標的ＤＮＡ領域にガイドされる。

ｔｒａｃｒＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列とは、ｔｒａｃｒＲＮＡ断片の一部の塩基配列と結合（ハイブリダイズ）可能な塩基配列を意味する。典型的には、少なくとも配列番号２で表される塩基配列を含む。好ましくはｔｒａｃｒＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列は、配列番号３で表される塩基配列において５’末のグリシン「Ｇ」を１番目として以降の塩基については２番目、３番目、４番目．．．２２番目と順次番号付けを行った場合、１番目から６番目の塩基からなる塩基配列と共に、７番目から２２番目の領域より、７番目の塩基に隣接して選択される１又は連続する複数の塩基からなる塩基配列を含むか、当該塩基配列よりなる。好ましくは、１番目から１０番目の塩基からなる塩基配列と共に、１１番目から２２番目の領域より、１１番目の塩基に隣接して選択される１又は連続する複数の塩基からなる塩基配列を含むか、当該塩基配列よりなる。実際、本発明者は、ｔｒａｃｒＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列において、５’側の６塩基を有すれば、本発明のゲノム編集システムが切断活性を持ち、５’側の１０塩基を有すれば、本発明のゲノム編集システムが優れた切断活性を持つことを見出している。

また、本発明においてｔｒａｃｒＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列には、上記塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）塩基配列を有し、かつｔｒａｃｒＲＮＡ断片と相互作用可能なオリゴヌクレオチドも含まれる。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）溶液を用いて、６５℃で洗浄することを意味する（以下においても、同じ意味で使用する）。このようなオリゴヌクレオチドには、上記塩基配列において数塩基の付加、置換、欠失又は挿入を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドや（ここで「数塩基」とは、３塩基以内、又は２塩基以内の塩基数を意味する）、上記塩基配列と、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド等が含まれ得る。このようなオリゴヌクレオチドのことを本明細書においては、上記塩基配列の「変異配列」と記載する場合がある。

ｃｒＲＮＡ断片は、上記標的ＤＮＡ領域の塩基配列と相補的な塩基配列と上記ｔｒａｃｒＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列を含み、全体として、好ましくは４２塩基以下、３９塩基以下、又は３６塩基以下、あるいは３０塩基以上、３６塩基以上、又は３９塩基以上、例えば、３０〜４２塩基、より詳細には３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、３９塩基、４０塩基、４１塩基又は４２塩基とすることができる。

なお、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの場合には、ｃｒＲＮＡ断片を意味し、ｔｒａｃｒＲＮＡ断片は不要である。ｃｒＲＮＡ断片がＣｐｆ１タンパク質と相互作用することにより、Ｃｐｆ１タンパク質が標的ＤＮＡ領域にガイドされる。ｃｒＲＮＡ断片において、Ｃｐｆ１タンパク質と相互作用する塩基配列（タンパク質結合セグメント）については、非特許文献９に開示されている。

複数のＤＮＡ領域を標的とするために、また、同一ＤＮＡ領域において複数箇所を標的とするために、複数種のＤＮＡ標的化ＲＮＡを用いることができる。複数種のＤＮＡ標的化ＲＮＡは、同時に細胞に導入されても良いし、連続的に導入されてもよい。ｎＣａｓタンパク質を利用する場合には、例えば、標的ＤＮＡ領域の二本鎖における各鎖に対して、それぞれ一箇所（合計２箇所）を標的とした、複数種のＤＮＡ標的化ＲＮＡを用いることができる。

本発明においてｔｒａｃｒＲＮＡ断片は、５’側にｃｒＲＮＡ断片の一部の塩基配列と結合（ハイブリダイズ）可能な塩基配列を有する。これら塩基配列の相互作用によりｃｒＲＮＡ断片／ｔｒａｃｒＲＮＡ断片が二重鎖ＲＮＡを形成し、形成された二重鎖ＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する。

本発明においてｔｒａｃｒＲＮＡ断片は、ｃｒＲＮＡ断片と共にＣａｓ９タンパク質をガイドできるものであれば特に限定されないが、好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｔｒａｃｒＲＮＡを利用する。

ｔｒａｃｒＲＮＡ断片について、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに必要とされる塩基配列はある程度明らかにされており（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６，２０１２）、本発明においてはこれらの知見を利用することができる。本発明のｔｒａｃｒＲＮＡ断片は、少なくとも配列番号４で表される塩基配列を含む。好ましくはｔｒａｃｒＲＮＡ断片は、配列番号５で表される塩基配列において５’末のアデニン「Ａ」を１番目として以降の塩基については２番目、３番目、４番目．．．６９番目と順次番号付けを行った場合、１１番目から３４番目の塩基からなる塩基配列と共に、１番目から１０番目及び／又は３５番目から６９番目の領域より、１１番目及び／又は３４番目の塩基に隣接して選択される１又は連続する複数の塩基からなる塩基配列を含むか、当該塩基配列よりなる。

したがって、ｔｒａｃｒＲＮＡ断片は全体として、好ましくは６９塩基以下、５９塩基以下、又は３４塩基以下、あるいは２４塩基以上、例えば、２４塩基、２４〜３４塩基、２４〜５９塩基又は２４〜６９塩基とすることができる。

また、本発明においてｔｒａｃｒＲＮＡ断片には、上記塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）塩基配列を有し、かつｃｒＲＮＡ断片と共にＣａｓ９タンパク質をガイドできるオリゴヌクレオチドも含まれる。このようなオリゴヌクレオチドには、上記塩基配列において数塩基の付加、置換、欠失又は挿入を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドや（ここで「数塩基」とは、３塩基以内、又は２塩基以内の塩基数を意味する）、上記塩基配列と、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド等が含まれ得る。このようなオリゴヌクレオチドのことを本明細書においては、上記塩基配列の「変異配列」と記載する場合がある。

（ｃ）一本鎖ドナーＤＮＡ
本発明において一本鎖ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質に切断された部位にて生じる相同組換え修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ＨＲ）を利用して、標的ＤＮＡ領域に所望のＤＮＡを挿入（ノックイン）するために用いられる一本鎖ＤＮＡである。

相同組換え修復のプロセスにおいては、標的ＤＮＡとドナーＤＮＡの塩基配列の相同性を必要とし、ドナーＤＮＡを標的ＤＮＡ（すなわち、二重鎖切断を受けたＤＮＡ）の鋳型修復に用い、ドナーＤＮＡから標的ＤＮＡへの遺伝情報の移動をもたらす。これにより、標的分子の塩基配列の変化（例えば、挿入、欠失、置換など）をもたらすことができる。

従って、一本鎖ドナーＤＮＡは、標的ＤＮＡ領域内の塩基配列と高い同一性を有する２つの塩基配列（所謂、相同性アーム）とそれらの間に配置された所望のＤＮＡ（標的ＤＮＡ領域に挿入するためのＤＮＡ）を含む。

相同性アームは相同組換えを行うのに十分な程度の大きさがあればよく、また、一本鎖ドナーＤＮＡの鎖長により変動し得るが、例えば、２０〜３００ｂの範囲よりそれぞれ独立して選択することができる。本発明によれば、例えば、７０ｂｐ以下（例えば、６５ｂｐ以下、６０ｂｐ以下、５５ｂｐ以下）の鎖長であっても、十分なノックイン効率を実現することが可能である。

また、相同性アームは相同組換えを行うのに十分な程度に標的ＤＮＡ領域内の塩基配列と同一性を有していれば、１００％の同一性がなくともよい。例えば、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の同一性をそれぞれ有する。

また、挿入する所望のＤＮＡの大きさは特に限定されることなく、様々なサイズのものを利用することができる。一本鎖ＤＮＡの鎖長は、例えば、１００ｂ以上、２００ｂ以上、３００ｂ以上、４００ｂ以上、５００ｂｐ以上、６００ｂ以上、７００ｂ以上、８００ｂ以上、９００ｂ以上、１ｋｂ以上である。非特許文献８では、２９６〜５１４ｂｐの一本鎖ＤＮＡをドナーとして用いているが、本発明の方法では、非特許文献８の方法よりも長鎖の一本鎖ＤＮＡ（６００ｂｐ以上）を用いた場合でも、極めて高い効率でノックイン個体を作製することができる。なお、非特許文献８の方法を、本発明と同様の一本鎖ＲＮＡの条件（６００ｂｐ以上）で検証を行ったところ、ノックインの効率は極めて低かった（後述の比較例１）。従って、本発明の方法によれば、特に長鎖の一本鎖ＤＮＡを用いた場合に、従来法と比較した、ノックインの効率の差がより顕著となる。

所望のＤＮＡ中に、事後的に除去したい塩基配列が存在する場合には、当該塩基配列の両端に、例えば、ｌｏｘＰ配列やＦＲＴ配列を付加することもできる。ｌｏｘＰ配列やＦＲＴ配列に挟まれた塩基配列は、Ｃｒｅ組換え酵素やＦＬＰ組換え酵素を作用させることにより、除去することができる。また、一本鎖ドナーＤＮＡのノックインの成功を確認するため等の目的で、例えば、選択マーカー配列（例えば、蛍光タンパク質や薬剤耐性遺伝子など）を所望のＤＮＡ中に組み込むこともできる。

また、挿入する所望のＤＮＡには、プロモーター及び／又はその他の制御配列を作動可能に連結することができる。「作動可能に連結する」とは、プロモーターの下流に連結された所望のＤＮＡ（遺伝子）が発現可能なように、プロモーターと所望のＤＮＡが連結されていることを意味する。プロモーター及び／又はその他の制御配列は特に限定されないが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、誘導性プロモーター、ＣＭＶプロモーターなど、その他の調節エレメントなど（例えば、ターミネーター配列）を適宜選択することができる。

本発明の一本鎖ドナーＤＮＡは、例えば、非対称ＰＣＲ法や片側リン酸化ＰＣＲ法を利用して、ワンチューブ反応で短時間かつ高収率で一本鎖ドナーＤＮＡを調製することができる。

非対称ＰＣＲ法は、ＰＣＲ法で用いる一組のプライマーについて、一方のプライマー量を少なくしておき、片鎖を優先的に合成する方法である。非対称ＰＣＲの後、その増幅産物に二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を作用させて二本鎖ＤＮＡを分解することにより、一本鎖ＤＮＡを調製することができる。一方、片側リン酸化ＰＣＲ法においては、一対のプライマーのうち、目的とする長鎖一本鎖ドナーＤＮＡと逆鎖のプライマーとして、リン酸化したプライマーを用いる。そして、ＰＣＲ反応後、その増幅産物に対し、リン酸化されたＤＮＡ特異的なＤＮＡ分解酵素を作用させて、リン酸化された鎖を分解することにより、一本鎖ＤＮＡを調製することができる。

これら方法で用いるプライマーには、一本鎖ドナーＤＮＡの構成要素としたい所望の配列を付加したものを用いることができる。所望の配列としては、例えば、相同性アームの配列、ｌｏｘＰ配列やＦＲＴ配列などの組換え酵素の認識配列などが挙げられるが、これらに制限されない。

また、非特許文献８に記載の方法や吉見らの方法（Ｙｏｓｈｉｍｉら, Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７：１０４３１（２０１６）， ＤＯＩ： １０．１０３８/ｎｃｏｍｍｓ１０４３１）を利用して調製することもできる。

なお、本発明の一本鎖ＤＮＡには、実験の性質上あるいはその他の理由により、多少の二本鎖ＤＮＡが混合されうることは理解されたい。

標的ＤＮＡ領域が異なる複数種のＤＮＡ標的化ＲＮＡあるいは同一標的ＤＮＡ領域内の標的箇所が異なる複数種のＤＮＡ標的化ＲＮＡを本発明において利用する場合には、それぞれの標的ＤＮＡ領域に対応した相同性アームを有する、複数種の一本鎖ドナーＤＮＡを含めることができる。この場合、複数種のドナーＤＮＡに含まれる所望のＤＮＡとしては、異なる塩基配列のＤＮＡとすることができる。

本発明において、上記（ａ）〜（ｃ）の分子が導入される細胞としては、その由来に特に制限はない。細胞は、動物細胞、植物細胞、藻細胞、真菌細胞などの真核生物細胞であっても、細菌や古細菌などの原核生物細胞であってもよい。好ましくは真核生物細胞であり、特に好ましくは動物細胞である。

動物細胞としては、例えば、哺乳類（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど）の細胞の他、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類の細胞が挙げられる。哺乳類の細胞は、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類の細胞であり、特に好ましくはマウス細胞である。

また、本発明は、いかなる種類の細胞も対象になり得るが、動物細胞においては、例えば、卵母細胞や精子などの生殖細胞；各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞や胚性幹（ＥＳ）細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞などの体細胞などが挙げられる。

卵母細胞は、受精前及び受精後の卵母細胞を利用することができるが、好ましくは受精後の卵母細胞、すなわち受精卵である。特に好ましくは、受精卵は前核期胚のものである。卵母細胞は、凍結保存されたものを解凍して用いることができる。

これら細胞への上記（ａ）〜（ｃ）の分子の導入には、タンパク質やＲＮＡ断片を細胞に導入するための公知の方法を利用することができ、例えば、顕微注入法を好適に用いることができる（例えば、Ｎａｇｙ Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．，２００３．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。電気穿孔法などその他の方法も利用することができる。

卵母細胞に顕微注入する場合には、卵母細胞の前核、細胞質、それらの両方、好ましくは前核に対して行う。受精卵の場合には雌性前核及び／又は雄性前核、細胞質、それらの両方、好ましくは雄性前核に対して行う。

代表的な一例として、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを細胞に注入する場合の条件は、次の通りである。

注入溶液には、Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片をそれぞれ以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）の一又は複数にて規定される量より選択される量にて含めることができる：
（ｉ） Ｃａｓ９タンパク質は、通常、５〜５０００ｎｇ／μＬ、好ましくは５〜５００ｎｇ／μＬ、より好ましくは１０〜５０ｎｇ／μＬ、さらに好ましくは２０〜４０ｎｇ／μＬ、よりさらに好ましくは３０ｎｇ／μＬとする；
（ｉｉ） ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片はそれぞれ、Ｃａｓ９タンパク質１ｎｇ／μＬに対し、通常、０．００２ｐｍｏｌ／μＬを超える濃度、好ましくは０．００５ｐｍｏｌ／μＬ以上、より好ましくは０．０１ｐｍｏｌ／μＬ以上、さらに好ましくは０．０２ｐｍｏｌ／μＬ以上であり、上限は、通常、２ｐｍｏｌ／μＬ以下、好ましくは０．２ｐｍｏｌ／μＬ以下となる濃度とする（ｃｒＲＮＡ断片の量とｔｒａｃｒＲＮＡ断片の量とは、同一であってもよいし、異なっていてもよい）；
（ｉｉｉ） ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片はそれぞれ、通常、０．０６ｐｍｏｌ／μＬを超える濃度、好ましくは０．１５ｐｍｏｌ／μＬ以上、より好ましくは０．３ｐｍｏｌ／μＬ以上、さらに好ましくは０．６ｐｍｏｌ／μＬ以上であり、上限は、通常、６０ｐｍｏｌ／μＬ以下、好ましくは６ｐｍｏｌ／μＬ以下、となる濃度とする（ｃｒＲＮＡ断片の量とｔｒａｃｒＲＮＡ断片の量とは、同一であってもよいし、異なっていてもよい）。

一態様において注入溶液中には、Ｃａｓ９タンパク質を、通常、２０〜４０ｎｇ／μＬ、好ましくは３０ｎｇ／μＬ、ｃｒＲＮＡ断片を、通常、０．１５ｐｍｏｌ／μＬ以上、好ましくは０．３ｐｍｏｌ／μＬ以上、より好ましくは０．６ｐｍｏｌ／μＬ以上、ならびに、ｔｒａｃｒＲＮＡ断片を、通常、０．１５ｐｍｏｌ／μＬ以上、好ましくは０．３ｐｍｏｌ／μＬ以上、より好ましくは０．６ｐｍｏｌ／μＬ以上の濃度でそれぞれ含めることができる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを使用する場合の条件は、上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する場合の条件を基に、当業者であれば適宜設定しうる。

顕微注入に際して、上記ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質と上記ＤＮＡ標的化ＲＮＡは複合体を形成していることが好ましい。複合体の形成は、これらを注入溶液中にて、通常、３５〜４０℃、好ましくは３７℃にて、通常、少なくとも１５分間程度、インキュベートすることにより行うことができる。

注入溶液の注入量は、細胞への顕微注入において一般的に用いられている量であればよく、例えば、卵母細胞の前核へ顕微注入する場合には、前核の膨化が飽和状態となる量とすることができる。

注入されたヌクレアーゼ活性を有するタンパク質は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡとの結合により、細胞におけるゲノムＤＮＡ上の標的ＤＮＡ領域にガイドされ当該領域内の二本鎖ＤＮＡの切断を引き起こす。

相同組換え修復によれば、ドナーＤＮＡの存在下、これを鋳型として相同組換え修復が起こり、一本鎖ドナーＤＮＡに含まれた所望のＤＮＡが標的ＤＮＡ領域に挿入（遺伝子ノックイン）され得る。

一本鎖ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質、ＤＮＡ標的化ＲＮＡと共に細胞に導入することができ、通常、１〜２００ｎｇ／μＬ、好ましくは５〜１０ｎｇ／μＬの濃度にて他の成分と共に注入溶液中に含めることができる。

また、上記複数種のＤＮＡ標的化ＲＮＡや複数種の一本鎖ドナーＤＮＡを組み合わせて用いることによって、複数種の遺伝子改変を生じることができる。

本発明は、また、所望のＤＮＡが標的ＤＮＡ領域に挿入された細胞を含む非ヒト個体の作製方法を提供する。この方法は、上記した、所望のＤＮＡが標的ＤＮＡ領域に挿入された細胞の作製方法を実施する工程、及び当該工程により得られた細胞から非ヒト個体を作製する工程を含む。

非ヒト個体としては、例えば、非ヒト動物及び植物が挙げられる。非ヒト動物としては、哺乳類（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど）、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類が挙げられるが、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類であり、特に好ましくはマウスである。植物としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類が挙げられる。具体的な作物としては、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションを例示することができる。

細胞から非ヒト個体を作製する方法としては、公知の方法を利用することができる。動物において細胞から非ヒト個体を作製する場合、通常、生殖細胞又は多能性幹細胞が利用される。例えば、上記（ａ）〜（ｃ）の分子を卵母細胞に顕微注入し、得られた卵母細胞を次いで、偽妊娠状態にした雌非ヒト哺乳動物の子宮に移植し、その後産仔を得る。移植は１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、又は桑実期胚の受精卵にて行うことができる。顕微注入された卵母細胞は必要に応じて、移植されるまで適当な条件下にて培養することができる。卵母細胞の移植及び培養は従来公知の手法に基づいて行うことができる（Ｎａｇｙ Ａら、上掲）。

また、植物においては、古くから、その体細胞が分化全能性を有していることが知られており、様々な植物において、植物細胞から植物体を再生する方法が確立されている。従って、例えば、上記（ａ）〜（ｃ）の分子を植物細胞に顕微注入し、得られた植物細胞から植物体を再生することにより、所望のＤＮＡがノックインされた植物体を得ることができる。

遺伝子改変の有無の確認、及び遺伝子型の決定は、従来公知の手法に基づいて行うことができ、例えばＰＣＲ法、配列決定法、サザンブロッティング法等を利用することができる。

得られた非ヒト個体からは、所望のＤＮＡがノックインされた子孫やクローンを得ることもできる。

本発明の方法によれば、ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質及びＤＮＡ標的化ＲＮＡを含むゲノム編集技術を利用して、一本鎖ドナーＤＮＡを細胞に導入することによって、極めて高効率にて標的ＤＮＡを遺伝子改変することができる。本発明方法によれば、遺伝子改変をホモ接合型にて有する非ヒト哺乳動物の製造も効率的に行うことができる。６００ｂ以上の長鎖一本鎖ＤＮＡを用いた場合でも、極めて高いノックイン効率を示すことから、本発明によれば、様々なサイズの遺伝子を極めて高効率でノックインすることが可能である。本発明の方法を用いた場合、検証した範囲において８０％ものノックイン効率を示したことは、驚くべきことである。

本発明は、また、上記本発明の方法に用いるためのキットを提供する。本発明のキットは、上記ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質、上記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、及び上記一本鎖ドナーＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つの分子を含む。２つの分子を含んでもよく、３つの分子を含んでもよい。

当該のキットは、一つ又は複数の追加の試薬をさらに含む場合があり、追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、対照試薬（例えば、対照のＤＮＡ標的化ＲＮＡ）が挙げられるが、これらに制限されない。

キットに含まれる各要素は、それぞれ別個の容器に収容されていてもよいし、あるいは同一の容器に収容されていてもよい。各要素は、一回の使用量ごとに容器に収容されていてもよいし、あるいは複数回分の量が一つの容器に収容されていてもよい（使用者は一回の使用に必要な量を取り出して用いることができる）。各要素は乾燥形態で容器に収容されていてもよいし、適当な溶媒中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。

以下に、比較例及び実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。

１．材料と方法
（１）長鎖一本鎖ドナーＤＮＡのデザイン
Ｃｒｅ組換え酵素が存在する特定細胞においてのみ、標的遺伝子が欠損するように設計されたノックインマウスをｆｌｏｘノックインマウスと呼ぶ。Ｃｒｅ組換え酵素は、２つのＬｏｘＰで挟まれた遺伝子領域を欠損させる作用を有することから、当該標的遺伝子をＬｏｘＰで挟み込むことにより、ｆｌｏｘノックインマウスを作製することができる。当該マウスは、ゲノム編集による遺伝子改変マウス作製の応用例で最も困難とされている。

本発明者は、マウスＣｏｌ１２ａ１遺伝子の第２エクソンを標的としたｆｌｏｘノックインマウスを作製するため、当該エクソン含む遺伝子領域の両末端に、ＬｏｘＰ配列及び５５塩基対のＣｏｌ１２ａ１相同配列を含む、長鎖一本鎖ドナーＤＮＡ（ｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１ ｓｓＤＮＡ、全長６３７塩基）を設計した（配列番号８）。

同様に、マウスＤｃｔ遺伝子の第１エクソンを標的としたＣｒｅ組換え酵素ノックインマウスを作製するため、Ｃｒｅ組換え酵素遺伝子の両末端に５５塩基対Ｄｃｔ相同配列を含む、長鎖一本鎖ドナーＤＮＡ（全長１１４８塩基）を設計した（配列番号９）。

（２）長鎖一本鎖ドナーＤＮＡの作製
（ｉ）ｃＤＮＡ法
三浦らの方法（非特許文献８）によりｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１長鎖一本鎖ドナーＤＮＡを作製した。具体的には、ＬｏｘＰ配列を付加したプライマーを用いて、マウスゲノムＤＮＡより、マウスＣｏｌ１２ａ１遺伝子の第２エクソンを含む遺伝子領域をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は全てＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）により行った。このＰＣＲ産物を精製後に鋳型として用いて、さらに５５塩基対のＣｏｌ１２ａ１相同配列を付加したプライマーを用いて、ＰＣＲによりｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１遺伝子カセットを作製した。このＰＣＲ産物を精製後に鋳型として用いて、さらに片側にＴ７認識配列を付加したプライマーを用いて、Ｔ７−ｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１遺伝子カセットを作製した。サンガーシークエンスにより塩基配列を確認した。

次に、このＰＣＲ産物を精製後に鋳型として用いて、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりＴ７試験管内ＲＮＡ合成法により、ｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１ ｍＲＮＡを増幅した。ｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１ ｍＲＮＡは、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で精製した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｉｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＡｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｉｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により電気泳動でサイズ確認を行った。ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)により濃度測定を行った。

次に５μgのｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１ ｍＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＣｅｌｌｓＤｉｒｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を用いて、ｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１ ｃＤＮＡ合成を行った。合成したｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１ ｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、予想サイズのバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製したｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１ ｃＤＮＡをエタノール沈殿でさらに濃縮した。これをｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１長鎖一本鎖ドナーＤＮＡとした。サンガーシークエンス法により、一本鎖ＤＮＡであること、また配列が正しいことを確認した。

（ｉｉ）非対称ＰＣＲ法
上記のｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１遺伝子カセットＰＣＲ産物を鋳型として、両端に設計したプライマー（Ｔｍ値は５７℃）により非対称ＰＣＲを行った。プライマーは、長鎖一本鎖ドナーＤＮＡとして増幅するＤＮＡと同鎖のプライマーを最終１ｍＭ、逆鎖のプライマーを最終１０−２５μＭで加えた。プライマーのアニーリングは６２℃で１０サイクル、さらに５７℃で３５サイクルとして、ＰＣＲ反応を行った。アガロースゲル電気泳動により、長鎖一本鎖ドナーＤＮＡの増幅を確認した。次に、二本鎖特異的ＤＮａｓｅ（ＰＣＲ ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｋｉｔ， ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ）をＰＣＲ後の反応液に加え、ＰＣＲで生成された二本鎖ＤＮＡを分解した。ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によりｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１長鎖一本鎖ドナーＤＮＡ精製した。サンガーシークエンス法により、一本鎖ＤＮＡであること、また配列が正しいことを確認した。Ｄｃｔ−Ｃｒｅ遺伝子カセットについても同様に作製した。

（ｉｉｉ）リン酸化ＰＣＲ法
上記（ｉ）のｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１遺伝子カセットＰＣＲ産物を鋳型として、両端に設計したプライマーで通常のＰＣＲを行った。ただしプライマーについて、長鎖一本鎖ドナーＤＮＡとして増幅するＤＮＡと同鎖のプライマーは非修飾、逆鎖のプライマーは５’末端塩基をリン酸化修飾した。ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で確認し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製後に、Ｌａｍｂｄａ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＮＥＢ）で処理して、５’末端がリン酸化されたＤＮＡ鎖のみを分解し、ｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１長鎖一本鎖ドナーＤＮＡを得た。

（３）ガイドＲＮＡ作製
（ｉ）クローニングフリーＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム法
相田らの方法（Ａｉｄａら, Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １６：８７（２０１５）, ＤＯＩ： １０．１１８６／ｓ１３０５９−０１５−０６５３−Ｘ）により作製した。マウスＣｏｌ１２ａ１遺伝子の第２エクソンの５’上流及び３’上流を標的としたｃｒＲＮＡをＲＮＡ化学合成で作製した（ファスマック）。インビトロ消化分析（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）で標的ＤＮＡの切断活性を検定した。５’上流及び３’上流について最も高い活性を示したｃｒＲＮＡをそれぞれインジェクションに用いた。マウスＤｃｔ遺伝子の第１エクソンを標的としたｃｒＲＮＡも同様にＲＮＡ化学合成（ファスマック）で作製した。ｔｒａｃｒＲＮＡについても同様にＲＮＡ化学合成（ファスマック）で作製した。

なお、マウスＣｏｌ１２ａ１遺伝子の第２エクソンの５’上流及び３’上流を標的としたｃｒＲＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号１０と１１に、マウスＤｃｔ遺伝子の第１エクソンを標的としたｃｒＲＮＡの塩基配列を配列番号１２に示した。これらｃｒＲＮＡにおいて、５’側の２０塩基が標的遺伝子と相補的な領域である。また、ｔｒａｃｒＲＮＡの塩基配列を配列番号５に示した。

（ｉｉ）通常法
相田らの方法（上掲）により作製した。上記のｃｒＲＮＡに対応するマウスＣｏｌ１２ａ１遺伝子の第２エクソンの５’上流及び３’上流を標的としたｓｇＲＮＡ、及びマウスＤｃｔ遺伝子の第１エクソンを標的としたｓｇＲＮＡについて、これらのＴ７付加ＰＣＲ産物を鋳型として、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)によりＴ７試験管内ＲＮＡ合成法により作製した。

（４）Ｃａｓ９
（ｉ）クローニングフリーＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム法
Ｃａｓ９タンパク質（ＰＮＡ Ｂｉｏ及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた。

（ｉｉ）通常法
相田らの方法（上掲）により作製した。ｐＸ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅ）プラスミドを鋳型に、Ｔ７付加Ｃａｓ９ ＰＣＲ産物を増幅した。これを鋳型として、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)によりＴ７試験管内ＲＮＡ合成法により、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを増幅した。

（５）インジェクション
相田らの方法（上掲）により行った。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス凍結受精卵の前核に、下記のインジェクション溶液を顕微注入した。インジェクション後に短時間３７℃で培養を行い、当日中に偽妊娠メスマウスに移植した。

（ｉ）クローニングフリーＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム法
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液に、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（０．６１μＭ）、Ｃａｓ９タンパク質（３０ｎｇ／μｌ）、長鎖一本鎖ドナーＤＮＡ（５−１０ｎｇ／μｌ）で加えた。

（ｉｉ）通常法
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液に、ｓｇＲＮＡ（２．５ｎｇ／μｌ）、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（５ｎｇ／μｌ）、長鎖一本鎖ドナーＤＮＡ（５−１０ｎｇ／μｌ）で加えた。

（６）解析
相田らの方法（上掲）により行った。産仔のテールＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ノックインマウスを同定した。これらのクローニングとサンガーシークエンスにより正確なノックインを確認した。

２．結果
[比較例１] 通常法＋長鎖一本鎖ドナーＤＮＡ（非特許文献８の方法）
マウスＣｏｌ１２ａ１遺伝子の第２エクソンの５’上流及び３’上流を標的とした２つのｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、及びｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１長鎖一本鎖ドナーＤＮＡ（６３７塩基）をマウス受精卵にインジェクションした。２６匹の産仔のうち、ｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１ノックインマウスは１匹も得られなかった。ノックイン効率は０％であった（図１）。

次に、マウスＤｃｔ遺伝子の第１エクソンを標的としたｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、及びＤｃｔ−Ｃｒｅ長鎖一本鎖ドナーＤＮＡ（１１４８塩基）をマウス受精卵にインジェクションした。１０匹の産仔のうち、１匹がＤｃｔ−Ｃｒｅノックインマウスであった。ノックイン効率は１０％であった（図２）
以上から、通常用いられるＣａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡに長鎖一本鎖ドナーＤＮＡの組み合わせでは、０．６ｋｂより長い遺伝子カセットを用いた場合、ノックイン効率が低いことが示された。

[比較例２] クローニングフリーＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム＋環状二本鎖ドナーＤＮＡ
マウスＣｏｌ１２ａ１遺伝子の第２エクソンの５’上流及び３’上流を標的とした２つのｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質、及びｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１環状二本鎖ドナーＤＮＡをマウス受精卵にインジェクションした。９匹の産仔のうち、３匹がｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１ノックインマウスであった。ノックイン効率は３３．３％であったが（図３）、ホモのノックインマウスは得られなかった。

以上から、クローニングフリーＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いることで、０．６ｋｂより長い遺伝子カセットのノックインが可能であることが示された。短い相同領域の環状二本鎖ドナーＤＮＡを用いたにもかかわらず、ノックイン効率は、相田ら（上掲）で示された４５．５％をやや下回る程度で、一般的には高い効率であった。

[実施例１]クローニングフリーＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム＋長鎖一本鎖ドナーＤＮＡ
マウスＣｏｌ１２ａ１遺伝子の第２エクソンの５’上流及び３’上流を標的とした２つのｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質、及びｆｌｏｘＣｏｌ１２ａ１長鎖一本鎖ドナーＤＮＡ（６３７塩基）をマウス受精卵にインジェクションした。３匹の産仔のうち、３匹全てがｆｌｏｘＣｏｌ１２a１ノックインマウスであった（図４）。うち１匹はホモのノックインマウスであった。さらに、産仔の数を増やして同様の実験を行ったところ、１２匹の産仔のうち、９匹がｆｌｏｘＣｏｌ１２a１ノックインマウスであった（図５；レーン４の産仔３は解析不能であったため、除外した）。全体のノックイン効率は、８０％（１２／１５）であった。

なお、複数の他の遺伝子を標的として同様の実験を行ったが、いずれの場合でも、高効率でノックインが認められた。

以上から、クローニングフリーＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに、長鎖一本鎖ドナーＤＮＡを組み合わせることで、０．６ｋｂより長い遺伝子カセットの超高効率のノックインが可能であることが示された。これは従来のクローニングフリーＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるノックインや、長鎖一本鎖ドナーＤＮＡによるノックインの効率を大きく上回るものである。またこの組み合わせにより、初めてホモノックインマウスが得られた。

本発明のゲノム編集システムによれば、高効率で遺伝子ノックイン細胞を作製することが可能である。本発明は、実験動物の作成などの研究目的のみならず、再生医療などの医療分野、有用形質を有する作物の作成などの農業分野、微生物を利用した有用物質の生産などの工業分野、など幅広い産業分野での利用が期待される。

配列番号２〜５、１０〜１２
＜２２３＞ 合成オリゴヌクレオチド
配列番号８、９
＜２２３＞ 一本鎖ドナーＤＮＡ

Claims (7)

1. 所望のＤＮＡが標的ＤＮＡ領域に挿入された細胞（但し、ヒト生体内の細胞、ヒト生殖細胞、及びヒト胚を除く）の作製方法であって、
   （ａ）Ｃａｓ９タンパク質、
   （ｂ）ｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片の２分子からなる組み合わせ、及び
   （ｃ）所望のＤＮＡを含む、６００塩基以上の塩基配列を有する一本鎖ドナーＤＮＡ
   を細胞に導入する工程を含む方法。
2. （ｃ）の一本鎖ドナーＤＮＡが、次の（ｉ）又は（ｉｉ）の方法で調製される、請求項１に記載の方法。
   （ｉ）量の異なる一対のプライマーを用いたＰＣＲによりＤＮＡを増幅する工程、及び増幅産物に含まれる二本鎖ＤＮＡを特異的に分解する工程を含む方法
   （ｉｉ）一対のプライマーのうち、一方のプライマーにリン酸化されたプライマーを用いるＰＣＲによりＤＮＡを増幅する工程、及び増幅産物におけるリン酸化された鎖を特異的に分解する工程を含む方法
3. 細胞が卵母細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 卵母細胞が受精卵である、請求項３に記載の方法。
5. 所望のＤＮＡが標的ＤＮＡ領域に挿入された細胞を含む非ヒト個体の作製方法であって、
   （ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法を実施する工程、及び
   （ｂ）工程（ａ）により得られた細胞から非ヒト個体を作製する工程、
   を含む方法。
6. 非ヒト哺乳動物がげっ歯類である、請求項５に記載の方法。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法に用いるためのキットであって、以下の（ａ）から（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１の分子を含むキット。
   （ａ）Ｃａｓ９タンパク質、
   （ｂ）ｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片の２分子からなる組み合わせ、及び
   （ｃ）所望のＤＮＡを含む、６００塩基以上の塩基配列を有する一本鎖ドナーＤＮＡ

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